KR101900292B1 - 폴리스트렙트아비딘을 이용한 면역분석법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리스트렙트아비딘과 항-스트렙트아비딘 항체 또는 바이오틴 컨쥬게이트 이용하여 타겟 물질의 검출 신호를 증폭시켜 보다 효율적으로 소량의 타겟 물질을 검출할 수 있는 면역분석법에 관한 것이다.

Description

폴리스트렙트아비딘을 이용한 면역분석법{IMMUNOASSAY USING POLYSTREPTAVIDIN}
본 발명은 폴리스트렙트아비딘을 이용한 면역분석법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 폴리스트렙트아비딘과 항-스트렙트아비딘 항체 또는 바이오틴 컨쥬게이트를 이용하여 타겟 물질의 검출 신호를 증폭시키고 민감도를 향상시키는 방법에 관한 것이다.
바이오 마커의 개발은 질병의 조기 진단, 병원성 미생물의 검출을 위한 것이므로, 국민 건강과 밀접한 연관이 있다. 따라서 질병의 조기 진단 및 미생물의 검출을 위해, 유기 또는 무기 저분자 화합물(small molec㎕e), 압타머(aptamer), 펩타이드(peptide), 항체(antibody)등을 이용한 바이오 마커 물질들이 개발되고 있다. 특정 물질을 검출하기 위해서는, 검출 하고자 하는 타겟 물질만을 특이적으로 감지해야 하며 다른 물질과는 반응성이 없어야 한다. 항체가 가지는 이러한 특징은 이미 바이오산업의 다양한 분야에서 사용되고 있다. 예를 들면, 혈청 중 특이 단백질의 검출은 질병의 진단에 사용되며 이를 위하여 특이 단백질에 결합하는 항체를 이용한다. 또한, 특정 바이러스나 미생물의 검출을 위해서 바이러스나 미생물이 가지고 있는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 병원성 미생물의 존재 여부를 판단할 수 있다.
현재 이용되고 있는 분자간의 결합(상호작용) 또는 효소활성 분석은 크게 이질성(heterogeneous) 방법과 동질성(homogeneous) 방법으로 나눌 수 있다. 이질성 방법의 대표적인 예로 효소면역측정법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 마이크로어레이(microarray), 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 등을 들 수 있고, 동질성 방법의 대표적인 예로 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRT) 및 형광 편광(fluorescence polarization, FP) 등의 기술이 존재한다.
ELISA는 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 반응을 확인하는 방법으로, 그 방법이 간단하고 비용이 많이 들지 않으며 다량 분석이 가능하기 때문에, 현재 가장 널리 쓰이고 있는 항원-항체 분석법 중 하나이다. 이는, 방사능면역시험법 (RIA, Radio ImmunoAssay)과 같이 매우 민감한 반응이면서도 RIA에서처럼 방사능을 사용하지 않는다는 장점이 있어서 그 사용이 증가되고 있다.
항체에 결합되는 효소 중에는 간단한 기질 용액을 넣으면 색깔을 띄는 반응이 이용되는 데, 대표적인 효소로는 AP(Alkaline phosphatase)나 HRP(Horseradish peroxidase) 등이 많이 이용되고 있다. 이들 효소는 화학반응에 의해 항체분자의 Fc 지역에 공유결합된다. 이 경우에는, 상기 항원-항체 반응을 이용해 물질을 감지하였을 때의 신호를 나타내는 과정이 필요하다. 예를 들면, 항체에 효소를 컨쥬게이션 하여 기질을 처리하였을 때 기질의 변화를 검출하는 방법이 있고, 또 다른 방법으로는 항체에 형광물질을 컨쥬게이션하여 레이져로 검출하는 방법이 있다.
현재 주로 사용되는 바이오틴(biotin)과 스트렙트아비딘(streptavidin)은, 그 특이적 결합으로 우수한 안정성을 나타낼 뿐만 아니라, 호모테트라머(homotetramer)로 이루어지는 스트렙트아비딘의 특성상 검출 신호를 약 네 배 가량 증폭시킬 수 있다는 장점이 있다. 그러나, 스트렙트아비딘을 이용하더라도 타겟 물질이 소량인 경우에는 검출에 한계가 있다. 따라서, 소량의 타겟 물질만으로 검출을 해야 하는 경우에는, 검출 신호를 더 효과적으로 증폭시킬 수 있는 방법이 필요하다.
