CN107541522A - 抗埃博拉病毒gp蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物免疫学技术领域。具体涉及抗埃博拉病毒GP蛋白的单克隆抗体及其应用。本发明公开了一种抗埃博拉病毒GP蛋白的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C2016106的杂交瘤细胞株所分泌的。本发明还公开了所述单克隆抗体的制备方法和用途。本发明的单克隆抗体特异性强、生物结合活性好，与感染含GP基因的重组杆状病毒感染的sf9细胞发生反应，而不与正常的sf9细胞反应。可应用于制备检测埃博拉病毒GP蛋白的试剂盒和免疫分析上。

Description

抗埃博拉病毒GP蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉生物免疫学技术领域。具体涉及抗埃博拉病毒GP蛋白的单克隆抗体及其应用。所述的埃博拉病毒单克隆抗体来自鼠源。该单克隆抗体与埃博拉病毒GP蛋白具有较高的特异性和灵敏性，可应用于制备埃博拉病毒GP蛋白检测试剂。本发明为后续的人源化改造，研发具有中和埃博拉病毒的中和抗体，为后期发展成为临床治疗埃博拉病毒病抗体奠定物质基础。

背景技术

埃博拉病毒病(Ebola virus disease,EVD)是由埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)引起的一种死亡率很高的烈性人兽共患传染病。埃博拉病毒在动物与动物间，人与人间，动物与人间传播，多次在非洲大陆造成重大动物和人伤害。其中，2014年在西非地区暴发的埃博拉出血热疫情是目前最为严重的一次。2014年前的疫情传播地主要集中在6个非洲国家，而2014年爆发的疫情规模和覆盖范围变大，疫区新加了西班牙、马里、几内亚、美国、塞拉利昂、塞内加尔、尼日利亚、利比里亚等8个国家。截止到2015年5月27日，全世界共发现26969例病例，其中病死11135例。

针对该病毒的疫苗研究工作已经开始，研发的疫苗可分为传统疫苗和新型疫苗。传统疫苗由于其需要在生物安全四级实验室操作，灭活不彻底会对人类造成伤害等因难以继续发展。目前的新型疫苗的研发主要集中在三大类：亚单位疫苗、DNA疫苗、病毒载体疫苗。比如通过杆状病毒表达系统，在Sf-9细胞中表达EBOV GP蛋白，并在C端连入IgG1中Fc片段，纯化后，加入佐剂乳化免疫小鼠，可以诱导中和抗体产生，获得抵抗EBOV致死剂量的保护力。在293T细胞(人肾上皮细胞)中，共表达含EBOV GP蛋白和VP40蛋白的载体，可获得空间结构类似天然的病毒的病毒样颗粒，免疫小鼠后，较普通抗原有更强诱导中和抗体产生能力，对非人类灵长类动物有保护力。不过，目前埃博拉病仍没没有合法有效的疫苗，也无有效的治疗方法。因此，需要寻找其他预防和治疗病毒感染的药剂。

埃博拉病毒属丝状病毒科，外有包膜，包膜上有成分为衣壳蛋白的突起，内有由负链RNA分子和四个毒力基因组成的核鞘，病毒颗粒呈管状，直径约80nm，有多种外形，其中以分支形较常见。埃博拉病毒基因编码产物包括一种核蛋白NP，3种糖蛋白(GP、sGP、ssGP)，4种病毒毒力结构蛋白(VP24、VP30、VP35、VP40)。其序列为：3`-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5`，基因间没有共同区域。

其中，GP蛋白是Ⅰ型跨膜蛋白，有676个氨基酸残基组成，相对分子质量为150000-170000，是埃博拉病毒表面棘突的唯一结构蛋白，通过与受体结合介导病毒进入宿主细胞，同时GP蛋白能诱导产生中和抗体，是研制疫苗的重要靶点。

