CN113416714A - 一种表达埃博拉gp蛋白的重组病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种表达埃博拉gp蛋白的重组病毒及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113416714A
CN113416714A CN202110704819.6A CN202110704819A CN113416714A CN 113416714 A CN113416714 A CN 113416714A CN 202110704819 A CN202110704819 A CN 202110704819A CN 113416714 A CN113416714 A CN 113416714A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
makona
protein
recombinant
ebola
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110704819.6A
Other languages
English (en)
Inventor
步志高
王翀
温志远
葛金英
王喜军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Original Assignee
Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harbin Veterinary Research Institute of CAAS filed Critical Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority to CN202110704819.6A priority Critical patent/CN113416714A/zh
Publication of CN113416714A publication Critical patent/CN113416714A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14111—Ebolavirus, e.g. Zaire ebolavirus
    • C12N2760/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14111—Ebolavirus, e.g. Zaire ebolavirus
    • C12N2760/14134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20221—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20251—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2760/20252—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)

Abstract

本发明属于生物工程技术领域。具体涉及一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒、该重组病毒的构建、制备方法及其在抗埃博拉病毒中的应用。所述的重组病毒为可以表达埃博拉GP蛋白的重组水泡型口炎病毒rVSVΔG‑Makona‑GP；该病毒含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI‑RzVSVΔG‑Makona‑GP。本发明的优点：(1)重组病毒易于增殖、致病性极低、无基因漂移风险、安全性更高。(2)重组病毒的构建方法简单，易行，易于大规模生产。(3)重组病毒对EBOV具有交叉保护能力。(4)疫苗一次免疫食蟹猴就可以快速激发体液免疫反应，产生特异性EBOV中和抗体。

Description

一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域。具体涉及一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒、该重组病毒的构建、制备方法及其在抗埃博拉病毒中的应用。
背景技术
埃博拉病毒病(Ebola virus disease，EVD)是由埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)感染引起的急性，发热并伴有严重出血症状的烈性人兽共患病。EBOV是致死率最高的病原之一，感染后致死率最高可达90％。自1976年EHF在扎伊尔东北部和苏丹南部暴发以来，至今发生过多次疫情。至今已发现并分离多种抗原型的EBOV，分别为扎伊尔型(Zaire Ebolavirus,ZEBOV)，苏丹型(Sudan ebola virus,SEBOV)，莱斯顿型(Reston ebola virus,REBOV)，本迪布焦型(Bundigbugyo ebola virus,BEBOV)和塔伊森林型(
Figure BDA0003130746180000011
Forest ebolavirus，TAFV)，而其中ZEBOV爆发次数最多、致死率最高。EVD病程短，感染1～4天就会死亡。
EBOV属于丝状病毒科(Filoviridae)，EBOV属，具有囊膜，基因组为不分节段的单股负链RNA病毒。EBOV的基因组编码7种结构蛋白，从3’端到5’端依次为核蛋白(NP)，VP35，VP40，糖蛋白(GP)，VP30，VP24以及RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(L)，此外，EBOV还编码两种非结构蛋白：sGP和ssGP。EBOV的GP蛋白是病毒粒子表面唯一的跨膜蛋白，通过与宿主细胞表面的受体结合介导病毒与宿主细胞融合，使病毒吸附并进入细胞。成熟的GP蛋白以三聚体的形式呈现在病毒粒子表面，是诱导产生中和抗体的最关键蛋白，是保护动物免受病毒感染的最关键的免疫原性蛋白。
