CN109843328A - 用于癌症诊断和建模的生物基质支架 - Google Patents

Abstract

本文描述了体外癌症转移模型，如通过人结肠直肠癌细胞在肝和肺生物基质支架（通过新的去细胞化策略产生的器官特异性基质提取物）的基底上的行为所表明的，其概括了器官特异性的生物学方面。肿瘤细胞自发地形成集落，其在组织学、生物学和遗传学的以及其他表型特征方面模拟体内转移性病变。不受理论限制，假定肿瘤对放射或化学治疗剂的响应证明了依赖于所用的基质基底；因此，相信所述支架为癌症研究和诊断提供了有力的工具。

Description

用于癌症诊断和建模的生物基质支架

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C. 119(e)要求2016年7月12日提交的美国序列号62/361,306和2017年2月16日提交的美国序列号62/460,056的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

背景

转移是癌症中发病率和死亡率的主要原因。癌症研究中的一个主要挑战是缺乏概括癌症转移的生物学的离体或体外模型，特别是关于器官特异性，这是转移的关键特征。因此，用于癌症研究和治疗开发的更好工具需要更好的转移性生长的模型。

器官特异性是癌症转移的重要标志，因为已知肿瘤细胞倾向于转移至某些器官。此外，转移性病变的治疗响应可以取决于发生转移性病变的器官，并且即使是在同一患者体内。然而，现有的体外/离体模型系统不反映这种器官特异性，可能是由于这些肿瘤模型中器官-微环境中缺乏变量。尽管体内基因工程小鼠模型确实具有器官特异性，但是它们难以研究并且非常昂贵。

临床上地，一个挑战是缺乏预测哪种肿瘤会转移以及其会转移至哪些组织或器官的工具。能够预测转移的部位的分析将具有巨大的临床价值，并且能够改变癌症治疗。

概述

本发明的各方面涉及与诊断和/或表征癌症或肿瘤有关的方法、试剂盒和组合物。在涉及本文的癌症或肿瘤的任何实施方案中，癌症或肿瘤可以是恶性的。在某些实施方案中，癌症或肿瘤的特征可以是其转移至特定组织的可能性和/或这些转移中的一种或多种响应于一种或多种下文描述的癌症治疗和/或化学治疗剂的响应性。

本文公开的方法实施方案包含用来自肿瘤或癌症的细胞接种一种或多种生物基质支架。

在这些方法实施方案的一些中，细胞可以来自（1）取自被诊断患有癌症或肿瘤的患者的肿瘤活组织检查（biopsy）或样品的细胞或（2）来自与患者相同的癌症或肿瘤类型的细胞系的细胞。在这些方法实施方案的一些中，分析细胞的形成生长细胞的集落的能力。在一些实施方案中，集落位于生物基质支架的基底（substratum）上。在这些方法实施方案的一些中，细胞形成集落。在这些方法实施方案的一些中，分析细胞的变成三维的集落的能力。在这些方法实施方案的一些中，细胞形成三维的集落。不受理论限制，相信这种三维集落形成可能受各个生物基质支架的基底的化学所影响。在这些方法实施方案的一些中，分析细胞的表达基因或分泌蛋白质或其他因子的能力。这些基因的非限制性实施例包括：多能性基因（例如OCT4、SOX2、KLF4、KLF5、SALL4、NANOG、BMi-1）、干细胞基因（例如EpCAM、LGR5/LGR6、CXCR4、编码透明质酸受体的基因的CD44家族的许多变体中的一种或多种）、多药耐药基因（例如mdr基因家族、p-糖蛋白）、编码溶解细胞外基质成分的酶的基因（例如透明质酸酶、胶原酶、弹性蛋白酶、基质降解金属蛋白酶）；这些蛋白质的非限制性实施例包括：由上述基因编码的蛋白质（例如CD44、p-糖蛋白、基质降解酶）；与该分析相关的其他因子的非限制性实施例包括与外泌体产生、microRNA、以及来自间充质饲养层的旁分泌信号传导的定性或定量独立性相关的因子。在这些方法实施方案的一些实施方案中，一旦将细胞接种并附着到一种或多种生物基质支架上，就可以进行该分析。在这些方法实施方案的一些实施方案中，细胞可以附着到一种或多种生物基质支架的组织特异性形式的基底。

在这些方法实施方案的一些中，所述一种或多种生物基质支架分别来源于人体的一种或多种预定的器官。在进一步的实施方案中，基于患者的癌症或肿瘤类型选择预定的器官——例如，从而包括已知与癌症或肿瘤类型的转移相关的器官或从而包括在其中发现癌症或肿瘤的器官。在所有方法实施方案中，每种生物基质支架概括（recapitulate）了其来源自的组织的生物学方面（biological facet）。

该接种方法可以任选地被用于确定肿瘤在被诊断患有癌症或肿瘤的患者体内转移的可能性。例如，如果肿瘤或癌细胞在生物基质支架上形成生长细胞的集落，则可以预测转移到器官中。可以进一步确定所预测的转移定位至衍生所述支架的器官。因此，在一些实施方案中，如果细胞在一种或多种生物基质支架上形成生长细胞的集落，则预测体内转移到其分别起源自的一种或多种预定的器官中。

该接种方法还可以被用于确定对被诊断患有癌症或肿瘤的患者中的肿瘤的适当治疗。这可以在除了确定肿瘤转移或由此独立的可能性之外进行。

任何上述公开的方法实施方案可以进一步包含：基于集落的组织学、外泌体产生、microRNA产生、与间充质细胞的相互作用、和/或基因表达谱来表征该集落。

任何上述公开的方法实施方案可以进一步包含：筛选集落的对一种或多种癌症治疗和/或化学治疗剂的响应性或用一种或多种癌症治疗和/或化学治疗剂治疗集落。所述癌症治疗和/或化学治疗剂包括但不限于放射治疗、免疫治疗、内分泌治疗、分子治疗的一个或多个剂量和/或一种或多种类型的化学治疗（例如蒽环类药物（anthracycline）、烷基化剂、铂基剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、或有丝分裂抑制剂）。可以任选地基于患者的癌症或肿瘤类型选择此类癌症治疗和/或化学治疗剂。在某些实施方案中，可以将器官中的癌症或肿瘤的对一种或多种治疗方法和/或剂的体内响应性，与在接种在由所述器官制备的生物基质支架上时癌症或肿瘤细胞的对一种或多种治疗方法或药剂的响应性相关联。

本公开的各方面还涉及试剂盒，其包含分别来源于人体的一种或多种预定的器官的一种或多种生物基质支架、以及实施上文公开的一种或多种方法的说明。进一步的实施方案考虑了试剂盒，所述试剂盒进一步包含一种或多种癌症治疗和/或化学治疗剂、用于获得取自被诊断患有癌症或肿瘤的患者的肿瘤活组织检查或样品的细胞的工具或说明、来自特定癌症或肿瘤类型的细胞系的细胞、和/或实施上述公开方法所需的任何试剂、介质或其他组分。

本公开的其他方面考虑了人工肿瘤或转移模型，其对人体的一种或多种预定的器官有特异性，通过上文公开的接种方法产生。

附图说明

图1显示生物基质支架（BMS）概括了体内发现的组织特异性微环境。（a）描述用于体外研究转移性疾病的方法的示意图。（b）肺和肝BMS的扫描电子显微照片。比例尺，100纳米。（c）脱细胞化前后肺组织中存在的生长因子和细胞因子的分析（n = 4）。使用配对t检验确定信号传导分子的相对丰度的差异。数据代表平均值±S.E.M，* p <0.001。（d）比较肝和肺BMS中存在的蛋白质的组成和相对丰度的热图（n = 4）。使用z分数标准化无标记定量强度进行分层聚类。

图2证明了当在肝和肺BMS上进行培养时，结肠直肠癌细胞自发地形成3D工程化转移。（a）在塑料、胶原蛋白、基质胶、肝BMS和肺BMS上生长的HT-29（左）、SW480（中）和Caco2（右）细胞的扫描电子显微照片。比例尺，50 μm。接种在塑料、胶原蛋白、基质胶、肝BMS和肺BMS（n = 3）上的HT-29（左）、SW480（中）和Caco2（右）细胞的（b）接种效率和（c）生长速率。数据代表平均值±S.E.M。使用具有Tukey多重比较后测试的单因素方差分析（one wayANOVA）确定接种效率和生长速率的差异。统计学的显著性用上面的字母表示（P<0.05）。共享相同字母的组没有显著差异。

图3显示工程化肝转移和体内发现的肝转移是可比较的。（a）工程化的HT-29肝转移（左图）、脾内注射HT-29细胞后形成的肝转移（中图）和晚期人结肠直肠癌患者活组织检测的肝转移（右图）均显示出典型的胃肠道来源的肝转移的组织学特征。比例尺，20 μm。（b）通过在塑料（“塑料”）、基质胶（“基质胶”）、肝BMS（“工程化肝转移”）上生长的HT-29细胞和来源于HT-29细胞的脾内注射的体内肝转移（“体内肝转移”）（n = 4）来显示的平均全基因表达模式的分层聚类分析。

图4证明工程化的转移证明了体内转移性的可能性增加。（a、c）（a）直接肝注射或（c）尾静脉注射从塑料、胶原蛋白、基质胶、肝BMS和肺BMS分离的HT-29-luc2细胞30天后的动物的生物发光图像。（b、d）总结了（b）直接肝注射或（d）尾静脉注射HT-29-luc2细胞后发生肝和肺转移的动物数量的表。

图5显示在不同基质上生长的CRC细胞对化学疗法和放射疗法的响应不同。（a）在塑料、胶原蛋白、基质胶、肝BMS和肺BMS上生长的CRC细胞对化疗药物的响应（n = 6）。数据代表平均值±S.E.M。使用具有Tukey多重比较后测试的单因素方差分析确定治疗响应的差异。统计学的显著性用上面的字母表示（P<0.05）。共享相同字母的组没有显著差异。（b）在塑料、胶原蛋白、基质胶、肝BMS和肺BMS上生长的CRC细胞对放射治疗的响应（n = 3）。数据代表平均值±S.E.M。

图6证明肺和肝组织的去细胞化产生含有组织特异性信号传导分子的BMS。（a）去细胞化之前和之后肺（左）和肝（右）的宏观和H＆E图像。比例尺，130 μm。（b）在去细胞化之前和之后评估肺和肝中存在的DNA含量（n = 3）。数据代表平均值±S.E.M。使用t检验确定DNA含量的差异。（**** P<0.0001）。（c）肺和肝BMS中存在的生长因子和细胞因子的分析（n= 4）。从先前的研究获得存在于肝BMS中的信号传导分子的平均像素强度值。

图7显示在肝和肺BMS之间细胞外基质成分的组成不同。热图比较了在肝和肺BMS中差异表达的胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白的相对丰度（n = 4）。使用z分数标准化无标记定量强度进行分层聚类。

图8描绘了工程化的肝转移的透射电子显微照片，其描绘了（a）集落和生物基质支架之间的界面，（b）细胞之间的紧密连接，以及（c）坏死区域。（a-b）比例尺，2 μm。（c）比例尺，10 μm。左图中的生物基质支架用“B”表示。中间途中的紧密连接用虚线框表示。右图中的坏死区域用“N”表示。

图9显示由于增殖速率降低，工程化转移生长相对缓慢。（a）使用流式细胞术（n =3）定量在塑料、胶原蛋白、基质胶、肝BMS和肺BMS上生长的CRC培养物中经历凋亡的、裂解的半胱天冬酶3阳性的细胞。（b）通过流式细胞术（n = 3）评估在4小时标记期间不同基质上培养的经历S期的、EdU阳性的细胞数量的定量。数据代表平均值±S.E.M。使用具有Tukey多重比较后测试的单因素方差分析评估细胞凋亡和增殖速率的差异。统计学的显著性用上面使用的字母表示（P<0.05）。共享相同字母的组没有显著差异。

