KR102653196B1 - 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3b에 특이적으로 결합하는 ｖｈｈ 단일도메인 항체 - Google Patents
구제역 바이러스의 비구조 단백질 3b에 특이적으로 결합하는 ｖｈｈ 단일도메인 항체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 구제역 바이러스에 특이적으로 결합하는 VHH 단일도메인 항체에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3B에 특이적으로 결합하는 VHH 단일도메인 항체를 이용하여, 구제역 바이러스의 존재 및 농도를 신속하게 확인할 수 있는 구체적 바이러스의 검출방법에 대한 것이다.
Description
본 발명은 구제역 바이러스에 특이적으로 결합하는 VHH 단일도메인 항체에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3B에 특이적으로 결합하는 VHH 단일도메인 항체를 이용하여, 구제역 바이러스의 존재 및 농도를 신속하게 확인할 수 있는 구체적 바이러스의 검출방법에 대한 것이다.
구제역은 피코르나바이러스과 아프타바이러스속의 구제역 바이러스에 의한 감염병으로, 주로 소, 돼지 등에 발병한다. 구제역은 전염성이 매우 높아 한번 발생하면, 축산업 분야에서 경제적 손실이 매우 큰 국가재난 질병이다. 이에 구제역 바이러스 감염여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 구제역 진단 기술이 개발되고 있으며, 일 예로 하기의 특허문헌 기재된 바와 같이 구제역 바이러스의 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 바이오리셉터로 사용하는 현장진단기술을 들 수 있다.
<특허문헌>
특허 제10-2191896호(2020. 12. 10. 등록) "구제역 바이러스 혈청형 O 진천주의 구조단백질에 대한 항체 탐지용 단일클론항체 및 이의 용도"
하지만, 현재 사용되는 대부분의 구제역 진단용 항체는 구제역 바이러스의 구조 단백질을 목적 항원으로 하는데, 대한민국과 같은 구제역백신 접종국가에서는 비감염개체에서 위양성이 나오므로, 구조단백질 기반의 구제역 진단이 불가능한 문제가 있다.
따라서, 구제역 감염 시 감염개체 내에서 생산되는 비구조단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여, 백신접종 국가에서도 신속하고 정확한 구제역 감염의 현장진단이 가능한 기술의 필요성이 증대되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로,
본 발명은 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3B에 특이적으로 결합하는 VHH 단일도메인 항체를 이용하여, 구제역 바이러스 감염 여부를 신속하고 간단하게 판별할 수 있는 현장진단 소자의 바이오리셉터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발병은 앞서 본 목적을 달성하기 위하여 다음과 같은 구성을 가진 실시예에 의해 구현된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 VHH 단일도메인 항체는 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3B에 특이적으로 결합하며, 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 VHH 단일도메인 항체는 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 VHH 단일도메인 항체에 있어서 상기 검출가능한 표지는 광학적 표지, 전기화학적 표지, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합인 것인 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 구제역 바이러스 검출용 조성물은 제1항의 VHH 단일도메인 항체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 구제역 바이러스 검출용 센서는 제1항의 VHH 단일도메인 항체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 구제역 바이러스 검출용 키트는 제1항의 VHH 단일도메인 항체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 구제역 바이러스 검출용 키트는 VHH 단일도메인 항체가 칩상에 고정화된 칩 형태 또는 기판상에 고정화된 마이크로 어레이 형태인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 구제역 바이러스 검출 방법은 청구항 제1항의 VHH 단일도메인 항체와 시료를 접촉시키는 접촉단계와; 상기 접촉 단계에서 형성된 구제역 바이러스-VHH 단일도메인 항체 복합체로부터 신호를 측정하는 신호측정단계와; 상기 신호측정단계에서 측정된 신호를 분석하여 시료 중 구제역 바이러스의 존재 또는 농도를 확인하는 확인단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 구제역 바이러스 검출 방법은 상기 시료와 VHH 단일도메인 항체를 포함하는 반응물로부터 구제역 바이러스-VHH 단일도메인 항체 복합체를 분리하는 분리단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 앞서 본 실시예에 의해 다음과 같은 효과를 얻을 수 있다.
본 발명은 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3B에 특이적으로 결합하는 VHH 단일도메인 항체를 이용하여, 구제역 바이러스 감염 여부를 신속하고 간단하게 판별할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 구제역 바이러스의 비구조단백질 3B에 특이적으로 결합하는 VHH 단일 도메인 항체와 항원간의 결합력을 APC 형광 신호로 나타낸 도면.
