CN103298498B - 用于器官增强的注射制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含活性剂例如生物活性细胞群体的治疗制剂以及制备和使用所述治疗制剂的方法。

Description

用于器官增强的注射制剂
发明领域
本发明涉及活性剂例如生物活性细胞群体的治疗制剂和制备其的方法，以及将所述制剂给有此需要的受试者施用的方法。
发明背景
胶原和基于明胶的生物材料已被成功地用于多种组织工程应用(Rohanizadeh等人J Mater Sci Mater Med2008；19：1173-1182；Takemoto等人Tissue Eng Part A2008；14：1629-1638；Young等人JControl Release2005；109：256-274)。这两种大分子的特征在于优良的生物相容性和低抗原性(Cenni等人J Biomater Sci Polym Ed2000；11：685-699；Lee等人Int J Pharm2001；221：1-22；Waksman等人J Immunol1949；63：427-433)；然而，由于明胶是通过胶原的水解获得的，因此其具有优于后者的某些有利方面：(a)其是可容易获得的和易于使用；(b)提供与分子量和起霜(bloom)相关的选择(即控制物理性质)；和(c)对于化学修饰更灵活并且更易于制造。此外，从生物学观点来看，明胶维持与胶原相似的生物相容性和细胞粘附性质Engvall等人Int J Cancer1977；20：1-5；Kim等人Oral Surg OralMed Oral Pathol Oral Radiol Endod2009；108：e94-100)。
已报导了用于交联此类大分子以延迟它们的生物降解，从而延长它们的体内停留(在组织工程应用中)或定制它们的药物释放能力(当用作药物载体时)的各种方法。已公布了用于胶原或明胶的化学或光化学交联的许多方法(Adhirajan等人JMicroencapsul2007；24：647-659；Chang等人Macromol Biosci2007；7：500-507；Gagnieu等人Biomed Mater Eng2007；17：9-18；Kimura等人J Biomater Sci Polym Ed2010；21：463-476；Ma等人J Biomed Mater Res A2004；71：334-342；Vandelli等人Int JPharm2001；215：175-184；Vandelli等人J Control Release2004；96：67-84)。大部分此类方法被靶向减少此类生物材料对酶促降解的易感性和延长它们的体内停留时间(Chang等人同上2007；Ma等人同上2004)。其它交联方法通常被用于产生适合作为缓慢释放药物、蛋白质或核酸载体的基于明胶或胶原的生物材料(Kimura同上2010；Vandelli同上2004；Kommareddy等人Nanomedicine2007；3：32-42；Sehgal等人Expert Opin Drug Deliv2009；6：687-695；Sutter等人J Control Release2007；119：301-312)。用于胶原和明胶以及其它组织工程-相容性系统的广泛使用的交联剂种类是碳二亚胺(Adhirajan同上2007；OldeDamink等人Biomaterials1996；17：765-773；Pieper等人Biomaterials2000；21：581-593；Cornwell等人Clin Podiatr Med Surg2009；26：507-523)。此类分子称为零长度(zero-length)交联剂并且通过介导存在于待交联的种类上的羧基与伯胺官能团之间的酰胺键的形成起作用。此外，碳二亚胺的细胞毒性低于其它常用交联剂(例如戊二醛)(Lai等人JMater Sci Mater Med2010；21：1899-1911)。戊二醛在CultispherTM珠粒中用作交联剂。Burg美国专利No.6,991,652描述了包含用于细胞的三维支持结构的组织工程组合物，所述组合可被递送至受试者。
再生医学技术提供了慢性肾疾病(CKD)的下一代治疗选择。Presnell等人WO/2010/056328和Ilagan等人PCT/US2011/036347描述了分离的生物活性肾细胞，包括肾小管细胞和红细胞生成素(EPO)产生性肾细胞群体，和分离及培养所述细胞的方法，以及利用细胞群体治疗有此需要的受试者的方法。
存在对适合用于在组织工程和再生医学应用中将活性剂例如生物活性细胞递送至有此需要的受试者的治疗制剂的需要。
发明概述
在一个方面，本发明提供了含有活性剂例如生物活性细胞的注射治疗制剂。在一个实施方案中，注射制剂包含生物活性细胞和温度敏感性细胞稳定化生物材料(cell-stabilizing biomaterial)。在另一个实施方案中，温度敏感性细胞稳定化生物材料(i)在约8℃或更低温度下大体上保持固体状态和/或(ii)在环境温度或更高温度下大体保持液体状态。在一个其它实施方案中，生物活性细胞包括肾细胞，如本文中所描述的。在另一个实施方案中，生物活性细胞大体上均匀地分散在整个细胞稳定化生物材料的体积中。在其它实施方案中，材料在约8℃与约环境温度或更高温度之间具有固体至液体的过渡状态。在一个实施方案中，大体上固体状态是凝胶状态。在另一个实施方案中，细胞稳定化生物材料包括水凝胶。在一个其它实施方案中，水凝胶包括明胶。在其它实施方案中，明胶以约0.5%至约1%(w/v)存在于制剂中。在一个实施方案中，明胶以约0.75%(w/v)存在于制剂中。在另一个实施方案中，制剂还包括细胞活性剂(cell viability agent)。在一个其它实施方案中，细胞活性剂包括选自抗氧化剂、氧载体、免疫调节因子、细胞募集因子(cellrecruitment factor)、细胞附着因子(cell attachment factor)、抗炎剂、免疫抑制剂、血管生成因子和伤口愈合因子的试剂。在一些实施方案中，细胞活性剂是抗氧化剂。在一个实施方案中，抗氧化剂是6-羟基-2,5,7,8-四甲基色原烷-2-羧酸。在另一个实施方案中，6-羟基-2,5,7,8-四甲基色原烷-2-羧酸以约50μM至约150μM存在。在一个其它实施方案中，6-羟基-2,5,7,8-四甲基色原烷-2-羧酸以约100μM存在。在一些实施方案中，细胞活性剂是氧载体。在一个实施方案中，氧载体是全氟化碳。在其它实施方案中，细胞活性剂是免疫调节剂。在一个实施方案中，细胞活性剂是免疫抑制剂。
在另一个方面，本发明提供了包含生物活性肾细胞的注射治疗制剂。在一个实施方案中，制剂包含生物活性肾细胞、约0.75%(w/v)的明胶和约100μM6-羟基-2,5,7,8-四甲基色原烷-2-羧酸，其中制剂(i)在约8℃或更低温度下大体上为固体状态，和(ii)在环境温度或更高温度下大体上为液体状态。在另一个实施方案中，生物活性肾细胞大体均匀地分散在整个细胞稳定化生物材料的体积中。在一个其它实施方案中，生物材料包括在约8℃与约环境温度之间的固体至液体的过渡状态。在其它实施方案中，大体上固体状态是凝胶状态。在一些实施方案中，制剂还包含细胞活性剂。在另一个实施方案中，细胞活性剂包括选自抗氧化剂、氧载体、免疫调节因子、细胞募集因子、细胞附着因子、抗炎剂、血管生成因子和伤口愈合因子的试剂。在一个实施方案中，细胞活性剂是氧载体。在另一个实施方案中，氧载体是全氟化碳。在一个其它实施方案中，细胞活性剂是免疫调节剂。在其它实施方案中，细胞活性剂是免疫抑制剂。
在一个其它方面，本发明提供了本文中描述的制剂，其还包括生物相容性珠粒。在一个实施方案中，生物相容性珠粒包括生物材料。在另一个实施方案中，珠粒是交联的。在一个其它实施方案中，交联的珠粒相较于未交联的生物相容性珠粒具有减小的对酶促降解的易感性。在其它实施方案中，交联的珠粒是碳二亚胺交联的珠粒。在一个实施方案中，碳二亚胺选自l-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)、DCC-N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIPC)。在另一个实施方案中，碳二亚胺是l-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)。在一个其它实施方案中，交联的珠粒相较于未交联的珠粒包含减少数量的游离伯胺。在其它实施方案中，游离伯胺的数目可通过分光度光度计测量在约355nm处检测到。在一些实施方案中，利用生物活性细胞接种珠粒。在一个实施方案中，生物活性细胞是肾细胞。在另一个实施方案中，制剂还包含含有温度敏感性生物材料的其它生物相容性珠粒，所述生物材料(i)在环境温度可更低温度下大体上保持固体状态，和(ii)在约37℃或更高温度下大体上保持液体状态。在一个其它实施方案中，珠粒的生物材料包含环境温度与约37℃之间的固体至液体的过渡状态。在其它实施方案中，大体上固体状态是凝胶状态。在一个实施方案中，珠粒的生物材料包括水凝胶。在另一个实施方案中，水凝胶包含明胶。在一个其它实施方案中，珠粒包含约5%(w/v)至约10%(w/v)的明胶。在一些实施方案中，另外的生物相容性珠粒是间隔珠(spacer bead)。在其它实施方案中，不用生物活性细胞接种间隔珠。
在另一个方面，本发明的制剂包含由肾细胞群体分泌的产物。在一个实施方案中，制剂包括由肾细胞群体和/或生物活性细胞分泌的产物。在一个其它实施方案中，生物活性细胞是肾细胞。在另一个实施方案中，产物包括旁分泌因子、内分泌因子和邻分泌因子的一种或多种。在一个其它实施方案中，产物包括囊泡。在其它实施方案中，囊泡包括微囊泡(microvesicle)。在一个实施方案中，囊泡包括外来体(exosome)。在另一个实施方案中，囊泡包括选自旁分泌因子、内分泌因子、邻分泌因子和RNA的分泌产物。
附图概述
图1.未交联的明胶珠粒的温度反应性。
图2.包含悬浮的单个肾细胞的基质。
图3.包含细胞聚集体的基质。
图4.包含附着至微载体珠粒的细胞的基质。
图5.包含细胞和可溶性因子(透明质酸)的基质。
图6.在4℃下于基质中进行3天后的细胞活力。
图7.利用与Cultispher S珠粒混合的间隔珠注射的肾的组织学(1周)，其举例说明了珠粒的生物相容性和它们的空间产生能力。
图8.基质的结构完整性的丢失的举例说明(左图框：固体；右图框：液体)。
图9.碳二亚胺介导的明胶交联的合成方案，显示了参与反应的氨基酸残基(在未交联的明胶中)和它们形成的酰胺键(在交联的明胶中)。
图10A-B.明胶珠粒的形态学。A–显示未交联的明胶珠粒的总体形态学和尺寸分布的扫描电子显微镜图像(比例尺1mm)。B–显示珠粒的多孔中空结构的高倍放大扫描电子显微镜图像(比例尺100μm)。
图11.珠粒的尺寸分布特征谱。
图12A-B.珠粒的表面形貌学。上行(A)–干燥珠粒的SEM图像。下行(B)–湿润珠粒的明视野显微镜图像。两组图像说明了珠粒的多孔表面。SEM图像还说明了中空内部。
图13A-B.交联的明胶中的胺定量。A–说明伯胺与苦基磺酸之间的橙色加成物的形成。B–存在于酶促消化的差异交联的明胶珠粒中的伯胺基的定量(n=3)。ANOVA统计分析P=0.007。
图14A-B.差异交联的明胶珠粒的酶促降解特征谱(A)和与Cultispher S珠粒比较(B)。
图15.显示细胞至珠粒的附着和细胞活力的10mM EDC交联的珠粒的细胞相容性(绿色=活的；红色=死亡细胞)。
图16.交联的珠粒的细胞相容性。交联的明胶珠粒上原代大鼠肾细胞的染色。
图17.说明珠粒的生物相容性的利用0.1M EDC交联的明胶珠粒注射的肾的组织学(1周)。
图18.显示注射后1周交联的明胶珠粒的降解的肾切片的组织学评估。
图19.显示注射后4周交联的明胶珠粒的降解的肾切片的组织学评估。
图20：用于NKA原型的产生的策略的概述。
图21A-C：选择的啮齿类动物再生肾细胞生物材料构建体的代表性活细胞/死细胞染色(A：细胞/PBS；B：细胞/GBH；C：细胞/珠粒)。
图22A-C：植入后4周内关键肾生理指标的概述(ANOVA分析)。(A)体重；(B)血尿素氮(BUN)；(C)血清肌酸酐(Scre)
图23A-B：植入后4周作为肾生理指标的(A)尿蛋白质/肌酸酐(UPC)和(B)尿蛋白质(Uprotein)的概述(ANOVA分析)
图24A-B：植入后4周作为肾生理指标的(A)比重和(B)尿肌酐(Ucre)的概述(ANOVA分析)。
图25：在半肾切除术模型中与细胞/生物材料构建体在啮齿类动物肾内的植入相关的代表性组织学结果。
图26：显示使用多层不连续梯度技术(左图)或单层混合梯度技术(右图)从新鲜分离的肾组织富集红细胞生成素生成细胞级分。两种方法都导致非红细胞生成素生成细胞组分(主要地肾小管细胞)从红细胞生成素带的部分消耗，其表现为1.025g/mL至1.035g/mL。
图27：显示了单独地收获和并行地用于相同的不连续梯度的“含氧量正常的”(21%的氧)和“缺氧”(2%的氧)啮齿类动物培养物的不连续梯度。
图28：显示单独收获并且并行地用于相同的不连续梯度的“含氧量正常的”(21%的氧)和“缺氧”(2%的氧)犬培养物的不连续梯度。
图29：提供了UNFX条件培养基的制备和分析的示意图。
图30A-B制备细胞聚集体的方法。A-具有低结合板的轨道旋转器；B–具有细胞的旋转瓶(spinner flask)。
图31描述细胞聚集体或球形体(spheroid)。
图32描述了细胞聚体-NKCC2，绿色；细胞核-蓝色。
图33描述了细胞聚集体-GGT-1，绿色；细胞核-蓝色。
图34描述了细胞聚集体-水通道蛋白1(Aquaporin1)，绿色；细胞核-蓝色。
图35描述了细胞聚集体-亮氨酸氨肽酶3，红色；细胞核，蓝色。
图36描述了细胞聚集体-有机离子转运蛋白1(Organic Ion Transporter1)(OAT1)，红色；细胞核，蓝色。
图37描述了细胞聚集体-立方蛋白(Cubilin)，红色；细胞核，蓝色。
发明详述
本发明涉及活性剂例如生物活性细胞的治疗制剂以及制备所述治疗制剂的方法和利用制剂治疗有此需要的受试者的方法。生物活性细胞制剂可适用于生物活性肾细胞(BRC)的异源混合物或级分。生物活性肾细胞可以为分离的肾细胞，包括肾小管细胞和红细胞生成素(EPO)生成肾细胞。BRC细胞群体可包括富集的肾小管和EPO生成细胞群体。BRC可来源于健康个体的肾细胞部分或它们本身为健康个体的肾细胞级分。此外，本发明提供了从不健康个体获得的肾细胞级分，所述不健康个体，当与健康个体的相应肾细胞级分相比较时可以缺少某些细胞组分，但仍然保持治疗性质。本发明还提供了与健康个体相比较缺少细胞组分的治疗活性细胞群体，在一个实施方案中，可从处于各种疾病状态的自体来源分离和扩增所述细胞群体。
虽然在本文中描述了生物活性细胞制剂，但本发明涉及包含多种其它活性剂的制剂。其它适当的活性剂包括但不限于细胞聚集体、无细胞生物材料、来自生物活性细胞的分泌产物、大和小的分子治疗剂，以及其组合。例如，可将一种类型的生物活性细胞与基于生物材料的微载体(具有或不具有治疗分子或另一种类型的生物活性细胞)组合，可将非贴壁细胞与无细胞颗粒组合。
1.定义
除非另外定义，否则本文中使用的技术和科学术语具有与由本发明所属领域内的技术人员通常理解的含义相同的含义。Principles of Tissue Engineering,第3版(由RLanza,R Langer,&J Vacanti编著),2007为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的一般指导。本领域技术人员将意识到与本文中描述的方法和材料类似或等同的许多方法和材料，所述方法和材料可用于本发明的实施。事实上，本发明绝不限定于所述方法和材料。
如本文中所用，术语“细胞群体”指通过从适当的组织来源，通常从哺乳动物直接分离获得的许多细胞。随后可在体外培养分离的细胞群体。本领域技术人将理解用于分离和培养用于本发明的细胞群体的各种方法和适用于本发明的细胞群体中的不同数目的细胞。细胞群体可以为来源于器官或组织例如肾的未分级的异源细胞群体。例如，可从组织活检组织或从完整器官组织分离异源细胞群体。可选择地，异源细胞群体可来源于从组织活检组织或完整器官组织建立的哺乳动物细胞的体外培养物。未分级的异源细胞群体还可称为非富集的细胞群体。在一个实施方案中，细胞群体包含生物活性细胞。
术语“自体器官”意指活受试者的器官。受试者可以是健康的或不健康的。不健康的受试者可具有与该特定器官相关的疾病。
术语“自体肾”意指活受试者的肾。受试者可以是健康的或不健康的。不健康的受试者可具有肾病。
术语“再生作用”意指给自体器官例如肾提供益处的作用。所述作用可包括但不限于对自体肾器官损害程度的减轻或自体器官功能的恢复或稳定化的提高。肾损害可以为纤维化、炎症、肾小球肥大(glomerular hypertrophy)等形式，并且与受试者的自体器官相关的疾病相关。
如本文中所用，术语“混合物”是指两种或更多种来源于未分级的异源细胞群体的分离的富级的细胞群体的组合。根据某些实施方案，本发明的细胞群体为肾细胞群体。
“富集的”细胞群体或制剂是指来源于起始器官细胞群体(例如，未分级的异源细胞群体)的细胞群体，其包含比起始群体中特定细胞类型的百分比更大的百分比的该细胞类型。例如，可富集起始肾细胞群体的第一、第二、第三、第四、第五等目标细胞群体。如本文中所用，术语“细胞群体”、“细胞制剂”和“细胞原型”可互换使用。
在一个方面，如本文中所用，术语“富集的”细胞群体是指来源于起始器官细胞群体的细胞群体(例如，来自肾活检组织或培养的哺乳动物肾细胞的细胞悬浮物)，其可包含比起始群体中能够生成EPO的细胞的百分比更大的百分比的能够生成EPO的细胞。例如，术语“B4”为来源于起始肾细胞群体的细胞群体，其包含与起始群体相比较更大百分比的EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。本发明的细胞群体可富集一种或多种细胞类型以及消耗其中的一种或多种其它细胞类型。例如，富集的EPO生成细胞群体可富集间质成纤维细胞，以及消耗肾小管细胞和集合管上皮细胞，相对于非富集的细胞群体即所述富集的细胞群体所源自的起始细胞群体中的间质成纤维细胞和肾小管细胞。在所有引用富集EPO或“B4”群体的实施方案中，富集的细胞群体为包含可以以氧调节的方式生成EPO(如通过来自内源自体EPO基因的氧可调节的EPO表达所显示的)的细胞的异源细胞群体。
在另一个方面，包含比起始群体中特定细胞类型例如血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞的百分比更大的百分比的该细胞类型的富集的肾细胞群体，与来源于健康个体或受试者的起始肾细胞群体相比较，也可缺少或缺乏一种或多种特定细胞类型，例如血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞。例如，术语“B4’”或B4prime”，在一个方面，与健康个体相比较，为来源于起始肾细胞群体的缺少或缺乏一种或多种细胞类型例如血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞(取决于起始样品的疾病状态)的细胞群体。在一个实施方案中，B4’细胞群体来源于患有慢性肾病的受试者。在一个实施方案中，B4’细胞群体来源于患有局灶性节段性肾小球硬化症(focal segmental glomerulosclerosis)(FSGS)的受试者。在另一个实施方案中，B4’细胞群体来源于患有自身免疫肾小球肾炎的受试者。在另一个方面，B4’为来源于包括所有细胞类型例如血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞的起始细胞群体(所述起始细胞群体后来被消耗一种或多种细胞类型例如血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞或使得缺乏所述细胞类型)的细胞群体。在另一个方面，B4’为来源于包括所有细胞类型例如血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞的起始细胞群体(其中后来富集一种或多种特定细胞类型例如血管细胞、肾小管细胞或内分泌细胞)的细胞群体。例如，在一个实施方案中，B4’细胞群体可富集血管细胞，但消耗肾小球细胞和/或内分泌细胞。在另一个实施方案中，B4’细胞群体可富集肾小球细胞但消耗血管细胞和/或内分泌细胞。在另一个实施方案中，B4’细胞群体可富集内分泌细胞但消耗血管和/或肾小球细胞。在另一个实施方案中，B4’细胞群体可富集血管细胞和内分泌细胞但消耗肾小球细胞。在优选实施方案中，单独的或与另一种富集的细胞群体(例如B2和/或B3)混合的B4’细胞群体保留治疗性质。例如在本文实施例例如实施例11-13中描述了B4’细胞群体。
在另一个方面，富集的细胞群体还可指来源于上述起始肾细胞群体的细胞群体，所述细胞群体包含比在起始群体中在一些EPO生成细胞中表达一种或多种血管、肾小球和近端肾小管标志物的细胞的百分比大的百分比的在一些EPO生成细胞中表达一种或多种血管、肾小球和近端肾小管标志物的细胞。例如，术语“B3”是指来源于起始肾细胞群体的细胞群体，其相较于起始群体包含更大百分比的近端肾小管细胞以及血管和肾小球细胞。在一个实施方案中，B3细胞群体相较于起始群体包含更大百分比的近端肾小管细胞，但相较于B2细胞群体包含更少百分比的近端肾小管细胞。在另一个实施方案中，B3细胞群体相较于起始群体包含更大百分比的在一些EPO生成细胞中表达血管和肾小球细胞标记物的细胞，但相较于B4细胞群体包含更少百分比的在一些EPO生成细胞表达血管和肾小球细胞标志物的细胞。
在另一个方面，富集的细胞群体还可指来源于上文论述的起始肾细胞群体的细胞群体，所述细胞群体包含大于起始群体中表达一种或多种肾小管细胞标志物的细胞的百分比的百分比的表达一种或多种肾小管细胞标志物的细胞。例如，术语“B2”是指来源于起始肾细胞群体的细胞群体，所述细胞群体包含与起始细胞群体相比较更大百分比的肾小管细胞。此外，针对表达一种或多种肾小管细胞标志物富集的细胞群体(或“B2”)可包含一些来自集合管系统的上皮细胞。虽然使针对表达一种或多种肾小管细胞标志物(或“B2”)的细胞富集的细胞群体相对消耗了EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞，但富集的群体可包含与起始群体相比较更小百分比的此类细胞(EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞)。一般地，使异源细胞群体消耗一种或多种细胞类型，以便消耗的细胞群体包含相对于消耗前的异源细胞群体中包含的细胞类型的比例更小比例的细胞类型。可被消耗的细胞类型是任何类型的肾细胞。例如，在某些实施方案中，可消耗的细胞类型包括具有＜约1.045g/ml的密度的集合管(collecting duct)和肾小管系统的具有大粒度的细胞(称为“B1”)。在某些其它实施方案中，可被消耗的细胞类型包括具有＞约1.095g/ml的密度的具有低粒度和活力的碎片和小细胞(称为“B5”)。在一些实施方案中，消耗相对地富集肾小管细胞的细胞群体的所有下列细胞：“B1”、“B5”、氧可调节的EPO表达细胞、肾小球细胞和血管细胞。
如本文中所用，术语“缺氧”培养条件是指其中将细胞在培养系统中经历相对于其中将细胞在大气氧水平(约21%)下培养的标准培养条件有效氧水平降低的培养条件。非缺氧条件在本文中是指正常或含氧量正常的培养条件。
如本文中所用，术语“氧可调节的”的是指细胞基于细胞有效氧的量调节基因表达(上调或下调)的能力。“缺氧诱导型(Hypoxia-inducible)”是指响应于氧张力减小的基因表达的上调(无论是预诱导还是起始氧张力)。
如本文中所用，术语“生物材料”是指适用于引入活组织的天然或合成的生物相容性材料。天然生物材料为由活系统产生或源自活系统的材料。合成生物材料为不由活系统产生或不源自活系统的材料。本文中公开的生物材料可以为天然与合成生物相容性材料的组合。例如本文中所用，生物材料包括例如多聚体基质和支架。本领域技术人员将理解，生物材料可以构造为多种形式，例如多孔泡沫、凝胶、液体、珠粒、固体，并且可包括一种或多种天然或合成的生物相容性材料。在一个实施方案中，生物材料是能够变成水凝胶的溶液的液体形式。
术语“缓释(modified release)”或等同术语“控释”、“延迟释放”或“缓慢释放”是指在给个体施用后随时间过去或在超过1个时间点上释放活性剂例如生物活性细胞的制剂。活性剂的缓释(取决于制剂，其可在一系列期望的时间例如分钟、小时、天、周或更长时间中发生)与其中大体上整个剂量单位可在施用后立即可获得的标准制剂相反。为了组织工程和再生医学应用，优选缓释制剂提供了活性剂在局部施用(例如，活性剂对实体器官的直接施用)后在多个时间点上的释放。例如，生物活性细胞的缓释制剂可在施用时立即和随后提供细胞的释放，在更晚的时间提供细胞的第二释放。进行活性剂的第二释放的时间延迟可以是初始施用后数分钟、数小时或数天。一般地，释放延迟的时期相应于对于活性剂的生物材料载体失去其结构完整性所消耗的时期。当这样的完整性开始减小时活性剂的延迟释放开始，并且在完整性完全消失时完成。本领域技术人员将理解其它适当的释放机制。
如本文中所用，术语“贫血”是指因受试者的EPO生成细胞不能生成充足的功能性EPO蛋白，和/或EPO蛋白至全身性循环的不充足释放，和/或骨髓中的幼红细胞不能响应EPO蛋白而引起的红细胞数目的不足和/或血红蛋白水平的降低。患有贫血的受试者不能维持红细胞的动态平衡(erythroid homeostasis)。一般地，贫血可因肾功能的下降或丧失(例如慢性肾衰竭)、与相对EPO缺乏相关的贫血、与充血性心力衰竭相关的贫血、与骨髓抑制疗法例如化学疗法或抗病毒疗法(例如，AZT)相关的贫血、与非骨髓性癌相关的贫血、与病毒感染例如HIV相关的贫血以及慢性疾病例如自身免疫疾病(例如，类风湿性关节炎)、肝病和多器官系统衰竭的贫血而发生。
术语“EPO缺乏”是指可利用红细胞生成素受体激动剂(例如，重组EPO或EPO类似物)治疗的任何病况或病症，包括贫血。
如本文中所用，术语“器官相关疾病”是指与急性或慢性器官衰竭的任何分期或程度相关的病症，所述器官衰竭导致器官进行其功能的器官能力的丧失。
如本文中所用，术语“肾病”是指与急性或慢性肾衰竭的任何分期或程度相关的病症，其可导致肾进行血液过滤和从血液除去过量液体、电解质和废物的功能的能力丧失。肾病还包括内分泌功能异常例如贫血(红细胞生成素缺乏)和矿物质不平衡(维生素D缺乏)。肾病可始于肾或可继发于多种病况包括(但不限于)心力衰竭、高血压、糖尿病、自身免疫性疾病或肝病。肾病可以为在对肾的急性损害后发展的慢性肾衰竭的病况。例如，通过贫血和/或对毒物的暴露而产生的肾损害可引起急性肾衰竭；急性肾损害的不完全恢复可导致慢性肾衰竭的发展。
