CN104918952A - 表达屈曲病毒多肽的重组麻疹病毒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及表达屈曲病毒多肽的麻疹病毒，特别涉及在其表面含有屈曲病毒包膜和壳体蛋白的病毒样颗粒(VLP)。这些颗粒是施用后能在宿主中复制的重组感染性颗粒。本发明提供产生这些重组感染性颗粒的工具，特别是核酸、载体、细胞和拯救系统。本发明还涉及这些重组感染性颗粒，特别是以组合物形式，更特别是以疫苗剂型用于治疗或预防屈曲病毒感染的用途。

Description

表达屈曲病毒多肽的重组麻疹病毒及其应用
技术领域
本发明涉及表达屈曲(Chikungunya)病毒多肽的重组麻疹病毒，特别涉及在其表面含有屈曲病毒包膜和壳体蛋白的病毒样颗粒(VLP)。这些颗粒是施用后能在宿主中复制的重组感染性颗粒。本发明提供产生这些重组感染性颗粒的工具，特别是核酸、载体、细胞和拯救系统。本发明还涉及这些重组感染性颗粒，特别是以组合物形式，更特别是以疫苗剂型用于治疗或预防屈曲病毒感染的用途。
背景技术
屈曲病毒(CHIKV)是披膜病毒科(Togaviridae)家族甲病毒属(Alphavirus)的正链RNA病毒，于1952年在坦桑尼亚首次分离。
这种病毒的感染引起人类疾病，其特征在于与登革热类似的症状，具有2-5天的急性发热期，随后是长期的关节痛疾病，影响四肢的关节。CHIKV是非洲、印度和东南亚地方性的，通过伊蚊(Aedes mosquitoes)经都市或森林传播循环传播。2006年，印度洋的多个岛(科摩罗、毛里求斯、塞舌尔群岛、马达加斯加、留尼汪岛…)爆发了CHIKV热，随后波及印度，在印度据报道预计140万病例。最近，欧洲报道了输入性感染，意大利报道了约200例地方性病例(Jose,J.et al.,A structural and functional perspective ofalphavirus replication and assembly.Future Microbiol,2009.4(7):p.837-56)。临床上，该CHIKV流行伴随着比之前爆发更严重的症状，据报道有严重的多关节痛和肌痛、并发症和死亡。
CHIKV基因组是11.8kb的具有正极性的单链RNA分子。该病毒与西门利克森林病毒(SFV)、辛德毕斯病毒(SINV)和其他旧大陆甲病毒密切相关，而与新大陆甲病毒如委内瑞拉马脑炎病毒较为疏远(Griffin,D.E.,Alphaviruses,in Fields Virology,5th ed.,D.M.Knipe,Editor 2007,WoltersKluwer,Lippincott Williams&Wilkins.p.1023-1067)。基因组RNA经加帽并直接翻译成名为P1234的全长非结构聚蛋白(nsP)，其由基因组5′的三分之二编码(Jose,J.,J.E.Snyder,and R.J.Kuhn,A structural and functionalperspective of alphavirus replication and assembly.Future Microbiol,2009.4(7):p.837-56；Kuhn,R.J.,Togaviridae:the viruses and their replication,in FieldsVirology,5th ed.,D.M.Knipe,Editor 2007,Wolters Kluwer,LippincottWilliams&Wilkins.p.1001-1022)。该前体自我切割产生P123和具有RNA依赖的RNA聚合酶活性的nsP4。这些蛋白与细胞辅因子一起装配成产生反义基因组RNA分子的复制复合物。P123随后切割成nsP1和P23，产生制备有义和反义基因组RNA的聚合酶复合物。P23进一步切割成nsP2和nsP3，产生仅制备正义基因组RNA分子的聚合酶复合物。除了复制病毒基因组，该病毒蛋白复合物从病毒基因组的3′端转录26S亚基因组RNA。该信使RNA翻译为聚蛋白前体，其由病毒和细胞酶的组合切割产生壳体蛋白(C)、两个主要的包膜蛋白(E1和E2)以及两个较小的附属肽E3和6k。一旦装配，CHIKV病毒体为直径65–70nm的球形颗粒，基本上由与壳体蛋白相关的基因组RNA分子组成，并包被在宿主来源的脂膜中，其由组装成二十面体晶格的E1-E2异二聚体装饰(Voss,J.E.,et al.,Glycoprotein organization ofChikungunya virus particles revealed by X-ray crystallography.Nature,2010.468(7324):p.709-12)。
病毒演化和向新的地理区域传播所体现的疾病的严重性是需要应对的严重的公众健康问题。为了解决该问题，已经开发了具有减毒活病毒、具有嵌合甲病毒、具有重组DNA或具有病毒样颗粒的疫苗。
一种福尔马林失活疫苗经证实在非人灵长类和人中具有免疫原性，但需要在BSL-3条件下制备大规模免疫所需的大量抗原限制了该策略的发展(Tiwari,M.,et al.,A ssessment of immunogenic potential of Vero adaptedformalin inactivated vaccine derived from novel ECSA genotype ofChikungunya virus.(Vaccine,2009.27(18):p.2513-22)。由美国陆军开发的减毒活TSI-GSD-218CHIKV疫苗具有免疫原性，但在II期临床试验中产生与毒力回复有关的副作用，引发安全问题。因此，尽管基于获得减毒活病毒的疫苗所获结果表明通过这种方式能获得有效的免疫，这些疫苗仍旧受到质疑，因为存在可能副作用的风险(Edelman R et al.,Am J Trop Med Hyg.2000Jun；62(6):681-685)。编码来自CHIKV的E1、E2和壳体蛋白的嵌合甲病毒疫苗策略在小鼠中具有免疫原性(Wang,E.,et al.,Chimeric alphavirusvaccine candidates for Chikungunya.(Vaccine,2008.26(39):p.5030-9)，但甲病毒易于重组的能力产生了影响这些策略发展的安全问题(Weaver,S.C.,etal.,Recombinational history and molecular evolution of western equineencephalomyelitis complex alphaviruses.J Virol,1997.71(1):p.613-23)。
另一种已开发的策略是设计重组DNA构建体用作疫苗。编码E1、E2和壳体蛋白的基于DNA的CHIKV疫苗已被证实在小鼠和非人灵长类中具有免疫原性(Muthumani,K.,et al.,Immunogenicity of novel consensus-basedDNA vaccines against Chikungunya virus.Vaccine,2008.26(40):p.5128-34；Mallilankaraman,K.,et al.,A DNA vaccine against chikungunya virus isprotective in mice and induces neutralizing antibodies in mice and nonhumanprimates.PLoS Negl Trop Dis,2011.5(1):p.e928)，但DNA策略不引发清除人中CHIKV所需的强烈的中和性免疫应答。DNA疫苗的缺陷在于需要大量DNA引发免疫应答，并且必须进行多次加强接种。对多次加强以及大量DNA注入许多细胞的核内的需求引发对于DNA疫苗能够整合入宿主DNA并造成插入突变的忧虑。因此，最近一项研究报道了将DNA疫苗与减毒活病毒组合使用(WO2011/082388)。尽管该技术允许减少减毒活病毒与DNA疫苗的缺点，但仍然存在提供副作用降低的疫苗的需求。
为了避免减毒活病毒与DNA疫苗的缺点，已经开发了其他类型的疫苗，例如基于病毒样颗粒(VLP)的疫苗，其通过表达屈曲病毒结构蛋白获得。这些结构蛋白能在病毒样颗粒中自装配。在此基础上，已经开发了包含编码所有屈曲病毒结构蛋白的多核苷酸的疫苗(Akahata,W.,et al.,A virus-likeparticle vaccine for epidemic Chikungunya virus protects nonhuman primatesagainst infection.Nat Med,2010.16(3):p.334-8)。然而，体外产生的VLP制备昂贵，并且完全免疫需要三次施用，因此这些疫苗价格不菲。Akata et al.中公开的CHIKV VLP策略需要用佐剂进行几次免疫以诱导保护。出于这个原因，仍然存在设计改进的疫苗的需求，所述疫苗能够使CHIKV VLP在感染的细胞，特别是感染的宿主细胞中体内产生，并由此提供有效而持久的免疫，所述疫苗尤其是仅在单次或两次施用步骤后诱导持久的免疫。
发明概述
为此，本发明人实现了产生基于重组感染性复制麻疹病毒的疫苗，所述麻疹病毒由编码屈曲病毒抗原的多核苷酸重组，当重组病毒在施用后特别是在宿主中复制时回收所述疫苗。因此，本发明涉及基于广泛使用的施瓦兹(Schwarz)小儿麻疹疫苗的活CHIKV疫苗活性成分。在优选实施方案中，该重组活MV-CHIKV疫苗通过在感染细胞中复制产生CHIK病毒样颗粒。
