CN104710537A - 柯萨奇病毒ca16 vp1重组抗原及其单克隆抗体与应用 - Google Patents

柯萨奇病毒ca16 vp1重组抗原及其单克隆抗体与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组柯萨奇病毒A16型(CA16)VP1重组抗原，是由SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示的8种氨基酸序列分别与柔性短肽氨基酸序列连接制得。本发明还公开了能与所述CA16VP1重组抗原特异性结合的单克隆抗体，以及所述重组抗原在制备A16型柯萨奇病毒抗原或抗体检测试剂盒中的应用。本发明提供的8个重组抗原和4组单克隆抗体具有高灵敏度、高特异性等特点，是可以作为研制柯萨奇CA16病毒检测试剂的关键原料。

Description

柯萨奇病毒CA16 VP1重组抗原及其单克隆抗体与应用
技术领域
本发明涉及一组柯萨奇病毒A16型(CA16)VP1重组抗原及其单克隆抗体与应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
手足口病(Hand foot mouth disease，HFMD)是由肠道病毒引起的一种全球性常见的急性传染病。该病多发生于5岁以下儿童，主要表现为口痛、厌食、低热、手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，少数患儿可引起心肌炎等并发症。个别重症患儿病情发展快，导致死亡。手足口病是由肠道病毒引起的传染病，引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)。目前国内爆发的手足口病以柯萨奇病毒A16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71)引起最为常见。以往研究多认为CA16引起的手足口病一般症状较轻，致使CV16的研究未能引起足够的重视，但其容易在儿童群体中引起暴发性流行。如果同时感染CA16和EV 71，20％患者可能出现重症炎症及伤害中枢系统造成后遗症。基于此，早发现CA16可有效降低该病毒传播风险，并有助于患者得到及时治疗。因此，研制CA16病毒检测试剂显得尤为重要。
柯萨奇病毒A16型是人类最早发现的柯萨奇A组病毒，1951年在南非被成功分离。该病毒基因组为单股正链RNA，全长约7410个核苷酸，基因组含一个开放读码框，编码一个多聚前体蛋白。该蛋白可进一步被水解成P1、P2、P3等3个前体蛋白。其中P1蛋白可分解为VP1、VP2、VP3和VP4四个外壳蛋白。VP1、VP2、VP3暴露在病毒衣壳蛋白的表面，具有大量抗原决定簇，而其中的VP1最主要的衣壳蛋白，其长度891bp，编码297个氨基酸残基，具有最多的特异性中和位点，因此，VP1蛋白的编码基因序列与病毒血清具有较高的相关性，常被用于病毒的鉴定和进化分析。
高相关的柯萨奇CA16 VP1重组抗原及其单克隆抗体是手足口病检测试剂制备的关键。近年来，基因工程的发展为研制CA16 VP1特异性抗原和单克隆抗体提供了良好基础。故加强研制新型柯萨奇CA16 VP1重组抗原及其单克隆抗体，对开发更加有效的早期诊断CA16病毒的方法和试剂盒具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于提供一组柯萨奇病毒A16型(CA16)VP1重组抗原及其单克隆抗体与应用。
本发明所述的一组柯萨奇病毒A16型(CA16)VP1重组抗原，其特征在于：所述重组抗原由SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示的8种氨基酸序列分别与柔性短肽氨基酸序列连接制得；其中，所述柔性短肽氨基酸序列是：GGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS或AAY，所述8种氨基酸序列分别与柔性短肽氨基酸序列连接时，每种氨基酸序列均重复3次。
进一步的，所述重组抗原为8种，其编号分别为CA16 VP1 1号～CA16 VP1 8号，其中CA16 VP1 1号～CA16 VP1 8号重组抗原的核苷酸序列分别依次如SEQ ID No.9～SEQ ID  No.16所示。
基于本发明人多年对全国不同疫区的病毒的研究，综合阅读国内外有关CA16文献，本申请选择CA16的VP1蛋白作为抗原靶位的主要研究对象。通过多种生物信息学数据库及生物信息学软件对VP1基因及其编码蛋白序列对比分析，考虑氨基酸序列亲水性，对VP1抗原表位预测，筛选得到CA16病毒8种潜在高交叉反应性的线性亲水表位氨基酸序列，合成基因重组表达，并经过实验验证具有高交叉反应，其氨基酸序列为：