도 2는 구제역 바이러스의 비구조단백질 3B에 특이적으로 결합하는 VHH 단일 도메인 항체와 항원의 결합에 따른 형광세기 변화를 항원 농도에 따라 나타낸 도면.
도 3은 항원 농도에 따른 결합신호를 바탕으로 구한 VHH 단일도메인 항체의 결합친화도 상수(KD)값을 나타낸 도면.
도 4는 VHH 단일 도메인 항체와 목적/비목적 항원인 단백질인 구제역 바이러스 비구조 단백질 3ABC, 3A, 3B, 2C의 결합력을 항원에 표지된 APC 형광강도를 이용하여 나타낸 도면.
도 2는 구제역 바이러스의 비구조단백질 3B에 특이적으로 결합하는 VHH 단일 도메인 항체와 항원의 결합에 따른 형광세기 변화를 항원 농도에 따라 나타낸 도면.
도 3은 항원 농도에 따른 결합신호를 바탕으로 구한 VHH 단일도메인 항체의 결합친화도 상수(KD)값을 나타낸 도면.
도 4는 VHH 단일 도메인 항체와 목적/비목적 항원인 단백질인 구제역 바이러스 비구조 단백질 3ABC, 3A, 3B, 2C의 결합력을 항원에 표지된 APC 형광강도를 이용하여 나타낸 도면.
이하에서는 본 발명에 따른 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3B에 특이적으로 결합하는 VHH 단일도메인 항체를 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 특별한 정의가 없는 한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 정의에 따른다. 또한, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대해 상세한 설명은 생략한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예는 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3B에 특이적으로 결합하는 VHH 단일도메인 항체를 제공한다. 상기 VHH 단일도메인 항체는 낙타과 동물인 라마에서 유래한 항체 단백질로 라마 면역글로불린에서 가변 중쇄 도메인(VHH)만을 분리해낸 것으로, VHH 단일도메인 항체는 다른 면역글로불린에 비해 크기(12~15kDa)가 작아 나노바디라고도 불리우며, 성상적 안정성 및 항원과의 반응성이 높고, 진단 장비와 결합하였을 때 정확성과 민감도를 높일 수 있는 바이오리셉터로 이용될 수 있다. 이러한 VHH 단일도메인 항체는 대장균 등 미생물을 숙주로 발현하는 것이 용이하여 저비용으로 대량생산하는 것이 가능하고, 유전자 조작 기술을 바탕으로 쉽게 개량하는 것이 가능하여 성능 개선이나 변이 발생에 따른 개량이 용이한 장점이 있다. 본 발명에서는 VHH 단일도메인 항체 라이브러리를 효모의 표면에 디스플레이하고, 구제역 바이러스의 비구조단백질 3B와 항원-항체 반응을 시켜 구제역 바이러스의 비구조단백질 3B에 특이적으로 결합하는 VHH 단일도메인 항체를 선별하고, 이를 바탕으로 제작된 합성 VHH 단일도메인 항체 라이브러리로부터 결합력이 개선된, 구제역 바이러스의 비구조단백질 3B에 특이적으로 결합하는 VHH 단일도메인 항체를 제공하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 구제역 감염 시 감염개체 내에서 생산되는 비구조단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하므로, 백신접종 국가에서도 신속하고 정확한 구제역 감염의 현장진단이 가능하며, 비구조단백질은 구조단백질에 비해 훨씬 변이가 적어 여러 혈청형에서 동일한 항원결정기를 가지고 있기 때문에, 구제역 바이러스의 진단의 정확성을 높일 수 있다.
상기 VHH 단일도메인 항체는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지며, 또한 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 예를 들면, 상기 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열 중 임의의 아미노산이 치환, 삽입, 결실, 부가 또는 이들의 조합을 가질 수 있다.
상기 VHH 단일도메인 항체는 검출가능한 표지가 부착되어 있을 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 당업계에 알려진 검출 방법에 의하여 검출될 수 있는 모이어티일 수 있다. 예를 들면, 상기 검출가능한 표지는 광학적 표지, 전기화학적 표지, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 광학적 표지는 예를 들면, 형광물질일 수 있다. 상기 형광물질은 APC(Allophycocyanin), 플로로세인(fluorescein), 6-FAM, 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민, 카르복시로다민, 카르복시로타민6G, 카르복시로돌, 카르복시로다민110, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이트 옐로우(Cascade Yellow), 코마린, Cy2(cyanine 2), Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE(6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신), NED, ROX(5-(및-6)-카르복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 알렉사 플로어, 7-아미노-4-메틸코마린-3-아세트산, 보디피(BODIPY) FL, 보디피 FL-Br 2, 보디피 530/550, 이의 콘쥬게이트화물 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 형광물질은 APC(allophycocyanin), 플로레세인, Cy3 또는 Cy5일 수 있다.