麻疹病毒是副粘液病毒科(Paramyxoviridae)家族麻疹属(Morbilivirus)的不分节单链反义包被RNA病毒。该病毒分离于1954年(Enders,J.F.,and T.C.Peebles.1954.Propagation in tissue cultures of cytopathogenic agents frompatients with measles.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.86:277-286.)，减毒活疫苗来源于该病毒，由此产生疫苗株，并且特别来自施瓦兹株。过去30年麻疹疫苗已施用于数亿儿童，其效力和安全性已经证实。其在许多国家大规模生产并低价分配。出于所有这些原因，本发明人使用减毒麻疹病毒产生稳定表达屈曲病毒结构抗原的重组麻疹病毒颗粒，特别是VLP。
因此，本发明涉及核酸构建体，其包含编码至少一种屈曲病毒(CHIKV)结构抗原的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接、特别是克隆入编码麻疹病毒(MV)全长、感染性反基因组(antigenomic)(+)RNA链的cDNA分子中。
本发明的核酸构建体特别是纯化的DNA分子，由可操作共同连接的各种不同来源的多核苷酸重组获得或可获得。
表述“可操作地连接”指本发明核酸构建体的不同的多核苷酸之间存在的功能性连接，由此所述不同的多核苷酸和核酸构建体有效转录，并且在适当的情况下翻译，特别是在细胞或细胞系中，尤其是在用作拯救系统的一部分产生本发明的嵌合感染性MV颗粒的细胞或细胞系中或宿主细胞中。
在本发明的具体实施方案中，通过将编码一个或多个CHIKV结构蛋白的多核苷酸克隆入编码麻疹病毒全长反基因组(+)RNA的cDNA分子中而制备构建体。可选择地，本发明的核酸构建体可以使用核酸片段合成或由模板聚合，包括通过PCR的步骤制得。
在本发明的具体实施方案中，编码至少一个CHIKV蛋白的多核苷酸或每个这些多核苷酸被克隆入插入到麻疹病毒cDNA中的ATU(额外转录单元)中。ATU序列是技术人员已知的，用于克隆入MV的cDNA的步骤，包括转基因的MV依赖的表达所必需的顺式作用序列，例如在MV cDNA中位于插入物之前的基因启动子，所述插入物由掺入多克隆位点盒的编码CHIKV蛋白的多核苷酸代表。
当用于进行本发明时，ATU有利地定位于编码MV反基因组全长(+)RNA链的cDNA分子的N末端序列中，并且尤其定位于该病毒的P和M基因之间或H和L基因之间。经观察，MV的病毒RNA转录遵循从5’向3’端的梯度。这解释了当插入cDNA编码序列的5’端时，ATU会使得其含有的异源DNA序列(例如编码至少一种CHIKV结构蛋白的多核苷酸)更有效的表达。
因此编码至少一种CHIKV结构蛋白的多核苷酸可以插入麻疹病毒cDNA分子任意的基因间的区域中，特别是ATU中。本发明具体的构建体如实施例中所例示。
在具体实施方案中，当几种不同的多核苷酸存在于DNA构建体中时，这些编码至少一种CHIKV结构蛋白的多核苷酸的每一个可以插入MVcDNA的不同位点中，可能是麻疹病毒cDNA的不同ATU中。
在本发明的优选实施方案中，编码至少一种CHIKV结构蛋白的多核苷酸插入麻疹病毒cDNA分子的P和M基因的基因间的区域中，特别是ATU中。
用于本申请的表述“编码”限定核酸分子在选择的细胞或细胞系中转录以及(如果适合)翻译以进行产物表达的能力。相应地，本发明的核酸构建体可以包含控制编码序列转录的调控元件，特别是转录启动子和终止序列，以及可能的增强子和其他顺式作用元件。这些调控元件可以是与CHIK多核苷酸序列异源的。
术语“蛋白”与术语“抗原”或“多肽”可互换使用，限定由氨基酸残基连接产生的分子。特别地，本申请中公开的蛋白源自CHIKV并且是结构蛋白，其可与天然蛋白相同或可选地可由天然蛋白经突变衍生，包括取代(特别通过保守氨基酸残基)或添加氨基酸或翻译后二次修饰，或缺失部分天然蛋白产生相对于作为参考的天然蛋白具有缩短尺寸的片段。本发明包含具有适于在宿主特别是人宿主中引发免疫应答的天然蛋白的表位的片段，优选该应答能够防止CHIKV感染或CHIKV相关疾病。表位特别是B型表位，通过在蛋白施用的宿主中或其在施用本发明的感染性复制颗粒后表达该蛋白的宿主中激活抗体产生，参与引发体液免疫应答。可选地，表位可以是T型表位，参与引发细胞介导的免疫应答(CMI应答)。片段可以具有代表多于50％的CHIKV天然蛋白氨基酸序列尺寸的尺寸，优选至少90％或95％。可选地，片段可以是具有至少10个氨基酸残基的短多肽，其具有天然蛋白的表位。就这一点来说，片段也包括本文限定的多表位。
在本发明的具体实施方案中，在核酸构建体中编码MV全长感染性反基因组(+)RNA链的核苷酸序列的cDNA符合麻疹病毒基因组的6倍规则(rule of six)。
麻疹病毒基因组的组构及其复制和转录过程已被现有技术充分确认，尤其是公开于Horikami S.M.和Moyer S.A.(Curr.Top.Microbiol.Immunol.(1995)191,35-50或Combredet C.et al(Journal of Virology,Nov 2003,p11546-11554)的病毒施瓦兹接种毒株，或Neumann G.et al(Journal ofGeneral Virology(2002)83,2635-2662)中广泛认定的反义RNA病毒。
“6倍规则”是指代表MV(+)链RNA基因组的核酸或包含MV(+)链RNA基因组的核酸构建体中存在的核苷酸总数是6的倍数。“6倍规则”已被本领域认为是麻疹病毒基因组中有关核苷酸总数的要求，其使得MV基因组RNA有效或优化复制。在限定满足6倍规则的核酸构建体的本发明的实施方案中，所述规则适用于限定编码全长MV(+)链RNA基因组的cDNA的核酸构建体。就此，6倍规则单独适用于编码麻疹病毒全长感染性反基因组(+)RNA链的核苷酸序列的cDNA，但不必适用于克隆入所述cDNA并编码一或多种CHIKV蛋白的多核苷酸。
根据本发明的具体方面，核酸构建体包含以下基因转录单元，由5'到3'包含：
(a)编码MV的N蛋白的多核苷酸，
(b)编码MV的P蛋白的多核苷酸，
(c)编码至少一种CHIKV结构蛋白的多核苷酸，
(d)编码MV的M蛋白的多核苷酸，
(e)编码MV的F蛋白的多核苷酸，
(f)编码MV的H蛋白的多核苷酸，和
(g)编码MV的L蛋白的多核苷酸，
所述多核苷酸和核酸构建体可操作地连接，并受病毒复制和转录调控序列如MV先导序列和尾随序列控制。
表述“N蛋白”、“P蛋白”、“M蛋白”、“F蛋白”、“H蛋白”和“L蛋白”分别指麻疹病毒的核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和RNA聚合酶大蛋白(L)。这些成分在现有技术中已经鉴定，并特别公开于Fields,Virology(Knipe&Howley,2001)。
在本发明的优选实施方案中，编码麻疹病毒全长感染性反基因组(+)RNA链的cDNA分子具有MV减毒株的特征或获自MV减毒株。
麻疹病毒的“减毒株”定义为在相同宿主中无毒或比母株低毒的毒株，施用于宿主时保留免疫原性以及可能的佐剂性，即保留免疫显性的T和B细胞表位以及可能的佐剂性例如诱导T细胞共刺激蛋白或细胞因子IL-12。
麻疹病毒的减毒株相应地指在选取的细胞上经系列传代并且可能地，适应于其他细胞以产生适于制备疫苗株的种子毒株的毒株，其具有不允许回复到病原性也不整合入宿主染色体的稳定基因组。作为具体的“减毒株”，经确证的用于疫苗的毒株是适于本发明的减毒株，其满足FDA(美国食品和药物管理局)限定的规则，即经过对实验室和临床数据严格的审阅后，其满足安全性、效力、质量和重复性规则(www.fda.gov/cber/vaccine/vacappr.htm)。
可用于实施本发明并尤其获得核酸构建体的MV cDNA的具体毒株是施瓦兹MV毒株、萨格勒布(Zagreb)毒株、AIK-C毒株和Moraten毒株。所有这些毒株均已在现有技术中记载并可获得，特别是用作商业化疫苗。
根据本发明的具体实施方案，cDNA分子位于异源表达控制序列的控制下。
当在具有cDNA的天然控制序列不能使该cDNA完全转录的细胞类型中寻求该cDNA的表达时，插入该cDNA表达控制是有利的。
根据本发明的具体实施方案，异源表达控制序列包含T7启动子和T7终止子序列。这些序列各自定位于MV的全长反基因组(+)RNA链的编码序列的5’和3’并与该编码序列周围的序列相邻。
在本发明的具体实施方案中，如上限定的cDNA分子经修饰，即包含额外的核苷酸序列或基序。
在优选实施方案中，本发明的cDNA分子在其5’端(与编码MV确证疫苗株的全长反基因组(+)RNA链的核苷酸序列的第一个核苷酸相邻)进一步包含GGG基序，其后是锤头状的核酶序列，并且在其3’端(与编码全长反基因组(+)RNA链的所述核苷酸序列的最后一个核苷酸相邻)包含核酶序列。肝炎delta病毒核酶(δ)适于进行本发明。
位于5’端，与上述编码序列的第一个核苷酸相邻的GGG基序改善所述cDNA编码序列的转录效率。为了麻疹病毒颗粒的适当装配，编码反基因组(+)RNA的cDNA应符合6倍规则，当添加GGG基序时，在cDNA编码序列的5’端还添加核酶，其位于GGG基序的3’端，从而能够在MV的全长反基因组(+)RNA链的第一编码核苷酸处切割转录物。
在本发明的具体实施方案中，为了制备本发明的核酸构建体，通过已知方法实现编码现有技术中公开的麻疹病毒全长反基因组(+)RNA的cDNA分子的制备。所述cDNA插入载体例如质粒中时，特别提供基因组载体。