因此研发一种针对GP蛋白用于埃博拉病毒诊断的抗体以及一种有望用于临床治疗的埃博拉单克隆抗体迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，其第一个目的是提供一种埃博拉病毒GP基因编码的重组蛋白GP-300-KG。

本发明的第二个目的是利用上述重组蛋白制备一种抗埃博拉病毒GP蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体重链为IgG₁，轻链为Kappa链。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种埃博拉病毒GP基因编码的重组蛋白基因，其核苷酸序列和对应的氨基酸序列如SEQID NO:1中第1-1578位碱基所示。

一种埃博拉病毒GP基因编码的重组蛋白，该蛋白编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。

所述的重组蛋白作为埃博拉病毒GP抗原蛋白的应用。

一种单克隆抗体，它是由所述的重组蛋白免疫动物后得到的杂交瘤细胞株1C1所分泌的，申请人将该杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株1C1，于2016年5月24日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：C2016106。

本发明还包括所述的单克隆抗体在检测埃博拉病毒GP蛋白中的应用。

本发明的有益效果在于：

1.本发明的杂交瘤细胞株，经3次克隆筛选，多次传代培养，染色体计数，该细胞株遗传稳定；该细胞株经液氮冻存，复苏后生长良好，抗体分泌未见衰退。

2.本发明的抗GP蛋白单克隆抗体具有高的特异性和灵敏性，能对产生EBOV GP蛋白的培养物进行定性检测，检测结果可作为判断依据。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是埃博拉病毒重组蛋白GP-300-KG基因的核苷酸序列(1-1578位碱基对应的序列，该序列也是该基因编码区)，序列长度为1578bp。

序列表SEQ ID NO：2是埃博拉病毒重组蛋白GP-300-KG基因编码的蛋白质序列，编码526个蛋白质。

图1:是本发明制备的杂交瘤细胞1C1染色体观察结果。附图标记说明：图1中的1为正常小鼠脾细胞，2为杂交瘤细胞1C1。

图2:是本发明包含GP基因重组杆状病毒的免疫印迹法检测结果。附图标记说明：图2中的A图为感染重组杆状病毒病毒的sf9细胞；图2中的B图为正常sf9细胞。

图3:是本发明包含GP基因重组杆状病毒的间接免疫荧光检测结果。附图标记说明：图3中的A图是感染重组杆状病毒病毒的sf9细胞，图3中的B图是正常sf9细胞。

图4：是本发明涉及的pKG-GST质粒图谱。

图5：是本发明制备的包含埃博拉病毒重组蛋白的pKG-GP-300重组质粒的图谱。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》。

具体实施方式

实施例1抗原的制备

1.埃博拉病毒GP基因片段的PCR扩增

根据埃博拉病毒GP基因序列(GenBank登录号：AF086833)，使用DNA STAR软件分析GP的免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果发现在1-300氨基酸片段的亲水性及抗原指数较高，故选取1-300位氨基酸的基因序列设计引物，以含有全GP基因表达质粒为模板，设计一对引物(上游引物:GCGGATCCATGGGCGTTACAGGAATATT；下游引物：CGAGCTCTTCATTTTTCTAGTGAGGTT；)，在上下游引物中分别引入BamH I和Sac I位点。经PCR扩增获得目的基因序列。

反应体系见表1和表2。

表1PCR反应体系

表2PCR反应条件

2.埃博拉病毒GP基因片段原核表达质粒的构建

埃博拉病毒GP基因片段(其核苷酸序列见SEQ ID NO：1第1-1578位碱基所示)和pGEX–KG载体(构建图谱如图4)分别用BamH I和Sac I双酶切后，使用胶回收试剂盒(购自Magen公司)回收酶切目的片段和载体，然后在T4DNA连接酶的作用下16℃进行连接，所得到的阳性重组质粒pKG-GP-300(图5)送到上海生工生物武汉分公司进行测序确认。

