CN116715737B - 新型冠状病毒受体结合域B细胞表位的靶标抗原及其在Peg菌毛展呈表达及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了新型冠状病毒受体结合域B细胞表位的靶标抗原及其在鸡白痢沙门氏菌Peg菌毛展呈表达及其凝集抗体检测中的应用。本发明能检测到新冠灭活疫苗特异性凝集抗体，该敏感性显著高于传统血清学检测技术，且能检测到新冠灭活疫苗产生的特异性凝集抗体效价。鉴于本发明具有快速特异、敏感、便捷和成本低廉等优势，有望成为SARS‑CoV‑2早期感染诊断以及新冠疫苗免疫检测监测评估的重要技术和平台。
Description
技术领域
本发明属于生物医学和免疫诊断检测技术领域，具体涉及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合域(RBD)B细胞表位的靶标抗原NA10在鸡白痢沙门氏菌Peg菌毛展呈表达及其应用。
背景技术
目前常用的新冠检测方法主要包括核酸检测(通常为荧光定量PCR)和血清学检测。
相较于核酸检测，血清学检测方法(抗体检测)则作为新冠的辅助诊断手段，这是由于传统血清学技术难以突破敏感性和特异性的技术瓶颈，包括：1)传统血清学技术(如ELISA，胶体金，化学发光法等)包被抗原的数量有限，导致抗体检测的敏感性局限。2)使用异源表达载体诱导产生的蛋白质抗原，与天然抗原空间构象和功能具有差异，一定程度影响与抗体的识别和结合，也要考虑到蛋白质抗原的大部分区域是冗余的，不仅不与特异性抗体结合，而且产生非特异性反应和一定的背景反应，导致特异性不能确保的技术瓶颈。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合域(RBD)B细胞表位的靶标抗原(TBE)及其在鸡白痢沙门氏菌Peg菌毛展呈表达及其凝集抗体检测中的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供了编码所述靶标抗原(TBE)的核酸或基因。
本发明还要解决的技术问题是提供了表达盒、重组载体、重组菌株或凝集抗体检测系统。
本发明还要解决的技术问题是提供了重组表达载体或所述的凝集抗体检测系统的构建方法。
本发明还要解决的技术问题是提供了结合SARS-CoV-2受体结合域B细胞表位的凝集抗体识别位点。
本发明还要解决的技术问题是提供了靶标抗原、所述的靶标抗原的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体、重组菌株或凝集抗体检测系统在制备检测新型冠状病毒凝集抗体的试剂或试剂盒中的应用。
本发明最后要解决的技术问题是提供了一种检测新型冠状病毒凝集抗体的试剂或试剂盒。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了新型冠状病毒受体结合域B细胞表位的靶标抗原，所述靶标抗原的氨基酸为NATRFASVYA，简称为NA10。
本发明内容还包括编码所述的靶标抗原的核酸或基因，所述核酸或基因的DNA序列为AACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCT，简称AT30。
其中，所述SARS-CoV-2凝集抗体为特异性针对B细胞表位的一种靶标抗原的氨基酸序列为：NATRFASVYA，简称NA10。
本发明内容还包括表达盒、重组载体、重组菌株或凝集抗体检测系统，包含所述的核酸或基因。
本发明内容还包括所述的重组表达载体，所述重组表达载体是将所述靶标抗原的核酸或基因插入鸡白痢沙门氏菌Peg菌毛编码基因序列中，构建得到的表达载体pBR-Peg-SARS-CoV-2-AT30。
其中，所述凝集抗体检测系统还包括将表达载体pBR-Peg-SARS-CoV-2-AT30导入载体菌中即得。
其中，所述的重组表达载体或所述的凝集抗体检测系统的构建方法，包括以下步骤：
(1)新型冠状病毒受体结合域B细胞表位的靶标抗原DNA序列的获得；