2014年在西非出现的疫情是继1976年首次发现EBOV以来发生的最严重且最复杂的EBOV疫情。此次疫情爆发流行的EBOV属于ZEBOV，但其为一个新变种，其GP蛋白与1976年的ZEBOV株相比，氨基酸同源性为97.6％。2014年西非流行株的抗原性与之前相比发生了一定的变化。研制能够快速激发免疫应答的疫苗对于紧急免疫、挽救病人生命，非常重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒和该重组病毒的构建方法，方法简单，易行，易于大规模生产。本发明还提供了该重组病毒的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒，所述的重组病毒为可以表达埃博拉GP蛋白的重组水泡型口炎病毒rVSVΔG-Makona-GP；
该病毒含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP。
进一步的，所述的Makona GP蛋白基因序列为合成基因序列，其以EBOV西非流行株Makona株(GeneBank:KP178538.1)的GP的基因序列按照哺乳动物密码子偏噬性对GP蛋白进行人工密码子优化并合成，并在在起始密码ATG前分别引入VSV基因起始、终止及Kozak序列；其3’→5’的顺序为：
TATGAAAAAAACTAACAGATATCACGACGCGTACAACC。
本发明还提供一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法。
表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法，其步骤如下：
(1)根据合成的Makona GP蛋白基因序列，以VSV病毒基因组质粒pCI-RzVSVΔG插入位点Nhe I序列为同源臂，设计用于构建表达Makona GP基因的重组基因组全长cDNA质粒的同源重组引物F1-F和F1-R；
(2)用限制性内切酶Nhe I酶切、线性化VSV病毒基因组质粒pCI-RzVSVΔG，胶回收纯化线性载体；
(3)采用PCR方法，以合成的Makona GP蛋白基因为模板，用引物F1-F和F1-R扩增Makona GP基因，胶回收纯化Makona GP基因；
(4)将Makona GP蛋白基因同源重组至载体pCI-RzVSVΔG的Nhe I位点，构成含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP；
(5)将重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L，采用脂质体转染的方法共转染宿主细胞；
(6)培养步骤(5)所述的宿主细胞2～4代；
(7)收获步骤(6)所述细胞释放的病毒，即为表达Makona GP蛋白基因重组水疱性口炎病毒rVSVΔG-Makona-GP。
进一步的，所述的引物F1-F和F1-R序列如下，
Figure BDA0003130746180000031
进一步的，步骤所述的(5)中的宿主细胞为HEK293细胞。
进一步的，步骤所述的(6)中的培养宿主细胞方法为：
HEK293细胞共转染重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L 48h后，更换培养基，5％CO2、37℃继续培养直至出现细胞圆缩病变，收获培养物上清；培养物上清10倍稀释后接种于单层Vero E6细胞，连续接种2～4代后，收获Vero E6细胞释放的病毒。
进一步的，所述的培养基为含10％胎牛血清的DMEM。
本发明还提供一种埃博拉病毒病疫苗。
一种埃博拉病毒病疫苗，其含有表达埃博拉GP蛋白的重组病毒和药学上可接受的载剂。
本发明还提供一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的应用。
一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的用途，重组病毒在埃博拉病毒抗血清制备中的应用；
重组病毒在制备抗埃博拉GP蛋白血清中的应用。
一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；所述试剂、检测板或试剂盒用于检测样品中埃博拉病毒GP蛋白；所述药剂用于治疗或预防埃博拉病毒感染。
本发明提供的一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒，利用水泡型口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)作为表达埃博拉GP蛋白的重组病毒基因的疫苗载体，具有如下优势：易于在多种细胞系上增殖到高滴度；在活体内能引发很强的体液免疫和细胞免疫，并且能引发粘膜免疫和系统性免疫；VSV在人群中阳性血清率极低，对人的致病性极低；VSV是单股负链RNA病毒，不会在人体内进行基因重排，无基因漂移风险；以VSV为疫苗载体且以外源病毒G蛋白将VSV G蛋白替换可以免防止被免疫个体产生针对载体的抗体，安全性更高，相同载体疫苗可以多次免疫；采用VSV病毒为载体构建的埃博拉病毒G蛋白嵌合型的重组VSV疫苗，一次低剂量免疫就能够快速形成完全的保护免疫，动物即使在埃博拉攻毒24小时后进行VSV嵌合病毒疫苗紧急免疫，也能够分别提供部分或100％的保护。
本发明提供的一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒，是具有传代能力的重组病毒。
本发明提供的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒和该重组病毒的构建方法简单，易行，易于大规模生产。
可以从本发明提供的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒基因组中扩增得到GP基因，所获PCR产物序列与预期目的片段相符，Makona GP基因成功插入表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的基因组。且重组病毒感染的细胞内EBOV GP能够正确表达。Western blotting检测重组病毒对Makona GP蛋白的表达结果显示，Makona GP蛋白在重组病毒感染的细胞中可以表达。通过实验，结果显示：(1)重组病毒免疫组小鼠体重的增长曲线与PBS对照组基本一致，表明重组病毒对小鼠具有良好的安全性；(2)重组病毒rVSVΔG-Makona-GP对小鼠具有免疫原性，可以诱导小鼠产生高水平的中和抗体；(3)以2014年EBOV西非流行株构建的重组病毒rVSVΔG-Makona-GP免疫的小鼠血清对1976年的EBOV毒株具有相同的中和作用，可以提供交叉保护；(4)在免疫后7天有一只食蟹猴血清转阳，免疫后14天三只食蟹猴血清均转阳，中和抗体最高为1:128。