본 발명의 목적은 폴리스트렙트아비딘과 항-스트렙트아비딘 항체 또는 바이오틴 컨쥬게이트를 이용하여 타겟 물질의 검출 신호를 증폭시켜 보다 효율적으로 소량의 타겟 물질을 검출할 수 있는 면역분석법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, i) 매트릭스에 표적 항원 검출용 항체를 고정시키는 단계; ii) 표적 항원이 포함된 검출 대상 시료를 상기 매트릭스에 처리하는 단계; iii)표적 항원에 특이적으로 결합하고 일단에 바이오틴(biotin)이 컨쥬게이션된 항체를 상기 매트릭스에 처리하는 단계; iv) 폴리스트렙트아비딘(polystreptavidin)을 상기 매트릭스에 처리하는 단계; 및 v) 일단에 라벨물질을 포함하는 항-스트렙트아비딘 항체(anti streptavidin antibody) 또는 라벨물질을 포함하는 바이오틴 컨쥬게이트를 상기 매트릭스에 처리하는 단계; 를 순차적으로 포함하는 면역분석법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, i) 매트릭스에 표적 항원 검출 항체를 고정시키는 단계; ii) 표적 항원이 포함된 검출 대상 시료를 상기 매트릭스에 처리하는 단계; iii) 표적 항원에 특이적으로 결합하고 일단에 바이오틴이 컨쥬케이션된 항체를 상기 매트릭스에 처리하는 단계; iv) 폴리스트렙트아비딘을 상기 매트릭스에 처리하는 단계; v) 일단에 바이오틴이 컨쥬게이션된 항-스트렙트아비딘 항체를 상기 매트릭스에 더 처리하는 단계; vi) 폴리스트렙트아비딘을 상기 매트릭스에 추가로 처리하는 단계; 및 vii) 일단에 라벨물질을 포함하는 항-스트립트아비딘 항체 또는 라벨물질을 포함하는 바이오틴 컨쥬게이트를 상기 매트릭스에 처리하는 단계; 를 순차적으로 포함하는 면역분석법이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 일단에 라벨물질을 포함하는 항-스트렙트아비딘 항체는 모노클로날 항체(monoclonal antibody) 또는 폴리클로날 항체(polyclonal antibody)일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 일단에 바이오틴이 컨쥬게이션된 항-스트렙트아비딘 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 매트릭스는 마그네틱 비드 또는 플레이트인 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 라벨물질은 형광 다이, 효소, 표면 증감 라만 산란 나노 프로브, 라텍스 입자, 퀀텀닷 및 금 나노 입자로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 면역분석법은 폴리스트렙트아비딘 및 항-스트렙트아비딘 항체를 이용하여 타겟 물질의 검출 신호를 증폭시켜 보다 효율적으로 소량의 타겟 물질을 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은 하나의 분자에 여러 반응기를 결합하거나 하나의 분자에 여러 반응기를 결합하는 반응을 반복 사용함으로써 통상적으로 사용하는 면역 진단 방법보다 민감도를 크게 향상에 시킬 수 있으며, 바이오틴-스트렙트아비딘의 결합 반응을 이용하므로 특이도 또한 크게 향상시킬 수 있다. 따라서, 면역 진단에 있어 문제가 되는 민감도 및 특이도 문제를 개선하여 보다 정확하게 질병 또는 병원성 미생물 등을 진단 및 검출할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 면역분석법의 원리를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 다른 일 실시예에 의한 면역분석법의 원리를 도시한 것이다.
도 3은 폴리스트렙트아비딘, 스트렙트아비딘 및 HRP(horseradish peroxidase)의 검출 민감도를 비교하기 위해 검출 하고자 하는 물질의 농도에 따른 흡광도를 나타내는 그래프이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, i) 매트릭스에 표적 항원 검출용 항체를 고정시키는 단계; ii) 표적 항원이 포함된 검출 대상 시료를 상기 매트릭스에 처리하는 단계; iii)표적 항원에 특이적으로 결합하고 일단에 바이오틴(biotin)이 컨쥬게이션된 항체를 상기 매트릭스에 처리하는 단계; iv) 폴리스트렙트아비딘(polystreptavidin)을 상기 매트릭스에 처리하는 단계; 및 v) 일단에 라벨물질을 포함하는 항-스트렙트아비딘 항체(anti-streptavidin antibody) 또는 라벨물질을 포함하는 바이오틴 컨쥬게이트를 상기 매트릭스에 처리하는 단계; 를 순차적으로 포함하는 면역분석법이 제공된다.