(2)将步骤(1)得到的DNA序列插入鸡白痢沙门氏菌Peg菌毛编码基因序列中，构建表达载体pBR-Peg-SARS-CoV-2-AT30；
和/或包括；
步骤(3)将表达载体pBR-Peg-SARS-CoV-2-AT30通过电转化的方式导入载体菌中即得。
作为优选地，步骤1)中的靶标抗原DNA序列为SARS-CoV-2-AT30：AACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCT。
作为优选地，步骤1)的靶标抗原氨基酸序列为SARS-CoV-2-NA10：NATRFASVYA。
本发明内容还包括所述的靶标抗原、所述的靶标抗原的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体、重组菌株或凝集抗体检测系统在制备检测新型冠状病毒凝集抗体的试剂或试剂盒中的应用。
本发明内容还包括结合SARS-CoV-2受体结合域B细胞表位的凝集抗体，所述凝集抗体特异性结合所述的B细胞表位靶标抗原。
本发明内容还包括一种检测新型冠状病毒凝集抗体的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括所述的B细胞表位靶标抗原或所述的表达盒、重组载体、重组菌株或凝集抗体检测系统。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优势：本发明所述新型冠状病毒(SARS-CoV-2)特异性靶标抗原NA10来自SARS-CoV-2RBD的B细胞表位序列，利用Peg菌毛实施展呈表达特异性靶标抗原NA10。通过间接凝集试验，验证载体菌表达Peg菌毛，以及其菌体表面功能性展示表达SARS-CoV-2-AT30，靶标抗原TBEA可精准识别和结合针对SARS-CoV-2受体结合域(RBD)B细胞表位的抗体，从而实现特异、敏感、快速的SARS-CoV-2凝集抗体检测。该凝集抗体检测系统与其他人源冠状病毒阳性血清(包括非典病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征病毒(MERS-CoV)S蛋白感染小鼠血清)和动物源冠状病毒阳性血清(包括与牛冠状病毒BCV、猫冠状病毒FIPV、鸡冠状病毒IBV、猪冠状病毒包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的阳性感染血清，猪的丁型冠状病毒感染血清)不产生交叉反应。接种新冠病毒灭活疫苗后第6天即可用本发明检测到特异性凝集抗体，该敏感性显著高于传统血清学检测技术，且能检测到特异性凝集抗体效价。鉴于本发明具有快速特异、敏感、便捷和成本低廉等优势，有望成为SARS-CoV-2早期感染诊断以及新冠疫苗免疫检测监测评估的重要技术和平台。
附图说明
图1、鸡白痢沙门氏菌Peg菌毛及其展呈靶标抗原NA10的结构示意图。
图2、鸡白痢沙门氏菌Peg菌毛操纵子编码基因pegABCD的PCR扩增鉴定电泳图。其中泳道M为Trans 2Kplus II DNAMarker，泳道1为鸡白痢沙门氏菌标准株CVCC 526的PCR扩增产物；泳道2为鸡白痢沙门氏菌标准株C79-13的PCR扩增产物；泳道3为禽致病性大肠杆菌分离株APEC-XM的基因组作为阴性对照；泳道4为大肠杆菌工程菌DH5α的基因组作为阴性对照。
图3、表达载体pBR-Peg酶切鉴定的核酸电泳图。其中泳道M为Trans 15KDNAMarker，泳道1为重组环状质粒pBR-Peg，泳道2为NheI单酶切pBR-Peg的线性DNA条带，泳道3为BamHI单酶切pBR-Peg的线性DNA条带，泳道4为NheI和BamHI双酶切pBR-Peg的线性DNA条带。
