CN107974434A - 一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定方法及试剂盒 - Google Patents

一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定方法，所述方法通过一株可识别ISKNV病毒主衣壳蛋白(MCP)的单克隆抗体作为捕获抗体捕获待测样品中的有效抗原，通过另一株识别传染性脾肾坏死病毒MCP不同抗原表位的单克隆抗体作为检测抗体对捕获的有效抗原进行定量。本发明所述方法及应用本方法的试剂盒具有灵敏度高、线性范围广、使用方便、所需时间短等优点，可用于传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗生产过程中半成品和成品中有效抗原含量的测定，为传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗质量控制提供了一种新的方法，可保障疫苗质量、提高疫苗生产效率。

Description

一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定方法及 试剂盒
技术领域
本发明涉及一种疫苗有效抗原含量测定方法，尤其是一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定方法及试剂盒。
背景技术
鳜(Siniperca chuatsi)是我国优质淡水鱼消费和出口创汇的重要品种，因其味道鲜美，蛋白质含量高而深受广大消费者的喜爱。然而严重的病害问题已成为限制鳜养殖业发展的主要瓶颈，自1997年以来，鳜暴发性传染病对鳜养殖业带来巨大的经济损失。吴淑勤等首次确认了一种截面呈六角形，直径约 150nm的大型球状病毒颗粒为鳜暴发性传染病的主要病原。由于该病毒主要感染鳜的脾和肾脏，何建国等将其命名为传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)，隶属于虹彩病毒科肿大细胞病毒属，其全基因组测序已完成。该病感染鳜的主要临床症状表现为脾肾肿大、充血、紫黑色。由于传染性脾肾坏死病毒病发病率高、致死率高、造成经济损失大，其防控技术研究成为鱼病研究者重要课题之一。疫苗接种是预防鱼类病毒病最经济有效的手段，针对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒，目前已研制出细胞灭活疫苗、重组亚单位疫苗、DNA疫苗，其中细胞灭活疫苗因具有制备简便、免疫效果稳定等优势而成为最具产业前景的疫苗之一。在鳜传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗生产过程中，疫苗质量评价主要采用抗原灭活前病毒滴度的测定以及灭活后鱼体免疫攻毒试验，但病毒滴度的测定依赖于活病毒，病毒灭活后的半成品及成品无法通过此方法对抗原进行定量，而鱼体免疫攻毒试验周期长、需强毒攻击存在病毒扩散等生物安全风险，在实用性和生物安全方面均存在弊端。因此，创制出快速简便的传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定方法成为鳜传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗质量控制急需解决的关键技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定方法及试剂盒。
一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定方法，所述方法通过一株可识别ISKNV病毒粒子主衣壳蛋白(MCP)的单克隆抗体作为捕获抗体捕获待测样品中的有效抗原，通过另一株针对传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白不同抗原表位的单克隆抗体作为检测抗体对捕获的有效抗原进行定量。
进一步的，所述方法以鼠抗ISKNV MCP抗原单克隆抗体株1C8 1B9作为包被单抗，然后以生物素标记的识别ISKNV MCP另一抗原表位的单克隆抗体株3B12 6B3作为检测抗体，以辣根过氧化物酶标记亲和素 (HRP-avidin)作为二抗，四甲基联苯胺(TMB)显色，建立了生物素-亲和素双抗体夹心ELISA(BA-ELISA) 检测方法。
进一步的，所述标准曲线的绘制为将制备的ISKNV抗原重组蛋白稀释至300ng/mL-1000ng/mL，优选 300ng/mL后，进行2倍系列稀释，以ISKNV抗原浓度为纵坐标，对应的A450值为横坐标，绘制标准曲线。
进一步的，一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定方法，具体包括以下步骤：
(1)ISKNV的增殖与纯化；
(2)重组蛋白表达与纯化；
(3)杂交瘤细胞株的筛选；
(4)单克隆抗体腹水的制备；
