KR101814757B1 - 구제역 바이러스의 3ａｂ 비구조단백질 및 이에 특이적인 단일클론항체를 이용한 구제역 바이러스 감염여부를 진단하는 방법 및 이를 구현하기 위한 진단키트 - Google Patents
구제역 바이러스의 3ａｂ 비구조단백질 및 이에 특이적인 단일클론항체를 이용한 구제역 바이러스 감염여부를 진단하는 방법 및 이를 구현하기 위한 진단키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 구제역 바이러스의 3ＡＢ 비구조단백질 및 이에 특이적인 단일클론항체를 이용하여 구제역 바이러스 감염여부를 진단하는 방법 및 이를 구현하기 위한 진단키트에 관한 것이다. 본 발명의 측방 유동 검정방법(lateral flow assay)을 이용한 면역검사법은 신속검사방법(rapid kit)으로서 기존의 효소면역분석법에 비해 신속한 진단이 가능하며 비용이 저렴한 장점이 있다. 따라서 본 발명의 진단방법 및 진단키트는 기존의 구제역 바이러스 감염여부 진단방법을 대체할 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 구제역 바이러스의 3ＡＢ 비구조단백질 및 이에 특이적인 단일클론항체를 이용하여 구제역 바이러스 감염여부를 진단하는 방법 및 이를 구현하기 위한 진단키트에 관한 것이다.
구제역 바이러스(Foot-Mouse Disease Virus, FMDV)는 전염성이 매우 강하여 무리에서 한 마리가 감염되면 나머지 가축 모두에게 급속하게 감염된다. 게다가 치사율이 50%이상에 달하는 가축의 제 1종 바이러스성 법정전염병으로 특별한 치료법은 없고 감염 동물과 접촉한 다른 동물들을 살처분해야 하기 때문에 신속한 진단과 대처가 필요하다. 원인체는 구제역 바이러스로서 8,500 염기쌍으로 구성된 단일가닥의 RNA를 함유하고 있으며 VP1, VP2, VP3, VP4 네 개의 단백질이 60개씩 모여서 바이러스 외피를 구성한다.
우제류 동물들이 구제역 바이러스에 감염되었는지의 여부를 확인하는 구제역 검사에 있어서 확진검사로는 항원검사가 필수적이나 항원검사시료가 없을 경우에는 혈청학적인 검사를 통해서 감염여부를 확인한다.
현재 구제역 검사에 사용되는 혈청학적인 검사를 통한 항체를 검출하는 진단법으로서 국제수역사무국에서는 중화시험법을 표준 진단법으로 권장하고 있으나, 표준 진단법으로 항체를 검출하는데 3일 정도가 소요되고 고도의 생물안전차폐실험실에서 실시해야 하는 등 대량의 시료를 검사하기에는 어려움이 있어서 이를 극복하기 위한 효소면역분석법(ELISA)이 개발되었다. 하지만 기존의 차단-효소면역분석법(blocking ELISA)은 여러 과정이 필요하고 많은 시간이 소요되며 고가의 장비가 필요하기 때문에 간편하고 신속한 진단에는 어려움이 있고, 또한 신속검사방법(rapid kit) 보다 비용이 비싼 단점이 있다. 한편, 측방 유동 검정방법(lateral flow assay)을 이용한 면역검사법은 항원과 항체의 반응 유무를 형광 레이저를 이용하여 검침하는 방법으로서 신속한 진단이 가능하며 효소면역분석법에 비해 비용이 저렴한 장점이 있다.
이에 본 발명에서는 측방 유동 검정방법을 이용한 면역검사법으로 구제역 바이러스 감염여부를 진단하는 방법 및 이를 이용한 진단키트를 개발하고자 하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 구제역 감염여부를 간편하고 신속하게 확인할 수 있는 구제역 바이러스 감염진단방법을 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 구제역 바이러스의 3AB 비구조단백질 및 이에 특이적인 단일클론항체를 이용한 구제역 바이러스 감염진단방법을 개발하였고, 이를 이용한 진단키트를 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 구제역 바이러스 감염진단방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 진단방법을 이용한 진단키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면 본 발명은 구제역 바이러스(FMDV) 감염여부를 판단할 수 있는 진단용 키트를 제공한다.
본 발명자들은 기존의 효소면역분석법(EISA)에 비해 신속, 간편하면서도 정확한 진단 키트를 개발하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 측방 유동 검정방법(lateral flow assay)을 이용한 면역검사법으로 구제역 감염여부를 신속, 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
측방 유동 검정방법(lateral flow assay)을 이용한 면역검사법은 항원과 항체의 반응 유무를 형광 레이저를 이용하여 검침하는 방법으로서 효소면역분석법에 비해 그 절차가 간단하면서도 정확도는 효소면역분석법과 차이가 없어 다양한 분야에서 이를 활용한 진단 키트의 개발이 이루어지고 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “구제역 바이러스의 항원”은 구제역 바이러스의 구조 및 비구조 단백질의 전부 또는 그 일부를 의미한다. 구제역 바이러스의 게놈은 약 8,000개의 핵산 염기로 이루어진 단일 RNA 포지티브 가닥(single RNA positive strand)으로 구성되어 있으며, 초기에 단일폴리펩타이드로 번역된 후, 감염된 세포 내에서 바이러스에 의해 암호화된 프로테아제(viral protease)에 의해 연속적으로 절단되어 4개의 캡시드 단백질(VP1-VP4) 및 비구조 폴리펩타이드(2C, 3A, 3B, 3C 및 3D)를 생성해 낸다.