术语“治疗”是指对肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷的治疗性治疗和预防性或防止措施，其中目的是逆转、预防或减缓(减轻)靶向的病症。需要治疗的人包括已患有肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷的人以及易于患有肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷的人，或将预防其肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷的人。如本文中所用，术语“治疗”包括肾功能的稳定和/或提高。
如本文中所用，术语“体内接触”是指由富集的细胞群体分泌的产物与自体器官之间的直接体内接触。例如，由富集的肾细胞群体(或包含肾细胞/肾细胞级分的混合物或构建体)分泌的产物可与自体肾直接体内接触。直接体内接触可以为天然的旁分泌、内分泌或邻分泌。分泌产物可以为本文中描述的不同产物的异源群体。
如本文中所用，术语“核糖核酸”或“RNA”是指其中每一个单元由含氮碱基、核糖和磷酸组成的核苷酸单元的链。RNA可为单链或双链形式。RNA可以为囊泡内的部分或与囊泡结合。囊泡可以为外来体。RNA包括但不限于mRNA、rRNA、小RNA、snRNA、snoRNA、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)和非编码RNA。RNA优选为人RNA。
术语“构建体”是指沉积在由一种或多种合成或天然存在的生物相容性材料组成的支架或基质的表面上或其内的一种或多种细胞群体。可用由一种或多种合成或天然存在的生物相容性生物材料、聚合物、蛋白质或肽组成的生物材料包被一种或多种细胞群体，或可将所述细胞群体沉积在所述生物材料上，包埋在其中，粘着于其上，接种于其中，或捕获于其中。可在体外或体内将一种或多种细胞群体与生物材料或支架或基质组合。一般地，选择用于形成支架/生物材料的一种或多种生物相容性材料来指导、促进或允许沉积在其上的细胞群体的至少一种形成多细胞三维组织。用于生成构建体的一种或多种生物材料也可被选择用以指导、促进或允许构建体或构建体的细胞组分至内源宿主组织的分散和/或整合，或指导、促进或允许构建体或构建体的细胞组分存活、移植、耐受或功能性操作。
术语“标志物”或“生物标志物”通常指DNA、RNA、蛋白质、糖类或基于糖脂的分子标志物，其在培养的细胞群体中的表达或存在可通过标准方法(或本文中公开的方法)来检测，并且与一种或多种在培养的细胞群体中作为特定类型的细胞的细胞一致。标志物可以为由细胞表达的多肽或染色体上可辨认的物理位置例如基因、限制性核酸内切酶识别位点或由自体细胞表达的编码多肽的核酸(例如，mRNA)。标志物可以为称为“基因表达标志物”的基因的表达区域，或不具有已知编码功能的DNA的一些区段。生物标志物可为细胞来源的，例如分泌产物。
可互换使用的术语“差异表达的基因”、“差异基因表达”及它们的同义词是指其表达在第一细胞或细胞群体中相对于其在第二细胞或细胞群体中的表达被激活至更高或更低的水平的基因。术语还包括其表达在第一或第二细胞培养传代过程中在随时间过去在不同阶段被激活至更高或更低水平的基因。还应理解，可在核酸水平或蛋白质水平上激活或抑制差异表达的基因，或可将所述基因经历选择性剪接以导致不同的多肽产物。此类差异可通过例如多肽的mRNA水平、表面表达、分泌或其它分布的改变来证实。差异基因表达可包括两个或更多个基因或它们的基因产物之间的表达的比较，或两个或更多个基因或它们的基因产物之间的表达的比率的比较，或甚至相同基因的两种差异加工的产物的比较，这在第一与第二细胞之间是不同的。差异表达包括例如第一细胞与第二细胞之间的基因或其表达产物的时间或细胞表达模式的定量及定性差异。为了本发明的目的，当给定的基因在第一细胞与第二细胞中的表达之间存在差异时，认为存在“差异基因表达”。在来自细胞群体、混合物或构建体的施用之前的患者的细胞(第一细胞)中相对于来自施用之后的患者的细胞(第二细胞)中的表达可存在标志物的差异表达。
术语“抑制”、“下调”、“表达不足”和“减少”可互换使用并且意指编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的基因的表达或其RNA分子或等同RNA分子的水平或一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的活性相对于一个或多个对照，例如，一个或多个阳性和/或阴性对照降低。在来自施用细胞群体、混合物或构建体之前的患者的细胞中相对于来自施用后的患者的细胞可存在表达不足。
术语“上调”或“过表达”用于指编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的基因的表达或其RNA分子或等同RNA分子的水平，或一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的活性相对于一个或多个对照例如一个或多个阳性和/或阴性对照升高。在来自施用细胞群体、混合物或构建体后的患者的细胞中相对于来自施用前的患者的细胞存在过表达。
术语“受试者”应当指任何单个人受试者，包括合适于进行治疗的患者，其正在经历或已经历器官相关疾病例如肾病、贫血或EPO缺乏的一个或多个体征、症状或其它指标(indicator)。此类受试者包括但不限于新近诊断的或先前诊断的以及现在正在经历肾病、贫血或EPO缺乏的再现或复发或处于发生所述疾病的风险中的受试者，不论病因如何。受试者先前可以已进行了肾病、贫血或EPO缺乏的治疗，或未进行这样的治疗。
术语“患者”是指任何期望对其进行治疗的任何单个动物，更优选哺乳动物(包括这样的非人动物例如狗、猫、马、兔、动物园动物、牛、猪、绵羊和非人灵长类动物)。最优选地，本文中的患者为人。
术语“样品”或“患者样品”或“生物样品”通常意指获自受试者或患者、体液、身体组织、细胞系、组织培养物或其它来源的任何生物样品。术语包括活检组织例如肾活检组织。术语包括培养的细胞，例如培养的哺乳动物肾细胞。用于从哺乳动物获得活检组织和培养的细胞的方法在本领域是公知的。如果单独使用术语“样品”，其仍然表示“样品”为“生物样品”或“患者样品”，即，术语可互换使用。
术语“测试样品”是指来自已通过本发明的方法治疗的受试者的样品。测试样品可源于哺乳动物受试者的各种来源，包括但不限于血液、精液、血清、尿、骨髓、粘液、组织等。
术语“对照”或“对照样品”是指其中预期阴性或阳性结果帮助与测试样品的结果关联的阴性或阳性对照。适用于本发明的对照包括但不限于已知显示特征在于正常红细胞系统动态平衡的指标的样品、已知显示特征在于贫血的样品、获自已知不为贫血的受试者的样品以及获自已知为贫血的受试者的样品。适用于本发明的方法的其它对照包括但不限于来源于已利用已知调节红细胞生成的药物试剂(例如，重组EPO或EPO类似物)治疗的受试者的样品。此外，对照可以为获自利用本发明的方法治疗之前的受试者的样品。其它适当的对照可以为获自已知患有任何类型或分期的肾病的受试者的测试样品和已知未患有任何类型或分期的肾病的受试者的样品。对照可以为正常健康匹配的对照。本领域技术人员将理解适用于本发明的其它对照。
“再生预后”、“再生性预后”或“再生的预后”通常是指本文中描述的细胞群体、混合物或构建体的施用或植入的可能再生过程或结果的预测或预计。对于再生预后，预测或预计可通过下列方面的一个或多个方面告知：植入或施用后有功能的肾的增强、植入或施用后有功能的器官(例如，肾)的发育、植入或施用后增强的肾功能或能力的发展以及在植入或施用后由自体肾进行的某些标志物的表达。
“再生器官”是指在植入或施用本文中描述的细胞群体、混合物或构建体后的自体器官。再生器官的特征在于各种指标，包括但不限于包括但不限于自体器官的功能或能力的发展、自体器官的功能或能力的增强以及某些标志物在自体器官中的表达。本领域技术人员将理解，其它指标可适用于表征再生的器官。
“再生的肾”是指在植入或施用本文中描述的细胞群体、混合物或构建体后的自体肾。再生的肾的特征在于各种指标，包括但不限于自体肾的功能或能力的发展、自体肾的功能或能力的增强以及某些标志物在自体肾中的表达。本领域技术人员将理解，其它指标可适用于表征再生的肾。
术语“细胞聚集体”或“球状体”是指经培养以允许3D生长(与作为单层的生长相反)的细胞的聚集或组合。应指出，术语“球状体”不是指聚集是几何球体。聚集体可被高度组织，具有良好确定的形态学，或其可以是无结构的团块；其可包括单细胞类型或超过一个细胞的类型。细胞可以是原代分离物，或永久细胞系，或两者的组合。该定义中包括类器官和具有器官特征的培养物。
术语“环境温度”是指将本发明的制剂给受试者施用时的温度。一般而言，环境温度是温度受控制的环境的温度。环境温度的范围为约18℃至约30℃。在一个实施方案中，环境温度为约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃。
2.细胞群体
本发明的制剂可包含用于治疗肾病即提供肾功能的稳定化和/或增强和/或再生的肾细胞及其混合物的分离的异源群体(对于该群体已富集了特定的生物活性组分或细胞类型和/或消耗了特定的无活性或不期望的组分或细胞类型)，所述制剂先前描述于Presnell等人U.S.2011-0117162和Ilagan等人PCT/US2011/036347(将所述专利申请通过引用整体并入本文)中。制剂可包含与健康个体相比较缺少细胞组分但仍然保持治疗性质即提供肾功能的稳定化和/或增强和/或再生的分离的肾细胞级分。本文中描述的细胞群体、细胞级分和/或细胞的混合物可来源于本文中描述的健康个体、患有肾病的个体或受试者。
本发明提供了本文中描述的制剂，其适合与和各种生物活性细胞群体(包括但不限于分离的细胞群体、细胞级分、混合物、富集的细胞群体、细胞聚集体及其任意组合)一起使用。在一个实施方案中，生物活性细胞群体是生物活性肾细胞。
生物活性细胞群体
本发明涉及治疗剂，其适合于待给有此需要的受试者的靶器官或组织施用的生物活性细胞群体。生物活性细胞群体通常指在给受试者施用后潜在地具有治疗性质的细胞群体。例如，在给有此需要的受试者施用后，生物活性肾细胞群体可在受试者中提供肾功能的稳定化和/或改善和/或再生。治疗性质可包括再生作用。
生物活性细胞群体包括但不限于干细胞(例如，多潜能性、多能性、寡能性(oligopotent)或单能性)例如胚胎干细胞、羊膜干细胞(amniotic stem cell)、成体干细胞(例如，造血、乳房、肠、间充质、胎盘、肺、骨髓、血液、脐带、内皮、牙髓、脂肪、神经、嗅觉、神经嵴、睾丸)、诱导的多潜能干细胞；遗传修饰细胞；以及来源于身体的任何来源的细胞群体或组织外植体。还可将本发明的制剂与肾脂肪来源的细胞群体(如2011年6月9日提交的Basu等人PCT/US11/39859中描述的)一起使用；和与脂肪来源的或外周血来源的平滑肌细胞(如Ludlow等人U.S.2010-0131075和2011年5月3日提交的Ludlow等人PCT/US11/35058中描述的)一起使用；或膀胱来源的泌尿道上皮或平滑肌细胞(如Atala U.S.6,576,019中描述的)一起使用，将每一件所述专利或专利申请通过引用整体并入本文。生物活性细胞在性质上可以是分离的、富集的、纯化的、均质的或异质的。本领域技术人员将理解适用于本发明的制剂的其它生物活性细胞群体。
在一个实施方案中，细胞的来源与期望的靶器官或组织相同。例如，肾细胞可来源于待用于待给肾施用的制剂的肾。在另一个实施方案中，细胞的来源与期望的靶器官或组织不同。例如，表达红细胞生成素的细胞可来源于待用于待给肾施用的制剂的肾脂肪。
在一个方面，本发明提供了包含富集了其生物活性组分和消耗了无活性或不期望的组分的肾细胞的异源群体的某些亚级分的制剂，提供了比起始群体更优的治疗和再生结果。例如，本文中描述的生物活性肾细胞，例如消耗了无活性或不期望的组分(例如B1和B5)的B2、B4和B3，单独地或混合地可以是待用于肾功能的稳定化和/或增强和/或再生的制剂的部分。
在另一个方面，制剂包含消耗了或缺乏一种或多种细胞类型例如血管细胞、内分泌细胞或内皮细胞的特定亚级分B4，即B4’，其单独地或当与其它生物活性亚级分例如B2和/或B3混合时保持治疗性质，例如肾功能的稳定化和/或增强和/或再生。在优选实施方案中，生物活性细胞群体为B2。在某些实施方案中，将B2细胞群体与B4或B4’混合。在其它实施方案中，将B2细胞群体与B3混合。在其它实施方案中，将B2细胞群体与B3和B4或B3和/或B4的特定细胞组分混合。
B2细胞群体的特征在于肾小管细胞标志物的表达，所述标志物选自如下标志物的一个或多个：兆蛋白、立方蛋白、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、N-钙粘蛋白(Ncad)、E-钙粘蛋白(Ecad)、水通道蛋白(Aquaporin)-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、成员RAS癌基因家族(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD结构域的离子转运调节剂4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换器)、成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族、成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员、成员A3(Aldh1a3)和钙蛋白酶-8(Capn8)以及集合管标志物水通道蛋白-4(Aqp4)。B2为比B3和/或B4更大和更加颗粒化，从而具有约1.045g/ml至约1.063g/ml(啮齿类动物)、约1.045g/ml至1.052g/ml(人)和约1.045g/ml至约1.058g/ml(犬)的浮力密度。
B3细胞群体的特征在于血管、肾小球和近端管标志物在一些EPO生成细胞中表达，与B2和B4相比较具有中等尺寸和粒度，从而具有约1.063g/ml至约1.073g/ml(啮齿类动物)、约1.052g/ml至约1.063g/ml(人)以及约1.058g/ml至约1.063g/ml(犬)的浮力密度。B3的特征在于标志物的表达，所述标志物选自如下标志物的一个或多个：水通道蛋白7(Aqp7)、含FXYD结构域的离子转运调节剂2(Fxyd2)、溶质载体家族17(磷酸钠)、成员3(Slc17a3)、溶质载体家族3、成员1(Slc3a1)、claudin2(Cldn2)、napsin A天冬氨酸肽酶(Napsa)、溶质载体家族2(促进葡萄糖转运蛋白)、成员2(Slc2a2)、丙氨酰(膜)氨基肽酶(Anpep)、跨膜蛋白27(Tmem27)、酰基-CoA合酶中间链家族成员2(Acsm2)、谷胱甘肽过氧化酶3(Gpx3)、果糖-1,6-二磷酸酶1(Fbp1)和丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶2(Agxt2)。B3的特征也在于血管表达标志物血小板内皮细胞粘附分子(Pecam)和肾小球表达标志物podocin(Podn)。
B4细胞群体的特征在于含有如下标志的一个或多个的血管标志物组的表达：PECAM、VEGF、KDR、HIF1a、CD31、CD146；含有如下标志的一个或多个的肾小球标志物组的表达：Podocin(Podn)和去氧肾上腺素(Nephrin)(Neph)；和与未分级的(UNFX)B2和B3相比较富集了氧可调节的EPO富集的群体。B4的特征还在于如下标志的一个或多个的表达：趋化因子(C-X-C基序)受体4(Cxcr4)、内皮素受体B型(Ednrb)、V型胶原、α2(Col5a2)、钙粘蛋白5(Cdh5)、纤溶酶原激活物、组织(Plat)、血管生成素2(Angpt2)、激酶插入物结构域蛋白受体(Kdr)、分泌型蛋白质、富含酸性半胱氨酸的骨结合素(osteonectin)(Sparc)、丝甘蛋白聚糖(Srgn)、TIMP金属肽酶抑制剂3(Timp3)、维尔姆斯瘤1(Wt1)、无翅类型MMTV整合位点家族、成员4(Wnt4)、G蛋白信转导的调节剂4(Rgs4)、血小板内皮细胞粘附分子(Pecam)和红细胞生成素(Epo)。B4的特征还在于与B2或B3相比较更小、颗粒化程度更低的细胞，具有约1.073g/ml至约1.091g/ml(啮齿类动物)、约1.063g/ml至约1.091g/mL(人和犬)的浮力密度。
B4’细胞群体被定义为具有1.063g/mL至1.091g/mL的浮力密度，和表达如下标志物的一个或多个：PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、podocin、去氧肾上腺素、EPO、CK7、CK8/18/19。在一个实施方案中，B4’细胞群体的特征在于包含如下标志的一个或多个的血管标志物组的表达：PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、CD31、CD146。在另一个实施方案中，B4’细胞群体的特征在于内分泌标志物EPO的表达。在一个实施方案中，B4’细胞群体的特征在于包含如下标志的一个或多个的肾小球标志物组的表达：Podocin(Podn)和去氧肾上腺素(Neph)。在某些实施方案中，B4’细胞群体的特征在于包含如下标志的一个或多个的血管标志物组的表达：PECAM、vEGF、KDR、HIF1a以及在于内分泌标志物EPO的表达。在另一个实施方案中，B4’的特征还在于与B2或B3相比较更小、颗粒化程度更低的细胞，具有约1.073g/ml至约1.091g/ml(啮齿类动物)、约1.063g/ml至约1.091g/mL(人和犬)的浮力密度。
在一个方面，本发明提供了包含具有1.063g/mL至1.091g/mL的密度的人肾细胞的分离的富集的B4’群体的制剂，所述B4’群体包含红细胞生成素(EPO)生成细胞、血管细胞和肾小球细胞的至少一种。在一个实施方案中，B4’细胞群体的特征在于血管标志物的表达。在某些实施方案中，B4’细胞群体的特征不在于肾小球标志物的表达。在一些实施方案中，B4’细胞群体能够氧调节红细胞生成素(EPO)表达。
在一个实施方案中，制剂包含B4’细胞群体但不包括具有1.045g/mL至1.052g/mL的密度的包含肾小管细胞的B2细胞群体。在另一个实施方案中，B4’细胞群体制剂不包括具有＜1.045g/ml的密度的包含集合管和肾小管系统的大颗粒细胞的B1细胞群体。在另一个实施方案中，B4’细胞群体制剂不包括具有＞1.091g/ml的密度的包含具有低粒度和活力的碎片和小细胞的B5细胞群体。
在一个实施方案中，含有B4’细胞群体的制剂不包括具有1.045g/mL至1.052g/mL的密度的包含肾小管细胞的B2细胞群体；具有＜1.045g/ml的密度的包含集合管和肾小管系统的大颗粒细胞的B1细胞群体；和具有＞1.091g/ml的密度的包含具有低粒度和活力的碎片及小细胞的B5细胞群体。在一些实施方案中，B4’细胞群体可来源于患有肾病的受试者。
在一个方面，本发明提供了包含含有具有1.045g/mL至1.052g/mL的密度的第一细胞群体B2(其包含分离的富集的肾小管细胞群体)和具有约1.063g/mL至1.091g/mL的密度的第二细胞群体B4’(其包含红细胞生成素(EPO)生成细胞和血管细胞但消耗了肾小球细胞)的人肾细胞的混合物的制剂，其中混合物不包括具有＜1.045g/ml的密度的包含集合管和肾小管系统的大颗粒细胞的B1细胞群体，或具有＞1.091g/ml的密度的包含具有低粒度和活力的碎片及小细胞的B5细胞群体。在某些实施方案中，B4’细胞群体的特征在于血管标志物的表达。在一个实施方案中，B4’细胞群体的特征不在于肾小球标志物的表达。在某些实施方案中，B2还包括集合管上皮细胞。在一个实施方案中，制剂包含能够进行受体介导的白蛋白吸收的细胞的混合物。在另一个实施方案中，细胞的混合物能够进行氧调节的红细胞生成素(EPO)表达。在一个实施方案中，混合物包含能够在体外和体内生成和/或刺激透明质酸(HA)的高分子量种类的生成的表达HAS-2的细胞。在所有实施方案中，第一和第二细胞群体可来源于肾组织或培养的肾细胞(Basu等人Lipids in Health and Disease,2011,10:171)。
在一个实施方案中，制剂包含能够在体内递送后提供再生刺激物的混合物。在其它实施方案中，混合物能够在体内递送后减少肾小管滤过、肾小管吸收、尿生成和/或内分泌功能的衰退，稳定或增强所述功能。在一个实施方案中，B4’细胞群体来源于具有肾病的受试者。
在一个方面，本发明提供了包含具有1.063g/mL至1.091g/mL的密度的人肾细胞的分离的富集的B4’群体的制剂，所述B4’群体包含红细胞生成素(EPO)生成细胞、血管细胞和肾小球细胞的至少一种。在一个实施方案中，B4’细胞群体的特征在于血管标志物的表达。在某些实施方案中，B4’细胞群体的特征不在于肾小球标志物的表达。不表达的肾小球标志物可以为podocin(参见实施例10)。在一些实施方案中，B4’细胞群体能够进行氧可调节的红细胞生成素(EPO)表达。
在一个实施方案中，含有B4’细胞群体的制剂不包括具有1.045g/mL至1.052g/mL的密度的包含肾小管细胞的B2细胞群体。在另一个实施方案中B4’细胞群体制剂不包括具有＜1.045g/ml的密度的包含集合管和肾小管系统的大颗粒细胞的B1细胞群体。在另一个实施方案中，B4’细胞群体制剂不包括具有＞1.091g/ml的密度的包含具有低粒度和活力的碎片和小细胞的B5细胞群体。
在一个实施方案中，含有B4’细胞群体的制剂不包括具有1.045g/mL至1.052g/mL的密度的包含肾小管细胞的B2细胞群体；具有＜1.045g/ml的密度的包含集合管和肾小管系统的大颗粒细胞的B1细胞群体；以及具有＞1.091g/ml的密度的包含具有低粒度和活力的碎片和小细胞的B5细胞群体。在一些实施方案中，B4’细胞群体可来源于患有肾病的受试者。
在一个方面，本发明提供了包含含有具有1.045g/mL至1.052g/mL的密度的第一细胞群体B2(其包含分离的富集的肾小管细胞群体)和具有1.063g/mL至1.091g/mL的密度的第二细胞群体B4’(其包含红细胞生成素(EPO)生成细胞和血管细胞但消耗肾小球细胞)的人肾细胞的混合物的制剂，其中混合物不包括具有＜1.045g/ml的密度的包含集合管和肾小管系统的大颗粒细胞的B1细胞群体，或具有＞1.091g/ml的密度的包含具有低粒度和活力的碎片和小细胞的B5细胞群体。在某些实施方案中，B4’细胞群体的特征在于血管标志物的表达。在一个实施方案中，B4’细胞群体的特征不在于肾小球标志物的表达。在某些实施方案中，B2还包括集合管上皮细胞。在一个实施方案中，细胞的混合物能够进行受体介导的白蛋白吸收。在另一个实施方案中，细胞的混合物能够进行氧可调节的红细胞生成素(EPO)的表达。在一个实施方案中，混合物包含能够在体外和体内生成和/或刺激透明质酸(HA)的高分子量种类的表达HAS-2的细胞。在所有实施方案中，第一和第二细胞群体可来源于肾组织或培养的肾细胞。
在另一个方面，本发明提供了包含异种肾细胞群体的制剂，所述肾细胞群体包含细胞级分或富集的细胞群体(例如，Bl、B2、B3、B4(或B4’)和B5)的组合。在一个实施方案中，组合具有约1.045g/ml至约1.091g/ml的浮力密度。在一个其它实施方案中，组合具有低于约1.045g/ml至约1.099g/ml或约1.100g/ml的浮力密度。在另一个实施方案中，组合具有如通过在密度梯度上分离(例如通过离心)测定的乳力密度。在另一个实施方案中，细胞级分的组合包括消耗了B1和/或B5的B2、B3和B4(或B4’)。在一些实施方案中，细胞级分的组合包含B2、B3、B4(或B4’)以及B5但消耗了B1。一旦消耗了B1和/或B5，随后就可将组合进行体外培养，随后制备包含B2、B3和B4(或B4’)细胞级分的组合的制剂。
本发明的发明人已令人惊讶地发现消耗了B1的B2、B3、B4和B5的组合的体外培养导致B5的消耗。在一个实施方案中，在至少1、2、3、4或5次传代后，B5被消耗。在一个其它实施方案中，在本文中描述的条件下传代的B2、B3、B4和B5细胞级分组合提供了以低于约5%、低于约4%、低于约3%、低于约2%、低于约1%或低于约0.5%的传代的细胞群体的百分比具有B5的传代的细胞群体。
在另一个实施方案中，B4’为细胞级分的组合的部分。在一个其它实施方案中，B5的体外培养消耗处于低氧条件下。
在一个实施方案中，制剂包含能够在体内递送后提供再生刺激物的混合物。在其它实施方案中，混合物能够在体内递送后减小肾小球滤过、肾小管吸收、尿生成和/或内分泌功能的衰退、稳定或增强所述功能。在一个实施方案中，B4’细胞群体来源于患有肾病的受试者。
在优选实施方案中，制剂包含包含含有与B3和/或B4组合的B2的混合物。在另一个优选实施方案中，混合物包含与B3和/或B4’组合的B2。在其它优选实施方案中，混合物由(i)与B3和/或B4组合的B2；或(ii)与B3和/或B4’组合的B2组成或基本上由所述组分组成。
包含B4’细胞群体的混合物可包含也从非健康受试者获得的B2和/或B3细胞群体。非健康受试者可以为从其获得B4’级分的相同受试者。与B4’细胞群体相反，从非健康受试者获得的B2和B3细胞群体与来源于健康个体的起始肾细胞群体相比较通常不缺乏一个或多个特定的细胞类型。
如Presnell等人WO/2010/056328中所描述的，已发现B2和B4细胞制剂能够通过透明质酸合酶-2(HAS-2)–在B2细胞群体中更特别地富含的标志物的作用在体外和体内表达更高分子量的透明质酸(HA)的种类。经显示在5/6Nx模型中利用B2的处理减少纤维化，伴随HAS-2的体内强表达以及处理的组织内预期的高分子量HA的生成。值得注意地，留下未处理的5/6Nx模型导致纤维化，有限的HAS-2被检测到并且几乎无高分子量的HA生成。不希望受理论束缚，假设主要由B2(以及一定程度上由B4)生成的HA的该抗炎高分子量种类与细胞制剂在肾脏纤维化的减少和在肾再生的帮助中协同作用。因此，本发明包括包含本文中描述的生物活性肾细胞和包含透明质酸的生物材料的制剂。本发明还涉及通过直接生成或通过植入的细胞刺激生成来提供再生刺激物的生物材料组分。
在一个方面，本发明提供了包含用于治疗有此需要的受试者的肾病、贫血和/或EPO缺乏的EPO生成肾细胞的分离的异源群体的制剂。在一个实施方案中，细胞群体来源于肾活检组织。在另一个实施方案中，细胞群体来源于完整肾组织。在一个其它实施方案中，细胞群体来源于从肾活检组织或完整肾组织建立的哺乳动物肾细胞的体外培养物。在所有实施方案中，这些群体是未分级分离的细胞群体，在本文中也称为非富集的细胞群体。
在另一个方面，本发明提供了包含分离的红细胞生成素(EPO)生成肾细胞群体的制剂，所述细胞群体被进一步富集以便富集的群体中EPO生成细胞的比例大于原始或初始细胞群体中EPO生成细胞的比例。在一个实施方案中，富集的EPO生成细胞级分包含相对于未富集的初始群体中包含的间质成纤维细胞和肾小管细胞更大比例的间质成纤维细胞和更小比例的肾小管细胞。在某些实施方案中，富集的EPO生成细胞级分包含相对于未富集的初始群体中包含的肾小球细胞、血管细胞和集合管细胞更大比例的肾小球细胞和血管细胞以及更小比例的集合管细胞。在这样的实施方案中，这些群体在本文中被称为“B4”细胞群体。
