KR20150101067A - 암세포 바이오마커 검출용 패턴화된 탄소 나노튜브 바이오센서 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탄소 나노튜브(carbon nanotube); 상기 탄소 나노튜브의 표면에 컨쥬게이션된, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen)과 특이적으로 결합하는 압타머; 상기 압타머를 탄소 나노튜브에 고정시키되, 탄소 나노튜브의 표면 상 고정물질과 압타머가 아마이드 결합으로 컨쥬게이션된, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen) 검출용, 압타머 고정화된 탄소 나노튜브(aptamer-conjugated carbon nanotube, ACNT) 바이오센서 및 이를 이용한 암배아 항원의 검출방법에 관한 것으로서, 암배아 항원의 라벨-프리 검출이 가능하고, 민감도가 매우 높으며, 단일-분자 해상도에서 암배아 항원 단백질의 인식(recognition)이 가능하고, 정량적 통찰을 가능하게 한다는 장점이 있다.

Description

암세포 바이오마커 검출용 패턴화된 탄소 나노튜브 바이오센서 {Patterned-carbon nanotube biosensor for detecting cancer biomarker}

본 발명은 탄소 나노튜브(carbon nanotube); 상기 탄소 나노튜브의 표면에 연결된, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen)과 특이적으로 결합하는 압타머; 상기 압타머와 탄소 나노튜브는, 탄소 나노튜브 표면 상 고정물질과 압타머의 아마이드 결합으로 연결된 것인, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen) 검출용, 압타머 고정화된 탄소 나노튜브(aptamer-conjugated carbon nanotube, ACNT) 바이오센서에 관한 것이다.

본 발명은 암의 조기진단을 위한 몇 가지 혈중종양세포(circulating tumor cells, CTCs)의 검출을 가능하게 하는 생화학적 분석 툴킷을 창안하는데 있어 매우 중요한 의미가 있다. 몇 몇의 CTC를 검출하기 위한 최근의 노력에도 불구하고, 몇 몇의 CTC 상에 발현된 낮은 농도 및/또는 극미량의 마커 단백질을 이러한 세포에서 센싱하기 위한 연구는 계속되고 있다.

나노스케일 센서는 특정 질환의 신호(signature)인 특정 마커 단백질을 포획(capture)하기 위한 센서의 능력에 기초하여 암과 같은 질환의 진단에 중요하게 기여하여왔다. 마커 단백질과 센서의 표면간 생화학적 상호작용(interaction)은 전기화학적 또는 전기적 방법, 나노메커니컬 검출, 형광 분석 및 마이크로플루이딕 시스템을 통해 측정되어왔다. 최근 암화세포(cancerous cell)상에 발현된 마커 단백질의 검출은 외과적 절제 후 예후의 모니터링 및 암의 효과적 진단에 있어 많은 관심을 받고 있다. 특히, 암의 조기진단에 있어서, 환자의 혈액시료로부터의 혈중종양세포(circulating tumor cell, CTC)상에 발현되는 암배아 항원(CEA)을 검출하는 것이 매우 중요하다. 암진단을 위해, 2.5 ng/mL 이하 (또는 1 내지 10 CTCs per mL) 농도의 CEA(또는 CTC)라는 극미량을 검출하는 것이 필요하다. 이러한 낮은 농도의 CEA (또는 CTC)의 검출은 복잡한 마이크로플루이드 칩(microfluidic chip) 또는 신호 증폭 또는 라벨링과 같은 다루기 힘든 과정을 필요로 하는 PCR을 통해 시행되고 있다.

현재까지의 진단용 센서는 대개의 경우 항원-항체 반응을 이용한 진단용 센서가 센서 시장의 대부분을 차지하고 있으며, 항원-항체 반응은 그 특이성이 매우 뛰어나서 정확한 진단용 도구로 매우 가치가 높은 장점을 가지고는 있으나, 항체가 단백질로 이루어져 있다는 단점도 가지고 있다.

특정 항체의 합성은 고 난이도의 배양과 합성을 요구하며 각 배치에 따라 합성된 항체의 특성이 조금씩 다를 수 있다는 문제점도 내포하고 있고 무엇보다 고가에서 오는 문제점이 상용화의 최대 걸림돌이 되고 있다.

또한, 단백질이 갖는 안정성의 문제는 항원-항체 반응을 이용한 바이오센서의 유통기한에 제한을 줄 수 밖에 없고, 이 또한 단가 상승 및 진단센서의 오작동의 원인이 될 수 있다.

따라서, 항체와 유사하거나 더욱 우수한 기질 특이성을 갖는 동시에 단백질인 항체와는 달리 뛰어난 안정성을 가지고 있으며 저가 생산이 가능한 진단센서의 개발이 요구되고 있다.

혈중종양세포(Circulating Tumor Cells, CTC)는 전이암 환자의 혈액에 존재하는 미량의 암세포로, 이들이 혈액을 통해 다른 인체의 조직으로 전이가 되며, 새로운 조직에 고착되어 전이암으로 발전되는 역할을 한다고 알려져 있다. 이 혈중종양세포는 통상 일반세포 10억 개당 1 ~ 100 개 정도의 극미량만이 혈액 안에 존재하여 현실적으로 혈중 종양세포를 정확하게 발견하고 분리하는 데 큰 어려움이 있다. 암 환자의 10명 중 9명이 전이암을 통해 사망하는 만큼 혈중종양세포를 발견할 수 있다면 전이암으로 인한 사망률을 크게 줄일 수 있다.

한편, CEA(Carcinoembryonic antigen)는 당단백으로 위장관암에서 가장 흔히 사용되는 종양 표지자이다. 초기에는 대장암에 특이적인 표지자로 생각되었으나, 유방암, 폐암, 간암 등에서도 증가할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 양성 예측률이 낮아 선별 검사로는 잘 이용되지 않으나 대장암의 병기, 예후 판정, 재발 판정에 이용될 수 있다. CEA(CEACAM5)는 180 kDa의 GIP 연결 막 당단백질이고, 70%의 폐암과 50%의 유방암을 비롯하여 대장암, 위암, 췌장암에서 발현되고 있다. 또한, CEA는 암태아성 항원으로서 태아의 장조직과 일반 성인의 대장 상피 세포에서도 어느 정도 발현이 되고 있다. CEA는 당화(glycosylation)가 많이 되어 있고, 시그널 펩타이드에 의해서 소포체를 통해 최종적으로는 세포막으로 이동하며, 포스트-트랜슬레이션 동안 시그널 펩타이드는 제거된다. 이 과정을 거친 CEA 단백질은 N-말단에 107개의 아미노산으로 구성되어 있는 N 도메인(domain)과 각 도메인이 178 개의 아미노산으로 구성되어 있는 Ig와 유사하게 반복되는 6개의 도메인(A1, B1, A2, B2, A3, B3)으로 구성되고, C-말단은 GPI막 앵커(glycosylphosphatidylinositol membrane anchor)로 이루어진다. CEA의 혈액 내 농도는 주로 대장암 수술 후 예후 판단의 기준으로 사용되고 있다.

검사는 통상 채혈하여 검체를 획득하여 실시되는데, 종양 표지자의 항목들을 검사하는 데에는 대개 면역 검사(immunoassay)가 이용된다. 면역 검사는 항원항체 반응을 이용한 검사로, 측정하고자 하는 물질에 선택적으로 결합하는 항체를 이용해서 원하는 물질을 측정할 수 있다. 대표적인 면역 검사의 종류와 원리는 다음과 같다. 기관별로 사용하는 방법과 구체적인 반응 조건은 약간 차이가 있을 수도 있으나 기본 원리는 거의 동일하다.

응집법(particle immunoassay)은 항원과 항체의 결합에 의해 응집 반응(agglutination)이 나타나는 것을 이용하는 것이다. 대개 적혈구나 라텍스(latex), 젤라틴(gelatin) 등에 항원이나 항체를 부착시켜 이 입자가 반응하면 응집을 나타내는 것을 측정한다. 응집 측정은 빛의 흡수 정도를 혼탁 측정법(turidimetry)으로 측정하거나 빛의 산란 정도를 비탁법(nephelometry)로 측정할 수 있다.