도 1은 상기 본 발명의 일 실시예에 의한 면역분석법의 원리를 나타낸 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 폴리스트렙트아비딘에 존재하는 스트렙트아비딘 잔기에 라벨물질이 결합된 항-스트렙트아비딘 항체 또는 라벨물질을 포함하는 바이오틴 컨쥬게이트가 결합하여 여러 개의 신호로 증폭되는 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, i) 매트릭스에 표적 항원 검출 항체를 고정시키는 단계; ii) 표적 항원이 포함된 검출 대상 시료를 상기 매트릭스에 처리하는 단계; iii) 표적 항원에 특이적으로 결합하고 일단에 바이오틴이 컨쥬케이션된 항체를 상기 매트릭스에 처리하는 단계; iv) 폴리스트렙트아비딘을 상기 매트릭스에 처리하는 단계; v) 일단에 바이오틴이 컨쥬게이션된 항-스트렙트아비딘 항체를 상기 매트릭스에 더 처리하는 단계; vi) 폴리스트렙트아비딘을 상기 매트릭스에 추가로 처리하는 단계; 및 vii) 일단에 라벨물질을 포함하는 항-스트립트아비딘 항체 또는 라벨물질을 포함하는 바이오틴 컨쥬게이트를 상기 매트릭스에 처리하는 단계; 를 순차적으로 포함하는 면역분석법이 제공된다.
도 2는 상기 본 발명의 다른 일 실시예에 의한 면역분석법의 원리를 나타낸 것이다. 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 일단에 바이오틴이 컨쥬게이션 된 항-스트렙트아비딘 항체를 추가로 처리하여 검출에 사용되는 폴리스트렙트아비딘의 수를 증가시키고, 결과적으로 신호가 더 크게 증폭되는 것을 확인할 수 있다.
아비딘은 난백에 포함되는 분자량 68,000인 염기성 당 단백질로서, 비타민 B군에 포함되는 바이오틴과 결합한다. 아비딘과 바이오틴의 결합해리상수(Kd)는 약 10-15M로 일반적인 항원-항체 반응보다 100만 배 이상의 강력한 결합 활성을 나타낸다. 스트렙트아비딘은 streptomyces avidinii 박테리아가 만든 아비딘으로 테트라머 구조이며, 본 발명의 면역분석법에 사용되는 폴리스트렙트아비딘은 스트렙트아비딘 잔기가 복수 개로 존재하는 분자를 의미하며, 분자량은 2,000,000 이상이다.
일단에 라벨물질을 포함하는 항-스트렙트아비딘 항체와 일단에 바이오틴이 컨쥬게이션된 항-스트렙트아비딘 항체는 모노클로날 항체(monoclonal antibody) 또는 폴리클로날 항체(polyclonal antibody)일 수 있다.
매트릭스는 검출 하고자 하는 물질(타겟)과 항원-항체 반응을 하는 항체를 고정할 수 있는 물질로서, 마그네틱 비드 또는 플레이트일 수 있다. 마그네틱 비드는 내부에 자성입자가 있고 외부에 실리카 등의 다양한 관능기를 코팅한 입자를 의미하며, 관능기는 중성 카르복시기(-COOH), 에스테르기(-COO-), 중성 아민기(-NH2), 중성 아민기의 이온(-NH- 또는 NH3 -), 중성 티올기(-SH) 및 중성 티올기의 이온(-S-)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 작용기를 포함할 수 있다. 플레이트는 플라스틱, 유리 또는 실리콘 기판일 수 있으며, 예를 들어, PDMS(polydimethylsiloxane), PMMA(polymethylmethacrylate), PC(polycarbonate), COC(cyclic olefin copolymer), PA(polyamide), PE(polyethylene), PP(polypropylene), PPE(polyphenylene ether), PS(polystyrene), POM(polyoxymethylene), PEEK(polyetheretherketone), PTFE(polytetrafluoroethylene), PVC(polyvinylchloride), PVDF(polyvinylidene fluoride), PBT(polybutyleneterephthalate), FEP(fluorinated ethylenepropylene), PFA(perfluoralkoxyalkane) 등의 고분자로 이루어질 수 있다.