在另一个方面，本发明提供了包含与一种或多种另外的肾细胞群体混合的EPO生成肾细胞群体的制剂。在一个实施方案中，EPO生成细胞群体为富集了EPO生成细胞的第一细胞群体例如B4。在另一个实施方案中，EPO生成细胞群体为未富集EPO生成细胞的第一细胞群体例如B2。在另一个实施方案中，将第一细胞群体与第二肾细胞群体混合。在一些实施方案中，第二细胞群体富集肾小管细胞，这可通过肾小管细胞的表型的存在来证明。在另一个实施方案中，肾小管细胞的表型可通过一个肾小管细胞标志物的存在来显示。在另一个实施方案中，肾小管细胞的表型可通过一个或多个肾小管细胞标志物的存在来显示。肾小管细胞标志物包括但不限于兆蛋白、立方蛋白、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、N-钙粘蛋白(Ncad)、E-钙粘蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、成员RAS癌基因家族(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD结构域的离子转运调节剂4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换器)、成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族、成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族，成员A3(Aldh1a3)和钙蛋白酶-8(Capn8)。在另一个实施方案中，将第一细胞群体与几种类型的肾细胞(包括但不限于间质来源的(interstitium-derived)细胞、肾小管细胞、集合管来源的细胞、肾小球来源的细胞和/或来源于血液或脉管系统的细胞)的至少一种混合。
本发明的制剂可包括EPO生成肾细胞群体，所述细胞群体包含以与B2和/或B3的混合物的形式存在，或以富集的细胞群体的形式存在的B4或B4’，例如B2+B3+B4/B4’。
在一个方面，制剂包含EPO生成肾细胞群体，所述细胞群体的特征在于EPO表达和对氧的生物响应，以便培养系统的氧张力的减小导致EPO表达的诱导。在一个实施方案中，EPO生成细胞群体富集EPO生成细胞。在一个实施方案中，当在其中使细胞在培养系统中经历有效氧水平的降低(与在有效氧的正常大气(～21%)水平下培养的细胞相比较)的条件下培养细胞群体时，EPO表达被诱导。在一个实施方案中，在更低的氧条件下培养的EPO生成细胞相对于在正常氧条件下培养的EPO生成细胞表达更高水平的EPO。一般地，在降低的有效氧的水平(也称为缺氧培养条件)下培养细胞意指相对于在有效氧的正常大气水平(也称为正常或含氧量正常的培养条件)下培养细胞降低减少的氧的水平。在一个实施方案中，缺氧细胞培养条件包括在约低于1%的氧、约低于2%的氧、约低于3%的氧、约低于4%的氧或约低于5%的氧下培养细胞。在另一个实施方案中，正常或含氧量正常的培养条件包括在约10%的氧、约12%的氧、约13%的氧、约14%的氧、约15%的氧、约16%的氧、约17%的氧、约18%的氧、约19%的氧、约20%的氧或约21%的氧下培养细胞。
在一个其它实施方案中，获得EPO的诱导或增加的表达并且可通过在约低于5%的有效氧下培养细胞和将EPO表达水平与在大气(约21%)氧下培养的细胞相比较来观察EPO的诱导或增加的表达。在另一个实施方案中，通过方法在能够表达EPO的细胞的培养物中获得EPO的诱导，所述方法包括其中在大气氧(约21%)下培养细胞一段时间的第一培养期和其中降低有效氧水平并且在约低于5%的有效氧下培养相同细胞的第二培养期。在另一个实施方案中，通过HIF1α调节响应缺氧条件的EPO表达。本领域技术人员将理解可将本领域已知的其它氧操作培养条件用于本文中描述的细胞。
在一个方面，制剂包含富集的EPO生成哺乳动物细胞群体，所述细胞群体的特征在于对灌注条件的生物响应(例如，EPO表达)。在一个实施方案中，灌注条件包括短暂的、间歇性或连续流体流动(灌注)。在一个实施方案中，当以通过流动将动力转移至细胞的方式间歇或连续地循环或搅动其中培养细胞的培养基时，EPO表达被机械地诱导。在一个实施方案中，以它们作为三维结构存在于给此类三维结构的形成提供构架和/或空间的材料中或其上的方式培养经历短暂、间歇性或连续性流体流动的细胞。在一个实施方案中，将细胞培养在多孔珠粒上并且利用摇摆平台、沿轨道运行的平台或旋转烧瓶将其经历间歇或连续流体流动。在另一个实施方案中，将细胞培养在三维支架上并且置于籍以固定支架的装置中，流体定向流过或穿过支架。本领域技术人员将理解，可将本领域已知的其它灌注培养条件用于本文中描述的细胞。
细胞聚集体
在一个其它方面，本发明的制剂包含细胞聚集体或球状体。在一个实施方案中，细胞聚集体包含本文中描述的生物活性细胞。在另一个实施方案中，细胞聚集体包含生物活性肾细胞例如肾细胞混合物、富集的肾细胞群体以及肾细胞级分的组合。
在某些实施方案中，可以以在本文中进一步描述的3D形式培养本发明的生物活性肾细胞。在一些实施方案中，术语“类器官”是指具有与自体肾一致的表型和/或功能的细胞的积累。在一些实施方案中，类器官包含多种谱系的通常在体内见于给定的组织的细胞的混合群体。在一些实施方案中，通过本发明的细胞籍以形成聚集体的任何方法体外形成本发明的类器官，所述聚集体可依次形成球状体、类器官或其组合。在一些实施方案中，此类聚集体、球状体或类器官假定结构与特定器官一致。在一些实施方案中，此类聚集体、球状体或类器官表达通常由特定器官的细胞表达的表面标志物。在一些实施方案中，此类细胞聚集体、球状体或类器官产生通常由特定器官的细胞表达的化合物或材料。在某些实施方案中，可将本发明的细胞培养在天然基质例如明胶上。在其它实施方案中，可将本发明的细胞培养在合成基质例如PGLA上。在实施例20中提供了用于提供细胞聚集体的示例性方法。
无活性的细胞群体
如本文中所述，本发明部分基于令人惊讶的发现：富集了生物活性组分并且消耗了无活性或不期望的组分的肾细胞的异源群体的某些级分提供了优于起始群体的治疗和再生结果。在优选实施方案中，本发明提供的制剂包含消耗了本发明的细胞群体的B1和/或B5细胞群体的细胞群体。例如，可消耗下列细胞群体的B1和/或B5：B2、B3和B4(或B4’)的两种或更多种的混合物；B2、B3和B4(或B4’)的富集的细胞群体。
B1细胞群体包含集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，所述细胞群体具有小于约1.045g/m的浮力密度。B5细胞群体由具有低粒度和活力的碎片和小细胞组成并且具有大于约1.091g/ml的浮力密度。
分离和培养细胞群体的方法
在一个方面，本发明的制剂包含已从肾组织分离和/或从肾组织培养的细胞群体。本文中提供了用于分开和分离肾细胞组分例如富集的细胞群体的方法，所述细胞群体将被用于制剂中以用于治疗用途(包括肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷(tubulartransport deficiency)和肾小球滤过缺陷(glomerular filtration deficiency)的治疗)的方法。在一个实施方案中，从新消化的，即机械或酶促消化的肾组织或从哺乳动物肾细胞的异源体外培养物分离细胞群体。
制剂可包含肾细胞的异源混合物，所述混合物在于密度梯度上分开之前已被培养于缺氧培养条件中，所述缺氧培养在B4(包括B4’)以及B2和/或B3级分中提供了细胞的增加的分布和组成。对于从患病和非患病的肾分离的肾细胞观察到依赖于氧的细胞在B4和B2中的富集。不希望受理论束缚，这可归因于下列现象的一个或多个现象：1)在缺氧培养期过程中特定细胞组分的选择性存活、死亡或增殖；2)响应缺氧培养的细胞的粒度和/或尺寸的改变，从而影响浮力密度的改变和随后在密度梯度分离过程中的定位；和3)响应缺氧培养期的细胞基因/蛋白质表达的改变，从而导致任何给定的梯度级分内的细胞的差异特征。从而，在一个实施方案中，制剂包含富集了小管细胞的细胞群体例如B2，其是抗低氧的。
用于分开和分离本发明的细胞群体的示例性技术包括基于目标群体内包含的不同细胞类型的差异比重在密度梯度进行的分离。任何给定的细胞类型的比重可受细胞内粒度的程度、细胞内水的体积及其它因素影响。在一个方面，本发明提供了用于分离跨多个物种包括但不限人、犬和啮齿类动物的本发明的细胞制剂例如B2和B4(包括B4’)的最佳梯度条件。在优选实施方案中，将密度梯度用于获得来源于肾细胞的异源群体的新型富集的肾小管细胞级分的群体即B2细胞群体。在一个实施方案中，将密度梯度用于获得来源于肾细胞的异源群体的新型富集的EPO生成细胞级分的群体即B4细胞群体。在其它实施方案中，将密度梯度用于获得富集的肾的肾小管细胞、肾小球细胞和内皮细胞的亚群。在一个实施方案中，将EPO生成细胞和肾小管细胞与红细胞和细胞碎片分开。在一个实施方案中，将EPO生成肾小球和血管细胞与其它细胞类型和与红细胞及细胞碎分开，同时伴随地将肾小管细胞和集合管细胞的亚群与其它细胞类型和与红细胞及细胞碎片分开。在一个其它实施方案中，将内分泌细胞、肾小球细胞和/或血管细胞与其它细胞类型和与红细胞及细胞碎片分开，同时伴随地将肾小管细胞和集合管细胞的亚群与其它细胞类型和与红细胞及细胞碎片分开。
在一个方面，本发明的制剂包含基于下文中描述的某些关键特征，通过部分使用包含60%的水中的非离子碘化化合物碘克沙醇的(Axis-Shield)密度梯度培养基产生的细胞群体。然而，本领域技术人员将承认，可根据本发明使用任何密度梯度或其它方法，例如使用本领域已知的细胞表面标志(包括用于分离本发明的细胞群体的必需特征)的免疫分离(immunological separation)。本领域技术人员还应当承认，通过密度梯度(尺寸和粒度)促成细胞亚群的分离的相同细胞特征可被开发利用来通过流式细胞术(前向散射=通过流式细胞仪的尺寸的反映，和侧向散射=粒度的反映)分离细胞亚群。重要地，密度梯度培养基应当对特定的目标细胞具有低毒性。虽然密度梯度培养基应当对特定的目标细胞具有低毒性，但本发明涉及在目标细胞的选择过程中起作用的梯度培养基的用途。不期望受理论束缚，利用包括碘克沙醇的梯度回收的本发明的细胞群体似乎是抗碘克沙醇的，因为在装载与回收步骤之间存在细胞的相当损失，这表明在梯度条件下对碘克沙醇的暴露导致某些细胞的消除。在碘克沙醇梯度后在特定条带上出现的细胞抗碘克沙醇和/或密度梯度暴露的任何不利作用。因此，还涉及为轻度至中度肾毒素(nephrotoxin)的其它造影剂(contrast media)在用于本文中描述的制剂的细胞群体的分离和/或选择中的作用。此外，密度梯度培养基还不应当结合人血浆中的蛋白质或不利地影响目标细胞的关键功能。
在另一个方面，本发明提供了包含已使用荧光激活细胞分选术(FACS)富集和/或消耗了肾细胞类型的细胞群体的制剂。在一个实施方案中，可使用BD FACSAriaTM或等同技术富集和/或消耗肾细胞类型。
在另一个方面，制剂包含已使用磁性细胞分选术富集和/或消耗了肾细胞类型的细胞群体。在一个实施方案中，可使用Miltenyi系统或等同技术富集和/或消耗肾细胞类型。
在另一个方面，制剂可包括已经历三维培养的肾细胞群体。在一个方面，培养细胞群体的方法是通过连续灌注。在一个实施方案中，通过三维培养和连续灌注培养的细胞群体当与静态培养的细胞群体相比较时显示更强的细胞结构(cellularity)和相互连接性(interconnectivity)。在另一个实施方案中，通过三维培养和连续灌注培养的细胞群体当与这样的细胞群体的静态培养物相比较时显示更多的EPO表达以及增多的肾小管相关基因例如e-钙粘蛋白的表达。在另一个实施方案中，通过连续灌注培养的细胞群体当与静态培养的细胞群体相比较时显示更高的葡萄糖和葡萄糖消耗。
如本文(包括实施例7)中所描述的，可将低氧或缺氧状况用于制备用于本发明的制剂的细胞群体的方法。然而，可使用制备细胞群体的方法而无需低氧条件化步骤。在一个实施方案中，可使用含氧量正常的条件。
在一个其它方面，本发明提供了用于制备细胞聚集体或球状体的方案(参见，例如，实施例20)。
本领域技术人员将理解可将本领域已知的其它分离和培养方法用于本文中描述的细胞。
3.生物材料
可将多种生物材料与活性剂组合以提供本发明的治疗制剂。生物材料可以以任何适当的形状(例如，珠粒)或形式(例如，液体、凝胶等)存在。如Bertram等人，美国公布的申请20070276507(通过引用整体并入本文)中所述，可将聚合物基质或支架塑造成许多期望的构型以满足许多完整系统、几何或空间限制。在一个实施方案中，本发明的基质或支架可以是三维的并且可被塑造来使适合器官或组织结构的尺寸和形状。例如，在使用聚合物支架治疗肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷中，可使用三维(3-D)基质。可使用多种差异塑形的3-D支架。自然地，可以以不同尺寸和形状塑造聚合物基质以使适合不同大小的患者。可以以其它方式塑造聚合物基质来适应患者的特殊需要。在另一个实施方案中，聚合物基质或支架可以是生物相容性的多聚聚合物支架。可从多种合成或天然存在的材料形成支架，所述材料包括但不限于开孔聚乳酸、纤维素醚、纤维素、纤维质酯(cellulosic ester)、氟化聚乙烯、酚、聚-4-甲基戊烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰胺酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚苯并恶唑、聚碳酸酯、聚芳醚腈、聚酯、聚酯碳酸酯、聚醚、聚醚醚酮、聚醚酰亚胺、聚醚酮、聚乙烯砜、聚乙烯、聚氟烯烃、聚酰亚胺、聚烯烃、聚噁二唑、聚苯撑氧(polyphenylene oxide)、聚苯硫醚(polyphenylene sulfide)了、聚丙烯、聚苯乙烯、聚硫化物、聚砜、聚四氟乙烯、聚硫醚、聚三唑、聚氨酯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯、再生纤维素、硅酮、尿素甲醛、胶原蛋白、明胶、藻酸盐、层粘连蛋白、纤连蛋白、蚕丝、弹性蛋白、藻酸盐、透明质酸、琼脂糖或其共聚物或物理混合物。支架构型可从液体悬浮物变化至软多孔支架至坚硬的保持形状的多孔支架。在一个实施方案中，构型是能够变成水凝胶的溶液的液体形式。
可从多种聚合物材料形成水凝胶，将所述水凝胶用于多种生物医学应用。可将水凝胶在物理上描述为亲水聚合物的三维网络。取决于水凝胶的类型，它们包含不同百分比的水，但完全不溶解于水。尽管它们含水量高，但水凝胶因亲水残基的存在能够另外结合大体积的液体。水凝胶可充分膨胀而不改变它们的凝胶状结构。根据使用的聚合物的性质和产品的其它专用设备，可特异性修改水凝胶的基本物理特征。
优选，水凝胶由聚合物、生物来源的材料、合成产生的材料或其组合构成，所述材料在生物学上是惰性的并且在生理上与哺乳动物组织相容。水凝胶材料优选不诱导炎症响应。可用于形成水凝胶的其它材料的实例包括(a)经修饰的藻酸盐，(b)通过暴露于单价阳离子可胶化的多糖(例如结冷胶和角叉菜胶)，(c)为非常粘的液体或具有触变性并且通过结构的缓慢演变随时间过去形成凝胶的多糖(例如，透明质酸)，(d)明胶或胶原，和(e)聚合物水凝胶前体(例如，聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物和蛋白质)。美国专利No.6,224,893B1提供了适用于制备根据本发明的水凝胶的各种聚合物以及此类聚合物的化学性质的详细描述。
支架或生物材料特征可使细胞能够附着支架或生物材料和与其相互作用，和/或提供可将细胞捕获入其中的多孔空间。在一个实施方案中，本发明的多孔支架或生物材料允许将细胞的一个或多个群体或混合物添加或沉积在构造为多孔支架的生物材料上(例如，通过细胞的附着)和/或支架的孔内(例如，通过细胞的捕获)。在另一个实施方案中，支架或生物材料允许或促进支架内细胞与细胞之间和/或细胞与生物材料之间的相互作用以形成本文中描述的构建体。
在一个实施方案中，根据本发明使用的生物材料由以水凝胶形式存在的透明质酸(HA)组成，其包含大小从5.1kDA至>2x106kDa范围的HA分子。在另一个实施方案中，根据本发明使用的生物材料由以多孔泡沫形式存在的透明质酸组成，其也包含大小从5.1kDA至>2x106kDa范围的HA分子。在另一个实施方案中，根据本发明使用的生物材料由基于聚乳酸(PLA)的泡沫组成，其具有开孔结构和约50微米至约300微米的孔径。在另一个实施方案中，特定的细胞群体，优选B2但也可以是B4，直接提供和/或刺激通过透明质酸合酶-2(HAS-2)的高分子量透明质酸的合成，特别地在肾内植入后。
本文中描述的生物材料还可被设计或改造来例如体外或体内响应某些外界条件。在一个实施方案中，生物材料是温度敏感性的(例如，在体外或体内)。在另一个实施方案中，生物材料经改造适合响应对于酶促降解的暴露(例如，在体外或体内)。生物材料对外界条件的反应可如本文中所述受到精细调节。描述的制剂的温度敏感性可通过调整制剂中生物材料的百分比来改变。例如，可调整溶液中明胶的百分比来调节终制剂(例如，液体、凝胶、珠粒等)中的明胶的温度敏感性。或者，可化学交联生物材料以提供更大的对酶促降解的抗性。例如，可将碳二亚胺交联剂用于化学交联明胶珠粒，从而提供减小的对内源酶的易感性。
在一个方面，由生物材料产生的对外界条件的反应涉及生物材料的结构完整性的丢失。虽然上文中提供了温度敏感性和对酶促降解的抗性，但存在生物材料完整性的丢失可籍以在不同的生物材料中发生的其它机制。这些机制可包括但不限于热力学(例如，相变例如熔解、扩散(例如，离子型交联剂从生物材料至周围组织的扩散))、化学、酶促、pH(例如，pH敏感性脂质体)、超声和对光敏感(光穿透(light penetration))。生物材料籍以丢失结构完整性的确切机制将会变化，但通常在植入时或植入后触发机制。
本领域技术人员将理解本领域已知的其它类型的合成或天然存在的材料可用于形成本文中描述的支架。
在一个方面，本发明提供了由上文提及的支架或生物材料制造的本文中描述的构建体。
4.构建体
在一个方面，本发明提供了包含具有一种或多种用于治疗有此需要的受试者的肾病、贫血或EPO缺乏的本文中描述的细胞群体的可植入构建体的制剂。在一个实施方案中，构建体由生物相容性材料或生物材料、由一种或多种合成或天然存在的生物相容性材料构成的支架或基质和一种或多种通过附着和/或捕获沉积在支架的表面上或包埋在其中的本文中描述的细胞群体或细胞混合物组成。在某些实施方案中，构建体由生物材料和一种或多种用生物材料组分包被的、沉积在生物材料上、沉积在其中、附着于其上、被捕获在其中、包埋在其中、接种的或与其组合的本文中描述的细胞群体或细胞混合物。可将本文中描述的任何细胞群体，包括富集的细胞群体或其混合物，与基质组合使用以形成构建体。
在一个方面，制剂包含由生物材料组成的构建体，所述生物材料被设计或改造来响应本文中描述的外界条件。因此，取决于外部条件，细胞群体与构建体中的生物材料的结合的性质将会改变。例如，细胞群体与温度敏感性生物材料的结合随温度而变化。在一个实施方案中，构建体包含细胞群体和在约8℃或更低温度下具有大体上固体状态以及在约环境温度或更高温度下具有大体上液体状态的生物材料，其中在约8℃或更低温度下将细胞群体悬浮在生物材料中。
然而，细胞群体在约环境温度或更高的温度下大体上自由地移动遍布生物材料的体积。在于更低的温度将细胞群体悬浮于大体上固相中为细胞例如依赖贴壁细胞提供了相较于液体中的细胞的稳定性有利方面。此外，将细胞悬浮于大体上固相中提供了下列益处的一项或多项：i)阻止细胞沉降；ii)允许细胞以悬浮状态保持锚定至生物材料；iii)允许细胞保持更均匀地分散在整个生物材料的体积中；iv)阻止细胞聚合体的形成；和v)在制剂的贮存和运输过程中为细胞提供更好的保护作用。可保持此类性质直至给受试者施用的制剂是有利的，至少因为制剂中细胞的总体健康将更好、更一致，并且可施用一致剂量的细胞。
在另一个实施方案中，沉积的细胞群体或构建体的细胞组分为富集了氧可调节的EPO生成细胞的第一肾细胞群体。在另一个实施方案中，第一肾细胞群体除氧可调节的EPO生成细胞外还包含肾小球和血管细胞。在一个实施方案中，第一肾细胞群体为B4’细胞群体。在一个其它实施方案中，沉积的细胞群体或构建体的细胞组分包括第一富集的肾细胞群体和第二肾细胞群体。在一些实施方案中，未富集第二细胞群体的氧可调节的EPO生成细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群体富集肾小管细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群体富集肾小管细胞，所述第二细胞群体包含集合管上皮细胞。在其它实施方案中，肾小管细胞的特征在于一种或多种肾小管细胞标志物的表达，所述标志物可包括但不限于兆蛋白、立方蛋白、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、N-钙粘蛋白(Ncad)、E-钙粘蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、成员RAS癌基因家族(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD结构域的离子转运调节剂4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换器)、成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族、成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族，成员A3(Aldh1a3)和钙蛋白酶-8(Capn8)。
在一个实施方案中，沉积在生物材料或支架上或与其组合以形成本发明的构建体的细胞群体来源于多种来源，例如自体来源。非自体来源也适合使用，包括但不限于异基因或同基因(自体或等基因(isogeneic))来源。
本领域技术人员将理解，存在几种用于将细胞群体沉积在生物材料上或另外地将细胞群体与生物材料组合以形成构建的适当方法。
在一个方面，本发明的构建体适用于本文中描述的使用的方法。在一个实施方案中，构建体适合于给需要任何病因学的肾病、贫血或任何病因学的EPO缺乏的治疗的受试者施用。在其它实施方案中，构建体适合于给需要红细胞的动态平衡的增强或恢复的受试者施用。在另一个实施方案中，构建体适合于给需要增强的肾功能的受试者施用。
在另一个方面，本发明提供了用于植入需要增强的肾功能的受试者的构建体，其包括：a)包含一种或多种生物相容性合成聚合物或天然存在的蛋白质或肽的生物材料；和
b)来源于患有肾病的受试者的哺乳动物肾细胞的混合物，其包含具有1.045g/mL至1.052g/mL的密度的包含分离的富集的肾小管细胞群体的第一细胞群体B2和具有1.063g/mL至1.091g/mL的密度的包含红细胞生成素(EPO)生成细胞和血管细胞但消耗了肾小球细胞的第二细胞群体B4’，所述细胞混合物用生物材料包被，或将其沉积在生物材料上或其中，捕获于其中，悬浮于其中，包埋在其中和/或另外地与其组合。在某些实施方案中，混合物不包括具有＜1.045g/ml的密度的包含集合管和肾小管系统的大颗粒细胞的B1细胞群体，或具有＞1.091g/ml的密度的包含具有低粒度和活力的碎片和小细胞的B5细胞群体。
在一个实施方案中，构建体包括特征在于血管标志物的表达的B4’细胞群体。在一些实施方案中，B4’细胞群体的特征不在于肾小球标志物的表达。在某些实施方案中，混合物能够进行氧可调节的红细胞生成素(EPO)表达。在所有实施方案中，混合物可来源于哺乳动物肾组织或培养的肾细胞。
在一个实施方案中，构建体包括被构造为适用于混合物捕获和/或附着的三维(3-D)多孔生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括被构建为适用于包埋、附着、悬浮或包被哺乳动物细胞的液体或半液体凝胶的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括由主要地高分子量种类的透明质酸(HA)组成的经构造以水凝胶形式存在的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括由主要地高分子量种类的透明质酸组成的经构造以多孔形式存在的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括由具有约50微米至约300微米的孔的基于聚乳酸的泡沫组成的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括可来源于对于需要增强的肾功能的受试者是自体的肾样品的一种或多种细胞群体。在某些实施方案中，样品为肾活检组织。在一些实施方案中，受试者患有肾病。在其它实施方案中，细胞群体来源于非自体肾样品。在一个实施方案中，构建体提供红细胞的动态平衡。
5.分泌产物
在一个其它方面，本发明涉及包含与从富集的肾细胞群体或富集的肾细胞群体的混合物分泌的产物(如本文中所描述的)组合的活性剂例如细胞群体的制剂。在一个实施方案中，产物包括下列物质的一种或多种：旁分泌因子、内分泌因子、邻分泌因子和囊泡。囊泡可包括下列物质的一种或多种：旁分泌因子、内分泌因子、邻分泌因子、微囊泡、外来体和RNA。分泌产物还可包括不在微囊泡内的产物，包括但不限于旁分泌因子、内分泌因子、邻分泌因子和RNA。例如，已在囊泡的外部分检测到细胞外miRNA(Wang等人，Nuc AcidsRes2010,1-12doi:10.1093/nar/gkq601,2010年7月7日)。分泌产物还可称为细胞来源的产物，例如细胞来源的囊泡。