本发明提供的重组病毒(重组水泡型口炎病毒rVSVΔG-Makona-GP)免疫的小鼠血清对基于1976年流行的EBOV GP蛋白构建的毒株rVSVΔG-eGFP-ZarieGP具有相同的保护效力，该疫苗候选株rVSVΔG-Makona-GP对EBOV具有交叉保护能力。本发明制备的rVSVΔG-Makona-GP疫苗一次免疫食蟹猴，就可以快速激发体液免疫反应，产生特异性EBOV中和抗体。
本发明提供的重组病毒可进一步大量制备对埃博拉GP蛋白是诱导产生中和抗体的最关键蛋白，是保护动物免受病毒感染的最关键的免疫原性蛋白，为抗血清和抗埃博拉病毒的疫苗研制提供原创性技术支撑，具有广泛的应用前景。
与现有技术相比，本发明提供的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒及其制备方法和应用的优点：
(1)重组病毒易于增殖、致病性极低、无基因漂移风险、安全性更高。
(2)重组病毒的构建方法简单，易行，易于大规模生产。
(3)重组病毒对EBOV具有交叉保护能力。
(4)疫苗一次免疫食就可以快速激发体液免疫反应，产生特异性EBOV中和抗体。
附图说明
图1是本发明提供Makona GP蛋白嵌合型的重组VSV病毒基因组结构示意图。
图2是RT-PCR鉴定重组病毒的GP基因。
图3是IFA鉴定Makona GP蛋白在重组病毒感染细胞中的表达(A：未感染的Vero E6细胞；B：感染重组病毒rVSVΔG-Makona-GP的Vero E6细胞)。
图4是IFA Western bloting检测Makona GP蛋白在重组病毒感染细胞中的表达(M：Marker 1:Vero E6细胞2:rVSV-EGFP 3:rVSVΔG-eGFP-MakonaGP4:rVSVΔG-Makona-GP)。
图5是电镜观察重组病毒的形态特征照片(A：重组病毒rVSVΔG-Makona-GP电镜观察结果；B：重组病毒rVSVΔG-Makona-GP免疫电镜观察结果)。
图6是重组病毒的生长动力学曲线。
图7是重组病毒免疫组小鼠体重的增长曲线。
图8是重组病毒免疫小鼠血清中和抗体检测结果。
图9是重组病毒免疫小鼠血清中和抗体交叉保护性检测结果。
图10是Makona GP蛋白嵌合型的重组VSV病毒免疫食蟹猴中和抗体水平结果。
具体实施方式
为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，以下实施例对本发明的作进一步详细描述，以下实施例仅用于说明发明，但不用来限制本发明的范围。
一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒，所述的重组病毒为可以表达埃博拉GP蛋白的重组水泡型口炎病毒rVSVΔG-Makona-GP；
该病毒含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP。
进一步的，所述的Makona GP蛋白基因序列为合成基因序列，其以EBOV西非流行株Makona株(GeneBank:KP178538.1)的GP的基因序列按照哺乳动物密码子偏噬性对GP蛋白进行人工密码子优化并合成，并在在起始密码ATG前分别引入VSV基因起始、终止及Kozak序列；其3’→5’的顺序为：
TATGAAAAAAACTAACAGATATCACGACGCGTACAACC。
本发明还提供一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法。
表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法，其步骤如下：
(1)根据合成的Makona GP蛋白基因序列，以VSV病毒基因组质粒pCI-RzVSVΔG插入位点Nhe I序列为同源臂，设计用于构建表达Makona GP基因的重组基因组全长cDNA质粒的同源重组引物F1-F和F1-R；
(2)用限制性内切酶Nhe I酶切、线性化VSV病毒基因组质粒pCI-RzVSVΔG，胶回收纯化线性载体；
(3)采用PCR方法，以合成的Makona GP蛋白基因为模板，用引物F1-F和F1-R扩增Makona GP基因，胶回收纯化Makona GP基因；
(4)将Makona GP蛋白基因同源重组至载体pCI-RzVSVΔG的Nhe I位点，构成含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP；
(5)将重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L，采用脂质体转染的方法共转染宿主细胞；
(6)培养步骤(5)所述的宿主细胞2～4代；
(7)收获步骤(6)所述细胞释放的病毒，即为表达Makona GP蛋白基因重组水疱性口炎病毒rVSVΔG-Makona-GP。
进一步的，所述的引物F1-F和F1-R序列如下，
Figure BDA0003130746180000081
进一步的，步骤所述的(5)中的宿主细胞为HEK293细胞。
进一步的，步骤所述的(6)中的培养宿主细胞方法为：
HEK293细胞共转染重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L 48h后，更换培养基，5％CO2、37℃继续培养直至出现细胞圆缩病变，收获培养物上清；培养物上清10倍稀释后接种于单层Vero E6细胞，连续接种2～4代后，收获Vero E6细胞释放的病毒。
进一步的，所述的培养基为含10％胎牛血清的DMEM。
本发明还提供一种埃博拉病毒病疫苗。
一种埃博拉病毒病疫苗，其含有表达埃博拉GP蛋白的重组病毒和药学上可接受的载剂。
本发明还提供一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的应用。
一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的用途，重组病毒在埃博拉病毒抗血清制备中的应用；
重组病毒在制备抗埃博拉GP蛋白血清中的应用。
一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；所述试剂、检测板或试剂盒用于检测样品中埃博拉病毒GP蛋白；所述药剂用于治疗或预防埃博拉病毒感染。
实施例1
一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒，所述的重组病毒为可以表达埃博拉GP蛋白的重组水泡型口炎病毒rVSVΔG-Makona-GP；该病毒含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP。
