CN108794625A - 一种抗ev-d68病毒的单克隆抗体及其制备和应用 - Google Patents
一种抗ev-d68病毒的单克隆抗体及其制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗EV‑D68病毒的单克隆抗体及其制备和应用。首次运用单个B细胞分离技术对EV‑D68病毒感染的恒河猴进行特异性单个记忆B细胞的分选，获得了配对的抗体轻重链基因，并进一步筛选得到具有中和活性的EV‑D68特异性单克隆抗体。该单克隆抗体包括重链和轻链，其核苷酸编码序列和氨基酸编码序列如序列表所示。本发明为针对EV‑D68感染的预防和治疗提供了备选药物，也为鉴定EV‑D68病毒提供了一种新的工具和思路。
Description
技术领域
本发明属于抗感染性单克隆抗体制备技术领域，具体是涉及一种能有效抑制EV-D68病毒感染的单克隆抗体。同时，本发明还涉及所述单克隆抗体的制备方法，以及该抗体在EV-D68病毒鉴定、制备抗感染药物等方面的应用。
背景技术
EV-D68(Enterovirus D68，EV-D68)病毒属于小核糖核酸病毒科，肠道病毒属。1962年，首次在美国分离获得。2014年，美国和加拿大地区出现EV-D68大规模爆发及广泛流行。随后在欧洲、泰国、中国、新西兰等地区也出现了由EV-D68病毒引起的呼吸道疾病的流行。EV-D68病毒不仅可以引起严重的呼吸道疾病，比如肺炎；还可以引起中枢神经系统症状，比如急性迟缓性麻痹(Acute Flaccid Paralysis，AFP)。鉴于有效治疗药物及预防性疫苗依然处于探索阶段，基于感染的动物模型开展单克隆抗体分选和鉴定的研究有望为EV-D68病毒的预防和治疗提供新的突破口。
近年来，单克隆抗体技术不断发展。抗感染性单克隆抗体具有以下优势：快速和立即的保护作用、针对病原体的特异性、相对较低的临床副作用。另外，单抗识别的抗原表位可作为新型基因工程疫苗设计的靶点。凭借这些优点，抗感染性单克隆抗体已经成为许多疾病的理想治疗性试剂，广泛应用于癌症、自身免疫紊乱及感染性疾病中，已成为预防性疫苗的重要补充。最早单克隆抗体是基于B细胞融合的杂交瘤技术所获得的鼠源单克隆抗体。这种技术虽然可以获得针对大部分抗原的单克隆抗体，但是这种单克隆抗体易引起人体自身对异源蛋白的免疫反应。为减少这种限制，研究者对鼠源单克隆抗体进行人源化改造，但这种人源化抗体仍不能模拟人体内天然抗体的精确构象及针对靶抗原的特异性。为彻底解决这种鼠源系统的干扰，有科学家开始使用全人源化的杂交瘤技术。随之而来的其他单抗展示技术也不断涌现，包括噬菌体展示技术、酵母展示技术、哺乳动物细胞展示技术等。但这些技术仍旧存在缺点：产生的抗体轻重链基因配对为非自然随机配对，产生的抗体与天然抗体活性有差别。鉴于上述缺点，一种基于直接扩增人体单个B细胞内所编码的抗体轻重链基因的单克隆抗体分离策略应运而生，这种单个B细胞分离技术能够更有效地分离得到功能性的、天然存在体内的单克隆抗体。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种抗EV-D68病毒的单克隆抗体，为针对EV-D68病毒感染的预防和治疗提供候选药物。
本发明的另一个目的在于提供一种制备所述单克隆抗体的方法。
本发明的目的还在于提供所述单克隆抗体在制备治疗或预防EV-D68病毒感染药物方面的应用。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
一种抗EV-D68病毒的单克隆抗体，包括重链和轻链，其特征在于：所述的单克隆抗体重链可变区的CDR2-FR3-CDR3-FR4核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO.1所示；轻链可变区的CDR2-FR3-CDR3-FR4核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO.2所示；所述的单克隆抗体重链可变区CDR2-FR3-CDR3-FR4氨基酸编码序列如序列表SEQ ID NO.3所示；轻链可变区CDR2-FR3-CDR3-FR4氨基酸编码序列如序列表SEQ ID NO.4所示。
一种制备所述抗EV-D68病毒的单克隆抗体的方法，包括以下步骤：
(1)用EV-D68病毒滴鼻感染恒河猴，作为EV-D68特异性单个B细胞的分选供体；
(2)用前期制备的EV-D68 VP1蛋白作为分选抗原分选EV-D68特异性的单个记忆B细胞；
(3)建立单个B细胞抗体轻重链基因的巢式PCR体系，并从单个记忆B细胞中扩增抗体轻重链基因；
(4)将上述的抗体轻重链基因连接表达载体，并在293T、293A细胞及CHO细胞中进行表达；
(5)表达抗体纯化。
所述的抗EV-D68病毒的单克隆抗体在制备治疗或预防EV-D68病毒感染药物方面的应用。
所述的抗EV-D68病毒的单克隆抗体在EV-D68病毒鉴定中的应用。所述的抗EV-D68病毒的单克隆抗体在抑制EV-D68病毒感染中的应用。
本发明的单克隆抗体是从恒河猴体内分离获得的。采用的技术是单个B细胞分离技术，可以按照该领域已知的常规制备方法发明制备抗EV-D68VP1蛋白的单克隆抗体A6-1，也可以参见相关文献制备A6-1单克隆抗体(参见Christopher S,Ganesh P,,Lyadh D,etal.2012,J Immunol Methods,386,85-93)。
本发明使用EV-D68病毒滴鼻感染恒河猴，恒河猴体内产生EV-D68抗原特异性的记忆性B细胞，利用EV-D68 VP1特异性的分选抗原可以分选出带有EV-D68特异性膜受体BCR的记忆B细胞。
