CN101793897A - 一种提高杂交瘤筛选效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明阐述了一种旨在提高细胞融合后筛选分泌抗原特异性抗体的杂交瘤细胞效率的方法，该方法通过使用抗原偶联的固相材料对细胞融合后的杂交瘤细胞进行筛选，筛选出分泌抗目的抗原的阳性细胞，进行克隆化培养，从而快速、简便的建立分泌抗目的抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

Description

一种提高杂交瘤筛选效率的方法

发明所属领域：

本发明涉及单克隆抗体制备中分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选方法，该方法的建立旨在提高杂交瘤制备过程中的筛选效率，降低人工劳动强度，缩短筛选时间。是发展单克隆抗体通量化制备的重要基础之一。

发明背景：

单克隆抗体的概念

抗体主要由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。将激活的单一B细胞进行培养，得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，称为单克隆。单克隆细胞合成针对一种抗原决定簇的抗体，就是单克隆抗体(简称单抗)。

单克隆抗体技术的基本原理

1975年德国学者Kohler和英国学者Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞在体外进行两种细胞融合，形成杂交瘤(hybridoma)细胞，这种细胞继承两种亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞无限繁殖的特性，又具有合成和分泌抗体的能力。用这种来源于单个融合细胞增殖的细胞群，可制备针对一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。后来两人凭借此项成就获得诺贝尔生理学奖。时至今日单克隆抗体技术已经走过了30多个年头，在这30年中，单克隆抗体技术被不断发展并日臻完善，但有一个问题一直困扰着单抗制备的研究人员和制约着单抗的通量化和规模化生产，这一问题就是如何减少单抗制备过程中的人力成本，缩短单抗制备所需要的时间，从而降低单个单抗制作的成本。

杂交瘤细胞技术已经广泛应用于生命科学的各个领域，杂交瘤细胞所分泌的抗体-单克隆抗体是目前认为的最为成熟与可靠的分子识别工具，被广泛应用于生物学研究的各个领域，然而由于杂交瘤细胞株的制备周期长，所需的劳动强度高，已经成为制约杂交瘤细胞制备的重要瓶颈之一。本发明通过使用抗原偶联的固相介质(磁性材料)对细胞融合后的混合物进行筛选，分离出分泌抗原特异性抗体的杂交瘤细胞，然后通过半固体培养基的方法对杂交瘤细胞进行克隆化培养以进一步建立分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。该方法可以大幅度提高特异性抗体筛选的阳性率，降低筛选工作的劳动强度，缩短杂交瘤细胞制备所需要的时间，在大规模单克隆抗体制备中具有重要的应用前景。

单抗制备过程中最重要也是最为需要人力资源的一步是分泌特异性抗体的筛选工作，好的筛选方案是单克隆抗体制备成功与否的关键，目前通用的筛选方法是通过固相酶联实验(ELISA)法进行筛选，从成千上万个融合后的杂交瘤细胞中筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，随着制备过程的进行，有些不稳定的杂交瘤细胞失去了分泌特异性抗体的功能，在制备的末期甚至会失去全部的分泌特异性抗体的杂交瘤，导致单抗制备的失败。几十年来，在筛选的方法上也存在众多的改进，如通过流式细胞仪对杂交瘤细胞所分泌的抗体进行筛选，可以筛选出亲和力较高的抗细胞膜抗原的单抗，近年来蛋白芯片技术的不断成熟也为单抗的筛选提供了一些新的方法，Sawyer利用蛋白芯片结合多蛋白的复合免疫，进行单抗的制备，取得了较好的结果。但所有这些改进，对于筛选中工作量的降低都不明显。

单抗制备过程中的另外一个需要工作量较大的部分是克隆化培养，目前常用的方法是有限稀释法，由于杂交瘤细胞的基因组的不稳定性，使得其在后续的培养中，会发生染色体丢失现象，即使杂交瘤细胞在建株后，仍可能会丢失编码抗体的染色体，使杂交瘤细胞失去分泌特异性抗体的能力，因此，在单抗制备初期，人们总是尽可能多的将所有阳性细胞进行克隆化培养，以期最大限度的保留分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，从而造成了巨大的工作量。基于这种情况，人们对细胞克隆化培养技术进行了改进，引进了半固体培养基对细胞进行克隆，具体做法是利用商业化的甲基纤维素对欲克隆的细胞进行培养，细胞在这种培养基中可以形成独立的细胞克隆，在克隆长到可以用肉眼识别的大小时将其挑出，进行培养，这样得到了阳性克隆易于后面的筛选工作，从而降低了由于不分泌抗体的细胞的生长快于分泌抗体生长的细胞而造成的分泌特异性性抗体的丢失现象。同时半固体培养基的使用，也有利于单抗制备的机械化处理。节省人力成本。