3.重组质粒pKG-GP-300的诱导表达

将重组质粒pKG-GP-300转化E.coli BL21(DE3)大场杆菌，挑取单菌落扩大培养，当活化培养的菌液的OD_600nm值在0.4-0.6时加入终浓度为1mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。在诱导表达4h后，取1mL诱导表达菌液于12000r/min离心1min，弃上清，用100μL PBS(即磷酸盐缓冲液，配方：80g NaCl，2g KCl，2g KH2PO4，29gNa2HPO4·12H2O用8000mL ddH2O充分溶解，调pH值至7.4，定容至10L)将沉淀重悬。加入25μL 5×SDS-PAGE Loading Buffer，混匀后，100℃沸水中煮沸10min后，置于冰上，作为SDS-PAGE检测的样品。同样取诱导表达5h的菌液离心后用100μL PBS重悬，将重悬的菌液经超声波破碎仪破碎，10000r/min离心30min后，用100μL PBS重悬沉淀，分别取上清和沉淀加入适量的SDS-PAGE Loading Buffer制备样品，进行SDS-PAGE检测。经检测发现重组的GP蛋白在诱导后4h获得高效表达，并且是以包涵体形式的形式存在。

4.重组蛋白的纯化

取大量诱导后的菌液200mL，在8,000r/min离心5min，收集所有菌体，用20mL包涵体提取用缓冲液A(缓冲液A配方：6.07g Tris，0.1861g EDTA，2.922g NaCl，50mL甘油，用800mL ddH₂O充分混匀，用ddH₂O定容至1L)重悬后，加入20μL二硫苏糖醇(DTT)，高压破碎。破碎后，在4℃12,000r/min离心10min，弃掉上清，沉淀用灭菌水洗涤两次，加入19.7mL缓冲液A、0.3mL十二烷基肌氨酸钠(SKL，20％)和20μL DTT，剧烈震荡后，于室温下静置0.5-2.0h。随后，在4℃，12,000r/min离心10min，收集上清，在上述上清中加入210μL聚乙烯醇(即PEG，购自sigma公司)4000(20％)、420μL氧化性谷胱甘肽(50mmol/L)、420μL还原性谷胱甘肽(100mmol/L)，装袋后透析3天；第一天2h换透析液一次，第二天4-5h换透析液一次，第三天换透析液两次。完成透析后，用PEG8000进行浓缩至需要体积，经SDS-PAGE电泳检测可知纯化效果良好，使用微量紫外分光光度计进行蛋白浓度测定，分装后作为免疫小鼠的免疫原于-80℃保存。

实施例2单克隆抗体的制备

1.小鼠免疫

选取6周龄雌性SPF级BALB/c小鼠6只(购自湖北省疾病预防控制中心)。取实施例1中制备的免疫原100μg截断GP蛋白容易与等体积的完全弗氏佐剂(购自sigma公司)乳化，小鼠背部皮下注射进行第一次免疫。14d和28d后使用相同的剂量与等体积不完全弗氏佐剂(购自sigma公司)乳化后进行第二次和第三次免疫。三免后第14d对免疫组和空白组小鼠进行断尾采血，分离血清，用间接ELISA方法(Engvall,E.(2010).The ELISA,enzyme-linkedimmunosorbent assay.Clin Chem,56(2),319-320.doi:10.1373/clinchem.2009.12780.)检测小鼠血清效价。在进行细胞融合的前4天，需对效价较高的小鼠进行加强免疫。

2.SP2/0骨髓瘤细胞的制备

将实验室冻存的SP2/0骨髓瘤细胞(常规生物材料)复苏，用1640基础培养基(购自sigma公司)进行培养，待细胞长势良好且细胞计数达1×10⁷左右，将细胞收集起来，用200μL1640基础培养基重悬，在6-8周龄的BALB/c小鼠的颈背部皮下多点注射。

