KR101966505B1 - 항균용 나노 구조체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 금 나노입자, 상기 금 나노입자의 표면에 결합되는 압타머 (aptamer), 및 상기 압타머에 결합되는 항균 펩타이드 (AMPs)를 포함하는 항균용 나노 구조체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항균용 조성물에 관한 것으로, 상기 나노 구조체는 금 나노입자에 결합한 다양한 tag의 압타머 또는 항균 펩타이드 특이적 압타머가 전달하고자 하는 항균 펩타이드에 특이적으로 결합하여 세포 내로 항균 펩타이드를 효과적으로 전달할 수 있고, 매우 적은 세포독성을 갖는 금 나노입자를 이용하여 인체에 무해한바, 항균 용도로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

항균용 나노 구조체 및 이의 용도 {Antimicrobial nano-complex, and uses thereof}
본 발명은 항균용 나노 구조체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항균용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 금 나노입자에 다양한 tag의 압타머 또는 항균 펩타이드 특이적 압타머를 결합하여 세포 내로 펩타이드의 전달능이 향상된 항균용 나노 구조체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
병원내 감염의 발생 빈도 증가 및 다제-내성 박테리아의 확산은 글로벌 건강을 위협하고 의료 시스템에 부담을 주고 있다. 특히, 숙주 세포 내 잔류하는 박테리아는 항균 화합물을 감염된 숙주 세포로 흡수하지 못하도록 하여, 상기 화합물의 치료 효과를 상당히 감소시킨다. 그러므로 이와 같은 박테리아 내성 발생의 전반적인 급격한 상승에 따라, 신규한 치료 전략의 필요성은 명백하며, 이는 항균 화합물의 새로운 클래스 및 효율적인 세포 내 약물 전달 시스템에 의해 수행될 수 있다.
한편, 많은 세포 내 병원성 세균 중에서, 살모넬라 (Salmonella) 감염이 주요 공중 보건 관심사이며, 이는 살모넬라가 사람과 동물 모두에 영향을 미치는 주요 장내 병원성 질환이기 때문이다. 특히, 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 (S. Typhimurium)은 본 속 (genus)에서 가장 특징적인 균주에 해당하며, 상기 병원체는 다형핵백혈구 (polymorphonuclear leukocyte)가 장내 단일층을 지나 궁극적으로 전신성 사이트에 접근할 수 있는 장내 상피로 침투할 수 있는 물리적 이동을 위하여, 장관 (intestinal tract)에 집락을 이루고, 상피세포 폐쇄소대 (epithelial tight junction) 무결성을 충분히 조절한다. 현재, 비록 항생제가 침습성 살모넬라 감염의 치료에 사용되고 있으나, 다제-내성 (multi-durg resistance, MDR)은 여전히 주요 관심사이다.
항균 화합물의 많은 새로운 클래스들이 다제-내성 (MDR) 세균을 치료하기 위해 개발되고 있으며, 그 중에서도, 항균 펩타이드 (AMPs)가 넓은 활성 범위 및 표적 세포에 의한 저항성 감소에 따라 유망한 약물 후보로 간주되고 있다. 자연계에 존재하는 많은 종류의 생물체들이 생체적 방어 시스템의 일환으로 항균 펩타이드를 체내외로 생산한다. 이러한 항균 펩타이드들은 일반적인 단백질에 비해 비교적 짧은 아미노산 서열 (10 여개에서 100 여개)로 이루어져 있으며, 알짜 전하 (net charge)가 +2에서 +9 정도를 띠고 있다. 단, 세포 생물체에서 인간에 이르는 거의 모든 생명체가 만들어 내는 일련의 항균 펩타이드들은 현재 전 세계 연구자들에 의하여 Magainin, Cecropin, Defensin, Buforin, Protegrin, Tachyplesin을 비롯한 300종 이상이 발견되었으며, 그람 양성균 (Gram +), 그람 음성균 (Gram -)과 진균류 (fungi), 암세포 (tumor cell)에 이르기까지 폭넓은 항균활성을 나타내는 펩타이드이다. 진핵 다세포 생물에서 발견되는 항균펩타이드들은 알파 헬릭스 (alpha-helix), 베타 시트 (beta-sheet) 또는 무작위 코일 (random coil) 구조를 가지고 있다.
일반적인 항균 펩타이드들의 작용 기작을 보면 이들 펩타이드가 세포막에 결합하면 세포막에 이온채널 (ion channel)을 형성하여 미생물의 에너지 생성을 저해하거나, 세포막에 큰 구멍을 만들게 되어 결과적으로 세포가 죽게 된다. 이와 같이 짧은 시간 내에 비특이적이면서 효과적인 물리적 방법으로 세포막을 파괴하는 작용기작을 가지고 있어서, 미생물의 세포벽이나 세포내 고분자 합성을 저해하는 기존의 항생제들과는 달리 미생물들이 항균 펩타이드에 대한 내성을 갖게 되기는 매우 어려우며, 현재까지도 항균펩타이드에 의해서는 내성이 생기지 않는 것으로 보고되어 왔다. 이러한 항균 펩타이드들의 생체 내외의 발현은 항시적인 경우도 있으며, 내재성 면역 (innate immune)을 자극하는 염증유발성 싸이토카인들, 세균들, 그리고 지질다당류 (lipopolysaccharides, LPS) 같은 세균 유래 물질에 의해서 유도되기도 한다.
또한, 항균 펩타이드의 작용 메커니즘은 지질다당류 (lipopolysaccaride) 및 리포테이코산 (lipoteichoic acid)과 항균 펩타이드의 결합, 기공 형성 또는 다른 프로세스를 통한 후속 막 파괴를 포함하는 것으로 생각된다. 이때, 세균의 세포막은 포스파티딜글리세롤 및 포스파티딜에탄올아민으로 구성되고, 음으로 대전되는데, 항균 펩타이드의 양으로 하전된 아미노산 잔기는 그 표면에 노출된 음전하를 통해 미생물과 정전기적 상호작용을 매개하는 것으로 생각된다. 이것이 항균 펩타이드 2차 구조를 변경할 수 있으며, 그들의 항균 효과를 촉진할 수 있다.
그러나, 임상에 있어서 항균 펩타이드의 응용은 효과적인 전달 시스템의 부족에 의해 방해되어왔다. 항균 펩타이드는 감염 부위에 도달하기도 전에 분해되어 경구 투여가 불가능하며, 숙주 면역 체계가 신속하게 이를 식별하고 면역 대상으로 하기 때문에, 항균 펩타이드의 전신성 전달 또한 도전이다. 이러한 이유로, 치료 효과를 달성하기 위해서는 엄청난 비용과 보다 중요하고 심각한 부작용을 일으킬 수도 있는, 높은 항균 펩타이드 복용량이 요구된다.