图4、插入SARS-CoV-2-NA1 0后peg-SARS-CoV-2-AT30的PCR扩增鉴定电泳图。其中泳道M为Trans 2KPlus II DNAMarker，泳道1为pegABCD操纵子基因的PCR扩增产物，模板DNA来自鸡白痢沙门氏菌标准株CVCC 526，作为阳性对照；泳道2为peg-SARS-CoV-2-AT30的PCR扩增产物；泳道3为禽致病性大肠杆菌分离株APEC-XM的基因组作为阴性对照；泳道4为大肠杆菌工程菌DH5α的基因组作为阴性对照。
图5、含peg-SARS-CoV-2-AT30基因的重组质粒pBR-Peg-SARS-CoV-2-AT30的酶切鉴定电泳图。其中泳道M为Trans 2K Plus II DNAMarker，泳道1为pBR322环状质粒阴性对照；泳道2为pBR-Peg-SARS-CoV-2-AT30环状质粒；泳道3为pBR-Peg-SARS-CoV-2-AT30的NheI单酶切产物；泳道4为pBR-Peg-SARS-CoV-2-AT30的BamHI单酶切产物；泳道5为pBR-Peg-SARS-CoV-2-AT30的NheI和BamHI双酶切产物。
图6、表达载体pBR-Peg-SARS-CoV-2-NA10质粒示意图。
图7、SARS-CoV-2凝集抗体检测系统DH-5α+Peg-SARS-CoV-2-AT30分别与不同来源SARS-CoV-2阳性血清凝集反应结果图。A：SARS-CoV-2凝集抗体检测系统分别与国药生产新冠病毒灭活疫苗免疫志愿者血清样品的凝集反应结果；B：SARS-CoV-2凝集抗体检测系统分别与科兴生产新冠病毒灭活疫苗免疫志愿者血清样品的凝集反应结果；C：SARS-CoV-2凝集抗体检测系统分别与新冠康复志愿者血清样品的凝集反应结果；D：SARS-CoV-2凝集抗体检测系统分别与SARS-CoV-2的S蛋白免疫食蟹猴血清样品的凝集反应结果；E：阴性对照1，SARS-CoV-2凝集抗体检测系统与非典病毒(SARS-CoV)的S蛋白免疫小鼠血清样品均不凝集；F：阴性对照2，SARS-CoV-2凝集抗体检测系统与中东呼吸综合征病毒(MERS-CoV)的S蛋白免疫小鼠血清样品均不凝集；G：阴性对照3，SARS-CoV-2凝集抗体检测系统与牛冠状病毒(BCV)感染牛血清样品均不凝集；H：阴性对照4，SARS-CoV-2凝集抗体检测系统与犬冠状病毒(CCV)感染犬血清样品均不凝集；I：阴性对照5，SARS-CoV-2凝集抗体检测系统与猫冠状病毒(FCV)感染猫血清样品均不凝集；J：阴性对照6，SARS-CoV-2凝集抗体检测系统与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染猪血清样品均不凝集；K：阴性对照7，SARS-CoV-2凝集抗体检测系统与猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染猪血清样品均不凝集；L：阴性对照8，SARS-CoV-2凝集抗体检测系统与猪丁型冠状病毒(PDCoV)感染猪血清样品均不凝集。
图8、SARS-CoV-2凝集抗体检测系统定量测试。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解：本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解：本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1鸡白痢沙门氏菌Peg菌毛基因的克隆和表面展呈功能验证
菌毛是细菌表面呈细丝状的结构，在细菌的生长、致病和抵御不良环境刺激等方面发挥重要作用。对于细菌而言，菌毛是重要的表面组分，介导细菌黏附和感染宿主的过程；对于宿主而言，菌毛是细菌主要表面抗原，针对菌毛的抗体可保护宿主免受感染。伴侣-推进(chaperon-usher，CU)菌毛是众多菌毛类型中种类最多和组装形式最具代表性的，沙门氏菌Peg菌毛就属于CU菌毛的γ4亚型，其组成包括：协助菌毛亚单位折叠的伴侣蛋白(chaperon)PegB，跨细胞外膜输送菌毛亚单位的推进蛋白(usher)PegC，形成菌毛表面主体的主要亚单位(major subunits)PegA和顶端黏附素(adhesin)PegD。将菌毛作为表面展呈表达本申请发明的靶标抗原TBEA区域，能够增殖放大TBEA数量，从而显著地提高检测的敏感性(图1)。因此，鸡白痢沙门氏菌Peg菌毛编码基因的克隆和功能鉴定是本发明的前提条件。基于鸡白痢沙门氏菌Peg菌毛编码基因的扩增和鉴定，克隆至pBR322表达质粒，通过电转化的方式导入大肠杆菌载体菌中扩增表达，并进一步通过间接凝集试验验证载体菌表达Peg菌毛与鸡白痢沙门氏菌阳性血清出现明显的凝集现象，验证大肠杆菌载体菌功能性表达鸡白痢沙门氏菌Peg菌毛。具体实施程序如下：
