KR101613020B1 - 표적항원 검출용 복합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

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최진하
장혜미
이은정
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서강대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 Fc와 특이적으로 결합하는 앱타머와 RT-PCR 기술을 사용하여 고감도로 표적 물질을 감지할 수 있는 표적항원 검출용 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 표적항원 검출용 복합체는 나노입자와 항체를 연결하는 앱타머를 구비하는데, 이러한 앱타머는 항체의 Fc부분과 선택적으로 결합하므로 항체의 활성영역(Fab)을 노출시켜 표적 항원과의 반응율을 높이며, 또한, RT-PCR로 기하급수적으로 증폭되므로 고감도로 표적물질을 검출할 수 있다.

Description

표적항원 검출용 복합체 및 이의 제조방법{Complex for detecting target antigen and method of preparing the same}
본 발명은 표적항원 검출용 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 Fc와 특이적으로 결합하는 앱타머와 RT-PCR 기술을 사용하여 고감도로 타겟물질을 감지할 수 있는 표적항원 검출용 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최근 건강관리에 대한 관심이 높아짐에 따라 조기 질병 발견방법에 대한 요구가 증가하고 있다. 바이오탐색은 다양한 질병의 조기진단에 매우 중요하고 신속히 중환자에 대한 진단을 용이하게 한다.
면역분석법은 그 검출 원리 및 방법에 따라 방사성 동위원소를 사용하여 신호를 검출하는 방사면역분석법(RIA: radio immunoassay), 효소에 의한 신호증폭을 사용하는 효소면역측정법(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay, 혹은 EIA: enzyme immunoassay), 형광을 이용하여 검출하는 형광항체법(FA: fluorescence antibody technique), 화학발광을 사용하는 화학발광면역측정법(CLIA: chemiluminescence immunoassay) 등으로 나눌 수 있으며, 그 밖에도 표지물질의 사용 방법이나 기질의 종류에 따라 다양한 분류가 가능하다. 여러 가지 면역분석법 중 현재 가장 많이 사용되고 있는 방법이 효소면역측정법이며, 상기 분석법은 항체의 활용 방법에 따라 직접효소면역측정법(Direct ELISA), 간접효소면역측정법(Indirect ELISA) 및 샌드위치효소면역측정법(Sandwich ELISA)의 3가지로 세분할 수 있다. 직접효소면역측정법은 고체표면에 고정된 항원에 효소와 연결된 항체(Enzyme-linked Antibody)가 결합하면 효소가 기질의 반응을 촉매 함으로써 신호를 생성하게 된다.
가장 널리 사용되는 형태인 샌드위치 효소 면역측정법은 검출하려는 하나의 항원에 대하여, 인식부위(epitope)가 다른 2종의 항체를 사용하는 것이며, 검출하고자 하는 항원에 대한 높은 선택성을 나타내어 진단용으로도 많이 사용이 되고 있다.
최근, 금과 실리카 등 다양한 종류의 나노입자들을 항체나 효소 표면에 결합시켜 검출 감도를 높이려는 활발한 시도가 있었다(Y. Wu, C. Chen, S. Liu, Anal. Chem., 81, 1600 (2009), H. S. Kim, B. K. Oh, BioChip J., 8, 1 (2014)). 도 1 은 나노파티클에 항체를 결합시킨 것을 보여주는 개념도로서, 도 1을 참고하면, 나노파티클에 항체를 결합시키면 항체 활성 영역(Fab 영역)이 나노파티클 표면에 부착되는 빈도가 높아 항체-항원 반응의 효율이 떨어지는 문제가 있었다. 이와 같이, 고감도로 타겟물질을 감지할 수 있는 탐침자(probe)에 대한 기술개발 요구가 여전히 존재한다. 또한 질병의 조기진단으로 인한 비용 절감 및 높은 치료율을 기대할 수 있는 민감한 진단 표지자에 대한 수요가 늘어나는 추세이다.