经过10-14d左右，可眼观小鼠背部长出一定大小的实体瘤，按常规方法将小鼠处死，用75％酒精浸泡5min，在超净台上将小鼠固定，将实体瘤的位置向上，在无菌条件下取出实体瘤，置于匀浆器中，加5mL 1640基础培养基充分研磨后，补加10mL 1640基础培养基并混匀，静置5min；轻轻吸取上层细胞悬液至无菌离心管中备用。再在匀浆器中补加10mL 1640基础培养基并混匀，静置5min；轻轻吸取上层细胞悬液至无菌离心管中备用。如此重复两次；将离心管中的细胞悬液1000r/min离心10min后去上清，用15mL 1640基础培养基重悬细胞沉淀，于另一无菌50mL离心管中加入15mL的淋巴细胞分离液(购自天津灏洋生物制品有限公司)，将重悬后的骨髓瘤细胞悬液沿管壁轻轻地加在淋巴细胞分离液上1000r/min离心10min；吸取两界面分界处致密的白色细胞层于另一离心管之中，用1640基础培养基洗涤两次，最后用10mL 1640基础培养基重悬，计数后备用。

3.细胞融合

将SP2/0骨髓瘤细胞悬液【1×10⁷细胞数】与免疫脾细胞悬液【(1×10⁸cells，一个脾脏的细胞量大约为1×108)在50mL离心管中混匀，1000r/min，离心10min，弃去上清后，用灭菌滤纸吸取残留液体，轻弹管底使细胞松动，在37℃水浴环境下，1min中内缓慢加入聚乙烯醇(PEG)800μL，边加边轻轻搅拌；再继续搅拌1min；在第3min时加入1mL预热到37℃的1640基础培养基；第4-5min时加入3mL 1640基础培养基；第6min时加入5mL 1640基础培养基；最后缓慢加入30mL 1640基础培养基；在1000r/min，离心10min，弃去上清后，37℃放置5-8min；将细胞用60mL HAT培养基(购自sigma公司)重悬，接于之前制备的饲养细胞的96孔板内，每孔150μL，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。

4.阳性杂交瘤细胞的筛选

细胞融合后第5天，每孔补加一滴HAT培养基，从第7天开始，每天弃掉一半用过的培养基再补加新鲜的HT培养基(购自sigma公司)，观察细胞集落的大小，在达到培养孔1/4时，可进行间接ELISA检测。在间接ELISA检测的前一天，将孔内所有培养基吸出，补加新鲜HT培养基。在进行间接ELISA检测时，每孔吸出50μL培养基作为一抗。将ELISA检测OD₆₃₀值较高的阳性杂交瘤细胞做好标记，补加新鲜的HT培养基准备扩大，并做亚克隆。

5.阳性杂交瘤细胞的亚克隆

用常用有限稀释法(Che,X.Y.,Qiu,L.W.,Pan,Y.X.,Wen,K.,Hao,W.,Zhang,L.Y.,...Yuen,K.Y.(2004).Sensitive and specific monoclonal antibody-based capture enzymeimmunoassay for detection of nucleocapsid antigen in sera from patients with severe acuterespiratory syndrome.J Clin Microbiol,42(6),2629-2635.doi:10.1128/jcm.42.6.2629-2635.2004)对筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，亚克隆前一天先制备饲养细胞，将饲养细胞提前铺至96孔板(一个脾脏可铺4-8块96孔板)，添加量150μL/孔；将需要亚克隆的杂交瘤细胞从96孔板培养孔内重悬并吸取至一洁净的EP管内。按倍比稀释的原则进行细胞计数，并逐步稀释至20个细胞/mL。将此浓度的细胞悬液接于制备的含饲养细胞的96孔板内，每孔加量为100μL，即每孔理论上含有2个杂交瘤细胞；待亚克隆第5天，观察每孔杂交瘤细胞的生长状态，着重标记好具有单集落的培养孔；待亚克隆第7-10天，杂交瘤细胞长至达到培养孔约1/5-1/3时，用间接ELISA方法进行检测；挑选阳性且为单集落的孔按同样方法进行亚克隆，重复3次，获得1株能稳定分泌抗EBOV GP蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株，申请人将得到的杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞1C1，于2016年5月24日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：C2016106。

