CN110760477A - 一种小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，细胞株和应用 - Google Patents

一种小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，细胞株和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，细胞株和应用，本发明小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法的原发灶是在大肠，提供转移发生的真实原发环境；转移的发生是从大肠原发灶自发转移至肝脏；筛选的环境是小鼠体内具有完整的生理环境，尤其是免疫完整的环境；筛选的条件是小鼠肝脏内适合肠癌细胞建立和生长转移灶生理特异性；所得到的高转移细胞株达到100％的原发成瘤率且80％以上的肝脏转移率；所得到的高转移细胞株转移的器官大约90％在转移前期发生且只发生在肝脏，肝脏特异转移率高。

Description

一种小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，细胞株和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，细胞株和应用。
背景技术
大肠癌是世界以及我国发病率第三的癌症。肝转移是肠癌最主要致死原因。肠癌肝转移的科学研究十分紧迫。尤其是从基础医学方面了解肝转移的发生发展的遗传及分子机制，对于进一步研发靶向肠癌肝转移的干预手段和治疗药物意义尤为重大。用于研究肠癌肝转移的实验工具和研究平台成为不可或缺的要素。随着近十几年对肿瘤研究的进一步认识，肿瘤微环境、肿瘤免疫环境等方向的新发现对研究平台反映癌症发生的真实性的要求更加严苛。能真实反应转移的分子生物学机制及微环境背景且具有稳定器官特异性高转移的肿瘤细胞系可以为癌症转移研究提供科学研究的工具。
小鼠来源的肠癌细胞系因可在免疫完全的动物体内研究，能反映转移研究不可缺少的真实的器官环境及正常的免疫背景，成为肠癌肝转移重要的实验工具和平台。遗憾的是现有的小鼠肠癌细胞系中没有一种能满足稳定的自发性肝脏特异性高转移要求。目前普遍采取的从已有细胞系筛选转移株的方法，主要方法大致分为如下：
1.体外筛选：通常利用Transwell小室在底层铺上模拟体内基质的Matrigel基质胶，筛选现有细胞系中具有高侵袭或高迁移能力细胞克隆。此类方法在体外环境培养基中，很难模拟体内真实环境，所筛选出的细胞株在体内的表现不确定，科学价值很有限。
2.经脾脏注射体内筛选：此方法将肠癌细胞株注射入小鼠脾脏，利用脾脏和肝脏解剖学上位置关系，使肿瘤细胞通过门静脉进入肝脏，在肝脏生长形成实验性转移灶，随后从肝脏转移灶上获取细胞株。此类方法虽在体内进行，但完全忽略肠癌是在大肠发生发展然后转移到肝癌的病理机制，并且实际上肠癌的肿瘤细胞的转移发生也不需要从脾脏经过。因此此方法和在肝脏直接注射肿瘤细胞的方法差异不大，也无法满足稳定的肝脏特异性高转移率的要求。
3.经盲肠注射体内筛选：此方法将肠癌注射入小鼠盲肠，形成原位的大肠肿瘤模型，待肿瘤细胞自发转移到肝脏形成转移灶后获取细胞株。此类方法虽然提供了原位的器官环境和从大肠到肝脏的自发转移过程，但目前已有的所有可用的小鼠肠癌细胞系利用此方法建立肠癌模型后，肝脏转移率非常低(<10％),所以获取肝脏转移细胞株的几率非常低且成本很高。同时，此方法获得的只是转移到肝脏的肿瘤细胞株，并不能保证其自身能够在科学实验中产生较高且稳定的肝脏转移率。更重要的是不能确定这样的细胞株具有只转移到肝脏的特异性，发生肺、脑等其他多脏器转移的可能性依然存在。所以基于此类细胞株的肠癌肝转移的科学研究，很可能会混杂如肺、脑等其他多脏器转移的分子、基因、免疫相关的噪音信息，影响肠癌肝转移的研究目的。
综上所述，现有的方法无法建立具有肝脏特异性高转移率，且能满足肠癌从原发灶到肝脏转移灶的全过程，并体现体内生理和免疫环境的肠癌细胞株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法以解决现有技术存在的问题，能够建立具有肝脏特异性高转移率，且能满足肠癌从原发灶到肝脏转移灶的全过程并体现体内生理和免疫环境的肠癌细胞株。
为实现上述目的，第一方面，本发明提供一种小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，所述方法包括步骤如下：
(1)将小鼠肠癌细胞进行抗生素抗性标记和生物光学标记，在体外培养至80％-90％的融合状态，其中，所述80％-90％的融合状态可以细胞覆盖了培养皿底面积的80％-90％为判断标准，收集细胞，将细胞用缓冲液轻柔洗涤1-2次，以0.1wt％-0.5wt％胰酶消化后收集在缓冲液中重悬，制成浓度为2*106-5*107/ml的细胞悬液a，将0.1-0.5ml所述细胞悬液a注射到小鼠皮下进行体内适应；