현재 사용 중인 구제역 예방백신은 바이러스 입자만을 정제하여 사용하고 있어 비구조단백질을 함유하고 있지 않기 때문에 백신을 접종한 동물에서는 구조단백질에 대한 항체만 생기고 비구조단백질에 대한 항체는 생기지 않게 된다. 즉, 구제역 바이러스에 감염된 동물에서는 비구조단백질에 대한 항체가 생기는 반면에, 백신을 접종한 동물에서는 비구조단백질에 대한 항체가 생기지 않게 된다. 따라서, 비구조단백질에 대한 항체의 존재 여부를 검사하면 구제역 바이러스에 감염된 동물, 감염되지 않았으나 백신을 접종한 동물을 구별할 수 있으므로 구제역 바이러스 감염여부를 정확하게 판단할 수 있게 된다. 이러한 점 이외에도, 비구조단백질은 구조단백질에 비해 훨씬 변이가 적어 여러 혈청형에서 동일한 항원 결정기(epitope)를 가지고 있다는 장점이 있다. 이와 같은 장점들을 고려하여, 본 발명에서는 구제역 바이러스의 비구조단백질을 항원으로 이용하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용하는 구제역 바이러스 항원은 서열목록 제1서열로 표시되는 구제역 바이러스의 3AB 비구조단백질이다.
본 명세서에서 사용된 용어, “검출자항원(detector antigen)”은 상기 구제역 바이러스 항원에 시그널을 발생시키는 표지를 결합시킨 것으로서, 검사하고자 하는 시료 내에 구제역 바이러스 항원에 대한 항체가 존재하는지를 검출하기 위한 것이다. 즉, 검사 시료 내에 상기 항원에 대한 항체가 존재한다면 검출자항원과 반응하여 복합체를 형성하게 될 것이고, 존재하지 않는다면 검출자항원과 어떠한 반응도 일으키지 않으므로 검출자항원은 원래 그대로의 형태로 남아있게 될 것이다. 따라서 복합체를 형성한 것과 원래 형태 그대로 남아있는 검출자항원을 구별할 수 있다면 검사 시료내의 구제역 바이러스 항원에 대한 항체 존재여부를 확인할 수 있게 되는 것이다.
진단 키트에서 정상적으로 항원-항체 반응이 일어나는지를 확인하기 위하여 대조군으로서 대조군항원을 검출자항원과 동시에 사용하게 된다. 대조군항원으로 사용되는 항원은 검사하고자 하는 개체의 혈청과 어떠한 복합체도 형성하면 안되므로 검사하고자 하는 개체와는 다른 종에서 분리한 단백질을 사용하여야 한다. 예컨대, 검사하고자 하는 개체가 소 또는 돼지라면 대조군항원은 토끼에서 분리한 단백질을 사용하는 것이 적합하다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 진단 키트의 대조군항원으로 토끼의 면역글로브린 G(rabbit IgG)를 사용하였다.
시그널을 발생시키는 표지로는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민(rhodamine), 리사민(lissamine) 및 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지의 결합은 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 시그널을 발생시키는 표지로서 형광표지를 사용하였고, 구체적으로 형광 입자인 Alexa Fluor 647 Carboxylic acid succinimidyl ester (Invitrogen)를 사용하였다.
본 명세서에서 사용된 용어, “구제역 바이러스의 항원에 특이적으로 결합하는 결합제(binder)”는 본 발명의 진단 키트에 사용된 특정 구제역 바이러스의 항원과 특이적으로 결합하는 물질로서, 구제역 바이러스 감염 개체의 혈청 내 항체와 경쟁반응을 하는 것이어야 한다. “경쟁반응을 한다”는 것은 구제역 바이러스 감염 개체의 혈청 내 항체와 상기 결합제가 특정 구제역 바이러스 항원의 동일한 부위(epitope)를 인식한다는 것으로서, 예컨대 구제역 바이러스 감염 개체의 혈청 내 항체가 검출자항원과 반응하여 복합체를 형성하는 경우, 이 복합체가 더 이상 결합제와는 반응을 하지 않는다는 것을 의미한다. 즉, 진단대상인 개체가 구제역 바이러스에 감염되었을 경우에는 감염 개체의 혈청 내에 이에 대한 항체가 생성되어 검출자항원과 복합체를 형성하므로 결합제에 결합하지 않지만, 감염되지 않았을 경우에는 감염 개체의 혈청 내에 이와 같은 항체가 존재하지 않으므로 검출자항원이 결합제에 결합하게 되는 것이다.
결합제로서는 앱타머(aptamer) 또는 단일클론항체(monoclonal antibody)가 바람직하다. 앱타머는 특정한 타겟 분자에 결합하는 올리고핵산(oligonucleic acid) 또는 펩타이드 분자(peptide molecule)로서, 짧은 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 DNA, RNA 또는 XNA 앱타머 및 짧은 펩타이드 도메인으로 구성된 펩타이드 앱타머가 있다. 단일클론항체는 다중클론항체(polyclonal antibody)와는 다르게, 동일한 면역세포로부터 만들어지기 때문에 동일한 항원결정기(epitope)에 결합하는 특성을 가지고 있다. 따라서 검출자항원에 특이적인 단일클론항체를 결합제로 사용한다면, 검출자항원이 구제역 감염 개체의 혈청 내 항체와 복합체를 형성할 경우 더 이상 결합제인 단일클론항체와 결합할 수 없게 된다. 한편, 구제역에 감염되지 않은 개체의 경우, 혈청 내에 구제역 바이러스의 항원에 대한 항체가 존재하지 않아 검출자항원이 단일클론항체인 결합제에 결합하게 되므로 구제역에 감염된 개체와의 구별이 가능해진다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 구제역바이러스 항원으로서 구제역 바이러스의 3AB 비구조단백질을, 결합제로서 상기 3AB 비구조단백질에 특이적인 단일클론항체를 사용하였다.