在一个其它实施方案中，制剂包含为来源于肾细胞的囊泡的部分的分泌产物。囊泡可以能够递送因子至其它目的地。在一个实施方案中，囊泡为分泌的囊泡。涉及几种类型的分泌的囊泡，包括但不限于外来体、微囊泡、外来体、膜颗粒、外来体-样囊泡和细胞凋亡囊泡(Thery等人2010.Nat.Rev.Immunol.9:581-593)。在一个实施方案中，分泌的囊泡为外来体。在一个其它实施方案中，分泌的囊泡为微囊泡。在一个其它实施方案中，分泌的囊泡包含或包括一种或多种细胞组分。组分可以为下列组分的一种或多种：膜脂质、RNA、蛋白质、代谢产物、细胞质组分及其任意组合。在优选实施方案中，分泌的囊泡包括微小RNA，由或基本上由微小RNA组成。优选，miRNA为人miRNA。在一个实施方案中，一种或多种miRNA选自miR-30b-5p、miR-449a、miR-146a、miR-130a、miR-23b、miR-21、miR-124和miR-151。在一个其它实施方案中，一种或多种miRNA可选自let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、mir-1-1、mir-1-2、mir-7-1、mir-7-2、mir-7-3、mir-9-1、mir-9-2、mir-9-3、mir-10a、mir-10b、mir-15a、mir-15b、mir-16-1、mir-16-2、mir-17、mir-18a、mir-18b、mir-19a、mir-19b-1、mir-19b-2、mir-20a、mir-20b、mir-21、mir-22、mir-23a、mir-23b、mir-23c、mir-24-1、mir-24-2、mir-25、mir-26a-1、mir-26a-2、mir-26b、mir-27a、mir-27b、mir-28、mir-29a、mir-29b-1、mir-29b-2、mir-29c、mir-30a、mir-30b、mir-30c-1、mir-30c-2、mir-30d、mir-30e、mir-31、mir-32、mir-33a、mir-33b、mir-34a、mir-34b、mir-34c、mir-92a-1、mir-92a-2、mir-92b、mir-93、mir-95、mir-96、mir-98、mir-99a 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本发明涉及包含可从本文中描述的细胞群体或构建体获得的细胞来源的或分泌的miRNA的制剂。或者，制剂包含含有本文中描述的miRNA的序列的核酸分子。在一个实施方案中，制剂包含将一种或多种可用于给自体肾提供再生作用的个别miRNA。个别miRNA的组合可适合提供这样的作用。示例性组合包括下列的两种或更多种：miR-21、miR-23a、miR-30c、miR-1224、miR-23b、miR-92a、miR-100、miR-125b-5p、miR-195、miR-10a-5p及其任意组合。另一个示例性组合包括下列的两种或更多种：miR-30b-5p、miR-449a、miR-146a、miR-130a、miR-23b、miR-21、miR-124、miR-151及其任意组合。在一个实施方案中，miRNA的组合可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种个别miRNA。本领域技术人员将理解，其它miRNA和mirRNA的组合可适用于本发明。另外的miRNA的来源包括http://mirbase.org上的miRBase，其由曼彻斯特大学生命科学学院托管和维护。
在一个实施方案中，制剂包含分泌产物，所述分泌产物包括旁分泌因子和/或邻分泌因子例如α-1微球蛋白、β-2-微球蛋白、钙结合蛋白、簇连蛋白(clusterin)、结缔组织生长因子、胱抑素-C、谷胱甘肽-S-转移酶α、肾损伤分子-1、嗜中性粒细胞明胶酶-相关脂质运载蛋白、骨桥蛋白、三叶因子3、塔姆-霍斯福尔尿糖蛋白(tam-horsfall urinaryglycoprotein)、金属蛋白酶1的组织抑制剂、血管内皮生长因子、纤连蛋白、白细胞介素-6、单核细胞趋化蛋白-1。
一般地，旁分泌因子为由可在短距离范围内扩散以诱导或实现邻近细胞的改变即旁分泌相互作用的细胞合成的分子。可扩散的分子称为旁分泌因子。一般地，邻分泌因子是促进细胞间通讯(所述细胞间通讯通过细胞膜的寡糖、脂质或蛋白质组分传递)的分子，并且可影响发射细胞(emitting cell)或紧邻的细胞。邻分泌信号转导通常包括两个参与的细胞之间的物理接触。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含一种或更多种分离的肾细胞来源的分泌囊泡的制剂，如本文中所描述的。本领域技术人员将理解包含分泌的囊泡的各种类型的制剂将是适合的。
在另一个方面，本发明提供了制备包含肾细胞分泌产物例如囊泡的制剂的方法。在一个实施方案中，方法包括提供肾细胞群体(包括一种或多种富集的肾细胞群体的混合物)的步骤。在另一个实施方案中，方法还包括在适当的条件下培养群体的步骤。条件可为低氧条件。在另一个实施方案中，方法还包括从肾细胞群体分离分泌产物的步骤。可从细胞群体的细胞培养基获得分泌的囊泡。在分离分泌产物后，随后可将它们用作本文中描述的制剂的部分。在一个其它实施方案中，提供分泌产物的肾细胞的特征在于对氧水平作出生物响应(以便培养系统的氧张力的减小导致囊泡生成和/或分泌的诱导)的囊泡生成和/或分泌。在一个实施方案中，当在其中将细胞与在正常大气(～21%)水平的有效氧下培养的细胞群体相比较在培养系统中经历有效氧水平的下降的条件下培养细胞群体时，诱导囊泡产和和/或分泌。在一个实施方案中，在更低的氧条件下培养的细胞群体生成和/或分泌相对于在正常氧条件下培养的细胞群体更高水平的囊泡。通常，在降低的水平的有效氧(也称为缺氧培养条件)下培养细胞意指减少的氧的水平相对于在正常大气水平的有效氧(也称为正常或含氧量正常的培养条件)下培养细胞被降低。在一个实施方案中，缺氧细胞培养条件包括在约低于1%的氧，约低于2%的氧，约低于3%的氧，约低于4%的氧或约低于5%的氧下培养细胞。在另一个实施方案中，正常或含氧量正常的培养条件包括在约10%的氧，约12%的氧，约13%的氧，约14%的氧，约15%的氧，约16%的氧，约17%的氧，约18%的氧，约19%的氧，约20%的氧或约21%的氧下培养细胞。在优选实施方案中，方法包括提供从肾细胞分离外来体和/或微囊泡。
在一个实施方案中，制剂包含从肾细胞分泌的产物。产物可由不在支架上的肾细胞(例如细胞不为本文中描述的构建体的部分)分泌。
在另一个实施方案中，制剂包含由已接种在支架例如构建体上的肾细胞分泌的产物。构建体包括一种或多种富集的肾细胞群体或其混合物，所述细胞群体或其混合物被直接接种在支架上或其中。
在另一个方面，本发明提供了用于在配制之前筛选/最优化/监测一种或多种富集的肾细胞群体和包含所述细胞群体的混合物或构建体的治疗功效的体外方法。在一个实施方案中，方法包括提供一种或多种测试群体、测试混合物或测试构建体(“检品(testarticle)”)的步骤。在另一个实施方案中，方法包括在适当的条件下培养检品的步骤，如本文中所描述的。在一个其它实施方案中，方法包括从培养的检品收集细胞培养基的步骤。该培养基称为“条件培养基”并且预期其包含由检品的肾细胞分泌的产物。
在一个其它方面，可将条件培养基用于进行一个或多个体外测定以测试检品的生物治疗功效。在一个实施方案中，可对条件培养基进行上皮细胞-间质细胞转化(EMT)测定。测定可测试由TGFβ1诱导的EMT。实施例18提供了该测定的示例性方案。
在另一个实施方案中，对条件培养基进行RNA(例如通过基于PCR的测定)和/或囊泡或外来体(例如通过FACS)的检测。在一个其它实施方案中，对条件培养基进行信号转导途径测定，例如免疫响应(例如，NFκB)、纤维变性响应(PAI-1)和血管生成。实施例15-17提供了此类测定的示例性方案。
6.使用方法
在另一个方面，可施用本发明的制剂以治疗疾病。例如，可将生物活性细胞作为本文中描述的制剂的部分给自体器官施用。在一个实施方案中，生物活性细胞可来源于为施用的受试者的自体器官或不为靶自体器官的来源。
在一个方面，本发明提供了利用包含本文中描述的肾细胞群体和肾细胞的混合物的制剂治疗有此需要的受试者的肾病、贫血或EPO缺乏的方法。在一个实施方案中，方法包括给受试者施用包含包括富集EPO生成细胞的第一肾细胞群体的组合物的制剂。在另一个实施方案中，第一细胞群体富集EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在一个实施方案中，第一细胞群体为B4’细胞群体。在另一个实施方案中，组合物还可包括一种或多种另外的肾细胞群体。在一个实施方案中，另外的细胞群体为未富集EPO生成细胞的第二细胞群体。在另一个实施方案中，另外的细胞群体为未富集EPO生成细胞、肾小球细胞或血管细胞的第二细胞群体。在另一个实施方案中，组合物还包括肾细胞群体或肾细胞的混合物，所述细胞群体或混合物被沉积在生物材料中，沉积在其上，包埋于其中，被其包被、悬浮于其中或捕获于其中以形成如本文中所述的可植入的构建体(以用于治疗本文中描述的疾病或病症)。在一个实施方案中，将细胞群体单独或与其它细胞或生物材料(例如，水凝胶、多孔支架或天然或合成肽或蛋白质)组合使用，以刺激急性或慢性疾病状态中的再生。
在另一个方面，可通过红细胞生成和/或肾功能的各种指标观察本发明的方法对受试者的肾病、贫血或EPO缺乏的有效治疗。在一个实施方案中，红细胞的动态平衡的指标包括但不限于血细胞比容(HCT)、血红蛋白(HB)、平均红细胞血红蛋白量(MCH)、红细胞计数(RBC)、网织红细胞计数(reticulocyte number)、网织红细胞%、平均细胞容积(MCV)和红细胞分布宽度(RDW)。在一个其它实施方案中，肾功能的指标包括但不限于血清白蛋白、白蛋白球蛋白比(A/G比)、血清磷、血清钠、肾尺寸(可通过超声测量的)、血清钙、磷钙比、血清钾、蛋白尿、尿肌酐、血清肌酸酐、血尿素氮(BUN)、胆固醇水平、甘油三酯水平和肾小球滤过率(GFR)。此外，一般健康和康乐的几个指标包括但不限于体重增加或减轻、存活、血压(平均全身血压、舒张压或收缩压)和身体耐力表现。
在另一个实施方案中，利用生物活性肾细胞制剂的有效治疗通过肾功能的一个或多个指标的稳定化来证明。肾功能的稳定化通过利用本发明的方法治疗的受试者的指标与未曾用本发明的方法治疗的受试者的相同指标相比较的改变来证明。或者，肾功能的稳定化可通过利用本发明的方法治疗的受试者的指标与治疗前相同受试者的相同指标相比较的改变来证明。第一指标的改变可以是值的增加或减小。在一个实施方案中，由本发明提供的治疗可包括受试者的血尿素氮(BUN)水平的稳定化，其中在受试者中观察到的BUN水平比未曾利用本发明的方法治疗的具有类似疾病状态的受试者低。在一个其它实施方案中，治疗可包括受试者的血清肌酸酐水平的稳定化，其中在受试者中观察到的血清肌酸酐水平比未曾利用本发明的方法治疗的具有类似疾病状态的受试者低。在另一个实施方案中，治疗包括受试者的血细胞比容(HCT)水平的稳定化，其中在受试者中观察到的HCT水平比未曾利用本发明的方法治疗的具有类似疾病状态的受试者低。在另一个实施方案中，治疗包括受试者的红细胞(RBC)水平的稳定化，其中在受试者中观察到的RBC水平比未曾利用本发明的方法治疗的具有类似疾病状态的受试者高。本领域技术人员将理解，可测量本文中描述的或本领域已知的一个或多个另外的指标以测定受试者的肾病的有效治疗。
在另一个方面，本发明涉及用于在受试者中提供红细胞的动态平衡的方法的制剂。在一个实施方案中，方法包括以下步骤：(a)给受试者施用包含肾细胞群体例如B2或B4’，或肾细胞的混合物例如B2/B4’和/或B2/B3或富集的肾细胞群体的制剂，如本文中所描述的；和(b)在来自受试者的生物样品中测定红细胞生成指标的水平相对于对照中的指标水平不同，其中指标水平的差异(i)表示受试者响应施用步骤(a)，或(ii)表示受试者的红细胞的动态平衡。在另一个实施方案中，方法包括以下步骤：(a)给受试者施用包含本文中描述的肾细胞群体或肾细胞的混合物的制剂；和(b)在受试者的生物样品中测定红细胞生成指标的水平相对于对照的指标水平不同，其中指标水平的差异(i)表示受试者响应施用步骤(s)，或(ii)表示受试者的红细胞的动态平衡。在另一个实施方案中，方法包括以下步骤：(a)提供生物材料或生物相容性聚合物支架；(b)将本发明的肾细胞群体或肾细胞混合物以本文中描述的方式沉积在生物材料或支架上或其内以形成可植入的构建体；(c)制备包含构建体的制剂；(d)将构建体植入受试者；和(e)在受试者的生物样品中测定红细胞生成指标的水平相对于对照的指标水平不同，其中指标水平的差异(i)表示受试者响应施用步骤(a)，或(ii)表示受试者的红细胞的动态平衡。
在另一个方面，本发明涉及用于给有此需要的受试者提供肾功能的稳定化和红细胞的动态平衡的恢复的方法的制剂，所述受试者具有肾功能缺陷以及贫血和/或EPO缺乏。在一个实施方案中，方法包括施用包含本文中描述的肾细胞群体或肾细胞混合物的制剂的步骤，所述细胞群体或混合物包含下列细胞类型的至少一种：肾小管来源的细胞、肾小球来源的细胞、间质来源的细胞(insterstitium-derived cell)、集合管来源的细胞、间质组织来源的细胞或来源于脉管系统的细胞。在另一个实施方案中，群体或混合物包含EPO生成细胞和肾小管上皮细胞、已通过下列标志物的至少一个标志物鉴定的肾小管细胞：兆蛋白、立方蛋白、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、N-钙粘蛋白(Ncad)、E-钙粘蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、成员RAS癌基因家族(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD结构域的离子转运调节剂4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换器)、成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族、成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族、成员A3(Aldh1a3)和钙蛋白酶-8(Capn8)。在该实施方案中，受试者的治疗可通过与未治疗的受试者或受试者的治疗前指标相比较红细胞生成的至少一个指标的增强伴随着肾功能的至少一个指标的改善来证明。
在一个方面，本发明提供了制剂，所述制剂用于通过施用富集EPO生成细胞的肾细胞群体或包含富集了本文中所述的EPO生成细胞的细胞群体的肾细胞的混合物的来(i)治疗肾病、贫血或EPO缺乏；(ii)稳定肾功能，(iii)恢复红细胞的动态平衡或(iv)其任意组合的方法，其中施用的有益作用大于施用未富集EPO生成细胞的细胞群体的作用。在另一个实施方案中，富集的细胞群体提供了升高水平的血清血尿素氮(BUN)。在另一个实施方案中，富集的细胞群体提高蛋白质在血清中的保留。在另一个实施方案中，富集的细胞群体提供了升高水平的血清胆固醇和/或甘油三酯。在另一个实施方案中，富集的细胞群体提供了升高水平的维生素D。在一个实施方案中，富集的细胞群体提供了与非富集的细胞群体相比较提高的磷钙比。在另一个实施方案中，富集的细胞群体提供了与非富集的细胞群体相比较升高水平的血红蛋白。在其它实施方案中，富集的细胞群体与非富集的细胞群体相比较提供了升高水平的血清肌酸酐。在另一个实施方案中，富集的细胞群体与非富集的细胞群体相比较提供了升高水平的血细胞比容。在其它实施方案中，富集的细胞群体与非富集的细胞群体相比较提供了升高水平的红细胞数(RBC#)。在一个实施方案中，升高水平的血细胞比容恢复至95%的正常健康水平。在其它实施方案中，富集的细胞群体与非富集的细胞群体相比较提供了增加的网织红细胞数。在其它实施方案中，富集的细胞群体与非富集的细胞群体相比较提供了增加的网织红细胞百分比。在其它实施方案中，富集的细胞群体与非富集的细胞群体相比较提供了升高水平的红细胞容积分布宽度(RDW)。在另一个实施方案中，富集的细胞群体与非富集的细胞群体相比较提供了升高水平的血红蛋白。在另一个实施方案中，富集的细胞群体在骨髓中提供红细胞生成响应(erythroietic response)，以便骨髓细胞性接近正常并且骨髓:红细胞系统比接近正常。
在另一个方面，本发明提供了制剂，所述制剂用于通过施用富集的细胞群体(i)治疗肾病、贫血或EPO缺乏；(ii)稳定肾功能，(iii)恢复红细胞的动态平衡或(iv)其任意组合的方法，其中施用本文中描述的肾细胞群体或肾细胞群体的混合物的有益作用的特征在于改善的红细胞的动态平衡(当与通过施用重组EPO(rEPO)提供的有益作用相比较时)。在一个实施方案中，所述群体或混合物，当给有此需要的受试者施用时，提供改善的红细胞的动态平衡(如通过血细胞比容、血红蛋白或RBC#测定的)(当与施用重组EPO蛋白相比较时)。在一个实施方案中，所述群体或混合物，当施用时，提供升高水平的血细胞比容、RBC或血红蛋白(当与重组EPO相比较时)，与对照的血细胞比容相比降低或升高不超过约10%。在其它实施方案中，群体或混合物的单次剂量或递送，当施用时，在被治疗的受试者中提供红细胞的动态平衡的改善(如通过血细胞比容、血红蛋白或RBC#的增加测定的)持续一段时间，所述持续时间显著超过重组EPO蛋白的单次剂量或递送提供红细胞的动态平衡的改善所持续的时间。在另一个实施方案中，所述群体或混合物，当施用时，在本文中描述的剂量上不导致大于匹配的健康对照的正常水平的约110%的血细胞比容、血红蛋白或RBC#。在其它实施方案中，所述群体或混合物，当以本文中描述的剂量施用时，提供了与以本文中描述的剂量递送的重组EPO蛋白相比较更优的红细胞的动态平衡(如通过血细胞比容、血红蛋白或RBC#测定的)。在另一个实施方案中，以约100IU/kg、约200IU/kg、约300IU/kg、约400IU/kg或约500IU/kg的剂量递送重组EPO。本领域技术人员将理解，其它剂量的本领域已知的重组EPO可以是适当的。
本发明的另一个实施方案涉及包含本文中描述的至少一个细胞群体(包括富集的细胞群体和其混合物)、或本文中描述的可植入构建体、或本文中描述的分泌产物的制剂用于制备药剂的用途，所述药剂用于治疗有此需要的受试者的肾病、贫血或EPO缺乏、提供有此需要的受试者的红细胞的动态平衡、增强有此需要的受试者的肾功能或给自体肾提供再生作用。
本发明的另一个实施方案涉及用于基于特定细胞亚群的选择(基于具体验证治疗属性)，治疗具有特定病因学的肾病的包含特定的富集的细胞群体(本文中描述的)的制剂。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗有此需要的受试者的肾病的方法的制剂，所述方法包括给受试者施用包含哺乳动物肾细胞的混合物的制剂，所述细胞混合物包含具有1.045g/mL至1.052g/mL的密度的包含分离的富集的肾小管细胞群体的第一细胞群体B2，和具有1.063g/mL至1.091g/mL的密度的包含红细胞生成素(EPO)生成细胞和血管细胞但消耗了肾小球细胞的第二细胞群体B4’，其中混合物不包括具有＜1.045g/ml的密度的集合管和肾小管系统的大颗粒细胞的B1细胞群体，或具有＞1.091g/ml的密度的包含具有低粒度和活力的碎片和小细胞的B5细胞群体。在某些实施方案中，方法包括在受试者的测试样品中测定肾功能指标的水平相对于对照的指标水平不同，其中指标水平的差异表示受试者的一种或多种肾功能的衰退的减轻、所述功能的稳定化或所述功能的增强。在一个实施方案中，用于方法的B4’细胞群体的特征在于血管标志物的表达。在某些实施方案中，用于方法的B4’细胞群体的特征不在于肾小球标志物的表达。在一个实施方案中，用于方法的细胞的混合物能够进行氧可调节的红细胞生成素(EPO)表达。在某些实施方案中，待通过本发明的方法治疗的肾病伴随红细胞生成素(EPO)缺乏。在某些实施方案中，EPO缺乏为贫血。在一些实施方案中，EPO缺乏或贫血继发于受试者的肾衰竭。在一些其它实施方案中，EPO缺乏或贫血继发于选自慢性肾衰竭、原发性EPO缺乏(primary EPO deficiency)、化学疗法或抗病毒疗法、非骨髓性癌、HIV感染、肝病、心力衰竭、类风湿性关节炎或多器官系统衰竭的病症。在某些实施方案中，用于方法的组合物还包含含有一种或多种生物相容性合成聚合物和/或天然存在的蛋白质或肽的生物材料，其中利用生物材料包被混合物，将所述混合物沉积在生物材料上或其中，捕获于其中，悬浮于其中，包埋在其中和/或另外地与其组合。在某些实施方案中，本发明的制剂中使用的混合物来源于哺乳动物肾组织或培养的哺乳动物肾细胞。在其它实施方案中，混合物来源于对于有此需要的受试者是自体的肾样品。在一个实施方案中，样品为肾活检组织。在其它实施方案中，制剂包含来源于非自体肾样品的混合物。
在另一个方面，本发明提供了包含本文中描述的细胞制剂及混合物或本发明的可植入构建体的制剂用于制备药剂的用途，所述药剂用于治疗有此需要的受试者的肾病、贫血或EPO缺乏。
在另一个方面，本发明提供了用于再生此有需要的受试者的自体肾的方法的制剂。在一个实施方案中，方法包括给受试者施用或植入本文中描述的细胞群体、混合物或构建体的步骤。再生的自体肾的特征可在于许多指标，包括但不限于自体肾的功能或能力的发展、自体肾的功能或能力的增强以及某些标志物在自体肾中的表达。在一个实施方案中，可基于上述红细胞的动态平衡和肾功能的各种指标观察发展或增强的功能或能力。在另一个实施方案中，再生肾的特征在于一个或多个干细胞标志物的差异表达。干细胞标志物可以为下列标志物的一种或多种：SRY(性别决定区Y)-盒2(Sox2)；未分化的胚胎细胞转录因子(UTF1)；来自小鼠的Nodal同源物(NODAL)；凸素(Prominin)1(PROM1)或CD133(CD133)；CD24及其任意组合。(参见Ilagan等人PCT/US2011/036347，通过引用整体并入本文)。在另一个实施方案中，干细胞标志物的表达与对照相比较被上调。
本文中描述的细胞群体(包括富集的细胞群体及其混合物以及包含所述细胞群体的构建体)可被用于给自体肾提供再生作用。所述作用可由细胞本身和/或由从细胞的分泌产物提供。再生作用的特征可在于下列的一个或多个方面：上皮细胞-间质细胞转化(其可通过TGF-β信号转导的减弱来进行)的减少；肾脏纤维化的减少；肾炎的减轻；干细胞标志物在自体肾中的差异表达；植入的细胞和/或自体细胞至肾损害例如肾小管损害的迁移、植入的细胞在肾损害例如肾小管损害的位置上的移植；肾功能的一个或多个指标(如本文中所描述的)的稳定化；红细胞的动态平衡(如本文中所描述的)的恢复；及其任意组合。
7.监测再生的方法
在另一个方面，本发明提供了用于在将包含本文中描述的细胞群体、混合物或构建体的制剂施用或植入至受试者后监测自体肾的再生的预后方法。在一个实施方案中，方法包括检测从受试者获得的测试样品和对照样品中标志物表达的水平的步骤，其中与对照样品相比较，测试样品中标志物的更高表达水平预示受试者的自体肾的再生。在另一个实施方案中，方法包括检测样品中一个或多个干细胞标志物的表达。干细胞标志物可选自Sox2、UTF1、NODAL、CD133、CD24及其任意组合(参见Ilagan等人PCT/US2011/036347的实施例11)。检测步骤可包括测定干细胞标志物的表达在测试样品中相对于对照样品被上调或更高，其中更高的表达水平预示受试者的自体肾的再生。在一个其它实施方案中，检测干细胞标志的mRNA表达。在其它实施方案中，可通过基于PCR的方法，例如qRT-PCR来检测mRNA表达。原位杂交还可用于检测mRNA表达。在另一个实施方案中，还可使用抗干细胞标志物试剂检测干细胞标志物的多肽表达。在一个其它实施方案中，试剂为抗标志物抗体。在另一个实施方案中，使用免疫组织化学或蛋白质印迹检测干细胞标志物多肽的表达。本领域技术人员将理解用于检测标志物的mRNA和/或多肽表达的其它方法。
在另一个方面，本发明提供了在植入或施用包含本文中描述的细胞群体、混合物或构建体的制剂后对患者进行预后评估的方法。在一个实施方案中，方法包括以下步骤：检测获自所述受试者的测试样品中标志物表达的水平；(b)测定相对于对照样品的标志物表达水平(或对照参考值)测试样品中标志物的表达水平；和(c)基于标志物表达水平的测定预测患者的再生预后，其中与对照样品(或对照参考值)相比较测试样品中更高水平的标志物表达预示受试者中的再生。
在一个其它方面，本发明提供了用于将包含本文中描述的细胞群体、混合物或构建体的制剂施用至或植入受试者后监测自体肾的再生的预后方法，其中使用非侵袭性方法。作为活检组织的替代物，可从体液例如尿的检查评估接受治疗的受试者中的再生结果。已发现，获自受试者来源的尿来源的微囊泡包含某些组分，包括但不限于最终来源于受利用本发明的细胞群体的治疗影响的肾细胞群体的特定蛋白质和miRNA。此类组分可包括参与干细胞复制和分化、细胞凋亡、炎症和免疫调节的因子。微囊泡结合的miRNA/蛋白质的表达模式的时间分析允许连续监测接受本发明的细胞群体、混合物或构建体的受试者的肾内的再生结果。实施例19描述了用于受试者的尿的分析的示例性方案。
可分析此类肾来源的囊泡和/或排入受试者的尿的肾来源的囊泡的腔内容物的表示再生结果的生物标志物。
在一个实施方案中，本发明提供了评估肾病(KD)患者是否响应于利用治疗制剂的治疗的方法。方法可包括测定或检测与对照样品中的囊泡的量相比较或相对于其，获自用治疗剂治疗的KD患者的测试样品中囊泡或其腔内容物的量的步骤，其中与对照样品中囊泡或其腔内容物的量相比较测试样品中囊泡或其腔内容物的更高或更低的量表示被治疗的患者对利用治疗剂的治疗的响应。
本发明还提供了监测利用治疗剂治疗KD患者的功效的方法。在一个实施方案中，方法包括测定或检测与对照样品中囊泡或其腔内容物的量相比较或相对于其，获自用治疗剂治疗的KD患者的测试样品中囊泡的量的步骤，其中与对照样品中囊泡或其腔内容物的量相比较测试样品中囊泡或其腔内容物的更高或更低的量表示利用治疗剂治疗KD患者的功效。
本发明提供了鉴定试剂对于治疗其的肾病(KD)是有效的患者亚群的方法。在一个实施方案中，方法包括测定试剂的功效与患者亚群的样品中许多囊泡或其腔内容物的存在(与获自对照样品的样品中囊泡或其腔内容物的量相比较)之间的相互关系的步骤，其中与对照样品中囊泡或其腔内容物的量相比较患者亚群的样品中更高或更低量的囊泡表示试剂对于治疗患者亚群的KD是有效的。
测定或检测步骤可包括分析可存在于测试样品中的miRNA或其它分泌产物的量(参见实施例19)。
非侵袭性预后法可包括在施用或植入本文中描述的细胞群体、混合物或构建体之前和/或之后从受试者获得尿样品的步骤。可使用标准技术，包括但不限于除去不想要的碎片的离心(Zhou等人2008.Kidney Int.74(5):613-621；Skog等人，美国公布的专利申请No.20110053157，将所述每一篇文献或专利通过引用整体并入本文)从尿样品分离囊泡和其它分泌产物。
本发明涉及在治疗后检测受试者的再生结果的非侵袭性方法。方法包括检测被治疗的受试者的尿中的囊泡或其腔内容物。腔内容物可以为一种或多种miRNA。个别miRNA的组合或小组的检测可适用于此类预后方法。示例性组合包括如下的两种或更多种：miR-24、miR-195、miR-871、miR-30b-5p、miR-19b、miR-99a、miR-429、let-7f、miR-200a、miR-324-5p、miR-10a-5p及其任意组合。在一个实施方案中，miRNA的组合可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多种个别miRNA。本领域技术人员将理解，其它miRNA和miRNA的组合可适用于此类预后方法。其它miRNA的来源包括http://mirbase.org上的miRBase，其由曼彻斯特大学的生命科学学院托管和维持。
本领域技术人员将理解，除了本文中描述的细胞群体和构建体外，用于检测再生的预后方法还可适用于利用本领域已知的其它治疗剂治疗的受试者。
在一些实施方案中，测定步骤包括使用通过适当的处理器执行的软件程序以(i)测量测试样品和对照中标志物表达(或囊泡/囊泡内容物)的差异水平；和/或(ii)分析获自测量测试样品和对照中标志物表达的差异水平的数据。适当的软件和处理器在本领域是公知的并且可商购获得。程序可包含在存储在可触摸介质例如CD-ROM、软盘、硬驱、DVD或与处理器结合的内存上的软件中，但本领域技术人员将理解，完整程序或其部分可选择地可通过除处理器外的设备来执行，和/或以公知的方式包含在固件和/或专用硬件中。