효소 면역 측정법(enzyme immunoassay, EIA)은 항원과 항체의 결합을 효소 반응(enzyme reaction)을 이용하여 측정하는 것이다. 대개 측정하고자 하는 물질에 결합하는 항체에 효소를 미리 부착시켜놓고 항원항체 반응을 일으킨다. 그 후 결합한 효소에 반응하는 기질을 넣어주면 효소 반응이 일어나게 된다. 흔히 이용하는 효소는 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase), 홀스래디쉬 과산화효소(horseradish peroxidase), 베타갈락토시다아제(β-galactosidase) 등이 있다. 효소 반응의 산물은 대개 색깔을 띠는 물질로 이를 분광광도계(spectrophotometer)로 측정한다.

방사 면역 측정법은 항원과 항체의 결합을 방사성동위원소(radioisotope)를 이용하여 측정하는 방법이다. 방사성동위원소란 물리적으로 불안정하여 자연적으로 붕괴(radioactive decay)를 일으키면서 안정한 물질로 바뀌고, 이 과정에서 방사선을 방출하는 물질이다. 측정하고자 하는 물질과 같은 물질에 방사성동위원소를 부착하거나, 또는 측정하고자 하는 물질에 반응하는 항체에 방사성동위원소를 부착하여 항원항체 반응을 일으킨다. 반응이 끝난 후 반응물에서 나오는 방사선의 양을 측정하여 원하는 물질의 농도를 계산해낼 수 있다. 많이 이용하는 방사성동위원소들은 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³H, ¹⁴C, ³²P 등이 있다. 방사면역측정법은 과거에 많이 이용되었으나 방사성 물질을 사용해야 하는 위험이 있고, 화학 발광 면역 측정법 같은 방법들이 개발되면서 쓰임새가 감소하는 추세이다.

형광 면역 측정법은 항원과 항체의 결합을 형광 반응(fluorescence)을 이용하여 측정하는 방법이다. 형광 반응이란 형광 물질이 특정 파장의 빛을 흡수하여 형광 물질의 분자가 여기(excitation)되었다가 다시 원래의 상태로 돌아오면서 흡수한 빛과는 다른 파장의 빛을 내는 반응을 말한다. 면역 측정에 이용할 때에는 측정하고자 하는 물질과 같은 물질에 형광 물질을 부착하거나, 또는 측정하고자 하는 물질에 반응하는 항체에 형광 물질을 부착하여 항원항체 반응을 일으킨다. 반응이 일어난 후 형광 반응을 일으킬 수 있는 파장의 빛을 투사하면 형광 물질의 양에 비례하여 형광을 내고, 이 형광의 양으로부터 측정 물질의 농도를 계산한다.

화학 발광 면역 측정법은 항원과 항체의 결합을 화학 발광 반응(chemiluminescence)을 이용하여 측정하는 방법이다. 화학 발광 반응이란 화학 발광 물질이 여기(excitation)되었다가 기저 상태(ground state)로 돌아오면서 빛을 발하는 현상으로, 분자를 여기시키는 에너지가 빛이 아닌 화학 반응이라는 점에서 형광과 다르다. 면역 측정에 이용할 때에는 다른 방법들과 마찬가지로 측정하고자 하는 물질과 같은 물질에 화학 발광 물질을 부착하거나, 또는 측정하고자 하는 물질에 반응하는 항체에 화학 발광 물질을 부착하여 항원항체 반응을 일으킨다. 반응이 일어난 후 필요한 화학 반응을 일으킨 후, 발산되는 발광의 정도를 측정하여 이로부터 측정 물질의 농도를 계산한다. 대표적인 발광 물질로는 루미놀(luminol), 이소루미놀(isoluminol), 아크리디늄 에스터(acridinium ester) 등이 있다.

미국암학회(American Society of Clinical Oncology)의 가이드라인에 따르면 CEA는 대장암에서 선별검사로 이용하기에는 부적합하다. 하지만 수술 전 병기 결정 및 치료 계획 수립에 도움이 될 수 있어 수술 전 검사로 많이 이용된다. 수술 후에는 재발 여부를 판단하기 위한 표지자로 이용될 수 있고 전이성 병변의 모니터에도 이용할 수 있다. 항암 치료에 대한 반응 판정에도 이용할 수 있으나 항암 치료 초기에는 상승할 수도 있다(참고치가 비흡연자인 경우 0~3 ng/mL, 흡연자인 경우 0~5 ng/mL임).

최근, 앞서 언급한 센싱 방법 대신 스캐닝 프로브 마이크로스코피(scanning probe microscopy, SPM)-기반 이미징 기술이 고감도 및 고효율도를 갖는, 마커 생분자의 라벨-프리 검출능으로 인하여 관심을 끌고 있다. 예를 들어 딥-펜(dip-pen) 리쏘그라피에 기초한 패턴화된 센싱 표면 또는 배열된(정렬된, aligned) CNT가 1pM 미만의 농도로 마커 단백질을 민감하게 검출하는 것을 가능하게 하였다. 특히, CNT(직경 4nm 이하)는 최소한의 센싱면적 컨스트럭션(construction)만이 요구되고, 1pM까지 검출감도가 향상되는 결과를 나타냈다. 게다가 CNT는 수용체 분자의 기능화(functionalization)에 적합하며, CNT 및 수용체 분자간 π-스태킹 상호작용(stacking interaction)을 사용하여 특정 타겟 분자의 선택적 검출에 중요하다.

본 발명에서는 몇몇 혈중종양세포(CTC)상에 발현된 암배아 항원(CEA)의 라벨-프리 인식이 가능하다는 점을 입증하였다. 인식(Recognition)을 위하여 SPM 이미징과 함께 CNT 센서를 이용하였으며, 이는 암진단용으로 활용될 수 있다. CNT-패턴화된 표면은 특히 CTC의 전체 세포 용해물(whole cell lysate)에서 CEA 분자를 10^-3 cells/mL 농도까지 포획할 수 있다. CNT-패턴화된 표면에 기초한 바이오어세이법은 몇몇 종양 세포상에 발현된 마커 단백질을 매우 고감도(sensitive)로 검출하는 것이 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 종양 세포상에 발현된 마커 단백질을 매우 고감도로 신속하게 검출함으로써 암의 정확한 진단 및 조기진단이 가능하도록 하는 진단툴을 제공하는 것이다.

보다 상세하게, 탄소 나노튜브(carbon nanotube); 상기 탄소 나노튜브의 표면에 연결된, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen)과 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하고; 상기 압타머와 탄소 나노튜브는, 탄소 나노튜브 표면 상 고정물질과 압타머의 아마이드 결합으로 연결된 것인, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen) 검출용, 압타머 고정화된 탄소 나노튜브(aptamer-conjugated carbon nanotube, ACNT) 바이오센서를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 탄소 나노튜브 표면에 압타머를 컨쥬게이션시키되, 탄소 나노튜브 표면을 소수성으로 개질하고, 상기 소수성으로 개질된 탄소 나노튜브의 표면에 압타머가 아마이드 결합에 의해 컨쥬게이션되는 단계; 및 상기 압타머와 특이적으로 결합하는 암배아 항원이 압타머에 노출되었을 때 이를 주사 탐침 현미경(Scanning probe microscopy)으로 검출하는 단계를 포함하는, 제1항에 기재된 바이오센서를 이용하여 암배아 항원을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 암배아 항원 특이적 압타머(aptamer specific for carcinoembryonic antigen)가 탄소 나노튜브(carbon nanotube) 표면 상 고정물질과 아마이드 결합으로 컨쥬게이션 된 암배아 항원 검출용 진단키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 검체로부터 시료를 채취하는 단계; 상기 시료를 암배아 항원 특이적 압타머(aptamer specific for carcinoembryonic antigen)가 탄소 나노튜브(carbon nanotube) 표면 상 고정물질과 아마이드 결합으로 컨쥬게이션 된 암배아 항원 검출용 바이오센서에 처리하는 단계; 및 AFM(Atomic Force Microscopy) 또는 KPFM(Kelvin Probe Force Microscopy)로 암배아 항원의 부착 정도를 측정하는 단계;를 포함하는, 암의 진단방법을 제공하는 것이다.