根据NCBI公布的鸡白痢沙门氏菌(Salmonella Pullorum)CVCC 526全基因组序列设计分子克隆引物，上游引物SP Peg Up：5’-GCCGCTAGCATGAAACGTTCACTTATTGCTGCT-3′下游引物SP Peg Down：5′-GCAGGATCCTTAATCAGTTAATACCGTCATCGTCAG-3，下划线序列分别代表NheI和BamHI限制性酶切位点，上述引物由南京擎科生物科技有限公司合成。
以鸡白痢沙门氏菌(Salmonella Pullorum)标准株CVCC 526(购自中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心)的基因组为模板，利用上、下游引物SP PegUp/Down进行PCR扩增，扩增体系为：pfu high-fidelity DNA Polymerase(北京全式金生物技术股份有限公司)2μL，5×pfu DNApolymerase buffer 10μL，dNTPs 5μL，上下游引物(10mM)各2μL，CVCC 526基因组(250ng/μL)2μL，超纯水27μL。将上述体系混合均匀后利用热循环仪(Bio-Red)进行PCR扩增，程序如下：预变性94℃ 5min，扩增阶段共30个循环，包括变性94℃ 30s、退火52℃ 30s和延伸72℃ 5min，进一步扩增72℃ 10min，扩增结束后温度降低至12℃。鸡白痢沙门氏菌标准株C79-13(购自中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心)的基因组作为阳性对照；禽致病性大肠杆菌分离株APEC-XM(刘家奇，武琥琮，尹义，张东，夏芃芃，任文凯，朱国强.禽源大肠杆菌致新生儿大肠杆菌型脑膜炎小鼠模型的构建研究[J].中国家禽，2019，41(10)：26-30.)和大肠杆菌工程菌DH5α的基因组作为阴性对照。
配置1％的琼脂糖凝胶，110V电泳45min后利用溴化乙锭染色后在紫外成像仪下成像观察，结果如图2所示，鸡白痢沙门氏菌标准株CVCC 526和C79-13均扩增出4850bp的DNA产物；禽致病性大肠杆菌分离株APEC-XM和大肠杆菌工程菌DH5α的基因组中未扩增出任何条带。利用通用型DNA纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收鸡白痢沙门氏菌标准株CVCC 526基因组的PCR扩增产物。
回收pBR322质粒(商品化质粒，购自淼灵质粒平台，货号P0090)，利用NheI和BamHI限制性内切酶(NEB)对鸡白痢沙门氏菌标准株CVCC 526的peg操纵子基因PCR扩增产物与pBR322质粒分别进行双酶切，然后利用T4 DNA连接酶(NEB)对上述线性DNA片段在16℃金属浴中过夜连接得到连接产物，次日将连接产物转化DH-5α感受态细胞(代红星，张庆桥，樊宝良.一种简捷有效的大肠杆菌感受态细胞制备方法[J].安徽农业科学，2008(29)：12627-12628.)，通过涂布含100μg/mL的氨苄青霉素固体培养基进行抗性菌落筛选。挑取平板上的单菌落接种至含100μg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中生长至平台期，回收重组质粒pBR-Peg后经NheI、BamHI单酶切和两种限制性内切酶双酶切。配置1％的琼脂糖凝胶，110V电泳45min后利用溴化乙锭染色后在紫外成像仪下成像观察，结果如图3所示，重组质粒pBR-Peg的NheI和BamHI单酶切产物均为9065bp，双酶切产物为4215bp的线性pBR322载体和4850bp的peg线性DNA片段，与预期片段大小一致，通过DNA测序验证(南京擎科生物科技有限公司)。