상기 광학적 표지는 효소일 수 있으며, 상기 효소는 효소결합면역흡착검사(ELISA)에 사용되는 효소일 수 있다. 상기 효소결합면역흡착검사(ElLISA)에 사용되는 효소는 알카라인 포스파타제, 홀스레디쉬 페록시다제, 루시퍼라제, 또는 글루코즈 옥시다제 일 수 있다. 상기 광학적 표지로 효소를 사용할 경우, 화학 발광 반응을 유도하기 위하여 바람직하게는 화학발광물질로서 루미놀(luminol), 이소루미놀(isoluminol), 루시퍼린(luciferin), 루시게닌(lucigenin), 3-(2'-Spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3''-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetane (AMPPD), Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricyclo[3.3.1.13,7]decan}-4-yl) phenyl phosphate (CSPD) 등이 사용될 수 있으며, 또한 이외에도 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
또한, 상기 광학적 표지는, 적절한 거리에 의하여 이격되어 있는 형광 도너 발색소 및 형광 수용자 발색소를 포함하고 도너의 형광 발광이 수용자에 의하여 억제되어 있는 형광공명에너지전달(fluorescence resonance energy transfer: FRET) 쌍일 수 있다. 도너 발색소는 FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5 및 Texas Red를 포함할 수 있다. 수용자 발색소는 그의 여기 스펙트럼이 도너의 발광 스펙트럼과 겹치도록 선택될 수 있다. 또한, 상기 수용자는 넓은 범위의 도너를 켄칭 (quenching)하는 비형광 수용자일 수 있다.
상기 전기화학적 표지는 당업계에 알려진 전기화학적 표지를 포함하는데, 예를 들면 상기 전기화학적 표지는 메틸렌 블루일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예는 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3B에 특이적으로 결합하는 VHH 단일도메인 항체를 포함하는 구제역 바이러스 검출용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 VHH 단일도메인 항체(이하, '항체 1'이라 함), 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 VHH 단일도메인 항체(이하, '항체 2'라 함), 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 VHH 단일도메인 항체(이하, '항체 3'이라 함)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 VHH 단일 도메인 항체를 포함한다. 상기 조성물에 포함된 VHH 단일도메인 항체는 앞서 설명한 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것일 수 있다.
상기 조성물은 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3B와 VHH 단일 도메인 항체가 결합하는 결합체 형성을 보조하기 위한 물질을 더 포함할 수 있는데, 예를 들면 salmon sperm DNA, BSA, Tween-20, 및/또는 PEG를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예는 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3B에 특이적으로 결합하는 VHH 단일도메인 항체를 포함하는 구제역 바이러스 검출용 센서를 제공한다. 상기 센서는 상기 VHH 단일도메인 항체 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 VHH 단일도메인 항체를 포함하며, 상기 센서에 포함된 VHH 단일 도메인 항체는 앞서 설명한 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것일 수 있다.
상기 센서는, 상기 VHH 단일도메인 항체가 고정화되어 있는 기판을 포함하는 것, 예를 들면 어레이 형태일 수 있다. 어레이는 복수 개의 특정 분자가 기판상의 일정 부분에 고정화되어 있는 것을 말하는데, 상기 어레이는 기판 및 상기 기판에 형성된 구제역 바이러스와 결합할 수 있는 VHH 단일도메인 항체를 포함하는 고정화 영역을 포함할 수 있다. 상기 VHH 단일도메인 항체는 상기 고정화 영역 내에 공유적으로 부착된 것일 수 있다. 상기 VHH 단일도메인 항체는 공유적으로 부착시킬 수 있는 관능기를 갖는 복수의 화합물을 더 포함할 수 있다. 상기 관능기는 상기 VHH 단일도메인 항체를 부착할 수 있도록 하는 것이면 어느 것이나 사용될 수 있다. 예를 들면, 알데히드, 에폭시, 카르복시 또는 아민기가 될 수 있으며, 상기 화합물은 말단에 알데히드, 에폭시, 카르복시 또는 아민기를 갖는 실록산이 될 수 있다. 상기 기판의 재질은 예를 들면, 유리, 실리콘, 폴리프로필렌 및 폴리에틸렌과 같은 물질이 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예는 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3B에 특이적으로 결합하는 VHH 단일도메인 항체를 포함하는 구제역 바이러스 검출용 키트를 제공한다. 상기 키트는 상기 VHH 단일도메인 항체 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 VHH 단일도메인 항체를 포함하며, 상기 키트에 포함된 VHH 단일도메인 항체는 앞서 설명한 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것일 수 있다.