상기목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 탄소 나노튜브(carbon nanotube); 상기 탄소 나노튜브의 표면에 연결된, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen)과 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하고; 상기 압타머와 탄소 나노튜브는, 탄소 나노튜브 표면 상 고정물질과 압타머의 아마이드 결합으로 연결된 것인, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen) 검출용, 압타머 고정화된 탄소 나노튜브(aptamer-conjugated carbon nanotube, ACNT) 바이오센서에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 바이오센서는 주사 탐침 현미경(Scanning probe microscopy)으로 검출하기 위한 바이오센서일 수 있다.

보다 바람직하게, 상기 주사 탐침 현미경은 AFM(Atomic Force Microscopy) 또는 KPFM(Kelvin Probe Force Microscopy)일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 암배아 항원은 암배아 항원-관련 세포 부착 분자(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5, CEACAM5)일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 고정물질은 파이렌(pyrene) 유도체일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 파이렌 유도체는 파이렌부티르산, 파이렌헥사노산, 파이렌옥타노산, 파이렌데카노산, 파이렌도데카노산, 파이렌테트라데카노산, 파이렌헥사데카노산, 파이렌옥타데카노산, 파이렌부티로일 클로라이드, 파이렌 헥사노일 클로라이드, 파이렌옥타노일 클로라이드, 파이렌데카노일 클로라이드, 파이렌 도데카노일 클로라이드, 파이렌 테트라데카노일 클로라이드, 파이렌헥사데카노일 클로라이드 및 파이렌옥타데카노일 클로라이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

보다 바람직하게, 상기 파이렌 유도체는 파이렌부티르산 일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 ACNT 바이오센서는 암 진단용일 수 있다.

보다 바람직하게, 상기 암은 장암(intestinal cancer), 대장암(colorectal cancer), 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 간암(liver cancer) 및 이들의 전이암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 암배아 항원 검출용 ACNT 바이오센서는 혈중종양세포(circulating tumor cell, CTC) 상에 발현된 암배아 항원을 인식하는 것일 수 있다.

보다 바람직하게, 상기 혈중종양세포의 농도가 1 cell/mL 이하인 것을 검출하는 것일 수 있다.

또한 보다 바람직하게, 상기 혈중종양세포의 농도가 1 X 10^-2 cell/mL 이하인 것을 검출하는 것일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 암배아 항원을 30분 이내에 검출하는 것일 수 있다.

또 하나의 양태로서 본 발명은, 탄소 나노튜브 표면에 압타머를 컨쥬게이션시키되, 탄소 나노튜브 표면을 소수성으로 개질하고, 상기 소수성으로 개질된 탄소 나노튜브의 표면에 압타머가 아마이드 결합에 의해 컨쥬게이션되는 단계; 및 상기 압타머와 특이적으로 결합하는 암배아 항원이 압타머에 노출되었을 때 이를 주사 탐침 현미경(Scanning probe microscopy)으로 검출하는 단계를 포함하는, 제1항에 기재된 바이오센서를 이용하여 암배아 항원을 검출하는 방법에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 주사 탐침 현미경은 AFM(Atomic Force Microscopy) 또는 KPFM(Kelvin Probe Force Microscopy)일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 압타머는 암배아 항원과 특이적으로 결합하는 압타머일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 암배아 항원은 암배아 항원-관련 세포 부착 분자(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5, CEACAM5)일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 암배아 항원을 검출하여 암을 진단하는 것일 수 있다.

보다 바람직하게, 상기 암은 장암(intestinal cancer), 대장암(colorectal cancer), 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 간암(liver cancer) 및 이들의 전이암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 암배아 항원은 혈중종양세포(circulating tumor cell, CTC) 상에 발현된 암배아 항원일 수 있다.

보다 바람직하게, 상기 혈중종양세포의 농도가 1 cell/mL 이하인 것을 검출하는 것일 수 있다.

또한 보다 바람직하게, 상기 순환종양세포의 농도가 1 X 10^-2 cell/mL 이하인 것을 검출하는 것 일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 상기 암배아 항원을 30분 이내에 검출하는 것 일 수 있다.

또 하나의 양태로서 본 발명은, 암배아 항원 특이적 압타머(aptamer specific for carcinoembryonic antigen)가 탄소 나노튜브(carbon nanotube) 표면 상 고정물질과 아마이드 결합으로 컨쥬게이션 된 암배아 항원 검출용 진단키트에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서 본 발명은, 검체로부터 시료를 채취하는 단계; 상기 시료를 암배아 항원 특이적 압타머(aptamer specific for carcinoembryonic antigen)가 탄소 나노튜브(carbon nanotube) 표면 상 고정물질과 아마이드 결합으로 컨쥬게이션 된 암배아 항원 검출용 진단키트에 처리하는 단계; 및 AFM(Atomic Force Microscopy) 또는 KPFM(Kelvin Probe Force Microscopy)로 암배아 항원의 부착 정도를 측정하는 단계;를 포함하는, 암의 진단방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 탄소나노튜브를 일직선을 성장시키고, 암세포주(LS174T 세포)의 마커 단백질인 CEACAM5를 탐지할 수 있는 압타머를 이용하여, 압터머-기능화된 탄소나노튜브(ACNT)을 제조하였다(실시예 1 및 실시예 2).

또 다른 실시예에서는, 상기 제조된 ACNT와 LS174T 세포의 마커 단백질인 CEACAM5를 이용하여 바이오어세이를 수행하고, AFM 및 KPFM을 이용하여 영상화 하여 ACNT-패턴화된 표면 이미지와 ACNT-패턴화된 표면의 CEACAM5 검출능을 확인하였다(실험예 1 내지 3).

그 결과, CNT의 표면 포텐셜, 카르복실화된 CNT상에 연결된 압타머를 확인하였고(실험결과 1), CEACAM5 단백질은 맨 CNT 상에는 비특이적으로 결합하지 않고, ACNT 상에 CEACAM5이 특이적으로 결합한다는 것을 확인하였다(실험결과 2, 3).

또한, 단일 세포 수준에서 ACNT-패턴화된 표면의 포텐셜 및 ACNT-패턴화된 표면의 검출 한계를 확인하였다.

그 결과, 매우 낮은 농도인 1 cell/mL 미만의 종양 세포상에 발현된 CEACAM5를 검출할 수 있고, 10^-3 cells/mL에 불과하더라도 CNT에 결합한 CEACAM5 단백질의 수가 CNT의 단위 길이(즉 1 μm) 당 18.3 ± 3.2 단백질로 측정되어, 본 발명에 따른 ACNT-기반 센서의 검출 감도가 다른 검출 방법에 비하여 현저히 우수하다는 것을 확인하였다(실험결과 4 및 5).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 ACNT-기반 센서 및 CEACAM5 사이의 결합친화도를 확인하였다. 그 결과, CEACAM5 마커 단백질은 ACNT-기반 센서에 의해 20분 이내에 캡쳐되는 것을 확인하였다(실험결과 6).