4周后或肿瘤的体积超过2cm3后处死小鼠，其中所述肿瘤的体积大小可用常规方法判断，例如可以用游标卡尺测量肿瘤的最长径和最短径，以公式：最长径*最短径*最短径/2计算肿瘤体积，将形成的皮下肿瘤组织取出，在体外经过酶消化处理成单细胞悬液，在体外根据小鼠肠癌细胞抗生素抗性筛选培养，去除其他非肿瘤细胞和细胞碎片后，再选取对生物光学标记呈阳性的细胞；
(2)将步骤(1)得到的细胞体外扩增培养后，收集在缓冲液中重悬，制成5*107-5*108/ml的细胞悬液b，用盲肠壁种植法处理新的活小鼠，用注射器将5-20ul所述细胞悬液b注射到浆膜下层；
(3)4-6周或至老鼠体内原位的肿瘤长至1cm3后处死小鼠，其中所述肿瘤的体积大小可以用触诊的方式或者小动物B超的方式判断，取出盲肠注射肿瘤细胞的小鼠的肝脏的转移灶组织，经过酶消化处理成单细胞悬液，在体外根据小鼠肠癌细胞抗生素抗性筛选培养，再选取对生物标记呈阳性的细胞；
(4)将步骤(3)得到的细胞体外扩增培养后，重复步骤(2)和步骤(3)的过程1-3次，4-5周后或至80％以上的小鼠在盲肠注射后发生肝脏转移后获得细胞株，处死小鼠后统计可见肠癌细胞肝脏转移的结果或者用鼠活体成像获得肠癌细胞肝脏转移率。
优选地，为了便于筛选小鼠肝脏高转移肠癌细胞珠，所述步骤(1)中所述生物光学标记包括荧光分子标记、荧光蛋白标记和生物发光标记中的至少一种；更优选地为荧光蛋白标记；最优选为红色荧光蛋白标记。
优选地，为了便于筛选小鼠肝脏高转移肠癌细胞珠，所述步骤(1)中抗生素抗性标记的小鼠肠癌细胞具有嘌呤霉素抗性，遗传霉素抗性，潮霉素抗性，灭瘟素抗性或博莱霉素抗性。更优选地，小鼠肠癌细胞具有嘌呤霉素抗性。
优选地，为了使小鼠肝脏高转移肠癌细胞株具有肝脏特异性高转移率，所述步骤(1)中抗生素标记和生物光学标记后的体外培养的条件为：温度37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱，细胞扩增培养的培养基中包括2-4mM的L-谷氨酰胺,1000-4500mg/L的葡萄糖,0-1.2mM的丙酮酸钠,1500-2200mg/L的碳酸氢钠，0-10mM HEPES，2％-20％胎牛血清和1-10μg/ml抗生素。
优选地，为了肠癌细胞更好地适应小鼠体内环境，所述步骤(1)中制成浓度为1*107/ml的细胞悬液a，将0.1ml所述细胞悬液a注射到小鼠皮下进行体内适应。
优选地，为了使小鼠肠癌细胞处在适宜的酸碱平衡环境中，所述步骤(1)和步骤(2)中的缓冲液为PBS缓冲液，包括130-145mM的NaCl，22-35mM的KCl，8-15mM的Na2HPO4和15-25mM的KH2PO4，PH为7.2-7.6。
更优选地，为了使小鼠肠癌细胞处在更适宜的酸碱平衡的生理环境中，所述步骤(1)和步骤(2)中的缓冲液为PBS缓冲液，包括137mM的NaCl,27mM的KCl,10mM的Na2HPO4和18mM的KH2PO4，PH为7.4。
优选地，所述步骤(1)和步骤(3)中的酶消化处理中采用的酶包括胶原酶、透明质酸酶和DNA酶，以更好地消化培养出的小鼠组织从而形成单细胞悬液；更优选地，所述胶原酶为I型胶原酶。
优选地，为了更好地消化培养出的小鼠组织从而形成单细胞悬液，所述步骤(1)和步骤(3)中的酶消化处理中采用的酶中胶原酶浓度为150-300units/ml，透明质酸酶浓度为25-40NF units/ml，DNA酶浓度为250-320units/ml。
优选地，为了使肠癌细胞更好的模拟从大肠形成原发灶到肝脏转移的自发过程，所述步骤(2)中制成5*107/ml的细胞悬液b，用注射器将10ul所述细胞悬液b注射到用盲肠壁种植法处理新的活小鼠的浆膜下层。
优选地，为了使小鼠肠癌细胞便于筛选，本发明所述的建立方法中在体外根据小鼠肠癌细胞抗生素抗性筛选培养和体外扩增培养的条件为：温度37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱，细胞扩增培养的培养基中包括2-4mM的L-谷氨酰胺,1000-4500mg/L的葡萄糖,0-1.2mM的丙酮酸钠溶液,1500-2200mg/L的碳酸氢钠溶液，0-10mM HEPES，2％-20％胎牛血清和1-10μg/ml抗生素。
为了便于筛选，所述步骤(2)和步骤(4)中所述扩增培养中使用的抗生素与小鼠肠癌细胞抗生素抗性标记的抗生素种类相同，优选地，所述抗生素选自嘌呤霉素，遗传霉素，潮霉素，灭瘟素抗性和博莱霉素抗性中的一种或多种；更优选为嘌呤霉素。
其中，在所述步骤(2)和步骤(4)的细胞扩增培养中，在培养基中加入筛选的抗生素(例如可以为嘌呤霉素)以确保培养过程中去除肝脏细胞或者基质细胞等；在细胞扩增培养过程中还需要避免细胞过密，细胞在100％细胞融合前必须传代，传代2次后收集到缓冲液重悬,选取荧光分子标记阳性的细胞(例如可以用流式细胞仪选取)，细胞在扩增传代5代之内冻存，以使得扩增培养的肠癌细胞维持肝脏特异高转移率的特性。