상기 키트는 상기 VHH 단일도메인 항체가 칩 상에 고정화된 칩 형태일 수 있으며, 또는 VHH 단일도메인 항체가 기판상에 고정화된 어레이 형태일 수 있다. VHH 단일도메인 항체를 칩이나 기판상에 고정화시키는 것은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있는데, 예컨대 칩 또는 기판을 스트렙트아비딘으로 개질하고, VHH 단일도메인 항체를 비오티닐화(biotinylation) 시킨 후, VHH 단일도메인 항체의 비오틴과 지지체의 스트렙트아비딘과의 결합을 이용하여 고정화할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예는 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3B에 특이적으로 결합하는 VHH 단일도메인 항체를 이용하는 구제역 바이러스 검출방법을 제공한다. 상기 검출방법은 시료와 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3B에 특이적으로 결합하는 VHH 단일도메인 항체를 접촉시키는 접촉단계와, 상기 접촉단계에서 형성된 구제역 바이러스-VHH 단일도메인 항체의 복합체로부터 신호를 측정하는 신호측정단계와, 상기 신호측정단계에서 측정된 신호를 분석하여 상기 시료 중 구제역 바이러스의 존재 또는 농도를 확인하는 확인단계를 포함한다. 상기 검출방법에서는 앞서 설명한 VHH 단일도메인 항체 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 VHH 단일도메인 항체가 사용되게 된다.
상기 접촉단계는 시료와 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3B에 특이적으로 결합하는 VHH 단일도메인 항체를 접촉시키는 단계로, 시료와 상기 VHH 단일도메인 항체 간의 접촉은 반응 용액 중에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 VHH 단일도메인 항체가 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3B와 잘 결합할 수 있는 염의 조성, 반응성을 극대화하기 위한 적정수소이온농도(pH), 균질성을 확보하기 위한 용매의 혼합물과 비특이적 결합을 방지하는 요소가 포함된 반응 용액 중에서 수행될 수 있다. 상기 용매는 예를 들면, 정제수, 메탄올, 아세토니트릴 등을 포함할 수 있다. 비특이적 결합을 방지하는 요소는 예를 들면, salmon sperm DNA, BSA 및/또는 Tween-20, PEG을 포함할 수 있다. 적정한 pH는 예를 들면, 4 내지 8, 5 내지 7.5, 6 내지 7일 수 있다. 반응 온도는 예를 들면, 15 내지 50℃, 25 내지 45℃, 또는 30 내지 40℃일 수 있다. 반응 시간은 예를 들면, 20 내지 90분, 30 내지 80분, 또는 50 내지 70분일 수 있다. 상기 VHH 단일도메인 항체는 VHH 단일도메인 항체 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 사용되게 되며, 상기 VHH 단일도메인 항체는 앞서 설명한 검출 가능한 표지가 부착되게 된다.
상기 신호측정단계는 상기 접촉단계에서 형성된 구제역 바이러스-VHH 단일도메인 항체의 결합체로부터 신호를 측정하는 단계로, 상기 구제역 바이러스-VHH 단일도메인 항체 복합체로부터 신호는 광학적 표지(형광, 효소), 전기화학적 표지 또는 이들의 조합에 의해 발생되는 것일 수 있다. 상기 광학적 표지(형광)는, 예를 들면, 도너-수용자 FRET 쌍일 수 있다. 상기 광학적 표지(효소)는 홀스레디쉬 페록시다제 일 수 있다. 상기 전기화학적 표지는, 예를 들면, 메틸렌 블루일 수 있다.