为制备EV-D68 VP1分选抗原，首先需要表达EV-D68 VP1蛋白，可以按照本领域技术人员熟知的分子克隆技术(参见Sambrook et al.Molecular Cloning:A laboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)或者参见本实验室先前已经申报的专利(专利申请号：201710579444.9)进行基因的克隆、目的基因片段的酶切与连接、克隆和表达载体的构建、感受态细胞的转化、蛋白表达与纯化。
可按照本发明的优选实施方案对EV-D68 VP1蛋白进行荧光标记。荧光标记方法参见蛋白标记的试剂盒说明书进行。
使用上述荧光标记好的EV-D68 VP1-FITC与anti-monkey CD20+、anti-monkeyCD27+流式抗体按一定比例混合后从EV-D68感染恒河猴体内分选单个记忆B细胞。首先从恒河猴体内分离外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)。可按照本领域常规的PBMC分离方法使用猴淋巴细胞分离液进行分离。使用混合的EV-D68 VP1-FITC抗体、anti-monkey CD20+抗体、anti-monkey CD27+抗体对PBMC细胞进行染色标记，随后上流式细胞分选仪进行单个B细胞分选。
使用巢式PCR的方法对分选获得的EV-D68特异性记忆B细胞进行抗体轻重链基因的扩增。巢式PCR引物设计的是按照文献报道进行优化(参见Meng W,Li L,Xiong W,etal.2016,mAbs,7(4):707-718)，第一轮引物的上游引物主要针对前导肽序列，下游引物主要覆盖抗体的恒定区；第二轮上游引物主要针对可变区的第1个框架区(Framwork region1,FR1)，下游引物主要针对可变区的J区域。按照本发明的优选实施方案进行抗体轻重链基因的巢式PCR扩增。
将扩增所获得的抗体轻重链基因片段连接到克隆载体及表达载体上面。可以按照本领域技术人员熟知的分子克隆技术(参见Sambrook et al.Molecular Cloning:Alaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)进行基因的克隆、目的基因片段的酶切与连接、克隆和表达载体的构建、感受态细胞的转化进行。本发明选用的克隆载体为Topo载体，按照常规的分子克隆操作，在使用该载体的情况下，基因片段阳性克隆率达到90％以上。
将鉴定的包含正确的抗体轻重链基因序列的表达载体转染进293T、293A、CHO细胞系中进行抗体表达。293T、293A表达系统使用无血清培养基、使用的转染试剂为脂质体转染试剂。CHO细胞表达系统为悬浮表达系统、使用无血清培养基、使用的转染试剂为FreeStyleMax Reagent试剂。其余操作方法按照本领域常规的293T、293A及CHO表达系统的常规操作方法进行操作。最后使用protein A进行抗体的亲和层析纯化，并收集纯化后的抗体。
核苷酸序列分析结果显示，本发明的纯化A6-1单克隆抗体轻重链基因核苷酸编码序列包含如序列表中SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2所示；根据单克隆抗体A6-1的核苷酸编码序列轻重链包含的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:4所示。其中所有氨基酸序列都是以氨基酸的标准单字母缩写符表示的。
本发明中的A6-1单抗可以有效识别EV-D68 VP1蛋白，因此未来可以利用该单抗鉴别EV-D68病毒。
为鉴定A6-1抗体的生物学功能，本发明首先进行了EV-D68病毒中和实验。中和抗体实验是一种用于体外检测抗体中和效力的重要实验。实验表明，A6-1可以有效抑制EV-D68病毒对细胞的吸附与感染。为鉴定A6-1抗体发挥中和作用的机制，本发明还进行了病毒吸附抑制实验。本实验可以反映抗体对病毒吸附宿主细胞的抑制作用大小。结果表明，A6-1可以有效抑制EV-D68病毒对细胞的吸附作用，并且呈剂量效应关系。本发明进一步对A6-1在乳鼠体内抗EV-D68病毒感染效果进行验证。结果表明，A6-1能够有效抑制EV-D68鼻腔攻毒导致的乳鼠感染。因此，通过上述实验表明，A6-1抗体可以被应用到抗EV-D68病毒感染的治疗中。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明首次运用单个B细胞分离技术对EV-D68病毒感染的恒河猴进行特异性单个记忆B细胞的分选，获得了配对的抗体轻重链基因，并筛选得到具有中和活性的EV-D68特异性单克隆抗体。该单克隆抗体的发现不仅为EV-D68感染的预防和治疗提供了备选药物，为鉴定EV-D68病毒提供一种新的工具，也为抗病毒感染的单抗药物研发提供了技术参考。
附图说明
图1：EV-D68感染恒河猴，不同时间点血液、鼻洗液、粪便样本中的病毒载量水平检测。
图2：流式分选EV-D68 VP1特异性单个记忆B细胞。EV-D68 VP1特异性单个记忆B细胞(CD20+CD27+EV-D68-VP1APC+)被分选到96孔板中。SSC:侧向散射光；FSC：前向散射光。
图3：EV-D68感染恒河猴的单个记忆B细胞的抗体轻重链基因序列打靶。(A)特异性单个B细胞中IGHV、IGHK、IGHL抗体基因序列不同亚群的分布情况；(B)不同抗体基因序列的CDR3区氨基酸长度情况分析。
图4：纯化的EV-D68全病毒的银染分析；抗体特异性识别EV-D68病毒颗粒的Western-blot分析。
图5：EV-D68 VP1特异的配对单克隆抗体的亲和力分析。31个配对的EV-D68特异性单克隆抗体的结合活性分析。
图6：qRT-PCR检测吸附在Hela、Vero细胞表面的EV-D68病毒载量。*代表p≤0.05，且具有统计学差异。