6.单克隆抗体的大量制备

选取6周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射500uL弗氏不完全佐剂预刺激，1周后将1×10⁶细胞数的杂交瘤细胞腹腔注射小鼠，当小鼠腹部膨大时(大约10天)收集腹水，将收集到的腹水用抗体纯化试剂盒(购自Thermo公司)进行纯化，最终获得纯化的单克隆抗体，使用微量紫外分光光度计测定该单抗的抗体浓度，分装后置于-80℃保存。

实施例3杂交瘤细胞的遗传稳定性检测

杂交瘤细胞株克隆纯化后，接种到24孔细胞培养板上培养，待细胞生长至对数生长期时，往细胞上清中添加终浓度为0.4mg/mL的秋水仙素，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养3h；用断头枪头轻轻吹打细胞，使细胞悬浮，吸出细胞悬液，置4mL EP管中1000r/min离心10min；加入1mL 37℃预热的0.075mol/L KCl低渗溶液，轻轻重悬细胞，将细胞悬液置于37℃温箱静置30min；加入1mL新配制的固定液(甲醇∶冰乙酸体积比＝3:1)，混匀，1000r/min离心10min，弃上清液；再加入1mL固定液，轻轻混匀，37℃温箱静置30min，1000r/min离心10min，弃上清液；加入200μL固定液，轻轻混匀，吸取50μL细胞悬液滴在4℃预冷的载玻片上，让液面均匀展开，载玻片置于室温自然干燥；吸取10％吉姆萨染色液滴加到整个载玻片上，染色10-15min；染色完成后用流水冲洗载玻片，室温自然干燥。光学显微镜下初步观察后，在显微镜的油镜下观察染色特形态并计数，拍照存档。

结果显示：本发明的杂交瘤细胞1C1的染色体数量大约为100条左右，而正常小鼠脾细胞的染色体条数约为40，本发明的杂交瘤细胞1C1约为SP2/0细胞和正常脾细胞染色体数量之和(见图1)。说明本发明所筛选的杂交瘤细胞株是单个小鼠免疫脾细胞和单个小鼠骨髓瘤细胞融合所产生的，其染色体数是正确的，遗传性稳定。

实施例3单克隆抗体的生物活性检测

1.本发明制备的单克隆抗体的亚型鉴定

用商购Thermo公司的抗体亚型鉴定试剂盒进行检测，具体方法如下：TMB底物显色液(购自Thermo公司)和检测孔提前平衡至室温，用Tris-HCl缓冲盐溶液(TBS试剂，购自Thermo公司)将腹水按体积比为1:75000进行稀释(即先取1μL腹水加入到5mL TBS中，再从中取67μL的稀释液加入到933μL TBS中)；将稀释好腹水样品加入到检测孔中，再加入50μL HRP羊抗小鼠IgG+IgA+IgM(购自Thermo公司)，轻轻混匀，室温孵育1h；弃去酶标板中的液体，加入200μL洗涤液(即Wash Buffer，购自Thermo公司)洗涤5min，重复3次；加入75μL TMB底物显色液显色5-15min；最后加入75μL终止液(购自Thermo公司)，用酶标仪测定OD₄₅₀值，大于0.2的判定为阳性。

试验结果表明：本发明制备的1C1单克隆抗体的重链均为IgG₁，轻链均为Kappa链。

2.免疫印迹法检测

具体步骤如下所述

(1)sf9细胞经含GP基因的重组杆状病毒感染24小时时细胞出现明显病变，裂解细胞后，加入5×SDS蛋白电泳上样缓冲液(购自武汉博士德生物工程有限公司)，同时取正常细胞样品；