상기 확인단계는 상기 신호측정단계에서 측정된 신호를 분석하여 시료 중 구제역 바이러스의 존재 또는 농도를 확인하는 단계로, 시료 중 구제역 바이러스의 존재 또는 농도 확인은 대조군과 비교하여 이루어지는 것일 수 있다. 상기 대조군은 구제역 바이러스와 결합하지 않은 상태의 VHH 단일도메인 항체일 수 있다. 예를 들면, VHH 단일도메인 항체에 부착되는 표지가 도너-수용자 FRET 쌍인 경우, 대조군은 형광 도너 발색소의 형광 신호가 수용자 발색소에 의해 억제되어 있는 VHH 단일도메인 항체일 수 있다. 구제역 바이러스-VHH 단일도메인 항체 복합체가 형성되면 FRET 효율이 감소됨으로써 형광 신호가 변화하고, 상기 신호 변화로부터 구제역 바이러스의 존재 또는 농도를 확인할 수 있다. 예를 들면, VHH 단일도메인 항체에 부착되는 표지가 효소인 경우, 대조군은 구제역 바이러스를 인지하지 못하는 VHH 단일도메인 항체에 부착되어 있는 효소가 될 수 있다. 구제역 바이러스-VHH 단일도메인 항체 복합체가 형성되면 효소의 기질 변화 반응에 의해 색깔 신호가 변화하고, 구제역 바이러스-VHH 단일도메인 항체 복합체가 형성되지 못할 경우 색깔 신호가 변화되지 않음을 확인하여 구제역 바이러스의 존재 또는 농도를 확인할 수 있다. 예를 들면, VHH 단일도메인 항체에 부착되는 표지가 전기화학적 표지인 경우, 대조군은 전극에 고정된 VHH 단일도메인 항체일 수 있다. 구제역 바이러스와 결합한 VHH 단일도메인 항체의 구조 변화로 인해 전기화학적 표지가 전극으로부터 멀어지거나, 가까워지거나 또는 VHH 단일도메인 항체로부터 분리됨으로써 전기화학적 신호가 변화하고, 상기 신호 변화로부터 구제역 바이러스의 존재 또는 농도를 확인할 수 있다.
상기 검출방법은 상기 시료와 VHH 단일도메인 항체를 포함하는 반응물로부터 구제역 바이러스-VHH 단일도메인 항체 복합체를 분리하는 분리단계를 더 포함할 수 있다. 상기 분리단계는 구제역 바이러스-VHH 단일도메인 항체 복합체가 형성된 후, 상기 복합체로부터 신호를 측정하기 전에 수행되는 것일 수 있다. 상기 분리는 예를 들면, 막 여과법, 이차적 고정담체 흡착을 이용한 방법, 자성을 이용한 분리법 또는 원심분리법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 상기 분리는 상기 VHH 단일도메인 항체가 기판에 고정된 경우 이를 세척하는 것일 수 있으며 상기 VHH 단일도메인 항체가 이차적 고정담체에 흡착된 경우 이를 탈착하거나 용리하는 것일 수 있다. 상기 VHH 단일도메인 항체의 이차적 고정담체의 경우 예를 들면, 특정 공극과 두께를 가지는 실리콘, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등 일 수 있다. 상기 VHH 단일도메인 항체에 부착되어 있는 광학적 표지는, 상기한 바와 같은 형광물질일 수 있다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 효모 균주에 VHH 단일도메인 항체 라이브러리 도입
1. 효모균주 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae)(EBY100, ATCC MYA-4941)를 5ml YPD 배지(10g/L Yeast extract, 20g/L peptone, 20g/L glucose가 포함된 효모균주 배양용 배지)에 접종하고, 30℃, 200rpm 조건에서 24시간 배양한 후, 준비된 세포를 50ml YPD 배지에 OD600=0.1이 되도록 분주하고, 30℃, 200rpm 조건에서 배양하였다. 배양한 세포가 OD600=1.3~1.5에 도달하면, 500ul Tris-DTT buffer(1M의 Tris-base용액에 2.5M의 1,4-dithiothreitol(DTT)을 pH 8.0으로 적정한 후 여과지로 멸균한 용액)를 추가로 넣고, 30℃, 200rpm 조건에서 15분 반응시켜 반응능 세포(competent cell)로 만들었다. 이후, 50ml 코니칼 튜브에 배양액을 모두 옮겨 담아, 2500xg, 4℃, 3분 조건으로 원심분리하고 세포를 수확하였다. 차가운 E-buffer(10mM Tris-base, 270mM sucrose, 2mM MgCl2가 포함된 용액을 pH 7.5로 적정한 후 여과지로 멸균한 용액) 25mL, 1mL으로 2번 세척하고, 최종 부피 300uL 차가운 E-buffer에 현탁하여, 세포 현탁액을 준비하였다.
2. VHH 단일도메인 항체 라이브러리 유전자는 선행문헌(Ju et al., A synthetic library for rapid isolation of humanized single-domain antibodies. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2017, 22, 239-247)에서 개발된 합성 항체 라이브러리로부터 PCR을 통하여 증폭하여 준비하였다.