图7：不同浓度的A6-1在preattachment阶段对病毒的中和有效性分析。
图8：A6-1对乳鼠的体内保护效果验证。乳鼠治疗组与对照组肺组织、脑组织的HE病理切片染色分析，使用显微镜放大倍数为200倍。充血(黑色箭头)；炎性细胞滤过(白色箭头)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但附图和实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明教导所作出的变化和等同替换均应属于本发明的保护范围。
实施例1：对所述抗EV-D68病毒的单克隆抗体的制备过程作详细说明。
EV-D68病毒感染恒河猴
1)动物实验均符合3R原则，即替代(Replacement)、减少(reduction)、优化(Refinement)；动物实验通过中国医学科学院医学生物学研究所IACUC(InstitutionalAnimal Care and Use Committee)组织的批准。两只健康的6月龄的恒河猴，体重为1.2kg±0.3kg，经由上呼吸道滴鼻注射滴度为104.5CCID50的EV-D68病毒。实验前，两只恒河猴的EV-D68病毒抗体检测为阴性。
2)在恒河猴滴鼻感染后1、3、5、7、9、11、14天，采样进行粪便、鼻拭液、血液病毒载量的检测；在0、7、14、21、28天进行中和抗体水平的检测；
3)结果分析：血液中病毒载量水平在第3天开始呈上升趋势，感染后第9天达到高峰，此后开始下降，与前述的血细胞变化时间点一致。鼻洗液与粪便样本中的病毒载量在第3-5天达到峰值。两只猴子的粪便样本病毒载量分别为28900copies/100mg，26000copies/100mg。无论是病毒血症还是鼻洗液、粪便样本中的高病毒载量均表明，恒河猴被EV-D68病毒感染(参见图1)EV-D68感染后，两只恒河猴产生的中和抗体水平均较低，未超过1:16。但是这一结果仍表明恒河猴对EV-D68病毒产生了抗体免疫应答。综合上述的血常规、病毒载量及中和抗体水平的结果可知，EV-D68感染恒河猴体内产生了针对EV-D68病毒的特异性免疫应答。
EV-D68 VP1分选蛋白的标记
按照Lightning-Link Allophycocyanin(APC)Conjugation Kit蛋白标记试剂盒说明(Innova Biosciences公司)将VP1蛋白标记为可用于流式分选的VP1-APC蛋白，按照下述步骤进行。
1)将1ul LL-modifier reagent加入至每10ul纯化的VP1重组蛋白中，轻轻混匀；
2)将Lightning-Link的盖子打开，向其中加入上述LL-modifier reagent标记的VP1蛋白，使用微量移液器轻轻混匀，吹打液体1-2次；
3)将上述混悬液置于室温(20-25度)，避光孵育3小时；或者在暗室，4度孵育过夜；
4)孵育完成后，在每10ul混悬液中加入1ul LL-quencher，标记30分钟后使用。
EV-D68特异性单个记忆B细胞的分选
本部分我们进行EV-D68特异性单个B细胞的流式分选。
1)我们从EV-D68病毒感染的恒河猴体内分离PBMC，将分离获得的PBMC进行流式抗体染色，使用100μl PBS溶液重悬PBMC细胞；
2)向其中加入CD20+-PE、CD27+-FITC、EV-D68VP1+-APC流式抗体，4度避光孵育30分钟；
3)使用PBS洗涤2次，最后使用300μl PBS重悬；
4)上机分选。将CD20+-PE、CD27+-FITC双阳性细胞进行设门，再将这一群阳性细胞进行EV-D68VP1+-APC的设门，将门中的细胞分选至96孔板中。
5)将分选后的含有B细胞的96孔板立即放入-80℃保存。
6)结果表明，在两只EV-D68滴鼻感染的恒河猴中，EV-D68VP1抗原特异性的记忆B细胞百分比分别为3.56％、2.02％，与感染前的0.58％、0.97％相比，明显增加。(参见图2)
单个B细胞的RT-PCR及抗体轻重链基因的巢式PCR扩增
向上述96孔板中补加RT-PCR的反应液，按照PrimeScriptTM II 1st Strand试剂盒(TAKARA公司)的反应比例及反应条件进行反应，获得cDNA后，作为巢式PCR模板，进行巢式PCR反应。
抗体的重链(Heavy chain)基因的第一轮巢式PCR反应体系如下：
PCR反应条件：预变性98℃1min；PCR反应98℃10s，55℃5s，72℃5s，50个循环；终延伸72℃5min。
抗体的轻链(Light chain)kappa基因第一轮巢式PCR反应体系如下：
PCR反应条件：预变性98℃2min；98℃10s，60℃5s，72℃5s，45个循环；终延伸72℃5min；
抗体的轻链基因(Light chain)Lamda的第一轮巢式PCR反应体系如下：
PCR反应条件：预变性98℃2min；PCR反应98℃10s，54℃5s，72℃5s，45个循环；终延伸72℃5min；
抗体的重链(Heavy chain)基因的第二轮巢式PCR反应体系如下：
PCR反应条件：预变性98℃1min；98℃10s，60℃5s，72℃5s，50个循环；72℃5min；
抗体的轻链(Light chain)kappa基因第二轮巢式PCR反应体系如下：
PCR反应条件：预变性98℃2min；98℃10s，60℃5s，72℃5s，45个循环；终延伸72℃5min；
抗体的轻链(Light chain)Lamda基因第二轮巢式PCR反应体系如下：
PCR反应条件：预变性98℃2min；98℃10s，60℃5s，72℃5s，40个循环；终延伸72℃5min；