所述的Makona GP蛋白基因序列为合成基因序列，其以EBOV西非流行株Makona株(GeneBank:KP178538.1)的GP的基因序列按照哺乳动物密码子偏噬性对GP蛋白进行人工密码子优化并合成，并在在起始密码ATG前分别引入VSV基因起始、终止及Kozak序列；其3’→5’的顺序为：
TATGAAAAAAACTAACAGATATCACGACGCGTACAACC。
实施例2
表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法，其步骤如下：
(1)根据合成的Makona GP蛋白基因序列，以VSV病毒基因组质粒pCI-RzVSVΔG插入位点Nhe I序列为同源臂，设计用于构建表达Makona GP基因的重组基因组全长cDNA质粒的同源重组引物F1-F和F1-R；
(2)用限制性内切酶Nhe I酶切、线性化VSV病毒基因组质粒pCI-RzVSVΔG，胶回收纯化线性载体；
(3)采用PCR方法，以合成的Makona GP蛋白基因为模板，用引物F1-F和F1-R扩增Makona GP基因，胶回收纯化Makona GP基因；
(4)将Makona GP蛋白基因同源重组至载体pCI-RzVSVΔG的Nhe I位点，构成含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP；
(5)将重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L，采用脂质体转染的方法共转染宿主细胞；
(6)培养步骤(5)所述的宿主细胞2～4代；
(7)收获步骤(6)所述细胞释放的病毒，即为表达Makona GP蛋白基因重组水疱性口炎病毒rVSVΔG-Makona-GP。
所述的引物F1-F和F1-R序列如下，
Figure BDA0003130746180000101
步骤所述的(5)中的宿主细胞为HEK293细胞。
步骤所述的(6)中的培养宿主细胞方法为：HEK293细胞共转染重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L 48h后，更换培养基，5％CO2、37℃继续培养直至出现细胞圆缩病变，收获培养物上清；培养物上清10倍稀释后接种于单层Vero E6细胞，连续接种2～4代后，收获Vero E6细胞释放的病毒。所述的培养基为含10％胎牛血清的DMEM。
实施例3
一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的用途，重组病毒在埃博拉病毒抗血清制备中的应用；重组病毒在制备抗埃博拉GP蛋白血清中的应用。
实施例4
一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；所述试剂、检测板或试剂盒用于检测样品中埃博拉病毒GP蛋白；所述药剂用于治疗或预防埃博拉病毒感染。
实施例5
表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法
1.材料与方法
1.1质粒和毒株
水疱性口炎病毒(VSV)全长cDNA重组质粒pCI-Rz-VSV-FL和辅助蛋白表达质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所重要人兽共患病与烈性外来病创新团队构建、保存。表达绿色荧光蛋白的VSV重组EBOV扎伊尔型糖蛋白嵌合型重组病毒(rVSVΔG-eGFP-ZarieGP)、表达绿色荧光蛋白的VSV重组EBOV Makona株糖蛋白嵌合型重组病毒(rVSVΔG-eGFP-MakonaGP)以及rVSVΔG-eGFP-ZarieGP免疫小鼠血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所重要人兽共患病与烈性外来病创新团队建立并保存。选择EBOV西非流行株Makona株(GeneBank:KP178538.1)的GP的基因序列按照哺乳动物密码子偏噬性对GP蛋白进行人工密码子优化并合成，同时在起始密码ATG前分别引入VSV基因起始、终止及Kozak序列(TATGAAAAAAACTAACAGATATCACGACGCGTACAACC)。
1.2细胞与试剂
HEK293细胞和Vero E6细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所重要人兽共患病与烈性外来病创新团队保存、培养。HEK293细胞和Vero E6细胞培养液为含10％胎牛血清的DMEM。高保真DNA聚合酶(Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase)、快速克隆试剂盒(ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit)购自南京诺维赞生物科技股份有限公司。X-tremeGENETM9 DNA转染试剂购自Merck公司。抗EBOV GP蛋白单克隆抗体由购自北京义翘神州科技股份有限公司。罗丹明(TRITC)标记的山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。胎牛血清购自赛默飞世尔科技有限公司。DMEM培养液购自西格玛奥德里奇贸易有限公司。
1.3引物设计与合成
根据合成的Makona GP蛋白基因序列，以VSV病毒基因组质粒pCI-RzVSVΔG插入位点Nhe I序列为同源臂，设计了用于构建表达Makona GP基因的重组基因组全长cDNA质粒的同源重组引物(表1)。
表1表达Makona GP基因重组基因组全长cDNA质粒所用引物
Figure BDA0003130746180000121
1.4表达Makona GP基因的重组VSV病毒基因组全长质粒的构建与拯救
用限制性内切酶Nhe I酶切、线性化pCI-RzVSVΔG，胶回收纯化线性载体。采用PCR方法，以合成的Makona GP蛋白基因为模板，用引物F1-F和F1-R扩增Makona GP基因，胶回收纯化Makona GP基因。利用快速克隆试剂盒，将Makona GP蛋白基因同源重组至载体pCI-RzVSVΔG的Nhe I位点，构成含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP。
