JP7311933B2 - 金ナノ粒子－アプタマー結合体をベースとする抗体伝達体およびその製造方法 - Google Patents

金ナノ粒子－アプタマー結合体をベースとする抗体伝達体およびその製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、金ナノ粒子－アプタマー結合体をベースとする抗体伝達体およびその製造方法に関し、より具体的には、金ナノ粒子に免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ、ＩｇＧ）特異的なアプタマーを結合して、細胞内への抗体伝達能が向上した抗体伝達体およびその製造方法に関する。
本出願は、２０１９年０６月０５日に出願された韓国特許出願第１０－２０１９－００６６４９１号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書および図面に開示されたすべての内容は本出願に援用される。
抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、生物体が去る約４０億年間進化するに伴って保有することになった最も高効率的に外部物質を認知し結合しうる生体分子である。抗体は、Ｙ 字形の免疫グロブリン分子であって、標的分子である抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）を特異的に認識し、高い親和力で結合することによって、脊椎動物の免疫システムに中枢的な役割を担当する。一般的に、抗体は、Ｂリンパ球から分泌されたり、Ｂリンパ球の表面に発現し、各個体ごとに高い多様性を示す。このような多様性と特異性を用いて生体内標的物質である病原体や毒素中和剤として使用したり、免疫成分の補充（補体、食菌作用増進、ナチュラルキラー細胞による細胞毒性抗体など）と色々な診断手続きまたは特定対象を破壊するための治療にも使用できる。
特にモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｍＡｂ）は、細胞外または細胞内抗原標的に対する高い特異性によって多数の病気を治療するために全世界的に臨床使用が承認された。最初のモノクローナル抗体が１９８６年に許可された以来、現在まで約５０個のモノクローナル抗体がＦＤＡにより承認された。医学で使用される抗体ベースの治療法は、タンパク質－タンパク質の相互作用を妨害したり、シグナル伝達経路を抑制することによって、目標とするタンパク質をターゲッティングすることができる。しかしながら、これらの抗体の大部分は、標的細胞内に伝達できないので、ＦＤＡで承認された抗体の大部分は、細胞の表面に露出した受容体を標的とする抗体である。例えば、過発現し、表面に露出したＨＥＲ２受容体を標的とするトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ／Ｈｅｒｃｌｏｎ）は、ＨＥＲ２陽性乳がん患者の治療に効果的に使用される。
抗体が標的細胞内の生体分子と結合して有用な治療剤として使用されるためには、抗体が細胞内に伝達されなければならない重要な問題が克服されるべきであり、ナノバイオ技術の発展に伴って、多様なナノ伝達体を使用して抗体を細胞内に伝達するための努力が続いてきた。しかしながら、膜透過ペプチド、ヒアルロン酸、キトサン、デキストラン、多価不飽和脂肪酸、デンドリマー、カーボンナノチューブなど多様な材料を使って抗体を細胞内に伝達させたが、試験管で培養した細胞への伝達にのみとどまり、生体内への伝達は効果的でない結果を得ている。さらに、今まで開発された技術は、特定抗体の包装および変形を通じて限定的な用途にのみ使用可能であった。
したがって、細胞毒性なしで哺乳動物生命体に抗体を容易かつ効率的に伝達するための伝達体に関する研究が急務である。
なお、金ナノ粒子（Ｇｏｌｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ，ＡｕＮＰｓ）は、治療剤および診断用造影剤として開発された新しいナノ物質の一つであって、現在映像医学においてＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｌｏｇｙ）、ＰＡ（ｐｈｏｔｏ ａｃｏｕｓｔｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ）、ＯＣＴ（ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ ｔｏｍｏｌｏｇｙ）などにおいて造影剤として広く用いられており、特にＣＴ造影剤として用いられている。金（Ａｕ）は、従来のヨード造影剤に比べてＸ線吸収率が高く、分子量が大きいため、ゆっくり排出されて、イメージ化時間が長く、生体親和性が高くて毒性が少なく、従来のＣＴ造影剤より少量を使用でき、造影剤としての活用性を高めることができる。また、ＡｕＮＰは、生体内安定性に優れていて、多様な分子の付着に使用できる大きい表面積特有の特性を有しており、ペプチドおよび核酸のような生体分子を細胞内に伝達して細胞治療剤として使用できる潜在力を保有している。