使用浓度为1.2％的琼脂糖凝胶电泳对第二轮的PCR产物进行检测。并对在300-400bp处有阳性片段的PCR产物进行胶回收，回收后的DNA片段浓度使用nanodrop测定其浓度。
轻重链基因的纯化PCR片段与TOP载体连接
将目的片段与克隆载体Topo连接：
1、在空气浴中(20-30℃)按照如下体系操作(10μl)
加完上述试剂后，用移液器轻轻吹打混匀或者轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体于管底，室温连接5分钟。
2、连接产物转化感受态细胞DH5α
1)取感受态细胞置于冰浴中；
2)向感受态细胞中加入5μl连接反应液，轻弹混匀，于冰浴中反应30分钟；
3)将离心管置于42℃水浴中放置90秒钟，快速将其转移至冰浴中，冷却2-3分钟，该过程不要摇动离心管；
4)向离心管中加入900μl无抗生素的LB培养基，混匀后于37℃摇床振荡培养45分钟(150转/分钟)；
5)将离心管内容物混匀，取混悬液100μl，使用无菌的涂布棒将液体均匀涂布到LB固体琼脂平板上(含有100mg/ml氨苄青霉素)。将平板置于37℃中，正放15分钟，直到液体被LB培养板完全吸收。随后倒置放置培养16-18小时，直到单个菌落形成。
3、摇菌
挑取上述氨苄抗性的LB培养板中长出的单个菌落，将单个菌落加入至氨苄抗性的液体LB培养基中，37度摇床振荡培养(转速为200转/分钟)16-18小时，收获菌液。
4、质粒小量提取
1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
2)取3ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm离心1min，尽量吸除上清；
3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已经加入RNaseA)，使用移液器和涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；
4)向离心管中加入250μl溶液P2，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解；
5)向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min；
6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm/min离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；
7)向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已经加入无水乙醇)，12000rpm/min离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管；
8)重复操作步骤7)
9)将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm/min离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除；
10)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜中央滴加30μl左右洗脱缓冲液，室温放置2min，12000rpm/min离心2min将质粒溶液收集到离心管中；
5、阳性克隆的鉴定
1)电泳鉴定：将所提取的质粒进行电泳，与阴性对照做比较，筛选出可能为阳性的质粒；
2)酶切鉴定：用EcoR I/Nhe I或者EcoR I/PvuII进行双酶切，将酶切产物分子量与DNA Marker进行电泳比较；
3)重组质粒的测序确证：把电泳鉴定、酶切鉴定均为阳性的克隆，送大连宝生物公司测序，将测序正确的表达载体质粒保存。
6、抗体轻重链基因序列基因打靶及结果分析。结果分析表明，在所有抗体的VH重链可变区中，IGHV3是最具代表性的亚群(61.5％)，随后为IGHV1(23.1％)，IGHV4和IGHV7分别为11.8％和3.8％(参见图3)。在V-Kappa中，IGKV1和IGKV3是最具代表性的亚群，比例均为37.5％，IGKV2比例为8.3％，IGKV4比例为16.7％(参见图3)。对于Lambda的可变区基因胚系，仅有IGLV1和IGLV3亚群，所占比例分别为14.3％、85.7％(参见图3)。重链可变区CDRH3的长度在11-22个氨基酸之间变化，所有克隆的CDR3氨基酸长度均大于11个。轻链Kappa链的CDRL3氨基酸长度均不超过9个，所有克隆的轻链Lambda链的CDRL3氨基酸长度均在10-14个之间。(参见图3)因此，恒河猴感染EV-D68后，受到外来抗原的刺激，抗体基因发生了重排，与感染前的胚系基因来源形成了差异。
抗体轻重链基因片段与表达载体连接、鉴定
1、将连接有正确抗体轻重链基因片段的pTOPO质粒及抗体真核表达载体分别进行双酶切，连接有抗体轻链基因的pTOPO质粒、真核表达载体使用(EcoR I/Nhe I)双酶切反应体系，按照下表所示进行配制：
反应条件：37℃反应3小时，酶切产物进行胶回收。
2、连接有抗体重链基因的pTOPO质粒、真核表达载体使用(EcoR I/PvuII)双酶切反应体系，按照下表所示进行配制：
反应条件：37℃反应3小时，酶切产物进行胶回收。
3、酶切后抗体目的基因片段及表达载体胶回收
1)切碎胶块；
2)称量胶块重量，计算胶块体积。按照1mg＝1μl进行计算；
3)溶解胶块。向胶块中加入溶解液GM，1.0％-1.5％凝胶按照：1：4比例(凝胶体积：溶解液GM体积)；
4)室温溶解胶块，此间间断振荡混合，使胶块充分溶解；