图10描绘了在塑料、胶原蛋白、基质胶、肝BMS和肺BMS上生长的HT-29（左）、SW480（中）和Caco2（右）细胞的代表性图像。比例尺，20 μm。

图11证明工程化的肝转移和体内转移显示出可比较的基因特征。通过微阵列分析（n = 4）评估（a）体内HT-29肝转移和（b）工程化的肝转移的总体基因表达谱。（a）中的肝转移由白色箭头指示。比例尺，100 μm。（c）维恩图描绘了当与在塑料上生长的细胞相比时，在基质胶培养物、工程化转移和体内肝转移中上调的基因数量。基因本体（Gene ontology）分析表明，许多常见的上调基因与血管生成、细胞粘附和药物代谢有关。（d）通过实时qPCR（n=4）评估在塑料、胶原蛋白、基质胶、肝和肺BMS上生长的HT-29、SW480和Caco2细胞中的Timp1基因表达。数据代表平均值±S.E.M。使用具有Tukey多重比较后测试的单因素方差分析确定Timp1表达的差异。统计学的显著性用上面的字母表示（P<0.05）。共享相同字母的组没有显著差异。

图12描绘了整个器官离体生物发光成像和组织学分析被用于证实基于HT29-luc2细胞的尾静脉注射（a）或直接肝注射（b）后的整体动物生物发光图像而鉴定的转移性的病变的存在。通过组织学鉴定的代表性肝和肺转移用箭头指出。比例尺，20 μm。

图13显示低氧预处理不会增加在塑料上生长的HT-29细胞的转移可能性。（a）尾静脉注射在正常和缺氧条件下培养的HT-29-luc2细胞后30天的动物的生物发光图像。（b）总结发生肺转移的动物数量的表。

图14描绘了在不同培养基质上生长的CRC细胞所显示的对失巢凋亡（anoikis）的相对易感性和侵入潜能的表征。（a）在塑料、胶原蛋白、基质胶、肝BMS和肺BMS上生长的HT-29、SW480和Caco2细胞在水凝胶涂覆的平板上培养后经历失巢凋亡的相对抗性（n = 3）。（b）使用碳酸脂膜侵染分析（n = 3）测定的在不同基质上生长的CRC细胞的侵染潜能。数据代表平均值±S.E.M。使用具有Tukey多重比较后测试的单因素方差分析确定存活和侵染的差异。统计学的显著性用上面的字母表示（P<0.05）。共享相同字母的组没有显著差异。

详细说明

以下将更全面地描述根据本公开的实施方案。然而，本公开的各方面可以以不同的形式实施，并且不应该被解释为限于这里阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案是为了使本公开彻底和完整，并且向本领域技术人员充分传达本发明的范围。在本文的描述中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是限制性的。本文提及的所有参考文献和整个申请均通过引用并入本文。

除非另外定义，否则这里使用的所有术语（包括技术和科学术语）具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。将进一步理解的是，除非在此明确定义，否则诸如在常用词典中定义的那些术语应当被解释为具有与其在本申请和相关领域的上下文中的含义一致的含义，并且不应该以理想化的或过于正式的意义解释。虽然下面没有明确定义，但这些术语应根据其普通含义进行解释。

本文描述中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用整体并入。

除非另有说明，否则本技术的实施将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。参见，例如，Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rdedition; Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology系列; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)系列; MacPherson et al.(1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press);MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds.(1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of AnimalCells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984)Oligonucleotide Synthesis; 美国专利号4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984)Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hamesand Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells andEnzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to MolecularCloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for MammalianCells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer andExpression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) ImmunochemicalMethods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London);以及Herzenberget al. eds (1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunology。

除非上下文另有说明，否则具体地意图是本文所述的本发明的各种特征能够以任何组合被使用。此外，本公开还预期在一些实施方案中，本文中阐述的任何特征或特征组合能够被排除或省略。为了说明，如果说明书指出复合物包含成分A、B和C，则具体地意图是任何A、B或C或其组合能够被单独地或以任何组合省略和放弃。

所有数字标记，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，在适当的情况下以1.0或0.1的增量（（+）或（-））变化，或者以+/-15％、或者10％、或者5％、或者2％变化。应理解，尽管并非总是明确说明，但所有数字标记前面都有术语“约”。还应理解，尽管并非总是明确说明，但本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等效物在本领域中是已知的。

定义

如在本发明的说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”、“一种”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。

当提及诸如量或浓度（例如，生物基质支架中的总蛋白质中的胶原蛋白的百分比）之类的可测量值等时，术语“约”意指包括指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％、或甚至0.1％的变化。

当用于描述本文公开的任何成分、范围、剂型等的选择时，术语或“可接受的”、“有效的”或“足够的”意指所述组分、范围、剂型等是适合于所公开的目的。

同样如本文所用，“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能组合，以及当在替代方案（“或”）中解释时缺乏组合。

本文使用的术语“缓冲液”和/或“冲洗介质”是指用于制备生物基质支架的试剂。

如本文所用，术语“细胞”是指真核细胞。在一些实施方案中，该细胞是动物来源的并且能够是干细胞或体细胞。术语“细胞群”是指具有相同或不同来源的相同或不同细胞类型的一种或多种细胞的组。在一些实施方案中，该细胞群可以源自细胞系；在一些实施方案中，该细胞群可以源自器官或组织的样品。

如本文所用，术语“包含”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。如本文所用，过渡短语“基本上由……组成”（和语法变体）应被解释为包含所述实施方案的所述材料或步骤“以及不实质上影响基本和新颖特征的那些”。参见，In re Herz,537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976)（原文中强调的）；还参见MPEP § 2111.03。因此，如本文所用的术语“基本上由……组成”不应该被解释为等同于“包含”。“由……组成”应意指排除多于其他成分的痕量元素和用于施用本文公开的组合物的实质方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的各方面都在本公开的范围内。

术语“培养物”或“细胞培养物”是指在人工、体外或离体二维（2D，单层）或三维（3D）环境（当在某些形式的基质上或当浮动时细胞的极化形状）中维持细胞，在一些实施方案中，作为贴壁细胞（例如单层培养物）或作为球状体或类器官的漂浮聚集体培养物。术语“球状体”表示细胞的漂浮聚集体都是相同的细胞类型（例如来自细胞系的聚集体），“类器官”是由多种细胞类型组成的漂浮的细胞聚集体。在一些实施方案中，类器官可以是上皮细胞的聚集体和一种或多种包含内皮细胞和/或基质细胞或星状细胞的间充质细胞类型。本文所用的“细胞培养系统”是指细胞群可以存活或生长的培养条件。

本文所用的“培养基”是指用于细胞培养、生长或增殖的营养液。在一些实施方案中，其包含氨基酸、维生素、盐、脂质、矿物质、微量元素中的一种或多种，并模拟间质液的化学成分。培养基可以通过功能特性被表征，例如但不限于将细胞维持在特定状态（例如多能状态、静止状态等）的能力、使细胞成熟的能力——在某些情况下，特别是促进干/祖细胞分化成特定谱系的细胞的能力。用于干/祖细胞的培养基的非限制性实施例是Kubota培养基，其在下文中进一步定义。在一些实施方案中，培养基可以是用于将细胞呈递或引入给定环境的“接种培养基（seeding medium）”。

更具体地，“基础培养基”是由组合物中的氨基酸、糖、脂质、维生素、矿物质、盐、微量元素和各种营养物组成的缓冲液，其模拟细胞周围的间质液的化学成分。此类培养基可以任选地补充有血清，以提供驱动生物过程（例如增殖、分化）所需的必需信号传导分子（激素、生长因子）或作为通常用于制备细胞悬浮液的酶的抑制剂来源。尽管血清能够与培养中使用的细胞类型自体同源，但最常见的是来自动物的血清，这些动物通常被屠宰用于农业或食品目的，例如来自牛、绵羊、山羊、马等的血清。补充有血清的培养基可以任选地称为血清补充培养基（SSM）。

如本文所用，“分化”是指特定条件使细胞成熟为产生成体特异性基因产物的成体细胞类型。

当提及特定分子、生物或细胞材料时，术语“等效物”或“生物等效物”可互换使用，并且意指那些具有最小同源性同时仍保持所需结构或功能的物质。

如本文所用，术语“表达”是指多核苷酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸来源于基因组DNA，则表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接。可以通过测量细胞或组织样品中mRNA或蛋白质的量来确定基因的表达水平；此外，可以确定多个基因的表达水平以建立特定样品的表达谱。

如本文所用，术语“功能的”可以用于修饰任何分子、生物或细胞材料，以使其实现特定的特殊效果。

如本文所用的术语“基因”是泛指包括转录成RNA分子的任何核酸序列，无论RNA是编码的（例如mRNA）还是非编码的（例如ncRNA）。

如本文所用，当提及产生特定模型集落、器官或类器官的方法步骤时，术语“产生”及其等效物（例如产生、生成）可与“生产”及其等效物互换使用。

如本文所用，术语“分离的”是指基本上不含其他材料的分子或生物制剂或细胞材料。

如本文所用，“Kubota培养基”是指为内胚层干细胞设计的、并使其能够以自我复制的分裂模式进行克隆性扩增（特别是如果在透明质酸基质或3D透明质酸水凝胶中）的无血清的、完全确定的培养基。Kubota培养基可以指任何不含铜、含有低钙（<0.5mM）、胰岛素、转铁蛋白/铁、与纯化的白蛋白结合的纯化的游离脂肪酸的混合物、以及任选地高密度脂蛋白的基础培养基。Kubota培养基或其等效物被无血清地使用（特别是在内胚层干细胞的培养物选择中），并且仅含有纯化的信号（胰岛素、转铁蛋白/铁）、脂质和营养素的确定混合物。在一些实施方案中，其能够作为SSM瞬时使用，其中使用低（通常5％或更低）水平的血清，用于将细胞引入基质支架中的接种过程，以及从而灭活用于制备细胞悬浮液的酶；尽可能快地（例如在5-6小时内）切换到无血清的Kubota培养基是最佳的。

在某些实施方案中，培养基由不含铜、低钙（<0.5 mM）并且补充有胰岛素（5 µg/mL）、转铁蛋白/Fe（5 µg/mL）、高密度脂蛋白（10 µg/mL）、硒（10^-10 M）、锌（10^-12 M）、烟酰胺（5 µg/mL）和纯化的游离脂肪酸与一种纯化的白蛋白结合的混合物的无血清基础培养基组成。用于制备该培养基的非限制性示例性方法已在别处公开，例如，Kubota H, Reid LM,Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 2000; 97:12132-12137,Y. Wang, H.L. Yao, C.B. Cui et al. Hepatology. 2010; 52(4):1443-54, Turner etal; Journal of Biomedical Biomaterials. 2000; 82(1): pp. 156-168; Y. Wang,H.L. Yao, C.B. Cui et al. Hepatology. 2010 Oct 52(4):1443-54，其公开内容通过引用并入本文。Kubota培养基的变体能够通过提供另外的因子和补充剂而被用于某些细胞类型以允许在无血清条件下扩增。例如，可以修饰Kubota培养基以使转运扩增细胞或定型祖细胞（例如成肝细胞）和晚于干细胞群体的其他成熟谱系阶段在无血清条件下离体存活和扩增。其中一个例子是修饰的Kubota培养基用于肝细胞及其后代、定向祖细胞的离体扩增成：无血清Kubota培养基进一步补充有肝细胞生长因子（HGF）、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、有时还有血管内皮生长因子（VEGF）。产生的细胞扩增以最小（如有）自我复制发生。如果细胞在IV型胶原蛋白和层粘连蛋白的基质上或嵌入含有超过50％IV型胶原蛋白和层粘连蛋白的3-D水凝胶中，则培养基特别有效。

术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸能够具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实施例：基因或基因片段（例如，探针、引物、EST或SAGE标签）、外显子、内含子、信使RNA（mRNA）、转移RNA、核糖体RNA、RNAi、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。

多核苷酸能够包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则能够在多核苷酸的组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列能够被非核苷酸成分中断。聚合后多核苷酸能够进一步被修饰，例如通过与标记成分结合。该术语还指双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则作为多核苷酸的该技术的任何方面涵盖双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。

如本文所用，术语“器官”是指作为个体生物的特定部分的结构，其中个体生物的某种功能是局部进行的并且在形态上是独立的。器官的非限制性实施例包括皮肤、血管、角膜、肾、心脏、肝、脐带、肠、神经、肺、胎盘、胰腺和脑。器官可以用作组织来源；例如，胎儿、新生儿、儿科（儿童）或成人器官可以被用于衍生本文公开的用途的目标细胞群。术语“组织”在本文中用于指活体或死亡生物体的组织或来源于或旨在模拟活体或死亡生物体的任何组织。该组织可以是健康的、患病的和/或具有基因突变。本文所用的术语“天然组织”或“生物组织”及其变体是指以其天然的或当其来源于生物体时以未修饰的状态存在的生物组织。“微器官”是指模仿“天然组织”的“生物工程组织”片段。