适于制备本发明核酸构建体的具体cDNA分子是使用麻疹病毒施瓦兹毒株获得的cDNA分子。相应地，用于本发明的cDNA可以如WO2004/000876中公开获得，或由CNCM的巴斯德研究所保藏的质粒pTM-MVSchw(保藏号I-2889，保藏日期2012年6月12日)获得，其序列于WO2004/000876中公开，通过引用并入本文。质粒pTM-MVSchw获自Bluescript质粒并包含位于T7RNA聚合酶启动子控制下的编码施瓦兹毒株全长麻疹病毒(+)RNA链的多核苷酸。其具有18967个核苷酸，序列如SEQID NO:1所示。来自其他MV毒株的cDNA分子(为了方便，也命名为麻疹病毒cDNA或MV cDNA)可类似地由例如本文所述的减毒MV的病毒颗粒纯化的核酸获得。
本发明的核酸构建体适合并用于制备重组感染性复制麻疹-屈曲病毒(MV-CHIKV)，并且相应地，所述核酸构建体用于插入转移基因组载体，由此其包含麻疹病毒尤其是施瓦兹毒株的cDNA分子，用于产生所述MV-CHIKV病毒和产生CHIKV结构蛋白，特别是CHIKV VLP。pTM-MVSchw质粒适于制备转移载体，通过插入CHIKV结构蛋白，特别是CHIKV VLP表达所必需的CHIKV多核苷酸。
本发明因此涉及转移载体，当从辅助细胞拯救(rescue)时，其用于制备重组MV-CHIKV颗粒。本发明的转移载体最好是质粒，特别是获自Bluescript质粒的质粒。
本发明还涉及转移载体转化适于拯救病毒MV-CHIKV颗粒的细胞的用途，特别是分别使用质粒或含有本发明核酸构建体的病毒载体转染或转导所述细胞，根据表达所需麻疹病毒蛋白的能力选择所述细胞，所述麻疹病毒蛋白用于病毒重组基因组的适当复制、转录和壳体化，其对应于重组感染性复制MV-CHIKV颗粒中的本发明的核酸构建体。
本发明还涉及由本发明的转移载体和提供辅助功能和蛋白的其他多核苷酸转化的细胞或细胞系。
因此多核苷酸位于所述细胞中，其编码特别包括麻疹病毒N、P和L蛋白的蛋白(即能够形成核糖核蛋白(RNP)复合物的天然MV蛋白或其功能性变体)，优选作为稳定表达的蛋白，至少在重组病毒MV-CHIKV颗粒的转录和复制中起作用的N和P蛋白。N和P蛋白可以在细胞中由包含其编码序列的质粒表达，或可以由插入细胞基因组中的DNA分子表达。L蛋白可以由不同的质粒表达。其可以暂时表达。辅助细胞也能表达RNA聚合酶，其适于合成来自本发明的核酸构建体的重组RNA，可能作为稳定表达的RNA聚合酶。RNA聚合酶可以是T7噬菌体聚合酶或其核形式(nlsT7)。
在一个实施方案中，麻疹病毒的cDNA克隆来自与N蛋白和/或P蛋白和/或L蛋白相同的麻疹病毒毒株。在另一个实施方案中，麻疹病毒的cDNA克隆来自与N蛋白和/或P蛋白和/或L蛋白不同的病毒毒株。
本发明因此涉及制备重组感染性麻疹病毒颗粒的方法，包含：
1)在辅助细胞系中转移，特别是转染本发明的核酸构建体或含有该核酸构建体的转移载体，所述辅助细胞系还在病毒颗粒能够装配的条件下由MV的cDNA表达蛋白，所述蛋白是MV的反基因组(+)RNA序列转录、复制和壳体化所必需的；以及
2)回收表达至少一种CHIKV结构蛋白的重组感染性MV-CHIKV病毒。
根据具体实施方案，该方法包含：
1)用转移载体转移将根据本发明的核酸构建体转染辅助细胞系，其中所述辅助细胞能够表现辅助功能以表达RNA聚合酶，并表达MV病毒的N、P和L蛋白；
2)将步骤1)的所述转染的辅助细胞与适于cDNA来源的MV减毒株传代的传代细胞共培养；
3)回收表达至少一种CHIKV结构蛋白的重组感染性MV-CHIKV病毒。
根据本发明另一具体实施方案，产生重组感染性MV-CHIKV病毒的方法包含：
1)用本发明的核酸构建体和包含编码麻疹病毒RNA聚合酶大蛋白(L)的核酸的载体重组细胞或细胞培养物，其稳定产生RNA聚合酶、麻疹病毒的核蛋白(N)和麻疹病毒的聚合酶辅因子磷蛋白(P)；以及
2)从所述重组细胞或重组细胞培养物中回收感染性MV-CHIKV病毒。
根据所述方法的一个具体实施方案，产生重组MV，其表达CHIKV结构蛋白，特别是CHIKV VLP，其中所述颗粒表达抗原组合，例如CHIK病毒的CE3E26KE1抗原。作为示例，拯救表达CHIKV结构蛋白，特别是CHIKV VLP的重组MV的方法包含以下步骤：
1)用(i)转移载体，特别是质粒，其包含编码麻疹病毒的全长反基因组(+)RNA的cDNA，与编码CHIKV结构蛋白，例如编码CHIKV-CE3E26KE抗原的至少一种多核苷酸重组，以及(ii)载体，特别是编码MV L聚合酶cDNA的质粒，共转染稳定表达T7RNA聚合酶以及麻疹N和P蛋白的辅助细胞，特别是HEK293辅助细胞；
2)在能够产生MV-CHIKV重组病毒的条件下培养所述共转染的辅助细胞；
3)通过将步骤2)的所述辅助细胞与能够使病毒增殖的细胞例如Vero细胞共培养，增殖由此产生的重组病毒；
4)回收复制的MV-CHIKV重组病毒和CHIKV结构蛋白，特别是CHIKV病毒样颗粒，特别是CHIKV-CE3E26KE1VLP。
该方法与所用构建体和条件一同例示于图1B。
用于本文，“重组”指将至少一种多核苷酸引入细胞，例如以载体形式，所述多核苷酸整合(整体或部分)或不整合入细胞基因组(例如上述)。
根据具体实施方案，重组可用第一多核苷酸获得，其为本发明的核酸构建体。重组还能或可选择地包括引入多核苷酸，其为编码麻疹病毒RNA聚合酶大蛋白(L)的载体，其定义、性能和表达稳定性已在本文描述。
根据本发明，稳定产生RNA聚合酶、麻疹病毒的核蛋白(N)和麻疹病毒的聚合酶辅因子磷蛋白(P)的细胞或细胞系或细胞培养物是本说明书中限定的细胞或细胞系或本说明书中限定的细胞培养物，即也是重组细胞，其经导入上述一或多种多核苷酸而修饰。在本发明的具体实施方案中，稳定产生RNA聚合酶、N和P蛋白的细胞或细胞系或细胞培养物不产生麻疹病毒的L蛋白或不稳定产生麻疹病毒的L蛋白，例如暂时表达或产生L蛋白。
本发明MV-CHIKV病毒的产生可涉及如本文所述转化细胞的转移。本文所用“转移”指将重组细胞置于不同类型的细胞上，尤其是置于不同类型细胞的单层上。后面这些细胞能够支持感染性MV-CHIKV病毒的复制和产生，即分别在胞内形成感染性病毒，以及可能的将这些感染性病毒释放到胞外。该转移造成本发明的重组细胞与前句限定的感受态细胞共培养。当重组细胞并非有效的病毒产生培养物时，即当感染性MV-CHIKV不能从这些重组细胞有效回收时，上述转移可以是额外即任选步骤。该步骤在本发明的重组细胞与本发明的核酸构建体，以及任选地包含编码麻疹病毒RNA聚合酶大蛋白(L)的载体进一步重组之后引入。
在本发明的具体实施方案中，需要转移步骤，因为通常因其便于重组的能力所选择的重组细胞并不足以有效支持并产生重组感染性MV-CHIKV病毒。在所述实施方案中，上述方法步骤1)的细胞或细胞系或细胞培养物是根据本发明的重组细胞或细胞系或重组细胞培养物。
适于制备本发明的重组细胞的细胞是原核或真核细胞，特别是动物或植物细胞，更特别是哺乳动物细胞例如人细胞或非人哺乳动物细胞或禽类细胞或酵母细胞。在具体实施方案中，在其基因组重组前，细胞分离自原代培养物或细胞系。本发明的细胞可以是分裂或不分裂细胞。
根据优选实施方案，辅助细胞来自人胚肾细胞系293，该细胞系293保藏于ATCC，保藏号CRL-1573。具体的细胞系293是在WO2008/078198中公开的细胞系，并在后续实施例中引用。
根据该方法的另一个方面，适于传代的细胞是CEF细胞。CEF细胞可由受精鸡蛋制得，所述鸡蛋获自EARL Morizeau，8rue Moulin，28190Dangers，France，或任意其他受精鸡蛋生产商。
本发明公开的方法有利地用于生产适于用作免疫组合物的感染性复制MV-CHIKV病毒。
本发明因此涉及免疫原性组合物，其活性成分包含从本发明的核酸构建体拯救的感染性复制MV-CHIKV病毒，并且特别地由所公开的方法获得。
如本文所限定，本发明的核酸构建体和本发明的MV-CHIKV病毒编码或表达至少一种CHIKV结构蛋白。
“屈曲病毒结构蛋白”是指本文所限定的“蛋白”，其序列与CHIKV毒株中的对应物相同，包括多肽，其为天然成熟的CHIKV结构蛋白或CHIKV结构蛋白前体，或如本文所限定的其片段或其突变体，特别是与天然存在的屈曲病毒壳体或包膜蛋白具有至少50％、至少80％、特别有利地至少90％或优选至少95％氨基酸序列相同性的片段或突变体。氨基酸序列相同性可由本领域技术人员使用手动比对或使用各种可用的比对程序(例如，BLASTP–http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)经比对确定。本发明CHIKV结构蛋白的片段或突变体可相对于本文例示的具体氨基酸序列来限定。
根据本发明，编码至少一种CHIKV结构蛋白的多核苷酸编码一或多种以下蛋白：结构糖蛋白、结构多肽和壳体蛋白。
在具体实施方案中，糖蛋白包含包膜糖蛋白E1、E2和E3包膜糖蛋白。多肽包含6K多肽和壳体蛋白。在以下段落中，术语蛋白或糖蛋白可互换用于命名E1、E2或E3糖蛋白或其组合。
根据本发明的具体实施方案，编码CHIKV结构蛋白的多核苷酸选自以下组：
-编码E1、E2、E3、6K或C蛋白之一的多核苷酸；
-编码选自E1、E2、E3、6K和C蛋白的几个蛋白的融合多核苷酸；
-编码E3-E2-6K-E聚蛋白的多核苷酸；
-编码C-E3-E2-6K-E1聚蛋白的多核苷酸以及特别是来自CHIKV基因组或编码所述聚蛋白的对应cDNA的开放读码框(ORF)；
-任意这些多核苷酸，其经修饰以编码一或多种这些蛋白的突变形式，特别是E2蛋白的突变形式。
就这一点来说，具体的多核苷酸编码可溶形式的E2蛋白(sE2)或编码E2蛋白的胞外域(ectodomain)或其可溶形式(sE2Δstem)。在具体实施方案中，多核苷酸编码以下多肽之一：E3-sE2-6K-E1、E3-sE2Δstem-6K-E1、C-E3-sE2-6K-E1和C-E3-sE2Δstem-6K-E1。
用于本文，术语“胞外域”指糖蛋白E2的结构域，其延伸出病毒颗粒，负责在CHIKV病毒颗粒感染过程中附着并进入细胞。