HEK293细胞接种于35mm六孔板中，待过夜生长至80％～90％单层时，将重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L，采用脂质体转染的方法共转染HEK293细胞。转染48h后，换成新鲜的完全培养基，5％CO2、37℃环境继续培养直至出现细胞圆缩病变，收获培养物上清，10倍稀释后接种于单层Vero E6细胞，连续接种3代后，经PCR鉴定正确后，表达Makona GP蛋白基因重组水疱性口炎病毒命名为rVSVΔG-Makona-GP。
1.5间接免疫荧光法(IFA)检测重组病毒中外源蛋白的表达
Vero E6细胞接种于细胞培养皿中，待生长至80％～90％单层时，将重组病毒rVSVΔG-Makona-GP感染Vero E6细胞，48h后，弃去培养上清，PBS洗涤细胞2次，预冷的3％多聚甲醛室温固定30min。以1:200倍稀释抗EBOV GP蛋白多克隆抗体为一抗，作用1h。PBST洗涤后加入1:200倍稀释TRITC标记的山羊抗兔IgG为二抗，作用30min，PBST洗涤后荧光显微镜观察结果。
1.6Western blotting法检测重组病毒中Makona GP蛋白基因的表达
Vero E6细胞接种于6孔板中，待生长至80％～90％单层时，将重组病毒rVSVΔG-Makona-GP按MOI为0.01感染细胞，于5％CO2、37℃培养，48～72h后，弃去培养上清，PBS洗涤细胞2次，按每孔100μL体积加入细胞裂解液，收集裂解细胞，10,000×g离心10min，加入蛋白上样buffer后煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳，后将蛋白转印到NC膜上，以抗EBOV GP蛋白多克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG为二抗，通过化学发光成像系统成像并分析重组Makona GP蛋白表达情况。
1.7重组病毒的形态特征
Vero E6细胞接种于6孔板中，待生长至80％～90％单层时，将重组病毒rVSVΔG-Makona-GP按MOI为0.01感染细胞，于5％CO2、37℃培养，72h后，收获病毒感染细胞上清，3000rpm/min，离心15min，取上清10000rpm/min，离心15min，采用磷钨酸负染法将上清制备成样品，在电子显微镜下观察病毒粒子的形态。为观察嵌合病毒的囊膜纤突，将样品用抗EBOV GP蛋白多克隆抗体进行标记，以金颗粒标记的山羊抗兔二抗进行标记，将制备好的样品在电子显微镜下观察Makona GP蛋白在病毒粒子表面的分布情况。
1.8重组病毒的生长动力学
将重组病毒rVSVΔG-Makona-GP按MOI为0.01感染Vero E6细胞，于5％CO2、37℃培养，在感染后的12h、24h、36h、48h、60h、72hh、84和96h分别收集细胞上清，测定上清中病毒的TCID50。
1.9 BALB/c小鼠免疫试验
为了评估重组病毒rVSVΔG-Makona-GP的安全性和对小鼠的免疫原性，随机将6周龄雌性BALB/c小鼠分为3组，每组10只。分别以1×106TCID50/100μL/只、1×105TCID50/100μL/只和PBS/100μL/只的剂量经肌肉注射途径免疫小鼠，间隔3周加强免疫。各组小鼠随机选取5只于免疫前、初次免疫后第3周和第5周经眶下静脉丛采血，分离血清，在56℃水浴灭活30min，用于EBOV中和抗体检测。
1.10食蟹猴免疫试验
为了评估重组病毒rVSVΔG-Makona-GP对非人灵长类动物的免疫原性，随机将6只食蟹猴分为2组，每组3只。分别以1×107TCID50/1mL/只和PBS/1mL/只的剂量经肌肉注射途径免疫食蟹猴。各组食蟹猴于免疫前、免疫后第7天和第14周经静脉采血，分离血清，在56℃水浴灭活补体30min，灭活后的血清用于EBOV中和抗体检测。
1.11中和试验
检测血清中EBOV中和抗体的中和试验在96孔板上进行，步骤如下：首先将血清样品置于56℃水浴30min进行灭活，再将血清样品分别以不完全DMEM连续倍比稀释，每稀释度体积为25μL，与25μL约含200TCID50的EBOV rVSVΔG-eGFP-MakonaGP或rVSVΔG-eGFP-ZarieGP病毒液混合，37℃感作1h后，加入提前铺好长为单层的Vero E6细胞，每孔30μL，5％CO2、37℃培养48h后，置于荧光显微镜下观察rVSVΔG-eGFP-MakonaGP或rVSVΔG-eGFP-ZarieGP病毒感染形成的蚀斑情况。每个血清稀释度做8个重复。血清中EBOV中和抗体滴度被定义为能抑制50％蚀斑产生的最高血清稀释倍数。
实施例6
实施例5结果，结合图1～10所示。
2结果
2.1表达Makona GP蛋白基因重组VSV病毒的构建与拯救
根据合成基因Makona GP序列信息，利用引物在Makona GP基因末端引入酶切位点。用同源重组引物扩增并纯化回收合成基因片段，与同样经Nhe I处理的载体pCI-RzVSVΔG进行同源重组克隆，获得表达Makona GP基因重组VSV病毒全长cDNA克隆pCI-RzVSVΔG-Makona-GP，如图1所示。
将重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L，采用脂质体转染的方法共转染HEK293细胞。将出现细胞病变的细胞培养上清收集，继续传代。将救获的重组病毒在Vero-E6细胞中连续传代5次后，提取病毒RNA，利用GP特异性引物进行RT-PCR鉴定并测序。结果显示，重组病毒基因组中扩增得到GP基因，所获PCR产物序列与预期目的片段相符。证明Makona GP基因成功插入重组病毒基因组，如图2所示。
2.2 Makona GP蛋白在重组病毒感染细胞中的表达
将重组病毒rVSVΔG-Makona-GP以MOI为0.01感染Vero E6细胞，48h后以抗EBOVGP蛋白多克隆抗体为一抗，以TRITC标记的山羊抗兔IgG为二抗，DAPI对细胞核染色后进行IFA检测。结果显示，重组病毒感染的细胞内EBOV GP能够正确表达，如图3所示。
2.3 Western blotting检测重组病毒对Makona GP蛋白的表达
将重组病毒rVSVΔG-Makona-GP感染的细胞裂解后，样品经SDS-PAGE电泳后将蛋白转印到NC膜上，以抗EBOV GP蛋白多克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG为二抗进行Western blot鉴定，通过化学发光成像系统成像，结果显示Makona GP蛋白在重组病毒感染的细胞中可以表达，如图4所示。