在测定步骤后，通常记录测量结果、发现、诊断、预测和/或治疗建议，并且例如将其传达给技术人员、医生和/或患者。在某些实施方案中，可使用计算机将这样的信息传达给当事人例如患者和/或主治医生。在一些实施方案中，可进行测定或在与结果或诊断被传达至的国家或管辖地区不同的国家庭或管辖地区分析测定结果。
在优选实施方案中，在完成测定后和生成预后和/或预测后，尽可能快地将基于在具有差异水平的标志物表达的测试者中测量的标志物表达的水平的预后、预测和/或治疗建议传达给受试者。可由受试者的治疗医生将结果和/或相关信息传达给受试者。或者，可通过任何传达方式，包括写信、电子传达形式例如电子邮件或电话将结果直接传达给测试者。可使用计算机，例如在电子邮件传达的情况下，帮助传达。在某些实施方案中，可生成包含预后测试的结果和/或从测试得出的结论和/或基于测试的治疗建议的通信(communication)，使用对于电信领域的技术人员来说熟悉的计算机硬件与软件的组合将其自动地递送给受试者。保健型通信系统的一个实例描述于美国专利No.6,283,761中；然而，本发明不限于利用该特定通信系统的方法。在本发明的方法的某些实施方案中，可在不同(例如外国)管辖地区进行全部或一些方法步骤，包括样品的测定、再生的预后和/或预测以及测定结果或预后的传达。
在另一个方面，本文中描述的预后方法给当事方提供关于植入或施用的再生成功的信息。
在所有实施方案中，给需要本文中描述的此类治疗的受试者提供再生肾的方法可包括预后评估再生的植入后步骤，如上文中所描述的。
8.生物活性细胞制剂
本文中描述的制剂包含生物材料，所述生物材料具有为待给受试者施用的活性剂例如生物活性肾细胞产生有利的环境的性质。在一个实施方案中，制剂包含第一生物材料，所述第一生物材料从利用生物材料配制活性剂时直至给受试者施用的点提供了有利的环境。在一个其它实施方案中，有利的环境涉及在给受试者施用之前将生物活性细胞悬浮于大体上固体状态相较于液体中的细胞(如本文中所描述的)的有利方面。在另一个实施方案中，第一生物材料是温度敏感性生物材料。温度敏感性生物材料可(i)在约8℃或更低的温度下具有大体上固体状态，和(ii)在环境温度或更高的温度下具有大体上液体状态。在一个实施方案中，环境温度为约室温。
在另一个方面，制剂包含与第二生物材料组合的生物活性细胞，所述第二生物材料从配制时直至给受试者施用后的点为组合的细胞提供有利的环境。在一个实施方案中，由第二生物材料提供的有利的环境涉及在保持结构完整性直至给受试者施用的点和在施用后保持一段时间的生物材料中施用细胞的有利方面。在一个实施方案中，植入后第二生物材料的结构完整性是数分钟、数小时、数天或数周。在一个实施方案中，结构完整性少于一个月、少于一周、少于一天或少于一小时。相对短期的结构完整性提供了制剂，所述制剂可以以受控的操作、旋转或分散将活性剂和生物材料递送至组织或器官的靶位置而不妨碍或阻碍整合的元件与其被整合进入的组织或器官之间的相互作用。
在另一个实施方案中，第二生物材料是与第一生物材料具有不同敏感性的温度敏感性生物材料。第二生物材料可(i)在约环境温度或更低的温度下具有大体上固体状态，和(ii)在约37℃或更高温度下具有大体上液体状态。在一个实施方案中，环境温度为约室温。
在一个实施方案中，第二生物材料是交联的珠粒。取决于交联的程度，交联的珠粒可具有可精细调节的体内停留时间，如本文中所描述的。在另一个实施方案中，交联的珠粒包含生物活性细胞并且抗本文中描述的酶促降解。
本发明的制剂可包括与活性剂例如生物活性细胞组合的第一生物材料，具有或不具有与活性剂例如生物活性细胞组合的第二生物材料。当制剂包括第二生物材料时，其可以是温度敏感性珠粒和/或交联的珠粒。各种代表性制剂提供于下面的实施例中(参见图3-7)。
可将本文中描述的生物活性细胞制剂、混合物和/或构建体作为生物活性细胞制剂进行施用。在一个方面，制剂包括细胞和一种或多种给本文中描述的生物活性细胞制剂、混合物和/或构建体提供稳定性的生物材料。在一个实施方案中，生物材料是温度敏感性生物材料，取决于温度，其可维持至少两种不同的相或状态。生物材料能够在第一温度下维持第一状态，在第二温度下维持第二状态，和/或在第三温度下维持第三状态。第一、第二或第三状态可以是大体上固体、大体上液体或大体上半固体或半液体状态。在一个实施方案中，生物材料在第一温度下具有第一状态，以及在第二温度下具有第二状态，其中第一温度低于第二温度。
在一个其它实施方案中，温度敏感性生物材料的状态在约8℃或更高的温度下是大体上固体状态。在其它实施方案中，在约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃或约8℃下维持大体上固体状态。在一个实施方案中，大体上固体状态具有凝胶的形式。在其它实施方案中，温度敏感性生物材料的状态在环境温度或更高温度下是大体上液体状态。在一个实施方案中，在约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃或约37℃下维持大体上液体状态。在一个实施方案中，环境温度为约室温。
在另一个实施方案中，温度敏感性生物材料的状态在约环境温度或更低的温度下为大体上固体状态。在一个实施方案中，环境温度是大约室温。在另一个实施方案中，在约17℃、约16℃、约15℃、约14℃、约13℃、约12℃、约11℃、约10℃、约9℃、约8℃、约7℃、约6℃、约5℃、约4℃、约3℃、约2℃或约1℃下维持大体上固体状态。在一个实施方案中，大体上固体状态具有珠粒的形式。在另一个实施方案中，温度敏感性生物材料的状态在约37℃或更高的温度下是大体上液体状态。在一个其它实施方案中，在37℃、约38℃、约39℃或约40℃下维持大体上固体状态。
可以以溶液的形式、珠粒的形式或以本文中描述的和/或本领域技术人员已知的其它适当的形式提供温度敏感性生物材料。可将本文中描述的细胞群体和制剂用温度敏感性生物材料包被、沉积在所述生物材料上、包埋在其中、附着于其上、接种在其中或被捕获在其中。或者，可提供不具有任何细胞(例如以间隔珠粒的形式)的温度敏感性生物材料。
在其它实施方案中，温度敏感性生物材料具有第一状态与第二状态之间的过渡状态。在一个实施方案中，过渡状态是约8℃的温度与约环境温度之间的固体至液体的过渡状态。在一个实施方案中，环境温度是约室温。在一个其它实施方案中，固体至液体的过渡状态在约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃和约18℃的一个或多个温度下发生。
温度敏感性生物材料在给定的温度下具有以厘泊(cP)测量的一定粘度。在一个实施方案中，生物材料在25℃下具有约1cP至约5cP、约1.1cP至约4.5cP、约1.2cP至约4cP、约1.3cP至约3.5cP、约1.4cP至约3.5cP、约1.5cP至约3cP、约1.55cP至约2.5cP或约1.6cP至约2cP的粘度。在另一个实施方案中，0.75%(w/v)的溶液在37℃下具有约1.0cP至约1.15cP的粘度。37℃下的粘度可以为约1.0cP、约1.01cP、约1.02cP、约1.03cP、约1.04cP、约1.05cP、约1.06cP、约1.07cP、约1.08cP、约1.09cP、约1.10cP、约1.11cP、约1.12cP、约1.13cP、约1.14cP或约1.15cP。在一个其它实施方案中，生物材料是明胶溶液。明胶以约0.5%、约0.55%、约0.6%、约0.65%、约0.7%、约0.75%、约0.8%、约0.85%、约0.9%、约0.95%或约1%,(w/v)存在于溶液中。在一个实例中，生物材料是0.75%(w/v)的PBS中的明胶溶液。在一个实施方案中，0.75%(w/v)的溶液在25℃下具有约1.6cP至约2cP的粘度。在一个实施方案中，0.75%(w/v)的溶液在37℃下具有约1.07cP至约1.08cP的粘度。明胶溶液提供于PBS、DMEM或另一种适当的溶剂中。
在一个方面，生物活性细胞制剂还包括细胞活性剂。在一个实施方案中，细胞活性剂选自抗氧化剂、氧载体、免疫调节因子、细胞募集因子、细胞附着因子、抗炎因子、血管生成因子、伤口愈合因子以及从生物活性细胞分泌的产物。
抗氧化剂的特征在于抑制其它分子氧化的能力。抗氧化剂包括但不限于6-羟基-2,5,7,8-四甲基色原烷-2-羧酸、类胡萝卜素、黄酮类化合物、异黄酮类、泛醌、谷胱甘肽、硫辛酸、超氧化物歧化酶、抗坏血酸、维生素E、维生素A、混合的类胡萝卜素(例如，β胡萝卜素、α胡萝卜素、γ胡萝卜素、叶黄素、番茄红素、八氢番茄红素、六氢番茄红素和虾青素)、硒、辅酶Q10、吲哚-3-原醇、原花色素、白藜芦醇、儿茶素、水杨酸、姜黄素、胆红素、草酸、植酸、硫辛酸、香草酸、多酚、阿魏酸、茶黄素的一种或多种及其衍生物。本领域技术人员将理解用于本发明的其它适当的抗氧化剂。
氧载体是特征在于运送和释放氧的能力的试剂。它们包括但不限于全氟化碳和包含全氟化碳的药物。适当的基于全氟化碳的氧载体包括但不限于全氟溴辛烷(C8F17Br)；perfluorodichorotane(C8F16C12)；全氟溴癸烷；全氟溴烷(perfluobron)；全氟萘烷；全氟三丙基胺；全氟甲基环哌啶(perfluoromethylcyclopiperidine)；(全氟萘烷和全氟三丙基胺)；(全氟萘烷和全氟甲基环哌啶)；(全氟溴癸烷和全氟溴烷)；OcycyteTM(全氟(叔-丁基环己烷))。本领域技术人员将理解用于本发明的其它适当的基于全氟化碳的氧载体。
免疫调节因子包括但不限于骨桥蛋白、FAS配体因子、白细胞介素、转化生长因子β、血小板源性生长因子、簇连蛋白、转铁蛋白、作用后受调节的正常T细胞表达的分泌的蛋白(RANTES)、纤溶酶原激活物抑制物-1(Pai-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、α-1微球蛋白和β-2-微球蛋白。本领域技术人员将理解用于本发明的其它适当的免疫调节因子。
抗炎剂或免疫抑制剂(下文中描述的)还可以是制剂的部分。本领域技术人员将理解用于本发明的其它适当的抗氧化剂。
细胞募集因子包括但不限于单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和CXCL-1。本领域技术人员将理解用于本发明的其它适当的细胞募集因子。
细胞附着因子包括但不限于纤连蛋白、原胶原、胶原、ICAM-1、结缔组织生长因子、层粘连蛋白、蛋白聚糖、特异性细胞附着肽例如RGD和YSIGR。本领域技术人员将理解用于本发明的其它适当的细胞附着因子。
血管生成因子包括但不限于基质金属蛋白酶1(MMP1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、血管内皮生长因子F(VEGF)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、组织抑制剂或金属蛋白酶-1(TIMP-1)、血管内皮生长因子F(VEGF)、血管生成素-2(ANG-2)。本领域技术人员将理解用于本发明的其它适当的血管生成因子。
伤口愈合因子包括但不限于角质细胞生长因子1(KGF-1)、组织型纤维蛋白酶原激活剂(tissue plasminogen activator)(tPA)、钙结合蛋白、簇连蛋白、胱抑素C、三叶因子3。本领域技术人员将理解用于本发明的其它适当的伤口愈合因子。
还可将本文中描述的生物活性细胞的分泌产物作为细胞活性剂添加至生物活性细胞制剂中。
在一个其它方面，制剂包括本文中描述的温度敏感性生物材料和包含生物材料的生物相容性珠粒的群体。在一个实施方案中，珠粒是交联的。交联可使用本领域技术人员已知的任何适当的交联剂来实现，所述交联剂是例如碳二亚胺；醛(例如糠醛、丙烯醛、甲醛、戊二醛、甘油醛)、基于琥珀酰亚胺的交联剂{双(磺酸基琥伯酰亚胺基)辛二酸盐(BS3)、二琥珀酰亚胺基戊二酸盐(DSG)、二琥珀酰亚胺基辛二酸盐(DSS)、二硫代双(琥伯酰亚胺基丙酸盐)、乙二醇双(磺酸基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)、乙二醇双(琥珀酰亚胺丁二酸酯)(Ethylene glycolbis(succinimidylsuccinate))、乙二醇双(琥珀酰亚胺丁二酸酯)(EGS)、双琥珀酰亚胺戊二酸酯(BS2G)、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(Disuccinimidyltartrate)(DST)}；环氧化物(乙二醇二缩水甘油醚、1,4丁二醇二缩水甘油醚)；糖类(葡萄糖和醛糖)；磺酸和对-甲苯磺酸；羰二咪唑；京尼平；亚胺；酮；二苯基磷酰基叠氮化物(DDPA)；对苯二酰氯；硝酸铈(III)六水合物；微生物谷氨酰胺转移酶和过氧化氢。本领域技术人员将理解用于本发明的其它适当的交联剂和交联方法。
在一个实施方案中，珠粒是碳二亚胺交联的珠粒。可用选自l-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)、DCC-N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIPC)的碳二亚胺交联碳二亚胺交联的珠粒。利用低浓度EDC处理的珠粒预期具有更多数目的游离伯胺，然而利用高浓度的交联剂处理的样品预期使大多数伯胺参与酰胺键。通过伯胺与苦基磺酸之间共价键合产生的橙色(可在335nm通过分光光度计测量检测的)的强度与存在于样品中的伯胺的数目成正比。当针对每毫克存在于样品中的蛋白质进行标准化时，可观察到存在的游离胺的数目与用于交联的EDC的初始浓度之间的负相关。该结果显示差异珠粒交联(通过反应中使用的碳二亚胺的量控制的)。一般地，交联的珠粒相较于未交联的珠粒显示减少的数目的游离伯胺。游离伯胺的数目可在约335nm通过分光光计计测量来检测。
交联的珠粒相较于未交联的生物相容性珠粒具有减小的对酶促降解的易感性，从而为珠粒提供了可精细调节的体内停留时间。例如，交联的珠粒抗内源酶例如胶原酶。交联的珠粒的提供为集中在生物材料的开发和产生上的递送系统的部分，所述生物材料促进如下方面的一项或多项：(a)将附着的细胞递送至期望的位置并且产生用于自体组织的再生和向内生长以及血管供应的空间；(b)保持在位置上长至足以允许细胞建立、起作用、重塑它们的微环境和分泌它们自己的细胞外基质(ECM)的能力；(c)促进移植的细胞与周围组织的整合；(d)以大体上固体形式植入细胞的能力；(e)不给组织向内生长或递送的细胞/材料与宿主组织的整合提供显著障碍的短期结构完整性；(f)在体内递送中以大体上固体形式定位，从而在植入过程中阻止细胞在组织内扩散；(g)贴壁依赖性细胞相较于悬浮于液体中的细胞的改善的稳定性和活力；和(h)当i)以大体上固体形式(例如，附着至珠粒)，和ii)以大体上液体形式(例如，悬浮于液体中)递送细胞时双向释放(biphasic release)特征。
在一个实施方案中，本发明提供了包含明胶的交联的珠粒。未交联的明胶珠粒不适合于生物活性细胞制剂，因为它们快速失去完整性，从而细胞从注射位置散逸。相反地，高度交联的明胶珠粒在注射位置保持太长时间，从而可阻止从新ECM分泌、细胞整合和组织再生。本发明允许精细调节交联的珠粒的体内停留时间。为了定制生物材料的生物可降解性，使用不同交联剂浓度的碳二亚胺，然而对于所有样品总体反应条件保持恒定。例如，可通过改变交联剂的浓度(从约0至约1M)来精细地调节碳二亚胺交联的珠粒的酶促易感性。在一些实施方案中，浓度为约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM、约31mM、约32mM、约33mM、约34mM、约35mM、约36mM、约37mM、约38mM、约39mM、约40mM、约41mM、约42mM、约43mM、约44mM、约45mM、约46mM、约47mM、约48mM、约49mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM或约100mM。交联剂浓度还可以是约0.15M、约0.2M、约0.25M、约0.3M、约0.35M、约0.4M、约0.45M、约0.5M、约0.55M、约0.6M、约0.65M、约0.7M、约0.75M、约0.8M、约0.85M、约0.9M、约0.95M或约1M。在另一个实施方案中，交联剂为1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)。在一个实施方案中，EDC-交联的珠粒是明胶珠粒。图10描述了明胶珠粒的EDC介导的交联的代表性示意图，图15举例说明可如何取决于交联剂的浓度，精细调节珠粒的降解%。
交联的珠粒可具有有利于接种、附着或包裹的某些特征。例如，珠粒可具有多孔表面和/或可以大体上是中空的。孔的存在提供了增加的细胞附着表面，从而允许更多数目的细胞附着(相较于无孔或光滑表面)。此外，孔结构可支持宿主组织与多孔珠粒的整合，从而支持从新组织的形成。珠粒具有可拟合相应于一般颗粒分布类型的韦布尔曲线的尺寸分布。在一个实施方案中，交联的珠粒具有小于约120μm、约115μm、约110μm、约109μm、约108μm、约107μm、约106μm、约105μm、约104μm、约103μm、约102μm、约101μm、约100μm、约99μm、约98μm、约97μm、约96μm、约95μm、约94μm、约93μm、约92μm、约91μm或约90μm的平均直径。交联的珠粒的特征取决于铸造工艺而变化。例如，将其中利用薄层色谱试剂喷雾器(ACEGlassware)，将气流用于雾化液体明胶溶液，将其喷射进入液氮的方法用于提供具有前述特征的珠粒。本领域技术人员将理解，调节铸造工艺的参数提供了定制不同的珠粒特征例如不同尺寸分布的可能性。
在配制之前，使用其中将珠粒与相应于终生物活性细胞制剂的细胞一起培养的细胞培养技术评估交联的珠粒的细胞相容性。例如，在制备生物活性肾细胞制剂之前将珠粒与原代肾细胞一起培养，使用活细胞/死细胞测定来确认细胞相容性。
在某些制剂中，将生物相容性交联的珠粒与温度敏感性生物材料以约5%(w/w)至约15%(w/w)的溶液体积组合在溶液中。交联的珠粒可以以约5%(w/w)、约5.5%(w/w)、约6%(w/w)、约6.5%(w/w)、约7%(w/w)、约7.5%(w/w)、约8%(w/w)、约8.5%(w/w)、约9%(w/w)、约9.5%(w/w)、约10%(w/w)、约10.5%(w/w)、约11%(w/w)、约11.5%(w/w)、约12%(w/w)、约12.5%(w/w)、约13%(w/w)、约13.5%(w/w)、约14%(w/w)、约14.5%(w/w)或约15%(w/w)的溶液体积存在。
在另一个方面，本发明提供了包含生物材料的制剂，所述生物材料在大约数分钟、数小时或数天的一段时间内降解。这与集中在固体材料的植入上的大量工作相反，所述固体材料在数天、数周或数月内缓慢降解。
在另一个方面，本发明提供了具有接种有生物活性细胞的生物相容性交联的珠粒以及递送基质的制剂。在一个实施方案中，递送基质具有下列特征的一个或多个特征：生物相容性、生物可降解的/生物可吸收的(bioresorbable)、在植入受试者之前和过程中大体上固体状态、植入后结构完整性(大体上固体状态)的丢失以及支持细胞活力的细胞相容性环境。递送基质在植入过程中使植入的颗粒(例如，交联的珠粒)保持隔开的能力增强了自体组织的向内生长。如果递送基质不存在，那么在植入过程中分裂成许多小室的珠粒的压紧可导致不能为充分的组织向内生长提供足够的空间。递送基质有利于固体制剂的植入。此外，结构完整性的更短的持续时间意味着在植入后不久，基质不会明显地阻碍组织向内生长或递送的细胞/材料与宿主组织的整合。递送基质提供了本文中描述的制剂的定位，因为固体单位的插入在植入过程中帮助阻止递送的材料在组织内扩散。对于基于细胞的制剂，固体递送基质改善了贴壁依赖性细胞的稳定性和活力(相效于悬浮于液体中的细胞)。
在一个实施方案中，递送基质是未接种有细胞的生物相容性珠粒的群体。在另一个实施方案中，未接种的珠粒分散在整个个别接种了细胞的珠粒中和所述珠粒之间。未接种的珠粒在移植之前和刚移植后用作接种了细胞的珠粒之间的“间隔珠粒”。间隔珠粒包含温度敏感性生物材料，所述生物材料在第一温度下具有大体上固体状态并且在第二温度下具有大体上液体状态，其中第一温度低于第二温度。例如，间隔珠粒包含在约环境温度或更低温度下具有大体上固体状态并且在约37℃下具有大体上液体状态的生物材料，例如本文中描述的生物材料。在一个实施方案中，环境温度为约室温。在另一个实施方案中，生物材料是明胶溶液。明胶溶液以约4%、约4.5%、约5%、约5.5%、约6%、约6.5%、约7%、约7.5%、约8%、约8.5%、约9%、约9.5%、约10%、约10.5%或约11%,(w/v)存在。明胶溶液可提供于PBS、细胞培养基(例如，DMEM)或其它适当的溶剂中。
在一个方面，本发明提供了包含生物材料的制剂，将所述生物材料以大体上固体形式(例如，间隔珠粒)植入，在植入身体后，所述制剂随后液化/熔化或另外地丢失结构完整性。这与集中在可以作为液体注射，随后在体内固化的材料的用途的大量工作相反。
可在配制之前体外评估间隔珠粒的温度敏感性。可标记间隔珠粒，将其与未标记的非温度敏感性珠粒混合。随后将混合物在37℃孵育以观察物理过渡的变化。随时间过去观察到标记的温度敏感性珠粒在更高温度下丢失形状。例如，温度敏感性明胶珠粒可利用阿辛蓝染粒来制造，以用作物理过渡的标志物。将蓝色明胶珠粒与CultispherS珠粒(白色)混合，加载至导管内，随后挤出，在37℃下于1X PBS,pH7.4中进行孵育。随后在不同时间点上通过显微镜术观察蓝色明胶珠粒的形状的丢失。蓝色明胶珠粒的物理状态的改变在30分钟后可见，并且随着延长的孵育时间变得更明显。由于材料的粘性，珠粒不完全分散(图2)。
本文中描述的生物活性细胞制剂可用于制备用于注射至肾中的基于肾细胞的制剂。然而，本领域技术人员将理解，制剂将适用于许多其它类型的生物活性细胞群体。例如，本发明涉及用于注射入任何实体器官或组织的生物活性细胞的制剂。
在一个方面，本文中描述的生物活性细胞制剂可包含设定数目的细胞。在一个实施方案中，用于制剂的细胞的总数为约104、约105、约106、约107、约108或109个。在一个实施方案中，用于本文描述的制剂的细胞的剂量可基于靶器官或组织的估计的质量或功能质量(functional mass)来计算。在某些实施方案中，本发明的生物活性细胞制剂包含对应于基于宿主器官(其将为利用制剂治疗的受试者)的重量的细胞数目的剂量。例如，生物活性肾细胞制剂基于约150克的人肾的平均重量。在一个实施方案中，每克(g)肾的细胞数目为约600个细胞/g至约7.0x107个细胞/g。在一些实施方案中，每克肾的细胞数目为约600个细胞/g、约1000个细胞/g、约1500个细胞/g、约2000个细胞/g、约2500个细胞/g、约3000个细胞/g、约3500个细胞/g、约4000个细胞/g、约4500个细胞/g、约5000个细胞/g、约5500个细胞/g、约6000个细胞/g、约6500个细胞/g、约7000个细胞/g、约7500个细胞/g、约8000个细胞/g、约8500个细胞/g、约9000个细胞/g、约9500个细胞/g或约10,000个细胞/g。
在其它实施方案中，每克肾的细胞数目为约1.5x104个细胞/g、约2.0x104个细胞/g、约2.5x104个细胞/g、约3.0x104个细胞/g、约3.5x104个细胞/g、约4.0x104个细胞/g、约4.5x104个细胞/g、约5.0x104个细胞/g、约5.5x104个细胞/g、约6.0x104个细胞/g、约6.5x104个细胞/g、约7.0x104个细胞/g、约7.5x104个细胞/g、约8.0x104个细胞/g、约9.5x104个细胞/g。
在其它实施方案中，每克肾的细胞数目为约1.0x105个细胞/g、约1.5x105个细胞/g、约2.0x105个细胞/g、约2.5x105个细胞/g、约3.0x105个细胞/g、约3.5x105个细胞/g、约4.0x105个细胞/g、约4.5x105个细胞/g、约5.0x105个细胞/g、约5.5x105个细胞/g、约6.0x105个细胞/g、约6.5x105个细胞/g、约7.0x10s个细胞/g、约7.5x105个细胞/g、约8.0x105个细胞/g、约8.5x105个细胞/g、约9.0x105个细胞/g或约9.5x105个细胞/g。
在其它实施方案中，每克肾的细胞数目为约1.0x106个细胞/g、约1.5x106个细胞/g、约2.0x106个细胞/g、约2.5x106个细胞/g、约3.0x106个细胞/g、约3.5x106个细胞/g、约4.0x106个细胞/g、约4.5x106个细胞/g、约5.0x106个细胞/g、约5.5x106个细胞/g、约6.0x106个细胞/g、约6.5x106个细胞/g、约7.0x106个细胞/g、约7.5x106个细胞/g、约8.0x106个细胞/g、约8.5x106个细胞/g、约9.0x106个细胞/g、约9.5x106个细胞/g、1.0x107个细胞/g或约1.5x107个细胞/g。
可选择用于制剂的细胞的总数，可调整制剂的体积以达到适当的剂量。
在一些实施方案中，制剂可包含给受试者的细胞的剂量，所述剂量是单次剂量或单次剂量加额外剂量。在其它实施方案中，剂量可以通过本文中描述的构建体来提供。本文中描述的肾细胞群体或肾细胞群体的混合物的治疗有效量可从被受试者安全接受的细胞的量大量变化至治疗肾病例如一个或多个肾功能的稳定化、减小的衰退率(rate-of-decline)或增强所必需的细胞的最少量。
可将治疗有效量的本文中描述的肾细胞群体或其混合物悬浮于药学上可接受的载体或赋形剂中。这样的载体包括但不限于基础培养基加1%血清白蛋白、盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、胶原、藻酸盐、透明质酸、纤维蛋白胶、聚乙二醇、聚乙烯醇、羧甲基纤维素及其组合。制剂应当适合于施用模式。
因此，本发明提供了包含肾细胞群体或其混合物(例如单独的或与B3和/或B4或B4’细胞群体混合的B2细胞群体)的制剂用于制造用于治疗受试者的肾病的药剂的用途。在一些实施方案中，药剂还包含重组多肽例如生长因子、趋化因子或细胞因子。在其它实施方案中，药剂包含人肾来源的细胞群体。可使用提供的本文中描述的方法的任何变型分离、衍生或富集用于制造药剂的细胞。
根据常规方法将肾细胞制剂或其混合物或组合物配制为适合于给人类施用的药物组合物。通常，用于静脉内施用、动脉内施用或肾被膜内施用的组合物例如为无菌等渗缓冲水溶液中的溶液。必要时，组合物还可包括局部麻醉剂以缓和注射位置上的任何疼痛。一般地，可分开地或混合在一起以单位剂量形式(例如，作为密封于容器例如标示活性剂的量的安瓿中的冷冻保藏的浓缩物)提供成分。当将要通过输注施用组合物时，可利用含有无菌药物级水或盐水的输液瓶将其分散。当通过注射施用组合物时，可提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便在施用之前混合成分。