根据具体实施方案，多核苷酸编码CHIKV结构蛋白的单个表位或编码由一或多个CHIKV结构蛋白的重复表位(具有相同或相似序列)或多个不同表位表达产生的多表位。
举例来说，多表位由编码定位于E2糖蛋白N末端、与弗林蛋白酶E2/E3切割位点临近的E2EP3单个表位的重复多核苷酸融合形成。E2EP3表位的氨基酸序列在Kam Y.W et al.(EMBO Mol Med 4,330-343)中公开，即SEQID NO:33。
根据本发明的具体实施方案，几种多核苷酸(其中每种多核苷酸编码至少一种CHIKV结构蛋白)组合或融合以形成编码几种CHIKV结构蛋白的多核苷酸。这些多核苷酸可以彼此不同，其编码不同毒株的CHIKV的蛋白。由此，多核苷酸编码本文所述多表位，例如单个E2EP3表位的多表位。
编码至少一种CHIKV结构蛋白的多核苷酸克隆在cDNA分子(编码麻疹病毒的全长感染性反基因组(+)RNA链)中，可能在不同位点，以产生本发明的核酸构建体。
根据本发明的一个方面，编码至少一种屈曲病毒(CHIKV)结构蛋白的多核苷酸来自分离和纯化的野生CHIKV毒株的基因组。野生CHIKV毒株可以是例如Ross毒株(GenBank:AF490259.3)，或S27毒株(GenBank:AF339485.1)，二者均在1952年坦桑尼亚爆发期间分离自患者，或在1983年塞内加尔爆发期间分离的名为Ae.furcifer(GenBank:AY726732.1)的毒株。
根据本发明另一方面，编码至少一种CHIKV结构蛋白的多核苷酸来自以下纯化和分离的野生CHIKV毒株：05.61、05.115、05.209、06.21、06.27和06.49，其在WO2007/105111中有记载。这些代表屈曲病毒印度洋爆发的不同地理起源、时间点和临床形式的CHIKV分离物的几乎完整的基因组序列已经测序并在WO2007/105111中公开。确定了11,601个核苷酸，对应于用作参考的1952年坦桑尼亚分离物S27的核苷酸序列(全长11,826nt)中的位置52(5'NTR)至11,667(3'NTR，3个重复序列片段的末端)。
WO2007/105111中出现的分离物05.61、05.115、05.209、06.21、06.27和06.49的基因组序列以及本发明的具体实施方案中可来源于此的根据本发明的多核苷酸如下组构。编码序列由分别编码非结构聚蛋白(2,474个氨基酸)和结构聚蛋白(1,248个氨基酸)的7,422nt和3,744nt的两个大开放读码框(ORF)组成。非结构聚蛋白是蛋白nsP1(535aa)、nsP2(798aa)、nsP3(530aa)和nsP4(611aa)的前体，结构聚蛋白是蛋白C(261aa)、p62(487aa，E3(64aa)和E2(423aa)的前体)、6K(61aa)和E1(439aa)的前体。作为甲病毒家族特征的非结构和结构聚蛋白中的切割位点是保守的。E3、E2和E1中的糖基化位点也保守。公开的基因组序列通过引用并入本文。
根据一个实施方案，编码CHIKV结构蛋白的多核苷酸来自如前所述名为06.115、06.21、06.27和06.49的野生CHIKV毒株的基因组。
出现在多核苷酸定义中的术语“来自”仅表明所述多核苷酸的序列可以与CHIKV毒株中的对应序列相同，或可以不同，以编码满足本发明“蛋白”定义的CHIKV结构蛋白。相应地，该术语不限制多核苷酸的产生模式。
本发明的多核苷酸和核酸构建体可以根据本领域任意已知的方法制备，并且特别地可通过聚合作用尤其是使用PCR方法克隆、获得，或可以合成。
本发明的核酸构建体进一步限定为包括以下编码至少一种CHIKV结构蛋白的多核苷酸之一。
根据具体实施方案，编码一或几种CHIKV结构蛋白的多核苷酸编码可溶形式的糖蛋白E2。作为实例，该多核苷酸包含具有SEQ ID NO:2、4、6、8序列的编码结构域。
在具体实施方案中，编码一或几种CHIKV结构蛋白的多核苷酸编码E2胞外域。作为实例，该多核苷酸包含具有SEQ ID NO:10、12、14序列的编码结构域。
在本发明的另一个实施方案中，编码可溶形式的糖蛋白E2的多核苷酸编码一种具有选自SEQ ID NO:3、5、7、9的氨基酸序列的多肽。
在本发明的另一个实施方案中，编码糖蛋白E2的胞外域的多核苷酸编码一种具有选自SEQ ID NO:11、13、15的氨基酸序列的多肽。
根据本发明的具体实施方案，编码CHIKV结构蛋白的多核苷酸包含以上限定的核苷酸序列之一，其编码可溶形式的E2糖蛋白或所述蛋白的胞外域，并进一步包含编码E3、E1、6K或C蛋白之一的多核苷酸，或编码其任意组合的多核苷酸。
相应地，编码分离自弗雷瑞斯的France/2010毒株的结构聚蛋白E2-6K-E1的本发明的具体的多核苷酸选自：包含具有SEQ ID NO:16(GenBank:CCA61130.1)和20(GenBank:CCA61131.1)的序列的编码结构域的多核苷酸。
本发明的优选多核苷酸编码来自CHIKV毒株的结构蛋白C-E3-E2-6K-E1。在具体实施方案中，所述多核苷酸编码名为S27或06.49的毒株之一的聚蛋白C-E3-E2-6K-E1，并分别具有序列SEQ ID NO:20和27。
在本发明另一个实施方案中，所用的多核苷酸编码E2EP3表位或由该表位的重复形成的或包含该重复的多表位。该多核苷酸特别具有SEQ ID No:32公开的核苷酸序列。
根据优选实施方案，本发明还涉及多核苷酸的修饰和优化，以允许在宿主中MV-CHIKV嵌合感染性颗粒表面有效表达屈曲病毒蛋白。
根据该实施方案，可进行多核苷酸序列的优化以避免核酸分子的顺式活性结构域：内部TATA盒、chi位点和核糖体进入位点；富含AT或富含GC序列段；ARE、INS、CRS序列元件；重复序列和RNA二级结构；隐藏的拼接供体和受体位点，分支点。
优化的多核苷酸也可以为在特定细胞类型中表达而经密码子优化，特别是可以为Maccaca密码子使用或人密码子使用而修饰。该优化使得嵌合感染性颗粒在细胞中的产生效率增加，而不影响表达的蛋白。
特别地，编码CHIKV蛋白的多核苷酸的优化可以通过密码子中的摆动位置(wobble position)的修饰进行，不会影响从所述密码子翻译的氨基酸残基相对于原始氨基酸残基的相同性。
还进行优化以避免来自麻疹病毒的编辑样序列。麻疹病毒转录物的编辑是特别发生在由麻疹病毒P基因编码的转录物中的过程。该编辑，通过在P转录物中的特定位点插入额外的G残基，产生与P蛋白相比截断的新蛋白。仅添加单个G残基导致V蛋白的表达，其含有独特的羧基末端(Cattaneo R et al.,Cell.1989Mar 10；56(5):759-64)。
在根据本发明的该具体实施方案的多核苷酸中，来自麻疹病毒的以下编辑样序列可被突变：AAAGGG、AAAAGG、GGGAAA、GGGGAA，及其互补序列：TTCCCC、TTTCCC、CCTTTT、CCCCTT。例如，AAAGGG能被突变为AAAGGC，AAAAGG能被突变为AGAAGG或TAAAGG或GAAAGG，GGGAAA能被突变为GCGAA。
根据本发明的修饰和优化的多核苷酸的一个实施方案由SEQ ID NO:29所限定。该多核苷酸编码无干区(stem region)的可溶形式的包膜蛋白E2。
编码所有结构蛋白C-E3-E2-6K-E1的修饰和优化的多核苷酸的一个实施方案由SEQ ID NO:31所限定。
根据SEQ ID NO:29和31所限定的本发明的该具体实施方案的这些优化的多核苷酸在BsiWI和BssHII位点的序列中但非在序列末端存在突变，以保留该位点用于克隆目的。
因此，根据该具体实施方案，本发明提供核酸构建体，其包含增加嵌合MV-CHIKV感染性颗粒产生效率的多核苷酸。
包含编码CHIKV结构蛋白的序列并也适用于本发明核酸构建体的其他优化的多核苷酸为优化的融合多核苷酸，其编码以下结构蛋白的组合之一：E3-E2-6K-E1、E3-sE2-6K-E1、E3-sE2Δstem-6K-E1、C-E3-E2-6K-E1、C-E3-sE2-6K-E1和C-E3-sE2Δstem-6K-E1。
本发明还涉及核酸构建体，其中编码至少一种CHIKV结构蛋白的多核苷酸编码以下多肽之一。
根据本发明优选实施方案的CHIK病毒结构蛋白以及与来自命名为05.115、06.21、06.27和06.49毒株的可溶形式的糖蛋白E2相关的氨基酸序列的实例由SEQ ID NO:3、5、7、9所限定。
根据本发明优选实施方案的CHIK病毒结构蛋白以及与来自命名为05.115、06.21、06.27和06.49毒株的糖蛋白E2的胞外域相关的氨基酸序列的实例由SEQ ID NO:11、13、15所限定。
在具体实施方案中，本发明涉及由分离自弗雷瑞斯的France/2010毒株的结构蛋白E2-6K-E1构成的融合蛋白。这些蛋白分别来自具有序列SEQ IDNO:16(GenBank:CCA61130.1)和18(GenBank:CCA61131.1)的多核苷酸的表达。它们的序列分别由SEQ ID NO:17和19所限定。
在特别优选的实施方案中，本发明涉及由所有CHIKV结构蛋白组成的融合蛋白。这些蛋白来自编码所有结构蛋白C-E3-E2-6K-E1的多核苷酸的表达，并由SEQ ID NO:21、22、23、24、25、26和28所限定。
获得的结构蛋白C-E3-E2-6K-E1能够在CHIKV-MV颗粒中自装配成CHIKV病毒样颗粒(VLP)。
用于本文，术语“病毒样颗粒(VLP)”指至少一个属性类似病毒但未被证实同样为感染性的结构。根据本发明的病毒样颗粒不携带编码病毒样颗粒蛋白的遗传信息，总体上，病毒样颗粒缺少病毒基因组，因此是非感染性和非复制性的。根据本发明，病毒样颗粒能大量产生并与CHIKV-MV重组颗粒一起表达。