본 발명에 따르면, SPM 이미징과 CNT-기반 패턴화된 표면에 기초하여, CTC상에 발현된 CEA의 라벨-프리, 고감도 검출이 가능하다. CNT-패턴화된 표면의 제조를 위하여, 일직선의(straight) 탄소 나노튜브를 화학증착공법을 사용하여 실리콘 기판상에서 화학적으로 성장시키고, 탄소나노튜브를 파이레닐(pyrenyl) 분자로 화학적으로 개질(modified)시켜 CNT에 압타머가 붙을 수 있도록 화학적으로 기능화(functionalization)시켜 CEA의 특이적 검출이 가능하도록 하였다. CNT-패턴화된 표면을 사용한 CEA의 라벨-프리 인식(recognition)을 위하여, SPM 이미징 기술이 도입되었고, 이로써 배열된(정렬된, aligned) CNT-기반 패턴화된 표면에 특이적으로 결합된 CEA의 시각화(visualization)가 가능하게 되었다(도 1). 모델 CEA로서, LS074T 세포의 용해물(lysate)로부터의 암배아 항원-관련 세포-부착 분자(cell-adhesion molecule 5, 약어로 CEACAM5, 또는 CD66e)가 사용되었다. CEACAM5는 통상 인간 대장암에 과발현되는 것으로서, 암세포의 중요 기능(key function)에 있어 중요한 역할을 한다. CEACAM5는 유용한 종양 마커로서, 외과적 절제 후 재발을 감지(identify)하는데 있어 유용하고, 최근까지, CEA의 높은 발현 수준은 모노클로날 항체를 사용하여 검출해왔다. 압타머는 모노클로날 항체보다 마커 단백질을 캡쳐하는데 더욱 유용한데, 왜냐하면 재사용이 가능하고, 결합 친화도(binding affinity)가 높고 압타머의 선택성이 우수하기 때문이다. 여기에서 우리는 암화 세포 상에 발현된 CEACAM5를 센싱하기 위한 캡쳐링 프로브로 압타머를 사용하였다.

따라서, 본 발명에 따른 ACNT(ACNT-패턴화된 표면)는 암 진단을 위해 종양 세포에서 발현되는 CEA를 매우 우수하게 검출할 수 있음을 입증하였다. 또한, 기존 PCR-기반의 검출과 비교하여 PCR 과정에서 통상 필요로 하는 증폭과정 또는 라벨링 과정이 필요하지 않고, 검출감도 또한 PCR-기반 검출의 검출감도 보다 현저히 높은 것을 확인하였다.

본 발명에서 용어 "탄소 나노튜브(CNT)"란, 탄소 동소체로서 하나의 탄소가 다른 탄소원자와 육각형 벌집무늬로 결합되어 튜브형태를 이루고 있는 물질이며, 직경이 나노미터(nm) 수준으로 극히 작은 영역의 물질을 의미한다. 또한, 탄소 나노튜브는 벽을 이루고 있는 결합 수에 따라 단일벽 나노튜브(Single Walled NanoTube), 다중벽 나노튜브(Mullti Walled NanoTube) 또는 단일벽 나노튜브가 여러 개로 뭉쳐있는 형태를 다발형 나노튜브(Rope NanoTube)일 수 있다. 본 발명의 CNT는 일직선으로 성장한 CNT일 수 있고, 이 때 CNT의 성장을 위한 촉매로 철(Fe)을 사용할 수 있으나, Ni, Co 등 탄소나노 튜브를 성장시킬 수 있는 촉매는 모두 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 일예로, 본 발명에 따른 CNT의 직경은 4nm 이하 일 수 있으나, 탄소 나노튜브의 벽을 이루고 있는 결합 수에 따라 직경은 조절될 수 있어 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 탄소 나노튜브의 표면에는 압타머와 결합할 수 있는 고정물질을 포함할 수 있는데, 상기 고정물질은 탄소 나노튜브와 친화력이 좋은 분자로 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 고정물질은 파이렌(pyrene) 유도체일 수 있고, 예를 들어, 파이렌부티르산, 파이렌헥사노산, 파이렌옥타노산, 파이렌데카노산, 파이렌도데카노산, 파이렌테트라데카노산, 파이렌헥사데카노산, 파이렌옥타데카노산, 파이렌부티로일 클로라이드, 파이렌 헥사노일 클로라이드, 파이렌옥타노일 클로라이드, 파이렌데카노일 클로라이드, 파이렌 도데카노일 클로라이드, 파이렌 테트라데카노일 클로라이드, 파이렌헥사데카노일 클로라이드 또는 파이렌옥타데카노일 클로라이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 고정물질은 소수성을 갖는 한쪽 부분이 탄소 나노튜브에 흡착되고, 다른 한쪽 부분이 상기 압타머와 공유결합 되는 것일 수 있다. 본 발명에서 상기 고정물질과 압타머는 아마이드 결합을 통하여 결합될 수 있다.

용어 "압타머"란, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 본 발명의 압타머는, RNA, DNA, 수식 핵산 또는 이들의 혼합물 등의 직쇄상 또는 환상의 형태의 핵산일 수 있다. 압타머는, 파지 디스플레이(phage display) 또는 단일 클론 항체(monoclonal antibodies, "MAbs")에 의해 생성되는 펩티드와 같은 것으로서, 선택된 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 불규칙 서열 올리고뉴클레오티드의 풀(pool)로부터 시험관내 선택 프로세스에 의해 생성된 것으로서, 압타머는 성장 인자, 전사 인자, 효소, 면역글로불린, 및 수용체를 포함하는 100 이상의 단백질에 걸쳐 생성된 것이다. 전형적인 압타머는 크기가 10-15 kDa(30-45개의 뉴클레오티드)이며, 나노몰 이하(sub-nanomolar)의 친화성으로 그 표적에 결합하며, 그리고 밀접하게 관련된 표적들로부터 구분된다(예컨대, 압타머는 동일한 유전자 패밀리로부터의 다른 단백질과는 전형적으로 결합하지 않는다). 압타머가 갖는 친화성을 유도하는 동일한 유형의 결합 상호작용(예컨대, 수소 결합, 정전기적 상보성, 소수성 접촉, 입체적 배제(steric exclusion))과 항체-항원 복합체에서의 특이성을 통하여 선택된 표적에 특이적으로 결합할 수 있다.

본 발명에서 압타머는 암배아 항원에 특이적으로 결합 활성을 갖는 압타머이다. 일예로, 상기 압타머는 탄소 나노튜브의 표면에 연결되어 암배아 항원을 검출할 수 있는 본 발명에 따른 압타머 고정화된 탄소 나노튜브 바이오센서에 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 암배아 항원은 암배아 항원-관련 세포 부착 분자인 CEACAM5 일 수 있다. 또한, 상기 암배아 항원은 혈중종양세포 상에서 발현되는 것 일 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 일 양태에서, 압타머의 서열은 SELEX 방법에 기초하여 적용될 수 있다. 압타머에 대한 상세한 정보는 Arlett, J. L.; Myers, E. B.; Roukes, M. L. Nat. Nanotechnol. 2011, 6, 203에 나타나있다. 본 발명에 따른 실시예에서 압타머는 하기 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는다.

서열번호 1: GCGGAAGCGUGCUGGGCUAGAAUAAUAAUAAGAAAACCAGUACUUUCGU

**상기 서열번호 1에 대한 정보는 Y.J. Lee, et al., Gastroenterology 2012, Vol. 143, p155-165에서 확인할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 압타머와 암배아 항원의 결합을 검출하여 암을 진단하는 것일 수 있다. "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하는 것으로, 본 발명의 목적 상 암 세포의 존재, 암배아 세포의 존재, 다양한 암종의 발병 가능성 및 발병 여부 또는 암의 전이 가능성을 확인하는 것을 의미하며, 다양한 암종 또는 암의 전이여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다. 구체적으로, 환자의 시료로부터 암배아 항원을 검출함으로써 다양한 암종의 발병 가능성 및 발병 여부 또는 암의 전이 가능성을 판단하는 것일 수 있다.

상기 암은, 장암, 대장암, 유방암, 폐암, 간암일 수 있으나, 암배아 항원을 검출함으로써 진단할 수 있는 암에 해당하는 경우 제한없이 본 발명의 범위에 포함된다.

