CN105219740A - 一种重组人3型腺病毒及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于重组病毒基因工程技术领域，具体涉及一种重组人3型腺病毒为载体的新型的肠道病毒71型（human？enterovirus71，EV71）-柯萨奇病毒A16型（CoxackievirusA16，CA16）-重组3型腺病毒(Had3)疫苗候选株及制备方法，所述人3型腺病毒六邻体上同时插入有EV71的中和表位SP70和CA16的中和表位VP1-1，所述EV71的中和表位SP70的氨基酸序列为YPTFGEHKQEKDLEYC，所述CA16的中和表位VP1-1的氨基酸序列为PKPTSRDSFAWQTAT，其具有可同时预防EV71和CA16，对预防手足口病有显著的效果。
Description
技术领域
本发明属于重组病毒基因工程技术领域，具体涉及一种重组人3型腺病毒为载体的新型的肠道病毒71型（humanenterovirus71,EV71）-柯萨奇病毒A16型（CoxackievirusA16,CA16）-重组3型腺病毒(Had3)疫苗候选株及制备方法。
背景技术
手足口病（hand，footandmouthdisease，HFMD）是由人类肠道病毒引起的以发热和手、足、口腔部位的皮疹或疱疹性咽峡炎为主要临床特征的一种急性传染病。HFMD主要在5岁以下儿童中高发，该病主要是由肠道病毒71型（humanenterovirus71，EV71）和柯萨奇病毒A16型（CoxackievirusA16，CA16）两种病原体引起的。该病近些年在世界各地均有流行报道，虽然临床上可以使用药物对症治疗，但无法控制本病的流行传播，每年高发期都会有大范围的传染病例出现。疫苗的使用被认为是控制病毒传播的最佳方法。
人3型腺病毒（HAdV3）疫苗也在发展之中，其经肠道免疫一般不引起病症，HAdV3也可以作为经肠道黏膜免疫的载体使用，其六邻体的高变区可以插入15个氨基酸的外源片段，这样将具有免疫活性的抗原片段展示的人3型腺病毒粒子的表面，随着病毒的复制，含有抗原片段的重组子就会不断复制，并且展示到人3型腺病毒粒子的表面的抗原片段具有一定的空间构象，具有更好的免疫原性。
中国公开专利201310043885.9，公开一种重组人3型腺病毒及其制备方法和应用，公开了在重组人3型腺病毒上插入EV71中和表位SP70和SP55，其能够同时预防EV71感染和HAdv3感染的预防，但是对于预防手足病依然无法做到有效的预防。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种重组人3型腺病毒，其具有可同时预防EV71和CA16，对预防手足口病有显著的效果。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种重组人3型腺病毒，所述人3型腺病毒六邻体上同时插入有EV71的中和表位SP70和CA16的中和表位VP1-1，所述EV71的中和表位SP70的氨基酸序列为YPTFGEHKQEKDLEYC,所述CA16的中和表位VP1-1的氨基酸序列为PKPTSRDSFAWQTAT。
其中，所述EV71的中和表位SP70的替换区为HAdv3六邻体的HVR1区，所述CA16的中和表位VP1-1的替换区为HAdv3六邻体的HVR2区。
其中，所述EV71的中和表位SP70的替换氨基酸序列为HVR1区的NRDNAV,所述CA16的中和表位VP1-1的替换氨基酸序列为HVR2区的TTEGEE。
一种人3型腺病毒-EV71-CA16的双价疫苗候选株，所述双价疫苗候选株含有权利要求1-3任一项所述的重组人3型腺病毒。
一种载体，所述载体包含上述的重组人3型腺病毒。
一种制备上述重组人3型腺病毒的方法，包括如下步骤：
在重组人3型腺病毒基因组E3区插入EV71的VP1蛋白表达框，人3型腺病毒六邻体上同时嵌入了EV71的中和表位SP70和CA16中和表位VP1-1，其中，所述EV71的中和表位SP70的氨基酸序列为YPTFGEHKQEKDLEYC，所述EV71的中和表位SP70的替换氨基酸序列为HVR1区的NRDNAV；所述的CA16中和表位VP1-1的氨基酸序列为PKPTSRDSFAWQTAT，所述的CA16中和表位VP1-1的替换氨基酸为HVR2区的TTEGEE。
一种重组人3型腺病毒的应用，所述双价疫苗候选株用于手足口病的预防。
本发明所提供的重组腺病毒，允许CA16中和表位个别氨基酸的缺失、替换或添加。但需要保持中和表位的免疫原性；允许被置换的HVR2区个别氨基酸的缺失、替换或添加，但需要保持腺病毒的稳定性，同时保证外源表位的免疫活性；本发明中嵌入的CA16表位不限于VP1-1，也可以是其他的保护性T细胞表位或B细胞表位，但需要保持腺病毒的稳定性和保证外源表位的免疫原性。
本发明的有益效果在于：本发明在六邻体衣壳上展示EV71中和表位的同时展示CA16的中和表位，该重组腺病毒可以产生抗CA16感染的免疫应答，多次免疫注射能加强免疫，该重组病毒可以同时预防EV71感染和CA16感染，对于预防手足口病具有显著的效果。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
本实施例中所述的Hadv3-EV71，使用的是Hadv3病毒株(全基因Genbank号：DQ099432)的六邻体的HRV1区插入EV71-08-02病毒株(全基因组序列Genbank号：FJ360545)的抗原表位序列，氨基酸序列无突变。