5)将试剂盒中的Spin column安装于Collection Tube上，将步骤(4)中的胶溶液转移至Spin column中，12000转离心1分钟，弃滤液；
6)将700μl的洗液加入Spin Column中，室温12000转离心30秒钟，弃滤液；
7)重复操作步骤6；
8)将Spin Column安置于新的1.5ml离心管上，在Spin Column膜的中央加入30μl灭菌水或者Elution Buffer，室温静置1分钟；
9)室温12000转离心1分钟洗脱DNA。
4、表达载体与抗体轻重链基因片段的连接
连接反应体系如下：
混匀上述反应液，16℃连接反应16小时。反应完成后，于65℃热灭活10分钟。
5、连接产物转化DH5a感受态细胞
1)取感受态细胞置于冰浴中；
2)向感受态细胞中加入5μl连接反应液，轻弹混匀，于冰浴中反应30分钟；
3)将离心管置于42℃水浴中放置90秒钟，快速将其转移至冰浴中，冷却2-3分钟，该过程不要摇动离心管；
4)向离心管中加入900μl无抗生素的LB培养基，混匀后于37℃摇床振荡培养45分钟(150转/分钟)；
5)将离心管内容物混匀，取混悬液100μl，使用无菌的涂布棒将液体均匀涂布到LB固体琼脂平板上(含有100mg/ml氨苄青霉素)。将平板置于37℃中，正放15分钟，直到液体被LB培养板完全吸收。随后倒置放置培养16-18小时，直到单个菌落形成。
6、摇菌
挑取上述氨苄抗性的LB培养板中长出的单个菌落，将单个菌落加入至氨苄抗性的液体LB培养基中，37度摇床振荡培养(转速为200转/分钟)16-18小时，收获菌液。
7、质粒小量提取
1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
2)取3ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm离心1min，尽量吸除上清；
3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已经加入RNaseA)，使用移液器和涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；
4)向离心管中加入250μl溶液P2，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解；
5)向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min；
6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm/min离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；
7)向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已经加入无水乙醇)，12000rpm/min离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管；
8)重复操作步骤7)
9)将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm/min离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除；
10)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜中央滴加30μl左右洗脱缓冲液，室温放置2min，12000rpm/min离心2min将质粒溶液收集到离心管中；
8、阳性克隆的鉴定
1)电泳鉴定：将所提取的质粒进行电泳，与阴性对照做比较，筛选出可能为阳性的质粒；
2)酶切鉴定：用EcoR I/Nhe I或者EcoR I/PvuII进行双酶切，将酶切产物分子量与DNA Marker进行电泳比较；
3)重组质粒的测序确证：把电泳鉴定、酶切鉴定均为阳性的克隆，送大连宝生物公司测序，将测序正确的表达载体质粒保存。
不同细胞系抗体表达条件摸索
1、293A细胞系统的抗体表达
将已经连接成功的抗体轻链和重链基因表达载体瞬时转染293A细胞：
1)使用12孔细胞培养板进行转染实验，每孔接种的细胞数为1.5×105个/孔，待293T细胞的细胞融合度达到70-90％时，开始进行转染；
2)转染前将培养基换成无血清培养基；
3)配制lipofectamine2000 Reagent混悬液，将lipofectamine2000 Reagent加入至75ul Opti-MEM Medium
4)将需要转染的轻链重链质粒(按照质量比1:1的比例)加入至75ul Opti-MEMMedium中；
5)将上述3)与4)的溶液等体积混合，轻轻混匀后室温静置5分钟，待形成DNA-lipid复合物；
6)将DNA-lipid复合物轻轻加入至293T细胞中；
7)转染后4-6小时，加入抗生素，37℃温箱培养1-3天；
8)从转染细胞中收获抗体：收获上清(包括细胞)，5000转/分钟离心10分钟。将收获的上清-20℃保存。使用预冷1mL PBS加入离心管，清洗离心后的沉淀，5000转/分钟离心5分钟，洗涤两次。弃PBS，加入100μl RIPA/管，冰浴30分钟，5000转/分钟离心5分，收获上清。将原本的上清及裂解沉淀后收获的上清分别进行SDS-PAGE、Western-Blot检测；
2、293T细胞系统的抗体表达
与上述293A细胞表达实验步骤一致；
3、使用CHO细胞进行抗体的大量表达
1)将带有目的基因大肠杆菌甘油菌，摇菌，用无内毒素质粒大提试剂盒进行大提，将大提的质粒过0.22μm滤器进行过滤；质粒浓度最好保证在1mg/ml，质粒浓度偏低时，需进行进行浓缩。