(5)双抗体夹心BA-ELISA法的建立。
本发明还保护一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定的杂交瘤细胞株1C8 1B9、3B12 6B3，于2017年3月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国武汉大学,分类命名: 杂交瘤细胞株 1C81B9，保藏编号分别为C201737、分类命名:杂交瘤细胞株 3B126B3保藏编号分别为C201738。
进一步的，所述步骤(5)所述方法为以鼠抗ISKNV MCP单克隆抗体株1C8 1B9作为包被单抗，以生物素标记的识别ISKNV MCP另一抗原表位的单克隆抗体株3B12 6B3作为检测抗体，以辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-avidin)作为二抗，四甲基联苯胺(TMB)显色，建立了生物素-亲和素双抗体夹心ELISA (BA-ELISA)检测方法。
优选的，包被抗体的最佳浓度为1-2μg/mL，优选最佳浓度为1μg/mL，生物素标记的单克隆抗株(一抗)稀释度为1:1000-1:2000优选稀释度为1:2000，辣根过氧化物酶标记亲和素(二抗)稀释度为1:3000 -1:5000，优选稀释度为1:4000。
优选的，包被条件为：4℃过夜；封闭液为2％BSA，封闭温度为37℃，封闭时间2h；检测温度37℃，时间1h。
优选的，本发明所述方法检测最佳线性范围为4.69～300ng/mL，最低检出限为0.9ng/mL。
本发明还保护一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定试剂盒，包含本发明所述方法。
一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原测定试剂盒，包括本发明所述杂交瘤细胞株。
本发明的有益效果是：
本发明方法及应用本方法的试剂盒灵敏度高、线性范围广、使用方便、所需时间短等优点，可用于传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量的测定，为传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗质量控制提供了一种新的方法，可保障疫苗质量、提高疫苗生产效率。
附图说明：
图1蔗糖密度梯度离心纯化的电镜负染图(11500×)；
图2 SDS-PAGE分析重组蛋白表达，Lane M：蛋白分子量Marker；Lane 1：纯化后的重组蛋白；
图3 Western blotting检测杂交瘤细胞上清结果，其中Lane M：蛋白分子量Marker；Lane 1-8：杂交瘤细胞培养上清；Lane 9:小鼠抗血清1:1000；Second antibody:IgG(H+L)-HRP(1:5000)；
图4 SDS-PAGE鉴定纯化后单克隆抗体，其中Lane 1,4：蛋白分子量Marker；Lane2：单克隆抗体3B12 6B3； Lane 3：单克隆抗体1C8 1B9；
图5抗原定量标准曲线,Y轴表示标准品浓度(ng/ml)，X轴表示不同浓度标准品对应的吸光值。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。
本发明实施例涉及的材料及主要试剂如下：
材料：SP2/0为供融合用的BalB/c小鼠骨髓瘤细胞系；BalB/c小鼠购置于湖北省实验动物研究中心，等级SPF级，许可证号：SCXK(鄂)2015-0018；鳜脑组织细胞系(Chineseperch brain cell line,CPB)由本实验室建立并保藏；鳜传染性脾肾坏死病毒QY株(ISKNV-QY)由本实验室分离保存。
试剂：细胞培养瓶、胰酶、胎牛血清等均购自Gibco公司；蔗糖购自SIGMA公司，PBS购自博士德公司；酶标板、生物素标记抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素购自金开瑞公司，NaCl、Tris碱、浓盐酸均为国产分析纯。
实施例一ISKNV的增殖与纯化
CPB细胞长至对数生长中期，以0.2个MOI同步接种ISKNV，血清终浓度6％，28℃恒温培养，当细胞产生90％病变后收毒，-80℃反复冻融3次后，采用蔗糖密度梯度离心法进行病毒纯化。
(1)病毒沉淀：收集病毒感染细胞悬液，7500rpm 4℃离心30min；取上清以150，000×g(约28000rpm) 4℃离心1h(BECKMAN 70Ti)，弃上清；沉淀中加入适量的TN buffer，吹打，重悬沉淀，(此时，沉淀往往结块不利于下面的梯度离心分离)，超声波破碎几次，直到没有明显的颗粒性沉淀出现为止。
(2)过蔗糖垫：将沉淀下来的病毒悬液加在35％的蔗糖溶液上面，150，000×g 4℃离心1h(BECKMEN,SW41)，轻轻吸取上清，此时沉淀仍为淡黄色，但由于过滤掉了部分的细胞残渣而颜色变浅。沉淀加入适量的TN 缓冲液，移液枪轻轻吹打重悬，低功率超声波适当打碎沉淀或者4℃过夜，最终为均一的淡黄色乳液。