매트릭스에 검출 하고자 하는 물질과 반응하는 항체를 고정시키는 방법으로는, 스트렙트아비딘-바이오틴 결합, 아비딘-바이오틴 결합, EDC 커플링, 설프하이드릴아민 커플링, Ni-NTA-히스티딘 결합, 아마이드 결합을 이용 할 수 있으나, 당 업계에서 공지된 결합이라면 어느 것을 이용하여도 무방하다.
검출 하고자 하는 물질의 검출 신호를 확인하기 위한 라벨물질은 형광 다이, 효소, 표면 증감 라만 산란 나노 프로브, 라텍스 입자, 퀀텀닷 또는 금 나노 입자와 같은 발광이나 발색을 나타내는 물질 등 일 수 있다.
라벨물질이 형광 다이(fluorescent dye)인 경우, 내재된 형광 발현 단백질 또는 유기화합물 형태의 형광물질이 될 수 있으며, 내재된 형광 발현 단백질은 GFP(green fluorescent protein), EGFP(enhanced GFP), EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), mCitrine, Venus, mECFP(monomeric enhanced cyan fluorescent protein), Cerulean, EBFP(enhanced blue fluorescent protein), Azurite, DSRed(Discosoma sp. red fluorescent protein), mOrange(monomeric orange fluorescent proteins), mStrawberry(monomeric strawberry fluorescent proteins), mCherry(monomeric cherry fluorescent proteins), Alexa, 및 이들의 혼합물 에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있다. 또한, 유기화합물 형태의 형광물질은 FITC(fluorescein isothiocyanate), TRITC(tetramethylrhodamine), FAM(fluorescein amidite), Rhodamine, TAMRA (Carboxytetramethylrhodamine), Cy™, CF™ (Cyanine-based fluorescent dye), Quantum Dot (Quantum square 포함) 및 이들의 혼합물에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있다.
라벨물질이 효소인 경우, 효소의 기질과 반응하여 색소를 형성할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 퍼옥시다아제(peroxidase) 또는 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 일 수 있다. 효소로서 퍼옥시다아제를 사용하는 경우, 퍼옥시다아제와 반응하여 광을 생성하는 퍼옥시다아제의 기질의 예는 과산화수소와 발광 화합물 (예를 들어, 루미놀 화합물 또는 루시게닌 화합물) 의 조합을 포함하고, 효소로서 알칼리 포스파타아제를 사용하는 경우, 알칼리 포스파타아제와 반응하여 광을 생성하는 알칼리 포스파타아제의 기질의 예는 3-(2'-스피로아다만탄)-4-메톡시-4-(3'-포스포릴옥시)페닐-1,2-디옥세탄 이나트륨염 (AMPPD), 2-클로로-5-{4-메톡시스피로[1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로[3.3.1.13,7]칸]-4-일}페닐포스페이트 이나트륨염 (CDP-StarTM), 3-{4-메톡시스피로[1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로[3.3.1.13,7]데칸]-4-일}페닐포스페이트 이나트륨염 (CSPDTM), [10-메틸-9(10H)-아크리디닐리덴]페녹시메틸포스페이트 이나트륨염 (LumigenTM APS-5) 및 9-(4-클로로페닐티오포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단 이나트륨염을 포함한다.