第二方面，本发明还提供上述小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法得到的细胞株。
第三方面，本发明还提供上述小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法在癌症研究中的应用。
第四方面，本发明还提供第二方面的细胞株在癌症研究中的应用。
本发明的有益效果：依据130年前由英国医学家Stephen Paget提出的关于肿瘤转移的“种子和土壤”理论，即器官特异性转移是由于器官的特异环境选择其适应的肿瘤细胞的结果。据此，本发明的建立方法利用小鼠体内肝脏的特异性作为筛选条件，筛选出具有从大肠转移至肝脏的细胞株，并通过多次重复筛选强化筛选结果，从而建立稳定小鼠肝脏特异性高转移肠癌细胞株。
本发明小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法满足的要求和优点如下：
1.本发明肠癌的原发灶是在大肠，提供转移发生的真实原发环境。
2.本发明转移的发生是从大肠原发灶自发转移至肝脏。
3.本发明筛选的环境是小鼠体内具有完整的生理环境，尤其是免疫完整的环境。
4.本发明得到的高转移细胞株处死小鼠后，所有的老鼠的阑尾上都会有原发灶肿瘤或者说大肠癌，达到100％的原发成瘤率，在此基础上有95％以上的大肠癌会发生肝转移。
5.本发明的方法利用小鼠体内肝脏的特异性从异质性肿瘤细胞群中筛选具有肝脏转移能力或特性的细胞株，所得到的高转移细胞株所转移到的器官大约90％在转移前期发生且只发生在肝脏，80％以上的肝脏特异转移率，甚至高达95％肝脏特异转移率。
本发明的方法建立的小鼠肝脏高转移肠癌细胞株具有以下优点：
1.本发明的方法建立的小鼠肝脏高转移肠癌细胞株由经历位于大肠原发灶自发转移到肝脏的真实过程，能更加反映肠癌肝转移中肿瘤细胞的性质和特征。在小鼠体内多次重复肿瘤细胞从大肠自发转移至肝脏的过程，重复筛选，富集强化所得细胞株具有的肝脏转移能力和器官特异性，以提高并稳定特异性肝脏转移的发生率，从而最终得到稳定肝脏高转移的肠癌细胞株。
2.本发明的方法建立的小鼠肝脏高转移肠癌细胞株筛选的过程是在具备完整免疫能力的机体内，无论是大肠、肝脏和整个个体都使肿瘤的筛选中都能提供完整的免疫环境，所得到的细胞也更能适用于肿瘤免疫类的研究。
3.本发明的方法建立的小鼠肝脏高转移细胞株可以通过生物标记法追踪，优选可采用mCherry追踪。
4.本发明的方法建立的小鼠肝脏高转移肠癌细胞株可达到100％的原发成瘤率，高达95％肝脏特异转移率。
5.本发明的方法建立的小鼠肝脏高转移细胞株还有其筛选前的低转移的原代细胞系，可以形成对比配对，更适用于癌症研究中针对转移的比较性研究。
附图说明
图1为实施例1中小鼠肝脏高转移肠癌细胞株建立方法的流程简图。
图2为实施例2中小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的流式细胞仪检测图。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
下述实施例中所用的实验材料、生物制剂等，如无特殊说明，均为市购。并且，如无特殊说明，下述实施例中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。
实施例1
本实施例中的主要材料包括：
用于提供体内环境的BALB/c小鼠。
小鼠肠癌细胞CT26，购自ATCC公司。
胰酶/EDTA溶液购自Thermo Scientific公司。
PBS缓冲液购自Thermo Scientific公司。
I型胶原酶购自Sigma-Aldrich公司。
透明质酸酶购自Sigma-Aldrich公司。
DNA酶购自Sigma-Aldrich公司。
嘌呤霉素购自InvivoGen公司。
DMEM细胞培养基购自Thermo Scientific公司。
流式细胞仪型号为贝克曼库尔特MoFlo Astrios EQ超高速流式分选系统。
本实施例细胞株建立方法为：
(1)将小鼠肠癌细胞进行抗生素标记和生物光学标记，包括如下步骤：步骤(a)、在37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱环境下，将CT26细胞铺入10cm的培养皿中，加入10mL DMEM培养基中包括：4mM的L-谷氨酰胺,4500mg/L的葡萄糖,0mM的丙酮酸钠,2000mg/L的碳酸氢钠，0mM HEPES，10％胎牛血清。培养过夜。细胞密度控制在转染时融合度达到50％为宜。