(3)蔗糖梯度离心：5mL注射器加注不同浓度的蔗糖，依次为30％、40％、50％和60％，每个浓度约2.6mL；将(2)收获的病毒悬液轻轻的加在蔗糖梯度的顶层，即30％蔗糖浓度的上面。称重平衡之后进行超速离心，200，000×g(约34，000rpm)4℃离心1h；
(4)病毒收集：经过蔗糖梯度离心之后，将可见病毒条带轻轻收集，同样位置的病毒带放在一起，补加 TN缓冲液，称重平衡，而后150，000×g 4℃离心40min。加入TN缓冲液，重悬病毒。此时的病毒重悬液为浓浓的乳白色。用冻存管分装-80℃保存以备用。
(5)电镜观察。如图1所示，负染观察到纯化的病毒粒子主要是圆球形，还有一些病毒粒子呈近似完整的六角形，说明纯化病毒结构完整，质量较好。
实施例二重组蛋白表达与纯化
将ISKNV mcp基因片段与pET-SUMO载体连接，将测序鉴定正确的重组质粒转化表达宿主。挑取含重组质粒的单菌落至3ml LB(含抗生素)中37℃过夜培养。取30μL过夜培养菌液加入到含20mL LB培养基中，37℃震荡培养至OD600约0.6，取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度 0.5mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养3h。收集发酵液，6000g离心10min收集菌体。将菌体悬浮于 40mL预冷的NTA-0缓冲液中。冰浴超声波破碎细菌，控制功率为300W，超声4s，暂停4s，超声90次。 20000g 4℃离心30min，收集上清以及沉淀。取少量样品进行SDS-PAGE检测；剩余上清及沉淀至于4℃备用。将Ni-NTA树脂装入合适的层析柱，用10倍柱床体积的NTA-0Buffer冲洗。将样品加到层析柱中，流速控制在0.5ml/min左右，收集穿透部分。层析用10倍柱床体积的NTA-0Buffer冲洗，流速控制在1mL/min左右。分别用10倍柱床体积的NTA-20，NTA-60，NTA-200，NTA-500Buffer洗脱，流速控制在 1mL/min左右，收集各洗脱峰。SDS-PAGE检测各组分。纯度达到要求的组分，至于透析带中，4℃以1*PBS 透析(换液2次)。4℃超滤浓缩透析产物。
SDS-PAGE检测结果见图2，根据已有报道，鳜虹彩病毒的主要衣壳蛋白(MCP)带分子量是45kDa，并构成病毒的二十面体衣壳。由于重组蛋白带有SUMO标签，所以显示重组蛋白条带位置在45～66.2kDa 之间，为ISKNV重组MCP蛋白。
实施例三杂交瘤细胞株的筛选
用ISKNV-QY株纯化病毒与重组ISKNV MCP蛋白混合物作为抗原，经腹腔免疫BalB/c小鼠，一免小鼠 50-100μg/只，佐剂为完全弗氏佐剂，加强免疫小鼠50-80μg/只，佐剂为不完全弗氏佐剂，共免疫四次，首免间隔2-3周后加强免疫2次，间隔1周，之后进行效价检测，高于1:10000后1周内进行腹腔冲击。末次冲击3天后，摘除眼球处死，收集阳性对照血，取出脾脏，制备成单细胞悬液，用PEG1450将脾细胞与SP2/0细胞融合(1:5-1:10)；采用间接ELISA法检测杂交瘤细胞上清中抗体效价，选择效价较高的细胞株进行亚克隆，再次挑选ELISA结果高的细胞株进行第二次亚克隆，并收集上清进行ELISA及WB检测，选择全阳的细胞株进行扩大培养。收集培养上清进行亚型鉴定及抗原表位分析。将筛选的分泌ISKNV 单克隆抗体的杂交瘤细胞株反复冻存、复苏3次，并连续传代培养2个月，采用间接ELISA法检测细胞培养上清效价，分析杂交瘤细胞的稳定性。Western-blotting检测小鼠抗ISKNV-MCP蛋白产生抗体反应结果如图3所示，筛选的单克隆细胞株上清均能识别病毒MCP蛋白。单克隆抗体亚型鉴定结果如表1所示：除1C81B9和8D46F5为IgG2b亚型外，其余的均为IgG1亚型。以3B12 6B3抗体标记生物素作为检测抗体，采用竞争分析法分析不同抗体株所识别的抗原表位，测试结果如表2所示，8C9 3C12、11F7 4C3与3B12 6B3 同表位，其他细胞均与3B126B3不同表位。
杂交瘤细胞经反复冻存、复苏并连续传代培养，细胞培养上清的效价均大于1:1000，且无明显下降，表明建立的杂交瘤细胞株具有稳定分泌抗体的能力。
表1抗ISKNV重组MCP单克隆抗体亚型鉴定
表2单克隆抗体抗原表位鉴定
实施例四单克隆抗体腹水的制备
取BalB/c小鼠，经腹腔注射杂交瘤细胞悬液，7-10天后收集腹水，经预处理后选用Protein-G琼脂糖亲和层析柱纯化。15％SDS-PAGE分析两株单抗1C8 1B9、3B12 6B3的纯度。如图4所示，纯化的ISKNV 单抗经SDS-PAGE分析，主要存在两条主要的蛋白条带，一条为重链(约45kDa)，一条为轻链(约25kDa)。间接ELISA检测结果显示，腹水抗体效价为1:103～1:106。
实施例五双抗体夹心BA-ELISA法的建立