アプタマーは、短い長さのオリゴマーであって、安定した三次構造の形成を通じて標的物質と高い親和性をもって特異的に結合する特徴を有しており、化学的合成技法を用いて、短時間かつ低費用で大量生産が可能であり、バッチ間変動（ｂａｔｃｈ ｔｏ ｂａｔｃｈ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）が殆どないため、生産的な観点から卓越した長所を有してる。それだけでなく、周辺のｐＨと温度に非常に安定性が高くて、最近、標的物質の探知および疾患診断センサーの開発など環境、医療など多様な分野における活用可能性が高く評価されている。
これより、本発明者らは、生体内安定性に優れた金ナノ粒子にアプタマーを結合した抗体伝達体を開発して、抗体を効率的に伝達することによって、病気の診断または治療に活用しようとした。
免疫グロブリンのうちで、免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ、ＩｇＧ）が最も豊富であり、本発明者らは、分析、新薬開発および親和性精製のための潜在的応用に適用して使用するために、ＩｇＧに対するアプタマー研究を進めた結果、マウスＩｇＧ－Ｆｃドメインの共通部位に結合できるＤＮＡアプタマーおよび蛍光物質であるＦＩＴＣに結合できるＤＮＡアプタマーを金ナノ粒子に結合して、抗体を細胞内に伝達するための新しい伝達体を開発して、本発明を完成した。
これより、本発明の目的は、金ナノ粒子と、前記金ナノ粒子の表面に結合するアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）と、を含む、抗体伝達体を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、金ナノ粒子にアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）を結合させる段階を含む、抗体伝達体の製造方法を提供することにある。
しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、以下の記載から本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が明確に理解できる。
上記目的を達成するために、本発明は、金ナノ粒子と、
前記金ナノ粒子の表面に結合するアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）と、を含む、抗体伝達体を提供する。
また、本発明は、金ナノ粒子にアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）を結合させる段階を含む、抗体伝達体の製造方法を提供する。
本発明の一具現例として、前記アプタマーは、免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ、ＩｇＧ）のＦｃドメインまたは蛍光物質であるＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）に特異的に結合するアプタマーであってもよい。本発明の他の具現例として、前記ＩｇＧのＦｃドメインに特異的に結合するアプタマーは、配列番号１の塩基配列からなるものであってもよい。
本発明のさらに他の具現例として、前記ＦＩＴＣに特異的に結合するアプタマーは、配列番号２の塩基配列からなるものであってもよい。
本発明のさらに他の具現例として、前記抗体伝達体は、前記アプタマーにＩｇＧ、ＰＡＲＰ１、ＶＰ６、ＮＳＤ２、Ａｕｒｏｒａ Ａ、Ｐａｘ５、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｒｏｃｋ－１、Ｒｏｃｋ－２、ＲｈｏＥ、Ｐ５３、Ｍｃｌ－１、Ｐ５０、およびＢＲＡＦからなる群から選択される一つ以上のモノクローナル抗体を結合して細胞内に伝達できる。
本発明のさらに他の具現例として、前記金ナノ粒子は、１０～２０ｎｍの直径を有するものであってもよい。
本発明のさらに他の具現例として、前記抗体伝達体は、細胞の核、細胞質、およびミトコンドリアからなる群から選択される一つ以上の内部に抗体を伝達できる。
また、本発明は、前記抗体伝達体と伝達しようとする抗体とが結合してなる複合体を提供する。
また、本発明は、前記抗体伝達体と伝達しようとする抗体とが結合してなる複合体を有効成分として含む、がんの予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、前記抗体伝達体と伝達しようとする抗体とが結合してなる複合体を含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、がんの予防または治療方法を提供する。