2)将重链轻链表达载体质粒、Opti-MEM溶液、FreeStyleTM CHO细胞培养基从冰箱中取出，恢复至室温。在FreeStyleTM CHO细胞培养基中按照体积比1/100加入谷氨酰胺(终浓度为8mM)，补加双抗；
3)在转染前，保证CHO悬浮细胞的密度为1.2×106-1.5×106个/mL，为了保证高的转染效率，活细胞比例应大于95％。
4)在使用FreeStyleTM MAX转染试剂之前，将溶液轻微混匀几次，不要振荡混匀；
5)将37.5μg质粒DNA加入至Opti-MEM溶液中，使得总体积为0.6ml，混匀；将37.5μlFreeStyleTM MAX Transfection Reagent加入至Opti-MEM溶液中，使得总体为0.6ml；
6)立即将稀释好的FreeStyleTM MAX转染试剂稀释液加入至稀释好的DNA溶液中，使得总体积为1.2ml，轻轻混匀；
7)将DNA-FreeStyleTM MAX混合溶液室温放置10分钟，使得DNA-FreeStyleTM MAX复合物形成；
将1.2ml DNA-FreeStyleTM MAX复合物加入至125-ml的悬浮细胞培养瓶中；将转染后的细胞在37℃，CO2温箱中培养，在振荡摇床中培养，培养6-7天后，收获转染的细胞；
抗体纯化
1)将Protein A Agarose beads以及所有溶液平衡至室温；
2)将柱子填充2ml树脂砂浆；
3)使用5ml binding buffer平衡填充柱；
4)将收集后的抗体表达上清过亲和层析柱，使其维持合适的盐离子浓度和PH值；
5)重复操作步骤(4)；
6)使用15ml Binding Buffer清洗Protein A珠子；
7)使用5ml Elution buffer洗涤亲和层析柱。洗脱后，立即用PH为8.0的Tris-HCL(1mmol)；进行中和，每ml洗脱液加入100μl Tris-HCL溶液；
8)最后使用10KD的超滤管对蛋白洗脱液进行浓缩；
9)使用BCA发对纯化抗体进行蛋白定量。定量结果显示，纯化抗体的浓度为0.1mg/ml-0.5mg/ml。
单克隆抗体亲和力筛选
1)抗原包被；在96孔板中加入VP1重组纯化蛋白，每孔加入0.2μg，4℃包被过夜；
2)封闭：向96孔板中加入含5％BSA的封闭液，室温封闭2小时；
3)加入单克隆抗体：加入PBST(含0.05％的BSA)稀释的纯化后的单克隆抗体，按照0.1～0.5μg/孔加入，室温2小时；
4)加入检测抗体：0.1％PBST洗涤三次，每次10分钟；加入HRP标记的兔抗人的IgGH&L的检测抗体，按照1:5000稀释，100μl/孔加入至96孔板中，室温1小时；
5)显色：0.1％PBST洗涤三次，每次10分钟；向96孔板中加入TMB显色液，按照100μl/孔加入其中，37℃作用10分钟；
6)终止显色：向上述96孔板中加入50μl/孔的显色终止液，在终止液加入后的10分钟内进行上机检测；
7)测定：以空白孔调零，450nm波长依次测定各孔的吸光度值即OD值，OD阳性血清/OD阴性血清大于2.5时判断为阳性；
8)检测结果分析：在所有的检测抗体中，A6-1、E2-2、F4-3和D7-4与纯化的EV-D68VP1抗原可以强烈结合，具有明显的亲和活性；(参见图5)
单克隆抗体的中和活性分析
1)EV-D68攻击病毒液的准备
用病毒稀释液将病毒原液稀释至2000CCID50/ml，即100CCID50/0.05ml加入至每个孔中；同时设置病毒回滴对照：用病毒稀释液从100CCID50开始10倍系列稀释，制备成10CCID50/0.05ml、1CCID50/0.05ml、1CCID50/0.05ml共3个梯度，将这3个梯度稀释的病毒液与100CCID50/0.05ml一起加入至病毒回滴板中，每个浓度梯度设置4个复孔，每个孔加入对应浓度梯度的病毒液50μl，外加50μl病毒稀释液补足至100μl；(相当于血清的量)
3)抗体稀释
将纯化后的抗体进行稀释，首先在96孔细胞培养板中加入50μl/孔的病毒稀释液。纯化后的抗体样本取出50μl加入96孔细胞培养板的第一排，用多道移液器吹打混匀后，按照50μl/孔吸取液体加入至第二排，用多道移液器吹打混匀后，按照50μl/孔吸取第二排液体加入至第三排，以此类推，直到最后一排。最后一排吹打混匀后，吸弃50μl液体；
4)加入攻击EV-D68攻击病毒液
将稀释好的EV-D68攻击病毒加入至上述细胞培养板中，50μl/孔吹打混匀。
5)病毒与抗体的中和
将上述96孔培养板放入37℃，5％CO2培养箱中，中和作用2小时；
6)加入细胞悬液
使用对数生长期的Hela细胞，胰酶消化后，使用完全细胞培养基进行吹打混匀，稀释成为2×105个/ml，按照100μl/孔加入至96孔细胞培养板中；
7)MTS试剂检测
室温静止90分钟，或者37℃水浴10分钟，直到CellTiter 96Aqueous OneSolution Reagent试剂完全溶解；在96孔细胞培养板中，每孔100μl培养基加入20μlCellTiter 96Aqueous One Solution Reagent；将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2的环境下孵育4小时；在酶标仪490nm波长下读取每孔的吸光度值。
8)结果处理与分析
使用Graphpad 5进行半数有效剂量的计算。结果显示，A6-1可以有效中和EV-D68病毒，抑制率达100％。半数抑制剂量(Half maximal inhibitory concentration，IC50)为KM株0.6μμg/ml，Fermon株1.57μg/ml，比F4-3、E2-2、D7-4抗体具有更好的中和活性。F4-3、E2-2、D7-4中和抗体对两株不同EV-D68病毒具有相似的IC50值，范围在2-6μg/ml，且三个抗体的最大有效抑制百分比均未达到100％。因此，在这四个抗体中，A6-1抗体具有较高的中和活性。