3. 전기천공법을 위해, 0.2cm cuvette에 pCTCON 벡터 1ug과 실시예 1의 2에서 준비된 상기 VHH 단일도메인 항체 라이브러리 유전자 5ug을 넣고, 최종 부피가 50ul가 되도록 실시예 1의 1에서 준비된 상기 세포 현탁액을 넣어주었다. 준비된 cuvette을 Gene Pulser에 넣고 0.54kV 및 25uF로 반응시켜 형질 전환한 후, 바로 1ml YPD 배지를 첨가하여 현탁하고, 15mL 코니칼 튜브로 옮겨 담고, 1ml YPD 배지를 추가하여 30℃, 200rpm 조건에서 1시간 배양시켜 세포를 성장시켰다. 이후, 2500xg, 4℃, 5분 조건에서 원심 분리하여 상등액을 제거하고, 3mL 선발 배지(6.7g/L Difco east Nitrogen Base w/o Amino Acids, 0.74g/L CSM-Trp, 20g/L D(+)-glucose가 포함된 영양요구성 선택적 효모 배양용 배지)로 1번 세척 후 동일한 배지 10ml에 세포를 현탁하였다. 이후, 연속 희석법을 사용하여 선발배지 플레이트(선발 배지의 조성에 15g/L Difco Agar Noble를 포함한 플레이트)에 평판 도말(spreading)한 후, 30℃, 48시간 조건에서 배양하여, 표면에 VHH 단일도메인 항체 라이브러리가 디스플레이된 효모균주를 얻었다.
<실시예 2> 유세포 분석법을 통한 구제역 바이러스의 비구조단백질 3B에 특이적으로 결합하는 VHH 단일도메인 항체의 선별
1. DSB-X biotin protein labeling kit(Molecular Probes, USA)를 사용하여, O형의 구제역 바이러스(O-JinChun-2014)의 비구조단백질 3B에 비오틴을 결합시켜, 비오틴이 결합된 3B(항원)를 얻었다. 상기 구제역 바이러스(O-JinChun-2014)의 비구조단백질 3B는 (주)바이오노트에서 입수하였다.
2. 실시예 1의 3에서 얻은 상기 표면에 VHH 단일도메인 항체 라이브러리가 디스플레이된 효모균주를 2×106 세포로 ep-tube에 분주한 후 상측액을 제거하고, 실시예 2의 1에서 얻은 항원을 PBSF buffer(8g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24g KH2PO4, 1g BSA를 1L의 2차 증류수에 녹이고, pH 7.4로 적정한 후 여과지로 멸균한 용액)로 연속 희석하여, 상기 ep-tube에 100ul씩 분주하였다. 이때, 항원의 최종 농도가 30, 20, 10nM이 되도록 희석하였다. 이후, 2.5ul c-Myc Tag(9B11) Mouse mAb(Alexa Fluor 488 conjugate)(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)(250배 희석)를 각 ep-tube에 분주한 후, 실온 암실에서 30분(15분 경과 후, 1times vortexing) 유지하여 항원-항체 반응을 진행하고, 원심 분리하여 상층액을 버린 후, APC 희석액(PBSF에 1%(v/v) streptavidin, APC(allophycocyanin), crosslinked, conjugate(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 희석한 용액)을 100ul씩 분주하여, 얼음에 넣은 후 암반응 조건에서 20분 반응시켜 상기 항원을 표지(APC와 컨쥬게이션된 아비딘과 항원의 비오틴이 결합하여 항원은 APC로 표지됨)하였다. 이후, PBSF buffer로 세포를 2번 세척하고 PBSF 500uL를 넣은 후, 유세포 분석기(FACSCalibur, BD)를 이용하여 형광을 측정하였으며, 위 과정을 3회 반복실시하였다.
3. 유세포 분석기 분석결과, VHH 단일도메인 항체와 항원의 결합으로 인하여 발생된 APC 신호를 나타내는 효모 세포를 선별적으로 분리할 수 있었으며, 이를 통해 구제역 바이러스(O-JinChun-2014)의 비구조단백질 3B에 대한 결합력이 높은 서열번호 1(MAQVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCTASGSYSSSSSYYSLGWFRQAPGQEREAVASIYSSGSYNYYADSVKGRFTISRDNAKNTVTLQMNNLKPEDTAIYYCAAVNWYHRSHDYYYYPNYWGQGTQVTVFS)의 아미노산 서열을 가지는 VHH 단일도메인 항체 1을 선별하였다.