携带peg菌毛操纵子重组质粒pBR-Peg的DH-5α工程菌在含100μtg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中生长14小时至平台期，4000rpm离心5min后弃上清，用等体积无菌生理盐水重悬，离心洗涤2次后制备细菌悬液(终浓度1×1010CFU/mL)。将携带重组质粒pBR-Peg的DH-5α工程菌细菌悬液与SPF鸡阴性血清(北京勃林格殷格翰公司)和鸡白痢阳性血清(经鸡白痢沙门氏菌标准株CVCC 526两次免疫90日龄SPF鸡，在免疫后45天采血后析出获得)进行凝集试验测试，并利用含pBR322空载体的DH-5α工程菌的细菌悬液作为阴性对照。结果如表1所示，两种菌株的细菌悬液均不与阴性血清发生反应。携带重组质粒pBR-Peg的DH-5α工程菌细菌悬液与阳性血清出现显著的凝集现象，凝集颗粒大，背景清晰；而含pBR322空载体的DH-5α工程菌细菌悬液与阳性血清不发生凝集现象，无凝集颗粒，背景呈浑浊状。该结果表明来自鸡白痢沙门氏菌的Peg菌毛能够在DH-5α工程菌表面成功功能性展呈表达。
表1携带重组质粒pBR-Peg的DH-5α工程菌表达鸡白痢沙门氏菌Peg的功能验证
实施例2携带新型冠状病毒B细胞表位靶标抗原NA10的Peg菌毛表达载体构建及其功能性表达验证
基于鸡白痢沙门氏菌peg菌毛操纵子基因的克隆和在载体菌菌体表面展示功能验证的基础上，将新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合域(RBD)B细胞表位NA10的DNA序列插入鸡白痢沙门氏菌Peg菌毛基因序列中，构建表达载体pBR-Peg-SARS-CoV-2-AT30，导入大肠杆菌载体菌中扩增表达，验证在载体菌菌体表面成功展示表达SARS-CoV-2-NA10。具体实施程序如下：
通过NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)检索SARS-CoV-2武汉株(Wuhan-Hu-1)序列(登录号：OP268178.1)，从全基因组中找到刺突蛋白(S蛋白)基因序列和氨基酸序列。利用蛋白质数据库(https://www.rcsb.org/)找到已经解析的S蛋白晶体结构，为保障TBE在空间结构的独特性，因此需考虑到S蛋白受体结合域(RBD)存在开放与闭合两种状态(引用晶体结构的蛋白数据库ID为：6VXX和6ZGF)。利用NovoPro在线工具(https://www.novopro.cn/tools/)对S蛋白RBD区域氨基酸序列进行疏水性分析，筛选亲水基序，并通过蛋白质分析软件Pymol(https://pymol.org/2/)在空间结构上进行进一步分析和比对，筛选出1种表面暴露较好的靶标抗原的氨基酸序列即为TBE，其氨基酸序列为：SARS-CoV-2-NA10：NATRFASVYA，简称NA10。NA10对应的的基因序列为，SARS-CoV-2-AT30：AACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCT。
同上方法，通过Pymol软件和NovoPro在线工具分析鸡白痢沙门氏菌Peg菌毛主要亚单位PegA蛋白结构和亲疏水情况，并在PegA中筛选到表面展呈效果最好的基序作为靶标抗原NA10的替代区域(展呈位点)。分析结果如表2所示，在Peg菌毛共筛选到5个表面展呈效果好的替代位点，由于上述筛选到的NA10均为亲水基序，因此根据5个替代序列的亲水性对替代位点进行评分，评分规则如下：序列中每存在一个疏水氨基酸-1分，每存在一个亲水氨基酸(包括极性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸)+1分，得分最高的序列作为替代NA10的基序，即NYTLNSSKFE，该序列亲水性评分达到6，包含8个亲水氨基酸，其基因序列为AATTACACTCTGAATTCAAGTAAGTTTGAA。