发明内容：

本发明的目的是要提供一种可以显著提高分泌特异性抗体的杂交瘤细胞的筛选效率的方法，该目的的实现是通过偶联(包被)有靶抗原的固相材料(如磁性小球-磁珠)，通过免疫亲和作用，将细胞融合后杂交瘤混合物中分泌抗靶抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞筛选出来，通过进一步的培养和克隆化培养，从而达到提高分泌特异性抗体的杂交瘤细胞的筛选效率的目的。本发明提供了实现上述目标的具体方法，包括：

1)提供一种将目的抗原(靶抗原)通过化学方法将其偶联到固相材料上的方法；2)提供用上述方法偶联的固相材料对细胞融合后的杂交瘤细胞的筛选方法；3)提供用上述方法筛选出的杂交瘤细胞的培养与克隆的方法；4)提供通过用上述方法培养克隆的杂交瘤细胞的进一步的检测与鉴定方法。

本发明的第二个目的是通过这种方法，建立可以分泌针对某种抗原(抗原的种类包括但不限于1.天然提取的蛋白；2.重组表达蛋白；3.体外合成的蛋白质中的多肽片段；4.半抗原)的特异性抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的第三个目的是提供按上述方法制备的特异性单克隆抗体在生命科学研究中的应用。在生命科学研究中，可利用已获得的单克隆抗体通过ELISA、免疫印记(WB)、免疫沉淀(IP)、抗体芯片等技术对蛋白质进行定性、定量、定位及相互作用研究。

本发明的第四个目的是提供按上述方法制备的特异性单克隆抗体在疾病诊断中的应用。在疾病诊断过程中，可利用已获得的单克隆抗体通过ELISA、免疫印迹(WB)、免疫层析、时间免疫荧光分辨、液相芯片等技术完成对肿瘤、感染性疾病的快速诊断。

本发明的第五个目的是提供按上述方法制备的特异性单克隆抗体在疾病治疗中的应用。在疾病治疗中，可利用已筛选到具有治疗价值的单克隆抗体进行人源化改造用于人体肿瘤、病毒感染性疾病(例如HIV、HCV等的传染)的治疗。

本发明的第六个目的是通过该方法的使用，可以大幅度的降低单克隆抗体制备过程中的研究人员的劳动强度，缩短单克隆抗体制备所需的时间。

本发明所涉及的提高单克隆抗体制备效率的方法，特别是细胞融合后采用免疫学的方法分离抗体分泌阳性的杂交瘤细胞，及后续的简易快速的克隆化培养方法，主要包括以下步骤：1)抗原偶联固相材料的制备：通过使用化学方法将欲制备抗体的蛋白通过特定的化学基团之间的反应偶联到相应的固相载体上；该载体可以是凝胶类物质，也可以是带有磁性的磁性材料。2)动物的免疫，将欲制备抗体的蛋白与弗氏完全佐剂(初次免疫)或弗氏不完全佐剂(加强免疫)混合后充分乳化，取乳化后的抗原免疫Balb/C小鼠。3)免疫后的Balb/C小鼠经过血清效价检测合格后，通过常规的方法进行细胞融合。4)融合后的细胞在体外用HAT选择性培养基培养3天以后，与偶联有靶抗原固相材料进行孵育后将分泌特异性抗体的

根据本发明方法的一个优选实施方案，其中作为免疫原的蛋白质是人血清白蛋白。

根据本发明方法的一个优选实施方案，特征在于使用包被有特异性抗原的固相介质为磁性介质(磁珠)。

根据本发明的一个优选实施方案，其中用于鉴定和筛选抗体的包括酶联免疫吸附、免疫印记方法。

目前单克隆抗体仍然是最为可靠的分子识别工具之一，单克隆抗体以其特异性强、均一性好和具有可靠的来源而受到广泛的应用，其应用领域涵盖了整个生命科学的研究领域，从科研试剂到疾病的临床诊断，单克隆抗体都是非常重要的工具。由于单克隆抗体制备工作的复杂性和对人工的依赖度高的特点，制约了其大规模制备，严重制约了单克隆抗体种类的丰富；近年来随着蛋白质组学研究的深入发展，发现了许多新的蛋白质，另外一些蛋白质的异构体也相继被发现，这些蛋白及其异构体的确认以及其功能的研究，急需大量的特异性抗体，因此，突破单克隆抗体大规模通量化的制备的瓶颈，成为目前单克隆抗体制备技术研究与改进的热点之一。如2005年Sawyer等将蛋白质芯片技术应用到单克隆抗体的筛选中，结合多抗原的复合免疫技术，实现了单克隆抗体的批量化制备。该方法由于使用了蛋白质芯片技术，因此对于仪器的依赖性较强，应用上具有一定的局限性(Alan Sawyer，et al.High throughputproduction of mouse monoclonal antibodies using antigen microarrays，Proteomics，5(16)，4070-4081.)。本发明利用抗原包被的固相介质，对细胞融合后的杂交瘤进行筛选，然后再进行克隆化培养和筛选，从而有效的提高了单克隆抗体的筛选效率，实验中引入了半固体培养基的克隆方法，有效的降低了劳动强度，缩短了单克隆抗体的制备时间。