본 발명은 간편하고 신속하게 타겟물질을 고감도로 감지할 수 있는 탐침자를 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 양상은
나노입자 ;
상기 나노입자 표면에 부착되고, 항체의 Fc(crystalizable fragment) 영역에 특이적으로 결합하는 앱타머 ; 및
상기 앱타머와는 Fc 영역이 결합되고, 표적 항원과 결합가능한 Fab(antibody binding fragment) 영역이 앱타머의 바깥쪽으로 배향되는 복수개의 항체를 포함하는 표적물질 검출용 복합체에 관계한다.
다른 양상에서, 본 발명은
항체의 Fc(crystalizable fragment) 영역에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선별하는 단계 ;
나노입자에 상기 앱타머를 결합시키는 단계 ; 및
항체를 첨가하여 상기 앱타머와 상기 항체의 Fc(crystalizable fragment) 영역과 결합시키는 단계를 포함하는 표적물질 검출용 복합체 제조방법에 관계한다.
또 다른 양상에서 본 발명은
상기 어느 한 항의 복합체와 항체가 고정된 자성 미세입자를 표적 항원 함유된 용액에 첨가하여 항원-항체 반응시키는 단계 ;
자력을 이용하여 항원-항체 반응물을 분리 및 세척하는 단계 ; 및
상기 항원-항체 반응물을 실시간 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)으로 증폭시켜 상기 항체에 결합된 표적 항원의 양을 검출하는 단계를 포함하는 표적물질 검출방법.
본 발명의 표적항원 검출용 복합체는 나노입자와 항체를 연결하는 앱타머를 구비하는데, 이러한 앱타머는 항체의 Fc부분과 선택적으로 결합하므로 항체의 활성영역(Fab)을 노출시켜 표적 항원과의 반응율을 높이며, 또한, RT-PCR로 기하급수적으로 증폭되므로 고감도로 표적물질을 검출할 수 있다.
도 1 은 나노파티클에 항체를 결합시킨 것을 보여주는 개념도이다.
도 2는 본 발명의 표적항원 검출용 복합체의 개념도이다.
도 3은 상기 복합체를 제조하는 방법을 보여준다.
도 4는 항체가 고정된 MMPs(magnetic microparticles)를 제조하는 과정을 나타낸다.
도 5는 표적항원 검출용 복합체와 MMP를 이용한 항원 검출 방법을 나타낸다.
도 6는 실시예 1과 비교예 1에서 앱타머에 Fc 단백질과 Fab 단백질 조각을 흘려줘, Fc 특이적 앱타머에 대한 Fc 단백질과 Fab 단백질 조각의 결합 친화도를 SPR로 측정한 것이다.
도 7은 실시예 1과 비교예 2에서 앱타머와 11-MUA의 Fc 특이 상수를 측정한 것이다.
도 8은 실시예 1의 앱타머가 고정된 금 나노입자 제조에 대해 Zeta-potenital과 UV-vis 분광기로 흡수율을 측정한 것이다.
도 9는 실시예 1의 real-time PCR을 통한 나노탐침과 앱타머의 신호증폭효과를 측정한 것이다.
도 10는 실시예 2에서 농도에 따른 바이오마커 검출 결과를 RT-PCR로 측정한 Cp 값의 그래프를 보여준다.
본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체 예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
도 2는 본 발명의 표적항원 검출용 복합체의 개념도이다. 도 2를 참고하면, 상기 복합체는 금 나노입자(10), 앱타머(aptamer)(20) 및 항체(30)를 포함한다.
상기 나노입자는 표적 물질을 할 수 있는 탐침자로 사용되는 공지된 물질을 제한 없이 사용할 수 있으며, 일예로서, 금, 은 또는 실리카일 수 있다.
상기 나노입자의 크기도 제한이 있는 것은 아니지만, 나노사이즈의 크기를 가지는 것이 바람직하다. 상기 나노 입자는 사이즈가 작아 검출 민감도를 향상시킬 뿐만 아니라, 작은 분자와 표적물질을 검출하는데 용이하고 안정성이 높다. 상기 나노입자의 사이즈가 10~100nm, 바람직하게는 30nm일 수 있다.
상기 나노입자는 금 나노입자일 수 있으며, 상기 금 나노입자(10)는 상기 앱타머(aptamer)(20)의 S(황)이 상기 금 나노입자와 결합될 수 있다.