암배아 항원 검출용 ACNT 바이오센서의 일 구현예는, 시료 내 혈중종양세포의 농도가 1 cell/mL 이하에서도 암배아 항원을 검출할 수 있으며, 시료 내 혈중종양세포의 농도가 1 X 10^-2 cell/mL 이하, 나아가 1 X 10^-3 cell/mL 이하에서도 암배아 항원을 특이적으로 검출할 수 있다. 또한, 상기 바이오센서는 암배아 항원을 매우 신속하게 검출할 수 있는데 구체적으로 30분 이내에 검출할 수 있고, 보다 구체적으로 20분 이내에 검출이 가능하다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 "시료"는 혈액일 수 있으나, 암 배아 항원을 검출할 수 있는 시료에 해당하는 한 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 탄소 나노튜브의 맨 표면상에는 상기 암배아 항원이 비특이적으로 결합하지 않고, 압타머 고정화된 탄소 나노튜브에 암배아 항원이 특이적으로 결합함으로써 위와 같이 우수한 검출 감도를 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 암배아 항원 검출용 ACNT 바이오센서를 주사 탐침 현미경(Scanning probe microscopy)으로 검출 시, 무차원 고도(dimensionless height)를 측정하여 암배아 항원을 정량적으로 검출할 수 있다.

본 발명에 따른 또 다른 일 양태에서, 암배아 항원 특이적 압타머(aptamer specific for carcinoembryonic antigen)가 탄소 나노튜브(carbon nanotube) 표면 상 고정물질과 아마이드 결합으로 컨쥬게이션 된 암배아 항원 검출용 진단키트가 제공된다. 상기 진단키트를 사용하여 병원에서 뿐만 아니라 가정에서도 손쉽게 암, 전이암 등을 진단할 수 있어 암의 조기진단이 가능하다.

본 발명에서는 SPM 이미징과 결합된 ACNT-패턴화된 표면을 개발하였고, 이로써 암 진단을 위해 종양 세포에 발현되는 CEA의 라벨-프리 검출이 가능하게 되었다. 본 발명에 따른 센싱 방법은 단일 CTC 뿐만 아니라 몇 몇 CTC상에 발현되는 CEA도 검출이 가능하며, 1 cell/mL 이하 농도의 검출도 가능할 정도로 민감도가 우수하다. 특히 본 발명에 따른 센싱 방법은 단일-분자 해상도에서 CEA 단백질의 인식(recognition)이 가능하다. 또한 본 발명에 따른 센서는 CEA가 (CNT상에 기능화된) 압타머에 결합하는 동력학에 있어 정량적 통찰을 가능하게 한다는 장점이 있다. 본 발명을 이용하면, 암 진단을 위해 종양 세포에 발현되는 CEA의 라벨-프리 검출이 가능하며 새로운 생화학적 분석 툴킷을 제공함으로써 암의 조기진단의 길을 열어줄 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 특정 암 마커 단백질을 센싱하는 과정의 모식도이다.
도 2에서 a)는 압타머로 기능화된 탄소 나노튜브의 패턴화된 표면의 제조방법을 나타낸 것이고, b)는 ACNT에 의해 포획된 마커 단백질(CEACAM5)의 SPM-기초 검출과정을 나타낸 것이며, c)는 CTC 상 발현된 CEACAM5 분자를 대장암 LS174T 세포의 전체 용해물로부터 수득되는 과정을 나타낸다.
도 3에서 a)는 맨 CNT, 압타머-기능화된 CNT(ACNT), 및 압타머-개질된 CNT에 의해 포획된 LS174T 세포 용해물(1 세포/mL)로부터 추출한 CEACAM5 분자의 AFM 영상, b)는 이들의 KPFM 영상이고, c)는 ACNT에 의해 포획된 CEACAM5에 결합한 2차 항체의 형광 영상이며, d)는 샌드위치 바이오어세이 처리된 맨 CNT의 형광영상을 나타낸 것이며, 스케일 바는 3 μm이다.
도 4는 CNT-패턴화된 표면의 검출 감도(detection sensitivity)에 있어서의 정량적 특징을 측정한 결과를 나타낸 것으로서, a)는 토폴로지 영상이고, b)는 CTC 농도에 따른 기능화된 CNT에 결합한 CEACAM5 단백질의 수를 나타낸 것이며, 스케일 바는 100 nm이다.
도 5는 기능화된 CNT 및 CEACAM5 단백질 간 결합에 있어서의 동력학적 특징을 나타낸 것으로서, a)는 전체 용해물 처리된 기능화된 CNT의 시간에 따른 토폴로지 영상이고, b)는 기능화된 CNT에 의해 포획된 CEACAM5 분자의 수를 나타낸 것이며, 스케일 바는 100 nm이다.
도 6은 ACNT상 CEACAM5 분자의 압타머-특이적 상호작용을 나타낸 것으로서, a)는 CEACAM5 처리한 ACNT, b)는 CEACAM5 처리한 맨 CNT의 tmAFM에 의한 토폴로지(topology) 영상(1 ㎛ x 1 ㎛)이다.
도 7에서 a)는 맨 CNT 및 CEACAM5 처리한 ACNT의 토포그래픽(topographic) 영상이고, b)는 CNT 및 CEACAM5 처리한 ACNT의 부착(adhesion) 맵핑 영상이다.
도 8은 ACNT상 LS174T 세포의 압타머-특이적 상호결합을 도시한 것으로서, a)는 핵-염색된 LS174T 세포 처리된 ACNT, b)는 CEACAM5 항체-컨쥬게이션된 형광 나노프로브로 추가로 라벨링한 것을 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 일직선( straight ) CNT 성장

탄소 나노튜브(CNT)의 성장을 위한 촉매로서 철(iron)을 사용하였다. 통상 철은 E-빔 증발기로 0.5 Å및 0.1 Å/s 조건에서 실리콘 웨이퍼 상에 증착된다. 그 후 실리콘 웨이퍼를 쿼르츠 튜브(quartz tube, 내경이 11 mm이고, 외경은 13 mm)에 넣었다. 이 쿼르츠 튜브를 로(furnace, Lindberg/Blue M tube furnace, 쿼르츠 튜브 내경 22.0 mm, 외경 25.4 mm) 내에 위치하는 다른 쿼르츠 튜브(직경 1 인치)에 넣었다. 어닐링을 위하여 로를 공기 중, 550℃로 40 분 동안 가열하였다. 그 후 로를 공기 중에서 실온으로 냉각시켰다. 어닐링 후, 쿼르츠 튜브를 H2 가스 2 sccm 처리하고, 로를 950℃로 30분 동안 가열하였다. 로를 1015℃로 재가열하고 일단 온도가 1015℃에 다다랐을 때 CH₄ 가스 1.5 sccm을 쿼르츠 튜브에 처리해 주었다. H₂ 및 CH₄의 유속(flow rate)은 매스 플로우 컨트롤러(mass flow controller, Aalborg AFC 26)로 조절하였다. 210 분간 성장시킨 후, 플로우를 정지시키고, 로를 N₂ 가스 120 sccm 하에서 실온으로 냉각하였다.

실시예 2. 센싱 기판의 제조( 압타머 -기능화된 CNT )