본 명세서에서 사용된 용어, “반응부”는 상기 검출자항원과 검사하고자 하는 시료를 반응시킨 반응용액과 상기 결합제가 접촉하여 반응이 일어나는 부분을 의미한다. 즉, 검사하고자 하는 개체가 구제역에 감염되었을 경우, 개체 내의 혈청에 존재하는 구제역 바이러스에 대한 항체가 검출자항원과 복합체를 형성하여 반응부의 결합제에 결합하지 않게 된다. 하지만 감염되지 않았을 경우, 아무런 복합체도 형성하지 못한 검출자항원이 반응부의 결합제에 결합하게 된다.
반응부에는 상기 결합제 이외에도 대조군으로서의 결합제가 포함되어 있다. 대조군으로서의 결합제는 반응부에서 항원-항체 반응이 정상적으로 일어나고 있는지를 확인하기 위한 것으로서, 상기 대조군항원에 특이적으로 결합하는 앱타머 또는 항체를 사용할 수 있다. 검출자항원-항체의 반응에서와는 달리, 어떠한 조건에서든지 항원-항체 반응이 확실하게 일어나는 것이 중요하므로, 단일클론항체보다는 다중클론항체를 사용하는 것이 더 바람직하다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 대조군항원으로 토끼 면역글로블린(rabbit IgG)을 사용하고, 대조군 결합제로 항-토끼 면역글로블린(anti-rabbit IgG)을 사용하였다.
본 명세서에서의“스트립”은 샘플패드, 전개막 및 흡수패드를 중첩되게 하여 검출항원과 검사하고자하는 시료를 미리 반응시킨 반응용액이 샘플패드로부터 전개막, 흡수패드까지 일정한 방향으로 흘러가면서 전개막상의 반응부의 결합제와 반응하도록 하는 형태를 갖는다. 상기 전개막은 나일론, 폴리에스터, 셀룰로오스, 폴리설폰, 폴리비닐리덴디플루오라이드, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리우레탄, 유리섬유, 니트로셀룰로오스로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 물질인 것을 특징으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 전개막으로서 니트로셀룰로오스 멤브레인을 사용하였다.
스트립을 제조하는 방법은 다음과 같다. 우선 반응부에 해당하는 전개막의 가운데 부분에 구제역 바이러스의 항원에 특이적으로 결합하는 결합제와 대조군으로서의 결합제가 일정한 간격을 두고 나란히 위치하도록 고정시킨다. 반응부의 양쪽 끝에는 각각 샘플패드와 흡수패드를 붙인다. 완성된 스트립을 적당한 하우징에 조립하면 진단용 키트가 완성된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 구제역 바이러스 감염 진단방법을 제공한다:
(a) 검출하고자 하는 시료를 구제역 바이러스의 항원을 포함하는 검출자항원(detector antigen)과 접촉시켜 반응시키는 단계로서, 상기 검출자항원에는 시그널을 발생시키는 표지가 결합되어 있다;
(b) 상기 (a)의 반응용액을 상기 구제역 바이러스의 항원에 특이적으로 결합하는 결합제가 고정화된 반응부에 접촉시키는 단계로서, 상기 반응부에는 상기 결합제가 고정된 부분 외에 정상적인 반응여부를 확인하기 위한 대조군으로서의 결합제가 고정된 부분이 포함되어 있다;
(c) 시그널 분석장치를 이용하여 상기 반응부에서 상기 구제역 바이러스의 항원에 특이적으로 결합하는 결합제가 고정된 부분 및 대조군으로서의 결합제가 고정된 부분의 각각의 시그널을 분석하는 단계;
(d) 상기 측정된 시그널 값을 이용하여 구제역 감염여부를 판단하는 단계.
본 발명의 진단방법은 상술한 구제역 바이러스 감염 진단용 키트를 사용하는 과정을 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 진단키트와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서의“시료”는 구제역 바이러스 감염여부를 진단하고자 하는 개체로부터 얻어지는 혈액, 혈장 또는 혈청 시료를 의미한다.
본 명세서에서의“시그널 분석장치”는 상술한 구제역 바이러스 감염 진단용 키트에서 검출자항원에 결합되어 있는 시그널을 분석할 수 있는 장치를 의미하는데, 사용된 표지의 종류에 따라 분석장치가 달라진다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 시그널을 발생시키는 표지로서 형광표지를 사용하였고, 이에 따라 시그널 분석장치로 형광리더기를 사용하였다.
본 명세서에서의“측정된 시그널 값을 이용하여 구제역 바이러스 감염여부를 판단”하는 방법은 다음과 같다. 우선 구제역 바이러스에 감염된 개체와 감염되지 않은 개체를 구별하는 기준이 되는 컷-오프 값을 정해야 한다. 이를 위해 다른 진단 방법을 통해 이미 구제역 바이러스 감염여부가 확인된 일정 수 이상의 시료를 본 발명의 진단 방법을 통해 분석한다. 분석 결과, 감염개체와 감염되지 않은 개체가 구별되는 시그널 값이 컷-오프가 되는데, 이 과정에서 시료의 시그널 값을 보정하기 위해 대조군으로 사용된 시그널 값을 이용한다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 구제역 바이러스의 항원에 특이적으로 결합하는 결합제가 위치한 반응부에서의 시그널 값을 대조군으로 사용한 결합제가 위치한 반응부에서의 시그널 값으로 나눈 다음, 이 값을 이용하여 컷-오프를 정하였다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 구제역 바이러스의 3AB 비구조단백질 및 이에 특이적인 단일클론항체를 이용한 구제역 감염진단방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 진단방법은 측방 유동 검정방법을 이용한 면역분석법을 사용한다.