また、本発明は、前記抗体伝達体と伝達しようとする抗体とが結合してなる複合体を有効成分として含む薬学的組成物の、がんの予防または治療用途を提供する。
また、本発明は、前記抗体伝達体と伝達しようとする抗体とが結合してなる複合体の、がんの予防または治療に用いられる薬剤を生産するための用途を提供する。
本発明による抗体伝達体は、金ナノ粒子にＩｇＧ Ｆｃドメイン特異的なアプタマーまたはＦＩＴＣ特異的なアプタマーが結合されており、前記アプタマーに伝達しようとする抗体を特異的に結合して、細胞の核、細胞質だけでなく、ミトコンドリアに抗体を効果的に伝達できる。また、非常に少ない細胞毒性を有する金ナノ粒子を用いて人体に無害なだけでなく、多様な波長で光を反射して細胞内での位置を容易に確認できるところ、病気の診断または治療に有用に用いられるものと期待される。
本発明の一具現例による金ナノ粒子にＩｇＧ－Ｆｃドメイン特異的に結合するＤＮＡアプタマーと抗体を結合してアプタマー－金ナノ粒子－抗体複合体を製造する概略的な模式図を示す図である。 本発明の一具現例によるＡｕＮＰ－ＡｐｔＩｇＧによる抗体のＨｅＬａ細胞内への伝達能を共焦点顕微鏡イメージで確認した図である。 本発明の一具現例によるＡｕＮＰ－ＡｐｔＩｇＧによる抗体のＡ５４９細胞内への伝達能を共焦点顕微鏡イメージで確認した図である。 本発明の一具現例によるＡｕＮＰ－ＡｐｔＦＩＴＣによる抗体のＭａｌｍｅ－３Ｍ細胞およびＳＫ－Ｍｅｌ２細胞内への伝達能を共焦点顕微鏡イメージで確認した図である。 本発明の一具現例によるＡ２０５８、Ｍａｌｍｅ－３Ｍ、およびＳＫ－ＭＥＬ２細胞にＡｕＮＰ－ＡｐｔＩｇＧ－ＢＲＡＦＶ６００Ｅを濃度を異ならせて（０、０．８８、１．６５および３．３ｎＭ）処理し、培養した後、細胞生存能を測定した結果を示す図である。
本発明は、金ナノ粒子と、
前記金ナノ粒子の表面に結合するアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）と、を含む、抗体伝達体を提供する。
本発明において、「ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）」とは、ナノ単位の直径を有する多様な物質の粒子を意味し、前記ナノ粒子は、ナノサイズを有する粒子であれば、特に制限されない。
本発明において、「金ナノ粒子」とは、ナノ単位の直径を有する金の金属粒子を意味し、このような小さい粒子サイズは、本発明のナノ粒子が目的の細胞（例えば、ヒト細胞）に浸透することを容易にして、細胞内にタンパク質伝達体の浸透を可能にする。
金ナノ粒子は、安定した粒子の形態で製造が容易なだけでなく、０．８ｎｍから２００ｎｍまで多様に使用目的に合わせてサイズを変化させることができる。また、金は、多様な種類の分子、例えばペプチド、タンパク質、核酸などと共に結合して構造を変形させることができ、多様な波長で光に反射するところ、これを用いて細胞内での位置を容易に確認できる。しかも、金ナノ粒子は、マンガン、アルミニウム、カドニウム、鉛、水銀、コバルト、ニッケル、ベリリウムなどの重金属とは異なって、人体に無害で、高い生体親和性を有し、非常に少ない細胞毒性を有するという長所がある。また、金ナノ粒子は、直径が１００ｎｍ以上と大きくなる場合、ナノ粒子としての特性が消滅すると共に、ナノ物質の特性を有しない金表面とチオール基などの官能基との結合が弱くなり、直径が１０～２０ｎｍ以外の金ナノ粒子は細胞毒性を誘発するので、本発明において、金ナノ粒子は、直径が１０～２０ｎｍのサイズを有することが好ましいが、これに制限されるものではない。
本発明において、「アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）」とは、オリゴヌクレオチド物質であって、それ自体で安定した三次構造を有し、標的分子に高い親和性と特異性で結合できる特徴を有する一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは修飾核酸）を意味し、化学的に合成が可能であり、熱とｐＨ変化に対して比較的に柔軟な特徴を有しており、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｏｆ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）という方法で所望の多様な目的物質（タンパク質、ペプチド、脂質、無機化合物、低分子有機物質、糖、染色物質、ＤＮＡ、金属イオン、細胞、抗生剤など）に対するアプタマーを開発できる。
本発明において、前記アプタマーは、免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ、ＩｇＧ）のＦｃドメインに特異的に結合するアプタマーであって、配列番号１の塩基配列からなるものであってもよく、伝達される抗体に標識された蛍光物質であるＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）に特異的に結合するアプタマーであって、配列番号２の塩基配列からなるものであってもよい。この際、前記アプタマーの配列は、全部３’末端がチオール基で修飾されたものであってもよい。