步骤(b)、第2天，使用Lipofectamine 2000转染试剂(购自Thermo Fisher公司)，依照厂家说明书提供的步骤操作，将质粒pBRY-nuclear mCherry-IRES-PURO(购自Addgene52409)转染进入CT26细胞。具体的，质粒pBRY-nuclear mCherry-IRES-PURO为10μg，转染试剂Lipofectamine 2000为30μl。
步骤(c)、第3天，换与步骤(a)相同的新鲜培养基。
步骤(d)、第4天，将细胞按照1：10传代铺板，并在培养基中加入嘌呤霉素筛选，嘌呤霉素的终浓度为7.5μg/ml。
步骤(e)、28天后，收集所有细胞，用流式细胞仪筛选mCherry亮度为前10％的阳性细胞(top 10％mcherry postive cells)。
步骤(f)、筛选所得的细胞称为CT26-mCherry-puro细胞，置于含有5μg/ml的嘌呤霉素培养，防止抗性丢失。
步骤(a)至步骤(f)使稳转后的细胞具有可在体外筛选的生物光学标记，并且因为质粒带有嘌呤霉素抗性基因，所以细胞也具有嘌呤霉素抗性，命名为CT26-mCherry-Puro；
将上述CT26-mCherry-Puro细胞在体外培养扩增，体外培养的条件为37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱环境下，将细胞铺入10cm的培养皿中，每个培养皿内加入10mL DMEM培养基中包括：4mM的L-谷氨酰胺,4500mg/L的葡萄糖,0mM的丙酮酸钠,2000mg/L的碳酸氢钠，0mM HEPES，10％胎牛血清，以及5μg/ml的至嘌呤霉素，其pH为7.4。至细胞呈85％的融合状态，收集细胞，将细胞用PBS缓冲液(包括137mM的NaCl,27mM的KCl,10mM的Na2HPO4和18mM的KH2PO4，PH为7.4)轻柔洗涤2次，以0.1wt％胰酶消化后收集在PBS缓冲液中重悬，制成1*107/ml细胞悬液a；将0.1ml细胞悬液a注射到BALB/c小鼠皮下进行体内适应；
4周后处死小鼠，将形成的皮下肿瘤组织取出，在体外经过多酶混合液(包括浓度为280units/ml的I型胶原酶，浓度为35NF units/ml的透明质酸酶，浓度为280units/ml的DNA酶)酶消化处理成单细胞悬液。在体外筛选培养，培养的条件为37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱环境下，将细胞铺入10cm的培养皿中，每个培养皿内加入10mL DMEM培养基中包括：4mM的L-谷氨酰胺,4500mg/L的葡萄糖,0mM的丙酮酸钠,2000mg/L的碳酸氢钠，0mM HEPES，10％胎牛血清，浓度为7.5μg/ml的嘌呤霉素，培养一周后去除其他非肿瘤细胞和细胞碎片后，通过流式细胞仪选取mCherry阳性的细胞，命名为CT26-mCherry-Puro-P细胞；
(2)将CT26-mCherry-Puro-P细胞体外培养扩增(条件为温度37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱，细胞扩增培养的培养基中包括3mM的L-谷氨酰胺,2500mg/L的葡萄糖,1.0mM的丙酮酸钠,1800mg/L的碳酸氢钠，5mM HEPES，12％胎牛血清和6μg/ml嘌呤霉素)，然后，收集在PBS缓冲液(包括137mM的NaCl,27mM的KCl,10mM的Na2HPO4和18mM的KH2PO4，PH为7.4)中重悬，制成5*107/ml细胞悬液b，再将新的活BALB/c小鼠麻醉后，在下腹部腹中线开1cm切口，然后打开腹膜，将盲肠部脱出小鼠体内，用微量注射器将10ul CT26-mCherry-Puro-P细胞悬液注射到浆膜下层，用3M生物用胶封闭注射孔后，将盲肠送回小鼠腹腔内，分层缝合腹膜和皮肤；
(3)4周后处死小鼠，大约20％的盲肠注射肿瘤细胞的小鼠的肝脏可以发现绿豆大小的白色转移灶，取下转移灶组织，经过如步骤(1)所述的多酶混合液消化，嘌呤霉素体外培养筛选，并采用流式细胞仪选取mCherry阳性的细胞，命名为CT26-mCherry-Puro-PG1细胞；
(4)将CT26-mCherry-Puro-PG1细胞体外扩增培养(条件为温度37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱，细胞扩增培养的培养基中包括2mM的L-谷氨酰胺,1000mg/L的葡萄糖,1.0mM的丙酮酸钠溶液,1500mg/L的碳酸氢钠溶液，10mM HEPES，20％胎牛血清和10μg/ml嘌呤霉素)，然后，重复步骤(2)和步骤(3)的过程2次，4周后获得细胞，分别命名为CT26-mCherry-Puro-PG2细胞和CT26-mCherry-Puro-PG3细胞。CT26-mCherry-Puro-PG2细胞可达到肝脏转移率85％，CT26-mCherry-Puro-PG3细胞可达到肝脏转移率95％。同时，收集盲肠种植CT26-mCherry-Puro-PG3细胞的小鼠的肺、脑脏并经过多酶混合液消化后形成单细胞悬液，随即通过流式细胞仪，未发现明显的mCherry阳性的细胞存在(如图2所示)。证明此肿瘤细胞种植4周时CT26-mCherry-Puro-PG3在肺脏和脑脏的转移率为0％，转移且只转移到肝脏。