상기 앱타머(aptamer)(20)는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형핵산)을 의미하며, SELEX(SystematicEvolution of Ligands of Exponential enrichment)라는 공지된 방법으로 원하는 다양한 목적 물질 (단백질, 당, 염색물질, DNA,금속이온, 세포 등)에 대한 앱타머를 개발할 수 있다.
본 발명에서는 일단이 상기 항체(30) Fc 영역에 특이적으로 결합되는 앱타머를 선별하여 사용한다. 그 결과, 상기 항체의 Fab(antibody binding fragment) 영역이 앱타머 반대방향으로 배향된다.
또한, 상기 앱타머(aptamer)(20)는 실시간 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)으로 증폭되어 상기 항체에 결합된 표적 항원의 양을 검출할 수 있다.
상기 항체(30)는 표적물질인 항원과 면역반응을 수행하는 것으로서, 검출하려는 항원의 종류에 따라 적절하게 부착될 수 있다.
도 1 및 도 2를 참고하면, 본원발명의 상기 항체(30)는 Fab(antibody binding fragment) 영역이 앱타머와 결합하지 않고 앱타머 반대방향으로 배향되므로 항원과의 반응율이 높다. 따라서, 본원발명의 복합체 구조는 종래도 1의 구조에 비해 항원-항체 반응율이 높아지므로 센서의 측정능력을 향상시킬 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 표적항원 검출용 복합체 제조방법에 관계한다. 도 3은 상기 복합체를 제조하는 방법을 보여준다.
도 3을 참고하면, 본 발명의 복합체 제조방법은 항체의 Fc(crystalizable fragment) 영역에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선별하는 단계, 나노입자에 상기 앱타머를 결합시키는 단계 및 항체를 첨가하여 상기 앱타머를 상기 항체의 Fc(crystalizable fragment) 영역과 결합시키는 단계를 포함한다.
상기 앱타머를 선별하는 단계는 먼저 후보군 핵산 라이브러리를 만든 후 친화 크로마토그래피 법을 이용해 결합하지 않은 핵산 구조체는 제거하고 표적분자(항원)에 선택적으로 결합한 핵산을 분리한다. 이와 같은 과정을 10~15번 반복하여 표적물질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선별한다.
상기 나노입자에 상기 앱타머를 결합시키는 단계는 상기 나노입자와 상기 앱타머를 1 : 2000~3000, 바람직하게는 1 : 2500(몰비) 내외로 혼합할 수 있다.
예를 들면, 상기 나노입자에 상기 앱타머를 결합시키는 단계는 나노 입자 용액과 티올-앱타머 함유 용액 및 블록킹 물질인 BSA를 혼합하고 배양하는 단계를 포함한다.
상기 항체를 첨가하여 상기 앱타머를 상기 항체의 Fc(crystalizable fragment) 영역과 결합시키는 단계는 상기 나노입자-앱타머 복합체에 항체와 BSA를 첨가하는 단계이다.
상기 방법은 앱타머가 항체의 Fc(crystalizable fragment) 영역에 특이적 결합하기 때문에 Fab(antibody binding fragment) 영역이 바깥으로 노출되어 표적항원과의 결합이 용이해진다.
상기 앱타머는 실시간 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)으로 증폭되어 상기 표적 항원의 양이 고감도로 검출된다.
도 4는 항체가 고정된 MMPs(magnetic microparticles)를 제조하는 과정을 나타낸다. 도 5는 표적항원 검출용 복합체와 MMP를 이용한 항원 검출 방법을 나타낸다.
도 5를 참고하면, 상기 방법은 항원-항체 반응 단계, 분리 단계 및 실시간 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR) 단계를 포함한다.
상기 항원-항체 반응 단계는 표적항원 검출용 복합체와 항체가 고정된 MMPs(magnetic microparticles)를 표적 항원이 함유된 용액에 첨가하여 항원-항체 반응시키는 단계이다.
상기 표적항원 검출용 복합체는 앞에서 서술한 금 나노입자 복합체에 Fc(crystalizable fragment) 특이적 앱타머가 고정되고, 상기 앱타머에 항체가 결합된 복합체이다.
상기 표적항원 검출용 복합체를 분리하기 위해 항체가 고정된 MMPs(magnetic microparticles)를 사용할 수 있다.