(c) 본 발명은 상기 진단방법을 이용한 진단키트를 제공한다.
도 1은 구제역 바이러스 감염 진단키트의 작동 원리에 대한 개요를 나타낸 도면이다.
도 2는 구제역 바이러스의 항원으로 사용된 구제역 바이러스의 3AB 비구조단백질을 대장균에서 재조합단백질로 생산한 후, 정제하여 SDS-PAGE로 분석한 것을 나타낸 도면이다.
도 3은 구제역 바이러스 감염 진단용 키트의 스트립 구조를 나타낸 도면이다.
도 4는 진단 키트에서 소 검체의 구제역 바이러스 감염여부를 판단하기 위한 컷-오프를 정하기 위하여 232개의 시료를 분석한 결과를 정리한 도표이다.
도 5는 진단 키트에서 돼지 검체의 구제역 바이러스 감염여부를 판단하기 위한 컷-오프를 정하기 위하여 117개의 시료를 분석한 결과를 정리한 도표이다.
도 2는 구제역 바이러스의 항원으로 사용된 구제역 바이러스의 3AB 비구조단백질을 대장균에서 재조합단백질로 생산한 후, 정제하여 SDS-PAGE로 분석한 것을 나타낸 도면이다.
도 3은 구제역 바이러스 감염 진단용 키트의 스트립 구조를 나타낸 도면이다.
도 4는 진단 키트에서 소 검체의 구제역 바이러스 감염여부를 판단하기 위한 컷-오프를 정하기 위하여 232개의 시료를 분석한 결과를 정리한 도표이다.
도 5는 진단 키트에서 돼지 검체의 구제역 바이러스 감염여부를 판단하기 위한 컷-오프를 정하기 위하여 117개의 시료를 분석한 결과를 정리한 도표이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
구제역 바이러스의 3AB 재조합 단백질 제조
구제역 바이러스(FMDV)의 3AB 비구조단백질의 재조합 단백질(r3AB)을 만들기 위해, FMDV 3AB 유전자를 PCR 클로닝하여 pBAD/D-topo 벡터(Invitrogen)에 삽입한 후, 대장균에서 생산하였다. PCR 반응을 위한 프라이머는 다음과 같다:
정방향(5`-CAC CAT CTC AAT TCC TTC CCA AAA GGC-3`)
역방향 (5`-CTC AGT GAC AAT CAA ATT CTT AGC-3`)
FMDV r3AB 단백질은 비용해성 단백질 및 용해성 단백질(soluble protein)로 발현되므로 HiTrap chelating HP 컬럼(제조사 GE healthcare) 5 ml을 사용하여 용해성 단백질을 정제하였다. 정제결과, 49 KDa의 용해성 단백질을 획득할 수 있었다.
단일항체의 제조
상기 방법대로 제조한 재조합 단백질(r3AB)을 이용하여 단일클론항체(monoclonoal antibody)를 만들기 위해 마우스에 면역반응을 진행하였다. 항원인 FMDV r3AB의 농도는 0.5 ㎎/㎖로 하였으며 200 ㎕의 FMDV r3AB와 200 ㎕의 보조제(Freund's Adjuvant, FA)를 혼합하여 Balb/C 마우스 복강에 2주 간격으로 3차례 주사하였다. 3차 면역 1주후에 FMDV r3AB 100 ㎕를 마지막으로 복강에 주사하였으며, 4일 후 세포융합에 사용하였다.
세포융합을 위한 세포주로 SP2/0 Ag14(ATCC, USA)를 사용하였다. D-MEM / HAT & HT(제조사 GIBCO) 배지에서 배양하였고, 융합 방법으로 지라 세포(spleen cell)를 이용한 PEG 방법을 사용하였다. 2차례 스크린을 통해 목적항원인 FMDV r3AB (0.5 ug/㎖)에는 반응하고, 대조항원인 정상 세포 용해물(normal cell lysate)에는 반응하지 않는 클론을 선별하였다. 단일항체 아이소타이핑 시약(isotyping reagent, Sigma)을 이용하여 IgM 클래스를 제외한 IgG 클래스만을 선별하였다. 이와 같은 방법으로 3가지 단일클론항체가 선별되었다. 선별된 항체 중 최적 반응성을 가진 항체를 선택하기 위해 FMDV 비구조단백질에 대한 차단 면역효소분석 키트(메디안디노스틱)를 사용하여 반응성 테스트를 수행하였다. 수행결과를 표 1에 정리하였다.
| 포획 | 검출 | 샘플 | 결과 | |
| 3AB | 항-FMDV NSP 항체 | 7F22 | 10 μg/㎖ | 0.050 |
| 5 μg/㎖ | 0.110 | |||
| 5B27 | 10 μg/㎖ | 0.081 | ||
| 5 μg/㎖ | 0.127 | |||
| 4G24 | 10 μg/㎖ | 0.286 | ||
| 5 μg/㎖ | 0.298 | |||
항체의 반응성이 높을수록 차단 효과가 뛰어나서 결과 수치가 낮게 나오게 되는데, 테스트 결과 7F22의 반응성이 가장 뛰어난 것으로 판단되었다.