生物组织可以包括任何单个组织（例如，可以互相连接的细胞的集合）或构成生物体的机体的器官或部分或区域的一组组织。组织可以包含均质的细胞材料，或者它可以是复合结构，例如在身体的包括胸部的区域中发现的复合结构，例如能够包括肺组织、骨骼组织和/或肌肉组织。示例性组织包括但不限于来源于自肝、肺、甲状腺、皮肤、胰腺、血管、膀胱、肾、脑、胆管树、十二指肠、腹主动脉、髂静脉、心脏、肠及其任何组合的组织。

术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以互换使用，并且在其最广泛的意义上是指两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚基可以通过肽键连接。在另一个方面，亚基可以通过其他键连接，例如酯、醚等。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以包含蛋白质的或肽的序列的最大氨基酸数量没有限制。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D和L光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。

如本文所用，术语“接种”是指将细胞引至某物（例如生物基质支架）上的方法。接种可以在各种容器中进行，包括但不限于板和/或生物反应器。

如本文所用，术语“对象”旨在表示任何动物。在一些实施方案中，对象可以是哺乳动物；在进一步的实施方案中，对象可以是人、小鼠或大鼠。

如本文所用，对象中疾病的“处理”或“治疗”是指（1）预防在易感或尚未表现出疾病症状的对象中出现症状或疾病；（2）抑制疾病或阻止其发展；或（3）改善或引起疾病或疾病症状的消退。如本领域所理解的，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果（包括临床结果）的方法。出于本技术的目的，有益的或期望的结果能够包括一种或多种，但不限于：一种或多种症状的缓解或改善；病症（包括疾病）的程度的减轻；稳定（即，不恶化）病症（包括疾病）的状态；延迟或减缓病症（包括疾病）、进展；改善或减轻病症（包括疾病）、状态和缓解（无论是部分还是全部），无论是可检测的还是不可检测的。

生物基质支架和细胞外基质

如本文所用，术语“细胞外基质”或“ECM”是指由细胞分泌的各种生物活性分子组成的复合支架，其与一个或多个细胞表面相邻，并参与包含其的细胞和组织或器官的结构性和/或功能性支持。ECM的化学成分是组织特异性的，尽管存在许多细胞类型共有的基质成分。特定基质成分及其浓度可以与特定组织类型、组织结构、器官和其他超细胞结构相关。与本公开相关的细胞外基质的成分包括但不限于胶原蛋白、胶原蛋白相关的基质成分（例如纤连蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖、糖胺聚糖）和信号传导分子（生长因子、细胞因子）。

在一些实施方案中，主要考虑因素是胶原蛋白和与其结合的因子，因为分离生物基质支架的策略主要设计为保持组织中不溶的所有胶原蛋白分子。通常，胶原蛋白分子具有对每种已知胶原蛋白类型独特的氨基酸化学。目前已知有29种类型的胶原蛋白。所有已知的胶原蛋白分子都由3条氨基酸链组成，其如编织物一样“编织”，在分子中间有一个棒状结构域，两端都有球状结构域（因此，使胶原蛋白分子具有“哑铃”状形状）。杆状结构域由重复的三个氨基酸主导[甘氨酸-脯氨酸-X]，其中X可以是任何氨基酸。球状结构域由对每种胶原蛋白类型独特的氨基酸序列组成。

胶原蛋白分泌自细胞，然后通过特定的肽酶除去分子的一个或两个球状末端，然后聚集多个胶原蛋白分子以形成胶原蛋白原纤维。例外的是“网络胶原蛋白”（例如IV型或VI型），其保留球状结构域，然后末端对末端聚合以形成具有“六角形网眼铁丝网（chicken-wire）”状结构的胶原分子网络。

聚集成原纤维或网络后，胶原蛋白通过赖氨酰氧化酶的作用进行交联，赖氨酰氧化酶是一种细胞外的铜依赖性酶，可以在胶原蛋白分子之间（以及弹性蛋白分子之间）产生共价键，从而产生构成非常稳定的胶原蛋白分子聚集体的交联形式。纤维状胶原蛋白中每个原纤维的胶原蛋白分子数或网络胶原蛋白中的连接模式，由特定的胶原蛋白类型的确切的氨基酸化学决定。

通过专注于以不溶形式分离组织的胶原蛋白的策略，可以实现组织的提取以分离其细胞外基质。已知胶原蛋白是非胶原蛋白基质成分附着的支架，并且信号传导分子结合至基质结合的成分中的许多种。细胞外基质成分复合物的自组装发生在未交联的和交联的胶原蛋白上。因此，以不溶形式回收所有组织的胶原蛋白的策略，是回收基质的大部分已知成分的理想策略。

基质的分离可以通过利用中性pH和盐浓度等于或高于1 M的缓冲液来完成。尽管交联胶原蛋白甚至能够用蒸馏水分离和保存，但保持未交联的胶原蛋白不可溶的盐的确切浓度取决于胶原蛋白的类型。例如，在皮肤中大量存在的I型和III型胶原蛋白需要大约1 M盐才能保持不溶。相比之下，具有高水平V型胶原蛋白的羊膜中的胶原蛋白需要3.5-4.5 M盐。肝中未交联的以及交联的胶原蛋白需要大约3.4-3.5 M盐才能保持不溶。

制备富含细胞外基质的提取物的大多数方法利用导致大多数（如果不是全部）未交联的胶原蛋白和相关成分损失的条件。基质支架分离中最常见的策略是使用a）降解基质成分的酶和/或b）使用低盐或无盐缓冲液（例如蒸馏水）导致未交联的胶原蛋白和任何限制它们的因子的溶解。因此，对于基质支架存在多种形式的脱细胞组织提取物，其含有交联的胶原蛋白和与这些交联的胶原蛋白结合但是没有或具有最小量的未交联的胶原蛋白及其相关成分的任何因子。

术语“生物基质支架”（biomatrix scaffold，BMS）是指通过将所有组织的胶原蛋白保持为不溶形式的策略而产生的细胞外基质的分离提取物。BMS提取物在其化学和其效果方面具有组织特异性。如本文所述，BMS保留一些（任选地大多数）在生物组织中天然存在的胶原蛋白和/或胶原结合因子。在一些实施方案中，BMS包含以下物质、由以下物质组成、或基本上由以下物质组成：胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、弹性蛋白、整联蛋白、蛋白多糖、糖胺聚糖（硫酸化和非硫酸化——包括透明质酸）及其任何组合，所有这些都是生物基质支架的一部分（例如，被包括在术语生物基质支架中）。

在一些实施方案中，BMS包含组织的胶原蛋白，其包括：（i）新生（新形成的）胶原蛋白，（ii）聚集但未交联的胶原蛋白分子（胶原蛋白原纤维），（iii）交联的胶原蛋白，（iv）与胶原蛋白结合的非胶原蛋白基质成分（例如层粘连蛋白、纤连蛋白、巢蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖、糖胺聚糖），（v）与这些不同形式的胶原蛋白结合的信号传导分子和/或与胶原蛋白结合的非胶原蛋白因子。在一些实施方案中，组织中发现的绝大部分交联的和未交联的天然胶原蛋白，与和这些胶原蛋白结合的非胶原蛋白基质分子和信号传导分子在一起。在一些实施方案中，BMS包含一种或多种胶原蛋白相关的基质成分，例如层粘连蛋白、巢蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖、透明质酸、非硫酸化糖胺聚糖和硫酸化糖胺聚糖以及与基质成分相关的生长因子和细胞因子。

在一些实施方案中，BMS包含大于50％的体内发现的基质结合的信号传导分子。在一些实施方案中，基质结合的信号传导分子可以是表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、肝细胞生长因子（HGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、骨形态发生因子（BMF）、转化生长因子（TGF）、白细胞介素（IL）、神经生长因子（NGF）、神经营养因子、白血病抑制因子（LIF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、干细胞因子（SCF）、集落刺激因子（CSF）、GM-CSF、促红细胞生成素、血小板生成素、肝素结合生长因子、IGF结合蛋白、胎盘生长因子和Wnt信号。

在一些实施方案中，制备本文公开的BMS，避免低离子强度缓冲剂以保留交联的和非交联的胶原蛋白。在一些实施方案中，BMS可以缺少可检测量的特定的胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖和/或其任何组合。在一些实施方案中，基本上保留了所有胶原蛋白和胶原蛋白结合因子。在其他实施方案中，BMS包含在组织中已知的所有胶原蛋白。

BMS可以包含在天然的生物组织中发现的、以任何组合形式的至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％的胶原蛋白、胶原蛋白相关基质成分和/或基质结合信号传导分子（例如生长因子、激素和/或细胞因子）。在一些实施方案中，BMS包含生物组织的至少95％的胶原蛋白和大多数胶原蛋白相关的基质成分和基质结合的信号传导分子。本文所述的胶原蛋白可以是新生的（新形成的）胶原蛋白，其聚集形成原纤维但仍未交联，并且一些可以是这些胶原蛋白的交联形式。示例性胶原蛋白及其提取方法在下文中简要描述。

在一些实施方案中，本文公开的生物基质支架基本上含有包含新生的（新形成的）胶原蛋白、在交联之前自组装以形成原纤维的聚集的胶原蛋白分子、以及交联的胶原蛋白的所有胶原蛋白。此外，生物基质支架可以任选地包含其他基质成分加上与这些胶原蛋白或结合的基质成分结合的信号分子。在一些实施方案中，生物基质支架中胶原蛋白的比例与所述生物基质支架来源自的组织中的比例相似或相同。用于模拟原始的组织的新生胶原蛋白和聚集的未交联胶原蛋白的合适的百分比的非限制性实施例包括但不限于至少约或约0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。

如本文所述，“生物组织的大多数胶原蛋白相关的基质成分和基质结合生长因子、激素和/或细胞因子”是指保留在天然的（例如，未加工的）生物组织中发现的约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％的胶原蛋白相关的基质成分和基质结合生长因子、激素和/或细胞因子的生物基质支架。术语“粉末状的”或“粉末化的”在本文中可以互换使用，以描述已经被研磨成粉末的生物基质支架。术语“三维生物基质支架”是指保留其天然的三维结构的脱细胞支架。这种三维支架可以是整个支架或其冷冻切片。出于某些目的，支架能够在液氮温度下被粉末化，这一过程称为冷冻粉末化（cryopulverization）。

示例性胶原蛋白包括任何和所有类型的胶原蛋白，例如目前被鉴定为I型至XXIX型的胶原蛋白，但不限于这些胶原蛋白，因此允许将来识别其他类型的胶原蛋白。生物基质支架可以包含至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或更多的一种或多种在天然生物组织中发现的胶原蛋白。在一些实施方案中，胶原蛋白是交联的和/或不交联的。生物基质支架中胶原蛋白的量能够通过本领域已知的和本文所述的各种方法测定，例如但不限于测定羟脯氨酸含量。确定胶原蛋白是交联还是未交联的特征的示例性方法也存在，例如依赖于观察其溶解特性的方法。参见，例如，D. R.Eyre,^* M. Weis, and J. Wu. Advances in collagen cross-link analysis Methods,2009; 45 (1): 65-74（描述了胶原蛋白化学领域中标准方法的交联分析）。例如，可以基于胶原蛋白是否溶解在1 M盐浓度或低于1M盐浓度的缓冲液中来确定胶原蛋白是交联的。

示例性的胶原蛋白相关基质成分包括但不限于粘附分子（纤连蛋白和层粘连蛋白的家族）、L-和P-选择素、肝素结合生长相关分子（HB-GAM）、血小板反应蛋白I型重复（TSR）、淀粉样蛋白P（AP）、巢蛋白、弹性蛋白、波形蛋白、蛋白多糖（PG）、硫酸软骨素PG（CS-PG）、硫酸皮肤素-PG（DS-PG）、富含亮氨酸的蛋白聚糖（SLRP）家族的成员（如双糖链蛋白多糖和饰胶蛋白聚糖）、肝素-PG（HP-PG）、硫酸乙酰肝素-PG（HS-PG）（如磷脂酰肌醇聚糖、多配体聚糖和基底膜聚糖）、以及糖胺聚糖（GAG）（如透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和肝素）。