本発明による抗体伝達体は、金ナノ粒子に結合されたＩｇＧ Ｆｃドメイン特異的なアプタマーが、伝達しようとする抗体のＦｃドメインに特異的に結合して、細胞内に抗体を効果的に伝達でき、この際、前記抗体伝達体は、前記アプタマーにＩｇＧ、ＰＡＲＰ１、ＶＰ６、ＮＳＤ２、Ａｕｒｏｒａ Ａ、Ｐａｘ５、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｒｏｃｋ－１、Ｒｏｃｋ－２、ＲｈｏＥ、Ｐ５３、Ｍｃｌ－１、Ｐ５０、およびＢＲＡＦからなる群から選択される一つ以上のモノクローナル抗体を結合して細胞内に伝達できるが、前記抗体の種類に制限されるものではない。
また、本発明による抗体伝達体は、金ナノ粒子が結合したＦＩＴＣ特異的なアプタマーが、伝達しようとする抗体に標識された蛍光物質であるＦＩＴＣに特異的に結合して、細胞内に抗体を伝達でき、この際、前記ＦＩＴＣが標識された抗体であれば、その種類に特に制限はないが、本発明の具体的な実施例によれば、前記抗体伝達体は、ＩｇＧに標識されたＦＩＴＣに特異的に結合して、細胞内にＩｇＧを伝達できる。
本発明において、前記抗体伝達体は、細胞内に抗体を伝達でき、例えば、細胞の核、細胞質、およびミトコンドリアからなる群から選択される一つ以上の内部に抗体を伝達できる。
また、本発明は、金ナノ粒子にアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）を結合させる段階を含む、抗体伝達体の製造方法を提供する。
この際、前記抗体伝達体は、金ナノ粒子に、ＩｇＧのＦｃドメインに特異的に結合するアプタマーを結合させて製造することができ、ＦＩＴＣに特異的に結合するアプタマーを結合させて製造することもできる。
また、本発明は、前記抗体伝達体と伝達しようとする抗体とが結合してなる複合体を提供する。
また、本発明は、前記抗体伝達体と伝達しようとする抗体とが結合してなる複合体を有効成分として含む、がんの予防または治療用薬学的組成物を提供する。
本発明において使用される用語、「予防」とは、本発明による組成物の投与によってがんを抑制させたり発病を遅延させるすべての行為を意味する。
本発明において使用される用語、「治療」とは、本発明による組成物の投与によってがんに対する症状が好転したり有益に変更されるすべての行為を意味する。
本発明において使用される用語「薬学的組成物」は、がんの予防または治療を目的に製造されたものを意味し、それぞれ通常の方法によって多様な形態で剤形化して使用できる。例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップなどの経口型剤形で剤形化でき、クリーム、ゲル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、パスタ（ｐａｓｔｅ）剤またはカタプラズマ剤などの皮膚外用剤、坐剤および滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用できる。
本発明による薬学的組成物は、薬学的組成物の製造に通常的に使用する適切な担体、賦形剤および希釈剤をさらに含んでもよい。この際、組成物に含まれ得る担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、オリゴ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネシウムステアレートおよび鉱物油が挙げられる。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使って調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調製される。また、単純な賦形剤以外に、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、頻用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、色々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用できる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用できる。