바이오 프로브 제조
바이오 프로브의 원료로 0.45 ㎎/㎖ 3AB 및 1 ㎎/㎖ 토끼 IgG (Arista)를 각각 200 ㎕ 준비하였다. 형광 입자로 Alexa Fluor 647 카르복시산 숙시니미딜 에스터(Carboxylic acid succinimidyl ester((Invitrogen) 1 ㎎을 DMSO(Sigma) 100 ㎕에 녹였다. 바이오 프로브 원료용액에 각각 1 M 카보네이트 버퍼(carbonate buffer pH 9.0)를 20 ㎕ 넣은 다음, 형광입자 용액 4 ㎕를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 회전시키면서 반응시켰다. 복합체를 이룬 것을 분리하기 위해 sephadex G-25 레진(Amersham biosciences) 3 ml이 팩킹(packing)된 미니 컬럼을 이용하여 정제과정을 수행하였다. 각 용리된 분획물(elution fraction)을 100 ㎕씩 수집하고 단백질을 정량하여 단백질이 100 μg/㎖ 이상 되는 분획물만을 모았다. 적당량씩 분주하여 20℃에서 보관하며 사용하였다.
진단키트의 제조
스트립은(strip)은 샘플패드(Ahlstrom), 멤브레인(Millipore), 흡수패드(Ahlstrom)를 중첩되게 하여 샘플이 일정한 방향으로 흘러가면서 포획 항체와 반응하도록 하는 형태로 만들었다.
제조 순서에 따른 진단 키드 제조 방법은 다음과 같다.
1) 항체 준비
항-토끼 IgG(anti-rabit IgG, Arista) 1 ㎎/㎖ 및 FMDV mAb 7F22 0.5 ㎎/㎖l에 각각 0.5% 수크로스(sucrose, Sigma) 및 0.1% NaN3 (Sigma)를 첨가하였다.
2) 항체 분주 및 고정
백킹 카드(backing card, PJ상사)에 멤브레인을 붙이고 컨트롤 라인에는 항-토끼 IgG를, 테스트 라인에는 7F22를 베드 속도 10 cm/sec, 분주 볼륨 0.9 ㎕/cm로 분주하였다. 이어서 제습 캐비닛에서 24시간 이상 건조하여 항체를 멤브레인에 고정시켰다.
3) 패드 부착 및 절단
항체가 고정이 되면 샘플패드와 흡수패드를 각각 정해진 위치에 붙인 다음, 회전식 절단기(rotary slitter)를 이용하여 4 ㎜ 간격으로 절단하였다.
4) 조립 및 포장
완성된 스트립을 하우징에 조립하고 알루미늄 파우치에 실리카겔과 밀봉하여 포장하였다.
검출시약 제조
바이오 프로브의 안정성을 돕기 위해 PBS 버퍼에 2% 무지방 우유(Difco), 0.4% Tween-20(Sigma), 0.01% NaN3를 넣어준 다음, 각각 항-토끼 IgG 바이오 프로브는 60 ng/㎖, r3AB 바이오 프로브는 300 ng/㎖이 되도록 첨가하였다.
진단키트 사용 방법
진단 키트의 사용방법은 다음과 같다.
(1) 검출시약 40 ㎕에 검사하고자 하는 샘플을 40 ㎕ 넣은 다음 잘 섞어주고 상온에서 2분 동안 반응시킨다.
(2) 진단 키트를 꺼내 평평한 곳에 놓은 다음. 검체 주입구에 (1)의 반응용액 70 ㎕를 넣는다.
(3) 상온에서 12분 동안 로딩(loading)시킨 다음, 형광 리더기를 이용하여 형광값을 측정한다.
(4) 테스트 라인(Test line) 형광값/컨트롤 라인(Control line) 형광값의 비율(T/C)을 구한다.
(5) (4)에서 구한 T/C 값이 컷-오프 값이 초과이면 음성, 컷-오프 값 이하이면 양성으로 판정한다.
컷-오프 값의 설정
돼지혈청검체 총 117건을 VDPro FMDV NSP Ab ELISA((주)메디안디노스틱)로 검사시 NSP 항체 양성으로 판독되는 양성검체 49건과 NSP 항체 음성으로 판독되는 음성검체 68건을 개발된 FMDV NSP Ab 형광 POCT 의 사용법에 따라 검사하여 양성은 양성으로 음성은 음성으로 판독되는지를 확인하였으며 그 결과를 표와 함께 TG-ROC 커브 작성을 통해 최적의 민감도와 특이도를 보이는 T/C 비율 컷-오프를 설정하였다.