实施例2：实施例1所得单克隆抗体A6-1用于鉴定EV-D68病毒。
抗体特异性的WB验证
1)样品制备：将80μl纯化的EV-D68全病毒加入20μl 5×上样缓冲液，混匀后100℃煮5分钟；
2)进行EV-D68全病毒的SDS-PAGE凝胶蛋白电泳；
3)电泳结束后取出凝胶，切去浓缩胶，将分离胶浸泡于转移缓冲液中；准备与胶相同大小的PVDF膜一张，滤纸2张，浸泡于转移缓冲液中；在正极电板上按照滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序叠放整齐，叠放过程中尽量赶走气泡，盖上负极板，25V，1.3A转膜20min；
4)封闭：转膜完成后，取出PVDF膜，放入玻璃平皿中，加入40ml新鲜配制的封闭液，4℃，平摇过夜；
5)一抗孵育：倒掉封闭液，PBST洗涤两次，每次5min；按照1:200浓度加入一抗，室温2h；
6)二抗孵育：PBST洗涤4-6次，每次15min，按照1:10000浓度加入羊抗兔二抗，室温1h；7)ECL化学发光显色：PBST洗涤4-6次，每次10min；将配制好的ECL试剂均匀覆盖在PVDF膜上，发光显影，于暗室条件下压片曝光，曝光时间10s，显影，定影。
8)结果表明，实施例1所得单克隆抗体A6-1可以识别EV-D68VP1病毒蛋白。(参见图4)
实施例3：实施例1所得单克隆抗体A6-1用于抑制EV-D68病毒感染。
1、病毒接触抑制实验
1)使用对数生长期的Hela、Vero细胞，胰酶消化后，使用完全细胞培养基进行吹打混匀，稀释成为4×105个/ml，按照500μl/孔加入至12孔细胞培养板中，待细胞长成单层后备用；
2)将病毒与不同稀释度的单克隆抗体进行中和，中和后的病毒-抗体混合液加入至长成单层的96孔细胞培养板中，室温作用1小时，使用PBS洗板3次移去多余的病毒；
3)收获上述12孔板中的细胞，并提取细胞总RNA，对病毒基因拷贝数进行qRT-PCR的定量检测。
4)结果分析：从qRT-PCR结果可知，A6-1对病毒的抑制作用呈剂量依赖性，当A6-1抗体浓度为2.5μg/ml时，只有占原来数量20％的病毒颗粒可以吸附到Hela细胞表面。相似的抗体剂量依赖抑制效应，也在Vero上被观察到。从上述结果，我们可以初步推测A6-1抗体可以抑制病毒对细胞的吸附(参见图6)。
2、MTS检测pre-attachment的中和效果
1)使用对数生长期的Hela细胞，胰酶消化后，使用完全细胞培养基进行吹打混匀，稀释成为2×105个/ml，按照100μl/孔加入至96孔细胞培养板中，待细胞长成单层后备用；
2)EV-D68攻击病毒液的准备、单克隆抗体稀释、加入攻击EV-D68攻击病毒液、病毒与抗体中和等步骤与“单克隆抗体的中和活性分析”部分的步骤相同；
3)将病毒与不同稀释度的单克隆抗体进行中和，中和后的病毒-抗体混合液加入至长成单层的96孔细胞培养板中，室温作用1小时，使用PBS洗板3次，补加含2％血清的细胞培养基，将细胞培养板置于37℃，5％CO2继续培养72小时；
4)进行MTS的检测：室温静止90分钟，或者37℃水浴10分钟，直到CellTiter96Aqueous One Solution Reagent试剂完全溶解；在96孔细胞培养板中，每孔100μl培养基加入20μl CellTiter 96Aqueous One Solution Reagent；将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2的环境下孵育4小时；在酶标仪490nm波长下读取每孔的吸光度值。
5)结果分析：研究结果显示，在病毒接触细胞前，先使用A6-1抗体进行处理，抗体干扰病毒对细胞的吸附，从而抑制感染，IC50值为1.39μg/ml。因此，A6-1单克隆抗体可以有效抑制EV-D68病毒对细胞的感染。(参见图7)
3、A6-1单克隆抗体在动物体内的抗EV-D68感染的效果评价
1)乳鼠分组及实验程序：分为实验组、对照组；每组20只乳鼠，进行不同的抗体注射及病毒攻毒处理，具体见表2。抗体注射剂量为30μg/只，攻毒剂量为104.5CCID50/只。
表2：乳鼠实验及分组情况
2)在0、3、7、10天时间点，每个时间点随机抽取3只小鼠进行解剖，采集肺组织、脑组织样本。制备组织悬液，进行病毒感染性滴度测定、病毒基因拷贝数的绝对定量PCR检测；在0、3、7天进行病理冰冻切片制备及HE染色。
3)结果分析：结果表明，A6-1单克隆抗体能够抑制EV-D68病毒呼吸道途径感染乳鼠，减轻被感染乳鼠组织的病理学症状，具有较好的预防作用。(参见图8)。
序列表
<110> 中国医学科学院医学生物学研究所
<120> 一种抗EV-D68 病毒的单克隆抗体及其制备和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
<210> 2
<211> 3
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
<210> 3
<211> 3
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
<210> 4
<211> 3
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
Claims (5)