本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与したり、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）でき、投与量は、患者の状態および体重、病気の程度、薬物形態、投与経路および時間によって異なるが、当業者により適宜選択できる。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスクの割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素およびその他医学分野によく知られた要素によって決定できる。本発明による薬学的組成物は、個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与でき、従来の治療剤とは順次または同時に投与でき、単一または多重投与できる。前記要素を全部考慮して副作用なしで最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者により容易に決定できる。投与は、１日に１回投与することができ、数回に分けて投与することもできる。
本発明において、「がん」は、細胞が正常な成長限界を無視し、分裂および成長する攻撃的（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）特性、周囲組織に浸透する浸透的（ｉｎｖａｓｉｖｅ）特性、および体内の他の部位に広がる転移的（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ）特性を有する細胞による病気を総称する意味である。本発明において、前記がんは、肝がん、乳がん、血液がん、前立腺がん、卵巣がん、すい臓がん、胃がん、大腸がん、脳がん、甲状腺がん、膀胱がん、食道がん、子宮頸がん、皮膚がん、および肺がんからなる群から選択される１種以上であってもよいが、これらに制限されるものではない。
また、本発明は、前記抗体伝達体と伝達しようとする抗体とが結合してなる複合体を含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、がんの予防または治療方法を提供する。
また、本発明は、前記抗体伝達体と伝達しようとする抗体とが結合してなる複合体を有効成分として含む薬学的組成物の、がんの予防または治療用途を提供する。
また、本発明は、前記抗体伝達体と伝達しようとする抗体とが結合してなる複合体の、がんの予防または治療に用いられる薬剤を生産するための用途を提供する。
また、本発明は、前記複合体を個体に投与する段階を含む抗体伝達方法を提供する。
本発明において、「個体」とは、病気の診断または治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒトまたは非ヒトである霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、ラット（ｒａｔ）、イヌ、ネコ、ウマおよびウシなどの哺乳類を意味する。
本発明において、「投与」とは、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の複合体を提供することを意味する。
本発明の一実施例において、金ナノ粒子にＩｇＧ Ｆｃドメイン特異的なアプタマーを結合した抗体伝達体（ＡｕＮＰ－ＡｐｔＩｇＧ）およびＦＩＴＣ特異的なアプタマーを結合した抗体伝達体（ＡｕＮＰ－ＡｐｔＦＩＴＣ）を製造し（実施例２を参照）、前記ＡｕＮＰ－ＡｐｔＩｇＧによる抗体の細胞内伝達能（実施例３を参照）およびＡｕＮＰ－ＡｐｔＦＩＴＣによる抗体の細胞内伝達能（実施例４を参照）を確認した結果、前記抗体伝達体ＡｕＮＰ－ＡｐｔＩｇＧおよびＡｕＮＰ－ＡｐｔＦＩＴＣにより抗体が細胞内に効果的に伝達されたことを確認した。
本発明の他の実験例において、ＡｕＮＰ－ＡｐｔＩｇＧ－ＢＲＡＦＶ６００Ｅ複合体を用いてＢＲＡＦＶ６００Ｅ抗体をＳＫ－ＭＥＬ２細胞株およびＢＲＡＦ突然変異（ＢＲＡＦＶ６００Ｅ）細胞株Ａ２０５８、Ｍａｌｍｅ－３Ｍに伝達した結果、前記Ａ２０５８、Ｍａｌｍｅ－３Ｍヒト皮膚がん細胞株において細胞生存能が減少することを確認して、金ナノ粒子－アプタマー－抗体複合体が細胞治療剤として用いられることを確認した（実施例５を参照）。
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
実施例１．実験方法
１－１．動物細胞培養（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）
ＨｅＬａ（ヒト子宮頸がん）細胞は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養し、Ａ５４９（ヒト扁平上皮がん）細胞は、２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸）バッファーを含むＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した。また、Ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ細胞であるＭａｌｍｅ－３Ｍ、ＳＫ－ＭＥＬ－２細胞は、ＲＰＭＩ－１６４０培地で培養し、Ａ２０５８細胞は、ダルベッコ変法イーグル培地で培養した。すべての培地は、１０％ 加熱不活性化したウシ胎児血清（Ｃａｉｓｓｏｎ，ＵＳＡ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｋｏｒｅａ）を含む。