实施例2
本实施例中的主要材料和步骤(1)中将小鼠肠癌细胞进行抗生素标记和生物光学标记的步骤(a)至步骤(f)与实施例1相同。
将上述CT26-mCherry-Puro细胞在体外培养扩增，体外培养的条件为温度37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱，细胞扩增培养的培养基中包括2mM的L-谷氨酰胺,1000mg/L的葡萄糖,0.8mM的丙酮酸钠溶液,1500mg/L的碳酸氢钠溶液，10mM HEPES，20％胎牛血清和10μg/ml嘌呤霉素，至细胞呈80％的融合状态，收集细胞，将细胞用PBS缓冲液(包括130mM的NaCl,22mM的KCl,15mM的Na2HPO4和25mM的KH2PO4，PH为7.6)轻柔洗涤2次，以0.5wt％胰酶消化后收集在PBS缓冲液中重悬，制成2*106/ml细胞悬液a；将0.5ml细胞悬液a注射到BALB/c小鼠皮下进行体内适应；
4周后处死小鼠，将形成的皮下肿瘤组织取出，在体外经过多酶混合液(包括浓度为150units/ml的I型胶原酶，浓度为40NF units/ml的透明质酸酶，浓度为250units/ml的DNA酶)酶消化处理成单细胞悬液。在体外筛选培养，温度37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱，细胞扩增培养的培养基中包括2mM的L-谷氨酰胺,1000mg/L的葡萄糖,0.8mM的丙酮酸钠溶液,1500mg/L的碳酸氢钠溶液，10mM HEPES，20％胎牛血清和10μg/ml嘌呤霉素，培养一周后去除其他非肿瘤细胞和细胞碎片后，通过流式细胞仪选取mCherry阳性的细胞，命名为CT26-mCherry-Puro-P细胞；
(2)将CT26-mCherry-Puro-P细胞体外培养扩增(条件为温度37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱，细胞扩增培养的培养基中包括2mM的L-谷氨酰胺,1000mg/L的葡萄糖,0.8mM的丙酮酸钠溶液,1500mg/L的碳酸氢钠溶液，10mM HEPES，20％胎牛血清和10μg/ml嘌呤霉素)，然后，收集在PBS缓冲液(包括130mM的NaCl,22mM的KCl,15mM的Na2HPO4和25mM的KH2PO4，PH为7.6)中重悬，制成2*108/ml细胞悬液b，再将新的活BALB/c小鼠麻醉后，在下腹部腹中线开1cm切口，然后打开腹膜，将盲肠部脱出小鼠体内，用微量注射器将10ul CT26-mCherry-Puro-P细胞悬液注射到浆膜下层，用3M生物用胶封闭注射孔后，将盲肠送回小鼠腹腔内，分层缝合腹膜和皮肤；
(3)4周后处死小鼠，大约30％的盲肠注射肿瘤细胞的小鼠的肝脏可以发现绿豆大小的白色转移灶，取下转移灶组织，经过如步骤(1)所述的多酶混合液消化，嘌呤霉素体外培养筛选，并采用流式细胞仪选取mCherry阳性的细胞，命名为CT26-mCherry-Puro-PG1细胞；
(4)将CT26-mCherry-Puro-PG1细胞体外扩增培养(条件为温度37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱，细胞扩增培养的培养基中包括3mM的L-谷氨酰胺,2500mg/L的葡萄糖,1.0mM的丙酮酸钠溶液,1800mg/L的碳酸氢钠溶液，5mM HEPES，12％胎牛血清和6μg/ml嘌呤霉素)，然后，重复步骤(2)和步骤(3)的过程1次，4周后获得细胞，分别命名为CT26-mCherry-Puro-PG2细胞和CT26-mCherry-Puro-PG3细胞。CT26-mCherry-Puro-PG2细胞可达到肝脏转移率84％，CT26-mCherry-Puro-PG3细胞可达到肝脏转移率92％。同时，收集盲肠种植CT26-mCherry-Puro-PG3细胞的小鼠的肺、脑脏并经过多酶混合液消化后形成单细胞悬液，随即通过流式细胞仪，未发现明显的mCherry阳性的细胞存在。证明此肿瘤细胞种植4周时CT26-mCherry-Puro-PG3在肺脏和脑脏的转移率为0％，转移且只转移到肝脏。
实施例3
本实施例中的主要材料和步骤(1)中将小鼠肠癌细胞进行抗生素标记和生物光学标记的步骤(a)至步骤(f)与实施例1相同。
