CN103364561A

CN103364561A - 猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸及制备方法

Info

Publication number: CN103364561A
Application number: CN2013103230547A
Authority: CN
Inventors: 廖园园; 漆世华; 朱薇; 秦伟; 李建; 刘洁; 谢红玲; 温文生; 冯钊
Original assignee: WUHAN CHOPPER BIOLOGY CO Ltd
Current assignee: WUHAN CHOPPER BIOLOGY CO Ltd
Priority date: 2013-07-29
Filing date: 2013-07-29
Publication date: 2013-10-23

Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸及制备方法。该试纸包括样品吸收区、金标探针区、固相化抗体区、吸水区和支撑板，样品吸收区、金标探针区、固相化抗体区和吸水区铺设在支撑板上并依次相互部分重叠；样品吸收区包被PCV2-Cap蛋白；金标探针区包被金标探针1和金标探针2，分别为胶体金标记的猪圆环病毒2型单克隆抗体和兔IgG；固相化抗体区依次有对照线C1包被羊抗兔IgG抗体、测试线T包被羊抗猪IgG抗体、对照线C2包被羊抗兔IgG抗体和对照线C3包被羊抗鼠IgG抗体。本发明的试纸检测快速，准确率高，特异性强，携带、操作简便，根据对照线颜色深浅来判断猪圆环病毒2型抗体水平高低。

Description

猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸及制备方法

技术领域

本发明涉及一种检测试纸及制备方法，具体涉及一种猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸及制备方法。

背景技术

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2，PCV2）是引发断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaningmultisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原，该病主要以患畜生长缓慢、进行性消瘦和多系统病例损伤为特征。除了引发PMWS外，PCV2还与仔猪先天性震颤、猪皮炎肾炎综合征、猪呼吸道综合征、母猪繁殖障碍等疾病相关。自1996年在加拿大首次发现PMWS以来，PCV2感染引起的相关疾病已经在全世界广泛存在。随着我国养猪业受到PCV2感染的危害日益严峻，研制PCV2血清抗体检测试剂盒的临床需求迫切。PCV基因组由一条共价闭合环状单股DNA构成，包含两个大的开放阅读框架ORF1和ORF2，分别编码病毒蛋白复制酶（Rep）和病毒衣壳蛋白（Cap）。Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白，含有4个抗原表位，具有较好的免疫原性和抗原性，是检测该病毒特异性抗体的理想靶抗原。由于该病毒在体外培养不产生细胞病变，病毒繁殖能力低，难于获得高产量的病毒抗原用于诊断目的。而昆虫杆状病毒表达系统以其表达外源蛋白产量高、免疫活性好、产物易纯化、反应背景低等优点，在多种动物疫病诊断中得到应用。检测PCV2的衣壳蛋白抗体可以反映PCV2的抗体水平，对猪群PCV2抗体水平进行监测，可确切了解猪体免疫水平或感染状况，制定最适免疫程序或淘汰选育，有效预防和控制PCV2的侵袭和传播，避免因此而引起的重大经济损失。

目前，国内外采用的PCV2检测技术主要有：病毒分离培养，间接免疫荧光，免疫酶单层实验（IMPA），原位杂交（ISH），聚合酶链式反应（PCR）等等。上述技术和方法虽然可以检测PCV2或抗体水平，在实践中也取得一定的效果。但均存在试验操作复杂，耗时长，需要特定的专业技能和仪器设备等，成品昂贵等缺点，不易在基层单位普及。而胶体金免疫层析法刚好可以避免以上几种检测方法的缺点。该方法是一种很成熟的实验检测方法，以其特异性强、成本低，操作简便，结果可靠、可单份或成批测定、不需任何仪器等优点已被广泛接受。现有关于猪圆环病毒2型抗体胶体金检测试纸的专利中一般都是1条对照线（或质控线），结果判读仅根据检测线颜色深浅进行，不能进行抗体水平高低的判定。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸。该试纸采用胶体金标记的猪圆环病毒2型单克隆抗体和胶体金标记的兔IgG做探针，包被羊抗猪IgG抗体、羊抗兔IgG抗体和羊抗鼠IgG抗体，结合样品吸收区上的纯化的猪圆环病毒2型Cap蛋白进行抗猪圆环病毒2型IgG抗体的检测。