지난 십년 동안, 연구자들은 항균 펩타이드의 전달을 위하여 리포좀, 키토산, 폴리 (lactide-co-glycolic acid) (PLGA)-나노-파티클, 및 유산균을 연구하였다. 그러나, 이러한 분자들은 AMPs를 로딩하기 위한 복잡성 및 내재 세포 독성에 의한 제한이 존재한다. 따라서, 세포 독성 없이 포유동물 생명체로 재조합 단백질을 쉽고 효율적으로 전달하기 위한 구조체에 대한 연구가 시급한 실정이다 (한국공개특허 제10-2013-0118518 참조).
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 세포 독성 없이 포유동물 생명체로 재조합 단백질을 쉽고 효율적으로 전달하기 위한 구조체를 연구하던 중, 금 나노입자-DNA 압타머 (AuNP-Apt) 복합체-기반 전달 시스템을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 금 나노입자, 상기 금 나노입자의 표면에 결합되는 압타머 (Aptamer), 및 상기 압타머에 결합되는 항균 펩타이드 (AMPs)로 이루어지는 나노 구조체를 포함하는 항균용 조성물 및 상기 나노구조체의 제조방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 금 나노입자, 상기 금 나노입자의 표면에 결합되는 압타머 (Aptamer), 및 상기 압타머에 결합되는 항균 펩타이드 (AMPs)로 이루어지는 나노 구조체를 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 나노 구조체는 나노입자는 10-20 nm의 크기를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 압타머는 표지물질 (tag)로 표지될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 항균 펩타이드는 표지물질 (tag)로 표지될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 압타머는 상기 표지물질에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 표지물질은 히스티딘 (His)일 수 있다.
또한, 본 발명은 금 나노입자와 압타머 (Aptamer)를 결합시키는 단계, 및 상기 압타머에 항균 펩타이드 (AMPs)를 결합시키는 단계를 포함하는, 나노 구조체 제조방법을 제공한다.
본 발명은 금 나노입자, 상기 금 나노입자의 표면에 결합되는 압타머 (Aptamer), 및 상기 압타머에 결합되는 항균 펩타이드 (AMPs)를 포함하는 항균용 나노 구조체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항균용 조성물에 관한 것으로, 상기 나노 구조체는 금 나노입자에 결합한 다양한 tag의 압타머 또는 항균 펩타이드 특이적 압타머가 전달하고자 하는 항균 펩타이드에 특이적으로 결합하여 세포 내로 항균 펩타이드를 효과적으로 전달할 수 있고, 매우 적은 세포독성을 갖는 금 나노입자를 이용하여 인체에 무해한바, 항균 용도로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 금 나노입자-압타머His에 로딩된 AMPHis 및 이에 따른 살모넬라-감염 포유동물 세포로의 AMPHis 전달 과정에 대한 개략적인 모식도이다.
도 2a는 matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) 질량 분광 분석을 이용하여 합성 항균 펩타이드 A3-APO 및 A3-APOHis의 질량을 분석한 도이다.
도 2b는 HeLa 세포에서 AMP 및 AMPHis의 세포 독성을 나타낸 도이다.
도 2c는 금 나노입자-압타머His 복합체의 로딩 용량을 나타낸 도이다.
도 3은 면역 및 공초점 레이저 주사 현미경 분석을 통하여 금 나노입자-압타머His의 항균 펩타이드 전달능을 확인하는 도이다.
도 4는 A3-APO 및 A3-APOHis 펩타이드의 원편광이색성 (Circular dichroism, CD) 스펙트럼을 확인한 도이다.
도 5는 A3-APO 및 A3-APOHis 펩타이드의 막 탈분극을 확인한 도이다.
도 6은 SYTOX Green 염색을 통하여 A3-APO 및 A3-APOHis 펩타이드의 살모넬라 균 세포막 파괴를 확인한 도이다.
도 7은 GUVs (PE/PG, m/m)에 미치는 A3-APO 및 A3-APOHis 펩타이드의 효과를 나타내는 도이다.
도 8a는 인공 거대 단계 (unilineal) 소포체의 작용 기작 (mode of action)을 나타낸 도이다.
도 8b는 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium) 세포를 SEM 현미경으로 관찰한 도이다.
도 9는 살모넬라 생균 세포수 측정을 통하여, 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)-감염 HeLa 세포에 대한 금 나노입자-압타머-AMP 복합체의 항균 효과를 확인한 도이다.
도 10a는 HeLa 세포에서 세포 내 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)의 성장에있어 금 나노입자-압타머His에 로딩된 A3-APO의 효과를 나타낸 도이다.
도 10b는 혈청에서 A3-APO, 및 A3-APOHis와 금 나노입자-압타머His 간 결합의 안정성을 나타낸 도이다.
도 11은 생존 HeLa 세포수 측정을 통하여, 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)-감염 HeLa 세포에 대한 금 나노입자-압타머-AMP 복합체의 항균 효과를 확인한 도이다.
도 12는 마우스에서 금 나노입자-압타머-AMP 복합체를 통하여 세포 내로 전달된 항균 펩타이드 (AMPs)를 시각화한 도이다.
도 13은 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)-감염 마우스의 생존기간 및 생존율을 통하여, 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)-감염 마우스에 대한 금 나노입자-압타머-AMP 복합체의 항균 효과를 확인한 도이다.
도 14는 장간막 림프절 (MLNc), 비장 (Spleen), 및 간 (Liver)에서 생존 가능한 박테리아 수 측정을 통하여, 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)-감염 마우스에 대한 금 나노입자-압타머-AMP 복합체의 항균 효과를 확인한 도이다.
도 15는 비브리오 불니피쿠스 (V. vulnificus)-감염 마우스의 생존기간 및 생존율을 통하여, 비브리오 불니피쿠스 (V. vulnificus)-감염 마우스에 대한 금 나노입자-압타머-AMP 복합체의 항균 효과를 확인한 도이다.
본 발명자들은, 금 나노입자-압타머 복합체가 낮은 독성과 높은 항균 펩타이드 (AMPs)의 전달 효율을 보이는 점에 기반하여 상기 금 나노입자-압타머-AMPs의 항균/살균 효과 등을 구체적으로 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 금 나노입자, 상기 금 나노입자의 표면에 결합되는 압타머 (Aptamer), 및 상기 압타머에 결합되는 항균 펩타이드 (AMPs)로 이루어지는 나노 구조체를 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "나노입자 (nanoparticle)"란, 나노 단위의 직경을 가지는 다양한 물질의 입자를 의미하며, 상기 나노입자는 나노 크기를 갖는 입자라면 특별히 제한되지는 않는다.
본 발명에서 "금 나노입자"란, 나노 단위의 직경을 가지는 금의 금속입자를 의미하며, 이러한 작은 입자 크기는 본 발명의 나노입자가 목적의 세포 (예컨대, 인간 세포)로 침투하는 것을 용이하게 하여 세포 내에 단백질 전달체의 침투를 가능하게 한다.