| S/P 비율 | 양성검체수 | 음성검체수 | 특이도 | 민감도 |
| 0.0-0.1 | 3 | - | 100 | 5.56 |
| 0.10.2 | 9 | - | 100 | 22.22 |
| 0.2-0.3 | 4 | - | 100 | 29.63 |
| 0.3-0.4 | 5 | - | 100 | 38.89 |
| 0.4-0.5 | 3 | 1 | 99.44 | 44.44 |
| 0.5-0.6 | 4 | - | 99.44 | 51.85 |
| 0.6-0.7 | 4 | - | 99.44 | 59.26 |
| 0.7-0.8 | 1 | - | 99.44 | 61.11 |
| 0.8-0.9 | 2 | - | 99.44 | 64.81 |
| 0.9-1.0 | 2 | - | 99.44 | 68.52 |
| 1.0-1.1 | 2 | - | 99.44 | 72.22 |
| 1.1-1.2 | 3 | - | 99.44 | 77.78 |
| 1.2-1.3 | 1 | - | 99.44 | 79.63 |
| 1.3-1.4 | 2 | 1 | 98.88 | 83.33 |
| 1.4-1.5 | 2 | - | 98.88 | 87.04 |
| 1.5-1.6 | 1 | 1 | 98.31 | 88.89 |
| 1.6-1.7 | - | - | 98.31 | 88.89 |
| 1.7-1.8 | 3 | - | 98.31 | 94.44 |
| 1.8-1.9 | 3 | 1 | 97.75 | 100 |
| 1.9-2.0 | - | 1 | 97.19 | 100 |
| 2.0-2.1 | - | 1 | 96.63 | 100 |
| 2.1-2.2 | - | 2 | 95.51 | 100 |
| 2.2-2.3 | - | 5 | 92.7 | 100 |
| 2.3-2.4 | - | 3 | 91.01 | 100 |
| 2.4-2.5 | - | 6 | 87.64 | 100 |
| 2.5-2.6 | - | 18 | 77.53 | 100 |
| 2.6-2.7 | - | 22 | 65.17 | 100 |
| 2.7-2.8 | - | 20 | 53.93 | 100 |
| 2.8-2.9 | - | 23 | 41.01 | 100 |
| 2.9-3.0 | - | 11 | 34.83 | 100 |
| 3.0-3.1 | - | 19 | 24.16 | 100 |
| 3.1-3.2 | - | 9 | 19.1 | 100 |
| 3.2-3.3 | - | 14 | 11.24 | 100 |
| 3.3-3.4 | - | 11 | 5.06 | 100 |
| 3.4-3.5 | - | 6 | 1.69 | 100 |
| 3.5-3.6 | - | 1 | 1.12 | 100 |
| 3.6-3.7 | - | - | 1.12 | 100 |
| 3.7-3.8 | - | 1 | 0.56 | 100 |
| 3.8-3.9 | - | - | 0.56 | 100 |
| 3.9-4.0 | - | 1 | 0 | 100 |
| 합계 | 54 | 178 | - | - |
| S/P 비율 | 양성검체수 | 음성검체수 | 특이도 | 민감도 |
| 0.0-0.1 | - | - | 100 | 0 |
| 0.10.2 | 3 | - | 100 | 6.12 |
| 0.2-0.3 | 5 | - | 100 | 16.33 |
| 0.3-0.4 | 4 | - | 100 | 24.49 |
| 0.4-0.5 | 4 | - | 100 | 32.65 |
| 0.5-0.6 | 5 | - | 100 | 42.86 |
| 0.6-0.7 | 6 | - | 100 | 55.1 |
| 0.7-0.8 | 2 | 1 | 98.53 | 59.18 |
| 0.8-0.9 | 1 | - | 98.53 | 61.22 |
| 0.9-1.0 | 3 | - | 98.53 | 67.35 |
| 1.0-1.1 | 2 | - | 98.53 | 71.43 |
| 1.1-1.2 | - | - | 98.53 | 71.43 |
| 1.2-1.3 | 2 | - | 98.53 | 75.51 |
| 1.3-1.4 | 2 | - | 98.53 | 79.59 |
| 1.4-1.5 | 2 | - | 98.53 | 83.67 |
| 1.5-1.6 | - | - | 98.53 | 83.67 |
| 1.6-1.7 | - | - | 98.53 | 83.67 |
| 1.7-1.8 | - | - | 98.53 | 83.67 |
| 1.8-1.9 | - | - | 98.53 | 83.67 |
| 1.9-2.0 | - | - | 98.53 | 83.67 |
| 2.0-2.1 | - | - | 98.53 | 83.67 |
| 2.1-2.2 | 1 | - | 98.53 | 85.71 |
| 2.2-2.3 | 2 | - | 98.53 | 89.8 |
| 2.3-2.4 | 3 | - | 98.53 | 95.92 |
| 2.4-2.5 | 1 | - | 98.53 | 97.96 |
| 2.5-2.6 | 1 | - | 98.53 | 100 |
| 2.6-2.7 | - | 1 | 97.06 | 100 |
| 2.7-2.8 | - | 4 | 91.18 | 100 |
| 2.8-2.9 | - | 2 | 88.24 | 100 |
| 2.9-3.0 | - | 9 | 75 | 100 |
| 3.0-3.1 | - | 5 | 67.65 | 100 |
| 3.1-3.2 | - | 11 | 51.47 | 100 |
| 3.2-3.3 | - | 10 | 36.76 | 100 |
| 3.3-3.4 | - | 11 | 20.59 | 100 |
| 3.4-3.5 | - | 3 | 16.18 | 100 |
| 3.5-3.6 | - | 3 | 11.76 | 100 |
| 3.6-3.7 | - | 4 | 5.88 | 100 |
| 3.7-3.8 | - | 3 | 1.47 | 100 |
| 3.8-3.9 | - | 1 | 0 | 100 |
| 합계 | 49 | 68 | - | - |
스트립간 재현성 테스트
FMDV NSP 단일클론 항체를 10 μg/ml부터 2진희석하여 제조한 교정기(calibrator)를 이용하여 POCT 용법대로 한 검체당 5회씩 반복 테스트하여 CV% 값을 구하였다. POCT 용법은 검체와 콘쥬게이트 버퍼를 1:1 비율로 섞어서 2분 동안 반응시키고 스트립에 로딩하여 12분간 전개시킨 후 리더를 이용하여 형광값을 측정하였다.