附图说明：

图1：本发明中涉及的抗原包被的固相介质对杂交瘤细胞的筛选原理图：免疫后的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞通过融合剂(聚乙二醇，PEG)作用后融合成为杂交瘤细胞，有些杂交瘤细胞表面存在有针对免疫原的特异性抗体，当偶联有免疫原的固相介质(磁珠)与这种杂交瘤细胞共同孵育后，这些固相介质会与杂交瘤细胞结合，从而达到从杂交瘤细胞混合液中分离分泌特异性抗体的杂交瘤细胞的目的。

图2：杂交瘤细胞表面IgG的流式细胞术的检测：为了探讨本发明的可行性，对杂交瘤细胞表面的IgG进行了流式细胞术的检测，取10⁶已建株的杂交瘤细胞G7和杂交瘤细胞的母体细胞之一SP2/0细胞，经2％的多聚甲醛于4度固定30分钟后，用荧光素FITC标记的山羊抗鼠的抗体与固定后的细胞在4度的条件下孵育60分钟，用PBS清洗2遍后，用流式细胞仪检测细胞的荧光，SP2/0细胞表面不存在抗体，因此其荧光值较低(图实体部分)，而杂交瘤细胞G7经过染色后，显示出较强的荧光(图中右侧未填充部分)，显示在G7细胞的表面存在大量的鼠IgG。

图3：筛选前后杂交瘤细胞数量比较：杂交瘤细胞混合液与磁珠共孵育前后的细胞数量的比较，仅有少量的杂交瘤细胞与偶联有免疫原的磁珠结合。

图4：筛选后杂交瘤细胞克隆化培养后，与未筛选的杂交瘤细胞克隆化培养后的阳性率比较：经过偶联有免疫原的磁珠筛选后的杂交瘤细胞的特异性抗体的阳性率有了很大的提高。

具体实施方式

以下借助实施例并结合附图进一步举例描述本发明。本领域技术人员可以理解到，这些实施例并不以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。

实施例1制备和鉴定抗人血清白蛋白的单克隆抗体的方法

本实施例旨在抗人血清白蛋白的单克隆抗体为例，举例描述本发明方法的实际可应用性。发明人建立了生产和鉴定抗人血清白蛋白单克隆抗体的方法。

1)抗原偶联磁性固相材料的制备：

制备所需的试剂及缓冲液：a)磷酸盐缓冲液(PBS)：20mM sodiumphosphate，0.15M NaCl，pH 7.2，偶联试剂：2)5mM BS3(Pierce产品，Product No.21580)in PBS，3)终止液：1M Tris，pH 7.5，4)磁珠(Pierce产品，Product No.21352)

实验方法：

在1ml磁珠悬液中加入1ml PBS并轻轻摇动，然后用磁架分离磁珠，吸取上清液，如此反复3次。静置反应容器，使磁珠自然沉降。

将目的蛋白----人血清白蛋白溶解于PBS中，使其终浓度为5mg/ml，并取1ml加入上述磁珠悬液中，并轻摇容器。

加入浓度为5mM的BS3使其终浓度达到1mM，室温轻摇30分钟。

加入50ul终止缓冲液，终止反应。

用磁珠分离架分离偶联后的磁珠并用1ml PBS清洗3次。

2)动物免疫

40ug人血清白蛋白溶于0.2ml无菌生理盐水中，与等体积的弗氏完全佐剂混合后于高速微量搅拌器中搅拌20分钟，使白蛋白溶液与弗氏完全佐剂充分乳化，腹腔免疫Balb/C小鼠；免疫14天后取20ug人血清白蛋白溶于0.2ml无菌生理盐水中，与等体积的弗氏不完全佐剂混合后在高速微量搅拌器中搅拌20分钟，使白蛋白溶液与弗氏不完全佐剂充分乳化，腹腔免疫Balb/C小鼠。免疫7天后进行第2次加强免疫，第二次加强免疫10天后尾静脉取血测定效价。