本实施例所使用的骨架质粒pBRAdSP70△E3GFP是利用中国公开专利，公开号CN103966263A中的制备方法得到的以HAdv3基因组为模板用重叠PCR方法获得的SP70（5’-tatcccacattcggagaacacaaacaggagaaagatcttgaatat-3’）的DNA序列替换HAdv3六邻体基因的HVR1相应序列的突变六邻体片段，然后利用ClaI+BamHI双酶切后连接至pBRH3S载体上，获得pBRSP70R1H3S穿梭载体，用EcoRI+SalI双酶切穿梭载体，与AvRII+PacI双酶切的骨架质粒pBRAd△E3GFP在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组，得到骨架质粒pBRAdSP70△E3GFP。
[0018]1：构建重组病毒载体
以HAdv3-EV71载体为模版，重叠PCR扩增含有CA16病毒主要中和抗原表位的六邻体片段，经过ClaI，BamHI双酶切后与经过ClaI，BamHI酶切后的穿梭质粒PBRLOR连接构建穿梭质粒，命名为PBRLOR-EV71-CA16。将构建好的穿梭质粒经过EcoRI，SalI双酶切与骨架质粒pBRAdSP70△E3GFP经过PacI，AvRII在BJ5183内同源重组，得到重组质粒pAdSP70R1VP1-1R2△E3GFP。所使用的引物见表1，CA16r为PCR筛选鉴定用特异引物。
表1重叠PCR法扩增外源表位嵌入的HAdv3-EV71六邻体基因使用的引物
| A3R2-CA16-1U： | GACATTACCCCGAAACCCACTTCCAGAGATTCGTTTGCTTGGCAGACTGCCACCAAGCCCATTTATGCCGATAAAAC |
| A3R2- CA16-1R： | AATGGGCTTGGTGGCAGTCTGCCAAGCAAACGAATCTCTGGAAGTGGGTTTCGGGGTAATGTCTTTCCCAATTTGCA |
| HEXONU: | AGGCTGAGTTGCTTTCAAGATGGCCACC |
| HEXONR: | CATGGGATCCACCTCAAAAGTCATGTCCAGC |
| CA16r | GATCTTTCTCCTGTTTGTGTTCTCC |
将上述重组得到的质粒pAdSP70R1VP1-1R2△E3GFP经过AsisI酶切线性化后转染AD293细胞，拯救包装得到重组病毒AdSP70R1VP1-1R2△E3GFP。大量培养并CsCl密度梯度离心纯化重组病毒粒子。经过纯化的病毒粒子达到1×1012VPs/ml，测定OD260/OD280比值约1.2-1.4，内毒素检测<10EU/ml。重组病毒AdSP70R1VP1-1R2△E3GFP在HEp-2细胞中连续传代10代后提取病毒基因组进行酶切鉴定、测序鉴定，表明重组病毒基因组保持稳定，没有基因缺少、重组现象。
2：重组病毒的免疫原性实验
制备抗血清，进行血清中和试验，验证重组病毒载体的免疫原性。将纯化的重组病毒AdSP70R1VP1-1R2△E3GFP肌肉注射免疫小鼠，得到多克隆血清，然后进行微量中和试验，以检测重组病毒产生的抗体是否具有体外中和EV71，CA16病毒的能力。
免疫3次后第14天采集的小鼠血清中和反应的实验结果见表2，表2为多次免疫小鼠血清中和效价，实验结果数据表明多次免疫后抗EV71病毒和抗CA16病毒的免疫应答均得到加强。
表2单次免疫血清中和效价
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种重组人3型腺病毒，其特征在于：所述人3型腺病毒六邻体上同时插入有EV71的中和表位SP70和CA16的中和表位VP1-1，所述EV71的中和表位SP70的氨基酸序列为YPTFGEHKQEKDLEYC,所述CA16的中和表位VP1-1的氨基酸序列为PKPTSRDSFAWQTAT。
2.根据权利要求1所述的一种重组人3型腺病毒，其特征在于：所述EV71的中和表位SP70的替换区为HAdv3六邻体的HVR1区，所述CA16的中和表位VP1-1的替换区为HAdv3六邻体的HVR2区。
3.根据权利要求2所述的一种重组人3型腺病毒，其特征在于：所述EV71的中和表位SP70的替换氨基酸序列为HVR1区的NRDNAV,所述CA16的中和表位VP1-1的替换氨基酸序列为HVR2区的TTEGEE。
4.一种人3型腺病毒-EV71-CA16的双价疫苗候选株，其特征在于：所述双价疫苗候选株含有权利要求1-3任一项所述的重组人3型腺病毒。
5.一种载体，其特征在于：所述载体包含权利要求1-3任一项所述的重组人3型腺病毒。
6.一种制备权利要求1-3任一项所述的重组人3型腺病毒的方法，其特征在于：包括如下步骤：
在重组人3型腺病毒基因组E3区插入EV71的VP1蛋白表达框，人3型腺病毒六邻体上同时嵌入了EV71的中和表位SP70和CA16中和表位VP1-1，其中，所述EV71的中和表位SP70的氨基酸序列为YPTFGEHKQEKDLEYC，所述EV71的中和表位SP70的替换氨基酸序列为HVR1区的NRDNAV；所述的CA16中和表位VP1-1的氨基酸序列为PKPTSRDSFAWQTAT，所述的CA16中和表位VP1-1的替换氨基酸为HVR2区的TTEGEE。
7.一种权利要求1-3任一项所述的重组人3型腺病毒的应用，其特征在于：所述双价疫苗候选株用于手足口病的预防。
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