도 4를 참고하면, 항체가 고정된 MMPs(magnetic microparticles)를 제작하는 단계는 MMPs(magnetic microparticles)(210)와 항체 Fc(crystalizable fragment) 영역에 특이적 결합을 하는 단백질(220)을 결합하는 단계 ; 및 항체(230)가 단백질과 결합되는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단백질로는 Protein G, Protein A, FcBP(Fc-binding peptide) 등이 있다.
상기 항체가 고정된 MMPs는 금 나노입자 복합체와 샌드위치 구조로 항원과 결합된 후 자력으로 미반응물과 분리 및 세척될 수 있다. 따라서, 본 발명의 검출방법은 단순하고 빠르게 항원을 고감도로 검출할 수 있다.
상기 실시간 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR) 단계는 항원-항체 반응물을 실시간 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)으로 증폭시켜 상기 항체에 결합된 표적 항원의 양을 검출한다. 즉, 상기 앱타머가 실시간 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)으로 증폭되므로 상기 항체에 결합된 표적 항원의 양을 고감도로 검출할 수 있다.
상기 실시간 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)은 실시간으로 진행되는 PCR 반응을 모니터하는 데 사용되는 기법으로서, 상대적으로 적은 양을 정량화할 수 있고, 결합의 특이성 및 분리의신속성 개선 및 검출의 민감도와 정확성을 제고할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시 예를 제시하지만, 하기의 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
항체의 Fc(crystalizable fragment)영역에 특이적으로 결합하는 앱타머
선별
후보군 핵산 라이브러리를 만든 후 친화 크로마토그래피 법을 이용해 결합하지 않은 핵산 구조체는 제거하고 표적분자(항원)에 선택적으로 결합한 핵산을 분리한다. 이와 같은 과정을 10~15번 반복하여 표적물질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선별하였다.
선별된 앱타머 특성 분석
SELEX 버퍼에 5' 티올-변형된 앱타머가 포함된 앱타머 용액이나 에탄올/글리세롤 (50/50) 용액에 11-MUA가 포함된 용액에 금 기질(substrate)를 가라앉혀 금 표면 상에 앱타머 층을 제조하였다. 이어서, 기질을 SELEX 버퍼로 세척하였다. 앱타머 특징을 분석하기 위해 BIACORE 3000 으로 SPR 신호를 검출하였다. 모든 SPR 실험은 금표면에 고정된 앱타머나 11-MUA를 포함한 SELEX 버퍼(SELEX buffer as a running : 50 mM Tris-HCl, 4.8 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2,15mMNaN3,pH7.4)로 실시하였다. 용액을 1분에 5μL의 속도로 첨가하고, 반응이 완료되면 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)로 보호(blocking)하였다. 이어서, SELEX 버퍼에 든 단백질(Fab, Fc 조각 단백질이나 항체)용액( 50 μg/mL, 100 μL)을 첨가하고, 결합되지 않은 물질을 러닝버퍼를 흘려서 제거하였다. IgG(immunoglobulin G)에 대한 앱타머의 반응성을 화학링커(chemical linker)와 비교하기 위해 Fc 특이 상수(Fc specific constant)를 계산하였다.