금 나노입자는 안정한 입자의 형태로 제조가 쉬울 뿐만 아니라 0.8 nm에서 200 nm까지 다양하게 사용 목적에 맞추어 크기를 변화시킬 수 있다. 또한, 금은 다양한 종류의 분자들, 예컨대 펩타이드, 단백질, 핵산 등과 함께 결합하여 구조를 변형시킬 수 있고, 다양한 파장에서 빛에 반사하는바, 이를 이용해 세포 내에서의 위치를 쉽게 확인할 수 있다. 더욱이, 금 나노입자는 망간, 알루미늄, 카드늄, 납, 수은, 코발트, 니켈, 베릴륨 등의 중금속과 달리 인체에 무해하여 높은 생체친화성을 가지며, 매우 적은 세포 독성을 가지는 장점이 있다.
금 나노입자는 직경이 100 nm 이상으로 커질 경우 나노 입자로서의 특성이 소멸될 뿐 아니라, 나노 물질의 특성이 없는 금 표면과 티올기 등의 작용기와의 결합이 약해지고, 직경이 10-20 nm 이외의 금 나노 입자는 세포독성을 유발하기 때문에, 본 발명의 금 나노입자는 직경은 10~20 nm의 크기를 가지는 것이 바람직하다.
본 발명에서, "압타머 (Aptamer)"란 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형핵산)을 의미하며, SELEX (Systematic Evolution of Ligands of Exponential enrichment)라는 방법으로 원하는 다양한 목적 물질 (단백질, 당, 염색 물질, DNA, 금속이온, 세포 등)에 대한 압타머를 개발할 수 있다.
본 발명에서 "항균 펩타이드"란, 자연계에 존재하는 많은 종류의 생물체들이 생체적 방어 시스템의 일환으로 생산하는 펩타이드를 의미하나, 인위적인 방법으로 생산할 수도 있으며, 이러한 항균 펩타이드들은 일반적인 단백질에 비해 비교적 짧은 아미노산 서열 (10 여개에서 100 여개)로 이루어져 있고, 어떠한 종류도 사용할 수 있으며, 특별히 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 금 나노입자와 결합하는 압타머는 다양한 tag의 압타머 또는 항균 펩타이드 특이적 압타머의 어떠한 종류도 사용할 수 있으며, 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 나노 구조체는 금 나노입자에 결합한 다양한 tag의 압타머 또는 항균 펩타이드 (AMPs) 특이적 압타머가 전달하고자 하는 항균 펩타이드에 특이적으로 결합하여 세포 내로 항균 펩타이드를 효과적으로 전달할 수 있는바, 항균 용도로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 금 나노입자와 압타머 (Aptamer)를 결합시키는 단계, 및 상기 압타머에 항균 펩타이드 (AMPs)를 결합시키는 단계를 포함하는, 나노 구조체 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 구조체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 항균성 펩타이드의 전달 방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 진단 또는 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
발명의 일실시예에서는, 금 나노입자-압타머-펩타이드 복합체를 제조하고(실시예 1-3 참조), 상기 나노 구조체에 의한 in vitro 또는 in vivo에서 박테리아 세포 생균수 및 감염 세포 생존능 (실시예 4 내지 6)을 확인한 결과, 본 발명의 나노 구조체에 의해 항균 펩타이드가 세포 내로 효과적으로 전달되었음을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 금 나노입자-압타머-펩타이드 복합체는 세포에 독성을 나타내지 않으며, 세포 내로의 높은 투과성을 갖는 바, 항균 펩타이드의 높은 전달 효율이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험 준비 및 실험 방법
1-1. 펩타이드 합성 및 정제 (Peptide synthesis and purification)
펩타이드는 이전에 공지된 절차에 의하여 합성하였다 (J.K. Lee, et al., A helix-PXXP-helix peptide with antibacterial activity without cytotoxicity against MDRPA-infected mice, Biomaterials 35 (2014) 1025-10390).
다음으로, N-말단 형광-표지 펩타이드를 생성하기 위하여, 수지-결합 펩타이드를 디메틸포름아미드 (DMF) 하에서 20 % (v/v) 피페리딘으로 처리하여 N-말단 아미노산으로부터 Fmoc 보호기를 제거하고, 상기 수지-결합 펩타이드를 5 % (v/v) 디이소프로필에틸아민을 함유하는 DMF 하에서, 로다민-SE (3-4 당량)로 반응시켰다. 그 후, 어둠속에서 24 시간 동안 부드럽게 혼합하고, 상기 수지를 DMF 및 디클로로메탄 (DCM) 순으로하여 철저히 세척한 후, 펩타이드를 각각의 수지로부터 절단하여 에테르로 침전 추출하였다. 추출된 조펩타이드는 0.05 % 트리클로로아세트산을 함유하는 물에 적절한 0~60% 아세토니트릴 구배로 Jupiter C18 column (250 x 21.2 mm, 15 mm, 300 A)을 사용하여 역상 (reversed-phase) prep HPLC를 통하여 정제하였다. 펩타이드의 순도는 Jupiter proteo C18 컬럼 상에서 analytical 역상 HPLC에 의해 측정하였으며 (250 x 4.6 mm, 90 A, 4 μm), 분자 질량은 matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry (MALDI Ⅱ, Kratos Analytical Ins.)를 사용하여 확인하였다.
1-2. 금 나노입자-압타머 결합체 (AuNP-Apt conjugates) 합성
표준 시트르산염-환원된 (citrate-reduced) 금 나노입자 (AuNPs)(직경 15 nm)는 BBI 생명 과학 (UK)에서 구입하였으며, 히스티딘-태그 (His-tagged) DNA 압타머 (5’-GCTATGGGTGGTCTGGTTGGGATTGGCCCCGGGAGCTGGC-A10-Thiol-3’)는 Bioneer (한국)에서 구입하였다. DNA 압타머는, 이황화결합을 절단하기 위하여, 히스티딘-태그 (His-tagged) DNA 압타머 올리고 뉴클레오티드 (oligonucleotide)를 1N 디티오트레이톨 (DTT)로 30 분 동안 실온 (RT)에서 처리하였다. 유리 티올-개질된 올리고 뉴클레오티드 혼합물로부터 과량의 DTT 및 원하지 않는 티올 단편을 제거하기 위하여 에틸아세테이트로 3 회 추출하였다. 잘라낸 올리고 뉴클레오티드는 에탄올 침전법을 사용하여 정제하였다. 금 나노입자 (AuNP) 1:100의 비율로 올리고 뉴클레오티드와 혼합하고, citrate-HCl buffer (0.5 M, pH 3)를 최종 농도가 ~ 10 mM이 되도록 첨가하였다. 간단히 볼텍싱 (vortexing)한 후, 샘플을 3 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 다음으로, 금 나노입자 (AuNP) 용액의 pH는 HEPES buffer (0.5 M, pH 7.6)을 이용하여 중성으로 조정하였다. 5-10 분 동안 실온에서 추가로 인큐베이션한 후, 금 나노입자 (AuNP)-올리고 혼합물을 13000×g에서 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 최종 혼합물을 5 mM의 HEPES 완충액에 재분산시켰다. 기능화된 금 나노입자 (AuNP)의 농도는 UV-Vis 분광법으로 측정하였다. 흡광도 값을 사용한 비어의 법칙 (Beer’s law, A = εbc)을 통하여 나노 입자의 농도를 측정하였다. 15 nm 입자 크기에 사용된 최대 흡수값 (λ) 및 흡광 계수 (ε)의 파장은 다음과 같다: λ = 524 nm, ε = 2.4 × 108 L/(몰·cm)
1-3. 금 나노입자-압타머-펩타이드 복합체 (AuNP-Apt-peptide complex) 제조
압타머-결합 금 나노입자 (AuNPs)는 이차 구조의 형성을 방지하기 위하여 5 분 동안 80 ℃에서 사전 배양 (pre-incubate)하였다. AuNP-AptHis (1 nM) 및 정제된 His-tagged 펩타이드는 1 x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, pH 7.4)로 평형시킨 1 x AMP binding buffer (200 mM Tris-Cl, pH 8.8, 200 mM NaOH, 및 1 mM MgCl2)에서 10 분 동안 실온으로 인큐베이션하였다. 각 용액의 pH는 염화수소로 조정 하였다.