在具体实施方案中，本发明涉及来自名为06.49的CHIKV毒株、无干区的可溶形式的糖蛋白E2。该糖蛋白来自SEQ ID NO:29限定的修饰和优化的多核苷酸的表达。其序列由SEQ ID NO:30限定。
根据另一方面，本发明涉及重组CHIKV-麻疹病毒颗粒，其表达本文限定的屈曲病毒结构蛋白，特别参考其核酸和多肽序列。重组CHIKV-MV病毒有利地表达CHIKV结构蛋白为VLP。
本发明还涉及CHIKV结构蛋白的病毒样颗粒，特别是C-E3-E2-6K-E1的VLP在组合物中与CHIKV-MV感染性复制病毒颗粒的联合。
根据本发明的优选实施方案，重组麻疹病毒载体以该方式设计，生产过程涉及细胞，由此在用所述载体转染或转化的辅助细胞中生产、来自适于接种的麻疹病毒毒株的病毒颗粒使得产生重组麻疹-屈曲感染性和复制病毒，并产生CHIKV-VLP，用于免疫原性组合物、优选保护性或甚至疫苗组合物。
有利地，本发明的重组麻疹-屈曲感染性病毒的基因组是能够复制的。“能够复制”是指核酸转导入表达MV的N、P和L蛋白的辅助细胞系时能够被转录和表达，从而产生新病毒颗粒。
使用制备MV-CHIKV重组基因组的MV cDNA获得的本发明重组病毒的复制也能在宿主体内实现，特别是施用重组MV-CHIKV的人宿主。
本发明还涉及活性成分的组合物或组合体，其包含与CHIKV结构蛋白的VLP，例如CE3E26KE1蛋白的VLP联用的重组麻疹-屈曲复制病毒。这些组合物或组合体诱导针对屈曲病毒的免疫应答，特别是保护性免疫应答，并特别引发针对屈曲病毒结构蛋白的抗体产生和/或引发针对CHIKV感染的细胞免疫应答。这些组合物相应地可包含对宿主、尤其是人宿主施用的适合的载体，例如药物学可接受的载体，并且可进一步包含但非必须的佐剂以增强宿主中的免疫应答。本发明人事实上已证实本发明活性成分的施用可引发免疫应答而无需佐剂化。
本发明特别涉及向儿童施用的组合物。
本发明还涉及免疫原性组合物，特别是疫苗组合物，并且特别涉及向儿童施用的疫苗组合物。所述组合物或疫苗用于在预防疗法中防止CHIKV感染。该疫苗组合物有利地具有活性成分，其包含拯救自载体的重组麻疹-屈曲感染性复制病毒颗粒，所述载体已在本文中限定为与CHIKV结构蛋白的VLP，例如CE3E26KE1蛋白的VLP联用。
在本发明的上下文中，术语“联用”或“关联”指MV-CHIKV重组病毒颗粒和CHIKV结构蛋白在独特组合物中的同时出现，特别是作为VLP，通常以物理分离的实体出现。
本发明还涉及与CHIKV病毒结构蛋白、特别是表达CHIKV结构蛋白的CHIKV病毒样颗粒、特别是CHIKV-CE3E26KE1VLP联用的重组MV-CHIKV感染性复制病毒颗粒，或本发明的组合物，其用于治疗或预防受试者、特别是人中屈曲病毒的感染。
本发明还涉及MV-CHIKV感染性、复制病毒以及联用的CHIKV病毒结构蛋白，特别是联用的CHIKV结构蛋白VLP，例如CE3E26KE1蛋白VLP，用于施用方案，以及根据给药方案使用，其引发针对CHIKV病毒感染或诱导性疾病的免疫应答，有利地为保护性免疫应答，特别是在人宿主中。
施用方案和给药方案需要独特施用选择剂量的MV-CHIKV感染性、复制病毒以及联用的CHIKV病毒结构蛋白，特别是联用的CHIKV结构蛋白VLP，例如CE3E26KE1蛋白VLP。
可选地，在免疫-加强方案中需要多剂量施用。可使用相同的活性成分实现免疫和加强，所述活性成分由MV-CHIKV感染性、复制病毒以及联用的CHIKV病毒结构蛋白，特别是联用的CHIKV结构蛋白VLP，例如CE3E26KE1蛋白VLP组成。
可选地，可使用不同的活性成分实现免疫和加强施用，所述活性成分在至少一个施用步骤中包含MV-CHIKV感染性、复制病毒以及联用的CHIKV结构蛋白，特别是联用的CHIKV结构蛋白VLP，例如CE3E26KE1蛋白VLP，在其他施用步骤中包含CHIKV的其他活性免疫原，例如表达C-E3-E2-6K-E1聚蛋白的CHIKV蛋白或VLP。
本发明还涉及不同活性成分的组合体，所述活性成分包括以下活性成分之一：MV-CHIKV感染性、复制病毒以及联用的CHIKV结构蛋白，特别是联用的CHIKV结构蛋白VLP，例如CE3E26KE1蛋白VLP。活性成分的组合体有利地用于宿主、特别是人宿主的免疫。
本发明人已经证实MV-CHIKV感染性、复制病毒以及联用的CHIKV结构蛋白VLP的施用引发免疫应答，并且尤其引发与不同CHIKV毒株，至少是ECSA基因型毒株交叉反应的抗体。相应地，已经证实施用本发明的活性成分(用特定CHIKV毒株的编码序列制备时)能引发针对CHIKV毒株群、特别是ECSA基因型毒株群、特别是包含CHIKV印度毒株、CHIKV刚果毒株、CHIKV泰国毒株和CHIKV留尼汪毒株的毒株群的免疫应答。
考虑到关于适于其他病原体(例如HBV或HPV)的疫苗(其涉及施用病毒样颗粒(VLP))以及还适于已知人MV疫苗的剂量的可用知识，本发明人确定用重组MV-CHIKV病毒回收CHIKV-VLP使得能够尝试施用有效低剂量的活性成分。事实上，考虑到重组MV-CHIKV病毒每个MV-CHIKV复制颗粒能够产生约104CHIKV-VLP，并且考虑到目前已知的人MV疫苗剂量为103至104pfu，待施用的重组MV-CHIKV病毒的适合剂量为0.1至10ng，特别是0.2至6ng，并且可能低至0.2至2ng。作为比较，在HBV或HPV疫苗中施用的VLP剂量在10μg范围内，这意味着重组MV-CHIKV疫苗的剂量可以包含少约2000或多达5000至10000倍的VLP。
根据本发明的具体实施方案，本文限定的疫苗的免疫原性组合物还可用于防止麻疹病毒感染。
附图说明
图1：示出屈曲病毒结构蛋白和MV基因组骨架的ORF-包括麻疹病毒表达的所述CHIK病毒抗原的MV-CHIKV构建体的示意图。
图1B：表达CHIKV VLP的重组MV的拯救
图2：在由MOI 0.1的重组MV-CHIKV感染24h的Vero细胞中免疫荧光检测E2抗原。
使用抗E2单抗3E4(1/100稀释)检测E2，二抗经1/5000稀释使用。
图3：MV-CHIKV载体表达E2和壳体蛋白。
MV-sE2Δstem和MV-CE3E26KE1感染24h的Vero细胞的细胞裂解物(细胞)和上清(SN)经western印迹分析。用3E4单抗探测E2，使用抗壳体单抗(来自P.Desprès，1/100稀释)检测C蛋白，二抗经1/5000稀释使用。
图4：电子显微镜检查分析在由MOI 0.1的MV-CE3E26KE1重组病毒感染的Vero细胞上清中分泌的CHIKV VLP。比例尺为200nm(左)和100nm(右)。红箭头代表在颗粒表面上的刺突的特定排列以及在颗粒内的壳体蛋白的二十面体对称。
图5：由MV-sE2重组病毒表达的截短的sE2(156aa,19kDa)的序列。
图6：重组MV-sE2Δstem和MV-CE3E26KE1与标准MV相比在Vero细胞上的生长动力学(MOI 0.01)。以TCID50表明细胞相关病毒滴度。
图7：实施例2的免疫和攻击计划。
图8：用MV-CE3E26KE1重组病毒两次免疫后，以100PFUCHIKV-06-49致死攻击的小鼠的存活曲线。
图9：实施例3的免疫和攻击计划。
图10：用MV-CE3E26KE1重组病毒单次免疫后，以100PFUCHIKV-06-49致死攻击的小鼠的存活曲线。
图11：实施例4的免疫和攻击计划。
图12：用不同剂量的MV-CE3E26KE1重组病毒免疫后，以100PFUCHIKV-06-49致死攻击的小鼠的存活曲线。
图13：实施例5的被动转移免疫血清和攻击计划。
图14：被动转移MV-CE3E26KE1免疫血清后，以100PFU CHIKV-06-49致死攻击的小鼠的存活曲线。
图15：通过106TCID50的MV-CHIKV单次注射免疫的CD46-IFNAR小鼠脾细胞内引发的细胞介导的免疫应答。
图16：实施例6的免疫和攻击计划。
图17：用MV-CE3E26KE1免疫后，以100PFU CHIKV-06-49致死攻击的预免疫小鼠的存活曲线。
图18：在首次免疫前第90天(加强之前)和第111天(加强之后第21天)进行针对CHIK的PRNT测定。
实施例
表达屈曲病毒蛋白的重组麻疹病毒载体的构建和特征
本发明人基于屈曲病毒06-49毒株天然蛋白的肽序列设计3种屈曲病毒抗原。能够制备这些肽序列的天然蛋白为5种结构蛋白，其由壳体(C)包膜和附属蛋白E1、E2、E3和6K组成。
第一结构涉及可溶形式的包膜蛋白E2(sE2)的表达，第二结构涉及无干区的sE2(sE2Δstem)的表达，第三结构涉及所有病毒结构蛋白(C-E3-E2-6K-E1)的表达(图1)。本文根据该后一构建体描述实验方案。
细胞培养。Vero(非洲绿猴肾)细胞培养于DMEM GlutaMAXTM(Gibco-BRL)中，添加5％热灭活胎牛血清(FCS,Invitrogen,Frederick,MD)。用于重组麻疹病毒拯救的HEK-293-T7-MV辅助细胞(WO2008/078198)培养于添加10％FCS的DMEM中。