将上述CT26-mCherry-Puro细胞在体外培养扩增，体外培养的条件为条件为温度37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱，细胞扩增培养的培养基中包括4mM的L-谷氨酰胺,4500mg/L的葡萄糖,1.2mM的丙酮酸钠溶液,2200mg/L的碳酸氢钠溶液，10％胎牛血清和1μg/ml嘌呤霉素，至细胞呈90％的融合状态，收集细胞，将细胞用PBS缓冲液(包括145mM的NaCl,35mM的KCl,8mM的Na2HPO4和15mM的KH2PO4，PH为7.2)轻柔洗涤1次，以0.3wt％胰酶消化后收集在PBS缓冲液中重悬，制成5*107/ml细胞悬液a；将0.1ml细胞悬液a注射到BALB/c小鼠皮下进行体内适应；
4周后处死小鼠，将形成的皮下肿瘤组织取出，在体外经过多酶混合液(包括浓度为300units/ml的I型胶原酶，浓度为25NF units/ml的透明质酸酶，浓度为320units/ml的DNA酶)酶消化处理成单细胞悬液。在体外筛选培养，条件为温度37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱，细胞扩增培养的培养基中包括4mM的L-谷氨酰胺,4500mg/L的葡萄糖,1.2mM的丙酮酸钠溶液,2200mg/L的碳酸氢钠溶液，10％胎牛血清和1μg/ml嘌呤霉素，培养一周后去除其他非肿瘤细胞和细胞碎片后，通过流式细胞仪选取mCherry阳性的细胞，命名为CT26-mCherry-Puro-P细胞；
(2)将CT26-mCherry-Puro-P细胞体外培养扩增(条件为温度37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱，细胞扩增培养的培养基中包括4mM的L-谷氨酰胺,4500mg/L的葡萄糖,1.2mM的丙酮酸钠溶液,2200mg/L的碳酸氢钠溶液，10％胎牛血清和1μg/ml嘌呤霉素)，然后，收集在PBS缓冲液(包括145mM的NaCl,35mM的KCl,8mM的Na2HPO4和15mM的KH2PO4，PH为7.2)中重悬，制成5*108/ml细胞悬液b，再将新的活BALB/c小鼠麻醉后，在下腹部腹中线开1cm切口，然后打开腹膜，将盲肠部脱出小鼠体内，用微量注射器将10ul CT26-mCherry-Puro-P细胞悬液注射到浆膜下层，用3M生物用胶封闭注射孔后，将盲肠送回小鼠腹腔内，分层缝合腹膜和皮肤；
(3)4周后处死小鼠，大约30％的盲肠注射肿瘤细胞的小鼠的肝脏可以发现绿豆大小的白色转移灶，取下转移灶组织，经过如步骤(1)所述的多酶混合液消化，嘌呤霉素体外培养筛选，并采用流式细胞仪选取mCherry阳性的细胞，命名为CT26-mCherry-Puro-PG1细胞；
(4)将CT26-mCherry-Puro-PG1细胞体外扩增培养(条件为温度37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱，细胞扩增培养的培养基中包括4mM的L-谷氨酰胺,4500mg/L的葡萄糖,1.2mM的丙酮酸钠溶液,2200mg/L的碳酸氢钠溶液，10％胎牛血清和1μg/ml嘌呤霉素)，然后，重复步骤(2)和步骤(3)的过程3次，4周后获得细胞，分别命名为CT26-mCherry-Puro-PG2细胞和CT26-mCherry-Puro-PG3细胞。CT26-mCherry-Puro-PG2细胞可达到肝脏转移率80％，CT26-mCherry-Puro-PG3细胞可达到肝脏转移率90％。同时，收集盲肠种植CT26-mCherry-Puro-PG3细胞的小鼠的肺、脑脏并经过多酶混合液消化后形成单细胞悬液，随即通过流式细胞仪，未发现明显的mCherry阳性的细胞存在。证明此肿瘤细胞种植4周时CT26-mCherry-Puro-PG3在肺脏和脑脏的转移率为0％，转移且只转移到肝脏。
实施例4
本实施例中用MC38小鼠大肠癌细胞在C57BL6小鼠上筛选出MC38肝脏特异性高转移的肠癌细胞。
本实施例中的主要材料包括：
用于提供体内环境的C57BL6小鼠。
小鼠肠癌细胞MC38，购自Kerafast公司。
胰酶/EDTA溶液购自Thermo Scientific公司。
PBS缓冲液购自Thermo Scientific公司。
I型胶原酶购自Sigma-Aldrich公司。
透明质酸酶购自Sigma-Aldrich公司。
DNA酶购自Sigma-Aldrich公司。
嘌呤霉素购自InvivoGen公司。
DMEM细胞培养基购自Thermo Scientific公司。
流式细胞仪型号为贝克曼库尔特MoFlo Astrios EQ超高速流式分选系统。
本实施例细胞株建立方法为：
(1)将小鼠肠癌细胞进行抗生素标记和生物光学标记，包括如下步骤：步骤(a)、将MC38细胞铺入10cm的培养皿中。培养的条件为37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱环境下，每个培养皿内加入10mL DMEM培养基中包括：4mM的L-谷氨酰胺,4500mg/L的葡萄糖,0mM的丙酮酸钠,2000mg/L的碳酸氢钠，0mM HEPES，10％胎牛血清中培养过夜。细胞密度控制在转染时融合度达到70％为宜。