1-4. 결합능 (Binding capacity) 평가
항균 펩타이드 (AMPs) 및 금 나노입자-압타머 (AuNP-AptHis) 결합체 간의 결합능 평가는 이전에 공지된 절차에 의하여 진행하였다(S.M. Ryou, et al., Gold nanoparticle-DNA aptamer composites as a universal carrier for in vivo delivery of biologically functional proteins, J. Control Release 196 (2014) 287-294).
1-5. 항균성 (Antibacterial) 평가
살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 (Salmonella enterica Typhimurium) ATCC14028 세포를 37 ℃, Luria-Bertani (LB) 배지에서 배양하고, 각 펩타이드의 최소 억제 농도 (MIC)는 미량 희석 (microdilution) 분석법으로 측정하였다. 다시 말해, 각각의 성장 중반 대수기 (mid-logarithmic phase)의 박테리아 (5 x 105 colony forming unit (CFU)/ml) 배양물을 함유하는 배지를 제조하기 위해 8-64 μM의 범위를 커버하는 2 배 계열 희석액을 첨가하고, 샘플을 37 ℃에서 18-24 시간 동안 배양하였으며, 이때 MIC는 배양물의 OD600 측정에 기초하여 최저 펩타이드 농도로 확인하였다.
1-6. 동물세포 배양
HeLa (human cervical carcinoma) 세포는 10 % (v/v) 소 태아 혈청 (fetal bovine serum, Welgene) 및 1 % (v/v) 페니실린스트렙토마이신 (penicillinestreptomycin, Welgene)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Welgene, Korea)에서 37 ℃, 5 %(v/v) CO2 조건하에서 배양하였다.
1-7. 세포독성 (Cytotoxicity) 평가
HeLa (2 x 104/well) 세포를 96-well 배양 디쉬에서 18-24 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포는 펩타이드와 함께 24 시간 더 배양한 후, CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay kit를 사용하여 생존능 (viability)을 평가하였다.
1-8. 살아있는 세포 및 죽은 세포 분석 (Live and dead cell assay)
살아있는 세포 및 죽은 세포를 분석하기 위해, 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium) ATCC14028 세포를 펩타이드와 함께 배양하고, 형광 현미경 (LX71, Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 모니터링하였다. A3-APO 및 A3-APOHis 펩타이드는 상기 항균성 평가를 위해 사용된 것과 동일한 절차를 이용하여 세포에 첨가하였다. 펩타이드는 500 μl 세포 현탁액 (1 x 107 CFU/mL)에 각 MIC로 첨가하였다. 배양 20 분 후, 세포를 8000 x g에서 5 분 동안 원심분리하고, 슬라이드상의 세포를 현미경 (LX71, Olympus)으로 관찰하였다.
1-9. 유세포 분석 (Flow cytometry)
살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)은 37 ℃, LB 배지에서 배양하고, 세포는 LB 배지 (5 x 106 CFU/ml) 내에 현탁시켰다. 펩타이드를 각 MIC로 투여하고 37 ℃, 20 분 동안 배양 후, 세포를 원심분리 (10,000 x g, 5 분)하여 수확하고, FxCycle™ PI/RNase staining solution (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)로 현탁시켰다. 이어서, 세포를 실온에서 20 분 동안 배양하고, CytoFLEX flow cytometer (Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다.
1-10. 원편광이색성 (Circular dichroism) 분석
원편광이색성 분석은 이전에 공지된 절차에 의하여 진행하였다 (‘J.K. Lee, et al., A helix-PXXP-helix peptide with antibacterial activity without cytotoxicity against MDRPA-infected mice, Biomaterials 35 (2014) 1025-1039’, ‘M. Cassone, et al., Scope and limitations of the designer proline-rich antibacterial peptide dimer, A3-APO, alone or in synergy with conventional antibiotics, Peptides 29 (2008) 1878-1886’).
1-11. 막 탈분극 (Membrane depolarization) 분석
막 탈분극 분석은 이전에 공지된 절차에 의하여 진행하였다 (J.K. Lee, et al., A helix-PXXP-helix peptide with antibacterial activity without cytotoxicity against MDRPA-infected mice, Biomaterials 35 (2014) 1025-10390).
1-12. SYTOX Green 염색
SYTOX Green 염색은 이전에 공지된 절차에 의하여 진행하였다 (J.K. Lee, et al., A helix-PXXP-helix peptide with antibacterial activity without cytotoxicity against MDRPA-infected mice, Biomaterials 35 (2014) 1025-10390).
1-13. 거대 리포좀 (Giant liposome) 분석
거대 리포좀 분석은 이전에 공지된 절차에 의하여 진행하였다 (T.M. Domingues, K.A. Riske, A. Miranda, Revealing the lytic mechanism of the antimicrobial peptide gomesin by observing giant unilamellar vesicles, Langmuir 26 (2010) 11077-11084.).
1-14. 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (Confocal laser scanning microscopy (CLSM)) 분석
공초점 레이저 스캐닝 현미경 분석은 이전에 공지된 절차에 의하여 진행하였다 (J.K. Lee, et al., A helix-PXXP-helix peptide with antibacterial activity without cytotoxicity against MDRPA-infected mice, Biomaterials 35 (2014) 1025-10390).