(2)将步骤(1)处理的样品加入电游仪上样孔中，每孔加入样品20μL，其中Marker 7μL，在稳定电压的条件下，起始时用低电压(80V)，待样品跑过浓缩胶后，加大电压至120V，电泳至溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳，取下凝胶；

(3)剪去电泳凝胶多余的部分，将其放在用转膜缓冲液(配制方法：2.9g甘氨酸，5.8gTris碱，0.37g SDS，200mL甲醇，用ddH₂O定容至1L)湿润的滤纸上。剪取一块与电泳凝胶相同大小的硝酸纤维膜(孔径0.22微米)，用甲醇浸泡1min，放在电泳后的凝胶上，将第二块湿润的滤纸贴在硝酸纤维素膜上；

(4)将上述固定好的样品放入装有转膜缓冲液的电泳槽中，凝胶面朝向负极；稳定电流359mA，通电1h。

(5)转移完毕，取出硝酸纤维素膜放入封闭液(0.5g牛血清白蛋白溶于50ml TBST溶液)中37℃下封闭1h；

(6)用TBST溶液(含0.05％吐温-20的TBS)洗3次，每次5min。

(7)将硝酸纤维素膜加入本发明制备的单克隆抗体(体积比为1∶500稀释于封闭液)，37℃缓慢摇动1h；

(8)用TBST溶液洗3次，每次5min；

(9)将硝酸纤维素膜放入体积比为1：1000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(体积比1：1000稀释于封闭液)，37℃缓慢摇动1h；

(10)用TBST洗3次，每次5min，用SuperSignal West Pico化学发光底物(购自Thermo公司)显色，并于化学发光成像系统中成像拍照。

结果表明：本发明的单克隆抗体与EBOV GP蛋白发生特异性反应(如图2所示)，本发明制备的单克隆抗体能与感染表达GP蛋白的重组杆状病毒的sf9细胞杂交显示出条带，而不和正常sf9细胞发生反应，说明本发明制备的单克隆抗体是有活性的，可以与抗原发生反应。3.间接免疫荧光检测

具体步骤如下：

(1)将sf9细胞接种至24孔板，待细胞长至80％-90％后，感染含GP基因重组杆状病毒，同时设置正常细胞对照；

(2)继续培养24-48h待细胞刚好出现病变时，弃去培养液，用PBS洗涤，5min×3次；

(3)加入100％甲醇固定10min，PBS洗涤，每次5min，共3次；

(4)加入封闭液，室温下孵育1h；

(5)用PBS洗涤，每次5min，共3次；

(6)加入待检的单抗样品3B8，室温孵育1h；

(7)用PBS洗涤，每次5min，共3次；

(8)加入Alexa Fluor 488羊抗鼠IgG(购自Invitrogen公司)(按体积比为1:300稀释)，室温孵育1h；

(9)PBS洗涤，每次5min，共3次，之后在荧光显微镜下观察并拍照。

结果如图3所示，重组杆状病毒感染组出现明显的绿色荧光，而正常细胞的对照组则没有荧光出现，说明制备的单克隆抗体能特异性与含GP基因重组杆状病毒结合，且结合活性较好。

Claims (6)

1.一种重组的埃博拉病毒GP蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1中第1-1578位碱基所述。

2.一种重组的埃博拉病毒GP基因编码的蛋白质，其蛋白质序列如SEQ ID NO：2所述。

3.如权利要求2所述的一种重组的埃博拉病毒GP基因编码的蛋白质序列作为埃博拉病毒GP抗原蛋白的应用。

4.一种单克隆抗体，它是由权利要求2所述的重组的埃博拉病毒GP基因编码的蛋白质序列免疫动物后得到的杂交瘤细胞株1C1所分泌的，所述的杂交瘤细胞株1C1保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2016106。

5.一株与埃博拉病毒GP抗原蛋白特异性结合、分泌埃博拉病毒GP抗原蛋白的和产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C1，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：C2016106。

6.权利要求4所述的单克隆抗体在检测埃博拉病毒GP蛋白中的应用。