pTM-MVSchw-CE3E26KE1构建。pTM-MVSchw质粒已在别处描述(Combredet,C.,et al.,A molecularly cloned Schwarz strain of measles virusvaccine induces strong immune responses in macaques and transgenic mice.JVirol,2003.77(21):p.11546-54)，其含有对应于施瓦兹MV疫苗株的反基因组的感染性MV cDNA。编码结构CE3E26KE1CHIKV抗原的cDNA由化学合成制备(GenScript,USA)。其含有来自CHIKV毒株06-49的病毒结构蛋白C-E3-E2-6K-E1的序列(WO2007/105111)。完整序列遵守“6倍规则”，其规定进入MV基因组的核苷酸数目必须是6的倍数，并在5’端含有BsiWI限制酶切位点，3’端含有BssHII限制酶切位点。序列经优化用于麻疹病毒在哺乳动物细胞中的表达。该cDNA插入BsiWI/BssHII消化的pTM-MVSchw-ATU2中，其在施瓦兹MV基因组的磷蛋白(P)和基质(M)基因之间含有额外的转录单元(ATU)(Combredet,C.,et al.,A molecularlycloned Schwarz strain of measles virus vaccine induces strong immuneresponses in macaques and transgenic mice.J Virol,2003.77(21):p.11546-54)。所得质粒命名为pTM-MVSchw-CE3E26KE1。
重组MV-CE3E26KE1的拯救。使用前述拯救系统如前所述拯救来自质粒pTM-MVSchw-CE3E26KE1的重组施瓦兹MV-CHIKV(Radecke,F.,etal.,Rescue of measles viruses from cloned DNA.J Virol,1995.14(23):p.5773-84；WO2008/078198)。通过在Vero细胞上的端点极限稀释测定确定病毒滴度，并使用法计算TCID50。
免疫荧光。如别处所述在感染细胞上进行免疫荧光染色(Lucas,M.,et al.,Infection of mouse neurons by West Nile virus is modulated by theinterferon-inducible 2’-5’oligoadenylate synthetase 1b protein.Immun.CellBiol.,2003.81:p.230-236)。用鼠抗E2(3E4)和抗壳体抗体探查细胞。Cy3缀合的山羊抗鼠Cy3缀合IgG抗体(Jackson Immunoresearch laboratories)用作二抗。
Western印迹测定。来自重组病毒感染的Vero细胞的蛋白裂解物经SDS-PAGE凝胶电泳分离，并转移至纤维素膜(Amersham PharmaciaBiotech)。用鼠抗E2单抗3E4和抗壳体抗体探查印迹。山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(Amersham)用作二抗。使用增强型化学发光检测试剂盒(Pierce)对过氧化物酶活性进行显影。
通过电子显微镜分析VLP产生。Vero细胞(3x T–150细颈瓶)用MOI1的MV–CHIKV重组病毒感染。感染后36h收集的上清于3000rpm离心30min澄清，铺于PBS中20％的蔗糖垫层上，在SW41转子中于41,000rpm离心2h。用含有1％BSA的PBS重悬沉淀，并用电子显微镜分析。用2％乙酸双氧铀在涂覆碳的铜载网上进行负染色，并在使用前辉光放电。用JeolJEM1200(Tokyo,Japan)透射电子显微镜在80kV观察样品。使用EloiseKeenview相机和Analysis Pro-software 3.1版本(Eloise SARL,Roissy,France)记录图像。
小鼠实验。如前所述制备对MV感染易感的CD46-IFNAR(Combredet,C.,et al.,A molecularly cloned Schwarz strain of measles virus vaccine inducesstrong immune responses in macaques and transgenic mice.J Virol,2003.77(21):p.11546-54)。小鼠在特定的无病原体条件下饲养于巴斯德研究所动物设施中。对于免疫，6周龄CD46-IFNAR小鼠用105TCID50重组MV-CE3E26KE1或MV经腹膜内(i.p.)接种。对于保护测定，免疫小鼠用100pfu CHIKV 06-49毒株经腹膜内接种，并跟踪死亡率2周。所有实验均获批准并按照巴斯德研究所试验动物护理办公室的准则进行。对于被动转移研究，用20μl来自以105TCID50MV-CE3E26KE1免疫的6只小鼠的混合血清经腹膜内接种CD46-IFNAR小鼠。对照小鼠接受20μl来自以105TCID50空MVSchw免疫的小鼠的混合血清或20μl抗CHIKV HMAF。血清在被动转移前24h、用100pfu CHIKV 06-49毒株攻击前16h、然后在攻击后12h稀释于总体积100μl的PBS中，以模拟感染动物中的抗体存在。分析小鼠死亡率2周，以确定保护。
体液免疫应答分析。为了评价特定的抗体应答，小鼠在免疫后不同时间通过眼窝途径采血。血清在56℃热灭活30min，通过ELISA(ENZYGNOST-Siemens)检测抗MV抗体。HRP缀合的抗鼠免疫球蛋白(Jackson Immuno Research)用作二抗。用特定ELISA检测抗CHIKV抗体。简言之，用在大肠杆菌中产生的重组CHIKV-E2蛋白包被96孔板。HRP缀合的抗鼠免疫球蛋白用作二抗。混合血清的端点滴度以产生来自作为阴性对照的MV接种小鼠的血清两倍吸光度的最终稀释的倒数计算。使用噬菌斑减少中和试验(PRNT)测量抗CHIKV中和抗体。将Vero细胞种植于12孔板24h。在DMEM Glutamax/2％FCS中系列稀释血清样品。100μl稀释液与含100pfu 06-49毒株的等体积CHIKV于37℃、温和搅拌下孵育2h。然后在覆盖含有最终0.8％(重量/体积)羧甲基纤维素的DMEMGlutaMAXTM/2％FCS的Vero细胞单层上测定剩余感染性。孵育3天后，固定细胞并用结晶紫染色，进行噬菌斑计数确定。端点中和滴度以测试的减少噬菌斑数量至少50％(PRNT50)的最高血清稀释计算。
细胞介导的免疫应答分析。6周龄CD46+/-IFNα/βR-/-小鼠腹膜内接种106TCID50的MV-CHIKV重组病毒。对照小鼠用106TCID50空MV载体免疫。感染后7天对小鼠进行安乐死，并收集脾脏。来自免疫小鼠的脾细胞于RPMI，10％FCS和10IU重组人白介素-2(rh-IL-2；BoehringerMannheim)中孵育。其刺激时分泌IFN-γ的能力通过酶联免疫印迹(ELISPOT)测定进行检测。细胞用刀豆素A(5μg/ml；Sigma)作为阳性对照，RPMI–IL-2(10U/ml)作为阴性对照刺激18h，CHIKV(MOI 1)，或MV(MOI 1)。多筛选-HA96孔板用处于PBS中的5μg抗鼠IFN-γ/ml(R4-6A2；Pharmingen)于4℃包被过夜，清洗，然后用100μl RPMI和10％FCS于37℃孵育1h。用100μl细胞悬浮液(每孔5x105脾细胞，一式三份)和100μl刺激剂替换培养基。于37℃2h后，添加加热的FCS(10％)，并将板在37℃孵育18h。清洗后，添加生物素化的抗鼠IFN-γ抗体(XMG1.2；Pharmingen)，并将板在室温孵育2h。链霉亲和素-碱性磷酸酶缀合物(Roche)用作第二步骤。用BCIP/NBT(Promega)形成斑点并计数(ELISpot Reader；Bio-Sys)。
重组MV载体表达CHIKV病毒样颗粒。CHIKV VLP已证实引发针对CHIKV感染的保护性免疫(Akahata,W.,et al.,A virus-like particle vaccine forepidemic Chikungunya virus protects nonhuman primates against infection.NatMed,2010.16(3):p.334-8)。为了受益于该能力，本发明人设计了能够诱导CHIKV VLP分泌的重组MV载体。为了该目的，编码CHIKV VLP产生所需的C-E3-E2-6K-E1结构蛋白的cDNA经化学合成(Genscript)并针对在哺乳动物细胞中的麻疹病毒表达进行优化，然后导入施瓦兹MV疫苗感染性cDNA的额外的转录单元(ATU)(图1)。通过将该质粒转染入HEK-293辅助细胞并在Vero细胞上增殖以获得MV-CHIKV。病毒母液在Vero细胞上生长，并确定滴度。
由免疫荧光、western印迹和电子显微镜证实，高含量的CHIKV VLP分泌到感染细胞的培养基中。
该策略提供了在每轮复制分泌CHIKV VLP的活的重组MV疫苗病毒。并未预期天然甲病毒颗粒的装配会发生，并且这些VLP不会妨碍副粘病毒的同时复制。这在此首次得到证实。由于MV疫苗以粗病毒提取物工业化制备，批量的重组MV-CHIKV含有活MV病毒和非复制CHIKV VLP。该策略允许得益于VLP上展示的多聚体抗原有利的免疫原性能，无需苛刻且昂贵的纯化和浓缩过程。而且，由于VLP得益于活疫苗有利的免疫原性特征，例如平衡的Th1应答和长期记忆，无需佐剂。