2.4电镜观察重组病毒的形态特征
采用磷钨酸负染法将收获的重组病毒制备样品，病毒样品以EBOV GP特异性抗体进行标记，经金颗粒标记的山羊抗兔二抗进行染色，制备电镜样品观察病毒粒子形态。结果如图5A显示，表达Makona GP蛋白的嵌合型VSV病毒粒子rVSVΔG-Makona-GP呈子弹状形态，能够观察到病毒粒子及其表面的糖蛋白纤突。免疫电镜负染结果如图5B显示，重组病毒表面纤突能够被特异性胶体金颗粒附着。
2.5重组病毒的生长动力学
将重组病毒rVSVΔG-Makona-GP感染Vero E6细胞，于感染后的不同时间点取样并测定样品的TCID50。结果显示，重组病毒在感染Vero E6细胞的84h病毒滴度达到峰值，rVSVΔG-Makona-GP的滴度可达到1×106.19TCID50/mL，如图6所示。
2.6重组病毒对小鼠和食蟹猴的免疫结果
2.6.1重组病毒免疫小鼠的安全性
以肌肉注射途径免疫6周龄雌性BALB/c小鼠(详见1.9)，对小鼠进行连续观察14天，称量体重。结果表明，在观察期内，免疫的小鼠全部存活，无症状，重组病毒免疫组小鼠体重的增长曲线与PBS对照组基本一致，初步表明重组病毒对小鼠具有良好的安全性，如图7所示。
2.6.2重组病毒免疫小鼠的中和抗体
为了评估重组病毒rVSVΔG-Makona-GP对小鼠的免疫原性，用重组病毒rVSVΔG-Makona-GP经肌肉免疫途径各免疫小鼠10只，所有小鼠间隔3周进行加强免疫。结果显示：初次免疫后3周，所有rVSVΔG-Makona-GP免疫小鼠检测血清中均有中和抗体，1×106TCID50免疫组(28.4)的抗体平均水平略高于1×105TCID50免疫组(27.8)。加强免疫后，小鼠血清中平均中和抗体水平均上升，1×106TCID50免疫组(210.6)的抗体平均水平略高于1×105TCID50免疫组(28.0)。而免疫对照小鼠血清中则检测不到EBOV中和抗体。结果表明，重组病毒rVSVΔG-Makona-GP对小鼠具有免疫原性，可以诱导小鼠产生高水平的中和抗体，如图8所示。
2.6.3重组病毒的交叉保护性
为了评估重组病毒rVSVΔG-Makona-GP的交叉保护能力，分别随机选择三份rVSVΔG-Makona-GP和rVSVΔG-Zarie-GP免疫的小鼠血清，分别用rVSVΔG-eGFP-MakonaGP与rVSVΔG-eGFP-ZarieGP病毒液测定其中和抗体，比较重组病毒rVSVΔG-Makona-GP和rVSVΔG-Zarie-GP免疫的小鼠血清对两种重组病毒的保护能力。结果如图9所示，rVSVΔG-Makona-GP免疫的小鼠血清对两种重组荧光病毒中和抗体相同，而以rVSVΔG-Zarie-GP免疫的小鼠血清对重组病毒rVSVΔG-eGFP-ZarieGP的中和抗体比对重组病毒rVSVΔG-eGFP-MakonaGP高2倍。这一结果提示以2014年EBOV西非流行株构建的重组病毒rVSVΔG-Makona-GP免疫的小鼠血清对1976年的EBOV毒株具有相同的中和作用，可以提供交叉保护，而以1976年EBOV毒株构建的rVSVΔG-Zarie-GP免疫的小鼠血清对2014年EBOV西非流行株的保护作用要弱于对1976年EBOV毒株的保护作用。
2.6.4重组病毒免疫食蟹猴的中和抗体
将重组病毒rVSVΔG-Makona-GP按107TICD50/mL/只肌肉注射免疫食蟹猴3只，同时设置PBS对照组，1mL/只肌肉注射免疫食蟹猴3只。食蟹猴免疫7天和14天采血，分离血清。以200TCID50的rVSVΔG-eGFP-MakonaGP测定血清中中和抗体效价，结果显示，在免疫后7天有一只食蟹猴血清转阳，免疫后14天三只食蟹猴血清均转阳，中和抗体最高为1:128，如图10所示。
自1976年埃博拉病毒病首次出现至今，仍未有获批的特异性治疗药物。大多数病毒感染的爆发可以追溯至EBOV通过不明宿主以未知的方式“溢出”到人群。随后，通常病毒通过直接接触(非气溶胶)、人际接触传播、或由感染过的组织、体液或污染物传播。预防埃博拉病毒感染可以采取感染防控措施进行自我保护，比如避免接触疑似或确诊感染埃博拉者的体液、疑似或确诊死于埃博拉者的尸体，接种疫苗也可以有效预防埃博拉病毒感染。
近年来，多种策略构建的针对EBOV疫苗相继问世，其中包括载体重组疫苗，如甲病毒复制子、人腺病毒载体，猩猩腺病毒载体，人副流感病毒载体，巨细胞病毒载体，狂犬病病毒载体，改良安卡拉痘苗病毒等，或病毒样颗粒，复制缺陷型的EBOV病毒，其中一些进入不同的临床试验阶段。重组载体疫苗中，进展最快的是以水泡性口炎病毒为载体重组扎伊尔型埃博拉病毒GP蛋白的rVSV-ZEBOV疫苗，在几内亚进行的临床试验证明，rVSV-ZEBOV疫苗具有很强的保护作用，并且具有良好的安全性。2019年12月，FDA批准了重组EBOV GP蛋白VSV载体疫苗在18岁以上人群接种。2019年10月，欧洲药品管理局获得了rVSV-ZEBOV疫苗的附条件销售授权，此后不久，欧洲委员会和美国食品药品监督管理局宣布批准该疫苗用于预防EVD，经过欧洲的认可委托，该疫苗已获准用于属于欧盟的国家。这充分证明了以VSV为载体的EBOV GP蛋白疫苗的安全性和有效性。rVSV-ZEBOV疫苗针对1976年出现的EBOV GP蛋白设计，近年来，埃博拉疫情不时在西非爆发，当前病毒流行株的抗原性与1976年的毒株相比发生了一定的变化，而发明制备的rVSVΔG-Makona-GP免疫的小鼠血清对基于1976年流行的EBOV GP蛋白构建的毒株rVSVΔG-eGFP-ZarieGP具有相同的保护效力，说明该疫苗候选株rVSVΔG-Makona-GP对EBOV具有交叉保护能力。本发明制备的rVSVΔG-Makona-GP疫苗一次免疫食蟹猴，就可以快速激发体液免疫反应，产生特异性EBOV中和抗体。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒，其特征在于，所述的重组病毒为可以表达埃博拉GP蛋白的重组水泡型口炎病毒rVSVΔG-Makona-GP；
该病毒含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP。
2.根据权利要求1所述的一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒，其特征在于：所述的Makona GP蛋白基因序列为合成基因序列，其以EBOV西非流行株Makona株(GeneBank:KP178538.1)的GP的基因序列按照哺乳动物密码子偏噬性对GP蛋白进行人工密码子优化并合成，并在在起始密码ATG前分别引入VSV基因起始、终止及Kozak序列；其3’→5’的顺序为：