步骤(b)、第2天，使用Lipofectamine 2000转染试剂(购自Thermo Fisher)，依照厂家说明书提供的步骤操作，将质粒pBRY-nuclear mCherry-IRES-PURO(购自Addgene52409)转染进入MC38细胞。具体的，质粒pBRY-nuclear mCherry-IRES-PURO为10μg，转染试剂Lipofectamine 2000为30μl。
步骤(c)、第3天，换与步骤(a)相同的新鲜培养基。
步骤(d)、第4天，将细胞按照1：15传代铺板，并在培养基中加入嘌呤霉素筛选，嘌呤霉素的终浓度为5μg/ml。
步骤(e)、28天后，收集所有细胞，用流式细胞仪筛选mCherry亮度为前10％的阳性细胞(top 10％mcherry postive cells)。
步骤(f)、筛选所得的细胞称为MC38-mCherry-puro细胞，置于含有2μg/ml的嘌呤霉素培养，防止抗性丢失。
步骤(a)至步骤(f)使稳转后的细胞具有可在体外筛选的标记，并且因为质粒带有嘌呤霉素抗性基因，所以细胞也具有嘌呤霉素抗性，命名为MC38-mCherry-Puro；
将上述MC38-mCherry-Puro细胞在体外培养扩增，体外培养的条件为温度37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱，细胞扩增培养的培养基中包括3mM的L-谷氨酰胺,2500mg/L的葡萄糖,1.0mM的丙酮酸钠溶液,1800mg/L的碳酸氢钠溶液，5mM HEPES，12％胎牛血清和6μg/ml嘌呤霉素，至细胞呈85％的融合状态，收集细胞，将细胞用PBS缓冲液(包括137mM的NaCl,27mM的KCl,10mM的Na2HPO4和18mM的KH2PO4，PH为7.4)轻柔洗涤2次，以0.1wt％胰酶消化后收集在PBS缓冲液中重悬，制成1*107/ml/ml细胞悬液；将0.1ml细胞悬液a注射到C57BL6小鼠皮下进行体内适应；
4周后处死小鼠，将形成的皮下肿瘤组织取出，在体外经过多酶混合液(包括浓度为280units/ml的I型胶原酶，浓度为35NF units/ml的透明质酸酶，浓度为280units/ml的DNA酶)酶消化处理成单细胞悬液。在体外筛选培养，温度37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱，细胞扩增培养的培养基中包括3mM的L-谷氨酰胺,2500mg/L的葡萄糖,1.0mM的丙酮酸钠溶液,1800mg/L的碳酸氢钠溶液，5mM HEPES，12％胎牛血清和6μg/ml嘌呤霉素，培养一周后去除其他非肿瘤细胞和细胞碎片后，通过流式细胞仪选取mCherry阳性的细胞，命名为MC38-mCherry-Puro-P细胞；
(2)将MC38-mCherry-Puro-P细胞体外培养扩增(条件为温度37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱，细胞扩增培养的培养基中包括3mM的L-谷氨酰胺,2500mg/L的葡萄糖,1.0mM的丙酮酸钠溶液,1800mg/L的碳酸氢钠溶液，5mM HEPES，12％胎牛血清和6μg/ml嘌呤霉素)，然后，收集在PBS缓冲液(包括137mM的NaCl,27mM的KCl,10mM的Na2HPO4和18mM的KH2PO4，PH为7.4)中重悬，制成5*107/ml细胞悬液，再将新的活C57BL6小鼠麻醉后，在下腹部腹中线开1cm切口，然后打开腹膜，将盲肠部脱出小鼠体内，用微量注射器将10ul MC38-mCherry-Puro-P细胞悬液注射到浆膜下层，用3M生物用胶封闭注射孔后，将盲肠送回小鼠腹腔内，分层缝合腹膜和皮肤；
(3)5周后处死小鼠，大约30％的盲肠注射肿瘤细胞的小鼠的肝脏可以发现绿豆大小的白色转移灶，取下转移灶组织，经过如步骤(1)所述的多酶混合液消化，嘌呤霉素体外培养筛选，并采用流式细胞仪选取mCherry阳性的细胞，命名为MC38-mCherry-Puro-PG1细胞；
(4)将MC38-mCherry-Puro-PG1细胞体外扩增培养(条件为温度37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱，细胞扩增培养的培养基中包括2mM的L-谷氨酰胺,1000mg/L的葡萄糖,1.0mM的丙酮酸钠溶液,1500mg/L的碳酸氢钠溶液，10mM HEPES，20％胎牛血清和10μg/ml嘌呤霉素)，然后，重复步骤(2)和步骤(3)的过程2次，4周后获得细胞，分别命名为MC38-mCherry-Puro-PG2细胞和MC38-mCherry-Puro-PG3细胞。MC38-mCherry-Puro-PG2细胞可达到肝脏转移率80％，MC38-mCherry-Puro-PG3细胞可达到肝脏转移率95％。同时，收集盲肠种植MC38-mCherry-Puro-PG3细胞的小鼠的肺、脑脏并经过多酶混合液消化后形成单细胞悬液，随即通过流式细胞仪，未发现明显的mCherry阳性的细胞存在。证明此肿瘤细胞种植4周时MC38-mCherry-Puro-PG3在肺脏和脑脏的转移率为0％，转移且只转移到肝脏。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，其特征在于，所述方法包括步骤如下：