CHIKV E2和壳体抗原的表达在感染的Vero细胞中通过免疫荧光得到证实，其使用针对CHIKV的E2蛋白的特异性抗体(单抗3E4)(图2)。为了寻找分泌VLP的存在，感染细胞的培养基经低速离心澄清，然后铺于20％蔗糖垫层，并通过在SW41转子中于41,000rpm离心2h浓缩。沉淀溶解于含1％BSA的PBS中。从细胞裂解物和浓缩的培养基中提取的蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分离，并转移至纤维素膜。用检测E2的3E4小鼠单抗和抗壳体单抗对印迹进行标记，所述3E4小鼠单抗由2007年9月6日以巴斯德研究所的名义保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes,Paris,France)、编号I-3824的杂交瘤产生。在细胞裂解物和浓缩的感染细胞上清中均发现正确大小(46KDa)的E2蛋白，表明MV-CHIKV病毒诱导包含E2蛋白的高密度颗粒的分泌。高密度颗粒中也发现了壳体蛋白，证实CHIKV-VLP的形成。C和E2蛋白二者在感染细胞的浓缩上清中的存在表明CHIKV VLP的形成。为了观察其物理存在，发明人通过电子显微镜分析了从MV-CHIKV感染细胞的上清中浓缩的沉淀。图像表明高含量颗粒的存在，其具有与野生型CHIKV感染后所述的颗粒相似的尺寸和表型(Pletnev,S.V.,et al.,Locations of carbohydrate sites on alphavirusglycoproteins show that E1forms an icosahedral scaffold.Cell,2001.105(1):p.127-36；Zhang,W.,et al.,Placement of the structural proteins in Sindbis virus.JVirol,2002.76(22):p.11645-58)(图4)。观察到的颗粒呈现65nm的外部直径和40nm核心直径。表面组构表明VLP表面上存在刺突，与其他甲病毒类似排列(Pletnev,S.V.,et al.,Locations of carbohydrate sites on alphavirusglycoproteins show that E1forms an icosahedral scaffold.Cell,2001.105(1):p.127-36；Zhang,W.,et al.,Placement of the structural proteins in Sindbis virus.JVirol,2002.76(22):p.11645-58)。该发现证实重组MV-CHIKV病毒对Vero细胞的感染使得分泌高含量的自装配的CHIK VLP。
E2蛋白还由麻疹病毒-sE2Δstem重组病毒，以及麻疹病毒-CE3E26KE1重组病毒以正确大小(46KDa)表达并分泌。
不幸的是，对MV-sE2感染细胞的分析再次证实截短形式的E2蛋白的表达。发明人在RT-PCR扩增感染细胞后对MV-sE2病毒产生的E2mRNA进行测序。分析证实产生STOP密码子的突变的存在，由此导致截短(图5)。
发明人继而使用低MOI(0.01)比较了麻疹病毒-sE2、麻疹病毒-sE2Δstem以及麻疹病毒-CE3E26KE1重组病毒在Vero细胞上相对于标准麻疹病毒母液产生的复制速率(图6)。MV-sE2的生长与对照MV类似。麻疹病毒-sE2Δstem和麻疹病毒-CE3E26KE1重组病毒的生长稍微延缓，但其最终滴度与空麻疹病毒范围相同。
MV-sE2和MV-CE3E26KE1的免疫原性以及在CD46-IFNAR小鼠中的保护
对MV感染易感的CD46-IFNAR用于评价重组MV-CHIKV病毒的免疫原性及其保护效力。这些小鼠表达人CD46基因，其具有人样组织特异性并缺乏I型干扰素受体。小鼠在特定的无病原体条件下饲养于巴斯德研究所动物设施中，所有实验均获批准并按照巴斯德研究所试验动物护理办公室的准则进行。6周龄CD46-IFNAR小鼠用103至105TCID50剂量的MV-CHIKV重组病毒经腹膜内(i.p.)接种并在1个月后用相同剂量的重组病毒加强。对照小鼠用相同剂量的空MVSchw载体免疫。对于抗体确定，在初次接种后1个月，然后在增强后的2或4周通过眼窝途径收集血样。
之前的研究证实，IFNAR小鼠对致死的屈曲病毒感染易感，显示感染的病理表现并提供评价保护的免疫机制的模型(Couderc et al；2008)。
对麻疹病毒感染易感的CD46-IFNAR用于评价重组麻疹-屈曲病毒的免疫原性及其保护效力。这些小鼠表达人CD46基因，其具有人样组织特异性并缺乏I型干扰素受体。小鼠在特定的无病原体条件下饲养于巴斯德研究所动物设施中，所有实验均获批准并按照巴斯德研究生试验动物护理办公室的准则进行。
实验1分析麻疹病毒-CE3E26KE1重组病毒在CD46-IFNAR小鼠中的免疫原性和保护效力
对麻疹病毒感染易感的6周龄CD46-IFNAR小鼠用2.104TCID50麻疹病毒–屈曲病毒重组病毒经腹膜内接种，并在1个月后用相同剂量的重组病毒加强。对照小鼠用相同剂量的空麻疹病毒施瓦兹载体(MV Schw)免疫。对于抗体确定，在初次接种后1个月，然后在增强后的2周通过眼窝途径收集血样。然后通过腹膜内注射100pfu屈曲病毒06-49毒株对小鼠进行攻击，以评价保护(免疫和攻击计划如图7所示)。
为了评价特异性抗体应答，在接种后不同时间点对小鼠采血。血清在56℃热灭活30min，并通过ELISA检测抗屈曲病毒抗体。用在大肠杆菌中产生的重组屈曲病毒-E2蛋白包被96孔板。HRP缀合的抗鼠免疫球蛋白用作二抗，抗屈曲病毒小鼠抗体用作阳性对照。使用50PFU屈曲病毒06-49(在Vero细胞上产生)在Vero细胞上通过噬菌斑减少中和试验(PRNT)检测抗屈曲病毒中和抗体(Warter L et al.JIM 2011(D4enclosed)and Russell PK et al.JIM 1967)on Vero cells using 50PFU of Chikungunya virus-06-49(producedon Vero cells)。端点滴度以测试的减少PFU数量至少50％(PRNT50)或90％(PRNT90)的最高血清稀释计算。
单次注射麻疹病毒-CE3E26KE1重组病毒诱导高抗体滴度，其被二次注射强烈加强(表1–图8)。在两次免疫后，诱导高中和滴度(PRNT50＝450-4050，PRNT90＝50-450)。用104或105TCID50免疫的所有动物都免受100PFU CHIKV-06-49的CHIKV致死攻击，而用较低剂量(103TCID50)免疫保护83％的动物。
表1.CD46-IFNAR小鼠对MV-sE2和MV-CE3E26KE1免疫的抗体应答(在混合小鼠血清中确定)
在两次免疫后，诱导高中和滴度(PRNT50＝1350，PRNT90＝150)，其保护小鼠免受100PFU屈曲病毒-06-49的致死攻击。
实验2分析单剂量麻疹病毒-CE3E26KE1重组病毒在CD46-IFNAR小鼠中的免疫原性和保护效力
6周龄CD46-IFNAR小鼠用105TCID50麻疹病毒-CE3E26KE1重组病毒经腹膜内接种。对照小鼠用相同剂量的空麻疹病毒Schw载体免疫。在免疫后2周通过眼窝途径收集血样用于抗体确定，然后通过腹膜内注射100pfu屈曲病毒06-49对小鼠进行攻击(免疫和攻击计划如图9所示)。
在IFNAR小鼠中单次注射后麻疹病毒-CE3E26KE1重组病毒诱导高抗体滴度(表2–图10)，以及足以给予对100pfu屈曲病毒06-49致死攻击进行保护的中和滴度。
表2.CD46-IFNAR小鼠中用MV-CE3E26KE1病毒单次免疫后引发的抗体应答
实验3确定CD46-IFNAR小鼠中麻疹病毒-CE3E26KE1重组病毒的保护剂量
6周龄CD46-IFNAR小鼠用103至105TCID50剂量的MV–CHIKV重组病毒经腹膜内(i.p.)接种，并在1个月后用相同剂量加强。对照小鼠用相同剂量的空MVSchw载体免疫。最后一次免疫后1个月，通过腹膜内注射100pfu CHIKV 06-49对小鼠进行攻击(免疫和攻击计划如图11所示)。对于抗体确定，在初次接种后1个月，然后在增强后1个月，攻击之前通过眼窝途径收集血样。进行特异性Elisa’s以检测抗MV和抗CHIKV结合抗体。在Vero细胞上通过噬菌斑减少中和试验(PRNT)确定抗CHIKV中和抗体滴度。
结果示于表3和图12。
表3.用不同剂量的MV-CE3E26KE1接种后的抗体应答
当重组MV剂量增加时，抗MV和抗CHIKV抗体的滴度均增加。MV-CE3E26KE1病毒单次免疫诱导高抗体滴度，其被二次注射增强。在两次免疫后，诱导高中和滴度(PRNT50＝450-4050，PRNT90＝50-450)。用104或105TCID50免疫的所有动物都免受100PFU CHIKV-06-49的CHIKV致死攻击，而用较低剂量(103TCID50)免疫保护83％的动物(图12)。
实验4评价来自由重组MV-CE3E26KE1病毒免疫小鼠的血清的被动转移给予的保护
6周龄CD46-IFNAR小鼠用20μl来自105TCID50的重组MV-CE3E26KE1免疫小鼠的混合血清经腹膜内(i.p.)接种。对照小鼠接受20μl来自以105TCID50空麻疹病毒施瓦兹免疫小鼠的混合血清或20μl抗CHIKV病毒HMAF。血清在总体积100μl的PBS中稀释。血清在用100pfu屈曲病毒06-49攻击前24h以及16h，然后在攻击后12h转移，以模拟感染动物中的抗体存在。分析小鼠死亡率2周以确定保护(免疫和攻击计划如图13所示)。
由MV-CE3E26KE1病毒免疫小鼠的免疫血清的被动转移保护83％的受体小鼠免受致死屈曲病毒攻击，而接受抗屈曲病毒HMAF的小鼠全部受到保护。相比之下，接受来自由空麻疹病毒免疫小鼠的免疫血清的小鼠全部死亡。这些结果表明，由麻疹病毒-CE3E26KE1重组病毒诱导的体液免疫应答在CD46-IFNAR小鼠中给予对屈曲病毒的保护(图14)。
实验5诱导特异性细胞介导的免疫应答
为了确定MV-CHIKV免疫是否引发细胞介导的免疫应答，我们通过ELISPOT测定测量了来自免疫小鼠的脾细胞在特异性离体刺激时分泌IFN-γ的能力。单次免疫后7天收集脾细胞，对MV-特异性和CHIKV-特异性应答进行评价。1MOI的CHIKV和MV用于脾细胞刺激。检测到显著数量的CHIKV-特异性细胞(多达300/106脾细胞，平均150/106)(图15)，其代表相似刺激条件下三分之一的MV-特异性应答(多达600/106脾细胞，平均500/106)。所有用MV-CHKV免疫的八只小鼠除一只外均具有对CHIKV显著的CMI应答。相比之下，用空MVSchw免疫的对照小鼠具有相似的MV-特异性应答，但不具有CHIKV-特异性应答。这些结果表明，单次接种MV-CHIKV在免疫小鼠的脾脏中诱导高水平的CHIKV和MV特异性细胞免疫应答。