3)细胞融合

脾细胞制备：取加强免疫小鼠一只，眼眶采血后脱臼处死，在75％酒精中消毒后取脾脏，去除结缔组织，制备脾细胞悬液，转移到50毫升离心管中，加RPMI1640至30ml，1500～2000rpm离心5分钟，弃上清，加RPMI1640至30ml，白细胞稀释液稀释20倍，计数，取1×10⁸个细胞待用。

骨髓瘤细胞制备：取2瓶生长状态良好的(活细胞数＞95％)骨髓瘤细胞，将之完全吹下，转移到50毫升离心管中，加RPMI1640至30ml，1500～2000rpm离心5分钟，弃上清，加RPMI1640至30ml，白细胞稀释液稀释20倍，计数，取1×10⁷个细胞待用。

细胞混合：脾细胞∶骨髓瘤＝10∶1，混合，1500～2000rpm离心5分钟。

细胞融合：将离心上清倒干，把沉淀细胞块弹成糊状，置37℃水浴，在1分钟内加入1ml融合剂，并搅拌细胞，37℃水浴放置45秒，

清。

2分钟内加入10ml  1640并搅拌细胞

细胞培养：轻轻将细胞弹匀，缓缓加入HAT培养液至所需体积，将细胞重悬，轻轻地将之混匀，加到预先准备好的饲养细胞瓶中。37℃CO₂培养箱培养、观察。培养3-5天后进行特异性抗体筛选。

4)分泌特异性抗体的杂交瘤细胞的筛选

将在HAT中培养3天后的融合后的细胞重悬后用无血清的1640培养基清洗2遍，将细胞悬浮于含10％胎牛血清的培养基中，加入0.5ml偶联有蛋白的磁珠，37度摇床孵育1小时后，洗去未结合的杂交瘤细胞，并将细胞悬浮于适量的含有20％胎牛血清的HAT选择性培养基中。

5)杂交瘤细胞的克隆化培养

将上述细胞悬液加入100ml平衡于20％胎牛血清的HAT选择培养基的1％的甲基纤维素中，充分混匀后分别接种于10个直径为100毫米的细胞培养皿中，37度、5％CO₂中，培养7-10天，直到有肉眼可辨的细胞克隆长出后，将克隆接种于另外一块96孔板中，每个克隆接种一孔，并补加含20％胎牛血清的1640HAT选择性培养基至200ul。继续培养2-3天，进行常规ELISA检测。

6)杂交瘤细胞的ELISA筛选

包被：2μg/ml抗原浓度，100μl/孔，4℃过夜，洗液洗涤3次。

封闭：加150μl/孔或加满/孔封闭液，4℃过夜或37℃2小时后，洗涤3次，拍干。置4℃冰箱保存备用。

加待侧样品：检测细胞培养上清时，无菌条件下取细胞上清，100μl/孔加样到包被好的酶标板中，同时，每板分别选取无细胞生长的两孔为阴性对照，选取无细胞生长的两孔加入阳性血清作为阳性对照；以正常小鼠血清为阴性对照，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。

加二抗：1∶4000倍稀释的酶标二抗(根据酶标二抗的效价选择一定稀释倍数)，100μl/孔，37℃孵育20～30min，洗板4次，拍干。

显色：加入TMB显色液A和B液各50～100μl/孔，37℃显色15～30min。

终止：加入终止液50μl/孔，450nm波长测定OD值。

读数：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值(P/N)大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。

备注：1、筛选阳性细胞时，P/N＞2.1的判别为阳性细胞；1＜P/N＜2.1的细胞孔加大包被浓度后再次检测，P/N＞2.1的仍判为阳性。

2、效价以P/N≥2.1的血清最大稀释倍数表示。

Claims (7)

1.提高特异性单克隆抗体筛选效率的方法，该方法包括：(1)首先用经过相应抗原包被(偶联)的固相介质的制备；(2)然后用所制备的抗原偶联后的固相介质对细胞融合后的杂交瘤细胞进行免疫亲和筛选，获得的杂交瘤细胞进行进一步的克隆化培养；(3)最后再用已知方法鉴定杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体的特异性。

2.根据权利要求1的方法，其中作为抗原的包被(偶联)的固相介质可以是但不限于是磁性介质、琼脂糖介质、葡聚糖介质。

3.根据权利要求1的方法，其中用于鉴定抗原的已知方法包括酶联免疫吸附、免疫印记(Western Blot)、流式细胞仪等方法。

4.按权利要求1的方法制备的抗相应蛋白质的特异性单克隆抗体在蛋白质组研究中的应用。

5.按权利要求1的方法制备的特异性单克隆抗体在疾病诊断中的应用。

6.按权利要求1的方法制备的制备的特异性单克隆抗体在疾病治疗中的应用。

7.按权利要求1的方法所指的抗原包括但不限于蛋白质、多肽、多糖、脂多糖、小分子半抗原。

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