本发明的另一目的在于提供上述猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸的制备方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸，包括样品吸收区、金标探针区、固相化抗体区、吸水区和支撑板，样品吸收区、金标探针区、固相化抗体区和吸水区铺设在支撑板上并依次相互部分重叠；所述的样品吸收区包被有PCV2-Cap蛋白，包被量优选为5～50μg；所述的金标探针区包被有金标探针1和金标探针2；所述的金标探针1为胶体金标记的猪圆环病毒2型单克隆抗体，其标记量优选为每mL胶体金标记5～20μg单抗；所述的猪圆环病毒2型单克隆抗体优选为猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体；所述的金标探针2为胶体金标记的兔IgG，其标记量优选为每mL胶体金标记1～10μg兔IgG；所述的固相化抗体区（自金标探针区至吸水区方向）依次有对照线C1、测试线T、对照线C2和对照线C3；所述的对照线C1包被有羊抗兔IgG抗体，包被量优选为0.05～0.5μg；所述的检测线T包被有羊抗猪IgG抗体，包被量优选为0.5～5μg；所述的对照线C2包被有羊抗兔IgG抗体，包被量优选为0.5～5μg；所述的对照线C3包被有羊抗鼠IgG抗体，包被量优选为1～5μg。

所述的支撑板的材料优选为粘有一层聚氯乙烯衬膜的聚乙烯板；所述的样品吸收区的材料优选为玻璃纤维膜；所述的金标探针区的材料优选为聚酯膜；所述的固相化抗体区的材料优选为硝酸纤维素膜；所述的吸水区的材料优选为吸水滤纸。

上述猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，包括如下步骤：将胶体金标记的猪圆环病毒2型单克隆抗体和胶体金标记的兔IgG分别喷涂于聚酯膜上；在硝酸纤维素膜上依次包被对照线C1（包被羊抗兔IgG抗体）、测试线T（包被羊抗猪IgG抗体）、对照线C2（包被羊抗兔IgG抗体）和对照线C3（包被羊抗鼠IgG抗体）；在玻璃纤维膜上包被PCV2-Cap蛋白；将玻璃纤维膜、聚酯膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装到支撑板上得到猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸。

优选的，所述的猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸的制备方法包括如下步骤：

（1）PCV2-Cap蛋白的制备：

1）利用基因工程技术Bac-to-Bac系统构建表达PCV2-ORF2基因（Cap蛋白）的重组杆状病毒，根据PCV2的基因序列设计Cap特异性引物，其中，

上游引物1：5’-TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG-3’，

下游引物1：5’-GCGAAGCTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3’，

上游引物2：5’-TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG-3’，

下游引物2：5’-GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3’，

通过PCR从PCV2基因组中扩增出ORF2基因全序列，将其亚克隆至杆状病毒穿梭载体pFastBac-Dual中，构建ORF2基因双拷贝的重组质粒pFastBac-Dual-ORF2(2×)，将重组质粒pFastBac-Dual-ORF2(2×)转化到大肠杆菌DH10Bac，获得重组bacmid；

2）将重组bacmid转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒rBac-ORF2(2×)；

3）将重组杆状病毒rBac-ORF2(2×)感染Sf9细胞，使其表达Cap蛋白，并自我组装形成病毒样颗粒（VLPs），通过超速离心和CsCl密度梯度离心，获得纯化的形成病毒样颗粒的Cap蛋白。