１－２．金ナノ粒子－アプタマー－抗体複合体の製造
金ナノ粒子－アプタマー結合体は、二次構造の形成を防止するために、８０℃で５分間プレインキュベートさせた。その後、前記金ナノ粒子－アプタマー結合体（ＡｕＮＰ－ＡｐｔＩｇＧ）（１ｎＭ）およびモノクローナル抗体を５ｍＭ ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．２）が含まれた１ｘ ＰＢＳで常温で１０分間反応させ、以後、１３，０００ｘｇで遠心分離後、上澄み液を除去した。これから製造されたＡｕＮＰ－ＡｐｔＩｇＧ－ａｎｔｉｂｏｄｙ複合体は、５００ｍＭ ＮａＣｌおよび１Ｍ ＫＣｌが追加されたＴＢＳＴを使って洗浄した。
１－３．共焦点顕微鏡を用いた金ナノ粒子－アプタマー結合体による抗体伝達能の分析
細胞内への抗体伝達を観察するために、リシンコーティングされた１０ｍｍカバースリップ（ｃｏｖｅｒ ｓｌｉｐ）上で培養された細胞に金ナノ粒子－アプタマー－抗体複合体（ＡｕＮＰ－ＡｐｔＩｇＧ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）を処理した後、１時間培養した後、４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）で固定させた。次に、共焦点顕微鏡（ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＺＥＮ ２０１１，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＦＩＴＣ（４９０ｎｍ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ，５２５ｎｍ ｅｍｉｓｓｉｏｎ）およびＡｌｅｘａ５４６（５５６ｎｍ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ，５７３ｎｍ ｅｍｉｓｓｉｏｎ）蛍光を探知した。
１－４．細胞生存能分析（Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ）
細胞株を９６－ｗｅｌｌプレートに接種し、細胞が付着するように一晩中培養した。以後、前記細胞を濃度を異ならせた（０、０．８８、１．６５および３．３ｎＭ）ＡｕＮＰ－ＡｐｔＩｇＧ－ＢＲＡＦＶ６００Ｅと培養させ、細胞生存能を測定した（Ｙｅｏｍ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ－ＤＮＡ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＢＡＸ ｍＲＮＡ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８，ｅ７５３６９（２０１３））。
実施例２．金ナノ粒子－アプタマー結合体を用いた抗体伝達体の製造
モノクローナル抗体のＦｃドメインに結合するアプタマーを用いて抗体伝達体を製造し、その概略的な模式図は図１に示した。
２－１．ＩｇＧアプタマーを用いた抗体伝達体（ＡｕＮＰ－ＡｐｔＩｇＧ）の製造
（イ）ＤＮＡアプタマー前処理
本発明による抗体伝達体を製造するために、モノクローナル抗体のＦｃドメインを探知して、これに特異的に結合するＩｇＧ－アプタマー（ＩｇＧ－ａｐｔａｍｅｒ）を使用した。より具体的に、前記ＩｇＧ－アプタマーは、３’末端がチオール基で修飾されたアプタマーであって、５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＡＡＴＧＧＴＡＣＧＧＴＡＣＴＴＣＣＣＣＡＣＴＣＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＴＧＣＣＧＣＴＣＣＣＡＡＡＡＧＴＧＣＡＣＧＣＴＡＣＴＴＴＧＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’（ＳＨ）（配列番号１）の塩基配列からなる。乾燥した前記ＤＮＡアプタマーを最終濃度が１００μＭになるように水に溶かした後、５０μｌのオリゴに１０μｌの１Ｎ ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を入れ、室温で１５分間反応させた。所望しないチオール基分子を含むＤＴＴを除去するために、エチルアセテート（Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）５０μｌを入れて混ぜた後、遠心分離して上澄み液を除去し、この過程を３回繰り返した。その後、エタノール沈殿法（ＥｔＯＨ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を用いてアプタマーを沈殿させた。