药学上可接受的载体部分通过待施用的具体组合物以及通过用于施用组合物的具体方法来确定。因此，存在许多适当的药物组合物的制剂(参见，例如，Alfonso RGennaro(编),Remington:The Science and Practice of Pharmacy,先前为Remington'sPharmaceutical Sciences，第20版,Lippincott,Williams&Wilkins,2003,通过引用整体并入本文)。通常将药物组合物配制为无菌的，大体上等渗的并且完全遵从美国食品和药物管理局的所有优质生产规范(Good Manufacturing Practice)(GMP)条例。
本发明的一个方面还提供了药物制剂，其包含本发明的肾细胞群体，例如单独的或与B3和/或B4或B4’细胞制剂组合的B2细胞群体，以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，制剂包含104至109个哺乳动物肾来源的细胞。
缓释制剂
在一个方面，本发明的制剂以缓释制剂的形式提供。一般地，缓释的特征在于在施用后第一活性剂的初始释放，随后至少一种另外的第二活性剂的随后释放。第一和第二活性剂可以相同或它们可以不同。在一个实施方案中，制剂通过相同制剂中的多个组分提供缓释。在另一个实施方案中，缓释制剂包含作为第一组分的部分的活性剂，所述第一组分允许活性剂自由地在整个制剂的体积中移动，从而允许在施用后在靶位置上立即释放。第一组分可以是具有大体上液相和大体上固相的温度敏感性生物材料，其中第一组分在施用时以大体上液相存在。在一个实施方案中，活性剂以大体上液相存在以便其充分自由地在整个制剂的体积中移动，从而在施用后立即释放至靶位置。
在另一个实施方案中，缓释制剂具有作为第二组分的部分的活性剂，其中将活性剂附着至第二组分、沉积在其上、利用其包被、包埋在其中、接种在其上或被捕获在其中，所述第二组分在施用之前和之后保持在靶位置。第二组分包含活性剂能够与其结合，从而在施用时阻止活性剂从第二组分立即释放的结构元件。例如，第二组件以大体上固体形式例如生物相容性珠粒提供，可将其交联以阻止或延迟体内酶促降解。在一个实施方案中，以大体上固相中的活性剂在施用之前和之后在制剂内保持其结构完整性，从而其在施用后不立即将活性剂释放至靶位置。用于缓释制剂的适当载体已在本文中进行了描述，但本领域技术人员将理解适合用于本发明的其它载体。
在一个实施方案中，制剂提供了递送的元件(包括细胞、纳米颗粒、治疗分子等)的初始快速递送/释放，随后提供元件的后来的延迟释放。可设计本发明的制剂的这样的双向释放特征，其中以未附着的形式(例如，溶液中的细胞)和附着的形式(例如，与珠粒或另一种适当的载体一起的细胞)提供待递送的试剂。在初始施用后，立即将没有阻碍的试剂提供至递送的位置，然而延迟释放被阻碍的试剂直至载体(例如，珠粒)的结构完整性消失，在该点上，先前附着的试剂被释放。如下文中所述，本领域技术人员将理解其它适当的释放机制。
可基于活性剂的性质调整释放的时间延迟。例如，生物活性细胞制剂的释放的时间延迟可以是大约数秒、数分钟、数小时或数天。在一些情况下，约数周的延迟可以是适当的。对于其它活性剂例如小分子或大分子，制剂的释放的时间延迟可以是大约数秒、数分钟、数小时、数天、数周或数月。制剂还可能包含提供不同的时间延迟释放特征的不同的生物材料。例如，具有第一活性剂的第一生物材料可具有第一释放时间，具有第二活性剂的第二生物材料可具有第二释放时间。第一和第二活性剂可是以相同的或不同的。
如本文中所述，延迟释放的时间期限可以通常相应于生物材料的结构完整性的丢失的时间期限。然而，本领域技术人员将理解延迟释放的其它机制。例如，活性剂可不依赖于任何特定生物材料的降解时间而随时间过去连续释放，例如，药物从聚合物基质的扩散。此外，生物活性细胞可从包含生物材料和生物活性细胞的制剂迁移至自体组织。在一个实施方案中，生物活性细胞迁移出生物材料(例如珠粒)，到达自体组织。
可使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯和聚乳酸。注射制剂的延长的吸收可通过将延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶包含在制剂中来实现。用于制备此类制剂的许多方法已申请了专利或对于本领域技术人员来说通常是已知的。参见，例如，Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems,J.R.Robinson,编,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。适用于多肽试剂的受控或延长释放的另外的方法描述于例如美国专利No.6,306,406和6,346,274中，以及例如美国专利申请No.US20020182254和US20020051808中，将所有所述专利或专利申请通过引用并入本文。
9.施用的方法和途径
可单独地施用或与其它生物活性组分组合地施用本发明的生物活性细胞制剂。制剂适合于整合的组织工程元件至实体器官的内部的注射或植入，以再生组织。此外，制剂用于组织工程元件至中空器官的壁的注射或植入以再生组织。
在一个方面，本发明提供了给有此需要的受试者提供本文中描述的生物活性细胞制剂的方法。在一个实施方案中，生物活性细胞的来源可以是自体的或同种异体的、同基因的(自体的或等基因的)及其任意组合。在其中来源不是自体的情况下，方法可包括施用免疫抑制剂。适当的免疫抑制药包括但不限于硫唑嘌呤、环磷酰胺、咪唑立宾、环孢素、他克莫司水合物、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯苯扎利二钠、金诺芬、前列地尔、盐酸胍立莫司、biosynsorb、muromonab、阿来法塞、喷司他丁、达珠单抗、西罗莫司、麦考酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil)、eflonomide、巴利昔单抗(basiliximab)、链道酶α、bindarid、克拉屈滨、吡美莫司、伊洛白介素、西利珠单抗、依法珠单抗、依维莫司、阿尼莫司、加维莫单抗、法拉莫单抗、氯法拉滨、纳巴霉素、西利珠单抗、saireito、LDP-03、CD4、SR-43551、SK&F-106615、IDEC-114、IDEC-131、FTY-720、TSK-204、LF-080299、A-86281、A-802715、GVH-313、HMR-1279、ZD-7349、IPL-423323、CBP-1011、MT-1345、CNI-1493、CBP-2011、J-695、LJP-920、L-732531、ABX-RB2、AP-1903、IDPS、BMS-205820、BMS-224818、CTLA4-1g、ER-49890、ER-38925、ISAtx-247、RDP-58、PNU-156804、LJP-1082、TMC-95A、TV-4710、PTR-262-MG和AGI-1096(参见美国专利No.7,563,822)。本领域技术人员将理解其它适当的免疫抑制药。
本发明的治疗方法包括本文中描述的生物活性细胞制剂的递送。在一个实施方案中，细胞至期望有益的位置的直接施用是优选的。有此需要的受试者还可通过将自体肾与本文中描述的生物活性细胞制剂以及从一种或多种富集的肾细胞群体和/或混合物或包含所述细胞群体的构建体分泌的产物体内接触来进行治疗。
可通过使用/施用包含一组(a population of)来自细胞培养基例如条件培养基的分泌产物的制剂或通过植入能够在体内分泌产物的富集的细胞群体和混合物或构建体来实现将自体肾在体内与分泌产物接触的步骤。体内接触的步骤给自体肾提供了再生作用。
根据本说明书，许多用于将细胞和/或分泌产物施用给受试者的方法对于本领域技术人员来说是显然的。此类技术包括细胞至受试者的靶位置内的注射。
可将细胞和/或分泌产物插入递送装置或媒介物，所述装置或媒介物通过注射入或植入受试者来促进引入。在某些实施方案中，递送媒介物可包括天然材料。在某些其它实施方案中，递送媒介物可包括合成材料。在一个实施方案中，递送媒介物提供模拟或适当地拟合入器官结构的结构。在其它实施方案中，递送媒介物在自然界中为流体样的。此类递送装置可包括用于将细胞和流体注射入接受者的身体的管，例如导管。在优选实施方案中，管额外地具有针，例如，注射器，通过其可将本发明的细胞在期望的位置上引入受试者。在一些实施方案中，哺乳动物肾来源的细胞群体被配制来利用导管(其中术语“导管”意欲包括任何各种用于将物质递送至血管的管状系统)施用至血管中。或者，可将细胞插入生物材料或支架(包括但不限于纺织品，例如编织物、织物、穗带(braid)、网丝(meshes)及非纺布(non-wovens)、有孔软片(perforated film)、海绵和泡沫以及珠粒，例如实心或多孔珠粒、微粒、纳米颗粒等(例如，Cultispher-S明胶珠粒-Sigma))或插在其上。可以多种不同的形式制备用于递送的细胞。例如，可将细胞悬浮于溶液或凝胶中。可将细胞与药学上可接受的载体或稀释剂混合，在所述载体或稀释剂中本发明的细胞保持活力。药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、缓冲水溶液、溶剂和/或分散介质。此类载体和稀释剂的用途在本领域是公知的。溶液优选为无菌的和流动的，并且通常为等渗的。优选，溶液在制造和贮存的条件下是稳定的并且通过使用例如对羟基苯甲酸、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等抵抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。本领域技术人员将理解，用于递送本发明的细胞群体及其混合物的递送媒介物可包括上述特征的组合。
包含分离的肾细胞群体例如单独的或与B4’和/或B3混合的B2细胞群体的制剂的施用模式包括但不限于全身性、肾内(例如，肾实质)、静脉内或动脉内注射和直接至期望的活性位置上的组织的注射。待按照本发明使用的其它施用模式包括通过直接剖腹术、通过直接腹腔镜检查、经腹或经皮的单次或多次注射。待按照本发明使用的其它施用模式包括例如逆行输注和输尿管肾盂输注。手术施用法包括一步法例如但不限于肾部分切除术和构建体植入、肾部分切除术、髌骨部分切除术、利用网膜(omentum)±腹膜(peritoneum)的血管形成、多病灶活检针轨迹(multifocal biopsy needle track)(圆锥体或锥体至圆柱体)以及肾柱状置换(renal pole-like replacement)，以及两步法包括例如用于再种(replanting)的类器官-内部生物反应器(organoid-internal bioreactor)。在一个实施方案中，通过相同途径同时包含递送细胞的混合物的制剂。在另一个实施方案中，将每一种包含受控混合物的细胞组合物分开地递送至特定的位置或通过特定方法同时或以时间上受控的方式，通过一种或多种本文中描述的方法递送至特定的位置。
可与细胞的活性例如EPO生成相关的现有信息确定，或从在临床前研究中进行的给药研究推断人的适当细胞植入剂量。根据体外培养和体内动物实验，可定量细胞的量，并且将所述量用于计算植入材料的适当剂量。或者，可监测患者以确定可进行额外的植入还是相应地减少植入的材料。
可将一种或多种其它组分添加至本发明的细胞群体及其混合物中，包括选择的细胞外基质组分，例如本领域已知的一种或多种类型的胶原或透明质酸，和/或生长因子、富含血小板的血浆和药物。
本领域技术人员将理解适合于本文中描述的分泌产物的各种制剂和施用方法。
10.制品和试剂盒
本发明还包括试剂盒，所述试剂盒包括本发明的聚合物基质和支架以及相关材料，和/或细胞培养基及使用说明书。使用说明书可以包括例如培养细胞或施用细胞和/或细胞产物的说明书。在一个实施方案中，本发明提供了包括本文中描述的支架和说明书的试剂盒。在另一个实施方案中，试剂盒包括用于检测标志物表达的试剂、用于药剂的使用的试剂(reagents for use of the agent)和使用说明书。该试剂盒还可用于测定植入或施用本文中描述的细胞群体、混合物或构建体后受试者的自体肾的再生预后的目的。试剂盒还可用于测定本文中描述的细胞群体、混合物或构建体的生物治疗功效。
本发明的另一个实施方案是包含用于治疗有此需要的受试者的生物活性细胞的制品。制品包括容器和在容器上的或与容器结合的标签或包装说明书。适当的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由多种材料例如玻璃或塑料形成。容器装有对于治疗病况是有效的组合物并且可具有无菌进入孔(access port)(例如容器可以是具有可利用注射针刺穿的塞子的溶液袋或小瓶)。制剂中的至少一种活性剂是本发明的生物活性细胞群体。标签或包装说明书显示将制剂用于治疗特定病况。标签或包装说明书还包括用于将制剂给患者施用的说明书。还涉及包括本文中描述的组合疗法的制品和试剂盒。包装说明书是指通常包括在治疗性产物的商业包装中的说明书，其包含关于有关此类治疗性产物的使用的适应征、用法、剂量、施用、禁忌和/或警告的信息。在一个实施方案中，包装说明书显示将制剂用于治疗疾病或病症，例如肾疾病或病症。其还可包括其它期望的材料(从商业和用户角度来看)，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。还提供了用于各种目的例如用于评估再生结果的试剂盒。可提供试剂盒，所述试剂盒包括用于尿来源的囊泡和/或其内容物例如核酸(例如miRNA)、囊泡、外来体等(例如本文中描述的)的检测试剂。检测试剂包括但不限于核酸引物和探针，以及用于期望的靶的体外检测的抗体。与制品一样，试剂盒包括容器和容器上或与容器结合的标签或包装说明书。容器装有包含至少一种检测试剂的组合物。可包括装有例如稀释剂和缓冲液或对照检测剂的另外的容器。标签或包装说明书可提供组合物的描述以及期望的体外、预后或诊断用途的说明书。
11.报告
本发明的方法，当为了商业目的而被实施时，通常产生生成再生预后的报告或概要。本发明的方法将生成包括在包含本文中描述的细胞群体、混合物或构建体的制剂的任何施用或植入之前和之后再生的可能过程或结果的预测的报告。报告可包括关于与预后有关的任何指标的信息。本发明的方法和报告还可包括将报告存储在数据库中。或者，方法还可在数据库中生成受试者的记录和填充记录数据。在一个实施方案中，报告为纸媒报告，在另一个实施方案中，报告为听觉报告(auditory report)，在另一个实施方案中报告为电子记录。预期报告被提供给医生和/或患者。报告的接受还可包括建立至包括数据和报告的服务器计算机的网络连接以及从服务器索要数据和报告。由本发明提供的方法还可以进行完全或部分自动化。
本文中举例说明描述的本发明适当地可在本文中未明确公开的任何要素、限制不存在的情况下进行实施。因此，例如，在本文中的每一种情况下，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”可用另外两个术语的任一个替换。因此，对于使用所述术语之一的本发明的实施方案，本发明还包括其中这些术语之一被这些术语的另一个替换的另一个实施方案。在每一个实施方案中，术语具有它们确定的含义。因此，例如，一个实施方案可包括“包含”许多种组分的制剂，另一个实施方案可包括“基本上由相同组分组成”的制剂，第三实施方案可包括“由相同组分组成的”制剂。已使用的术语和表达用作说明的术语并且不具有限制性，在此类术语和表达的使用中无意排除显示和描述的性质的任何等同物或其部分，但应承认各种变动可能在所述发明的范围内。因此，应当理解，虽然已通过优选实施方案和任选的性质明确地公开了本发明，但本文中公开的概念的任选性质、变动和变化可求助于本领域技术人员，并且此类变动和变化被认为在由所附权利要求确定的本发明的范围内。
前述书面描述被认为足以使得本领域技术人员能够实施本发明。下列实施例仅被提供用于举例说明目的，并且无意以任何方式限定本发明的范围。事实上，根据前述说明，除本文中显示和描述的变动外的本发明的各种变动对于本领域技术人员来说将变得显然，并且落在所附权利要求的范围内。
本说明书中引用的所有专利、专利申请和文献参考资料通过引用整体并入本文。
实施例
实施例1：具有短期结构完整性的递送基质的用途
在研究新型生物材料/细胞系统和评估它们在我们的啮齿类动物注射模型中的性能的方法中，我们设计和开发了用于产生基于明胶的热逆变珠粒，以及热逆变明胶连续相递送基质的方法，所述珠粒或明胶连续相递送基质可产生围绕分裂为许多小室的珠粒、细胞聚集体或单细胞悬浮物的拟生态的微环境，允许细胞诱导的细胞外基质重塑、细胞间相互作用、细胞迁移、增殖和组织再生。我们已明确地证明了以明胶溶液的形式存在的递送基质技术的效用，所述明胶溶液在室温或低于室温下是固体并且在体温下是液体。该热逆变注射基质已被用于将游离细胞、细胞聚集体、微载体珠粒上的细胞以及游离细胞与微载体上的细胞的混合物植入大鼠肾的实质。
方法
珠粒制造。在去离子水中制备10%w/v的明胶溶液(Gelita,Inc.,Sioux City,IA)，随后利用薄层色谱试剂喷雾器(thin layer chromatography reagent sprayer)通过空气将其喷射入液氮(LN2)。使LN2在化学通风橱(chemical fume hood)中蒸发，收集珠粒。
生物材料的细胞相容性和体内植入。将哺乳动物细胞活力/细胞毒性试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)与荧光显微照片成像术结合用于评估细胞相容性。进行利用与Cultispher S珠粒混合的间隔珠粒注射的肾的组织学分析(植入后1周)以评估珠粒的生物相容性及它们的空间产生能力。利用Masson’s Trichrome(其将胶原染成蓝色)或苏木精和伊红(H&E)对组织学载片进行染色。评估图像的阳性指标(组织内向生长，1个月时的最少至无可检测的生物材料和健康组织)和阴性指标(巨噬细胞、巨细胞和其它炎症细胞的存在；支持纤维包膜(fibrotic capsule)形成和集合管尺寸的增加的生物材料的持久性)。
结果
热逆变珠粒
从具有允许材料在低于25℃的温度下胶化/固化并且在30℃以上液化的浓度的猪明胶溶液产生珠粒。观察到未交联的明胶珠粒(蓝色)的温度反应。将阿辛蓝染料包含在初始明胶溶液中以用作物理过渡(physical transition)的标志物。随后将蓝色明胶珠粒与商购可得的微载体珠粒(白色)混合，加载至导管内，随后挤出，在37℃下于1X PBS,pH7.4中进行孵育。随后在不同时间点上通过显微镜术观察蓝色明胶珠粒的形状的丢失。蓝色明胶珠粒的物理状态的改变在30分钟后可见，并且随着延长的孵育时间变得更明显。由于材料的粘性，珠粒不完全分散(图1)。
热逆变递送基质
将热逆变注射基质与以液体状态存在的待递送的元件组合，置于管状导管内，冷却至低于室温以使基质胶化。在荧光显微照片图像中，使用哺乳动物细胞活力/细胞毒性试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)染色，该染色显示染成绿色的活细胞和染成红色的死细胞(图2-6)。我们发现包埋在热逆变注射基质中的细胞在冷却以胶化基质后仍然有活力。其中植入了包含微载体珠粒的基质的组织的组织学分析(植入后1周)显示微载体珠粒为深紫色结构。基质材料在该载片上是不可见的，不存在其是组织向内生长的障碍的证据(图7)。
基质的结构完整性的丢失的图解示于图8中。基质在室温下不流动，但在37℃下流动。基质材料的观察到的特征和性质将允许在许多组织工程和再生医学应用中递送整合的元件。具体地，本发明利用如下益处：1)植入前和植入期间的结构完整性，以及2)在植入后不久在一些位点上结构的丢失，以通过受控的操作、放置或分散将材料递送至组织或器官的靶位置而不防碍或阻碍整合的元件与其所被置入的组织或器官的相互作用。
实施例2：通过化学交联定制生物材料的酶促易感性
为了定制生物材料对内源胶原酶的酶促易感性，可将基于猪明胶的热逆变珠粒的产生(如上文实施例1中所描述的)进一步化学交联至不同程度，以调节它们的体内停留时间。这也允许材料用作分开的组织再生构建体(例如接种在载体珠粒上的细胞)之间的间隔子，从而有利于组织向内生长和产生拟生态小生境(niche)。此外，该材料具有用作细胞、药物或其它分子的递送系统的潜能。为此，我们选择使用良好表征和广泛使用的试剂N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。该零长度交联剂促进空间上相邻的羧基与位于分子内或分子间的伯胺官能团之间的酰胺键的形成(图9)。
方法
材料。低内毒素明胶购自Gelita,Inc.,Sioux City,IA。苦基磺酸溶液(TNBS)和N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)来自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO。哺乳动物细胞活力/细胞毒性试剂盒来自Invitrogen,Carlsbad,CA。氢氧化钠(NaOH)、氯化钙(CaCl2)和2-[吗啉代]乙磺酸、0.9%NaCl,pH4.7(MES)缓冲液来自Fisher Scientific,Pittsburgh,PA。胶原酶IV来自Worthington Biochemical Corp.,Lakewood,NJ以及分散酶I(4U/ml)来自Stemcell Technologies,Vancouver,BC。达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)、角质细胞-无血清培养基(角质细胞-SFM)和磷酸缓冲盐溶液(PBS)来自Invitrogen/Gibco,Carlsbad,CA。
化学交联。将冻干的明胶珠粒悬浮于0.1M MES缓冲液，pH4.7(Thermo FisherScientific,Rockford,IL)(20ml缓冲液/克珠粒)，再水化1-3小时，优选在4℃下进行。随后除去缓冲液(基于化学反应的pH和缓冲需要选择的)，利用等于珠粒体积的EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)/MES pH7.4溶液制备1:1(v/v)的悬浮液，其中EDC浓度范围为10-100mM，在短暂的涡旋后，将悬浮液在室温下在静止状态下孵育过夜。随后，将珠粒过虑，用去离子水(洗涤体积=20X珠粒体积)进行洗涤，随后冷冻和冷冻干燥。
体外酶促降解测定。通过它们对胶原酶/分散酶消化的易感性测定利用不同浓度的EDC交联的珠粒的降解速率，将其与商购可得的珠粒相比较。称取和交联的珠粒的重量，将其悬浮于PBS,pH7.4中至～20mg/ml的浓度。向0.5ml体积的珠粒悬浮液中添加50μl的具有0.5mM CaCl2的30U/ml胶原酶/分散酶混合物(Thermo Fisher Scientific)，随后涡旋样品，在37℃于振荡器(n=3，对于每一个使用的交联剂浓度)上孵育1小时。随后，收集20μl来自部分消化的样品的上清液，使用改进的Bradford测定(其中将染料对蛋白质的比率设置至1:9v/v以增加其灵敏性)评估其可溶性蛋白质含量。如上所述将剩余的消化混合物孵育过夜，与针对总蛋白质含量测定类似地测定所述混合物。将这些值用于标准化部分消化的样品的值。从明胶标准曲线(通过将从已知量的明胶制备的溶液的A595值(将所述明胶完全消化，随后利用Bradford试剂测量)作图获得的)计算样品的总蛋白质的量。将样品的总蛋白质的量当作100%，将通过部分消化获得的蛋白质的量相对于100%进行标准化。降解可计算为1小时时可溶性蛋白质/总可溶性蛋白质(如通过Bradford测定测量的)的比率。
胺的定量。通过向每一个小瓶(终pH值为～8.5)中添加5μl1MNaOH来升高完全消化的交联的珠粒溶液(如上所述获得的)的pH(n=3)。随后，将TNBS添加至每一个样品中至0.25%w/v的终浓度，将小瓶在振荡器上在37℃下孵育2小时。随后利用板读数器测定A335值，针对先前测定的(上文中描述的)的每一个样品的每毫克蛋白质对值进行标准化。从明胶标准曲线(通过将从已知量的明胶制备的溶液的A595值(将所述明胶完全消化，随后利用Bradford试剂测量的)作图获得的)计算样品的总蛋白质的量。
珠粒筛分。为了缩窄尺寸分布，将交联的珠粒悬浮于70%v/v乙醇中，利用连续滤过，通过具有确定孔径的尼龙网，筛分至64-250μm。
形态学和尺寸分布。将冻干的珠粒用于碳粘贴的残端(carbon taped stubs)(溅射涂覆的)，利用Philips515扫描电子显微镜(SEM)成像。通过分析10个SEM图像和汇集500个珠粒的测量(n=500)来测定珠粒的尺寸分布。
结果
通过将浓缩的明胶溶液喷射至液氮内，冻干所得的珠粒，随后将它们与碳二亚胺反应来获得基于明胶的化学交联的多孔珠粒。通过改变交联溶液的浓度(从0至1M EDC)，我们能够控制效联的程度以及合成具有可精细调节的酶促易感性的珠粒。
利用SEM分析喷射的珠粒的形态学和尺寸分布(图10A-B)。珠粒表现为具有多孔表面和大体上中空核心的球状体。水合或交联不影响珠粒的物理性质(结果未显示)。总群体的尺寸分布遵循对于颗粒是特异性的韦布尔分布特征谱，大部分珠粒直径小于100μm，通常在50-75μm的范围内(图11)。该形态学和尺寸范围与我们先前的肾组织工程靶向筛选研究(Basu同上2011)一致。
此外，珠粒的内部是中空的，这可使它们适合于作为微载体的各种应用。珠粒的总表面具有在湿润状态(因水化而导致的)更明显的多孔外观(图12A-B)。孔的存在转化成增加的细胞附着表面，增加的细胞附着表面相较于具有光滑表面的对应物允许更多数目的细胞附着。前述物理性质，特别地珠粒尺寸，高度依赖于铸造工艺。在该情况下，利用薄层色谱试剂喷雾器(ACE Glassware)，通过使用气流雾化液体明胶溶液并且将其喷射至液氮内来获得珠粒。与该方法相关的参数的调整可导致不同的尺寸分布。
在生理条件下，未交联的明胶珠粒在数分钟内失去它们的完整性，这限制了它们作为载体的适用性范围。目标是开发可将细胞递送至期望的位置同时也将它们保持在原位(直至它们开始在新环境中整合)的载体系统。此外，载体可通过外源与内源细胞的局部协调的相互作用介导再生过程。为此目的，通过使用一系列碳二亚胺浓度共价交联明胶。交联的程度可通过利用比色法定量在反应完成后仍然存在于明胶中的伯胺的数目来进行测定(图13A-B)。
利用低浓度的EDC处理的珠粒预期具有更多数目的游离伯胺，然而利用高浓度的交联剂处理的样品使大多数伯胺参与酰胺键。通过伯胺与苦基磺酸之间共价键合产生的橙色(可在335nm通过分光光度计测量检测的)的强度与存在于样品中的伯胺的数目成正比。当针对每毫克存在于样品中的蛋白质进行标准化时，我们的结果显示存在的游离胺的数目与用于交联的EDC的初始浓度之间存在良好的负相关。该结果显示差异珠粒交联(通过反应中使用的碳二亚胺的量控制的).