<실시예 3> 구제역 바이러스의 비구조단백질 3B에 특이적으로 결합하는 VHH 단일도메인 항체의 결합력 개선
1. 상기 VHH 단일도메인 항체 1의 유전자를 주형으로 비특이적 돌연변이 PCR(Error-prone PCR)로 증폭하여 개량 VHH 단일도메인 항체 라이브러리를 제작하였다. 상기 VHH 단일도메인 항체 1의 돌연변이화는 GeneMorph II Random Mutagenesis Kits(Agilent Technologies, Santa Clara, CA,USA)를 사용하였으며, 돌연변이율을 높이기 위해 항체 주형 100ng을 넣고 최종 부피 50ul로 Error-prone PCR을 진행하였으며, PCR 반응은 2분 동안 98℃, 이후 30초 동안 98℃, 30초 동안 52℃, 30초 동안 72℃를 25회 반복하고 10분동안 72℃으로 진행하여, 무작위 돌연변이가 일어난 VHH 단일도메인 항체 라이브러리를 증폭하였다.
2. 개량(돌연변이가 유발된) VHH 단일도메인 항체 라이브러리를 실시예 1의 3과 같은 방식으로 효모균주에 도입하여, 표면에 개량 VHH 단일도메인 항체 라이브러가 표면에 디스플레이된 효모균주(이하, '개량 효모균주'라 함)를 얻었다. 이후, 실시예 2의 2와 같은 방식으로, 상기 개량 효모균주와, 실시예 2의 1에서 얻은 항원(단, 항원의 최종 농도가 30, 20, 15, 10nM이 되도록 하고, 개량 효모균주와 항원의 반응을 총 4회 실시)을 반응시키고 항원을 표지한 후, 실시예 2의 3과 같은 방식으로 유세포 분석기를 이용하여 분석하여, 구제역 바이러스(O-JinChun-2014)의 비구조단백질 3B에 대한 결합력이 높은, 서열번호 2(MAQVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCTASGSYSSSSSYYSLGWFRQAPGQEREAVASIYSSGSYNYYADSVKGRFTISRDNAKTTVTLQMNNLKPEDTAIYYCAAVNWYHRSHDYYYYPNYWGQGTQVTVFS)의 아미노산 서열을 가지는 VHH 단일도메인 항체 2 및 서열번호 3(MAQVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCTASGSYSSSSSYYSLGWFRQAPGQEREAVASIYSSGSYNYYADSVKGRFAISRDNAKNTVTLQMNNLKPEDTAIYYCAAVNWYHRSHDYYYYPNYCGQGTQVTVFS)의 아미노산 서열을 가지는 VHH 단일도메인 항체 3을 선별하였다.
<실시예 4> VHH 단일도메인 항체의 효과 확인
1. 실시예 2 및 3에서 얻은 상기 VHH 단일도메인 항체 1 내지 3 각각을 실시예 1의 3과 같은 방식으로 효모균주에 도입하였고, 이후 실시예 2의 2와 같은 방식으로, 표면에 항체 1 내지 3 각각이 디스플레이된 효모균주와, 실시예 2의 1에서 얻은 항원(단 항원의 최종 농도가 0, 30, 50, 100, 200, 400, 600nM이 되도록 함)을 반응시키고 항원을 표지한 후, 유세포 분석기를 이용하여 분석하여, 항원의 농도에 따른, VHH 단일도메인 항체 1 내지 3과, 항원 간의 결합력을 APC 형상 신호로 나타내어 그 결과를 도 1에 나타내었고, 항원 농도에 따라, VHH 단일도메인 항체 2 및 3과, 항원의 결합에 따른 형광세기의 변화를 측정하여, 그 결과를 도 2에 나타내었고, 상기 항원 농도에 따른 항원 결합 신호를 바탕으로, 결합친화도 상수(KD)값을 구해, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 1 내지 3을 보면, 항체 1 내지 3 모두 3B에 특이적으로 결합하며, 항체 2 및 3이 항체 1에 비해 3B에 대한 친화도가 큼을 알 수 있다.