VP1(1-15AA)SEQ ID NO1：GDPIADMIDQTVNNQ
VP1(26-40AA)SEQ ID NO2：LPTAANTEASSHRLG
VP1(47-61AA)SEQ ID NO3：LQAAETGASSNASDK
VP1(94-108AA)SEQ ID NO4：TMPTTGTQNTDGYVN
VP1(156-177AA)SEQ ID NO5：VPPGAPKPTSRDSFAWQTATNP
VP1(183-199AA)SEQ ID NO6：MTDPPAQVSVPFMSPAS
VP1(208-228AA)SEQ ID NO7：YPTFGEHLQANDLDYGQCPNN
VP1(274-293AA)SEQ ID NO8：KTNPNYKGNDIKCTSTSRDK
利用基因重组方法，将上述各线性表位序列分别加入柔性短肽连(GGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS或AAY)接在一起，可以获得具有高交叉反应的融合VP1抗原，即柯萨奇病毒A16型(CA16)VP1重组抗原。
本发明还提供了一组抗体，其特征在于：所述抗体是能分别与上述柯萨奇病毒A16型(CA16)VP1重组抗原特异性结合的单克隆抗体。
分别将上述表达纯化的柯萨奇病毒A16型(CA16)VP1重组抗原，利用常规单克隆抗体制备方法免疫小鼠(注射小鼠)，然后经纯化分离即得到分别与上述重组抗原特异性结合的单克隆抗体。本发明并通过ELISA进行两两配对的组合实验，获得了4组有效组合。
本发明所述柯萨奇病毒A16型(CA16)VP1重组抗原在制备A16型柯萨奇病毒抗原或抗体检测试剂盒中的应用。
本发明所述柯萨奇病毒A16型(CA16)VP1重组抗原可以用于开发体外检测样品中是否存在抗CA16病毒抗体的试剂盒或作为其他CA16检测产品的重要原料，或者可以用于开发体外检测样品中是否存在CA16病毒抗原的试剂盒或作为其他CA16检测产品的重要原料。对开发更加有效的早期诊断CA16的方法和试剂盒提供了基础。
与现有技术比，本发明技术具有以下特点：
1.筛选得到的VP1抗原是线性亲水表位，易于与患者血清中抗CA16病毒抗体发生特异性结合反应。运用本发明的特异性重组蛋白可用于免疫于兔、鼠等动物，制备单克隆抗体。
2.本发明得到的单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的各种技术进行制备(如杂交瘤技术)，亦可以通过小抗体技术制备Fab段。
3.本发明的重组抗原蛋白和抗体是高特异性、高灵敏度的优质生物原料，均可以直接 用于检测人血清中CA16病毒或抗CA16抗体，从而有利于CA16病毒感染早期筛查。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明范围。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1：候选抗原表位的选择
通过查找NCBI(美国国立生物技术信息中心，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，对CA16的共51条CA16序列进行分析，根据氨基酸序列的同源性，依次分筛选出8条各基因型序列保守的线性表位抗原序列。其氨基酸序列分别如表1所示。
表1本发明所述CA16VP1线性抗原表位序列
序号 氨基酸位点 氨基酸序列
1 1-15AA GDPIADMIDQTVNNQ
2 26-40AA LPTAANTEASSHRLG
3 47-61AA LQAAETGASSNASDK
4 94-108AA TMPTTGTQNTDGYVN
5 156-177AA VPPGAPKPTSRDSFAWQTATNP
6 183-199AA MTDPPAQVSVPFMSPAS
7 208-228AA YPTFGEHLQANDLDYGQCPNN
8 274-293AA KTNPNYKGNDIKCTSTSRDK
实施例2：CA16 VP1重组抗原的克隆与表达
1.CA16 VP1重组抗表达质粒的构建
1.1CA16 VP1重组抗原抗原的合成
根据上述8条CA16 VP1抗原氨基酸序列，并利用基因重组方法，将上述各CA16 VP1序列分别加入柔性短肽(GGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS或AAY)连接在一起(所述8种氨基酸序列分别与柔性短肽氨基酸序列连接时，每种氨基酸序列均重复3次)，采用大肠杆菌偏好密码子，将氨基酸序列翻译成核苷酸序列，分别在5’端和3’端引入EcoRI和HindIII两个酶切位点(见序列表)，并委托上海捷瑞生物工程有限公司合成上述CA16VP1抗原序列的基因。