CNT-패턴화된 센싱 표면의 제조를 위해 CNT를 화학적 방법으로 제조하였고, 화학기상증착(chemical vapor deposition, CVD) 방법을 통해 기판상 철 촉매로부터 CNT를 화학적으로 성장시켰다. CNT는 일직선으로 성장하였고 CNT의 평균 직경은 4 nm 이하로 이는 압타머 단층을 형성하기에 충분한 폭이다. 상기 일직선(으로 성장한) CNT는 CNT가 나노스케일 패턴화된 라인으로 형성될 수 있다는 점을 가리킨다. 압타머-컨쥬게이션된 탄소 나노튜브(ACNT) 제조를 위해 CNT의 표면을 10 mL N,N-디메틸포름아미드(99%, Sigma-Aldrich, USA) 중의 1-파이렌부티르산(1-pyrenebutyric acid, 1 mg, 97%, Sigma-Aldrich, USA)을 사용하여 우선 기능화하였고, 이로써 CNT의 표면상에 카르복실 그룹이 형성되었다. 이로써 CNT 표면에 CNT 및 1-파이렌부티르산 간 π-π 스태킹(stacking) 작용에 의해 카르복실기(carboxyl group)가 형성되었다. 실온에서 하룻밤동안 반응시킨 후, 카르복실화된 CNT를 탈이온수(Millipore, USA)로 세척하였다. CNT 상에 압타머를 컨쥬게이션시키기 위하여, 1-에틸-3-[3-디메틸아미노-프로필]카르보디이미드 하이드로클로라이드(1 mg, Thermo Scientific Pierce, USA) 및 N-하이드록시술포숙신이미드(1 mg, Thermo Scientific Pierce, USA)를 함유하는 탈이온수(1 mL, pH 7.0)를 준비하였다. 탈이온수를 사용함으로써 표면 포텐셜 영상의 에러를 줄일 수 있다. 수중 이온은 표면 포텐셜 영상에 있어서 노이즈 신호의 원인이 된다. 상기 준비된 용액은 카르복실 그룹을 활성화시켜 압타머 말단의 아민 그룹과 아마이드 본드를 형성할 수 있도록 한다. 그 후, CNT를 준비된 용액과 30 분간 반응시키고 탈이온수로 세척하였다. 기판 상 ACNT를 세척한 후 압타머를 함유하고 있는 TE 완충액 100㎕를 적하하였다. 압타머의 서열은 SELEX 방법에 기초하여 적용되었으며 압타머에 대한 상세한 정보는 Arlett, J. L.; Myers, E. B.; Roukes, M. L. Nat. Nanotechnol. 2011, 6, 203에 나타나있다. 마지막으로, 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하고 ACNT를 탈이온수로 세척하여, 압타머-기능화된 CNT를 제조하였다.

실험예 1. 바이오어세이

LS174T 세포(CL-188, ATCC)의 마커 단백질인 CEACAM5를 타겟 단백질로 하여 실험하였다. LS174T 세포 용해물을 RIPA 완충액(Pierce, USA)을 사용하여 제조하였다. 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Gibco, USA) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신(PS, Gibco, USA)이 보강된 MEM(Gibco, USA) 배지를 사용하여 5% CO₂ 조건하에 LS174T 세포를 배양하였다. LS174T 세포를 마이크로튜브에서 5 x 10⁵ cells/mL의 밀도로 배양하고, RIPA 완충액 중에 재분산시켰다. 그 후 시료를 14,000 g로 15분 동안 원심분리하여 세포 파편(cell debris) 펠렛을 수득하였다. 마지막으로, 상청액(supernatant)을 새로운 마이크로튜브로 트랜스퍼하였다. 세포 용해물 용액을 탈이온수 (pH 7.0)로 희석하여 세포 용해물의 농도가 0.001 cell/mL 내지 1 cell/mL의 범위가 되도록 하였다. 20㎕의 CEACAM5가 용해되어 있는 각 용액을 ACNT상에 적하하고 1시간동안 실온(ambient condition)에서 건조시켰다. 인큐베이션 후, ACNT를 탈이온수로 세척하고 시료를 건조시켰으며 그 후 SPM[scanning probe microscopy, 예컨대 tapping-mode atomic force microscopy (tmAFM) 및 Kelvin probe force microscopy (KPFM)와 같은 장치]로 영상화하였다.

실험예 2. 탭핑 모드 AFM ( tmAFM ) 영상

탭핑 모드 AFM (tmAFM) 영상화에는 Nanodrive controller (Veeco Inc.) 와 함께 Innova (Veeco Inc., Santa Barbara, CA)를 사용하였고, 실온 환경에서 단일 단백질 분자를 구분하기에 충분하였다. tmAFM 영상에 폐쇄 루프 스캐너(closed loop scanner)가 사용되었으며, 이로써 ACNT 및 바이오분자의 정확하고 재현 가능한 영상이 얻어질 수 있었다. tmAFM 영상을 위해, ~75 kHz의 공진 주파수 및 ~20 nm의 팁 반경의 SCM-PIT 캔틸레버 팁(Veeco Inc.)을 사용하였다. 모든 tmAFM 영상은 영상의 해상도가 가장 우수한 것으로 나타나는 0.8 Hz의 스캔 속도에서 얻어졌다. 모든 영상은 SPM 랩 분석 소프트웨어 v.7.0(Veeco Inc.)로 얻어졌다.

실험예 3. KPFM 영상

KPFM 영상을 위해 리프트 모드를 사용하였는데, 여기에서 팁 바이어스 포텐셜(tip bias potential)은 캔틸레버의 공진 주파수에서 진동하였다. SCM-PIT 캔틸레버가 KPFM에 사용되었고, 이는 Pt/Ir (front layer) 및 Cr(bottom layer)로 코팅되었다. KPFM 영상은 DNA 압타머가 CNT에 컨쥬게이션 된다는 점, 및 ACNT가 CEACAM5를 포획한다는 점을 컨펌하는데 사용되었다. 고품질의 KPFM 영상을 위해 KPFM 영상 구현 전에 KPFM 영상을 위한 파라미터를 셋업하였다. 피드백 파라미터 [예를 들어 상, 비율 및 인테그랄 게인(integral gains)과 같은 것]을 조정하기 위하여, 맨 CNT의 표면 포텐셜 프로파일을 체크하였는데, 이는 기판 상에 수평으로 성장하였고, 그 후 피드백 파라미터들을 조절하였다. KPFM 팁은 기판과 5 nm의 거리를 두도록 하였다. 모든 시료를 카르본 테이프 및 실버 페이스트 (Dotite, Japan)를 사용하여 갈아주었다. 갈아줌으로써 에러 시그널 및 차지-업(charge-up) 현상을 모두 줄일 수 있었다.

실험예 4. 형광 실험의 준비

LS174T 세포 용해물 중에는 다양한 타입의 세포 소기관, DNA 및 단백질이 존재한다. DNA 압타머와 CEACAM5 분자 간 특이적 상호작용을 명확히 보기 위하여, 샌드위치 형광 방법을 사용하였다. CEACAM5에 대한 특이적 항체 및 FITC 간 컨쥬게이션을 위하여 수용해성 마그네틱 나노프로브가 사용되었다. 수-용해성 마그네틱 나노프로브(magnetic nanoprobes, MNPs)를 제조하기 위하여, 열분해에 의해 합성된 10 mg의 MnFe2O4 나노결정을 4 mL의 클로로포름에 용해시켰다. 유기 상(organic phase)을 100 mg의 트리-아미네이트화 폴리소르베이트(tri-aminated polysorbate)를 함유하는 20 mL의 액상 용액에 첨가하였다. 유기 및 연속상의 상호 포화 후, 혼합물을 울트라소니케이터(Sae Han SH-2100, Korea)로 190 W로 15분 동안 에멀젼화하였다. 유기 용매를 증발시켜 날린 후 MNP를 센트리프렙(centriprep, 30 분 동안, 3,000 gforce, MWCO 10,000)으로 정제하고, 물에 분산시킨 후 나중에 사용하기 위하여 보관해 두었다. 레이져 스캐터링(Otsuka Electronics ELS-8000, Osaka, Japan)을 사용하여 콜로이드 크기의 아미네이트화 MNP를 측정하고 준비된 수-용해성 MNP의 콜로이드 안정성을 3 개월 이상 유지시켰다. 트리-아미네이트화 MNP 컨쥬게이트 (400 ㎍ / MnFe)를 1 mL의 PBS 완충액 (pH 7.4, 100 mM)에 분산시키고 EDC 및 설포-NHS의 존재 하에 형광성 펩타이드로 라벨링하였다. 그 후 100㎕의 PBS (pH 7.4) 에 용해된 EDC (1.2 mg, 6.26 μmol) 및 N-히드록시술포숙신이미드 (Sulfo-NHS, 1.5 mg, 6.9 μmol)를 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 20 분 동안 흔들었다. FITC 및 CEACAM5 항체를 나노파티클 용액에 첨가하고 암 조건, 실온에서 6시간 동안 반응을 시켰다. 부산물 및 미반응 펩타이드 분자를 증류수를 사용하여 투석에 의해 2 일 동안 제거하였고 (molecular weight cut off = 10 kDa, Spectrum), Amicon Ultracell-10K (Millipore)로 농축시켰다. ACNT 상 세포 부착 가능성을 위해 세포 핵(nuclei) 염색에 Hoechst 33342 (Molecular Probes, USA)이 사용되었다 (도 S3 참조). LS174T 세포를 마이크로튜브에서 1 x 10⁶ cells/mL 밀도로 배양하고, 세포를 2 ㎍/ml Hoechst 33342 용액으로 20 분 동안 염색하였다.