TATGAAAAAAACTAACAGATATCACGACGCGTACAACC。
3.权利要求1所述的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法，其步骤如下：
(1)根据合成的Makona GP蛋白基因序列，以VSV病毒基因组质粒pCI-RzVSVΔG插入位点Nhe I序列为同源臂，设计用于构建表达Makona GP基因的重组基因组全长cDNA质粒的同源重组引物F1-F和F1-R；
(2)用限制性内切酶Nhe I酶切、线性化VSV病毒基因组质粒pCI-RzVSVΔG，胶回收纯化线性载体；
(3)采用PCR方法，以合成的Makona GP蛋白基因为模板，用引物F1-F和F1-R扩增MakonaGP基因，胶回收纯化Makona GP基因；
(4)将Makona GP蛋白基因同源重组至载体pCI-RzVSVΔG的Nhe I位点，构成含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP；
(5)将重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L，采用脂质体转染的方法共转染宿主细胞；
(6)培养步骤(5)所述的宿主细胞2～4代；
(7)收获步骤(6)所述细胞释放的病毒，即为表达Makona GP蛋白基因重组水疱性口炎病毒rVSVΔG-Makona-GP。
4.根据权利要求3所述的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法，其特征在于：所述的引物F1-F和F1-R序列如下，
Figure FDA0003130746170000021
5.根据权利要求3或4所述的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法，其特征在于：步骤所述的(5)中的宿主细胞为HEK293细胞。
6.根据权利要求3或4或5任意一项所述的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法，其特征在于：步骤所述的(6)中的培养宿主细胞方法为：
HEK293细胞共转染重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L 48h后，更换培养基，5％CO2、37℃继续培养直至出现细胞圆缩病变，收获培养物上清；培养物上清10倍稀释后接种于单层Vero E6细胞，连续接种2～4代后，收获Vero E6细胞释放的病毒。
7.根据权利要求3或4或5任意一项所述的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法，其特征在于：所述的培养基为含10％胎牛血清的DMEM。
8.一种埃博拉病毒病疫苗，其含有根据权利要求1～3中任一项所述的病毒和药学上可接受的载剂。
9.根据权利要求1～3中任一项所述的重组病毒的用途，其特征在于：重组病毒在埃博拉病毒抗血清制备中的应用；
重组病毒在制备抗埃博拉GP蛋白血清中的应用。
10.根据权利要求1～3中任一项所述的重组病毒的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
所述试剂、检测板或试剂盒用于检测样品中埃博拉病毒GP蛋白；
所述药剂用于治疗或预防埃博拉病毒感染。
CN202110704819.6A 2021-06-24 2021-06-24 一种表达埃博拉gp蛋白的重组病毒及其制备方法和应用 Pending CN113416714A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110704819.6A CN113416714A (zh) 2021-06-24 2021-06-24 一种表达埃博拉gp蛋白的重组病毒及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110704819.6A CN113416714A (zh) 2021-06-24 2021-06-24 一种表达埃博拉gp蛋白的重组病毒及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113416714A true CN113416714A (zh) 2021-09-21

Family

ID=77716768

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110704819.6A Pending CN113416714A (zh) 2021-06-24 2021-06-24 一种表达埃博拉gp蛋白的重组病毒及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113416714A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117925662A (zh) * 2023-12-19 2024-04-26 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 一种重组水泡性口炎病毒以及埃博拉出血热感染动物模型的构建方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105582532A (zh) * 2015-08-30 2016-05-18 李小彦 可溶性埃博拉病毒包膜蛋白疫苗的制备方法及其用途
CN107541522A (zh) * 2016-06-24 2018-01-05 华中农业大学 抗埃博拉病毒gp蛋白的单克隆抗体及其应用
CN111518815A (zh) * 2020-02-26 2020-08-11 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 通用埃博拉病毒病免疫球蛋白及其制备方法与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105582532A (zh) * 2015-08-30 2016-05-18 李小彦 可溶性埃博拉病毒包膜蛋白疫苗的制备方法及其用途
CN107541522A (zh) * 2016-06-24 2018-01-05 华中农业大学 抗埃博拉病毒gp蛋白的单克隆抗体及其应用