라벨물질이 표면 증감 라만 산란 나노 프로브인 경우, 나노 프로브는 금, 은, 구리 등으로 이루어진 귀금속 나노입자(Nobel metal nanoparticle)를 사용할 수 있으며, 금속 나노입자의 형태는 구형, 사각형, 별 모양 등 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 폴리스트렙트아비딘을 이용한 면역분석법
검출 하고자 하는 물질과 특이적으로 결합하는 항체를 50 mM Carbonate-bicarbonate 버퍼 (pH 9.4)에 1 ㎍/ml 농도로 희석하고 96 웰 플레이트에 웰 당 100 ㎕씩 분주하여 4℃에서 하루 동안 두어 항체를 플레이트에 고정한다. 고정되지 않은 항체를 석션하여 버리고 Tween 20이 0.02% 포함된 PBS (Phosphate Buffered Saline, pH 7.4)를 웰 당 200 ㎕씩 분주 후 석션하여 96 웰 플레이트를 세척하기를 총 세 번 반복 한다. 카세인(Casein) 단백질이 0.25% 포함된 PBS를 웰 당 150 ㎕씩 분주하고 37℃에서 1시간 동안 두어 항체가 고정되지 않은 웰의 빈 공간을 차단(blocking) 한다. 상기 버퍼를 석션하여 버리고 Tween 20이 0.02% 포함된 PBS (Phosphate Buffered Saline, pH 7.4)를 웰 당 200 ㎕씩 분주 후 석션하여 96 웰 플레이트를 세척하기를 총 3반복 한다. 검출 하고자 하는 물질을 PBS에 1000 ng/ml 부터 1 pg/ml 까지 1/10씩 희석하고 웰 당 100 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 상기 반응액을 석션하여 버리고 Tween 20이 0.02% 포함된 PBS (Phosphate Buffered Saline, pH 7.4)를 웰 당 200 ㎕씩 분주 후 석션하여 96 웰 플레이트를 세척하기를 총 세 번 반복 한다. 바이오틴이 접합되어 있고 검출 하고자 하는 물질에 특이적인 항체를 0.1 ㎍/ml 농도로 PBS에 희석하고 96 웰 플레이트에 웰 당 100 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 반응하고 남은 항체를 석션하여 버리고 Tween 20이 0.02% 포함된 PBS (Phosphate Buffered Saline, pH 7.4)를 웰 당 200 ㎕씩 분주 후 석션하여 96 웰 플레이트를 세척하기를 총 세 번 반복 한다. 폴리스트렙트아비딘을 1 ㎍/ml로 PBS에 희석하고 96 웰 플레이트에 웰 당 100 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 반응하고 남은 폴리스트렙트아비딘을 석션하여 버리고 Tween 20이 0.02% 포함된 PBS (Phosphate Buffered Saline, pH 7.4)를 웰 당 200 ㎕씩 분주 후 석션하여 96 웰 플레이트를 세척하기를 총 세 번 반복 한다. HRP가 접합된 항-스트렙트아비딘 항체를 0.2 ㎍/ml로 PBS에 희석하고 96 웰 플레이트에 웰 당 100 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 반응하고 남은 HRP가 접합된 항-스트렙트아비딘 항체를 석션하여 버리고 Tween 20이 0.02% 포함된 PBS (Phosphate Buffered Saline, pH 7.4)를 웰 당 200 ㎕씩 분주 후 석션하여 96 웰 플레이트를 세척하기를 총 세 번 반복 한다. 3, 3', 5, 5'-Tetramethylbenzidine (TMB) 용액을 웰 당 100 ㎕씩 분주하고 차광하여 상온에서 10분간 반응한다. 0.5 M H2SO4 용액을 웰 당 50 ㎕씩 분주하여 반응을 중지시킨 후 ELISA 리더로 흡광도를 측정한다 (450 nm).
실시예 2: HRP를 이용한 면역분석법
실시예 1의 검출 하고자 하는 물질(항원)처리과정까지 동일하게 실험한 후 HRP와 접합된, 검출물질과 특이적으로 반응하는 항체를 0.1 ㎍/ml 농도로 PBS에 희석하고 96 웰 플레이트에 웰당 100 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 반응하고 남은 항체를 석션하여 버리고 Tween 20이 0.02% 포함된 PBS (Phosphate Buffered Saline, pH 7.4)를 웰 당 200 ㎕씩 분주 후 석션하여 96 웰 플레이트를 세척하기를 총 세 번 반복 한다. TMB 용액을 웰 당 100 ㎕씩 분주하고 차광하여 상온에서 10분간 반응한다. 0.5 M H2SO4 용액을 웰 당 50 ㎕씩 분주하여 반응을 중지시킨 후 ELISA 리더로 흡광도를 측정한다 (450 nm).
실시예 3: 스트렙트아비딘을 이용한 면역분석법
실시예 1의 검출 하고자 하는 물질(항원)처리과정까지 동일하게 실험한 후 바이오틴이 접합되어 있고 검출 하고자 하는 물질에 특이적인 항체를 0.1 ㎍/ml 농도로 PBS에 희석하고 96 웰 플레이트에 웰 당 100 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 반응하고 남은 항체를 석션하여 버리고 Tween 20이 0.02% 포함된 PBS (Phosphate Buffered Saline, pH 7.4)를 웰 당 200 ㎕씩 분주 후 석션하여 96 웰 플레이트를 세척하기를 총 세 번 반복 한다. HRP가 접합된 스트렙트아비딘을 0.2 ㎍/ml로 PBS에 희석하고 96 웰 플레이트에 웰 당 100 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 반응하고 남은 폴리스트렙트아비딘을 석션하여 버리고 Tween 20이 0.02% 포함된 PBS (Phosphate Buffered Saline, pH 7.4)를 웰 당 200 ㎕씩 분주 후 석션하여 96 웰 플레이트를 세척하기를 총 세 번 반복 한다. TMB 용액을 웰 당 100 ㎕씩 분주하고 차광하여 상온에서 10분간 반응한다. 0.5 M H2SO4 용액을 웰 당 50 ㎕씩 분주하여 반응을 중지시킨 후 ELISA 리더로 흡광도를 측정한다 (450 nm).