表2筛选到的Peg菌毛蛋白潜在替代TBEA的位点
由南京擎科生物科技有限公司合成peg(参考序列为Salmonella enterica SPstrain，GenBank登录号CP077668.1，1831920-1827125)和SARS-CoV-2-NA10嵌合基因，由SARS-CoV-2-NA10替代peg操纵子基因序列的替代位点AATTACACTCTGAATTCAAGTAAGTTTGAA，获得的嵌合基因命名为peg-SARS-CoV-2-AT30。以上述嵌合基因为模板(1μL，含1ng嵌合基因)，鸡白痢沙门氏菌标准株CVCC 526基因组作为阳性对照，禽致病性大肠杆菌分离株APEC-XM基因组和大肠杆菌工程菌DH5α基因组作为阴性对照，并用实施例1中提到的引物SPPegUp和SP Peg Down进行PCR扩增，PCR的体系和程序与实施例1中完全一致。配置1％的琼脂糖凝胶，110V电泳45min后利用溴化乙锭染色后在紫外成像仪下成像，PCR结果如图4所示，阳性对照的扩增大小为4850bp；peg-SARS-CoV-2-AT30的PCR产物为：4850bp；阴性对照无扩增条带。利用通用型DNA纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收peg-SARS-CoV-2-AT30的PCR产物的PCR扩增产物。
回收pBR322质粒，利用NheI和BamHI限制性内切酶(NEB)对pegA-SARS-CoV-2-AT30的PCR扩增产物与pBR322质粒分别进行双酶切，然后利用T4 DNA连接酶(NEB)对上述线性DNA片段在16℃金属浴中过夜连接，次日将连接产物转化DH-5α感受态细胞，通过涂布含100μg/mL的氨苄青霉素固体培养基进行抗性筛选。挑取平板上的单菌落接种至含100μg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中生长至平台期，回收质粒后经NheI、BamHI单酶切和两种限制性内切酶双酶切。配置1％的琼脂糖凝胶，110V电泳45min后利用溴化乙锭染色后在紫外成像仪下成像，结果如图5所示，重组质粒pBR-Peg-SARS-CoV-2-AT30的NheI和BamHI单酶切产物分别为9065bp；载体的双酶切产物包含4215bp的线性载体，以及4850bp的peg-SARS-CoV-2-AT30线性DNA片段，与预期大小一致。
携带重组质粒pBR-Peg-SARS-CoV-2一AT30的DH-5α工程菌在含100μg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中生长至平台期，4000rpm离心5min后弃上清，用等体积无菌生理盐水重悬，如此方式连续离心洗涤2次制备为细菌悬液(终浓度1×1010CFU/mL)。将携带上述重组质粒的重组DH-5α工程菌细菌悬液与SARS-CoV-2阴性血清(健康且未免疫新冠疫苗人血清10份)和SARS-CoV-2阳性血清(科兴、国药新冠灭活疫苗免疫志愿者血清各10份，新冠康复志愿者血清10份)分别进行凝集试验，并利用含pBR-Peg的DH-5α工程菌的细菌悬液作为阴性对照。结果如表3所示，所有菌株的细菌悬液均不与阴性血清发生反应；携带重组质粒pBR-Peg-SARS-CoV-2-AT30的重组DH-5α工程菌细菌悬液与阳性血清出现明显的凝集现象，凝集颗粒大，背景清晰；而仅含pBR-Peg质粒的DH-5α工程菌细菌悬液与阳性血清均不发生凝集现象，无凝集颗粒，背景呈浑浊状。该结果表明来自SARS-CoV-2刺突蛋白S的B细胞表位靶标抗原NA10能够通过Peg菌毛Peg实现菌体表面展呈表达，并且能够特异性检测针对SARS-CoV-2的凝集抗体。