（2）本发明的猪圆环病毒2型单克隆抗体可以商购，或按照本领域的常规方法制备，如参照文献（曹雪涛,精编免疫学实验指南[M].北京:科学出版社,2009）公开的方法制备。作为示例，本发明的猪圆环病毒2型单克隆抗体的制备方法，包括下述步骤：

1）将前述纯化的猪圆环病毒2型Cap蛋白常规免疫Balb/c小鼠，当小鼠血清ELISA效价达到1:10000以上时，取脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）以5×10⁷：1×10⁷的比例进行融合；用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞；用ELISA方法和间接免疫荧光（IFA）方法进行阳性杂交瘤细胞的筛选；将筛选到的阳性杂交瘤细胞经三次有限稀释得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株及猪圆环病毒2型单克隆抗体；

2）将步骤1）制得的猪圆环病毒2型单克隆抗体经硫酸铵沉淀，纯化，制得纯化的猪圆环病毒2型单克隆抗体。

（3）胶体金标记猪圆环病毒2型单克隆抗体的方法：分别取半径为10～40nm浓度为0.01%的胶体金20mL及猪圆环病毒2型单克隆抗体100～400μg，在pH8.5～9.2的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇20000（PEG20000）作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为0.1～5%，PEG20000最终质量浓度为0.01～0.1%，采用离心法除去未结合的猪圆环病毒2型单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金－猪圆环病毒2型单克隆抗体复合物。

（4）胶体金标记兔IgG的方法：分别取半径为10～40nm浓度为0.01%的胶体金20mL及兔IgG20～200μg，在pH8.5～9.2的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇20000（PEG20000）作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为0.1～5%，PEG20000最终质量浓度为0.01～0.1%，采用离心法除去未结合的兔IgG和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金－兔IgG复合物。

（5）将胶体金标记的猪圆环病毒2型单克隆抗体和胶体金标记的兔IgG分别喷涂于聚酯膜上：用20mL含1%BSA的PBS（0.01M，pH7.4）分别洗涤胶体金－猪圆环病毒2型单克隆抗体复合物和胶体金－兔IgG复合物，离心除去上清液，得到深红色沉淀，纯化后的沉淀用2mL含1%BSA的PBS溶解，用喷涂设备分别涂于聚酯膜上，冻干。

（6）硝酸纤维素膜的包被：在硝酸纤维素膜依次包被对照线C1、测试线T、对照线C2和对照线C3；检测线T包被的是羊抗猪IgG抗体，包被量0.5～5μg，对照线C1包被的是羊抗兔IgG抗体，包被量0.05～0.5μg，对照线C2包被的也是羊抗兔IgG抗体，包被量0.5～5μg，对照线C3包被的是羊抗鼠IgG抗体，包被量1～5μg，每条线宽1～3mm。

（7）玻璃纤维膜的包被：将前述纯化的PCV2-Cap蛋白用适量的PBS（0.01M，pH7.4）溶解后包被在玻璃纤维膜上，包被量为5～50μg。

（8）试纸组装：用粘上一层聚氯乙烯衬膜的聚乙烯板作为支撑载体，上面依次铺设包被有纯化的猪圆环病毒2型Cap蛋白的玻璃纤维膜、金标探针的聚酯膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，外面用胶带包封制成。

除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量（mL/g）百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积（g/mL）百分比；其余为重量/重量百分比。

上述猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸的使用方法，包括如下步骤：将该试纸的样品吸收区一端浸入待检血清样品中，5～10分钟后判读结果：对照线C1、C2、C3均出现红色，表示试纸有效；对比检测线T和对照线C1、C2的颜色，检测线T颜色较对照线C2颜色深，表明抗体强阳性；检测线T颜色介于对照线C1和C2之间，表明抗体阳性；检测线T颜色较对照线C1颜色浅或无颜色出现，表明血清中没有猪圆环病毒2型抗体或抗体量不足。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