MMP 탐침의 제조
Dynabeads M-280(Tosyl기 활성화)를 물에 분산시켰다. 분산액 33.3㎕(30 mg/ml)를 1.5ml 튜브로 옮기고 자석 위에 위치시켰다. 상층액을 제거하고, 0.1M의 보레이트 버퍼(pH 9.5) 용액1mL를 상기 용액에 첨가하여 토실기(tosyl group)를 아민기로 치환하였다. 상기 용액을 2분정도 격렬하게 혼합한 후 자석 위에 놓았다. 상층을 제거하고 상기 치환 단계를 반복하였다. 자성미세입자를 분리한 후에 0.1M 1ml 보레이트 버퍼와 4㎕ 단백질 G용액(5mg/mL)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 37℃에서 18시간정도 인큐베이팅 시켜 단백질G를 Dyabeads M-280(Tosyl기 활성화)에 고정 시킨다. 상기 고정 반응 후에 분리는 자력을 이용하였다. 상층액을 다시 제거하였다. 비드에 고정된 단백질 상대적 흡광도를 측정하기 위해 상층액을 UV-vis 분광기로 측정하였다. 0.1% BSA와 0.05% Tween20(washing buffer)가 포함된 PBS 용액을 분리된 비드에 넣어주었다. 상기 혼합물을 2분간 격렬하게 혼합한 뒤 자석으로 분리한 후 상층액을 제거하였다. 세척단계를 반복하였다. 6% BSA(blocking buffer)가 포함된 PBS 용액을 분리된 비드에 넣어주고 37℃에서 1시간동안 인큐베이팅 시켜 보호시켜주었다. 보호단계가 끝난 후, 자력 분리를 한 후, 워싱 버퍼를 첨가해 주었다. 상기 혼합물을 격렬하게 혼합한 뒤 자력으로 분리하였다. 세척단계를 두 번 이상 반복하였다. Pab 용액(3 , 5.6 mg/mL)을 상기 혼합물에 첨가하고, 상온에서 2시간동안 인큐베이팅 시켜준다. 반응이 끝나면, 자력분리를 해서 상층액을 제거하였다. 상층액을 UV-vis 분광기로 측정해 고정된 항체를 식별하였다. 워싱 버퍼를 비드에 넣어주고 상기 혼합물을 격렬하게 혼합하고 자력으로 분리하고, 상층액을 제거하였다. 세척과정을 두 번 이상 반복하고, 보호 단계를 진행하였다. 이어서, 세척과정을 세 번 이상 반복하고, 최종 산물을 0.1% BSA가 포함된 PBS용액에 재현탁 시키고 4℃에서 저장하였다.
앱타머가 고정된 금 나노 입자 탐침의 제조
30 nm의 금 나노 입자 용액 2 ㎖를 티올 앱타머 용액 10 μL (100 μM)과 혼합 하였다. 상기 혼합용액을 상온에서 16시간 인큐베이팅 하였다. 16시간 후, 100 mM의 인산염 완충액(247.8 μL)이 포함된 10 % SDS (2.2 μL)용액을 콜로이드에 첨가하고 앱타머가 중화될 수 있게 0.5시간 인큐베이팅 하였다. 이어서, 250 μL의 염이 첨가될 때까지 2 M 염화나트륨 수용액 50 μL를 매 4시간마다 첨가하였다. 중화 후, 보호(blocking) 용액(6% albumin from bovine serum (BSA) and 0.05% Tween 20 in PBS (pH 7.4, 10 mM)) 첨가한 후, 37℃에서 1시간동안 인큐베이팅 하였다. 보호 후, 용액을 두 개의 튜브에 나눠담고 13000 rpm에서 20분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 입자를 워싱 버퍼(10 mM PBS solution, pH 7.4, 0.1% BSA, 0.05% Tween 20)에 재현탁 하였다. 원심분리를 세 번 반복하였다. 최종 금 나노입자 탐침을 SELEX버퍼에 재현탁 하였다. Mab 용액(1.8 mg/mL, 2 μL)을 각각의 튜브에 첨가하고 37℃에서 2시간동안 인큐베이팅 하였다. 반응이 끝나면 입자들을 13000rmp 에서 20분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 입자들을 워싱 버퍼로 재현탁 하였다. 원심분리를 다섯 번 더 반복하였다. 최종 금 나노 탐침을 0.1%BSA가 포함된 PBS 버퍼에 재현탁 하였다. 탐침을 식별하기 위해 용액을 UV-vis 분광기로 측정하였다.
PCR을 이용한 표적 바이오마커의 검출
Prostate specific antigen(PSA)용액을 100μL PBS용액(10 aM, 1 fM, 100 fM, 10 pM, and 1 nM)으로 희석시켰다. MMP 탐침(100 μL, 6.6 × 106 in number) 과 앞에서 제조된 50μL (앱타머가 고정된) 금 탐침 (1.0 × 1010 in number)을 희석된 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 37℃에서 25분 동안 인큐베이팅 하였다. 이어서, 자기 분리한 후, 상층액을 제거하였다. 워싱 버퍼를 각각 분리된 혼합물에 첨가하고, 상층액을 제거하였다. 세척 단계를 두 번 이상 반복 하였다. 최종 상층액을 제거하고 증류수 250μL를 넣고 20℃에서 20분간 인큐베이팅 하였다. 이어서, 혼합물을 자석위에 놓고 상층액을 PCR튜브로 옮겨 얼음에 보관하였다.