실험결과

1. ACNT -패턴화된 표면 이미지 확인

도 2는 맨(bare) CNT-패턴화된 표면, 압타머-기능화된(functionalized) CNT(ACNT)-패턴화된 표면, 및 CEACAM5-결합 ACNT-패턴화된 표면의 SPM 이미지이다. 맨 CNT의 원자힘현미경(AFM) 고도는 4.0 ± 0.3 nm이었고, 맨 CNT의 표면 포텐셜은 21.7 ± 4.6 mV로 측정되었으며, Si 웨이퍼보다 아주 조금 포지티브하였다. 카르복실화된 CNT상에 압타머를 컨쥬게이션시킨 후, 고도는 4.9 ± 0.3 nm로 맨 CNT보다 약간 증가하였다. 반면, 압타머의 네거티브 백본 전하로 인하여 표면 포텐셜은 -93.9 ± 13.7 mV로 급격히 감소하였다.

2. ACNT -패턴화된 표면의 CEACAM5 검출능 평가

ACNT-패턴화된 표면의 CEACAM5 검출능을 평가하기 위하여, 대장암 LS174T 세포(1 세포/mL)의 용해물을 RIPA 완충액을 사용하여 준비하고, 순차적으로 용해물 용액(lysate solution)을 ACNT-패턴화된 표면에 적하하였다. ACNT상에 결합한 CEACAM5는 약 2.4 nm의 양까지 AFM고도가 증가하는 것으로 나타났고, 이는 마커 단백질 CEACAM5의 분자 사이즈에 기인한 것으로 보인다. CEACAM5 결합으로 인하여 표면 포텐셜이 거의 80 mV까지 증가하였으며, 이는 CEA의 등전점(isoelectric point)에 의한 전하 스크리닝 효과 때문인 것으로 보인다(pI = 5.74). ACNT 및 CEACAM5 사이의 특이적인 상호작용을 증명하기 위하여 CEACAM5 단백질이 맨 CNT에 결합하지 않은 음성대조군 실험을 수행하였고, 이 실험을 통해 표면상 CEACAM5가 비특이적으로 결합하는 현상은 거의 일어나지 않는다는 점을 알 수 있다(도 6). ACNT 상에 CEACAM5이 특이적으로 결합한다는 점을 더욱 컨펌하기 위하여, AFM 토포그라피 이미징과 동시에 얻은 부착력(adhesion force) 이미징을 고려하였다(도 7). CEACAM5 분자가 ACNT에 부착될 때, ACNT와 CEACAM5 사이의 화학적 상호작용으로 인해, CEACAM5-결합 ACNT는 맨 CNT에 비하여 더 높은 부착력을 나타내었다.

3. 샌드위치 바이오어세이를 통한 ACNT 와 CEACAM5 사이의 특이적 결합 친화도 확인

또한, ACNT와 CEACAM5 사이의 특이적 결합 친화도(binding affinity)를 증명하기 위하여 샌드위치 바이오어세이를 수행하였다(도 2c 및 2d). 특히 우리는 ACNT에 결합하는 CEACAM5 단백질을 비쥬얼화하기 위하여 2차 라벨로 형광다이로 라벨링된 CEACAM5 항체를 사용하였다. 도 2c는 (녹색 점으로 표시된 2차 라벨과 결합된) CEACAM5 단백질이 ACNT에 특이적으로 결합한 것을 보여준다. 그러나 샌드위치 바이오어세이는 가시광선영역에서 광학적 한계로 인하여 ACNT에 결합한 단일 CEACAM5 단백질의 비쥬얼화 및 정량화에 있어 한계점이 있다. 또한 맨 CNT를 사용한 샌드위치 바이오어세이를 통해 맨 표면상에 CEACAM5가 비특이적으로 결합하는 현상이 거의 일어나지 않는다는 점을 컨펌하였다.(도 2d)

4. 단일 세포 수준에서의 ACNT -패턴화된 표면의 포텐셜 확인

CTC 검출에 있어서의 ACNT-패턴화된 표면의 포텐셜을 단일 세포 수준에서 측정하였다. 세포 용해물 대신, (모델 CTC로서) LS174T 세포를 함유하는 용액을 ACNT-패턴화된 표면상에 적하하였다. CNT에 결합한 핵-염색된 LS174T 세포가 형광이미지로 비쥬얼화되었다(도 8a). CNT에 결합된 LS174T 세포상의 CEACAM5 단백질의 발현이 샌드위치 바이오어세이를 통해 증명되었다(도 8b). 1 mL의 용액에서, 본 발명에 따른 ACNT-패턴화된 표면이 단일 종양 세포를 효과적으로 캡쳐할 수 있다는 점을 보여준다. 암의 조기진단을 위해, 매우 낮은 농도, 즉 1 cell/mL 미만의, 종양 세포상에 발현된 CEACAM5를 검출하는데 더욱 유리하다는 점을 알 수 있었다.

5. ACNT -패턴화된 표면의 검출 한계 확인

CTC상에 발현된 CEACAM5 단백질을 센싱하기 위한 본 발명에 따른 ACNT-패턴화된 표면의 검출 한계를 면밀히 조사하였다. ACNT-패턴화된 표면을 10^{- 3}내지 1 cells/mL 농도의 LS174T 세포를 함유하는 용액으로 처리하였다. CTC 농도가 증가함에 따라, CNT에 결합한 CEACAM5 단백질로 인하여 조도(roughness)가 변화하는 것으로 나타났다(도 3a). CTC 농도의 함수로서 CNT의 단위길이당 CNT에 결합하는 CEACAM5 단백질의 수는 도 3b에 나타낸 바와 같다. 여기에서, CEACAM5 단백질의 열거(enumeration)는 CEACAM5 단백질을 캡쳐한 CNT의 AFM 이미지를 사용하여 시행되었다.

놀랍게도, CTC 농도가 10^-3 cells/mL에 불과하더라도 CNT에 결합한 CEACAM5 단백질의 수가 CNT의 단위 길이(즉 1 μm) 당 18.3 ± 3.2 단백질로 측정되었다. CTC 농도가 10^-2 cells/mL보다 더 큰 경우에는, CNT에 결합한 단백질의 수가 포화되었다. 이로써, 본 발명에 따른 CNT-패턴화된 표면이, 1 cell/mL보다 훨씬 낮은 농도의 종양 세포상에 발현된 마커 단백질을 라벨-프리하게 검출하는데 있어 유용하다는 점을 알 수 있고, 본 발명에 따른 ACNT-기반 센서의 검출 감도가 다른 센싱 방법에 비하여 현저히 높다는 점을 알 수 있다.

6. ACNT -기반 센서 및 CEACAM5 사이의 결합친화도 확인

본 발명에 따른 ACNT-기반 센서 및 마커 단백질(CEACAM5) 사이의 결합친화도(binding affinity)에 대해 자세히 알아보기 위하여, 1 cell/mL의 CTC 농도로 준비된 세포 용해물을 기초로 시간의 함수로 CNT에 결합한 마커 단백질의 수를 측정하였다. 도 4a는 마커 단백질과 상호작용하는 CNT-기반 센서의 SPM 이미지를 시간의 함수로 나타낸 것이다. CNT의 조도는 시간에 따라 증가하는 것으로 나타났으며, 이는 CNT상에 마커 단백질이 결합하는 것에 기인한 것으로 보인다.