在一些实施方案中，生物基质支架包含以下物质、由以下物质组成、或基本上由以下物质组成：与各种基质成分结合的胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖、糖胺聚糖（GAG）、生长因子、激素和细胞因子（以任何组合）。生物基质支架可以包含在天然生物组织中发现的至少约50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或更多的一种或多种胶原蛋白相关基质成分、激素和/或细胞因子和/或可以具有在天然生物组织中发现的以至少约50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或更多的浓度存在的这些成分的一种或多种。

在一些实施方案中，生物基质支架包含在组织中已知的所有或大部分胶原蛋白相关基质成分、激素和/或细胞因子。在其他实施方案中，生物基质支架包含以下物质、由以下物质组成、或基本上由以下物质组成：一种或多种胶原相关基质成分、激素和/或细胞因子，其浓度接近于天然生物组织中发现的浓度（例如，天然组织中发现的浓度的约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％）。

示例性基质结合信号传导分子包括但不限于骨形态发生蛋白（BMP）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、肝细胞生长因子（HGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、转化生长因子（TGF）、神经生长因子（NGF）、神经营养因子、白血病抑制因子（LIF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、干细胞因子（SCF）、集落刺激因子（CSF）、GM-CSF、促红细胞生成素、血小板生成素、肝素结合生长因子、IGF结合蛋白、胎盘生长因子、Wnt信号。

示例性细胞因子包括但不限于白细胞介素、淋巴因子、单核因子、集落刺激因子、趋化因子、干扰素和肿瘤坏死因子（TNF）。生物基质支架可以包含在天然生物组织中发现的至少约50％、60%、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、100%或更多（以任何组合）的一种或多种基质结合生长因子和/或细胞因子和/或可以具有在天然生物组织中发现的以至少约50％、60%、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、100%或更多的浓度存在的这些生长因子和/或细胞因子（以任何组合）的一种或多种。

在一些实施方案中，生物基质支架包含许多或大多数已知在天然组织中和/或在组织中检测到的基质结合生长因子、激素和/或细胞因子的生理水平或接近生理水平，并且在其他实施方案中，生物基质支架包含一种或多种基质结合生长因子、激素和/或细胞因子，其浓度接近天然生物组织中发现的那些的生理浓度（例如，相比之下，相差不超过约30％、25％、20％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％）。存在于生物基质支架中的生长因子或细胞因子的量或浓度能够通过本领域已知的和本文所述的各种方法测定，例如但不限于各种抗体分析和生长因子分析。

涉及生物基质支架及其分离的方法和组合物在例如美国专利号8,802,081、美国专利号9,102,913、美国专利号7,456,017和美国临时申请号62/335,013中进行了讨论。

如本文所公开的，生物基质支架可以以各种形式使用，包括但不限于生物基质支架的冷冻切片、冷冻粉末化的生物基质支架、或完整的生物基质支架。

癌症和肿瘤

如本文所用，术语“癌症”是指源自机体的任何部分或任何细胞类型的癌症。这包括但不限于癌、肉瘤、血管瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞肿瘤和胚细胞瘤。在一些实施方案中，癌症与机体中的特定位置或特定疾病相关。如本文所用，术语“肿瘤”是指任何类型的肿瘤组织，良性的或恶性的。众所周知，癌症治疗和/或化学治疗剂可以用于治疗某些肿瘤。

通常，癌症是组织的疾病并且涉及影响组织/器官内的细胞-细胞关系的遗传和/或表观遗传畸变。最常见的是上皮-间充质细胞关系的失常，其在后生动物、由组织组成的生物体、有组织的细胞群中构成基本的细胞-细胞关系。所有正常组织由上皮细胞的成熟谱系组成，所述上皮细胞与间充质细胞的成熟谱系结合并且所述谱系在成熟过程中彼此协调。上皮-间充质关系是由旁分泌信号传导介导的，其由细胞外基质复合物和信号传导分子的动态和协同相互作用组成。由遗传性遗传缺陷或通过辐射或环境毒素（化学物质）引起的一种或多种细胞突变，能够导致上皮细胞与间充质细胞的定性或定量独立性。癌是上皮的恶性肿瘤、肉瘤是间充质细胞的恶性肿瘤、血管瘤是内皮细胞癌症的一种、白血病和淋巴瘤是血细胞恶性肿瘤的代表、等等。恶性细胞能够发生在任何年龄的供体的任何组织中，并且能够在主要部位（首先发生恶性肿瘤的部位）引起破坏。恶性肿瘤能够扩散，即转移到机体内的其他部位并导致远处部位的破坏。在一些实施方案中，癌症与机体中的特定位置或特定疾病相关。

细胞的恶性转化涉及细胞中的一种或多种遗传和/或表观遗传变化，并且对特定肿瘤类型是特异性的。在最近的许多综述中给出了关于恶性肿瘤、特别是转移可能性的已知的遗传和表观遗传变化的讨论。参见，例如，Turajlic S, Swanton C. Metastasis asan evolutionary process. Science. 2016 Apr 8; 352(6282):169-75. Review; SuvàML, Riggi N, Bernstein BE. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 2013Mar 29; 339(6127):1567-70. Review; Vanharanta S, Massagué J. Origins ofmetastatic traits. Cancer Cell. 2013 Oct 14; 24(4):410-21. Review; VogelsteinB1, Papadopoulos N, Velculescu VE, Zhou S, Diaz LA Jr, Kinzler KW. Cancergenome landscapes. Science. 2013 Mar 29;339(6127):1546-58. Review; MarquardtJU, Factor VM, Thorgeirsson SS. Epigenetic regulation of cancer stem cells inliver cancer: current concepts and clinical implications. Journal ofHepatology. 2010 Sep; 53(3):568-77. Review。

引起恶性转化的一种或多种遗传或表观遗传变化的存在，能够导致恶性细胞与邻近细胞的相互作用的改变。恶性细胞能够变得较少依赖于通常协调组织的细胞群活动的旁分泌信号。近年来，已发现一些变化涉及“外泌体”，即从恶性细胞中起泡的质膜包裹的环。外泌体能够释放进间质液中、进入血液中和/或进入相邻细胞的微环境中。外泌体含有部分恶性细胞的细胞质成分、microRNA和酶活性，能够与邻近细胞的质膜融合，从而将外泌体的内容物输送到邻近的细胞中；这个过程能够改变邻近细胞的生物活性。外泌体还能够通过淋巴管或血流分布到远离原发肿瘤的部位，与那些部位的细胞融合，并改变那些远处部位的细胞的生物活性。实际上，对邻近细胞或远处部位的细胞的这种修饰可能是侵染或转移的前兆。

大多数恶性肿瘤的致命方面是它们转移的能力。人们早就知道肿瘤扩散到远处部位的能力可以证明细胞去向的模式。乳腺癌和前列腺癌转移到骨骼、肝、肺和大脑，结肠癌转移到肝、肺和腹膜，甲状腺癌扩散到肝、肺和骨骼，等等。尽管转移的早期阶段涉及具有转移性的病变的有限组织，但癌症的晚期阶段涉及遍布全身。

影响转移过程的变量包括肿瘤细胞产生酶，并且其能够溶解细胞外基质的成分，使肿瘤细胞侵染和分散到远处部位。酶的全部能力在不同类别的肿瘤中是不同的。例如，肉瘤产生的酶允许肿瘤细胞迅速扩散到血管中，从而通过血源性（血管）途径促进肿瘤扩散到其他部位。相比之下，癌通常产生的酶能够使肿瘤细胞扩散到淋巴管通道中，并且只能在晚期进入血管通道。

扩散或转移的途径（例如血源性与淋巴途径）导致其次肿瘤细胞接种到不同组织中。即使当肿瘤细胞扩散到并被发现附着在组织中时，它们也不一定在该组织生长并定殖。在癌症的早期和中期阶段，肿瘤优先仅在某些远处部位生长或定殖。相比之下，在癌症的晚期阶段，肿瘤细胞通常能够在大多数组织中被发现，其已经克服了那些组织中肿瘤细胞生长的任何“障碍”。

这种转移的器官部位特异性在1889年由Stephen Paget描述，他将这种现象称为“种子和土壤”假说。通过这种方式，Paget博士表示“种子”（肿瘤细胞）和“土壤”（组织的微环境）中存在变量。如Isaiah Fidler博士最近的综述（The pathogenesis of cancermetastasis: the ‘seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer 2003; 3, 453-458）中所概述的那样，它已经成为一百多年来的调查对象。

虽然已知由给定肿瘤产生的酶的全部能力在扩散途径中是变量，并且在一定程度上也有能力在给定组织中定殖，但该酶的全部能力不足以解释转移的器官部位特异性的现象。申请人在下面的实验中表明，另一组变量是在细胞外基质的组织特异性形式的化学过程中。基质的化学过程对于每种组织是独特的，并且决定了肿瘤细胞在组织的微环境中存活和生长的能力。不受理论限制，申请人假设Paget归因于“土壤”的一些变量是归因于细胞外基质的变量。在疾病的早期到中期阶段，基质化学过程的控制能够支配并决定肿瘤细胞是否存活和生长；在晚期阶段，肿瘤细胞产生如此多（和许多）酶，使得基质内的变量和控制肿瘤细胞生长被削弱或破坏，导致肿瘤细胞在大多数组织中生长的能力。

癌症治疗和化学治疗剂

如本文所用，术语“癌症治疗/疗法”意指用于癌症的任何已知治疗方案，包括但不限于冷冻治疗、过高热、光动力治疗、激光治疗、放射治疗、癌症特异性抗体治疗、化学治疗、过继细胞转移、细胞因子治疗、免疫治疗、疫苗接种、卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）、CAR细胞治疗、内分泌治疗（也称为激素治疗）、干细胞治疗（自体、同种异体或同源）、以及其他类型的靶向或非靶向治疗。参见国家癌症研究所网站www.cancer.gov，上次访问时间为2016年5月6日。

如本文所用，术语“化学治疗剂”是指用于治疗癌症的基团（例如用于治疗癌症的小分子化合物），并且涵盖用于治疗癌症的已知药剂的所有剂型、制剂和方案。化学治疗剂的非限制性实例包括：蒽环类药物，例如阿霉素、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、戊柔比星或其衍生物；抗生素，例如放线菌素-D、博来霉素、丝裂霉素-C或其衍生物；烷基化剂，例如环磷酰胺、氮芥、乌拉莫司汀、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、苯达莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲霉素、白消安、达卡巴嗪、替莫唑胺、噻替哌、六甲蜜胺或其衍生物；铂基剂，例如顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、赛特铂、四硝酸三铂或其衍生物；抗代谢物，例如5-氟尿嘧啶、6-巯嘌呤、卡培他滨、克拉屈滨、氯法拉滨、西司他滨（cystarbine）、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、培美曲塞、喷司他丁、托古因（thoguanin）或其衍生物；拓扑异构酶抑制剂，例如喜树碱、托泊替康、伊立替康、依托泊苷、替尼泊苷、米托蒽醌或其衍生物；有丝分裂抑制剂，例如紫杉醇、多西紫杉醇、izabepilone、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、雌莫司汀或其衍生物。

细胞减少剂（如用于减少细胞增殖的药剂），是本领域已知的并且被广泛使用的。仅在它们分裂时杀死癌细胞的药剂被称为“细胞周期特异性的”并且包括在S期起作用的药剂（例如拓扑异构酶抑制剂和抗代谢物）。

拓扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶（拓扑异构酶I和II）作用的药物。在化学处理过程中，拓扑异构酶控制复制所必需的DNA结构的操作，因此是细胞周期特异性的。拓扑异构酶I抑制剂的实施例包括上面列出的喜树碱类似物、伊立替康和拓扑替康。拓扑异构酶II抑制剂的实施例包括安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷。

抗代谢物通常是正常代谢底物的类似物，通常干扰涉及染色体复制的过程。它们在循环中非常特定的阶段攻击细胞。抗代谢物包括叶酸拮抗剂（例如甲氨蝶呤）、嘧啶拮抗剂（例如5-氟尿嘧啶，氟尿苷、阿糖胞苷、卡培他滨和吉西他滨）、嘌呤拮抗剂（例如6-巯基嘌呤和6-硫鸟嘌呤）、腺苷脱氨酶抑制剂（例如克拉屈滨、氟达拉滨、奈拉滨和喷司他丁）等等。

植物生物碱来源于某些类型的植物。长春花生物碱由长春花植物（Catharanthus rosea）制成。紫杉烷是由太平洋紫杉树（Taxus）的树皮制成的。长春花生物碱和紫杉烷也称为抗微管剂。足叶草毒素来源于五月苹果植物。喜树碱类似物来源于亚洲“幸福树”（Camptotheca acuminata）。足叶草毒素和喜树碱类似物也被归类为拓扑异构酶抑制剂。植物生物碱通常是细胞周期特异性的。