실시예 2 ; PCR을 이용한 표적 바이오마커의 검출
실시예 2는 표적물질로 PSA 대신에 E. coli O157:H7를 사용하였다.
먼저, E. coli O157:H7 (E. coli)를 1 OD (109cfu/mL)까지 37℃에서 LB배지에 배양하고 배양된 대장균을 4℃에 보관하였다. 대장균 100μL 원액을 13000 rpm으로 1분간 원심분리하고, 0.1% BSA(100μL)가 포함된 PBS 용액(pH 7.4)을 첨가하였다. 상기 용액을 107,106,105,104,103,102cfu/mL에 100μL의 부피로 희석시켰다. 100μL의 MMP탐침(6.7 × 106 in number)과 50μL (앱타머가 고정된) 금 탐침(1.0 × 1010 in number)을 각각의 희석된 용액에 첨가한 후 혼합물을 37℃에서 25분간 인큐베이팅 하였다. 이어서, 자기분리 후 상층액을 제거하였다. 워싱 버퍼를 각각 분리된 산물에 첨가하고 상층액을 제거하였다. 세척 과정을 두 번 더 반복하고 최종 상층액을 제거하였다. 이어서, 증류수 250μL를 첨가하고 20℃에서 20분간 인큐베이팅 하였다. 인큐베이팅 후, 상기 혼합물을 자석위에 놓고 상층액을 PCR 튜브에 옮겨 얼음에 보관하였다.
비교예 1
비교예 1은 실시예 1의 Fc 특이적 앱타머 선별에서 고정된 앱타머에 Fc 단백질 조각대신 Fab 단백질 조각을 흘려주는 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
비교예 2
비교예 2는 실시예 1의 Fc 특이적 앱타머 선별에서 SELEX 버퍼에 5' 티올-변형된 앱타머가 포함된 용액 대신 에탄올/글리세롤 (50/50) 용액에 11-MUA가 포함된 용액을 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
비교예 3
비교예 3은 앱타머가 고정된 나노탐침을 사용해서 민감하고 다양한 바이오 마커 검출을 위해 단백질 마커인 PSA와 병원성 미생물인 E. coli O157:H7을 바이오 마커로 사용하였다.
도 6는 실시예 1과 비교예 1에서 앱타머에 Fc 단백질과 Fab 단백질 조각을 흘려줘, Fc 특이적 앱타머에 대한 Fc 단백질과 Fab 단백질 조각의 결합 친화도를 SPR로 측정한 것이다. 도 6를 참고하면 앱타머에 대한 친화도가 Fc 단백질이 Fab 단백질 보다 세배 높은 것을 알 수 있다. 이것은 Fc 특이적 앱타머를 이용 할 때, 효과적인 항체배열을 통해 항원에 대한 더 많은 활성부위를 노출시키는 것이 가능함을 확인할 수 있다.
도 7은 실시예 1과 비교예 2에서 앱타머와 11-MUA의 Fc 특이 상수를 측정한 것이다. 도 7을 참고하면 항체가 잘 배향된 Fc 특이적 앱타머의 Fc 특이 상수는 11-MUA보다 2.4배 높은 것을 확인 할 수 있다. 이것은 Fc 특이적 앱타머를 사용해 항원(표적물질)에 대한 비활성 부위의 노출을 줄이고 활성부위의 노출을 증가시킴으로서, 훨씬 더 민감하고 선택적인 검출이 가능함을 확인할 수 있다.
도 8은 실시예 1의 앱타머가 고정된 금 나노입자 제조에 대해 Zeta-potenital과 UV-vis 분광기로 흡수율을 측정한 것이다. 도 8은 금 나노입자에 앱타머-항체 순으로 부착할 때, 금 나노 입자의 표면 전하가 변화하는 것과 Uv/vis 흡수율 그래프가 오른쪽으로 이동하는 것을 보여준다. 이것은 앱타머가 부착된 금 나노입자를 성공적으로 제조했음을 확인할 수 있다.