以单克隆抗体株1C8 1B9作为包被单抗，生物素标记的单克隆抗体株3B12 6B3作为检测抗体，以辣根过氧化物酶标记的亲和素(HRP-avidin)作为二抗，四甲基联苯胺(TMB)显色，建立了生物素-亲和素双抗体夹心ELISA检测方法。将制备的ISKNV抗原重组蛋白稀释至300ng/mL后，进行2倍系列稀释，以 ISKNV抗原浓度为纵坐标，对应的A450值为横坐标，绘制标准曲线。
包被抗体的最佳浓度为1-2μg/mL，优选最佳浓度为1μg/mL，生物素标记的单克隆抗株(一抗)稀释度为1:1000-1：2000，优选稀释度为1:2000，辣根过氧化物酶标记亲和素(二抗)最佳稀释度为1:3000-1： 5000，优选稀释度为1:4000。确定的包被条件为：封闭液为2％BSA，封闭温度为37℃，封闭时间2h，或者4℃封闭过夜；检测温度37℃，时间40分-1小时。最佳线性范围为4.69～300ng/mL，最低检出限为0.9ng/mL(见图5)。
实施例六方法的验证
应用建立的ELISA方法分别对ISKNV三个批次的细胞培养灭活疫苗进行检测，结果如表3所示，根据抗原定量标准曲线求得抗原含量与ISKNV病毒滴度呈正相关，滴度越高，抗原含量越高，说明建立的方法是可靠的。
表3不同批次疫苗的抗原含量检测结果
注：表中抗原含量均为三个重复实验得出结果的平均值
需要指出的是，以上的两个实施例只是对本发明的解释，并非是对发明的限定，在不违背本发明的精神的情况下，本发明可以作任何形式的修改。

Claims (10)

1.传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定的杂交瘤细胞株1C8 1B9、3B126B3，于2017年3月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号分别为C201737、C201738。
2.一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定方法，基于权利要求1所述杂交瘤细胞株，其特征在于：所述方法通过一株可识别ISKNV病毒粒子主衣壳蛋白的单克隆抗体1C8 1B9作为捕获抗体捕获待测样品中的有效抗原，通过另一株识别传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白不同抗原表位的单克隆抗体3B12 6B3作为检测抗体，通过建立生物素-亲和素双抗体夹心ELISA对捕获的有效抗原进行定量。
3.如权利要求2所述的一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定方法，其特征在于：所述检测抗体通过建立生物素-亲和素双抗体夹心ELISA对捕获的有效抗原进行定量为用单克隆抗体株1C8 1B9作为包被单抗，然后以生物素标记的单克隆抗体株3B126B3作为检测抗体一抗，以辣根过氧化物酶标记亲和素作为二抗，四甲基联苯胺显色，建立了生物素-亲和素双抗体夹心ELISA检测方法。
4.如权利要求3所述的一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定方法，其特征在于：所述生物素-亲和素双抗体夹心ELISA检测方法定量时标准曲线为将制备的ISKNV抗原重组蛋白稀释至300-1000ng/mL后，以2倍稀释法进行稀释，以ISKNV抗原浓度为纵坐标，对应的A450值为横坐标，绘制标准曲线。
5.如权利要求3所述的一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原测定方法，其特征在于：所述包被抗体的浓度为1-2μg/mL。
6.如权利要求3所述的一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原测定方法，其特征在于：所述生物素标记的单克隆抗体稀释度为1:1000-1:2000。
7.如权利要求3所述的一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原测定方法，其特征在于：所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释度为1:3000-1:5000。
8.如权利要求3或4所述的一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原测定方法，其特征在于：所述方法检测最佳线性范围为4.69～300ng/mL，最低检出限为0.9ng/mL。
9.一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原测定试剂盒，包括本发明所述杂交瘤细胞株。
10.一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原测定试剂盒，使用本发明所述方法。
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