这些药剂的实施例包括长春花生物碱（例如长春新碱、长春碱和长春瑞滨）、紫杉烷（例如紫杉醇和多西紫杉醇）、足叶草毒素（例如依托泊苷和替尼泊甙）、以及喜树碱类似物（例如伊立替康和拓扑替康）。

如本文所用，术语“内分泌治疗”是指内分泌治疗的所有方法，即添加、阻断或去除激素的治疗。对于某些情况（如糖尿病或更年期），给予激素来调节低激素水平。对于某些情况，为了减缓或阻止某些癌症（如前列腺癌和乳腺癌）的生长，可以给予合成激素或其他药物来阻断机体的天然激素。参见NCI癌症术语词典。

如本文所用，术语“免疫治疗”是指一种生物治疗，其使用物质来刺激或抑制免疫系统以帮助机体抵抗癌症、感染和其他疾病。某些类型的免疫治疗仅针对免疫系统的某些细胞。其他类型以一般方式影响免疫系统。免疫治疗的非限制性实施例包括细胞因子、疫苗、卡介苗（BCG）和一些单克隆抗体。参见NCI癌症术语词典。在一些实施方案中，免疫治疗可以是树突细胞治疗、抗体依赖性治疗、T细胞依赖性治疗或NK细胞依赖性治疗。

如本文所用，术语“分子治疗”是指旨在通过中断驱动癌症生长的独特分子异常来治疗癌症的个性化治疗。药物和/或分子药剂（例如但不限于抑制性或反义寡核苷酸（例如任何类型的干扰RNA、锁核酸（LNA）等））能够被用于旨在干扰特定的癌症的发展、生长和传播的特定生化途径核心的靶向治疗。

如本文所用，术语“放射治疗”是指放射治疗的所有方法，包括外部束放射治疗、密封源定量治疗和全身放射性同位素治疗。在一些实施方案中，辐射局部聚焦到靶位点，例如聚焦到肿瘤部位。在一些实施方案中，在施用前药结合物之前进行放射治疗。在使用放射治疗的任何实施方案中，放射治疗可以包括伽马刀辐射、网络刀辐射和/或高强度聚焦超声辐射。

短语“一线”或“二线”或“三线”是指患者接受的治疗顺序。一线治疗方案是首先给予的治疗，而二线或三线治疗分别在一线治疗后或二线治疗后给予。国家癌症研究所将一线治疗定义为“疾病或病症的首选治疗方法”。在患有癌症的患者中，主要治疗可以是手术、化学治疗、放射治疗或这些治疗的组合。一线治疗也被本领域技术人员称为“主要疗法和主要治疗”。参见国家癌症研究所网站www.cancer.gov，上次访问时间为2016年5月6日。通常，随后给予患者化学治疗方案，因为患者未对一线治疗显示出阳性临床或亚临床反应或者一线治疗已经停止。

缩写词

在整个本公开中出现以下缩写词。

以下是本文使用的缩写词的非限制性列表，并且独立于用于生长因子和细胞因子的缩写：如果首字母缩略词表示因子并且以斜体给出，则其指的是基因；如果是常规字体，则表示由该基因编码的蛋白质。如果首字母缩略词是针对细胞群体的，那么细胞来源的物种由首字母缩略词前面的小写字母表示。例如，m=鼠（小鼠）、R=大鼠、H=人类。

，生物基质支架，富含细胞外基质的组织特异性提取物；Caco-2，由Jorgen Fogh博士（Sloan-Kettering癌症研究所，NYC，NY）建立的上皮结直肠-腺癌细胞系——其具有肠干细胞特性，使其能够在不同的条件下根据培养条件将谱系限制进入小肠样细胞而不是大肠（结肠）细胞；CD，共同决定因素；CD34，造血干/祖细胞抗原；CD45，在大多数造血细胞亚群中发现的常见白细胞抗原；CRC，结直肠癌；CYP，细胞色素P450单加氧酶，其催化与药物代谢和/或胆固醇、类固醇和脂质合成相关的许多反应；CK，细胞角蛋白；CK7，与胆管细胞相关的细胞角蛋白；CK8和CK18，与所有上皮细胞相关的细胞角蛋白；EpCAM，上皮细胞粘附分子；FBS，胎牛血清；GAG，糖胺聚糖，碳水化合物链是二聚体（糖醛酸和氨基糖）的聚合物，它们中的大多数具有特定的硫酸化模式，在信号转导过程中与蛋白质协同发挥多种作用；HDL，高密度脂蛋白；HDM，一种无血清、激素定义的培养基，用于特定细胞类型的维持或分化；H＆E，苏木精和曙红；HT-29，一种结肠直肠腺癌细胞系，在某些条件下表现为未分化细胞，而在分化条件下产生具有极化形态的细胞，其特征在于膜抗原的重新分布和顶端刷状缘膜的发育；KM，Kubota培养基，一种为内胚层干细胞设计的无血清培养基，经过一些修饰，也能够被用于干细胞（如肝细胞（hepatoblasts）或定型祖细胞）的成熟后代；LGR5，含有富含亮氨酸的重复序列的G蛋白偶联受体5，是肠、肝和胰腺中重要的干细胞标记物；MMP，基质金属蛋白酶（或肽酶）；MMP2，基质金属蛋白酶-2，72kDa IV型胶原酶或明胶酶A（GELA）；MMP9，基质金属肽酶9，也称为92kDa IV型胶原酶或明胶酶B（GELB），是一种基质素，是一类参与细胞外基质降解的锌-金属蛋白酶家族的酶；PAS，过碘酸-希夫反应（Periodic acid–Schiff）；SDC，脱氧胆酸钠；SEM，扫描电子显微镜；SW480，一种来源于转移性的病变（疾病：Duke's B型）的人结肠直肠腺癌细胞系；TEM，透射电子显微镜。

信号（生长因子、激素、细胞因子）的首字母缩略词

BMP，骨形态发生蛋白，是属于转化生长因子β（TGF-β）超家族的多功能的生长因子；bFGF，碱性成纤维细胞生长因子；EGF，表皮生长因子；EGFR，表皮生长因子受体；FGF，成纤维细胞生长因子（例如FGF-4、FGF-6、FGF-7）；FGF-4，成纤维细胞生长因子-4；FGF-6，成纤维细胞生长因子-6；FGF-7，成纤维细胞生长因子-7；GCSF，粒细胞集落刺激因子；GDNF，胶质衍生的神经营养因子；GM-CSF，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；hGH，人生长激素；HGF，肝细胞生长因子；HB-EGF，肝素结合表皮生长因子；IGFBP-1，胰岛素样生长因子结合蛋白1；IGFBP-3，胰岛素样生长因子结合蛋白3；IGFBP-4，胰岛素样生长因子结合蛋白4；IGFBP-6，胰岛素样生长因子结合蛋白6；IGF-I，胰岛素样生长因子-I；IGF-1 SR，胰岛素样生长因子-I受体；IGF-II，胰岛素样生长因子-II；IL，白细胞介素（例如IL-6、IL-11）；M-CSF，巨噬细胞集落刺激因子；M-CSF R，巨噬细胞集落刺激因子受体；NT-3，神经营养因子-3；NT-4，神经营养因子-4；PDGF R a，血小板衍生生长因子受体α；PDGF R b，血小板衍生生长因子受体β；PDGF-AA，血小板衍生生长因子AA；PDGF-AB，血小板衍生生长因子AB；PDGF-BB，血小板衍生生长因子BB；PIGF，磷脂酰肌醇聚糖锚定生物合成F类；SCF，基质的细胞衍生因子-1；SCF R，基质的细胞衍生因子受体；TGF-α，转化生长因子α；TGF-β，转化生长因子β；TGF-β2，转化生长因子β2；TGF-β3，转化生长因子β3；VEGF，血管内皮生长因子；VEGF R2，血管内皮生长因子受体2；VEGF R3，血管内皮生长因子受体3；VEGF-D，血管内皮生长因子受体D。

实施本公开的方法

本发明的各方面涉及与诊断和/或表征癌症或肿瘤有关的方法、试剂盒和组合物。在涉及本文的癌症或肿瘤的任何实施方案中，癌症或肿瘤可以是恶性的。在某些实施方案中，癌症或肿瘤的特征可以是其转移至特定组织的可能性和/或这些转移中的一种或多种响应于一种或多种下文描述的癌症治疗和/或化学治疗剂的响应性。

本文公开的方法实施方案包含用来自肿瘤或癌症的细胞接种一种或多种生物基质支架。

在这些方法实施方案的一些中，细胞可以来自（1）取自被诊断患有癌症或肿瘤的患者的肿瘤活组织检查或样品的细胞或（2）来自与患者相同的癌症或肿瘤类型的细胞系的细胞。在这些方法实施方案的一些中，分析细胞的形成生长细胞的集落的能力。在一些实施方案中，集落位于生物基质支架的基底上。在这些方法实施方案的一些中，细胞形成集落。在这些方法实施方案的一些中，分析细胞的变成三维的生长细胞的集落的能力。在这些方法实施方案的一些中，细胞形成三维的生长细胞的集落。在这些方法实施方案的一些中，分析细胞的表达基因或分泌蛋白质或其他因子的能力。这些基因的非限制性实施例包括：多能性基因（例如OCT4、SOX2、KLF4、KLF5、SALL4、NANOG、BMi-1）、干细胞基因（例如EpCAM、LGR5/LGR6、CXCR4、编码透明质酸受体的基因的CD44家族的许多变体中的一种或多种）、多药耐药基因（例如mdr基因家族、p-糖蛋白）、编码溶解细胞外基质成分的酶的基因（例如透明质酸酶、胶原酶、弹性蛋白酶、基质降解金属蛋白酶）；这些蛋白质的非限制性实施例包括：由上述基因编码的蛋白质（例如CD44、p-糖蛋白、基质降解酶）；与该分析相关的其他因子的非限制性实施例包括外泌体产生、microRNA、来自间充质饲养层的旁分泌信号传导的定性或定量独立性。在这些方法实施方案的一些实施方案中，一旦将细胞接种并附着到一种或多种生物基质支架上，就可以进行该分析。在这些方法实施方案的一些实施方案中，细胞可以附着到一种或多种生物基质支架的组织特异性形式的基底。

在这些方法实施方案的一些中，所述一种或多种生物基质支架分别来源于人体的一种或多种预定的器官。在进一步的实施方案中，基于患者的癌症或肿瘤类型选择预定的器官——例如，从而包括已知与癌症或肿瘤类型的转移相关的器官或从而包括在其中发现癌症或肿瘤的器官。在所有方法实施方案中，每种生物基质支架概括了其起源的组织的生物学方面。

该接种方法可以任选地被用于确定肿瘤在被诊断患有癌症或肿瘤的患者体内转移的可能性。例如，如果肿瘤或癌细胞在生物基质支架上形成生长细胞的集落，则可以预测转移到器官中。可以进一步确定所预测的转移定位至衍生所述支架的器官。因此，在一些实施方案中，如果细胞在一种或多种生物基质支架上形成生长细胞的集落，则预测体内转移到其分别起源自的一种或多种预定的器官中。

该接种方法还可以被用于确定对被诊断患有癌症或肿瘤的患者中的肿瘤的适当治疗。这可以在除了确定肿瘤转移或由此独立的潜能之外进行。

任何上述公开的方法实施方案可以进一步包含：基于集落的组织学、外泌体产生、microRNA产生、与间充质细胞的相互作用和/或基因表达谱来表征集落。

任何上述公开的方法实施方案可以进一步包含：筛选集落的对一种或多种癌症治疗和/或化学治疗剂的响应性或用一种或多种癌症治疗和/或化学治疗剂治疗集落。所述癌症治疗和/或化学治疗剂包括但不限于放射治疗、免疫治疗、内分泌治疗、分子治疗的一个或多个剂量；和/或蒽环类药物、烷基化剂、铂基剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂或有丝分裂抑制剂中的一种或多种。可以任选地基于患者的癌症或肿瘤类型选择此类癌症治疗和/或化学治疗剂。在某些实施方案中，可以将器官中的癌症或肿瘤的对一种或多种治疗方法和/或药剂的体内响应性，与在接种在器官的生物基质支架上时癌症或肿瘤细胞的对一种或多种治疗方法或药剂的响应性相关联。