CN111518815A (zh) * 2020-02-26 2020-08-11 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 通用埃博拉病毒病免疫球蛋白及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AHX24658.2: "virion spike glycoprotein precursor", 《GENBANK》 *
JOAN G TELL等: "Environmental Risk Assessment for rVSVΔG-ZEBOV-GP, a Genetically Modified Live Vaccine for Ebola Virus Disease", 《VACCINES》 *
JOHN B RUEDAS等: "Spontaneous Mutation at Amino Acid 544 of the Ebola Virus Glycoprotein Potentiates Virus Entry and Selection in Tissue Culture", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 *
KP178538.1: "Zaire ebolavirus", 《GENBANK》 *
邵钰等: "埃博拉和马尔堡病毒囊膜糖蛋白嵌合型重组水泡性口炎病毒的构建及鉴定", 《中国预防兽医学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117925662A (zh) * 2023-12-19 2024-04-26 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 一种重组水泡性口炎病毒以及埃博拉出血热感染动物模型的构建方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhao et al. Newcastle disease virus (NDV) recombinants expressing infectious laryngotracheitis virus (ILTV) glycoproteins gB and gD protect chickens against ILTV and NDV challenges
Indran et al. Novel approaches to develop Rift Valley fever vaccines
AU2020277165B2 (en) Feline calicivirus vaccine
CN104918952B (zh) 表达屈曲病毒多肽的重组麻疹病毒及其应用
WO2022218325A1 (zh) 一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用
CN113201507B (zh) 一种重组的伪狂犬病病毒及其疫苗组合物
JP7374893B2 (ja) ネコカリシウイルスワクチン
CN100425291C (zh) O型口蹄疫病毒多基因复制缺陷型腺病毒活载体疫苗及制备方法
Yan et al. Vesicular stomatitis virus-based vaccines expressing EV71 virus-like particles elicit strong immune responses and protect newborn mice from lethal challenges
Wang et al. Recombinant rabies virus expressing the H protein of canine distemper virus protects dogs from the lethal distemper challenge
CN115851623A (zh) 非洲猪瘟mgf505-2r基因缺失减毒株的构建及作为疫苗的应用
CN113817753B (zh) 表达SARS-CoV-2纤突蛋白或其变异体SΔ21的假型化VSV病毒构建和应用
DK2310510T3 (en) IDNA vaccines and methods for their use
WO2022027749A1 (zh) 耐热表型稳定遗传、携带负标记的重组口蹄疫病毒无毒株及o/a型口蹄疫二价灭活疫苗
CN113416714A (zh) 一种表达埃博拉gp蛋白的重组病毒及其制备方法和应用
Wang et al. Rapid development of an effective newcastle disease virus vaccine candidate by attenuation of a genotype VII velogenic isolate using a simple infectious cloning system
Jia et al. Development of vaccines for prevention of peste-des-petits-ruminants virus infection
CN110904152A (zh) 表达非洲猪瘟病毒p54蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用
Wang et al. Parainfluenza virus 5 is a next‐generation vaccine vector for human infectious pathogens
CN102816741A (zh) 犬瘟热弱毒疫苗株f和h基因重组新城疫病毒活载体疫苗的构建及其应用
US20220185848A1 (en) Recombinant vaccine against marek's disease and newcastle disease
CN102641499A (zh) 口蹄疫病毒vp1基因重组小反刍兽疫病毒活载体疫苗构建及应用
CN102344913A (zh) 表达狂犬病病毒g蛋白重组犬瘟热病毒cdv/r-20/8疫苗株的构建
CN111481663B (zh) 一种流感病毒活疫苗及其制备方法
CN108743934B (zh) 利用重组水泡性口炎病毒构建预防猪流行性腹泻病毒疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210921