（ロ）金ナノ粒子とＤＮＡアプタマーの結合
前記（イ）過程を通じて前処理して沈殿したＩｇＧ－アプタマーを水に溶かした後、これを金ナノ粒子に添加し、この際、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）として、英国ＢＢＩ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅから購入したＧｏｌｄ ｃｏｌｌｏｉｄ－１５ｎｍ（＃ＥＭ．ＧＣ１５）を使用した。
具体的に、２ｎＭの金ナノ粒子にアプタマーを入れ（ＤＮＡ：ＡｕＮＰ＝１００：１）、十分に混ぜた後、最終濃度が１０ｍＭになるように、０．５Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ３）を添加して混合した。室温で３～５分間反応させた後、反応が終わると、金の中和のために、最終濃度が３０ｍＭになるように、０．５ＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．６）を入れ、室温で１０分間反応させた。アプタマーと金の混合物は、～１０，０００ｘｇで２０分間遠心分離して集めた後、上澄み液にある未反応のオリゴを除去し、この過程を３回繰り返した。最終的な金ナノ粒子－アプタマー結合物は、５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．６）に入れて分散させた。
２－２．ＦＩＴＣアプタマーを用いた抗体伝達体（ＡｕＮＰ－ＡｐｔＦＩＴＣ）の製造
（イ）ＤＮＡアプタマー前処理
本発明による抗体伝達体を製造するために、蛍光トレーサーとして多用されるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）と特異的に結合するＦＩＴＣ－アプタマー（ＦＩＴＣ－ａｐｔａｍｅｒ）を使用した。より具体的に、前記ＦＩＴＣ－アプタマーは、３’末端がチオール基で修飾されたアプタマーであって、５’－ＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧＧＴＣＧＧＡＴＣＣＧＴＧＡＧＴＴＧＴＧＡＣＡＡＴＴＴＡＧＣＧＧＧＴＧＧＴＡＴＴＡＧＡＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＡＣＡＧＣＡＡＴＡＧＧＡＴＣＧＡＴＡＣＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’（ＳＨ）（配列番号２）の塩基配列からなる。乾燥した前記ＤＮＡアプタマーを最終濃度が１００μＭになるように、水に溶かした後、５０μｌのオリゴに１０μｌの１Ｎ ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を入れ、室温で１５分間反応させた。所望しないチオール基分子を含むＤＴＴを除去するために、エチルアセテート（Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）５０μｌを入れて混ぜた後、遠心分離して上澄み液を除去し、この過程を３回繰り返した。その後、エタノール沈殿法（ＥｔＯＨ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を用いてアプタマーを沈殿させた。
（ロ）金ナノ粒子とＤＮＡアプタマーの結合
前記（イ）過程を通じて前処理して沈殿したＦＩＴＣ－アプタマーを前記実施例２－１の（ロ）過程と同じ方法で金ナノ粒子に結合して、抗体伝達体（ＡｕＮＰ－ＡｐｔＦＩＴＣ）を製造した。
実施例３．ＡｕＮＰ－Ａｐｔ ＩｇＧ による抗体の細胞内伝達能の確認
３－１．共焦点顕微鏡分析
前記実施例２－１によって製造された金ナノ粒子－アプタマー結合体を用いて前記実施例１－２の方法で金ナノ粒子－アプタマー－抗体複合体を製造した。次に、金ナノ粒子－アプタマー－抗体複合体をＨｅＬａ細胞とＡ５４９細胞に処理した後、１時間培養した。培養後、ＰＢＳで洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定させ、固定させたサンプルを免疫染色（ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）した後、共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で観察した。
３－２．ＡｕＮＰ－ＡｐｔＩｇＧによる抗体の細胞内伝達能の確認