本公开的各方面还涉及试剂盒，其包含分别来源于人体的一种或多种预定的器官的一种或多种生物基质支架、以及实施上文公开的一种或多种方法的说明。进一步的实施方案考虑了试剂盒，所述试剂盒进一步包含一种或多种癌症治疗和/或化学治疗剂、用于获得取自被诊断患有癌症或肿瘤的患者的肿瘤活组织检查或样品的细胞的工具或说明、来自特定癌症或肿瘤类型的细胞系的细胞、和/或实施上述公开方法所需的任何试剂、介质或其他组分。

本公开的其他方面考虑了人工肿瘤或转移模型，其对人体的一种或多种预定的器官有特异性，通过上文公开的接种方法产生。

实施例

以下实施例是非限制性的并且说明了能够在实施本公开的各种情况下使用的程序。另外，下文公开的所有参考文献都通过引用整体并入。

实施例1——生物基质支架的生成和表征

所有动物实验均符合北卡罗来纳大学机构动物护理和使用委员会提供的指南。

组织工程领域的一个突破是使用通过组织去细胞化方法制备的细胞外基质提取物，尤其是通过灌注方案进行的。去细胞化方案是器官或组织被化学剥离其细胞，留下具有与体内相似的化学组成的细胞外基质提取物的方案。重要的是，去细胞化保留了细胞外基质的复杂组成，甚至是正常器官中发现的解剖学特征，这几乎不可能使用合成技术重建。申请人假设来自去细胞的组织的基质提取物能够被用于产生组织特异性体外培养平台以设计癌症“转移”（图1a）。虽然先前的研究成功地使用多种方法使组织去细胞化并工程化复杂的器官（包括肝和肺），但使用这些方法保存细胞信号传导分子的程度仍然很大程度上未知⁷。有一个例外，用于制备“生物基质支架”的方案显示保持了肝组织中发现的所有已知信号传导分子的生理水平¹²。然而，尚不清楚这套保存在这种生物基质支架中的信号传导分子是否是组织特异性的。申请人使用该方案制备生物基质支架（BMS），其保留大于98％的组织基质成分并保留基质结合的生长因子和细胞因子的生理水平。作为概念的证明，申请人使用该培养平台来研究转移性的CRC细胞。鉴于肝和肺是CRC患者中最常见的转移部位，申请人旨在设计体外肝和肺转移。

通过肝和肺的基于灌注的去细胞化而制备的生物基质支架

使用先前建立的方案，将Sprague-Dawley大鼠（雄性，250-300g）用于产生肝和肺生物基质支架。通过插入门静脉（肝BMS）或下腔静脉（肺BMS）以用去细胞化试剂灌注来制备生物基质支架（BMS）。用基础培养基（例如无血清DMEM/F12）灌注脉管系统直至血液被消除，然后用250 mL含有36个单位/L磷脂酶的1％脱氧胆酸钠（SDC）灌注。接下来，用无血清基础培养基冲洗器官，然后用3.5 M NaCl（制备的基础培养基）灌注，直至灌注液如通过光密度（OD280）评估的对蛋白质呈阴性。最后，用基础培养基冲洗BMS样品并快速冷冻。使用冷冻研磨机（Spex SamplePrep 6770, Metuchen, NJ）将冷冻的BMS样品粉碎成细粉。将处理过的BMS粉末储存在-80℃。

用生物基质支架粉末涂覆的组织培养板的制备

将BMS样品溶解在由4 M盐酸胍、50 mM乙酸钠（pH5.8）和含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的25 mM EDTA组成的溶液中。然后进行BCA分析以确定总蛋白质浓度。将含有BMS样品的培养基（DMEM/F12）加至组织培养板或加至Nunc Thermanox盖玻片（ThermofisherScientific, Waltham, MA）上并使其干燥过夜。使用100 Gy的外部束照射（Precision X-Ray, Inc, North Branford, CT）对板进行灭菌。

生长因子抗体阵列

将组织（肺、肝）和来自这些组织的BMS样品送至RayBiotech（Norcross, GA），在那里对它们进行处理并提交用于生长因子阵列分析。具体地，通过RayBio人生长因子抗体阵列G系列1（Cat＃AAH-GF-G1-8）定量生长因子和细胞因子的相对水平。数据以归一化信号强度表示。

质谱分析

将肺BMS（n=4）和肝BMS（n=4）粉末化，并如前所述提取和纯化蛋白质²²。用5 mM DTT还原每个样品（50 μg），用15 mM碘乙酰胺烷基化，并用胰蛋白酶（Promega, Madison, WI）在37℃下消化过夜。使用C18旋转柱（Pierce）将肽样品脱盐。使用结合QExactive HF质谱仪（Thermo Scientific, Waltham, MA）的Easy nLC 1000，通过LC/MS/MS分析肽样品（1μg）。并用2小时的方法分离。用于分离的梯度由250 nl/min流速的5-32％流动相B 组成，其中流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B由含有0.1％甲酸的ACN组成。QExactive HF以数据依赖模式操作，其中选择15种最强的前体用于随后的破碎。前体扫描的分辨率（m/z 400-1600）设定为120,000，目标值为3×10⁶个离子。MS/MS扫描分辨率设定为15,000，目标值为5×10⁴个离子。HCD的归一化碰撞能量设定为27％。将肽匹配设定为优选，并且排除具有未知电荷或电荷状态为1和大于等于7的前体。

使用MaxQuant 1.5.3.17版处理原始数据文件，并使用MaxQuant中的Andromeda对Uniprot rat数据库（2016年12月下载，包含29,795个条目）进行搜索。将酶特异性设定为胰蛋白酶，允许多达两个错过的切割位点，将Cys的氨甲酰甲基化设定为固定修饰，并将Met的氧化设定为可变修饰。使用1％的错误发现率（FDR）来过滤所有数据。使用剃刀（razor）+独特肽的无标记定量并启用运行之间的匹配（1分钟时间窗口）。每个蛋白质至少需要3个独特的肽用于定量。删除了具有大于60％缺失值的蛋白质。使用ANOVA在Perseus 1.5.6.0版中进行统计学分析，p<0.05认为是显著的。使用显著蛋白质的z得分标准化的LFQ强度进行分层聚类。

细胞培养

从UNC的组织培养设施获得人结肠直肠癌细胞系（HT-29、Caco2和SW480）。表达荧光素酶的细胞系（HT-29-luc2）购自Caliper Life Sciences（Hopkinton, MA）。使用短串联重复验证细胞系并测试支原体污染。HT-29、HT-29-luc2和SW480细胞在补充有10％胎牛血清（Gibco）和青霉素/链霉素（Mediatech, Manassas, VA）的DMEM/F12（Gibco, Invitrogen,Carlsbad, CA）中培养。将Caco2细胞在补充有20％胎牛血清（Gibco）和青霉素/链霉素（Mediatech）的DMEM/F12（Gibco）中培养。将细胞在正常组织培养板或涂覆有胶原蛋白、基质胶、肝BMS和肺BMS（100 μg/cm²）的组织培养板上传代。

细胞接种效果

将CRC细胞接种在涂覆有胶原蛋白、基质胶、肝BMS和肺BMS（100 ug/cm²）的平板上。24小时后，用PBS洗涤培养物并在500 μL的DNA裂解溶液中裂解。使用Qubit dsDNA BR分析试剂盒来评估DNA浓度。

细胞生长速率

CRC细胞在6孔板中的塑料、胶原蛋白、基质胶、肝BMS或肺BMS（100 ug/cm²）上生长。在接种后的不同时间点收集细胞并置于DNA裂解溶液中。使用Qubit dsDNA BR分析试剂盒评估DNA浓度。基于接种效率来标准化随时间的生长速率。

体外增殖和凋亡的评估

对于增殖分析，将在塑料、胶原蛋白、基质胶、肝BMS或肺BMS（100 μg/cm²）上生长的CRC细胞与10 μM 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）一起温育4小时。然后用PBS洗涤细胞，使用TrypLE处理成单个细胞，并根据制造商的说明书使用Click-iT Plus EdU Assay for FlowCytometry kit（目录号C10646）进行EdU染色。然后将细胞在含有10％FBS的PBS中洗涤三次，并进行流式细胞术分析。

对于细胞凋亡分析，收集在塑料、胶原蛋白、基质胶、肝BMS或肺BMS（100 μg/cm²）上生长的CRC细胞，处理成个单细胞，并在室温下在4％多聚甲醛中固定10分钟。在Dako块（cat）中将细胞悬浮液封闭过夜。然后将细胞用初级共轭的Cleaved Caspase 3（1：100）在室温下染色2小时。用含有10％FBS的PBS洗涤三次，并进行流式细胞术分析。使用BeckmanCoulter CyAn ADP进行所有流式细胞术分析，并使用软件Summit 5.2进行分析。

失巢凋亡分析

将在塑料、胶原蛋白、基质胶、肝BMS或肺BMS上生长的CRC细胞以1×10⁴/孔接种到Anchorage Resistance Plate（Cell Biolabs）或对照96孔细胞培养板。使细胞培养48小时。用钙黄绿素AM检测活细胞，并用酶标仪读取荧光。

侵染分析

将生长在无血清培养基中的塑料、胶原蛋白、基质胶、肝BMS或肺BMS上的CRC细胞置于涂覆有基质胶（Corning）的插入物的上室中。下室包含含有10％胎牛血清的DMEM/F12。培养16小时后，用棉签除去非侵入细胞，用100％甲醇固定膜下表面的细胞，用1％甲苯胺蓝染色。使用倒置显微镜在五个视野中计数细胞。

扫描电子显微镜（SEM）

盖玻片涂覆有胶原蛋白、基质胶、肝BMS或肺BMS。将在这些基质上生长的培养物在含有3％戊二醛的0.15 M磷酸钠缓冲液（pH 7.4）溶液中于4℃固定过夜。将样品用PBS漂洗三次，然后使用逐渐浓缩的乙醇溶液（30％、50％、75％至100％）连续温育脱水10分钟。将盖玻片转移至Samdri-795临界点干燥器并使用CO₂作为过渡溶剂（Tousimis ResearchCorporation, Rockville, MD）干燥。然后将盖玻片安装在13 mm铝制平板上，该平板具有双面碳粘合片并用10 nm金钯合金（60Au:40Pd, Hummer X Sputter Coater, AnatechUSA, Union City, CA）溅射涂覆。使用在5 kV下操作的Zeiss Supra 25 FESEM获得图像，工作距离为5 mm，孔径为10 μm（Carl Zeiss Microscopy, Pleasanton, CA）。

透射电子显微镜（TEM）

将细胞集落在含有3％戊二醛的0.15 M磷酸钠缓冲液（pH 7.4）溶液中于室温下固定1小时。然后用PBS漂洗样品，并用1％四氧化锇/1.25%亚铁氰化钾/0.15M PBS后固定1小时。在后固定后，样品用去离子水冲洗并在逐渐浓缩的乙醇溶液（30％、50％、75％至100％）中使用连续温育脱水10分钟（30％、50％、75％、至100％）。然后将样品在环氧丙烷/Polybed812环氧树脂（Polysciences, Inc., Warrington, PA）的1：1混合物中温育过夜，然后在100％树脂中温育24小时。然后将样品置于新鲜的Polybed 812环氧树脂中，并使用金刚石刀和Leica Ultracut UCT切片机（Leica Microsystems）将其横向切割为70 nm的切片。将切片安装在网状铜网上，并用4％乙酸双氧铀和Reynold柠檬酸铅染色。使用LEO EM910透射电子显微镜（Carl Zeiss SMT, LLC）在80 kV下观察网格。使用具有DigitalMicrograph3.11.0软件（Pleasanton, CA）的Gatan Orius SC 1000 CCD相机获得图像。

组织学

将细胞集落在4％多聚甲醛中在室温下固定1小时，石蜡包埋，并切成4 μm切片。切片用苏木精和曙红（H＆E）染色。

脾内注射

在UNC从动物集落获得无胸腺Nu/Nu小鼠（雄性，8-10周龄）。用腹膜内注射氯胺酮（100mg/kg）和脱毒剂（1 mg/kg）麻醉小鼠。在腹部左侧切开切口以暴露脾脏。然后每只小鼠脾内注射含有5×10⁶个HT-29或HT-29-luc2细胞的50 μl PBS悬浮液。所有动物实验均经UNC机构动物护理和使用委员会批准。