我们假设可与化学交联的程度成比例地改变明胶珠粒对生理参数例如酶促降解的易感性。为了测试该假说，对差异交联的珠粒进行部分酶促降解，将数据针对每总样品量进行标准化。通过开发基于最优化的Bradford试剂测定的筛选测试来体外评估可调节的酶促易感性。将样品与30U的胶原酶/分散酶混合物孵育1小时，随后测定其降解(n=3)。将值针对样品中的明胶总量(如在完全酶促降解(过夜)后测定的)进行标准化。ANOVA统计分析P=0.0008。对胶原酶/分散酶的暴露从Cultispher和交联的明胶珠粒释放了不同量的可溶性蛋白质。对于明胶珠粒，这些体外降解速率与用于交联的EDC浓度良好关联。交联的明胶珠粒的降解速率与对于胶原酶/分散酶混合物的1小时暴露后的EDC交联剂的浓度大致成正比。我们的结果显示，与我们的假说一致，具有最高交联程度的样品是对酶促降解最不易感的，并且消化速率与反应中使用的EDC浓度良好关联(R2=0.97)(图14A-B)。结果表明交联的珠粒的体内停留时间将与交联的程度关联。
实施例3–分裂为许多小室的交联的珠粒的验证
在将生物材料直接显微注射进入健康成年大鼠的肾后，在体外和体内评估交联的珠粒的生物降解能力。为了解决交联的珠粒的细胞相容性，在动态条件下在交联的珠粒上培养原代大鼠肾细胞。24小时后，测定珠粒的细胞活力。不将未交联的珠粒包括在本测定中，因为它们在培养条件(37℃的温度)下溶解。
方法
选择的肾细胞(SRC)的制备。利用汉克斯平衡盐溶液(Hanks Balanced SaltSolution)(HBSS)洗涤生物活检组织，切碎，称重，在由4个单位的HBSS中的分散酶1(Dispase1)、300个单位/ml的IV型胶原酶和5mM CaCl2组成的缓冲液中进行离解。在含有5%(v/v)FBS的高葡萄糖(4.5g/L)DMEM:KSFM的1:1混合物中洗涤所得的细胞悬浮物，随后重悬浮于含有5%(v/v)FBS、2.5μg人重组表皮生长因子1-53(rEGF1-53)、25mg牛垂体提取物(BPE)、1X ITS(胰岛素/转铁蛋白/硒)以及含有1X抗生素/抗霉菌素(用于涂板)的高蔗糖(4.5g/L)DMEM:KSFM的1:1混合物中。在37℃/5%CO2下进行孵育。利用0.25%的具有EDTA的胰蛋白酶分离细胞，进行传代。通过台盼蓝拒染法评估活力，使用血细胞计数器手工进行计数。
在培养后分离之前，将培养物从近大气氧条件(16-21%)转移至更加生理上相关的低氧(2%)环境中，进行过夜。利用含有EDTA的0.25%胰蛋白酶分离细胞以进行收获。通过台盼蓝拒染法评估活力，使用血细胞计数器手工进行计数。将细胞悬浮液在2mL未补充的KSFM(uKSFM)中制备为60-75x106个细胞，将其在两步骤碘克沙醇(；60%w/v于uKSFM中)密度梯度(16%，7%)上于在15mL尖底聚丙烯管中，通过在室温下以800xg离心20分钟(在无制动装置的情况下)来进行分离。收集16%与7%碘克沙醇层之间界面上的细胞条带，在无菌盐溶液洗涤3次，随后进行配制。
配制。在分带(banding)后，将选择的肾细胞(SRC)沉淀，计数，于盐水中洗涤，在明胶中进行最终的洗涤。在最终的离心后，除去明胶溶液上清液，将足够体积的含有100uM水溶性维生素E等同物的0.75%明胶添加至目标体积/细胞浓度。
或者，首先将SRC以2.5x106个细胞/35μl的珠粒(压积容积(packed volume))的比率接种至交联的珠粒上，将其在37℃/5%CO2下在设置为1rpm的旋转设备中于管中以1.5ml基础培养基/百万个细胞孵育过夜。基础培养基由以1:1体积比与角质细胞-SFM(Invitrogen)混合的DMEM-HG(Invitrogen)组成。随后通过离心温和地沉淀此类细胞接种的珠粒，除去上清液，通过悬浮于10%的PBS中的明胶溶液中来进一步配制。10%的明胶在环境温度下是凝胶，但在37℃下是液体。明胶:珠粒比为1:5(按体积计)。
细胞相容性。24小时后，通过使用细胞活力/细胞毒性试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)来测定配制的细胞的活力。
生物材料的体内植入和评估。用细胞接种交联的珠粒，如上所述进行配制。在卡罗来纳医学中心(Carolinas Medical Center)的PHS和IACUC指导方针下进行所有实验方法。在异氟醚麻醉下，雌性路易斯大鼠(Lewis rat)经历正中切割，暴露左肾。通过显微注射将配制的生物材料(35μl)引入肾实质(Basu同上2011)。在注射后1或4周处死大鼠。未发生过早死亡。
统计分析。为了获得尺寸分布特征谱，将珠粒直径值与两参数韦布尔等式拟合。为了获得胺的定量和酶促消化的数据，利用单因素ANOVA比较值。
结果
如所预期的，珠粒维持高细胞附着和活力(图15)。在于动态条件下孵育24小时后，在利用25mM EDC交联的交联的明胶珠粒上，通过原代大鼠肾细胞的染色评估交联的珠粒的细胞相容性(图16)。将25mM EDC交联的珠粒上的染色的大鼠肾细胞的图像选择作为系列的代表。通过显微镜术评估，发现细胞的附着和活力与先前公开的关于EDC交联的生物材料的细胞相容性的数据(Lai等人同上2010；Lv等人J Biomed Mater ResA2008；84：198-207)一致。
为了进一步验证我们的体外观察，将代表性分裂为许多小室的交联的珠粒(25、50和100mM EDC)同位(orthotopically)注射入雌性路易斯大鼠肾，在1周和4周后对其进行组织学评估。在第1周，交联的材料的所有注射位置的特征在于增加的细胞过多反应(hypercellular response)，其主要由具有局灶性轻度肾小管扩增/萎缩和轻度致纤维化反应(fibrogenic reaction)的慢性炎症性浸润(巨噬细胞、浆细胞、淋巴细胞和巨细胞)组成。总体上，在该时间点上，我们记录了生物材料的中度降解以及适度的组织向内生长和新生血管形成。重要地，在注射后1周观察到的降解模式已表现出与由体外数据显示的趋势良好相关。
此类生物材料在啮齿类动物(肾注射)中的体内性能的评估确认了珠粒是细胞相容性的，并且能够赋予细胞相容性小生境，在所述小生境中细胞可发挥生理功能(图17)。此外，交联的珠粒的可调降解模式与我们的体外观察关联(图18)。图18和图19描述了其上接种有大鼠细胞的明胶珠粒的组织学图像。利用Masson’s Trichrome(其将胶原染成蓝色)或苏木精和伊红(H&E)对组织载片进行染色。评估图像的阳性指标(组织向内生长，在1个月时最少的至不可检测的生物材料和健康组织)和阴性指标(巨噬细胞、巨细胞和其它炎症细胞的存在；支持纤维包膜(fibrotic capsule)形成和集合管尺寸的增加的生物材料的持久性)。这些图像显示强劲的至生物材料内的组织向内生长，该生长具有最小炎症反应和轻度纤维包膜形成。此外，形成与植入物相关的良好血管化的组织。
图18显示肾切片的组织学评估，所述切片显示注射1周后交联的明胶珠粒的降解。白色箭头指示H&E以及Trichrome染色的切片中的交联的珠粒。Trichrome将明胶染成蓝色并且允许显现珠粒(白色箭头)和由珠粒的降解产生的明胶痕(黑色箭头)(对于所有图像比例尺为200μm)。在第4周，所有注射位置显示中度纤维细胞反应和慢性间质性炎(单核细胞的)。
图19显示肾切片的组织学评估，所述切片显示注射4周后交联的明胶珠粒的降解。白色箭头指示H&E以及Trichrome染色的切片中的交联的珠粒。Trichrome将明胶染成蓝色并且允许显现珠粒(白色箭头)和由珠粒的降解产生的明胶痕(黑色箭头)(对于所有图像比例尺为200μm)。将生物材料的降解分成从中度(100mM EDC交联的)至显著的(25mM EDC交联的)(图19，珠粒用白色箭头指示；黑色箭头指示降解的材料)。对于25mM EDC交联的珠粒，存在最少的残留生物材料(珠粒)，其被轻度慢性炎症(巨噬细胞和巨细胞)包围，具有中度至显著的组织生长和中度新血管形成。记录了50mM EDC交联的珠粒的中度至显著的降解，然而100mM EDC对应物表现为珠粒的部分(轻度)降解的无定形聚集体，其被主要由巨噬细胞和巨细胞、一些浆细胞和淋巴细胞组成的中度慢性炎症包围。同样地，对于该样品，记录了周围的中度至显著的纤维细胞反应(具有足够的组织/细胞向内生长)(图19)。总体上，我们在两个时间点上的组织学观察与在我们的体外测试中观察到的降解模式一致。此外，差异交联的珠粒在体内被良好地耐受，不诱导生物材料的纤维包膜形成并且被良好地整合在周围组织中。
基于明胶的珠粒的体外酶促降解可在合成时通过用于交联的ECD的浓度来控制。本文中所示的制造工艺可代表用于产生(使用目前用于临床制品的生产的试剂)具有可调酶促易感性的生物可降解的支架的直接和具有成本效益的工艺。可调体外降解至可调体内降解的转化正处于活跃地研究中，并且可潜在地代表用于生成生物材料的有用的平台技术，其中可对空间和结构特征的短暂保持进行最优化以满足待再生的器官和/或组织的特殊需要。
对生物材料的物理化学和生物学性质的控制对于任何组织工程应用的成功是非常重要的。在我们的案例中，一个需要是具有特定的体内停留时间的生物材料，所述生物材料可将活细胞递送至期望的位置，为因细胞浸润和增殖而产生的再生变化提供空间，随后逐渐再吸收，同时使细胞适应新的环境条件，分化成适当的组织和器官。我们在此处显示通过使用EDC(广泛用于制造基于胶原的FDA批准的设备的碳二亚胺)和基于水的化学交联方法，我们可获得具有横跨大范围的生物降解速率的明胶珠粒。此外，方法是高度可重现的。总体上，该方法提供了用于产生具有器官特异性生物降解速率的组织工程生物材料的有效和高效的方法。
总体上，我们能够制造可用作各种分子的间隔子、细胞递送系统或微载体的基于明胶的微珠粒(microbead)。该设计利用明胶的浓度依赖性解链温度，将该特征用于产生温度反应性间隔珠粒。此外，通过使用简单的良好表征的化学药品，可定制此类珠粒来在体内和体内满足期望的酶促降解速率。先前报导的类似交联的系统不具有此处报导的物理特征，这使我们的系统更适合于微载体或细胞递送应用。
实施例4-啮齿类动物半肾切除术模型对由选择的肾细胞和生物材料组成的新生 肾增强原型的植入的生物反应
为了解决对恢复肾功能的新型治疗的需要，已开发了能够催化组织和器官的再生的独特的集成再生医学技术平台(unique integrated regenerative medicinetechnology platform)。
由生物材料和选择的再生肾细胞(SRC)组成的新生肾增强(NKA)产品原型是一种这样的能够促进肾组织的再生的平台。SRC获自肾活检组织的酶促消化和细胞的密度梯度分离。基于明胶的水凝胶(GBH)用作生物材料。先前已在健康成年啮齿类动物中评估了哺乳动物肾对NKA原型的植入的生物反应(Basu等人,2011,Cell Transplantation,在印刷中)。然而，从啮齿类动物取出单个肾(半肾切除术)增加了模型的
敏感性，从而允许检测全身性作用的毒理学作用。在本研究中，用NKA原型在残余肾的肾实质内注射15个半肾切除的啮齿类动物，评估其关键肾生理指标。
方法
通过将选择的肾细胞与表1中显示的生物材料组合来制备新生肾增强原型。如图20(用于NKA构建体的生成的策略的概述)中所示，制备细胞/生物材料构建体。
明胶溶液制备:
计算制备0.75%或1.0%w/v明胶/100μm水溶性维生素E等同溶液所需的粉末明胶和水溶性维生素E等同物/PBS的量。将PBS置于具有磁力搅拌棒的烧杯中，将其在设置至50℃的搅拌加热板上温热15分钟。缓慢添加明胶，将混合物在50℃搅拌1小时。使用预加温的无菌滤清器过滤所得的明胶溶液。随后将无菌明胶溶液等分入更小体积(10ml，于15ml管中)，于4℃下贮存直至使用。
优选方法是制备0.76%或1.01%的PBS中的明胶溶液，随后当与SRC混合时添加足够体积的100X(10mM)水溶性维生素E等同物，以产生期望的0.75%(或1.0%)明胶/100μm水溶性维生素E等同物溶液。
表1–递送至半肾切除的啮齿类动物组的生物材料的概述。
结果:
图21A-C显示选择的啮齿类动物再生肾细胞生物材料构建体的代表性活细胞/死细胞染色。通过18规针将构建体递送至半肾切除的路易斯大鼠(2月龄)的残余肾。在植入之前或在植入后4周的时间点上评估来源于全血、血清和尿化学的生理指标。在注射后第4周处死动物，在组织学上检查残余肾的炎症或纤维变性生物反应的证据。
NKA原型的植入未显著影响关键肾生理指标，并且呈现炎症、坏死或纤维变性生物反应的最小限度的证据。因此，基于GBH中的SRC的NKA原型可被啮齿类动物半肾切除术模型的残余肾良好地耐受。
图22显示植入后4周按组计的体重(A)、血尿素氮水平(B)和血清肌酸酐水平(C)的变化的概述(ANOVA分析)-A：按组ID计的Δ重量的单因素分析；B：按组ID计的ΔsBUN的单因素分析(BUN：血尿素氮水平)；C：按组ID计的ΔScre的单因素分析(Scre：血清肌酸酐)。
图23显示植入后4周按组计的尿蛋白/肌酸酐(A)和尿蛋白(B)的变化的概述(ANOVA分析)-A：按组ID计的ΔUPC的单因素分析(UPC：尿蛋白/肌酸酐)；B：按组ID计的ΔUprotein的单因素分析(Uprotein：尿蛋白)。
图24显示植入后4周按组计的比重(A)和尿肌酐(B)的变化的概述(ANOVA分析)-A：按组ID计的Δ比重的单因素分析；B：按组ID计的ΔUcre的单因素分析(Ucre：尿肌酐)。总体上，细胞/生物材料构建体在半肾切除术啮齿类动物模型中的引入与SRC相比较在一个月的时期中不影响肾生理的关键指标。
细胞/生物材料构建体在半肾切除术啮齿类动物模型内的引入也不显著影响残余肾的组织学。
图25显示半肾切除后4周的大鼠；肾外髓质(内部条纹)；HE,x400。批次A(图25的顶行)，也在大鼠编号(HN-16和HN-18)观察到但未在HN-7和HN-10观察到特征在于固缩核(piknotic nuclei)(批次1中描述的)的肾小管坏死，所述大鼠在肾实质(kidneyparenchyma)内未显示显著的损伤。批次B(图25的底行)；在一只大鼠(HN11)中观察到但在其余动物(HN-12、HN-13和HN-14)未观察到外髓质的内部条纹中显示固缩核的最小局部肾小管坏死，从而被认为在正常限度内。
总而言之，选择的肾细胞/生物材料新生肾增强原型至啮齿类动物半肾切除术模型内的植入不影响残余肾生理学或组织学。
实施例5-生物响应性肾细胞的分离及表征
在成年雄猪(野猪(Sus scrofa))中具有贫血的特发性进行性慢性肾病(CKD)的病例提供了用于通过与年龄匹配的正常猪肾组织直接比较进行细胞组成的评估和表征的新鲜患病肾组织。收获时肾组织的组织学检查确认了特征在于严重慢性弥漫性间质纤维化和具有多病灶纤维化的新月体性肾小球肾炎(crescentic glomerulonephritis)的肾病。临床化学确认了氮血症(血尿素氮和血清肌酸酐的升高)和轻微贫血(血细胞比容的轻微减小和降低的血红蛋白水平)。从患病肾组织和正常肾组织分离细胞，扩增细胞，以及表征细胞。如Presnell等人WO/2010/056328(通过引用整体并入本文)的图1中所示，Gomori’sTrichrome染色突显了与正常肾组织相比较患病肾组织的纤维化(由箭头标示的蓝色染色)。从正常和患病肾组织繁殖表达cubulin:兆蛋白并且能够进行受体介导的白蛋白转运的功能性肾细胞。表达红细胞生成素(EPO)的细胞也存在于培养物中并且被保留通过多次传代和冷冻/解冻周期。此外，分子分析确认了来自正常和患病组织的EPO表达细胞在体外通过EPO和其它缺氧调控的基因靶包括vEGF的HIF1α-驱动的诱导响应缺氧条件。通过利用胶原酶+分散酶(dispase)进行酶促消化从猪肾组织分离细胞，还通过进行简单机械消化和外植体培养在单独的实验中分离所述细胞。在第二代，将包含EPO表达细胞的外植体来源的细胞培养物经历大气(21%)和不同的缺氧(＜5%)培养条件以确定对缺氧的暴露是否在EPO基因表达的上调中达到极点。正如啮齿类动物培养(参见实施例3)，正常猪显示EPO基因的依赖于氧的表达和调控。令人惊讶地，尽管CKD猪的尿毒症/贫血状态(血细胞比容＜34,肌酸酐>9.0)，但可容易地从组织分离和繁殖EPO表达细胞，并且EPO基因的表达仍然受缺氧调控，如Presnell等人WO/2010/056328(通过引用整体并入本文)的图2中显示的。如Presnell等人WO/2010/056328(通过引用整体并入本文)的图3中显示的，繁殖的培养物中的细胞显示自组织成肾小管状结构的能力。如Presnell等人WO/2010/056328(通过引用整体并入本文)的图4中显示的，通过观察培养的细胞对缀合有FITC的白蛋白的受体介导的吸收确认功能性肾小管细胞在培养物(在第3代)中的存在。绿点(通过细白色箭头标示的)表示通过肾小管细胞特异性受体兆蛋白和立方蛋白介导的内吞的缀合有荧光素的白蛋白，这表明蛋白质被功能性肾小管细胞重吸收。蓝色染色(通过粗白色箭头标示的)为Hoescht染色的细胞核。综合起来，这些数据表明可从猪肾组织，甚至在因CKD而已严重受损的肾组织中分离和繁殖功能性肾小管和内分泌细胞。此外，这些发现支持基于自体细胞的治疗性产物用于治疗CKD的进步。
此外，从正常成年人肾酶促分离EPO生成细胞(如实施例1中显示的)。如Presnell等人WO/2010/056328(通过引用整体并入本文)的图5中显示的，分离方法导致在分离后比初始组织中更多的相对EPO表达。如Presnell等人WO/2010/056328(通过引用整体并入本文)的图6中显示的，可能在培养物中维持人EPO生成细胞，保留EPO基因表达。在平面组织培养处理的塑料或已用一些细胞外基质例如纤连蛋白或胶原包被的塑料上培养/繁殖人细胞，并且发现所有细胞随时间过去支持EPO表达。
实施例6-特定生物反应性肾细胞的分离及富集
肾细胞的分离：简而言之，从商业供应商(Hilltop Lab Animals Inc.)获得成批的10只2周龄雄性路易斯大鼠的肾，将其在约4℃的温度下在Viaspan保存介质中装载过夜。在生物安全工作厨(BSC)中进行本文中描述的所有步骤以保持无菌性。将肾在汉克平衡盐溶液(HBSS)中洗涤3次以漂洗掉Viaspan保持介质。在第三次洗涤后，除去剩下的肾被膜以及任何剩下的间质组织(stromaltissue)。还使用显微解剖技术除去肾大盏。随后使用无菌解剖刀将肾细细地切碎成浆。随后将浆转移至50ml尖底离心管并且称重。收集少量样品的RNA，将其置于无RNA酶的无菌1.5ml微量离心管中，在液氮中快速冷冻(snap frozen)。冷冻后，随后将其转移至-80度的冰箱中直至分析。10只少年肾的组织重量约等于1克。基于批次的重量，调整消化介质以递送20ml消化介质/1克的组织。用于该方法的消化缓冲液包含4个单位的HBSS中的分散酶1(Stem Cell Tech)、300个单位/ml的胶原酶IV型IV(Worthington)和5mM CaCl2(Sigma)。
将适当体积的预加温的消化缓冲液添加至管中，随后密封管，将其在振荡器上置于37℃的培养箱中进行20分钟。第一消化步骤除去许多红细胞并且增强剩余组织的消化。20分钟后，取出管，将其置于BSC中。使组织在管的底部静置，随后除去上清液。随后用等于起始体积的新鲜消化缓冲液补充剩余的组织。再次将管在振荡器上置于37℃的培养箱中进行另外30分钟。
30分钟后，用移液器将消化混合物转移通过70μm细胞过滤器(cell strainer)(BDFalcon)，进入等体积的中和缓冲液(DMEM w/10%FBS)中以终止消化反应。随后通过以300xg离心5分钟来洗涤细胞悬浮物。离心后，随后将沉淀重悬浮于20ml KSFM培养基中，获取样品以进行细胞计数和使用台盼蓝拒染法进行活力评估。计算细胞计数后，收集100万个细胞以提取RNA，将细胞于PBS中洗涤，然后于液氮中快速冷冻。将剩余的细胞悬浮物置于50ml的KSFM培养基中，通过以300xg离心5分钟再次洗涤。洗涤后，以1500万个细胞/ml的KSFM的浓度重悬浮细胞沉淀。
随后将5毫升肾细胞悬浮物添加至15ml尖底离心管(BD Falcon)中的5ml30%(w/v)中，随后通过倒转6次进行混合。这形成了15%(w/v)的的终混合物。倒转后，用1mL PBS小心地将管分层。将管在无制动装置的情况下以800x g离心15分钟。离心后，取出管，在混合梯度的顶部形成细胞带(cell band)。还存在包含红细胞、死亡细胞和一小群活细胞(包括一些小的颗粒性更低的细胞(small less granular cell)、一些红细胞生成素生成细胞、一些肾小管细胞和一些内皮细胞)的沉淀。使用移液器小心地取出条带，将其转移至另一个15ml尖底离心管中。通过抽吸移取梯度介质，通过重浮于1ml KSFM中收集沉淀。随后重组条带细胞和沉淀细胞，使用KSFM将其重悬浮于收集的条带体积的至少3个稀释物中，通过以300xg离心5分钟进行洗涤。洗涤后，将细胞重悬浮于20ml KSFM中，收集用于细胞计数的样品。在使用台盼蓝拒染法计算细胞计数后，将集100万个细胞用以提取RNA样品，将其在PBS中进行洗涤，随后于液氮中快速冷冻。
使用密度梯度分离进行的增强特定生物活性肾细胞的活力和培养性能的预培养 ‘净化(Clean-up)’：为了生成用于培养的干净的有活力的细胞群体，首先如在上文的“肾细胞分离”中所述生成细胞悬浮物。作为任选步骤和作为净化初始制剂的方法，将悬浮于无菌等渗缓冲液中的共达1亿个细胞与等体积的在室温下从原液60%(w/v)碘克沙醇制备的30%(从而生成终15%w/v Optiprep溶液)以1:1充分混合，通过倒转6次充分混合。混合后，将1ml PBS缓冲液在混合细胞悬浮物顶部小心地分层。随后将梯度管小心地装载入离心机，确保适当的平衡。将梯度管在无制动装置的情况下在25°C下以800x g离心15分钟。净化的细胞群体(包含有活力的功能性集合管细胞、肾小管细胞、内分泌细胞、肾小球细胞和血管细胞)在6%与8%(w/v)之间分段，相应于1.025-1.045g/mL的密度。其它细胞和碎片沉淀至管底部。
肾细胞培养：随后将组合的细胞条带与沉淀以30,000个细胞/cm2的细胞浓度于150ml DMEM(高葡萄糖)/KSFM(包含5%(v/v)FBS,2.5μg EGF,25mg BPE,1X ITS(胰岛素/转铁蛋白/亚硒酸钠培养基补充物)和抗生素/抗真菌素)的50:50混合物中涂铺在组织培养处理的三瓶(triple flask)(Nunc T500)或等同物中。将细胞在潮湿的5%CO2培养箱中培养2-3天，从而为细胞提供21%的大气氧水平。两天后，改变培养基，将培养物置于由CO2/氮气多气体潮湿培养箱(Sanyo)提供的2%氧水平环境中进行24小时。在24小时的孵育后，用60ml1XPBS洗涤细胞，随后40ml0.25%(w/v)胰蛋白酶/EDTA(Gibco)移取细胞。移取后，用等体积的含10%FBS的KSFM中和细胞悬浮物。随后通过以300xg离心10分钟洗涤细胞。洗涤后，将细胞重悬浮于20ml KSFM中，将其转移至50ml圆锥管中，收集样品以进行细胞计数。在使用台盼蓝拒染法测定活细胞计数后，收集100万个细胞以提取RNA样品，将其在PBS中洗涤，然后于液氮中快速冷冻。将细胞再次于PBS中洗涤，通过以300xg离心5分钟来收集细胞。将已洗涤的细胞沉淀以3750万个细胞/ml的浓度重悬浮于KSFM中。
使用密度不连续梯度分离来富集特定生物活性肾细胞：使用从多个浓度w/v的碘克沙醇(Optiprep)制备的密度不连续梯度将主要由肾小管细胞组成但包含其它细胞类型(集合管、肾小球、血管和内分泌)的小亚群的培养的肾细胞分成它们的组分亚群。将培养物置于缺氧环境中进行达到24小时，然后收获并且用于梯度。通过在无菌的15mL圆锥管中在使4种不同的密度介质在彼此的顶上分层，将具有最高密度的溶液置于底部并且将密度最小的溶液置于顶部来生成不连续梯度。将细胞施用至不连续梯度的顶部，然后离心，这导致群体基于尺寸和粒度分离成多个条带。
简而言之，使用KFSM介质作为稀释剂制备7、11、13和16%(60%w/v碘克沙醇)的密度。例如：对于50ml7%(w/v)，将5.83ml原液60%(w/v)碘克沙醇添加至44.17ml的KSFM介质中，通过倒转充分混合。将通过管道连接至无菌毛细管的装载有无菌L/S16Tygon蠕动泵(Master Flex L/S)设置至每分钟2ml的流速，将各自2mL的4种溶液装载入无菌的15mL圆锥管，始于16%的溶液，然后13%的溶液，11%的溶液和7%的溶液。最后，将2mL的含有7500万个培养的啮齿类动物肾细胞的细胞悬浮物装载在不连续梯度的顶部(已如上文的‘肾细胞培养’中所述生成的悬浮物)。重要地，当泵开始递送梯度溶液至管时，小心地使流体以45°角缓慢地沿管的侧面流下以确保在梯度的每一层之间形成适当的界面。随后将载有细胞的不连续梯度在无制动装置的情况下以800x g离心20分钟。离心后，小心地将管取出以不扰乱每一界面。产生5个不同的细胞级分(4条带和沉淀)(B1-B4,+沉淀)(参见图26，左圆锥管)。使用无菌一次性球吸管或5ml移液器收集每一个级分，在表型和功能上表征所述级分(参见Presnell等人WO/2010/056328的实施例10)。当将啮齿类动物肾细胞悬浮物在分离后立即经历不连续梯度分级分离时，富集了肾小管细胞(和包含一些来自集合管的细胞)的级分划分至1.062-1.088g/mL的密度。相反地，当在离体培养后进行密度梯度分离时，富集了肾小管细胞(和包含一些来自集合管的细胞)的级分划分至1.051-1.062g/mL的密度。类似地，当将啮齿类动物肾细胞悬浮物在分离后立即经历不连续梯度分级分离时，富集了红细胞生成素生成细胞、肾小球足细胞和血管细胞的级分(“B4”)在1.025-1.035g/mL的密度上分离。相反地，当在离体培养后进行密度梯度分离时，富集了红细胞生成素生成细胞、肾小球足细胞和血管细胞的级分(“B4”)在1.073-1.091g/mL的密度上分离。重要地，通过将培养物暴露于缺氧培养环境(缺氧被定义为小于21%(大气)的氧水平)(进行约1小时的时期至24小时的时期)来增强细胞至“B2”和“B4”级分的培养后分布，然后进行收获和不连续梯度法(关于对条带分布的缺氧影响的其它详细内容提供于实施例7中)。
通过用3x体积的KSFM稀释来洗涤每一个条带，将其充分混合，以300x g离心5分钟。将沉淀重悬浮于2ml KSFM中，使用台盼蓝拒染法和血细胞计数器计数活细胞。收集100万个细胞以提取RNA样品，在PBS中洗涤细胞，然后于液氮中快速冷冻。将来自B2和B4的细胞用于至尿毒症和贫血雌大鼠(在Charles River实验室通过两步5/6肾切除术产生)内的移植研究。利用定量实时PCR确认B4的特征，包括氧调控的红细胞生成素和vEGF的表达，肾小球标志物(去氧肾上腺素、podocin)的表达和血管标志物(PECAM)的表达。通过E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白和水通道蛋白-2的表达确认‘B2’级分的表型。参见Presnell等人WO/2010/056328的图49a和49b。
因此，不连续梯度策略的使用不仅允许富集了红细胞生成素生成细胞的罕见群体(B4)，而且还是生成相对富集的功能性肾小管细胞的级分(B2)的方法(参见Presnell等人WO/2010/056328的图50及51)。不连续梯度策略还允许EPO生成细胞和肾小管细胞与红细胞、细胞碎片和其它潜在不期望的细胞类型例如大细胞聚集体和某些类型的免疫细胞分离。
不连续梯度法可能需要在使用的特定密度方面进调整以提供细胞组分的良好分离。调整梯度的优选方法包括1)运行其中从梯度底部的高密度(例如，16-21%Optiprep)至梯度顶部的相对低密度(例如，5-10%)的连续密度梯度。可按照标准方法(Axis Shield)利用任何标准密度梯度溶液(Ficoll、Percoll、蔗糖、碘克沙醇)制备连续梯度。将目标细胞装载至连续梯度上，在无制动装置的情况下以800xG离心20分钟。具有相似尺寸和粒度的细胞倾向于在梯度中一起分离，以便可测量梯度中的相对位置，还测量该位置上的溶液的比重。因此，随后，可衍生聚集在基于它们在特定条件下横断密度梯度的能力的特定细胞群体的分离的确定的不连续梯度。当从不健康对健康组织分离细胞时，或当从不同物种分离特定细胞时，可能需要应用这样的最优化。例如，对犬和人肾细胞培养物进行最优化，以确保在大鼠中鉴定的特定B2和B4亚群可从其它物种分离。用于分离啮齿类动物B2和B4亚群的最佳梯度由7%、11%、13%和16%(w/v)的Optiprep组成。用于分离犬B2和B4亚群的最佳梯度由7%、10%、11%和16%(w/v)Optiprep组成。用于分离人B2和B4亚群的最佳梯度由7%、9%、11%、16%(w/v)组成。因此，用于从培养的啮齿类动物、犬和人肾细胞局限化B2和B4的密度范围提供于表2中。
表2.物种密度范围
实施例7-在梯度之前进行低氧培养影响条带分布、组成和基因表达
为了测定氧条件对原型B2和B4的分布和组成的影响，将来自不同物种的新肾细胞制剂暴露于不同氧条件，然后进行梯度步骤。使用用于大鼠细胞分离和培养起始的标准方法(如上文中所描述的)建立啮齿类动物新生肾增强(neo-kidney augmentation)(NKA)细胞制剂(RK069)。将所有培养瓶在21%(大气)氧条件下培养2-3天。改变培养基，随后将一半培养瓶重新放置至设置至2%的氧的控氧的培养箱中，同时将剩余培养瓶在21%的氧条件下保持另外24小时。随后使用上文中描述的标准酶促收获法来从每一组条件收获细胞。按照标准方法制备不连续梯度，单独地收获“含氧量正常的”(21%氧)和“缺氧”(2%氧)培养物，将其并行地用于相同的不连续梯度(图27)。虽然在两个条件下都生成4个条带和沉淀，但在21%和2%的氧培养的批次中，细胞在整个梯度上的分布是不同的(表3)。具体地B2的产率因缺氧而增加，伴随B3的减少。此外，B4-特异性基因(例如红细胞生成素)的表达在从缺氧培养的细胞生成的所得梯度中增强(Presnell等人WO/2010/056328的图73)。
使用用于狗细胞分离和培养的标准方法(与啮齿类动物分离和培养法类似)建立犬NKA细胞制剂(DK008)，如上文中所描述的。将所有培养瓶在21%(大氧)的氧条件下培养4天，随后将一亚组培养瓶转移至缺氧(2%)，进行24小时，同时将一亚组培养瓶维持在21%。随后，收获每一组培养瓶，使其经历相同的不连续梯度(图28)。与大鼠结果(实施例6)相似，缺氧培养的狗细胞与大气氧培养的狗细胞在整个梯度中差异分布(表3)。再次地，B2的产率在进行梯度之前因缺氧暴露而增加，同时伴随至B3中的分布减少。
表3.