2. 상기 VHH 단일도메인 항체 2 및 3의 항원 특이성을 평가하기 위해, 실시예 3에서 얻은 상기 VHH 단일도메인 항체 2 및 3 각각을 실시예 1의 3과 같은 방식으로 효모균주에 도입하였다. 실시예 2의 1과 같은 방식으로, O형의 구제역 바이러스(O-JinChun-2014)의 비구조단백질 2C, 3A, 3ABC, 3B에 비오틴을 결합시켜, 비오틴이 결합된 2C, 3A, 3ABC, 3B를 얻었다. 이후 실시예 2의 2와 같은 방식으로, 표면에 항체 2 및 3 각각이 디스플레이된 효모균주와, 동일 농도의 상기 비오틴이 결합된 2C, 3A, 3ABC, 3B 각각은 반응시키고 항원을 표지한 후, 유세포 분석기를 이용하여 분석하여, VHH 단일도메인 항체 2(또는 3)와, 구제역 바이러스의 비구조단백질 2C, 3A, 3ABC, 3B의 결합력을 항원에 표지된 APC 형광광도를 이용하여 구해, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4를 보면, 항체 2 및 3은 모두 3B와 반응하였을 때에만 항원-항체 결합에 따른 형광신호가 검출됨을 확인할 수 있다.
이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
<120> VHH single domain antibody with high affinity against
nonstructural protein 3B of foot-and-mouth disease virus
<130> PDAHJ-21128
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 130
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH single domain antibody with high affinity against NSP 3B of
FMDV
<400> 1
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ser Tyr Ser Ser
20 25 30
Ser Ser Ser Tyr Tyr Ser Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln
35 40 45
Glu Arg Glu Ala Val Ala Ser Ile Tyr Ser Ser Gly Ser Tyr Asn Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
65 70 75 80
Lys Asn Thr Val Thr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Asn Trp Tyr His Arg Ser His Asp
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Phe Ser
130
<210> 2
<211> 130
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH single domain antibody with high affinity against NSP 3B of
FMDV
<400> 2
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ser Tyr Ser Ser
20 25 30
Ser Ser Ser Tyr Tyr Ser Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln
35 40 45
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115 120 125
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130
<210> 3
<211> 130
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH single domain antibody with high affinity against NSP 3B of
FMDV
<400> 3
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
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115 120 125
Phe Ser
130
Claims (9)
- 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3B에 특이적으로 결합하는 VHH 단일도메인 항체로, 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 VHH 단일도메인 항체.
- 제1항에 있어서,
상기 VHH 단일도메인 항체는 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 VHH 단일도메인 항체. - 제2항에 있어서,
상기 검출가능한 표지는 광학적 표지, 전기화학적 표지, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합인 것인 특징으로 하는 VHH 단일도메인 항체. - 제1항의 VHH 단일도메인 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스 검출용 조성물.
- 제1항의 VHH 단일도메인 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스 검출용 센서.
- 제1항의 VHH 단일도메인 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스 검출용 키트.
- 제6항에 있어서,
상기 키트는 VHH 단일도메인 항체가 칩상에 고정화된 칩 형태 또는 기판상에 고정화된 마이크로 어레이 형태인 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스 검출용 키트. - 청구항 제1항의 VHH 단일도메인 항체와 시료를 접촉시키는 접촉단계와; 상기 접촉 단계에서 형성된 구제역 바이러스-VHH 단일도메인 항체 복합체로부터 신호를 측정하는 신호측정단계와; 상기 신호측정단계에서 측정된 신호를 분석하여 시료 중 구제역 바이러스의 존재 또는 농도를 확인하는 확인단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스의 검출방법.
- 제8항에 있어서, 상기 구제역 바이러스의 검출방법은
상기 시료와 VHH 단일도메인 항체를 포함하는 반응물로부터 구제역 바이러스-VHH 단일도메인 항체 복합체를 분리하는 분리단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스의 검출방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210084772A KR102653196B1 (ko) | 2021-06-29 | 2021-06-29 | 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3b에 특이적으로 결합하는 ｖｈｈ 단일도메인 항체 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210084772A KR102653196B1 (ko) | 2021-06-29 | 2021-06-29 | 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3b에 특이적으로 결합하는 ｖｈｈ 단일도메인 항체 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230001793A KR20230001793A (ko) | 2023-01-05 |
| KR102653196B1 true KR102653196B1 (ko) | 2024-04-01 |
Family
ID=84926089
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210084772A KR102653196B1 (ko) | 2021-06-29 | 2021-06-29 | 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3b에 특이적으로 결합하는 ｖｈｈ 단일도메인 항체 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102653196B1 (ko) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101814757B1 (ko) * | 2014-12-19 | 2018-01-05 | 주식회사 메디안디노스틱 | 구제역 바이러스의 3ａｂ 비구조단백질 및 이에 특이적인 단일클론항체를 이용한 구제역 바이러스 감염여부를 진단하는 방법 및 이를 구현하기 위한 진단키트 |
-
2021
- 2021-06-29 KR KR1020210084772A patent/KR102653196B1/ko active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20230001793A (ko) | 2023-01-05 |
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