1.2CA16VP1抗原表达质粒的构建
1.2.1CA16VP1抗原基因序列及表达载体pET28a的双酶切
取以上8条抗原合成基因产物及pET28a表达载体个30ul分别置于1.5ml Eppendorf离心管中，加入10×buffer 5ul、EcoRI(10U/ul)和HindIII(10U/ul)各3ul，加入灭菌蒸馏水4ul，置37℃水浴酶切3小时。酶切产物的琼脂糖凝胶电泳纯化和回收：合成基因及pET28a表达载体双酶切后产物按照TaKaRa DNA凝胶回收试剂盒产品说明书进行。
1.2.2连接：于灭菌Eppendorf离心管中加入上述酶切后的载体和目的基因各2ul、10×T4  DNA Ligase buffer 2ul、T4 DNA Ligase(5U/ul)1ul，加入灭菌蒸馏水至20ul，置16℃过夜。
1.2.3转化：在超净工作台中，用无菌吸头吸取100ul感受态细胞BL21(感受态细胞按照《分子克隆》(科学出版社，第三版)的方法进行)悬液于Eppendorf中，加入上述连接产物10ul，轻轻涡旋混匀，冰浴30分钟。立即转移到42℃水浴中放置2分钟，每管加入0.5ml LB培养基，37℃温箱振荡培养60分钟，吸取培养液涂布与LB培养基上(含抗生素)，置37℃温箱倒置培养过夜。
1.2.4阳性重组子的筛选：各挑取上述培养过夜的平皿中的单克隆菌落，接种于5ml LB液体培养基(含抗生素)中，37℃温箱振荡培养5小时。保存各单克隆菌液并提取质粒(按照《分子克隆》(科学出版社，第三版)的方法进行)。提取后的质粒用EcoRI和HindIII酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
2CA16VP1抗原的表达与纯化
2.1表达菌株的培养：分别取上述8条抗原的阳性表达菌株单克隆菌液20ul接种于100mlLB培养基中，37℃温箱振荡培养过夜。次日，按照1％接种比例转种于LB培养基，37℃温箱振荡培养3小时，当OD600值达到0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养，终浓度1mmol/L，37℃温箱振荡培养5小时。将菌液合并，6000rpm离心20分钟，弃上清，收集沉淀部分。
2.2提取包涵体：将沉淀称湿重，用10倍体积的20mmol/L，pH8.0Tris缓冲液将沉淀悬起，加入溶菌酶，在室温下磁力搅拌10分钟。在冰浴中超声破碎菌体。12000rpm，离心10分钟，其上清，沉淀用1mol/L NaCl洗1次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M尿素(用20mmol/L，pH8.0 Tris配制)溶解，加入1‰DTT，于4℃，12000rpm，离心10分钟，去沉淀取上清。
2.3纯化：将上述包涵体溶解液过S-Sepharose柱阶段梯度洗脱，用不同浓度的NaCl(用平衡器配制)洗脱，收集0.15M NaCl洗脱峰，再经Sephadex G50柱脱盐，收集第一个洗脱峰。
3CA16 VP1重组抗原活性鉴定
分别使用经过处理的实施例二制备的CA16 VP1重组抗原用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释到5.0ug/ml，包被，与50例病人(已确诊)的血清混合反应。结果表明，本发明的重组抗原可以识别患者血清中早期出现的针对CA16的特异性抗体，并与之结合，洗涤后加入羊抗人IgG-HRP(辣根过氧化物酶)酶联二抗，最后加入显色底物液，A450检测。
基于以上结果，将8种CA16 VP1重组抗原用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释到5.0ug/ml，包被ELISA测定板，经封闭后，对收集的180份CA16验证为阴性血清(其中包括部分HSV、腺病毒、RSV、麻疹病毒血清)进行测定。结果如表2所示。
表2：8种CA16 VP1抗原包被测定板检测血清结果
抗原编号 1 2 3 4 5 6 7 8
检出阳性例数 39 43 45 45 48 49 49 48
[0050] 
阴性样本检出例数 0 0 0 0 0 0 0 0
结果表明本发明8种抗原包被的酶联免疫吸附板没有假阳性出现。说明本发明重组抗原特异性良好。