基因表达微阵列

使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）根据制造商的说明书从在塑料、基质胶和肝脏BMS上生长的HT-29细胞中提取总RNA。还从脾内注射HT-29细胞后产生的肝转移中分离RNA。使用在每种条件下生长的细胞的四个生物学重复。通过Agilent Bioanalyzer 2100评估RNA质量。RNA样本被送到北卡罗来纳大学教堂山分校的Lineberger综合癌症中心基因组学核心实验室。使用Agilent SurePrint G3 Unrestricted Gene Expression 8x60K微阵列（人G4858A）分析样品。在杂交之前用Cy3-CTP标记cDNA。

使用GeneSpring 12.6 GX软件进行微阵列数据分析。对原始信号值进行分位数归一化，并基于标志值过滤探针组。使用Euclidean距离对归一化强度值进行分层聚类分析以对实体和样本进行分类。基于统计学（单因素方差分析，p<0.05）和倍数变化（>=4）阈值来选择差异表达的基因。使用基因本体分析在工程化肝转移和体内转移中上调的基因。数据已提交至Gene Expression Omnibus数据库（登录号GSE76180）。

实时PCR

使用RNeasy mini试剂盒（QIAGEN, Valencia, CA），从在塑料、胶原蛋白、基质胶和肝BMS上生长的CRC细胞中分离总RNA。使用Quantitek cDNA合成试剂盒（QIAGEN），将总RNA逆转录成cDNA。使用β-Actin作为内参，通过2^-ΔΔCt方法进行Timp1转录物的定量。用于Timp1基因表达的引物序列如下：正向引物5'-AGACCTACACTGTTGGCTGTGAG-3'，反向引物5'-GACTGGAAGCCCTTTTCAGAG-3'。

药物响应分析

将CRC细胞以2×10⁴个细胞/每孔接种在涂覆有胶原蛋白、基质胶、肝BMS和肺BMS（100μg/cm²）的96孔板中。接种后一天，用化学治疗剂处理细胞24小时。然后除去化学治疗剂，并将细胞在标准培养基中再培养24小时。使用CellTiter 96® Aqueous One Solution CellProliferation分析试剂盒（(Promega, Madison, WI），通过MTS[（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑鎓）]细胞增殖分析，测定细胞活力。将每种培养条件的处理响应标准化至未处理的培养物。

集落形成分析

测定了每种细胞系的平板接种效率（plating efficiency，PE）。在塑料、胶原蛋白、基质胶、肝BMS和肺BMS上生长的细胞用0、2、4、6和8 Gy照射。照射后，将细胞以100至250,000的密度接种到25 mL烧瓶中。将细胞培养14天，固定，然后由4％甲醛、80％甲醇和0.25％结晶紫组成的溶液染色。仅计数含有30个或更多细胞的集落。使用下式计算存活分数（SF）：(形成的集落数的#）/（平板接种的细胞数的#）（平板接种效率）。将SF以对数标度对照辐射剂量作图。使用R程序包“CFAssay”，用线性二次公式SF=e^（-αD-βD2）生成存活曲线。

转移可能性的体内评估

将在塑料、胶原蛋白、基质胶、肝BMS或肺BMS上生长的HT-29-luc2细胞，用胰蛋白酶消化，收获并处理成单细胞悬浮液。对于缺氧细胞培养，将HT-29-luc2细胞在含有1％O₂和5％CO₂的缺氧培养箱中37℃培养24小时。将细胞悬浮于PBS中，并通过尾静脉注射（1×10⁶/小鼠）或通过直接肝脏注射（2×10³/小鼠）施用于无胸腺Nu/Nu小鼠（雄性，8-10周龄）。使用IVIS成像系统（Caliper）每周测量生物发光。将小鼠随机分配到组。研究人员对细胞注射和生物发光成像并非不了解。没有动物被排除在统计分析之外。将每个时间点的荧光素酶强度标准化至第0天的相应强度值。去除处死小鼠的肺和肝，并通过离体生物发光进行检查。

统计分析

使用GraphPad Prism 6（GraphPad, La Jolla, CA）或R统计软件进行数据分析。通过单因素方差分析进行分析，然后进行Tukey的真实显著性差异事后检验，分析细胞生长速率、接种效率、MTS、流式细胞术、失巢凋亡分析、侵染分析和实时PCR的结果。对于集落形成测定，使用R程序包“CFAssay”分析线性二次细胞存活曲线。没有统计方法被用于预先确定样本量。F检验被用于检验两个方差的相等性。P值小于0.05被认为是显著的。

数据可用性

微阵列数据可在Gene Expression Omnibus中以研究的登录号获得：ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi.token=sdmluyaqplgvtuz&acc=GSE76180。

讨论

转移是癌症患者发病率和死亡率的主要原因，并且了解转移的生物学能够导致癌症治疗的显著改善。癌症转移的标志之一是器官特异性。每种类型的癌症都具有独特的转移性扩散模式，其不能完全通过器官附近或由血管流动决定的部位来解释。虽然通常认为正常组织微环境在调节转移性生长和发育中起重要作用，但这种相互作用背后的生物学知之甚少²。这主要是由于缺乏易于使用并且完全概括了癌症转移中器官特异性的生物学的实验模型。由于缺少器官-微环境中存在的组分，现有的体外/离体模型系统不具有器官特异性。虽然胶原蛋白和基质胶能够被用于提供部分三维（3D）培养基底，但这些基底的组成与体内组织特异性微环境和转移遇到的组织特异性微环境高度不同。虽然在体内发生转移的基因工程动物模型能够被用于以组织特异性方式研究转移性癌症，但它们昂贵且难以使用。了解转移和它们所栖息的组织微环境之间的相互作用的生物学基础，可能会为转移性癌症患者带来更有效的癌症治疗，因为先前的研究已经确定转移的治疗响应在转移性的部位之间可以不同。

因此，非常需要能够概括癌症转移的体内生物学的体外模型。这些模型能够促进癌症转移的有效治疗的开发。这是特别重要的，因为已知转移的治疗响应在转移性的部位之间不同，并且可能与原发性肿瘤的治疗响应不同^2-5。因此，我们旨在开发具有器官特异性的新型体外癌症转移模型。

假设器官微环境是纳入器官特异性转移模型开发的关键组成部分。鉴于通过去细胞化处理制备的基质提取物已经被用于生物工程复杂的器官，理论上认为，这些由现有方案中的一种或另一种产生的基质提取物可能证明可以为工程化癌症转移提供良好的基质^6-8（图1a）。然而，在化学组成和功能性方面保留组织特异性的组织去细胞化的唯一方法是Rojkind和Reid描述的基质提取物，称为“bomatrices”。

概括了体内生化环境的器官特异性的生物基质支架

Wang等人开发了Rojkind-Reid方案的高度改进版本，并且显示产生的基质提取物，称为“生物基质支架”，其保留大于98％的组织胶原蛋白和胶原蛋白相关的基质成分（例如纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖等）。此外，已经显示生物基质支架含有与任何组织的基质成分结合的所有已知信号传导分子（生长因子、细胞因子），并且其水平与体内发现的水平相似。基质成分和结合信号显示保留在组织学上准确的位置。使用Wang等人的方案从大鼠肝脏制备生物基质支架。采用类似的方案，制备肺生物基质支架。

将大鼠的下腔静脉（IVC）插管以输注去细胞化试剂，并使用血管夹夹住上腔静脉（SVC）。在大鼠的颈动脉中开出一个开口用于流出。大鼠肺的颜色变化（从白色到近乎透明）提供了成功去细胞化的初步指示（图6a）。通过插入肝门静脉以输注去细胞化试剂来制备去细胞化肝BMS（图6b）。通过组织学和通过评估BMS材料的核酸含量来确认完全去细胞化（补充图1a、b）。值得注意的是，这些BMS自然形成纤维蛋白和碳水化合物的网状结构，其完全覆盖了组织培养板（图1b）。

为了评估肺BMS是否含有体内肺微环境中存在的信号传导分子，我们使用半定量ELISA评估了去细胞化后我们的肝BMS保留的生长因子和细胞因子的相对丰度。与证明了细胞外基质结合信号传导分子在肝去细胞化后被保留¹²的先前的数据一致，肺生物基质支架几乎以接近生理水平保留了所有（93％）分析的生长因子和细胞因子（图1c）。注意，这些信号传导分子的相对丰度在肝和肺BMS之间变化，与其组织特异性相一致（图6c）。

为了进一步评估肝和肺BMS之间存在的分子差异，我们进行了质谱分析。与细胞外基质结合生长因子和细胞因子一样，我们发现细胞外基质本身的相对成分在肝和肺BMS之间也不同（图1d；图7）。

细胞系在体外形成肝和肺“转移”

为了工程化组织特异性CRC癌症转移，我们在涂覆有肝和肺BMS的组织培养皿上培养CRC细胞系（HT-29、SW480和Caco2）。令人兴奋的是，所有三种CRC细胞系自发地形成通过紧密连接结合在一起的肿瘤细胞组成的三维（3D）球状体集落（图2a；图7a、b）。这些“转移”的规模相对较大，直径达到毫米。直径大于500微米的肿瘤球状体由于缺乏氧气和养分可用性以及细胞毒性代谢物的内部积累而含有坏死的核心。与该观察结果一致，在BMS上工程化的转移也含有类似于体内转移中发现的缺氧和坏死区域的坏死区域（图7c）。

为了表征我们的工程化转移的行为，我们比较了在肝和肺BMS上生长的CRC细胞的接种效率和生长速率与在塑料、胶原蛋白和基质胶上生长的细胞的接种效率和生长速率。申请人发现，与在塑料上生长的细胞相比，CRC细胞在胶原蛋白、基质胶、肝BMS和肺BMS的接种效率降低（图2b）。此外，申请人发现，在胶原蛋白、肝BMS和肺BMS上生长的细胞比在塑料和基质胶上生长的细胞生长更慢（图2c）。在工程化转移中观察到的较慢生长速率与体内转移性的癌细胞的行为一致。

申请人接下来试图确定肝和肺工程化转移所显示的相对缓慢的生长速率是否是由于细胞凋亡率增加或增殖速率降低。为了表征在不同基质上生长的癌细胞中的细胞凋亡，申请人使用流式细胞术评估了Cleaved Caspase 3（细胞凋亡标记物）的表达。申请人发现，在所有培养条件下CRC细胞表现出相当的凋亡率（图9a）。为了评估在不同基质上生长的癌细胞的相对增殖速率，我们进行了EdU细胞增殖分析。申请人用EdU温育培养物4小时，其中EdU是一种胸苷类似物，当细胞进入S期时掺入DNA中。随后，申请人使用流式细胞术量化了经历S期（EdU阳性）的细胞数量。申请人发现，在所有三种细胞系测试的所有培养条件中，肝和肺生物基质支架上生长的肿瘤细胞显示出最低的增殖速率（图8b）。累积地，这些数据表明，接种在BMS上的CRC细胞产生相对大的缓慢生长的培养物，其比其他培养平台产生的培养物更相当于体内转移的。

工程化的肝转移与体内发现的转移非常相似

为了进一步评估在BMS和常规基质上生长的癌细胞与体内转移共有的相似程度，申请人进行了组织病理学分析。将在塑料、胶原蛋白、基质胶和肝生物基质上生长的细胞的组织学与裸鼠中存在的体内肝转移和来自患有转移性CRC癌转的患者的肝转移进行比较。在体内发现的胃肠道来源的肝转移的典型组织学特征包括：（1）印戒细胞，（2）奇异的有丝分裂图（bizarre mitotic figure），（3）坏死的碎片（嗜酸性粒细胞和核碎片的细胞外积聚），（4）多形性细胞大小和形状，以及（5）多核细胞。申请人能够鉴定由HT-29、SW480和Caco2CRC细胞产生的工程化的肝转移中的所有这些特征（图3a；图8）。相反，在胶原蛋白和基质胶上生长的CRC细胞仅显示出奇异的有丝分裂图，并且在标准塑料培养皿上生长的多核细胞和CRC细胞不含有这些组织学特征（图3a；图8）。印戒细胞是体内病理学的发现，其尚未在离体模型系统中报道。这些数据表明工程化的转移含有在体内肝转移中发现的相同病理学的特征。