1-15. 주사 전자 현미경 (Scanning electron microscopy (SEM)) 분석
주사 전자 현미경 분석은 이전에 공지된 절차에 의하여 진행하였다 (J.K. Lee, et al., A helix-PXXP-helix peptide with antibacterial activity without cytotoxicity against MDRPA-infected mice, Biomaterials 35 (2014) 1025-10390).
1-16. 금 나노입자- 압타머 복합체와 결합된 펩타이드의 시각화 (Visualization of peptide uptake by AuNP-Apt conjugates)
라이신 코팅된 10 mm 커버 슬립 (cover slip) 상에서 배양된 HeLa 세포에 금 나노입자-압타머-AMP 복합체 (AuNP-Apt-AMP complex)를 처리한 후 1 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 4 % 파라포름알데히드 (paraformaldehyde, Sigma, USA)로 고정시키고 세포를 Alexa 488 표지 항-His 및 rabbit IgG (여기 495 nm 및 방출 519 nm)로 면역염색하였다. 공초점 현미경 (laser scanning confocal microscopy, Carl Zeiss ZEN 2011, Germany)을 통하여 Alexa488 (495 nm excitation, 519 nm emission) 형광을 탐지하였다.
1-17. 펩타이드 혈청 안정성 (Serum stability of peptide) 평가
친수성 펩타이드 (16 μM) 및 금 나노입자-압타머-펩타이드 (16 μM) 복합체를 37 ℃에서 10 또는 100 % (v/v) 소 태아 혈청 (FBS)을 함유한 DMEM에서 배양하고, 0, 6, 12, 24, 또는 48 시간 후, 각 펩타이드 및 혈청을 트리신-도데실 황산나트륨폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법 (tricine-sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis, Tricine-SDS-PAGE)으로 분리하고, 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
1-18. 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석
준비된 시료의 Tricine-SDS-PAGE를 실시하고 이를 멤브레인에 옮겼다. 멤브레인을 항-His (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; Qiagen) 및 항-GAPDH (Ab Frontier, Seoul, Korea) 항체로 면역블로팅하였다. 신호는 전기화학발광 시약으로 측정하였다. 밴드 강도는 Quantity One (Bio-Rad, Richmond, CA, USA)로 측정하였다.
1-19. ( In vitro ) 세포 내 박테리아 세포 (intracellular bacteria cell) 생균수 측정
HeLa (5 x 104 /well) 세포를 24-well 배양 접시에서 18-24 시간 동안 배양하였다. 배양한 HeLa 세포는 감염다중도 (multiplicity of infection, MOI) 1:100으로, 1 시간 동안 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium) ATCC14028로 감염시켰다. 세포를 50 μg/ml 젠타 마이신 (GIBCO™, Invitrogen, USA)을 포함하는 DMEM으로 세척하고, 10 % (v/v) FBS 및 금 나노입자-압타머-AMP 복합체 (AuNP-Apt-AMP complex) 또는 대조군 시약을 함유하는 DMEM에서 1 또는 6 시간 동안 배양하였다. 감염된 세포는 남아있는 세포 외 박테리아 및 항균 펩타이드를 제거하기 위하여 1 x PBS로 3 회 세척하였으며, 1 % (v/v) 트리톤 X-100을 함유하는 PBS로 용해시키고, 세포 내 박테리아를 세포로부터 방출시켰다. 박테리아 세포를 PBS로 (1:25)로 희석하고, CFU의 수를 결정하기 위하여 LB 플레이트상에 플레이팅하였다.
1-20. ( In vitro ) 감염 세포 생존능 (infected cell viability) 평가
HeLa (2 x 104 /well) 세포를 96-well 배양 접시에서 18-24 시간 동안 배양하였다. 배양한 HeLa 세포는 버퍼로 처리하거나, 감염다중도 (multiplicity of infection, MOI) 1:100으로, 1 시간 동안 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)으로 감염시킨 후, 50 μg/ml 젠타 마이신 (GIBCO™, Invitrogen, USA)을 포함하는 DMEM으로 세척하였다. 이어서, 세포를 10 % (v/v) FBS 및 금 나노입자-압타머-AMP 복합체 (AuNP-Apt-AMP complex) 또는 대조군 시약을 함유하는 DMEM에서 0, 6, 12, 또는 24 시간 동안 배양한 후, 감염된 세포는 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산 (trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid)으로 회수하고, 생존능은 트리판 블루 배제 염색 (trypan blue dye exclusion staining)에 의해 측정하였다.
1-21. 동물 준비
18-20 g의 6 주령 암컷 FvB 마우스 (DBL, Korea)를 준비하고, 동물사육실은 30-40 % 습도 및 22±1 ℃의 온도를 유지하였다. 실내의 조명은 12 시간 명암 주기로 조절하였다. 동물 프로토콜은 동물 실험에 대한 중앙대학교 동물실험센터에 의해 승인되었고, 동물은 프로토콜에 기재된 대로 처리되었다.
1-22. ( In vivo ) 펩타이드 안정성 (stability of peptide) 평가
친수성 AMP (8 mg/kg) 및 금 나노입자-압타머-AMP (8 mg/kg) 복합체를 정맥 주사 (i.v.)하였다. 주사 0, 6, 12, 24, 또는 48 시간 후, 마우스를 희생시키고 비장 및 간을 제거한 뒤 이를 4 ℃, 4 % (v/v)의 파라포름알데히드에서 밤새 고정시켰다. 고정된 장기들은 이틀간 4 ℃, 30 % (v/v) sucrose로 탈수시킨 후, 최적의 절단 온도 화합물에 임베딩 (embedding)하였다. 냉동 블록은 10 mm로 절단하고, 열풍 건조 후, 단편을 Alexa 488 표지 항-His 및 rabbit IgG 항체로 면역염색하였다. 공초점 현미경 (laser scanning confocal microscopy, Carl Zeiss ZEN 2011, Germany)을 통하여 Alexa488 (495 nm excitation, 519 nm emission) 형광을 탐지하였다.
1-23. ( In vivo ) 세포 내 박테리아 세포 (intracellular bacteria cell) 생균수 측정
살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium) ATCC14028의 접종원은 미드-로그 상의 LB에서 배양하고 PBS로 세척하였다. 마우스는 접종 전 4-18 시간 동안 음식 및 물을 섭취하지 않도록 하였다. 그 후, 마우스는 복강 내 살모넬라균 1-5 x 102 CFU를 함유하는 100 μl PBS로 감염시켰다. 세균 투여 (bacterial challenge) 4 시간 후, 금 나노입자-압타머-AMP (8 mg/kg) 복합체 및 대조군 시약을 하루에 한번 정맥 주사 (i.v.)하였다.