| #1 | #2 | #3 | #4 | #5 | 평균 T/C | STDEV | CV% | |
| cal.1 | 0.12 | 0.07 | 0.08 | 0.13 | 0.09 | 0.1 | 0.02 | 25.43 |
| cal.2 | 0.23 | 0.14 | 0.16 | 0.24 | 0.15 | 0.18 | 0.05 | 25.74 |
| cal.3 | 0.51 | 0.43 | 0.37 | 0.42 | 0.37 | 0.42 | 0.06 | 14.06 |
| cal.4 | 1.05 | 0.92 | 0.98 | 1.02 | 0.91 | 0.98 | 0.06 | 6.24 |
| cal.5 | 1.86 | 1.83 | 1.75 | 1.92 | 1.77 | 1.83 | 0.07 | 3.8 |
| cal.6 | 2.45 | 2.68 | 2.61 | 2.36 | 2.62 | 2.54 | 0.13 | 5.23 |
| cal.7 | 3.19 | 3.2 | 2.94 | 2.94 | 3.01 | 3.06 | 0.13 | 4.29 |
| cal.8 | 3.99 | 3.55 | 3.6 | 3.3 | 3.71 | 3.63 | 0.25 | 6.94 |
형광 POCT(Point of care testing) 컷-오프 구간인 cal.5~6에서 CV%가 5% 내외로 나타났다.
기존 진단방법과의 비교 분석
기존 검사법과 비교하기 위하여, 기존 차단효소면역분석방법(blocking ELISA)과 본 발명의 진단 키트를 검출 한계와 민감도 및 특이도 측면에서 비교하였다.
1. 검출 한계 비교
FMDV NSP 단일클론 항체를 10 μg/ml부터 2진희석하여 제조한 교정기를 이용하여 POCT 용법대로 테스트하였다. POCT 용법은 검체와 콘쥬게이트 버퍼를 1:1 비율로 섞어서 2분 동안 반응시키고 스트립에 로딩하여 12분간 전개시킨 후 리더를 이용하여 형광값을 측정하였다.
위에서 설정된 컷-오프 값을 기준으로 ELISA 결과와 비교하여 양성을 더 민감하게 검출하는 것을 확인하였고 스파이킹(spiking)한 단일클론 항체의 농도를 이용하여 검출한계 농도를 확인하였다. 비교 결과를 표 5에 정리하였다.
| - | 검사법 | 형광 POCT | 블로킹 ELISA | ||
| T/C 비율 | P/N | S/N 비율 | P/N | ||
| 항체 농도 (μg/㎖) |
10 | 0.10 | P | 0.08 | P |
| 5 | 0.18 | P | 0.16 | P | |
| 2.5 | 0.42 | P | 0.53 | P | |
| 1.25 | 0.98 | P | 0.70 | N | |
| 0.63 | 1.83 | P | 0.89 | N | |
| 0.31 | 2.54 | N | 0.92 | N | |
| 0.16 | 3.06 | N | 0.96 | N | |
| 0 | 3.63 | N | 0.94 | N | |
형광 POCT가 차단효소면역분석법보다 4배(소 검체 1.9 cut) 내지 8배(돼지 검체 2.6 cut) 정도 검출한계가 높은 것으로 나타났다.
2. 민감도 및 특이도 비교
기존 검사법과의 항체검출 효율을 비교하기 위하여, 소검체 및 돼지검체를 이용하여 민감도 및 특이도를 분석하였다.
소검체의 경우, 기존 차단효소면역분석방법(blocking ELISA)에 의할 때 양성으로 판정된 57개의 혈청과 음성으로 판정된 175개의 혈청을 상기 방법에 따라 제작된 키트를 이용하여 검사하였다(표 6). 그 결과, 민감성은 100%였으며 특이성은 99.4%로 확인되어 기존 검사법과의 일치율이 매우 높게 나타났다.
| - | 형광 POCT(1.9 컷-오프) | 합 | ||
| 양성 | 음성 | |||
| ELISA | 양성 | 57 | 0 | 57 |
| 음성 | 1 | 174 | 175 | |
| 합 | 58 | 174 | 232 | |
| 민감도 (양성/(양성+위음성) |
100% | |||
| 특이도 음성/(음성+위양성) |
99.4% | |||
돼지검체의 경우, 기존 차단효소면역분석방법(blocking ELISA)에 의할 때 양성으로 판정된 57개의 혈청과 음성으로 판정된 175개의 혈청을 상기 방법에 따라 제작된 키트를 이용하여 검사하였다(표 7). 그 결과, 민감성은 100%였으며 특이성은 99.4%로 확인되어 기존 검사법과의 일치율이 매우 높게 나타났다.
| - | 형광 POCT(1.9 컷-오프) | 합 | ||
| 양성 | 음성 | |||
| ELISA | 양성 | 50 | 0 | 50 |
| 음성 | 0 | 67 | 67 | |
| 합 | 50 | 67 | 117 | |
| 민감도 (양성/(양성+위음성) |
100% | |||
| 특이도 음성/(음성+위양성) |
100% | |||
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> MEDIAN Diagnostics Inc.