。

除了探索在不同基质上生长和体内转移的癌细胞所共有的组织学特征之外，申请人还试图研究它们各自的转录组之间的相似程度。具体地，申请人将在塑料、基质胶和肝BMS上培养的HT-29细胞的全基因表达谱与通过脾脏注射HT-29细胞形成的体内肝转移的全基因表达谱进行比较（图9a、b）。分层聚类分析显示，与在塑料和基质胶上生长的HT-29细胞相比，我们的工程化的肝转移的基因表达特征更相当于体内肝转移的（图3b）。通过比较工程化的转移和在基质胶上生长的CRC细胞与在塑料上生长的细胞的基因表达谱，进一步评估工程化的转移和体内转移所共有的相对高度的相似性。

与在塑料上生长的细胞相比，观察到总共791个基因在生物工程化的转移和体内肝转移中均上调。发现许多这些常见的上调基因参与对氧化应激和缺氧的生物反应。

与在塑料和基质胶上生长的细胞相比，观察到总共619个基因在工程化的转移和体内肝转移中离散地上调（图11c）。发现通常上调的基因与血管生成、细胞粘附和药物代谢的功能相关（图11c）。

申请人还观察到，体内和工程化的肝CRC转移比在基质胶和塑料上培养的CRC细胞表达更高水平的Timp1（补充图5d）。该发现与先前的研究一致，证明TIMP1在肝转移中的表达高于CRC患者的原发性肿瘤中的。总之，这些数据表明，工程化的转移在表型和生物学上非常类似于体内转移。

工程化的转移表明体内转移性的可能性增加

申请人试图确定工程化的转移与体内转移共享的组织学和分子相似性是否功能性地转化为增加的在相应的体内组织内生长的能力。即，申请人假设，如果BMS重现组织特异性微环境，那么在BMS上生长的细胞应该能够在其相应的体内微环境中存活和生长。例如，在肝脏BMS上生长的细胞应该更适合在肝脏组织中生长。为了验证这一假设，申请人将在塑料、胶原蛋白、基质胶、肝脏BMS和肺BMS上生长的HT-29-luc2细胞递送至宿主的肝和肺，随后使用生物发光成像评估其在体内形成转移的能力（图4a、c；图12）。为了确定工程化的肝转移在肝组织中生长的相对能力，申请人使用直接肝注射将在不同培养条件下生长的CRC细胞递送至肝，并发现从工程化的肝转移分离的细胞在体内比在塑料、胶原蛋白、基质胶或肺BMS上生长的细胞更能够形成肝转移（图4a、b、图11）。

为了评估工程化的肺转移在肺组织中生长的相对能力，我们使用尾静脉注射将在不同基质上生长的CRC细胞递送至肺。申请人发现，在肺BMS上生长的细胞表现出比在所有常规培养基质上生长的细胞更高的形成肺转移的能力（图4c、d；图12）。出乎意料的是，申请人发现，在肝BMS上生长的细胞也能够形成肺转移。此外，申请人发现，来自肝脏BMS的细胞和较小程度的肺BMS在尾静脉注射后形成肝转移（图4a、b；图12）。

暴露于低氧条件下的癌细胞能够对经历细胞凋亡表现出增强的存活和抗性。为了确定由工程化的转移显示的增加的肺转移性可能性是否归因于缺氧细胞的存在，申请人使用尾静脉注射将在缺氧条件下在塑料上生长的细胞递送至肺。申请人发现，在塑料上生长的CRC细胞的低氧预处理不会增强它们形成肺转移的能力（图13）。另外，使用尾静脉注射递送的细胞必须能够在发生肺转移之前避免失巢凋亡并定植肺组织。重要的是，申请人发现，在肝和肺BMS上生长的HT-29细胞显示的肺转移可能性增加不是由于对失巢凋亡的抗性增加或侵染能力增强（图14a、b）。这些数据一起表明，与常规基质上生长的培养物相比，工程化转移更能够在其相应的体内微环境中生长。

工程化的转移显示器官特异性治疗响应

以组织特异性方式有效治疗转移的治疗方案的鉴定仍然是感兴趣的动态领域，因为同一患者的不同器官中的转移能够对相同的治疗方案作出不同的响应。为了确定CRC细胞在其上生长的基质是否影响治疗响应，我们将在塑料、胶原蛋白、基质胶、肝BMS和肺BMS上生长的CRC细胞处理为标准CRC化学治疗方案以及放射治疗。检查了四种常用于转移性的CRC的化学治疗方案：单独的伊立替康、伊立替康+5-氟尿嘧啶（5-FU）、单独的奥沙利铂、以及奥沙利铂+5-FU。申请人发现，CRC细胞系对化学治疗和放射治疗的响应受其体外微环境的强烈影响（图5a）。例如，工程化的Caco2肺转移比工程化的Caco2肝转移对化学治疗方案一致地更敏感（图5a）。另外，申请人发现，CRC细胞培养物对放射治疗的响应取决于它们的培养基质（图5b）。重要的是，申请人观察到工程化的肝和肺转移的治疗响应不同。这些结果表明，CRC细胞的治疗响应受到培养它们的细胞外基质的器官特异性成分的影响。

转移的行为受它们所居住的组织特异性微环境的强烈影响。认识到这种相互作用的重要性，申请人已经开发了一种新的3D体外培养平台，其使用去细胞化的器官的基质提取物以组织特异性方式研究转移性的疾病。作为原理证明，申请人设计了来自CRC细胞系的肝和肺转移。虽然一些研究使用共培养来重建肿瘤微环境，但该数据表明申请人能够通过重现无细胞生化环境来设计具有与体内转移性病变中存在的相似的组织学特征和基因表达谱的转移。例如，申请人在工程化的肝转移中鉴定了印戒细胞，这一观察结果迄今尚未在任何体外癌症模型系统中报道。重要的是，申请人表明，与在常规培养基质上生长的细胞相比，工程化的转移更适于在其各自的体内组织特异性微环境中生长。申请人还观察到工程化的肝转移能够在肺中形成转移。对于该观察结果的可能的解释是，肺是比肝通常更“宽容的”环境，或者在肝微环境中生长的肿瘤细胞具有促进其在肺内生长的能力的特征。

该数据表明，CRC细胞对标准治疗方案的治疗响应取决于它们在体外暴露于的组织特异性微环境。有趣的是，在肺BMS上生长的细胞通常比在肝BMS上生长的细胞对治疗更敏感。该数据与临床观察结果一致，即肝转移是转移性的CRC患者中发病率和死亡率的主要原因，尽管肝和肺转移在该疾病环境中是常见的。

不受理论限制，申请人相信这种能够在体外工程化的转移的培养平台代表了以组织特异性方式研究转移性癌症生物学的有力工具。未来的工作将涉及识别影响癌细胞行为的特定ECM成分，因为这样的评估可能揭示新的治疗靶标。该模型也适用于研究转移的组织特异性治疗响应。值得注意的是，该模型能够被用于药物筛选分析以测试新开发的用于转移性的疾病的治疗剂。重要的是，这是唯一允许高通量筛选分析的系统，其旨在识别设计用于以器官特异性方式治疗转移的疗法。

癌细胞和器官特异性环境之间的相互作用，被认为在调节癌细胞定殖器官并随后生长成转移的能力中起重要作用，即“种子和土壤”假说²。认识到微环境（“土壤”）的重要性，使用了组织特异性生物基质支架，并在行为、组织学和生物学上密切模拟体内转移。另外，工程化的转移对治疗性治疗的响应取决于肿瘤细胞在其上生长的器官特异性的基质化学。重要的是，在生物基质支架上培养细胞增加了癌细胞的转移性的可能性，并且可能对组织定植给予组织特异性的偏好。该发现暗示了为转移性的癌症患者开发新的预后和治疗策略的可能性并且是独特的，因为它是目前唯一能够在体外重现器官特异性微环境的培养系统。

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Claims (18)

1.一种确定癌症或肿瘤在被诊断患有癌症或肿瘤的患者之内转移的可能性的方法，包含：

用取自被诊断患有癌症或肿瘤的患者的肿瘤活组织检查或样品的细胞，对一种或多种生物基质支架进行接种，每一种或多种生物基质支架分别来源自人体的一种或多种预定的组织或器官，

分析所述细胞的形成生长细胞的集落的能力，

其中每种生物基质支架概括了其来源自的器官或组织的生物学方面，并且

其中如果所述细胞在一种或多种生物基质支架上形成生长细胞的集落，则预测体内转移进其分别来源自的所述一种或多种预定的组织或器官中。

2.根据权利要求1所述的方法，如果细胞在一种或多种生物基质支架的基底上形成生长细胞的集落，则预测转移进其分别来源自的所述一种或多种预定的组织或器官中。

3.根据权利要求1所述的方法，其中来源自一种或多种预定的组织或器官的所述一种或多种生物基质支架中的每一种，选自生物基质支架的冷冻切片、冷冻粉末化的生物基质支架、以及完整的生物基质支架。

4.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包含：基于所述集落的组织学、外泌体产生、microRNA产生、与间充质细胞的相互作用、和/或基因表达谱，对所述集落进行表征。

5.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包含：筛选所述集落的对一种或多种癌症治疗和/或化学治疗剂的响应性。

6.根据权利要求5所述的方法，其中基于所述集落的组织学、外泌体产生、microRNA产生、与间充质细胞的相互作用、和/或基因表达谱，选择所述癌症治疗和/或化学治疗剂。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述一种或多种癌症治疗和/或化学治疗剂选自放射治疗的一个或多个剂量和/或一种或多种化学治疗，所述化学治疗例如是蒽环类药物、烷基化剂、铂基剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂和有丝分裂抑制剂。

8.根据权利要求5所述的方法，其中所述一种或多种癌症治疗和/或化学治疗剂选自放射治疗、免疫治疗、内分泌治疗和分子治疗。

9.一种确定对被诊断患有癌症或肿瘤的患者中的癌症或肿瘤的适当治疗的方法，包含：

用（1）取自被诊断患有癌症或肿瘤的患者的肿瘤活组织检查或样品的细胞或（2）来自与患者相同的癌症或肿瘤类型的细胞系的细胞，对一种或多种生物基质支架进行接种，每一种或多种生物基质支架分别来源自人体的一种或多种预定的组织或器官，其中所述细胞在所述生物基质支架上形成生长细胞的集落，

用一种或多种癌症治疗和/或化学治疗剂处理所述集落，

其中所述生物基质支架概括了其来源自的组织或器官的生物学方面，

并且其中基于所述集落对用所述一种或多种癌症治疗和/或化学治疗剂进行的处理的响应性，选择对所述患者的适当治疗。

10.根据权利要求9所述的方法，其中基于三维集落的组织学或基因表达谱，选择所述癌症治疗和/或化学治疗剂。

11.根据权利要求9的所述的方法，其中所述一种或多种癌症治疗和/或化学治疗剂选自放射治疗的一个或多个剂量和/或一种或多种化学治疗，所述化学治疗例如是蒽环类药物、烷基化剂、铂基剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂和有丝分裂抑制剂。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述一种或多种癌症治疗和/或化学治疗剂选自放射治疗、免疫治疗、内分泌治疗和分子治疗。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述免疫治疗选自树突细胞治疗、抗体依赖性治疗、T细胞依赖性治疗、或NK细胞依赖性治疗。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述分子治疗包含施用一种或多种反义寡核苷酸。

15.一种试剂盒，其包含分别来源于人体的一种或多种预定的组织或器官的一种或多种生物基质支架、用于在所述一种或多种生物基质支架上接种细胞的说明、以及用于实施权利要求1至8中任一项所述的方法的说明。

16.一种试剂盒，其包含分别来源于人体的一种或多种预定的组织或器官的一种或多种生物基质支架、用于在所述一种或多种生物基质支架上接种细胞的说明、以及用于实施权利要求9至14中任一项所述的方法的说明。

17.根据权利要求16所述的试剂盒，所述试剂盒还包含一种或多种癌症治疗和/或化学治疗剂。

18.一种人造肿瘤或转移模型，所述模型对人体的一种或多种预定的组织或器官有特异性，通过下述方法产生：

用（1）取自被诊断患有癌症或肿瘤的患者的肿瘤活组织检查或样品的细胞或（2）来自与患者相同的癌症或肿瘤类型的细胞系的细胞，对一种或多种生物基质支架进行接种，每一种或多种生物基质支架分别来源自人体的一种或多种预定的组织或器官，

其中所述细胞在所述生物基质支架上形成生长细胞的集落，并且

其中所述生物基质支架概括了其来源自的组织或器官的生物学方面。