세균 투여 (bacterial challenge) 3일 후, 대조군 그룹, A3-APOHis-, AuNP-AptHis-HPN3His-, 및 AuNP-AptHis-A3-APOHis 처리 마우스를 희생시키고 장간막 림프절, 비장, 및 간을 제거하였다. 장기들의 무게 측정 및 개별적 균질화 후, PBS에 용해시켰다. 균질 현탁액 (homogenate)은 Salmonella-Shigella agar (Neogen, Lansing, MI, USA)에 플레이팅 후, 콜로니를 계수할 수 있도록 밤새 37 ℃에서 배양하였다. 결과는 g 당 CFU의 숫자로 표현하였으며, 분석은 두 번 반복하였다.
1-24. ( In vivo ) 금 나노입자-압타머-AMP 복합체에 의한 세균 투여 및 치료
세균 투여 (bacterial challenge) 4 시간 후, 금 나노입자-압타머-AMP (8 mg/kg) 복합체 및 대조군 시약을 연속 5 일 동안 하루에 한번 정맥 주사 (i.v.)하였다. 주입된 마우스는 감염 후 14 일 동안 관찰하였으며, 빈사 된 (moribund) 경우는 즉시 희생시켰다.
실시예 2: 금 나노입자- 압타머 복합체를 통한 항균 펩타이드 (AMP)의 항균 활성 및 세포 내 전달능 확인
히스티딘-태그 DNA 압타머와 결합된 금 나노입자 (AuNP-AptHis)가 헥사히스티딘 (His)-태그 항균 펩타이드 (AMPHis)를 포유동물 세포 내로 전달하여 항균 활성을 나타낼 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험하였으며, 이의 개략적인 모식도는 도 1에 나타내었다.
2-1. 펩타이드의 항균 활성 확인
먼저, C-말단 히스티딘-태그 A3-APO (A3-APOHis)의 살균 활성 및 세포 독성을 평가하였다. A3-APO는 자연 곤충산물 (insect products)에서 파생된 합성 AMP의 새로운 클래스의 주력 펩타이드로, in vitro 및 in vivo에서 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica) 혈청형 티피뮤리움 (Typhimurium)에 대한 살균 활성이 있으며 (하기 표 1 및 도 2a), 이에 헥사히스티딘으로 표지하더라도 A3-APO의 랜덤 코일 구조를 변경하지 않는바, His-비표지된 경우와 비교하여도 여전히 살모넬라에 대한 살균 활성을 갖는다. 또한, A3-APOHis는 200 μM 농도에서 HeLa 세포에 세포 독성을 나타내지 않았다 (도 2b). 이때, 음성 대조군으로서 사용된 히스티딘-태그 HPN3 (HPN3His)의 경우는 살균 작용 또는 세포 독성을 어느것도 나타내지 않았다. 또한, 최소 억제 농도 (MIC)의 A3-APO 및 A3-APOHis 펩타이드와 함께 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium) 세포를 20 분 동안 처리하는 경우, 프로피디움 요오드화물-민감성 세포의 수가 대폭 증가됨을 확인하였는바, 박테리아 세포의 사멸이 A3-APO 및 A3-APOHis 펩타이드에 의해 빠르게 유도되는 것을 알 수 있었다.
Figure 112016118951275-pat00001
2-2. 금 나노입자-압타머 복합체를 통한 항균 펩타이드 (AMP)의 세포 내 전달능 확인
먼저, 히스티딘-태그 AMPs를 단순 혼합 배양하여 금 나노입자-압타머His에 로딩한 후, HeLa 세포에 적용한 결과, 반응 혼합물에서 히스티딘-태그 AMPs의 약 40-50 %가 금 나노입자-압타머His에 로딩되었다 (도 2c).
이에, 상기 실시예 1-16의 방법에 따라, AMPs 및 AuNP-AptHis의 최종 농도는 각각 16 mM 및 1 nM로 하여, 버퍼, 유리 A3-APOHis, 금 나노입자-압타머His, 금 나노입자-압타머His-A3-APOHis, 또는 금 나노입자-압타머His-HPN3His를 첨가하여 1 시간 동안 배양한 HeLa 세포의 형광 이미지 (스케일 바 = 20 μm)를 확인한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 히스티딘-태그 AMPs (A3-APOHis 또는 HPN3His)가 로딩된 금 나노입자-압타머His와 함께 배양된 HeLa 세포의 경우 면역 및 공초점 레이저 주사 현미경 분석에서 강한 형광 신호를 나타내었으나, 단지 금 나노입자-압타머His 또는 A3-APOHis 펩타이드 만으로 처리된 대조군 세포에서는 형광 신호를 나타내지 않았다.
실시예 3: A3-APO 및 A3-APO His 의 작용 메커니즘 확인
상기 금 나노입자-압타머 복합체를 통한 항균 펩타이드 (AMP)의 항균 활성 및 세포 내 전달능 결과를 바탕으로, A3-APO 및 A3-APOHis 펩타이드의 작용 메커니즘을 확인하기 위하여, 실시예 1-10 내지 1-15의 방법으로 실험하였다.
먼저, A3-APO 및 A3-APOHis 펩타이드의 막 결합 상호작용을 관찰하기 위하여, 인지질에 결합시에 발생하는 응집 및 기공 형성 작용을 통하여 막-모방 환경을 만드는 음이온성 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 미셀을 사용하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 두 펩타이드의 원편광이색성 (Circular dichroism, CD) 스펙트럼은 막-모방 환경에서 30 mM SDS 미셀과 같은 자기 연합 (self-association)을 보이지 않았으나, SDS에서 히스티딘 잔기의 화학적 이동 값은 약간 변경됨을 확인하였다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium) 세포에 A3-APO 및 A3-APOHis 펩타이드 첨가시, DisC3-5 형광 강도에서 외막 분열이 나타난 반면, 외막의 손상이 없는 경우 형광 강도의 변화는 관찰되지 않았다. 보다 구체적으로, A3-APO 및 A3-APOHis는 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)의 외막에 작용하는 동일한 메커니즘을 공유하지 않은 것으로 보였다. A3-APO 펩타이드는 빠르게 반응하면서 일시적인 기공 형성을 유도한 반면, A3-APOHis는 이러한 현상이 나타나지 않았으며, 대신, 막-탈분극 활성을 증가시킴을 확인하였다.
이에, 펩타이드가 SYTOX 그린이 로딩된 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium) 세포의 세포질 막 분열을 일으킬 수 있는지 여부를 확인한 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, A3-APO 및 A3-APOHis가 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)의 내부 막 분열을 유도하는 것을 확인하였으며, 막 파괴는 SYTOX 녹색 형광 강도의 증가에 기초하여 알 수 있었다. 이때, 세포 내 SYTOX 형광 염료 신호는 세포막이 손상되는 경우 변하지 않지만, 염료가 막 파괴로 인해 노출된 핵산에 결합하는 경우 증가한다.