（1）检测快速：检测时间只需5～10分钟，能够满足现场检测的需要。

（2）检测准确率高、特异性强：本反应试纸与其他猪易感病原体没有交叉反应，检测灵敏度与ELISA基本相同。

（3）携带方便，操作简便：本发明不需要借助其它仪器设备，适合各级兽医院、猪场及个人使用。

（4）检测试纸在常温下即可保存，无需特殊的设备和仪器。保存期可达2年，且检测重复性好。

（5）检测结果根据检测线和对照线C1及C2的颜色比较，可以判断样品中的抗体水平高低。

附图说明

图1是猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸平面结构区域图；其中，1-样品吸收区，2-金标探针区，3-固相化抗体区，31-对照线C1，32-检测线T，33-对照线C2，34-对照线C4，4-吸水区。

图2是猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸纵切面结构图（用具体材料代表各个区域），其中，5-粘有一层聚氯乙烯衬膜的聚乙烯板（支撑板），6-玻璃纤维膜（样品吸收区），7-聚酯膜（金标探针区），71-金标探针1，72-金标探针2，8-硝酸纤维素膜（固相化抗体区），9-吸水滤纸（吸水区）。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行具体的说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。

实施例1

猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸平面结构区域图如图1所示，试纸水平面自下而上依次为：样品吸收区1、金标探针区2、固相化抗体区3和吸水区4，固相化抗体区3包被有对照线C1 31、检测线T32、对照线C2 33和对照线C3 34。

猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸纵切面结构图（用具体材料代表各个区域），粘有一层聚氯乙烯衬膜的聚乙烯板5为支撑板，玻璃纤维膜6为样品吸收区，聚酯膜7为金标探针区，硝酸纤维素膜8为固相化抗体区，吸水滤纸9为吸水区，聚酯膜7上包被有金标探针1 71和金标探针2 72；玻璃纤维膜6、聚酯膜7、硝酸纤维素膜8、吸水滤纸9铺设在聚乙烯板5上并依次相互部分重叠。

样品吸收区1的玻璃纤维膜上包被有纯化的PCV2-Cap蛋白，包被量为5μg。金标探针171为胶体金标记的猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体，标记量为每mL胶体金标记5μg单抗，金标探针2 72为胶体金标记的兔IgG，标记量为每mL胶体金标记1μg兔IgG。对照线C1 31包被的是羊抗兔IgG纯化抗体，包被量0.05μg；检测线T32包被的是羊抗猪IgG抗体，包被量0.5μg；对照线C2 33包被的是羊抗兔IgG抗体，包被量0.5μg；对照线C3 34包被的是羊抗鼠IgG抗体，包被量1μg。

上述猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸制备方法如下：

（1）PCV2-Cap蛋白的制备：

上游引物1：5’-TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG-3’，

下游引物1：5’-GCGAAGCTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3’，

上游引物2：5’-TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG-3’，

下游引物2：5’-GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3’，

2）将重组bacmid转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒rBac-ORF2(2×)；

（2）猪圆环病毒2型单克隆抗体的制备方法，包括下述步骤：

（3）胶体金标记猪圆环病毒2型单克隆抗体的方法：分别取半径为40nm浓度为0.01%的胶体金20mL及猪圆环病毒2型单克隆抗体100μg，在pH8.5的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇20000（PEG20000）作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为0.1%，PEG20000最终质量浓度为0.01%，采用离心法除去未结合的猪圆环病毒2型单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金－猪圆环病毒2型单克隆抗体复合物。

（4）胶体金标记兔IgG的方法：分别取半径为40nm浓度为0.01%的胶体金20mL及兔IgG20μg，在pH8.5的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇20000（PEG20000）作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为5%，PEG20000最终质量浓度为0.1%，采用离心法除去未结合的兔IgG和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金－兔IgG复合物。