도 9는 실시예 1의 real-time PCR을 통한 나노탐침과 앱타머의 신호증폭효과를 측정한 것이다. 앱타머의 경우 검출 한계가 0.1 fM이고, 금 나노탐침의 검출한계는 1mL 당 50 probes, 즉 0.08 aM 이다. 도 9를 참고하면 신호 탐침으로서 금 나노 탐침과 앱타머를 비교할 때, 탐침 농도의 검출한계가 1000배 차이 나는 것을 알 수 있다. 이것은 앱타머가 신호 향상물질로써 적합하고 금 나노탐침이 앱타머에 비해 훨씬 더 민감하다는 것을 보여준다.
도 10는 실시예 2에서 농도에 따른 바이오마커 검출 결과를 RT-PCR로 측정한 Cp 값의 그래프를 보여준다. 도면 10를 참고하면, PSA 농도 10 aM에서 1 nM에 대한 Cp의 변화가 PSA의 농도와 선형관계를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 즉, 도 10은 본 발명의 센서가 PSA의 폭 넓은 농도에 대한 검출이 가능하고, 기존의 검출 방식인 ELISA 보다 훨씬 낮은 검출한계(10 aM)를 가진다는 것을 보여준다. 도 10을 참고하면, E. coli O157:H7 농도 100 cfu/mL에서 107 cfu/mL 에 한 Cp의 변화가 E. coli O157:H7의 농도와 선형관계를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 이것은 E. coli O157:H7에 대해 100 cfu/mL의 검출한계를 가짐을 보여준다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 속하는 것으로, 본 발명의 구체적인 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.

Claims (11)

  1. 나노입자 ;
    상기 나노입자 표면에 부착되고, 항체의 Fc(crystalizable fragment) 영역에 특이적으로 결합하는 앱타머 ; 및
    상기 앱타머와는 Fc 영역이 결합되고, 표적 항원과 결합가능한 Fab(antibody binding fragment) 영역이 상기 앱타머와 반대방향으로 배향되는 복수개의 항체를 포함하되.
    상기 앱타머는 실시간 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)으로 증폭되어 상기 항체에 결합된 표적 항원의 양을 검출하는 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출용 복합체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 나노입자는 금, 은 또는 실리카인 것을 특징으로 하는 표적물질 검출용 복합체.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 나노입자는 10~100nm의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출용 복합체.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 나노입자가 금인 경우, 상기 앱타머의 S(황)이 상기 금 나노입자와 결합하는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출용 복합체.
  5. 삭제
  6. 항체의 Fc(crystalizable fragment) 영역에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선별하는 단계 ;
    나노입자에 상기 앱타머를 결합시키는 단계 ; 및
    항체를 첨가하여 상기 앱타머와 상기 항체의 Fc(crystalizable fragment) 영역과 결합시키는 단계를 포함하되,
    상기 앱타머는 실시간 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)으로 증폭되어 상기 항체에 결합된 표적 항원의 양을 검출하는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출용 복합체 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 나노입자와 상기 앱타머는 1 : 2000~3000의 몰비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출용 복합체 제조방법.
  8. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 복합체와 항체가 고정된 자성 미세입자를 표적 항원이 함유된 용액에 첨가하여 항원-항체 반응시키는 단계 ;
    자력을 이용하여 항원-항체 반응물을 분리 및 세척하는 단계 ; 및
    상기 항원-항체 반응물을 실시간 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)으로 증폭시켜 상기 항체에 결합된 표적 항원의 양을 검출하는 단계를 포함하는 표적물질 검출방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 자성 미세 입자는 표면에 코팅된 상기 항체의 Fc 부분에 선택적 결합을 유도하는 단백질을 포함하고, 상기 단백질이 상기 항체의 Fc 영역과 결합된 것을 특징으로 하는 표적물질 검출방법.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 항체가 고정된 자성 미세 입자를 제조하는 방법은 자성입자에 항체 Fc(crystalizable fragment)부분에 특이적 결합을 하는 단백질을 고정하는 단계 및 항체가 단백질과 반응을 통해 결합되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출방법.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 단백질은 Protein G, Protein A, FcBP(Fc-binding peptide)인 것을 특징으로 하는 표적물질 검출방법.
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