또한, 포스파티딜에탄올아민/포스파티딜글리세롤 (PE/PG, 7:3, v/v)을 포함하는 하나의 거대 단일층 소포체 (GUVs)를 사용하여 펩타이드의 형태학적 변화 및 지역화 (localization) 여부를 확인한 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, A3-APOHis는 A3-APO에 비해 더 큰 정도로 GUV 막을 파괴함을 확인하였으며, 특히, A3-APOHis 펩타이드는 C-말단 영역에 양전하를 띠는 헥사히스티딘을 삽입하여 GUV 막에 있는 지질을 둘러싸는 것을 알 수 있었다. 즉, A3-APOHis 항균 펩타이드는 일종의 "카펫 같은" 행동 메커니즘을 통해 기능할 수 있지만, A3-APO 펩타이드는 일시적인 기공 형성에 따라 세포막을 침투할 수 없었음을 알 수 있었다 (도 8a).
나아가, 공초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)을 사용하여 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium) 배양시 로다민 표지-펩타이드의 위치를 모니터링함으로써 살아있는 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium) 세포에서 A3-APO 및 A3-APOHis의 메커니즘을 확인한 결과, 로다민-표지 A3-APOHis 펩타이드와는 반대로, 로다민-표지 A3-APO 펩타이드는 세포질보다는 세포 표면에 축적됨을 알 수 있었으며, 이는 A3-APO 항균 펩타이드의 경우 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium) 막으로부터 핵산 및 연관 단백질과 상호작용하는 세포질로 이동하는 것을 의미하나, A3-APOHis 펩타이드는 세포막을 파괴하는 세포 표면과 강하게 상호작용하는 것을 의미한다. 따라서, 이러한 펩타이드는 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)의 세포 사멸을 유발하는 다른 메커니즘을 통해 역할을 한 것으로 보인다.
또한, 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하여 각 MIC의 A3-APO 또는 A3-APOHis를 첨가하여 배양된 살모넬라 ATCC14208 세포를 확인한 결과, A3-APOHis 펩타이드가 세포질 막에서 막 파괴를 발생시키는 것을 확인하였으나, A3-APO 펩타이드는 세포막에 영향을 미치지 않았다. 즉, A3-APOHis 펩타이드는 세포질 막을 파괴하여 박테리아를 사멸시킬 수 있는 반면, A3-APO 펩타이드는 단지 막에 일시적인 기공을 형성하여 세포에 침투할 수 있음을 확인하였다 (도 8b).
실시예 4: ( in vitro ) 살모넬라 티피뮤리움 ( S. Typhimurium )-감염 포유동물 세포에 대한 금 나노입자-압타머-AMP 복합체의 항균 효과 확인
살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)-감염 세포에 있어 금 나노입자-압타머His-A3-APOHis의 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-19의 방법으로 실험하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 금 나노입자-압타머His-A3-APOHis를 첨가한 경우, 금 나노입자-압타머His 또는 금 나노입자-압타머His-HPN3His를 첨가한 세포에 비해 세포 내 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium) 세포 수는 약 30-50 % 낮게 나타났으며, 금 나노입자-압타머His-A3-APOHis의 살균 효과는 용량-의존성을 나타냄을 확인하였다 (도 10a). 또한, A3-APOHis를 1 시간 동안 처리한 경우, 생존 가능한 세포 내 살모넬라 세포 수에 영향을 미치지 않은 반면, 6 시간 동안 동일 처리한 경우, 생존 가능한 세포 내 박테리아 수가 약 20 % 감소함을 확인하였으며, 이러한 A3-APOHis의 살균 효과는 A3-APO에 대해 보고 된 바와 같이, 포유류 세포에 대한 낮은 침투성 때문인 것으로 보인다.
따라서, 금 나노입자-압타머His 결합체가 효과적으로 포유동물 세포의 혈장 막을 통해 항균 펩타이드를 전달하여 세포 내 세균에 대한 A3-APOHis의 살균 작용을 향상시킬 것으로 기대된다.
이에, 금 나노입자-압타머His에 로딩 시 A3-APOHis의 안정성을 향상시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 혈청 내에서 추가적으로 48 시간 동안 배양하여 온전한 A3-APOHis의 양을 측정하였다. 그 결과, 금 나노입자-압타머His에 로딩하지 않을 경우 온전한 A3-APOHis가 빠르고 점진적으로 감소됨을 확인하였으며, 결과적으로 혈청 배양 48 시간 후, 펩타이드의 약 60 %가 사라짐을 확인하였다 (도 10b). 반면, 혈청 내 금 나노입자-AptHis 복합체에 로딩된 A3-APOHis의 분해 (degradation)는 A3-APOHis 자체보다 느리게 나타났으며 (48 시간 배양 후, 80 % 이상 혈청에 남았음), 이러한 결과는 금 나노입자-압타머His가 숙주 세포의 침투성 뿐만 아니라 A3-APOHis의 안정성을 향상시킬 수 있음을 의미한다.
금 나노입자-압타머His를 통한 A3-APOHis의 전달이 세포 내 박테리아의 사멸을 유도한다는 사실을 바탕으로, 금 나노입자-압타머His-A3-APOHis를 통한 세포 내 박테리아 수의 감소가 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)-감염 HeLa 세포의 생존성을 증가시킬 수 있는지 여부를 상기 실시예 1-20의 방법으로 실험하여 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 금 나노입자-압타머His-A3-APOHis를 처리한 세포의 경우, 계속적으로 증식하여 결과적으로 24 시간 이내에 생존 HeLa 세포의 수를 약 80 % 증가시켰으며, 이러한 결과는 살모넬라에 감염되지 HeLa 세포의 수준과 비슷했다. 반면, 금 나노입자-압타머His 또는 금 나노입자-압타머His-HPN3His로 처리된 세포의 경우, 비처리 세포와 비슷한 수준인 생존 HeLa 세포의 수의 약 40 % 감소를 나타냈다. 또한, 금 나노입자-압타머His 또는 금 나노입자-압타머His-HPN3His로 처리된 것과 비교할 때, A3-APOHis 처리한 경우에는 생존 세포의 수가 약 15 % 감소하였으며, 이러한 결과는, 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)-감염 HeLa 세포에 대한 A3-APOHis의 세포 내 살균 활성의 낮은 수준과 일치하였다.
상기 내용을 종합하면, 금 나노입자-압타머His 복합체에 의한 A3-APOHis의 세포 내 박테리아 살균 활성의 증가는 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)-감염 포유동물 세포의 생존성을 증가시키고, 계속적으로 증식할 수 있도록 하며, HeLa 세포에서 금 나노입자-압타머His 복합체로부터 A3-APOHis의 분리는 Cy5-표지 금 나노입자-압타머His에 로딩된 A3-APOHis로 처리 한 HeLa 세포의 공초점 형광 이미지로 확인하였다.
실시예 5: ( in vivo ) 살모넬라 티피뮤리움 ( S. Typhimurium )-감염 마우스에 대한 금 나노입자- 압타머 -AMP 복합체의 살균 효과 확인
상기 실시예 결과를 바탕으로, 또한 이 시스템이 살아있는 유기체에 적용될 수 있는지 여부를 검토하였다. 이를 위해, 인간 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)에 의해 야기된 장티푸스와 유사한 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)-감염 마우스 모델을 이용하였다.