在该抗体检测系统中，DH-5α+pBR-Peg细菌悬液作为对照系统，抗体检测系统仅增加NA10，专一识别与结合特异性抗体，排除非特异假阳性反应，从而确保个体精准诊断；DH-5α+pBR-Peg-SARS-CoV-2-AT30细菌悬液作为SARS-CoV-2特异性抗体检测系统，能够特异性识别针对SARS-CoV-2的凝集抗体。
表3载体菌DH-5α表面展呈表达Peg-SARS-CoV-2-AT30的功能验证
注：“-”代表凝集反应阴性；“+”代表凝集反应阳性
实施例3SARS-CoV-2凝集抗体检测系统的特异性和敏感性测试
基于载体菌DH-5检表面展呈表达Peg-SARS-CoV-2-TBEA的功能验证，进一步对SARS-CoV-2凝集抗体检测系统的特异性和敏感性测试，具体实施程序如下：
根据实施例2中的相同方法，准备对照系统DH-5α+pBR-Peg细菌悬液、SARS-CoV-2凝集抗体检测系统DH-5α+pBR-Peg-SARS-CoV-2-AT30细菌悬液。将上述四种细菌悬液分别与不同背景来源的血清进行凝集测试，以验证该凝集抗体检测系统的特异性，参与检测的血清包括：107份健康人(未免疫新冠疫苗)血清、30份国药新冠病毒灭活疫苗者血清、32份科兴新冠病毒灭活疫苗志愿者血清；50份新冠康复志愿者血清、30份健康食蟹猴血清、18份SARS-CoV-2的S蛋白免疫食蟹猴血清、3份健康SPF小鼠血清、10份非典病毒(SARS-CoV)的S蛋白免疫小鼠血清、10份中东呼吸综合征病毒(MERS-CoV)的S蛋白免疫小鼠血清、3份牛冠状病毒(BCV)感染牛血清、5份犬冠状病毒(CCV)感染犬血清、5份猫冠状病毒(FCV)感染猫血清、9份猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染猪血清、67份猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染猪血清和5份猪丁型冠状病毒(PDCoV)感染猪血清。检测结果如表4所示，30份国药新冠病毒灭活疫苗者血清、32份科兴新冠病毒灭活疫苗志愿者血清、50份新冠康复志愿者血清样品与对照系统不发生凝集，而与Peg-SARS-CoV-2-AT30凝集抗体检测系统均发生凝集反应；同时上述系统与全部健康人(未免疫新冠疫苗)血清、健康食蟹猴血清、SARS-CoV-2的S蛋白免疫食蟹猴血清、健康SPF小鼠血清、非典病毒(SARS-CoV)的S蛋白免疫小鼠血清、中东呼吸综合征病毒(MERS-CoV)的S蛋白免疫小鼠血清、牛冠状病毒(BCV)感染牛血清、犬冠状病毒(CCV)感染犬血清、猫冠状病毒(FCV)感染猫血清、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染猪血清、猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染猪血清和猪丁型冠状病毒(PDCoV)感染猪血清均不发生凝集反应，其特异性为100％。血清样品的凝集图见图7所示。
表4Peg-SARS-CoV-2-NA10凝集抗体检测系统的特异性验证
注：“-”代表凝集反应阴性；“+”代表凝集反应阳性
本发明的测试中，分别收集了未免疫新冠疫苗血清200份，免疫新冠疫苗(国药或科兴，下同)1天的血清97份，免疫新冠疫苗2天的血清75份，免疫新冠疫苗3天的血清98份，免疫新冠疫苗4天的血清201份，免疫新冠疫苗5天的志愿者血清195份，免疫新冠疫苗6天的志愿者血清199份，免疫新冠疫苗7天的志愿者血清200份，免疫新冠疫苗8天的志愿者血清215份，免疫新冠疫苗9天的志愿者血清204份，免疫新冠疫苗10天的志愿者血清199，免疫新冠疫苗11天的志愿者血清134份，免疫新冠疫苗12天的血清志愿者155份，免疫新冠疫苗13天的志愿者血清195份，免疫新冠疫苗14天的志愿者血清175份，免疫新冠疫苗15天的志愿者血清140份。这些血清来自SARS-CoV-2灭活疫苗和采集血样的志愿者，并且我们对志愿者的年龄和性别没有要求。