<120> Diagnosis Method for Foot-Mouse Disease Virus using Non
Structural Proteins 3AB of FMD-Virus and its Specific Monoclonal
Antibodies, and Diagnostic Kit using the method
<130> PN140130
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 224
<212> PRT
<213> FMDV O MANISA 3AB Amino Acid
<400> 1
Ile Ser Ile Pro Ser Gln Lys Ser Val Leu Tyr Phe Leu Ile Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gln His Glu Ala Ala Ile Glu Phe Phe Glu Gly Met Val His Asp
20 25 30
Ser Ile Lys Glu Glu Leu Arg Pro Leu Ile Gln Gln Thr Ser Phe Val
35 40 45
Lys Arg Ala Phe Lys Arg Leu Lys Glu Asn Phe Glu Thr Val Ala Leu
50 55 60
Cys Leu Thr Leu Leu Ala Asn Ile Val Ile Met Ile Arg Glu Thr Arg
65 70 75 80
Lys Arg Gln Gln Met Val Asp Asp Ala Val Asn Asp Tyr Ile Glu Lys
85 90 95
Ala Asn Ile Thr Thr Asp Asp Lys Thr Leu Asp Glu Ala Glu Lys Asn
100 105 110
Pro Leu Glu Thr Ser Gly Ala Ser Thr Ile Gly Phe Arg Glu Arg Thr
115 120 125
Leu Pro Gly His Lys Ala Ser Asp Asp Val Ser Thr Glu Pro Ala Lys
130 135 140
Pro Val Glu Asp Arg Pro Gln Ala Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu
145 150 155 160
Glu Arg Gln Lys Pro Leu Arg Val Lys Thr Lys Leu Pro Gln Gln Glu
165 170 175
Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Met Asp Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Arg
180 185 190
Ala Arg Ala Pro Val Val Lys Glu Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys
195 200 205
Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Lys Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu
210 215 220
<210> 2
<211> 672
<212> DNA
<213> FMDV O MANISA 3AB DNA
<400> 2
atatcaattc cttcccaaaa gtctgtgttg tacttcctca ttgagaaagg ccaacacgaa 60
gcagcaattg aattctttga gggaatggtg catgactcca tcaaggaaga gctccggccc 120
ctcatccaac agacctcatt tgtgaaacgc gcttttaagc gcctgaagga aaactttgag 180
actgttgccc tgtgtttgac tcttttggca aacatagtga tcatgatccg cgagactcgc 240
aagagacaac agatggtgga cgatgcagtg aatgactaca ttgagaaggc aaacatcacc 300
acagatgaca agactcttga cgaggcggaa aagaaccctc tagagaccag cggtgccagc 360
actattggtt tcagagagag aactctcccg gggcacaagg cgagcgatga cgtgagcacc 420
gagcccgcca aacccgtgga ggaccgacca caagctgaag ggccctacgc cggaccactt 480
gagcgtcaga aacctctgag agtgaaaacc aagttgccac aacaggaggg accctacgct 540
ggcccgatgg atagacagaa accgttgaaa gtgagagcaa gagccccggt cgtgaaggag 600
ggaccctacg agggaccggt gaagaagcct gtcgctttga aagtgaaagc caagaacttg 660
attgtcactg ag 672
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> r3AB Forward primer
<400> 3
caccatctca attccttccc aaaaggc 27
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> r3AB Reverse primer
<400> 4
ctcagtgaca atcaaattct tagc 24
Claims (11)
- 다음을 포함하는 구제역 바이러스(FMDV) 감염 진단용 측방 유동 검정방법 키트:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 구제역 바이러스의 3AB 비구조단백질을 항원으로 포함하는 시그널을 발생시키는 형광표지가 결합된 검출자항원(detector antigen); 및
(b) 상기 구제역 바이러스의 항원에 특이적으로 결합하는 결합제(binder)가 고정화된 반응부를 포함하는 스트립.
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 결합제는 구제역 바이러스의 3AB 비구조단백질에 특이적이며, 구제역 바이러스 감염 개체의 혈청 내 항체와 경쟁반응을 하는 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 진단용 측방 유동 검정방법 키트.
- 제 1 항에 있어서, 상기 스트립은 샘플패드, 상기 샘플패드의 일단부와 접촉하여 검체를 모세관 이동시키는 전개막 및 상기 전개막의 일단부에 접촉하는 흡수패드가 순차 연결된 구조를 포함하며, 상기 반응부는 상기 샘플패드와 흡수패드 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 진단용 측방 유동 검정방법 키트.
- 다음 단계를 포함하는 구제역 바이러스(FMDV) 감염 진단 측방 유동 검정방법:
(a) 검출하고자 하는 시료를 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 구제역 바이러스의 3AB 비구조단백질을 항원으로 포함하는 시그널을 발생시키는 형광표지가 결합된 검출자항원(detector antigen)과 접촉시켜 반응시키는 단계;
(b) 상기 (a)의 반응용액을 상기 구제역 바이러스의 항원에 특이적으로 결합하는 결합제가 고정화된 반응부에 접촉시키는 단계로서, 상기 반응부에는 상기 결합제가 고정된 부분 외에 정상적인 반응여부를 확인하기 위한 대조군으로서의 결합제가 고정된 부분이 포함되어 있다;
(c) 시그널 분석장치를 이용하여 상기 반응부에서 상기 구제역 바이러스의 항원에 특이적으로 결합하는 결합제가 고정된 부분 및 대조군으로서의 결합제가 고정된 부분의 각각의 시그널을 분석하는 단계; 및
(d) 상기 측정된 시그널 값을 이용하여 구제역 바이러스 감염여부를 판단하는 단계.
- 삭제
- 삭제
- 제 6 항에 있어서, 상기 구제역 바이러스의 항원에 특이적으로 결합하는 결합제는 구제역 바이러스의 3AB 비구조단백질에 특이적이며, 구제역 바이러스 감염 개체의 혈청 내 항체와 경쟁반응을 하는 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 측방 유동 검정 진단 방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 정상적인 반응여부를 확인하기 위한 대조군으로서의 결합제는 항-토끼 면역글로불린 G(anti-rabbit IgG)인 것을 특징으로 하는 측방 유동 검정 진단 방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 시그널 분석장치는 형광리더기인 것을 특징으로 하는 측방 유동 검정 진단 방법.
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