먼저, 급성 감염은 FvB/N 마우스당 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium) 1-5 x 102 CFU를 복강 주사 (i.p.)하여 유도하였으며, 상기 접종 후 8 시간 동안, 장간막 림프절, 비장, 및 간을 포함하는 마우스의 장기들에서의 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)의 확산을 모니터링하였다. 접종 4시간 후, 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)의 증식 및 이들 기관에의 정착을 확인하였다.
또한, 금 나노입자-압타머His-A3-APOHis의 효과를 최적화하기 위해, 마우스에 금 나노입자-압타머His-A3-APOHis (8 ㎎/㎏)를 정맥 주사 (i.v.) 후 48 시간 동안 각 장기 내 온전한 A3-APOHis의 상대적인 양을 분석함으로써, A3-APOHis의 반감기를 측정하였다. 이때, A3-APOHis의 존재는 면역염색 및 공초점 레이저 주사 현미경으로 측정하였으며, 이에 따라 측정된 A3-APOHis의 반감기는 기타 관련된 프롤린-풍부 펩타이드보다 훨씬 긴 수치인 28 시간으로 나타났다 (도 12). A3-APOHis는 이를 단독으로 주입 시 마우스의 장기에서 검출되지 않았음을 고려할 때, 금 나노입자-압타머His가 마우스에서 A3-APOHis의 안정성 뿐만 아니라 세포 침투성도 강화함을 알 수 있었다.
다음으로, 금 나노입자-압타머His 복합체가 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)-감염 마우스에서 A3-APOHis의 세포 내 살균 능력을 증가시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-23 및 1-24의 방법으로 실험하였다.
먼저, 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium) 세포 접종 4시간 후, 버퍼, A3-APO, A3-APOHis, 금 나노입자-압타머His, 금 나노입자-압타머His-HPN3His, 또는 금 나노입자-압타머His-A3-APOHis를 감염 마우스에 연속 5 일 동안 하루에 한 번 정맥 주사 (i.v.)하고, 각 군 마우스의 생존율은 10 일 동안 측정하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 상기 마우스의 평균생존기간 (median survival duration)은, 버퍼, A3-APO, A3-APOHis, 금 나노입자-압타머His, 또는 금 나노입자-압타머His-HPN3His로 3 회씩 주입한 경우 5.1-5.7 일이었던 반면, 금 나노입자-압타머His-A3-APOHis로 처리된 마우스의 경우, 모든 마우스가 측정 기간 내에 생존하였다.
이에, 이러한 금 나노입자-압타머His-A3-APOHis로 처리된 마우스의 100 % 생존이 세포 내 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium) 세포의 완전한 제거에 기인한 것인지 확인하기 위하여, 장간막 림프절, 비장, 및 간 등 마우스의 장기에서 생존하는 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium) 세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 접종 사흘 후, 감염된 마우스의 이환율 (morbidity)의 가시적 징후가 나타나지 않았을 때, 버퍼, A3-APO, A3-APOHis, 금 나노입자-압타머His, 또는 금 나노입자-압타머His-HPN3His로 처리한 마우스와 비교하여 금 나노입자-압타머His-A3-APOHis로 처리된 마우스의 경우, 세 장기 모두에서 생존한 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium) 세포의 수가 ~93-98 % 감소하였으며, 연속 5 일 동안 하루에 한 번 금 나노입자-압타머His-A3-APOHis를 주입한 감염 마우스의 장기에서는 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium)의 정착이 관찰되지 않았고, 마우스는 접종 7일 후 희생되었다.
상기 내용을 종합하면, A3-APOHis가 로딩된 금 나노입자-압타머His 복합체의 정맥 주사 (i.v.) 주입은 세포 내 살모넬라 티피뮤리움 (S. Typhimurium) 세포를 완전히 제거하고 감염 마우스를 생존할 수 있게 함을 알 수 있었다.
실시예 6: ( in vivo ) 비브리오 불니피쿠스 ( Vibrio vulnificus )-감염 마우스에 대한 금 나노입자-압타머-AMP 복합체의 살균 효과 확인
상기 실시예 결과를 바탕으로, 또한 이 시스템이 다른 감염성 세균인 비브리오 불니피쿠스 (V. vulnificus)의 감염에 적용될 수 있는지 여부를 검토하였다. 이를 위해, 사람에서 패혈증, 식중독을 일으키는 세균인 비브리오 불니피쿠스 (V. vulnificus) 감염 마우스 모델을 이용하였고, 비브리오 불니피쿠스 (V. vulnificus) 특이적 억제 효과가 있는 압타머 HPA3P 및 HPA3PHis를 사용하였다.
비브리오 불니피쿠스 (V. vulnificus) 세포 접종 2 시간 후, 버퍼, HPA3PHis, 금 나노입자-압타머His, 또는 금 나노입자-압타머His-HPA3PHis를 감염 마우스에 1 회 정맥 주사 (i.v.)하고, 각 군 마우스의 생존율은 5 일 동안 측정하였다.
그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 상기 마우스의 평균생존기간 (median survival duration)은, 버퍼, HPA3PHis, 또는 금 나노입자-압타머His로 1회 주입한 경우, 24~40 시간인 반면, 금 나노입자-압타머His-HPA3PHis로 처리된 마우스의 경우, 모든 마우스가 측정 기간 내에 생존하였다.
상기 내용을 종합하면, HPA3PHis가 로딩된 금 나노입자-압타머His 복합체의 정맥 주사 (i.v.) 주입은 세포 내 비브리오 불니피쿠스 (V. vulnificus) 세포 감염 마우스를 생존할 수 있게 함을 알 수 있었다.
따라서, 금 나노입자-압타머His 복합체를 항균 펩타이드의 전달 물질로 사용하는 경우, 독성을 낮추고 전달 효율 높일 수 있는 바, 이를 항균 물질을 이용한 치료에 응용할 수 있음을 시사하고 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (7)

  1. 금 나노입자;
    상기 금 나노입자의 표면에 결합되는 히스티딘(His) 태그(tag) DNA 압타머 (aptamer); 및
    상기 압타머에 결합되는 히스티딘 태그 A3-APO 펩타이드로 이루어지는 나노 구조체를 포함하는, 항균용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 금 나노입자는 10-20 nm의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 압타머는 상기 히스티딘 태그 A3-APO 펩타이드의 히스티딘 태그에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 삭제
  7. 금 나노입자와 히스티딘(His) 태그(tag) DNA 압타머(aptamer)를 결합시키는 단계; 및
    상기 압타머에 히스티딘 태그 A3-APO 펩타이드를 결합시키는 단계를 포함하는, 나노 구조체 제조 방법.
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