实施例3：重组CA16 VP1抗原蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体
1.免疫抗原的制备：8种CA16 VP1重组抗原制备方法按照实施例2方法进行。 
2.小鼠免疫：用重组CA16 VP1蛋白进行BALB/c小鼠免疫。免疫程序：首次免疫取重组CA16VP1蛋白与弗氏完全佐剂混合乳化，免疫BALB/c小鼠，50ug/只，腹腔注射；间隔14天后进行第二次免疫：取重组VP1蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化，免疫BALB/c小鼠，50ug/只，腹腔注射；7天后采血，采用间接ELISA法测定CA16抗体活性。对检测抗体效价最高的小鼠不加佐剂，用重组CA16VP1蛋白进行静脉注射加强免疫。
3.细胞融合、细胞筛选与培养、制备腹水、抗体纯化均采用本领域技术人员所熟知的常规手段。
通过以上实验，本发明获得单克隆抗体共11个。分别将11个经纯化的单克隆抗体，采用经典过碘酸钠法进行HRP标记，标记后的抗体加等量甘油后-70℃保存。
利用实施例3获得的11个单克隆抗体和11个HRP标记的单克隆抗体采用双抗体夹心法进行两两配对组合检测CA16病毒抗原，得到A(5，3-HRP)、B(3，5-HRP)、C(3，7-HRP)，D(9，8-HRP)，共4组有效的组合，分别测得OD450>3.0。结果如表3。
表3单克隆抗体的优化组合
  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1-HRP - 1.113 1.650 1.222 1.569 1.301 1.232 1.457 1.667 1.369 1.594
2-HRP 1.621 - 1.345 1.221 1.454 1.356 1.842 1.751 1.488 1.052 1.337
3-HRP 0.869 1.521 - 1.399 3.200 0.723 1.648 1.775 1.653 1.412 1.511
4-HRP 0.562 2.254 1.632 - 1.637 1.745 1.366 1.740 1.128 1.475 1.026
5-HRP 1.634 1.345 3.482 1.412 - 2.001 1.334 1.454 1.266 1.758 2.465
6-HRP 1.587 1.354 1.474 1.685 1.800 - 1.036 1.384 1.721 1.430 1.231
7-HRP 1.247 1.388 3.336 1.752 1.213 1.665 - 1.364 1.550 1.698 1.759
8-HRP 1.400 1.945 1.644 1.632 1.453 1.512 2.102 - 3.376 1.520 1.566
9-HRP 1.399 1.489 1.597 1.333 1.548 1.497 1.847 1.359 - 1.874 1.647
10-HRP 1.564 1.597 1.578 1.369 1.662 1.097 1.488 1.694 1.770 - 1.333
11-HRP 1.748 1.522 1.634 1.151 1.357 1.429 1.457 1.903 1.384 1.598 -

Claims (4)

1.一组柯萨奇病毒A16型(CA16)VP1重组抗原，其特征在于：所述重组抗原由SEQ IDNo.1～SEQ ID No.8所示的8种氨基酸序列分别与柔性短肽氨基酸序列连接制得；其中，所述柔性短肽氨基酸序列是：GGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS或AAY，所述8种氨基酸序列分别与柔性短肽氨基酸序列连接时，每种氨基酸序列均重复3次。
2.如权利要求1所述的柯萨奇病毒A16型(CA16)VP1重组抗原，其特征在于：所述重组抗原有8种，其编号分别为CA16 VP1 1号～CA16 VP1 8号，其中CA16 VP1 1号～CA16VP1 8号重组抗原的核苷酸序列分别依次如SEQ ID No.9～SEQ ID No.16所示。
3.一组抗体，其特征在于：所述抗体是能分别与权利要求2所述柯萨奇病毒A16型(CA16)VP1重组抗原特异性结合的单克隆抗体。
4.权利要求1或2所述柯萨奇病毒A16型(CA16)VP1重组抗原在制备A16型柯萨奇病毒抗原或抗体检测试剂盒中的应用。
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