（6）硝酸纤维素膜的包被：在硝酸纤维素膜依次包被对照线C1、测试线T、对照线C2和对照线C3；检测线T包被的是羊抗猪IgG抗体，包被量0.5μg，对照线C1包被的是羊抗兔IgG抗体，包被量0.05μg，对照线C2包被的也是羊抗兔IgG抗体，包被量0.5μg，对照线C3包被的是羊抗鼠IgG抗体，包被量1μg，每条线宽1～3mm。

（7）玻璃纤维膜的包被：将前述纯化的PCV2-Cap蛋白用适量的PBS（0.01M，pH7.4）溶解后包被在玻璃纤维膜上，包被量为5μg。

（8）试纸组装：用粘上一层聚氯乙烯衬膜的聚乙烯板作为支撑载体，上面依次铺设包被有纯化的猪圆环病毒2型Cap蛋白的玻璃纤维膜、金标探针的聚酯膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，外面用胶带包封后切成2～4mm宽的试纸制成。

实施例2：

除检测线T包被量为5μg；对照线C1包被量为0.5μg，对照线C2包被量为5μg，对照线C3包被量为2μg，玻璃纤维膜PCV2-Cap蛋白包被量为20μg；金标探针1胶体金标记猪圆环病毒2型单克隆抗体标记量为每mL胶体金标记20μg单抗，金标探针2胶体金标记兔IgG标记量为每mL胶体金标记10μg兔IgG；胶体金标记猪圆环病毒2型单克隆抗体的方法：分别取半径为10nm浓度为0.01%的胶体金20mL及猪圆环病毒2型单克隆抗体400μg，在pH9.0的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇20000（PEG20000）作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为2%，PEG20000最终质量浓度为0.05%，采用离心法除去未结合的猪圆环病毒2型单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金－猪圆环病毒2型单克隆抗体复合物；胶体金标记兔IgG的方法：分别取半径为10nm浓度为0.01%的胶体金20mL及兔IgG200μg，在pH9.0的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇20000（PEG20000）作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为2%，PEG20000最终质量浓度为0.05%，采用离心法除去未结合的兔IgG和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金－兔IgG复合物外，其余与实施例1相同。

实施例3

除检测线T包被量为2μg；对照线C1包被量为0.2μg，对照线C2包被量为2μg，对照线C3包被量为5μg，玻璃纤维膜PCV2-Cap蛋白包被量为50μg；金标探针1胶体金标记猪圆环病毒2型单克隆抗体标记量为每mL胶体金标记10μg单抗，金标探针2胶体金标记兔IgG标记量为每mL胶体金标记5μg兔IgG；胶体金标记猪圆环病毒2型单克隆抗体的方法：分别取半径为20nm浓度为0.01%的胶体金20mL及猪圆环病毒2型单克隆抗体200μg，在pH9.2的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇20000（PEG20000）作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为5%，PEG20000最终质量浓度为0.1%，采用离心法除去未结合的猪圆环病毒2型单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金－猪圆环病毒2型单克隆抗体复合物；胶体金标记兔IgG的方法：分别取半径为20nm浓度为0.01%的胶体金20mL及兔IgG100μg，在pH9.2的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇20000（PEG20000）作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为0.1%，PEG20000最终质量浓度为0.01%，采用离心法除去未结合的兔IgG和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金－兔IgG复合物外，其余与实施例1相同。

实施例4

猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸的使用方法：

检测时，抽取被测者少量血清样品，用PBS（0.01M，pH7.4）稀释一倍，将该试纸的样品吸收区一端浸入稀释的样品中，5～10分钟后判读结果：对照线C1、C2、C3均出现红色，表示试纸有效；对比检测线T和对照线C1、C2的颜色，检测线T颜色较对照线C2颜色深，表明抗体强阳性；检测线T颜色介于对照线C1和C2之间，表明抗体阳性；检测线T颜色较对照线C1颜色浅或无颜色出现，表明血清中没有猪圆环病毒2型抗体或抗体量不足，应及时加强免疫。

实施例5

本发明猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸与猪圆环病毒2型抗体ELISA检测方法的比较：