实验6分析麻疹病毒预免疫对重组MV-CE3E26KE1病毒在CD46-IFNAR小鼠中的免疫原性和保护效力的影响
6周龄CD46-IFNAR小鼠用5.103TCID50的空麻疹病毒施瓦兹经腹膜内(i.p.)接种(图16组1)以模拟预免疫。3个月后，这些小鼠两次注射105TCID50麻疹病毒-CE3E26KE1重组病毒，间隔1个月。对照小鼠用105TCID50麻疹病毒-CE3E26KE1重组病毒(组2)或105TCID50空麻疹病毒Schw(组3)免疫。对于抗体确定，如图16所示通过眼窝途径收集血样，然后通过腹膜内注射100pfu屈曲病毒06-49毒株对小鼠进行攻击，用于保护测定。
该实验证实由5.103TCID50空麻疹病毒预先免疫的CD46-IFNAR小鼠能够在用麻疹病毒-CE3E26KE1重组病毒免疫后增加保护性屈曲病毒免疫应答。ELISA和PRNT滴度(表4–图17)保持较高，并与天然小鼠中诱导的滴度(ELISA滴度不变，PRNT滴度减少1倍稀释)处于相同范围。在用麻疹病毒-CE3E26KE1重组病毒免疫的预免疫和天然组的动物中，100％的接种动物免受屈曲病毒致死攻击。
表4.CD46-IFNAR小鼠在对MV载体预免疫存在下对MV-CE3E26KE1的抗体应答
实验7：由接种引发的抗体交叉反应
为了确定MV-CHIKV免疫是否引发对不同CHIKV原代分离物的交叉反应性抗体应答，测试获自实验4动物的血清中和不同CHIKV原代分离物的能力。选择属于ECSA基因型的4种毒株。
·CHIKV印度毒株，临床分离物n°3710(NRC for Arbovirus,France)，分离于2011年。在Vero细胞上传代1次(2011年11月)，病毒滴度6.3log PFU/ml
·CHIKV刚果毒株，临床分离物n°525(NRC for Arbovirus,France)，分离于2011年。在Vero细胞上传代1次(2011年6月)，病毒滴度6.5log PFU/ml
·CHIKV泰国毒株，临床分离物n°1499(NRC for Arbovirus,France)，分离于2009年。在C6/36细胞上传代(2009年12月)，病毒滴度6.3log PFU/ml
·CHIKV留尼汪毒株，临床分离物2006.49(NRC for Arbovirus,France)，分离于2006年。在Vero细胞上传代3次(2011年4月4日)，病毒滴度7.3log PFU/ml
使用噬菌斑减少中和试验(PRNT)检测抗CHIKV中和抗体。将Vero细胞种植于12孔板24h。在DMEM Glutamax/2％FCS中系列稀释血清样品。100μl稀释液与含100pfu 06-49毒株的等体积CHIKV于37℃、温和搅拌下孵育2h。然后在覆盖含有最终0.8％(重量/体积)羧甲基纤维素的DMEMGlutaMAXTM/2％FCS的Vero细胞单层上测定剩余感染性。孵育3天后，固定细胞并用结晶紫染色，进行噬菌斑计数确定。端点中和滴度以测试的减少噬菌斑数量至少50％(PRNT50)的最高血清稀释计算。
表5.来自MV-CHIKV免疫小鼠的中和抗体的交叉反应性
结果表明，MV-CHIKV免疫小鼠诱导交叉反应性抗体，其能够中和来自不同国家的CHIKV的几种原代分离物。有趣的是，用06-49留尼汪病毒攻击动物导致甚至扩展应答，并将对印度和泰国分离物的中和增强至极高水平。仅对ECSA基因型进行测试，因为其在巴斯德研究所可获得。
实验8：MV-CHIKV在食蟹猴中的免疫原性
在非人灵长类中测试重组麻疹病毒疫苗对屈曲的免疫原性。预先选择的对黄病毒和麻疹病毒血清阴性的2组4只食蟹猴(macaca fascicularis)于第0天皮下接种104或105TCID50的MV-CHIKV，然后在第90天用相同剂量加强。收集血清和血浆并储存于-20℃用于后续分析。通过使用PRNT测定检测对屈曲病毒的中和抗体。
表6
表6所示结果表明，所有猴子出现中和CHIKV的高滴度抗体。最高剂量比较低剂量更有效。如图18所示，在大多数动物中，增强是有效的(第90天，该天进行增强，对比第111天，增强后第21天)。这些结果证实MV-CHIKV疫苗候选物在非人灵长类中的免疫原性。
总体结论
发明人产生了稳定表达CHIKV毒株06.49的完整结构蛋白CE3E26KE1的重组MV-CHIK病毒。被该重组病毒感染的Vero细胞表达高水平的CHIKV蛋白并且分泌高密度VLP。该重组病毒的生长动力学稍微延迟，但产生与空MV载体相似的滴度。经在对MV感染易感的CD46-IFNAR小鼠中的评价，该疫苗候选物根据施用的剂量和次数诱导高水平的CHIKV中和抗体(PRNT50＝450-4050；PRNT90＝150-450)。所有免疫小鼠均可重复地受到保护，即使是在单次施用后，表明该疫苗候选物强烈的免疫能力。在天然动物中被动转移免疫血清给予对致死攻击的保护，即使是在这些高度易感的小鼠中。最后，发明人证实CD46-IFNAR小鼠中对MV载体预先免疫的存在并不妨碍在用MV-CE3E26KE1疫苗候选物免疫后诱导保护性免疫。基于这些结果，由此获得的重组载体值得在可靠的非人灵长类感染模型中进行评估。

Claims (20)

1.核酸构建体，其包含编码至少一种屈曲病毒(CHIKV)结构蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接、特别是克隆入cDNA分子，所述cDNA分子编码麻疹病毒(MV)全长、感染性反基因组(+)RNA链的核苷酸序列。
2.权利要求1的核酸构建体，特征在于所述核酸构建体符合麻疹基因组的6倍规则。
3.权利要求1或2的核酸构建体，其包含基因转录单元，从5'到3'包括：
(a)编码MV的N蛋白的多核苷酸，
(b)编码MV的P蛋白的多核苷酸，
(c)编码至少一种CHIKV结构蛋白的多核苷酸，
(d)编码MV的M蛋白的多核苷酸，
(e)编码MV的F蛋白的多核苷酸，
(f)编码MV的H蛋白的多核苷酸，和
(g)编码MV的L蛋白的多核苷酸，
所述多核苷酸在所述核酸构建体中可操作地连接，并受病毒复制和转录调控序列如MV先导和尾随序列控制。
4.权利要求1-3任一项的核酸构建体，特征在于所述麻疹病毒为减毒病毒毒株，所述毒株特别选自施瓦兹毒株、萨格勒布毒株、AIK-C毒株和Moraten毒株。
5.权利要求1-4任一项的核酸构建体，特征在于编码CHIKV结构蛋白的所述多核苷酸已经为Macacca密码子使用优化或为人密码子使用优化。
6.权利要求1-5任一项的核酸构建体，特征在于麻疹编辑样序列已从编码CHIKV结构蛋白的所述多核苷酸中缺失。
7.权利要求1-6任一项的核酸构建体，特征在于编码CHIKV结构蛋白的所述多核苷酸编码选自E1、E2、E3、C和6K蛋白的一或几种蛋白。
8.权利要求1-7任一项的核酸构建体，特征在于所述屈曲病毒来自命名为06-49毒株的毒株。
9.权利要求1-8任一项的核酸构建体，特征在于所述核酸构建体编码可溶形式的SEQ ID NO:3、5、7、9限定的包膜蛋白E2。
10.权利要求1-8任一项的核酸构建体，特征在于编码包膜蛋白E2的胞外域的多核苷酸具有SEQ ID NO:11、13、15的序列。
11.权利要求1-8任一项的核酸构建体，特征在于所述核酸构建体编码SEQID NO:17、19、21、22、23、24、25、26和28限定的一或几种CHIKV结构蛋白E1、E2、E3、C和6K。
12.权利要求1-8任一项的核酸构建体，特征在于所述核酸构建体编码SEQID NO:30限定的无干区的可溶形式的包膜蛋白E2。
13.权利要求1-8任一项的核酸构建体，特征在于所述核酸构建体由SEQID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、27、29和31限定。
14.转移载体质粒，其包含权利要求1-12任一项的核酸构建体。
15.权利要求14的载体，特征在于所述载体是pMV-CHIKV。
16.细胞，特征在于所述细胞用权利要求1-15任一项的核酸构建体或转移载体质粒转化，特别是真核细胞，例如禽类细胞，特别是CEF细胞、哺乳动物细胞或酵母细胞。
17.重组感染性复制MV-CHIK病毒颗粒，特征在于所述病毒颗粒是权利要求1-12任一项的核酸构建体或权利要求14或15的载体在宿主细胞中表达的产物，所述宿主细胞产生、特别是稳定产生至少被所述宿主细胞识别的RNA聚合酶、MV的核蛋白(N)、MV的磷蛋白(N)以及任选存在的MV RNA聚合酶大蛋白(L)。
18.活性成分组合物或组合体，其包含与表达CHIKV结构蛋白的CHIKV-病毒样颗粒、特别是CHIKV-CE3E26KE1 VLP联用的权利要求17的重组感染性复制MV-CHIK病毒颗粒以及药物学可接受的载体。
19.包含与CHIKV结构蛋白尤其与CHIKV-病毒样颗粒、特别是CHIKV-CE3E26KE1 VLP联用的重组感染性复制MV-CHIK病毒颗粒的活性成分组合物或组合体，或权利要求1-18任一项的组合物，其用作疫苗，在需要的宿主、特别是人宿主中引发针对CHIK病毒的保护性免疫应答，特别是引发针对所述CHIKV蛋白的抗体和/或细胞免疫应答。
20.与CHIKV结构蛋白特别是CHIKV病毒样颗粒、特别是CHIKV-CE3E26KE1 VLP联用的重组感染性复制MV-CHIKV病毒颗粒或权利要求18的组合物，用于治疗或预防受试者、特别是人中屈曲病毒的感染。
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