상기 실시예 1 내지 3에 따른 면역분석법에 따른 흡광도를 아래의 표 1에 나타내었다.
Figure 112017126687989-pat00001
표 1의 결과와 도 3의 그래프를 참고하면, 검출 하고자 하는 물질의 농도가 증가할수록 흡광도가 증가하는 것을 알 수 있다. 또한, 검출 하고자 하는 물질의 농도가 매우 낮은 경우(1 pg/ml 이하)에는 폴리스트렙트아비딘을 사용한 경우가 스트렙트아비딘과 HRP를 사용한 경우보다 흡광도가 높았으며, 검출 하고자 하는 물질의 농도가 비교적 높은 경우에는 폴리스트렙트아비딘>스트렙트아비딘>HRP의 순서로 흡광도가 높은 것을 알 수 있다.
따라서, 실시예 1~3의 결과에 의해 폴리스트렙트아비딘을 사용한 면역분석법은, 검출 하고자 하는 물질의 농도가 높은 경우는 물론 낮은 경우에서도 스트렙트아비딘 또는 HRP 을 사용한 면역분석법과 비교하여 보다 뛰어난 검출 민감도를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (6)

  1. i) 매트릭스에 표적 항원 검출용 항체를 고정시키는 단계;
    ii) 표적 항원이 포함된 검출 대상 시료를 상기 매트릭스에 처리하는 단계;
    iii)표적 항원에 특이적으로 결합하고 일단에 바이오틴(biotin)이 컨쥬게이션된 항체를 상기 매트릭스에 처리하는 단계;
    iv) 폴리스트렙트아비딘(polystreptavidin)을 상기 매트릭스에 처리하는 단계; 및
    v) 일단에 라벨물질을 포함하는 항-스트렙트아비딘 항체(anti-streptavidin antibody)를 상기 매트릭스에 처리하는 단계; 를 순차적으로 포함하고,
    상기 일단에 라벨물질을 포함하는 항-스트렙트아비딘 항체는 모노클로날 항체(monoclonal antibody)인, 면역분석법.
  2. i) 매트릭스에 표적 항원 검출 항체를 고정시키는 단계;
    ii) 표적 항원이 포함된 검출 대상 시료를 상기 매트릭스에 처리하는 단계;
    iii) 표적 항원에 특이적으로 결합하고 일단에 바이오틴이 컨쥬케이션된 항체를 상기 매트릭스에 처리하는 단계;
    iv) 폴리스트렙트아비딘을 상기 매트릭스에 처리하는 단계;
    v) 일단에 바이오틴이 컨쥬게이션된 항-스트렙트아비딘 항체를 상기 매트릭스에 처리하여 상기 폴리스트렙트아비딘과 결합시키는 단계;
    vi) 폴리스트렙트아비딘을 상기 매트릭스에 추가로 처리하여 상기 단계 v)의 항-스트렙트아비딘 항체와 결합시키는 단계; 및
    vii) 일단에 라벨물질을 포함하는 항-스트립트아비딘 항체를 상기 매트릭스에 처리하는 단계; 를 순차적으로 포함하고,
    상기 일단에 라벨물질을 포함하는 항-스트렙트아비딘 항체는 모노클로날 항체(monoclonal antibody)인, 면역분석법.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서,
    상기 일단에 바이오틴이 컨쥬게이션된 항-스트렙트아비딘 항체는 모노클로날 항체인, 면역분석법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 매트릭스는 마그네틱 비드 또는 플레이트인 것인, 면역분석법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 라벨물질은 형광 다이, 효소, 표면 증감 라만 산란 나노 프로브, 라텍스 입자, 퀀텀닷 및 금 나노 입자로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 면역분석법.
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