应用实施例1、2、3制备的3种猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸（编号为试纸1、2、3）与商品化韩国JENO公司生产的猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒同时检测猪血清样品35份、猪圆环病毒2型抗体阴性血清、猪圆环病毒1型抗体阳性血清、猪瘟病毒抗体阳性血清、猪伪狂犬病毒抗体阳性血清、猪蓝耳病毒抗体阳性血清、猪细小病毒抗体阳性血清和不同稀释度的猪圆环病毒抗体阳性参考血清。试纸使用方法按实施例4方法进行，ELISA试剂盒按照试剂盒说明书进行操作，检测结果见表1。

表1本发明试纸与ELISA试剂盒的比较实验结果

检测结果显示，本发明实施例1、2、3制备的猪圆环病毒抗体胶体金免疫层析检测试纸特异性好，与猪圆环病毒1型、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒和猪细小病毒阳性血清没有交叉反应；试纸敏感性不低于ELISA试剂盒敏感性；检测的35份猪血清样本结果显示，本发明试纸与ELISA检测方法的符合率高达97.14%（34/35）。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉中博生物股份有限公司

<120> 猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸及制备方法

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游引物1

<400> 1

tctggatcca tgacgtatcc aaggaggcg 29

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游引物1

<400> 2

gcgaagcttt aagggttaag tggggggtc 29

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游引物2

<400> 3

tctctcgaga tgacgtatcc aaggaggcg 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游引物2

<400> 4

gcgggtacct aagggttaag tggggggtc 29

Claims

1.一种猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于：包括样品吸收区、金标探针区、固相化抗体区、吸水区和支撑板，样品吸收区、金标探针区、固相化抗体区和吸水区铺设在支撑板上并依次相互部分重叠；所述的样品吸收区包被有猪圆环病毒2型Cap蛋白；所述的金标探针区包被有金标探针1和金标探针2，所述的金标探针1为胶体金标记的猪圆环病毒2型单克隆抗体，金标探针2为胶体金标记的兔IgG；所述的固相化抗体区依次有对照线C1、测试线T、对照线C2和对照线C3；所述的对照线C1包被有羊抗兔IgG抗体，所述的检测线T包被有羊抗猪IgG抗体，所述的对照线C2包被有羊抗兔IgG抗体，所述的对照线C3包被有羊抗鼠IgG抗体。

2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于：所述的猪圆环病毒2型单克隆抗体为猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于：所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白的包被量为5～50μg；所述的猪圆环病毒2型单克隆抗体的标记量为每mL胶体金标记5～20μg单抗，兔IgG的标记量为每mL胶体金标记1～10μg兔IgG；所述的对照线C1包被羊抗兔IgG抗体的量为0.05～0.5μg，检测线T包被羊抗猪IgG抗体的量为0.5～5μg，对照线C2包被羊抗兔IgG抗体的量为0.5～5μg；对照线C3包被羊抗鼠IgG抗体的量为1～5μg。

4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于：所述的支撑板的材料为粘有一层聚氯乙烯衬膜的聚乙烯板；所述的样品吸收区的材料为玻璃纤维膜；所述的金标探针区的材料为聚酯膜；所述的固相化抗体区的材料为硝酸纤维素膜；所述的吸水区的材料为吸水滤纸。

5.权利要求1-4任一项所述的猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将胶体金标记的猪圆环病毒2型单克隆抗体和胶体金标记的兔IgG分别喷涂于聚酯膜上；在硝酸纤维素膜上依次包被对照线C1、测试线T、对照线C2和对照线C3；在玻璃纤维膜上包被PCV2-Cap蛋白；将玻璃纤维膜、聚酯膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装到支撑板上得到猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸。