1.一种抗EV-D68病毒的单克隆抗体，包括重链和轻链，其特征在于：所述的单克隆抗体重链可变区的CDR2-FR3-CDR3-FR4核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO.1所示；轻链可变区的CDR2-FR3-CDR3-FR4核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO.2所示；所述的单克隆抗体重链可变区CDR2-FR3-CDR3-FR4氨基酸编码序列如序列表SEQ ID NO.3所示；轻链可变区CDR2-FR3-CDR3-FR4氨基酸编码序列如序列表SEQ ID NO.4所示。
2.一种制备权利要求1所述抗EV-D68病毒的单克隆抗体的方法，包括以下步骤：
(1)用EV-D68病毒滴鼻感染恒河猴，作为EV-D68特异性单个B细胞的分选供体；
(2)用前期制备的EV-D68VP1蛋白作为分选抗原分选EV-D68特异性的单个记忆B细胞；
(3)建立单个B细胞抗体轻重链基因的巢式PCR体系，并从单个记忆B细胞中扩增抗体轻重链基因；
(4)将上述的抗体轻重链基因连接表达载体，并在293T、293A细胞及CHO细胞中进行表达；
(5)表达抗体纯化。
3.权利要求1所述抗EV-D68病毒的单克隆抗体在制备治疗或预防EV-D68病毒感染药物中的应用。
4.权利要求1所述抗EV-D68病毒的单克隆抗体在EV-D68病毒鉴定中的应用。
5.权利要求1所述抗EV-D68病毒的单克隆抗体在抑制EV-D68病毒感染中的应用。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112266895A (zh) * | 2020-10-16 | 2021-01-26 | 中国农业大学 | 单个记忆b细胞的筛选方法及其在小分子单克隆抗体制备中的应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016044656A1 (en) * | 2014-09-17 | 2016-03-24 | Ansun Biopharma, Inc. | Treatment of infection by human enterovirus d68 |
| US20160312314A1 (en) * | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Washington University | Methods and compositions for detection of enterovirus d68 |
| US20160355897A1 (en) * | 2015-06-05 | 2016-12-08 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Serv | Compositions and methods for detecting enterovirus d68 |
| CN106636162A (zh) * | 2017-01-04 | 2017-05-10 | 天津大学 | 基于人rna聚合酶i系统的肠道病毒68型微复制子体系及其构建方法 |
| CN107893083A (zh) * | 2017-11-10 | 2018-04-10 | 天津大学 | 一种人类肠道病毒d68型感染性克隆及其构建方法和应用 |
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2018
- 2018-06-12 CN CN201810598512.0A patent/CN108794625A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016044656A1 (en) * | 2014-09-17 | 2016-03-24 | Ansun Biopharma, Inc. | Treatment of infection by human enterovirus d68 |
| US20160312314A1 (en) * | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Washington University | Methods and compositions for detection of enterovirus d68 |
| US20160355897A1 (en) * | 2015-06-05 | 2016-12-08 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Serv | Compositions and methods for detecting enterovirus d68 |
| CN106636162A (zh) * | 2017-01-04 | 2017-05-10 | 天津大学 | 基于人rna聚合酶i系统的肠道病毒68型微复制子体系及其构建方法 |
| CN107893083A (zh) * | 2017-11-10 | 2018-04-10 | 天津大学 | 一种人类肠道病毒d68型感染性克隆及其构建方法和应用 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112266895A (zh) * | 2020-10-16 | 2021-01-26 | 中国农业大学 | 单个记忆b细胞的筛选方法及其在小分子单克隆抗体制备中的应用 |
| CN112266895B (zh) * | 2020-10-16 | 2022-03-29 | 中国农业大学 | 单个记忆b细胞的筛选方法及其在小分子单克隆抗体制备中的应用 |
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