(1)将小鼠肠癌细胞进行抗生素标记和生物光学标记，在体外培养至80％-90％的融合状态，收集细胞，将细胞用缓冲液轻柔洗涤1-2次，以0.1wt％-0.5wt％胰酶消化后收集在缓冲液中重悬，制成浓度为2*106-5*107/ml的细胞悬液a，将0.1-0.5ml所述细胞悬液a注射到小鼠皮下进行体内适应；
4周后或肿瘤的体积超过2cm3后处死小鼠，将形成的皮下肿瘤组织取出，在体外经过酶消化处理成单细胞悬液，在体外根据小鼠肠癌细胞抗生素抗性筛选培养，去除其他非肿瘤细胞和细胞碎片后，再选取对生物标记呈阳性的细胞；
(2)将步骤(1)得到的细胞体外扩增培养后，收集在缓冲液中重悬，制成5*107-5*108/ml的细胞悬液b，用盲肠壁种植法处理新的活小鼠，用注射器将5-20ul所述细胞悬液b注射到浆膜下层；
(3)4-6周后或小鼠体内原位的肿瘤长至1cm3后处死小鼠，取出盲肠注射肿瘤细胞的小鼠的肝脏的转移灶组织，经过酶消化处理成单细胞悬液，在体外根据小鼠肠癌细胞抗生素抗性筛选培养，再选取对生物标记呈阳性的细胞；
(4)将步骤(3)得到的细胞体外扩增培养后，重复步骤(2)和步骤(3)的过程1-3次，4-5周后或至80％以上的小鼠在盲肠注射后发生肝脏转移后获得细胞珠。
2.根据权利要求1所述的小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)中的缓冲液为PBS缓冲液，包括130-145mM的NaCl，22-35mM的KCl，8-15mM的Na2HPO4和15-25mM的KH2PO4，PH为7.2-7.6。
3.根据权利要求1所述的小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)中制成浓度为1*107/ml的细胞悬液a，将0.1ml所述细胞悬液a注射到小鼠皮下进行体内适应。
4.根据权利要求1所述的小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(3)中的酶消化处理中采用的酶包括浓度为150-300units/ml的胶原酶、浓度为25-40NF units/ml的透明质酸酶和浓度为250-320units/ml的DNA酶。
5.根据权利要求1所述的小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，其特征在于，所述步骤(2)中制成5*107/ml的细胞悬液b，用注射器将10ul所述细胞悬液b注射到用盲肠壁种植法处理新的活小鼠的浆膜下层。
6.根据权利要求1所述的小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，其特征在于，所述步骤(2)中扩增培养的条件为：温度37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱，细胞扩增培养的培养基中包括2-4mM的L-谷氨酰胺,1000-4500mg/L的葡萄糖,0-1.2mM的丙酮酸钠,1500-2200mg/L的碳酸氢钠，0-10mM HEPES，2％-20％胎牛血清和1-10μg/ml抗生素。
7.根据权利要求1所述的小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，其特征在于，所述步骤(4)中扩增培养的条件为：温度37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱，细胞扩增培养的培养基中包括2-4mM的L-谷氨酰胺,1000-4500mg/L的葡萄糖,0-1.2mM的丙酮酸钠溶液,1500-2200mg/L的碳酸氢钠溶液，0-10mM HEPES，2％-20％胎牛血清和1-10μg/ml抗生素。
8.权利要求1-7任一项所述的小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法得到的细胞株。
9.权利要求1-7任一项所述的小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法在癌症研究中的应用。
10.权利要求8所述的细胞株在癌症研究中的应用。
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