도4b는 CNT의 단위 길이 당 CNT에 결합한 마커 단백질의 수를 시간의 함수로 나타낸 것이다. 마커 단백질은 본 발명에 따른 ACNT-기반 센서에 의해 20분 이내에 캡쳐되는 것으로 나타났고, 이는 아마도 센서와 마커 단백질 간의 높은 결합친화도 때문인 것으로 보인다. 본 발명에 따른 센서와 마커 단백질 간의 결합 동력학은 랑뮈르(Langmuir) 속도론에 의해 설명될 수 있다. 본 발명에 따른 센서와 결합한 마커 단백질의 수는 N(t) = N0[1-exp(-kbt)]에 의해 구해진다. 상기 식에서 N0는 CNT와 결합한 마커 단백질의 수의 평형값(equilibrium value)을 나타내고, kb 는 CNT 및 마커 단백질 간 결합에 있어서의 kinetic rate를 나타낸다. Kinetic rate는 0.06 ± 0.02 min^-1인 것으로 측정되었다. 본 발명에 따른 방법은 몇 가지 종양세포상에 발현되는, 단일-분자 해상도에서, 마커 단백질의 촉각 감각(tactile sensation)이 가능하다는 점을 시사한다. 말초혈액 시료를 사용하여, 예후 마커(prognostic marker)로서 CEACAM5-mRNA의 PCR-기반 검출에 대해 보고된 바 있다. 한편, 본 발명에 따른 ACNT-기반 센서의 검출감도는 CEACAM5의 센싱에 있어, PCR-기반 검출의 검출감도에 비하여 현저히 높은 것으로 나타났으며, 본 발명에 따른 방법에는 PCR-기반 센싱시 통상 필요로 하는 증폭과정 또는 라벨링 과정이 필요하지 않다. 게다가 mRNA 레벨은 암 세포에 있어서 복잡한 전사 메커니즘으로 인하여 단백질 수준과 항상 연관성을 보여주는 것은 아니기 때문에, mRNA 대신 CEACAM5는 장암(intestinal cancer)의 발암 시그널링에 관여하는 중요한 인자이다.

<110> KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Patterned-carbon nanotube biosensor for detecting cancer biomaker <130> DPP20135993KR <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Aptamer for specific-binding to carcinoembryonic antigen <400> 1 gcggaagcgu gcugggcuag aauaauaaua agaaaaccag uacuuucgu 49

Claims (24)

1. 탄소 나노튜브(carbon nanotube);
   상기 탄소 나노튜브의 표면에 연결된, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen)과 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하고;
   상기 압타머와 탄소 나노튜브는, 탄소 나노튜브 표면 상 고정물질과 압타머의 아마이드 결합으로 연결된 것인,
   암배아 항원(carcinoembryonic antigen) 검출용 바이오센서.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 바이오센서는 주사 탐침 현미경(Scanning probe microscopy)으로 검출하기 위한 바이오센서인 것을 특징으로 하는 암배아 항원 검출용 바이오센서.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 주사 탐침 현미경은 AFM(Atomic Force Microscopy) 또는 KPFM(Kelvin Probe Force Microscopy)인 것을 특징으로 하는 암배아 항원 검출용 바이오센서.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 암배아 항원은 암배아 항원-관련 세포 부착 분자(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5, CEACAM5)인 것을 특징으로 하는 암배아 항원 검출용 바이오센서.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 고정물질은 파이렌(pyrene) 유도체인 것을 특징으로 하는 암배아 항원 검출용 바이오센서.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 파이렌 유도체가 파이렌부티르산, 파이렌헥사노산, 파이렌옥타노산, 파이렌데카노산, 파이렌도데카노산, 파이렌테트라데카노산, 파이렌헥사데카노산, 파이렌옥타데카노산, 파이렌부티로일 클로라이드, 파이렌 헥사노일 클로라이드, 파이렌옥타노일 클로라이드, 파이렌데카노일 클로라이드, 파이렌 도데카노일 클로라이드, 파이렌 테트라데카노일 클로라이드, 파이렌헥사데카노일 클로라이드 및 파이렌옥타데카노일 클로라이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암배아 항원 검출용 바이오센서.
   
7. 제5항에 있어서, 상기 파이렌 유도체가 파이렌부티르산인 것을 특징으로 하는 암배아 항원 검출용 바이오센서.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 바이오센서는 암 진단용인 것을 특징으로 하는 암배아 항원 검출용 바이오센서.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 암은 장암(intestinal cancer), 대장암(colorectal cancer), 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 간암(liver cancer) 및 이들의 전이암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암인 것을 특징으로 하는 암배아 항원 검출용 바이오센서.
   
10. 제1항에 있어서, 상기 암배아 항원 검출용 바이오센서는 혈중종양세포(circulating tumor cell, CTC) 상에 발현된 암배아 항원을 인식하는 것을 특징으로 하는 암배아 항원 검출용 바이오센서.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 혈중종양세포의 농도가 1 cell/mL 이하인 것을 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 암배아 항원 검출용 바이오센서.
    
12. 제10항에 있어서, 상기 혈중종양세포의 농도가 1 X 10^-2 cell/mL 이하인 것을 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 암배아 항원 검출용 바이오센서.
    
13. 제1항에 있어서, 상기 암배아 항원을 30분 이내에 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 암배아 항원 검출용 바이오센서.
    
14. 탄소 나노튜브 표면에 압타머를 컨쥬게이션시키되,
    탄소 나노튜브 표면을 소수성으로 개질하고,
    상기 소수성으로 개질된 탄소 나노튜브의 표면에 압타머가 아마이드 결합에 의해 컨쥬게이션되는 단계; 및
    상기 압타머와 특이적으로 결합하는 암배아 항원이 압타머에 노출되었을 때 이를 주사 탐침 현미경(Scanning probe microscopy)으로 검출하는 단계를 포함하는,
    제1항에 기재된 바이오센서를 이용하여 암배아 항원을 검출하는 방법.
    
15. 제14항에 있어서, 상기 주사 탐침 현미경은 AFM(Atomic Force Microscopy) 또는 KPFM(Kelvin Probe Force Microscopy)인 것을 특징으로 하는 암배아 항원을 검출하는 방법.
    
16. 제14항에 있어서, 상기 압타머는 암배아 항원과 특이적으로 결합하는 압타머인 것을 특징으로 하는 암배아 항원을 검출하는 방법.
    
17. 제14항에 있어서, 상기 암배아 항원은 암배아 항원-관련 세포 부착 분자(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5, CEACAM5)인 것을 특징으로 하는 암배아 항원을 검출하는 방법.
    
18. 제14항에 있어서, 상기 암배아 항원을 검출하여 암을 진단하는 것을 특징으로 하는 암배아 항원을 검출하는 방법.
    
19. 제18항에 있어서, 상기 암은 장암(intestinal cancer), 대장암(colorectal cancer), 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 간암(liver cancer) 및 이들의 전이암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암인 것을 특징으로 하는 암배아 항원을 검출하는 방법.
    
20. 제14항에 있어서, 상기 암배아 항원은 혈중종양세포(circulating tumor cell, CTC) 상에 발현된 암배아 항원인 것을 특징으로 하는 암배아 항원을 검출하는 방법.
    
21. 제20항에 있어서, 상기 혈중종양세포의 농도가 1 cell/mL 이하인 것을 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 암배아 항원을 검출하는 방법.
    
22. 제20항에 있어서, 상기 순환종양세포의 농도가 1 X 10^-2 cell/mL 이하인 것을 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 암배아 항원을 검출하는 방법.
    
23. 제14항에 있어서, 상기 암배아 항원을 30분 이내에 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 암배아 항원을 검출하는 방법.
    
24. (a) 검체로부터 시료를 채취하는 단계;
    (b) 상기 시료를 제1항의 암배아 항원 검출용 바이오센서에 처리하는 단계; 및
    (c) AFM(Atomic Force Microscopy) 또는 KPFM(Kelvin Probe Force Microscopy)로 암배아 항원의 부착 정도를 측정하는 단계;를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.

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