ＡｕＮＰ－ＡｐｔＩｇＧにモノクローナル抗体ＰＡＲＰ１、ＶＰ６、ＮＳＤ２、Ａｕｒｏｒａ Ａ、Ｐａｘ５、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｒｏｃｋ－１、Ｒｏｃｋ－２、ＲｈｏＥ、Ｐ５３、Ｍｃｌ－１、Ｐ５０、ＢＲＡＦを反応させて、金ナノ粒子－アプタマー－抗体複合体を製造した後、前記抗体がＨｅＬａ細胞およびＡ５４９細胞に伝達されるかを確認するために、二次抗体であるＭｏｕｓｅ－５４６（Ｒｅｄ）で標識し、前記実施例３－１の方法で共焦点顕微鏡分析を実施した。
その結果、図２ａおよび図２ｂに示されたように、前記抗体がＨｅＬａ細胞（図２ａ）およびＡ５４９（図２ｂ）細胞内に伝達されたことを確認できた。
実施例４．ＡｕＮＰ－Ａｐｔ ＦＩＴＣ による抗体の細胞内伝達能の確認
前記実施例２－２の方法で製造されたアプタマー－金ナノ粒子結合体（ＡｕＮＰ－ＡｐｔＦＩＴＣ）とＦＩＴＣで標識されたモノクローナル抗体ＩｇＧ（ＦＩＴＣ－ＩｇＧ）を反応させて製造された金ナノ粒子－アプタマー－抗体複合体（ＡｕＮＰ－ＡｐｔＩｇＧ－ＦＩＴＣ－ＩｇＧ）をヒト皮膚がん細胞株（Ｍａｌｍｅ－３ＭおよびＳＫ－ＭＥＬ２）に処理して１時間培養した後、これを共焦点蛍光顕微鏡で観察した。この際、細胞は、４０ｘ水浸対物レンズ（ｗａｔｅｒ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を使って視覚化した。
その結果、図３に示されたように、ＦＩＴＣ－ＩｇＧ（Ｇｒｅｅｎ）が細胞内で位置していることを確認して、ＩｇＧがヒト皮膚がん細胞株に伝達されたことを確認できた。
実施例５．金ナノ粒子－アプタマー－抗体複合体による細胞生存能の評価
ヒト皮膚がん細胞株（Ａ２０５８、ＳＫ－ＭＥＬ２、およびＭａｌｍｅ－３Ｍ）へのＡｕＮＰ－ＡｐｔＩｇＧ－ＢＲＡＦＶ６００Ｅの伝達による細胞生存能を前記実施例１－４の方法で測定した。ヒト皮膚がん細胞株の治療用ターゲット分子として使用されるＢＲＡＦＶ６００Ｅ抗体をＢＲＡＦ突然変異細胞株Ａ２０５８、Ｍａｌｍｅ－３ＭにＡｕＮＰ－ＡｐｔＩｇＧを用いて伝達した結果、図４に示されたように、突然変異のない皮膚がん細胞株ＳＫ－ＭＥＬ２に比べて細胞生存能が減少したことを確認できた。
したがって、前記結果から、金ナノ粒子－アプタマー－抗体複合体は、細胞治療剤として利用可能なものと確認した。
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で容易に変形が可能であることが理解できるだろう。したがって、前述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的ではないものと理解しなければならない。
本発明による抗体伝達体は、アプタマーに伝達しようとする抗体を特異的に結合して細胞の核、細胞質だけでなく、ミトコンドリアに抗体を効果的に伝達できるところ、病気の診断または治療に有用に用いられるものと期待される。

Claims (8)

  1. 金ナノ粒子と、
    前記金ナノ粒子の表面に結合するアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）と、を含む、抗体運搬体であって、
    抗体のＦｃドメインに特異的に結合する前記アプタマーは、配列番号１の塩基配列を含むか；又は、
    抗体に結合するＦＩＴＣに特異的に結合する前記アプタマーは、配列番号２の塩基配列を含む、抗体運搬体。
  2. 前記抗体運搬体は、前記アプタマーにＩｇＧ、ＰＡＲＰ１、ＶＰ６、ＮＳＤ２、Ａｕｒｏｒａ Ａ、Ｐａｘ５、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｒｏｃｋ－１、Ｒｏｃｋ－２、ＲｈｏＥ、Ｐ５３、Ｍｃｌ－１、Ｐ５０、およびＢＲＡＦからなる群から選択される一つ以上のモノクローナル抗体を結合して細胞内に運搬することを特徴とする請求項１に記載の抗体運搬体。
  3. 前記金ナノ粒子は、１０～２０ｎｍの直径を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体運搬体。
  4. 前記抗体運搬体は、細胞の核、細胞質、およびミトコンドリアからなる群から選択される一つ以上の内部に抗体を運搬することを特徴とする請求項１に記載の抗体運搬体。
  5. 金ナノ粒子にアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）を結合させる段階を含む、抗体運搬体の製造方法であって、
    抗体のＦｃドメインに特異的に結合する前記アプタマーは、配列番号１の塩基配列を含むか；又は、
    抗体に結合するＦＩＴＣに特異的に結合する前記アプタマーは、配列番号２の塩基配列を含む、方法。
  6. 請求項１に記載の抗体運搬体と運搬しようとする抗体とが結合してなる複合体。
  7. 請求項６に記載の複合体を有効成分として含む、がんの予防または治療用薬学的組成物。
  8. 請求項６に記載の複合体の、がんの予防または治療に用いられる薬剤の生産のための使用。
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