将上述2682份志愿者血清进行2n倍比稀释：在96孔板各孔中加入10μL无菌生理盐水，然后吸取10μL血清加入每一列的第一孔，与无菌生理盐水充分混合后将10μL稀释的血清加入下一孔，并以此为循环稀释至212倍。将每个稀释度的血清与对照系统DH-5α+pBR-Peg细菌悬液、SARS-CoV-2凝集抗体检测系统DH-5α+pBR-Peg-SARS-CoV-2-AT30细菌悬液分别进行凝集测试，最后一个出现凝集颗粒的稀释度作为该血清凝集抗体效价。凝集试验的阳性率结果如表5所示，接种者中最早可以在第6天检测到凝集抗体，该敏感性显著高于传统血清学检测技术，且随着免疫时长的增加，凝集测试的阳性率逐渐增加；定量测试结果如图8所示，在免疫后第11天，可测得凝集抗体效价达到1：16。
综上所述，本发明的SARS-CoV-2凝集抗体测试方法的特异性和敏感性好。与目前针对SARS-CoV-2的免疫学检测方法(胶体金、免疫发光、ELISA等)报道的结果比较，本技术的敏感性显著性提高，且能定量检测到特异性凝集抗体效价。
表5Peg-SARS-CoV-2-NA10凝集抗体检测系统的敏感性验证
综上所述，本发明提供新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合域(RBD)B细胞表位的靶标抗原NA10在鸡白痢沙门氏菌Peg菌毛展呈表达系统及其凝集抗体检测应用。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都要求在保护本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (6)
1.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是将靶标抗原的基因替代鸡白痢沙门氏菌Peg菌毛的主要亚单位PegA蛋白的亲水基序，构建得到的表达载体，编码所述靶标抗原的基因序列为AACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCT。
2.一种凝集抗体检测系统，其特征在于，所述凝集抗体检测系统还包括将权利要求1所述的重组表达载体导入载体菌中即得。
3.权利要求1所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）新型冠状病毒受体结合域B细胞表位的靶标抗原DNA序列的获得；所述DNA序列为AACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCT；
（2）将步骤（1）得到的DNA序列替代鸡白痢沙门氏菌Peg菌毛的主要亚单位PegA蛋白的亲水基序，构建表达载体。
4.权利要求2所述的凝集抗体检测系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）新型冠状病毒受体结合域B细胞表位的靶标抗原DNA序列的获得；所述DNA序列为AACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCT；
（2）将步骤（1）得到的DNA序列替代鸡白痢沙门氏菌Peg菌毛的主要亚单位PegA蛋白的亲水基序，构建表达载体；
（3）将步骤（2）得到的表达载体通过电转化的方式导入载体菌中即得。
5.权利要求1所述的重组表达载体或权利要求2所述的凝集抗体检测系统在制备检测新型冠状病毒凝集抗体的试剂或试剂盒中的应用。
6.一种检测新型冠状病毒凝集抗体的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括权利要求1所述的重组表达载体或权利要求2所述的凝集抗体检测系统。
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