6.根据权利要求5的猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）PCV2-Cap蛋白的制备：

1）利用基因工程技术Bac-to-Bac系统构建表达PCV2-ORF2基因的重组杆状病毒，根据PCV2的基因序列设计Cap特异性引物，其中，

上游引物1：5’-TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG-3’，

下游引物1：5’-GCGAAGCTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3’，

上游引物2：5’-TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG-3’，

下游引物2：5’-GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3’，

2）将重组bacmid转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒rBac-ORF2(2×)；

3）将重组杆状病毒rBac-ORF2(2×)感染Sf9细胞，使其表达Cap蛋白，并自我组装形成病毒样颗粒，通过超速离心和CsCl密度梯度离心，获得纯化的形成病毒样颗粒的Cap蛋白；

（2）猪圆环病毒2型单克隆抗体的制备，包括下述步骤：

1）将前述纯化的猪圆环病毒2型Cap蛋白常规免疫Balb/c小鼠，当小鼠血清ELISA效价达到1:10000以上时，取脾细胞与骨髓瘤细胞以5×10⁷：1×10⁷的比例进行融合；用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞；用ELISA方法和间接免疫荧光方法进行阳性杂交瘤细胞的筛选；将筛选到的阳性杂交瘤细胞经三次有限稀释得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株及猪圆环病毒2型单克隆抗体；

2）将步骤1）制得的猪圆环病毒2型单克隆抗体经硫酸铵沉淀，纯化，制得纯化的猪圆环病毒2型单克隆抗体；

（3）胶体金标记猪圆环病毒2型单克隆抗体的方法：分别取半径为10～40nm浓度为0.01%的胶体金20mL及猪圆环病毒2型单克隆抗体100～400μg，在pH8.5～9.2的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加BSA和PEG20000作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为0.1～5%，PEG20000最终质量浓度为0.01～0.1%，采用离心法除去未结合的猪圆环病毒2型单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金－猪圆环病毒2型单克隆抗体复合物；

（4）胶体金标记兔IgG的方法：分别取半径为10～40nm浓度为0.01%的胶体金20mL及兔IgG 20～200μg，在pH8.5～9.2的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加BSA和PEG20000作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为0.1～5%，PEG20000最终质量浓度为0.01～0.1%，采用离心法除去未结合的兔IgG和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金－兔IgG复合物；

（5）将胶体金标记的猪圆环病毒2型单克隆抗体和胶体金标记的兔IgG分别喷涂于聚酯膜上：用20mL含1%BSA的PBS分别洗涤胶体金－猪圆环病毒2型单克隆抗体复合物和胶体金－兔IgG复合物，离心除去上清液，得到深红色沉淀，纯化后的沉淀用2mL含1%BSA的PBS溶解，用喷涂设备分别涂于聚酯膜上，冻干；

（6）硝酸纤维素膜的包被：在硝酸纤维素膜依次包被对照线C1、测试线T、对照线C2和对照线C3；检测线T包被的是羊抗猪IgG抗体，包被量0.5～5μg，对照线C1包被的是羊抗兔IgG抗体，包被量0.05～0.5μg，对照线C2包被的也是羊抗兔IgG抗体，包被量0.5～5μg，对照线C3包被的是羊抗鼠IgG抗体，包被量1～5μg，每条线宽1～3mm；

（7）玻璃纤维膜的包被：将前述纯化的PCV2-Cap蛋白用适量的PBS溶解后包被在玻璃纤维膜上，包被量为5～50μg；

7.权利要求1-4任一项所述的猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸的使用方法，其特征在于包括如下步骤：将所述试纸的样品吸收区一端浸入待检血清样品中，5～10分钟后判读结果：对照线C1、C2、C3均出现红色，表示试纸有效；对比检测线T和对照线C1、C2的颜色，检测线T颜色较对照线C2颜色深，表明抗体强阳性；检测线T颜色介于对照线C1和C2之间，表明抗体阳性；检测线T颜色较对照线C1颜色浅或无颜色出现，表明血清中没有猪圆环病毒2型抗体或抗体量不足。