上述数据显示对缺氧的梯度前暴露增加B2的组成以及特定的特化细胞(红细胞生成素生成细胞、血管细胞和肾小球细胞)至B4的分布。因此，如上所述，进行缺氧培养，然后进行密度梯度分离是跨物种生成‘B2’和‘B4’细胞群体的有效方法。
实施例8-从人肾分离肾小管/肾小球细胞
利用详尽描述的酶促分离法从正常人肾组织分离和繁殖肾小管和肾小球细胞。通过上述梯度法，在培养后离体富集了肾小管细胞级分。如Presnell等人WO/2010/056328(通过引用整体并入本文)的图68中显示的，表型属性在分离和繁殖中得到维持。通过标记的白蛋白的吸收评估的肾小管细胞功能在反复传代和低温保藏后也得到保持。Presnell等人WO/2010/056328(通过引用整体并入本文)的图69显示当在3D动态培养中培养富集了肾小管细胞的群体和消耗了肾小管细胞的群体时，在富集了肾小管细胞的群体中表现出肾小管标志物钙粘蛋白的表达的显著增加。这确认了当在3D动态环境中培养细胞时，可维持超过初始富集的肾小管细胞的富集。将上文实施例7中描述的肾细胞的相同培养群体经历流式细胞术分析以检查前向散射和侧向散射。小的颗粒性更低的EPO生成细胞群体是可辨别的(8.15%)并且可使用流式细胞仪的分选能力通过小的颗粒性更低的群体的阳性选择来分离(参见Presnell等人WO/2010/056328(通过引用整体并入本文)的图70)。
实施例9-从自身免疫性肾小球肾炎患者样品分离的肾细胞的未分级的混合物的 表征
如上所述，从自身免疫性肾小球肾炎患者样品分离肾细胞的未分级混合物。为了测定从肾组织分离和扩增的肾细胞的特定亚群的无偏表型组成，将定量实时PCR(qRTPCR)分析(Brunskill等人，同上，2008)用于鉴定细胞亚级分间差异细胞类型特异性和途径特异性基因表达模式。如Ilagan等人PCT/US2011/036347的表6.1中显示的，HK20为自身免疫性肾小球肾炎患者样品。如Ilagan等人PCT/US2011/036347的表6.2中显示的，从HK20产生的细胞缺少肾小球细胞，如通过qRTPCR测定的。
实施例10-从局灶性节段性肾小球硬化症的病例分离的治疗上相关的肾生物活性 细胞群体的遗传谱表征
为了测定从肾组织分离和扩增的肾细胞的特定亚群的无偏基因型组成，利用定量实时PCR(qRTPCR)分析(Brunskill等人，同上，2008)来鉴定细胞级分间差异细胞类型特异性和途径特异性基因表达模式。评估收获时人制剂HK023(来源于其中大部分肾小球已被破坏的局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)的病例)的肾小球细胞在B4级分中的存在。简而言之，从使用标准活组织检查法从肾获取的(4)核心活检组织的每一个单独地产生(Aboushwareb等人，同上，2008)和维持未分级的(UNFX)培养物。在UNFX离体传代(2)后，收获细胞，将其经历密度梯度法(如在实施例6中一样)以产生亚级分，包括亚级分B4，基于在啮齿类动物、狗和其它人样品中进行的工作，已知其富集了内分泌细胞、血管细胞和肾小球细胞。
单独地从HK023的每一个独立的UNFX样品收集B4级分，所述级分表现为具有1.063-1.091g/mL的浮力密度的独特细胞条带。从每一个样品分离RNA，通过定量实时PCR检查其的Podocin(肾小球细胞标志物)和PECAM(内皮细胞标志物)的表达。如从来自严重FSGS的病例的活组织检查生成的样品所预期的，podocin(+)肾小球细胞在B4级分中的存在与podocin在2/4的样品中不能被检测到不一致。相反地，PECAM+血管细胞始终存在于4/4的活组织检查起始的培养物的B4级分中。因此，可在1.063-1.091g/mL密度范围上，甚至从具有严重疾病状态的人肾分离B4级分。
表4用于检测从FSGS的病例分离的亚级分B4中的肾小球细胞和血管细胞的Podocin和PECAM的表达
此外，如Ilagan等人PCT/US2011/036347的表7.2中显示的，人样品(HK018)在密度梯度离心后显示通过qRTPCR未检测到的Podocin(肾小球标志物)。
实施例11-使用荧光激活细胞分选术(FACS)富集/消耗有活力的肾细胞类型
可使用荧光激活细胞分选术(FACS)从分离的原代肾组织富集一种或多种分离的肾细胞，和/或消耗一种或多种特定肾细胞类型。
试剂：70%乙醇；洗涤缓冲液(PBS)；50:50肾细胞培养基(50%DMEM高葡萄糖)：50%角质细胞-SFM；台盼蓝0.4%；针对靶肾细胞群体例如CD31(对于肾内皮细胞)和去氧肾上腺素(对于肾的肾小球细胞)的第一抗体。匹配的同种型特异性荧光第二抗体；染色缓冲液(0.05%的PBS中的BSA)。
方法：在进行清洁生物安全工作厨(BSC)的标准方法后，可从T500T/C处理的培养瓶获得来自原代分离的肾细胞或培养的细胞的单细胞悬浮物，将其重悬浮于肾细胞培养基中并且置于冰上。随后进行细胞计数，使用台盼蓝拒染法测定活力。为了从异源群体肾细胞富集/消耗例如肾小球细胞或内皮细胞，获得具有至少70%的活力的10至50e6个活细胞。随后以1μg/0.1ml的染色缓冲液/1x106个细胞(必要时滴度)的起始浓度利用对于靶细胞类型是特异性的第一抗体染色肾细胞的异源群体。可缀合(例如CD31PE(对于肾内皮细胞是特异性的))或不缀合(例如去氧肾上腺素(对于肾的肾小球细胞是特异性的))靶抗体。
随后在冰上或在4℃下避光染色细胞，进行30分钟。30分钟的孵育后，通过以300xg离心5分钟洗涤细胞。随后将沉淀重悬浮于PBS或染色缓冲液中，这取决于是否需要缀合的同种型特异性第二抗体。如果用缀合有荧光染料的第一抗体标记细胞，则将细胞重悬浮于2ml PBS每10e7个细胞，然后继续进行FACS aria或等同的细胞分选仪。如果不用缀合有荧光染料的抗体标记细胞，则以1ug/0.1ml/1e6个细胞的起始浓度用缀合有荧光染料的同种型特异性第二抗体标记细胞。
随后在冰上或在4℃下避光染色细胞，进行30分钟。在30分钟的孵育后，通过以300xg离心5分钟洗涤细胞。离心后，将沉淀以5e6/ml的PBS的浓度重悬浮于PBS中，随后将4ml每12x75mm转移至无菌试管中。
按照制造商的说明书(BD FACs Aria User Manual)准备用于活细胞无菌分选的FACs Aria。将样品管装载至FACs Aria中，在获取开始后调整PMT电压。将门拉下以使用特定波长，利用荧光强度选择肾特异性细胞类型。将另一个门拉下以选择阴性群体。在已将期望的门拉下以将阳性靶群体和阴性群体封入后，使用制造商的说明书分选细胞。
将阳性靶群体收集在一个15ml圆锥管中，将阴性群体收集在另一个装有1ml肾细胞培养基的15ml圆锥管中。收集后，利用流式细胞术分析每一个管的样品以测定纯度。通过以300xg离心5分钟洗涤收集的细胞，将沉淀重悬浮于肾细胞培养基中以用于进一步分析和实验。
实施例12-使用磁性细胞分选术富集/消耗肾细胞类型
可从分离的原代肾组织富集一种或多种分离的肾细胞和/或消耗一种或多种特定的肾细胞类型。
试剂：70%乙醇；洗涤缓冲液(PBS)；50:50肾细胞培养基(50%DMEM高葡萄糖)：50%角质细胞-SFM；台盼蓝0.4%；电泳缓冲液(PBS,2mM EDTA,0.5%BSA)；漂洗缓冲液(PBS,2mMEDTA)；清洁液(70%v/v乙醇)；Miltenyi FCR封闭试剂；对于IgG同种型靶抗体例如CD31(PECAM)或去氧肾上腺素是特异性的Miltenyi微珠或第二抗体。
方法：在进行清洁生物安全工作厨(BSC)的标准方法后，获得来自原代分离物或培养物的肾细胞的单细胞悬浮物，将其重悬浮于肾细胞培养基。使用台盼蓝拒染法测定细胞计数和活力。为了从异源群体肾细胞富集/消耗例如肾小球细胞或内皮细胞，获得具有至少70%的活力的至少10e6至高达4e9个活细胞。
基于目标靶细胞测定富集/消耗法的最佳分离。为了富集低于10%的靶频率，例如肾小球细胞(使用去氧肾上腺素)，使用Miltenyi autoMACS，或等同物，仪器程序POSSELDS(灵敏模式中的双阳性选择)。为消耗大于10%的靶频率，使用Miltenyi autoMACS，或等同物，仪器程序DEPLETES(灵敏模式中的消耗)。
通过在15ml尖底离心管中添加1μg/10e6个细胞/0.1ml的含0.05%BSA的PBS，然后在4℃下孵育15分钟，利用靶特异性第一抗体例如去氧肾上腺素rb多克抗体(对于肾小球细胞)标记活细胞。
标记后，通过添加1-2ml缓冲液每10e7个细胞，然后以300xg离心5分钟洗涤细胞以除去未结合的第一抗体。洗涤后，以1ug/10e6/0.1ml的含0.05%BSA的PBS加入同种型特异性第二抗体例如鸡抗-兔PE，然后在4℃下孵育15分钟。
孵育后，通过添加1-2ml缓冲液每10e7个细胞，然后以300xg离心5分钟洗涤细胞以除去未结合的第二抗体。除去上清液，将细胞沉淀重悬浮于60μl缓冲液每10e7个总细胞，然后添加20μl FCR封装试剂每10e7个总细胞，随后将其充分混合。添加20μl的直接MACS微珠(例如抗-PE微珠)，混合，随后在4℃下孵育15分钟。
孵育后，通过添加10-20x标记体积的缓冲液，然后以300xg离心细胞悬浮物5分钟来洗涤细胞，将细胞沉淀重悬浮于500μl-2ml缓冲液每10e8个细胞。
按照制造商的说明书，清洁和装填(prime)autoMACS系统以准备使用autoMACS进行磁性细胞分离。将新的无菌收集管置于排出口下。选择autoMACS细胞分离程序。对于选择，使用POSSELDS程序。对于消耗，选择DEPLETES程序。
将标记的细胞插在吸收口(uptake port)上，随后开始程序。在细胞选择或消耗后，收集样品，将其置于冰上直至使用。利用流式细胞术验证消耗或选择的样品的纯度。
实施例13-可从正常和患慢性病的肾组织分离和繁殖具有治疗潜能的细胞
本研究的目的是通过高含量分析(HCA)测定人NKA细胞的功能特征。高含量成像(High-content imaging)(HCI)提供了使用两个或更多个跨许多样品的荧光探针(多路技术(multiplexing))对多个亚细胞事件的同时成像。高含量分析(HCA)提供了对高含量成像中捕获的多个细胞参数的同时定量测量。简而言之，使用标准活组织检查法从从5个患有晚期慢性肾病(CKD)的人肾和3个非CKD人肾获取的核心活检组织独立地生成(Aboushwareb等人，同上，2008)和维持未分级(UNFX)培养物。在UNFX离体传代(2)后，收获细胞，将其经历密度梯度法(如实施例2中的一样)以生成亚级分，包括亚级分B2、B3和/或B4。
从非CKD和CKD人供体获取人肾组织，如Ilagan等人PCT/US2011/036347的表10.1中概述的。Ilagan等人PCT/US2011/036347的图4显示HK17和HK19样品的组织病理学特征。从所有非CKD(3/3)和CKD(5/5)肾建立离体培养物。确定目标区域(regions of interest)(ROI)的人NKA细胞中的白蛋白转运的高含量分析(HCA)示于Ilagan等人PCT/US2011/036347的图5(人NKA细胞中的白蛋白转运的HCA)。来源于非CKD和CKD肾的NKA细胞中白蛋白转运的定量比较示于Ilagan等人PCT/US2011/036347的图6中。如Ilagan等人PCT/US2011/036347的图6中显示的，在CKD来源的NKA培养物于中白蛋白转运未被削弱。富集了肾小管细胞的B2与消耗了肾小管细胞的B4亚级分之间的标志物表达的比较分析示于Ilagan等人PCT/US2011/036347的图7(CK8/18/19)中。
富集了肾小管细胞的B2与消耗了肾小管细胞的B4亚级分之间的白蛋白转运的比较功能分析示于Ilagan等人PCT/US2011/036347的图8中。亚级分B2富含近端肾小管细胞，从而显示增强的白蛋白转运功能。
白蛋白吸收：用不含酚红、无血清的含有1X抗真菌素/抗生素和2mM谷氨酰胺的低葡萄糖DMEM(pr-/s-/lg DMEM)替换在24孔胶原IV板(BD BiocoatTM)中生长至汇合的细胞的培养基，进行18-24小时。在即将进行测定时，利用pr-/s-/lg DMEM+10mM HEPES、2mM谷氨酰胺、1.8mM CaCl2和1mM MgCl2洗涤细胞，并且用其孵育细胞30分钟。将细胞暴露于25μg/mL缀合有罗丹明的牛白蛋白(Invitrogen)，进行30分钟，然后用冰冷PBS洗涤细胞以终止胞吞作用，立即用含25μg/mL赫斯特细胞核染料的2%多聚甲醛固定细胞。对于抑制实验，在添加白蛋白之前10分钟，添加1μM受体相关蛋白(RAP)(Ray Biotech,Inc.,Norcross GA)。利用BD PathwayTM855High-Content BioImager(Becton Dickinson)(参见Kelley等人Am JPhysiol Renal Physiol.2010年11月;299(5):F1026-39.2010年9月8日电子出版)进行显微成像和分析。
综上所述，HCA产生细胞水平数据并且可显示不能通过其它测定即基因或蛋白质表达检测的群体动态(populations dynamics)。用于测量白蛋白转运功能的可计量的离体HCA测定(HCA-AT)可用于将人肾的肾小管细胞表征为人NKA原型的组分。HCA-AT使得能够进行细胞功能的比较评估，从而显示具有白蛋白转运能力的细胞保留在来源于人CKD肾的NKA培养物中。还显示了NKA培养物的特定亚级分B2和B4在表型和功能上与代表具有增强的白蛋白转运活性的富集了肾小管细胞的级分的B2显著不同。来自人CKD的B2细胞亚群在表型和功能上与在体内显示功效(如上显示的)的啮齿类动物B2细胞类似。
实施例14–来源于原代肾细胞的外来体包含微小RNA
我们设法使特定的外来体来源的miRNA与靶细胞在体外的功能上相关的结果相关联，以告知用于阐明产生再生结果的机制的体内研究的设计。
方法：使用商购的细胞：HK-2(人近端肾小管细胞系)、原代人肾小球系膜细胞(HRMC)和人脐带内皮细胞(HUVEC)研究条件培养基对与再生愈合响应相关的信号转导途径的作用。利用设计来检测已知miRNA的基于PCR的阵列筛选来自条件培养基(来自人和大鼠原代肾细胞培养物(UNFX))中的外来体的RNA内容物。已报导低氧影响外来体排出；因此，将一组培养物暴露于低氧(2%O2)24小时，然后收集培养基。通过FACS将外来体与细胞碎片分离。图29提供了UNFX-条件培养基的制备和分析的示意图。
结果：发现UNFX-条件培养基影响与再生愈合响应相关的信号转导途径；在使用非条件培养基的对照中未观察到此类响应。具体地，NFκB(免疫响应)和上皮至间质转化(纤维化响应)在HK-2细胞中减弱，PAI-1(纤维化响应)在HRMC细胞中减弱，血管生成在HUVEC中得到促进。来自UNFX-条件培养基的外来体内容物的PCR阵列筛选的初步数据显示UNFX生成包含与观察到的对UNFX-条件培养基的响应一致的miRNA序列的外来体。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图13A-C显示来自UNFX培养物的条件培养基在体外影响多个潜在地与再生结果相关的细胞过程。NFkB信号转导被提议为肾病的炎症性过程的关键介质(Rangan等人，2009.Front Biosci12:3496-3522；Sanz等人，2010.J Am SocNephrol21:1254-1262)，并且可被肿瘤坏死因子(TNF)激活。用非条件培养基(左)或UNFX条件培养基(右)在37℃下预孵育HK-2细胞1小时，随后用或不用10ng/ml TNFa进行激活。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图13A显示UNFX-条件培养基减弱TNF-a介导的NF-kB的激活。NFkB激活通过RelA/p65免疫荧光染色(绿色)来测量。赫斯特复染色的细胞核(蓝色)和鬼笔环肽染色的丝状肌动蛋白(红色)有助于RelA/p65核定位(白色箭头)的评估。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图13B显示UNFX-条件培养基增强HUVEC细胞培养物的促血管生成行为。将HUVEC细胞(100,000个/孔)覆盖在Media200加0.5%BSA中的聚合基质胶(Matrigel)上。添加非条件培养基(左)或UNFX条件培养基(右)，通过图像捕捉可视地监测细胞组织响应，进行3-6小时。对细胞组织的细胞迁移(白色箭头)、调整(alignment)(黑色箭头)、管形成(红色箭头)和闭合多边形的形成(星号)进行评分。UNFX条件培养基与非条件培养相比较诱导更多的小管和闭合多边形，这表明促血管生成因子存在于培养基中。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图13C显示UNFX-条件培养基减弱上皮细胞中的纤维化途径。HK-2细胞失去上皮特征，并且当体外暴露于转化生长因子(TGF)时获得间质表型，从而复制与肾脏纤维化进展相关的上皮至间质转化(EMT)(Zeisberg等人2003NatMed9:964-968)。将HK-2细胞在非条件培养基(CTRL)、含10ng/ml TGFβ1的非条件培养基(TGFβ1)或含10ng/ml TGFβ1的UNFX条件培养基(TGFβ1+CM)中培养72小时。通过定量RT-PCR测定细胞的CDH1(上皮标志物)、CNN1(间质标志物)和MYH11(间质标志物)。条件培养基减小TGFβ1-诱导的EMT的程度，如通过CDH1、CNN1和MYH11基因表达测量的。误差棒代表3个实验重复的平均值的标准差(SEM)。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图13D描述了通过TGFβ1和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)建立的正反馈回路，当不抑制该回路时，可导致细胞外基质蛋白质的逐渐积累(Seo等人，2009.Am J Nephrol30:481-490)。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图14A-B显示系膜细胞中纤维化途径的减弱。将HRMC在对照(CTRL)或添加(+)或不添加(-)5ng/ml TGFβ1的UNFX条件培养基(UNFX CM)中培养24小时。PAI-1的蛋白质印迹分析显示UNFX CM减弱TGFβ1-诱导的PAI-1蛋白水平的升高。b肌动蛋白显示为上样对照。人肾小球系膜细胞(HRMC)在5ng/ml TGFb1存在(+)的情况下表达升高水平的PAI-1。利用来源于人生物活性肾细胞的条件培养基(CM)的共培养减弱TGFb1诱导的PAI-1蛋白表达。CM不改变PAI-1在mRNA水平上的表达(数据未显示)。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图14B显示来自大鼠生物活性肾细胞的CM对利用TGFb1诱导(+)和未利用其诱导(-)的培养HRMC具有相似的作用。离心后收集的CM上清液(消耗大鼠CM)在减弱PAI-1表达上不太有效，这表明负责观察到的PAI-1蛋白的减弱的CM组分可能与由大鼠生物活性肾细胞分泌的囊泡结合。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图15显示来自UNFX的条件培养基包含分泌的囊泡。Ilagan等人PCT/US2011/036347的图15A描述了分泌的囊泡(包括外来体)，其为包括细胞质来源的内部组分(绿色)的双脂质结构(红色)。磷脂酰丝氨酸(蓝色三角形)为在囊泡生物合成过程中暴露于细胞外空间的膜的组分(Thery等人，2010.Nat Rev Immunol9:581-593)。
PKH26和CFSE分别标记分泌的囊泡的脂质膜和细胞质(Aliotta等人，2010.ExpHematol38:233-245)，而膜联蛋白V结合磷脂酰丝氨酸。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图15B-C显示FACS分选。UNFX条件培养基用PKH26、CFSE和缀合有APC的膜联蛋白V进行标记，随后利用荧光辅助细胞分选术(FACS)进行分选。收集代表分泌的囊泡的三阳性颗粒，使用TRIZol试剂提取总RNA。使用商购的基于RT-PCR的阵列筛选微小RNA内容物的已知序列。
表5显示分泌的囊泡包含具有预测的治疗结果的微小RNA。UNFX细胞排出包含已知的miRNA序列的外来体。UNFX-条件培养基影响人细胞系的功能上相关的再生响应。检测到的miRNA与观察到的再生响应之间的因果关系正处于活跃的研究中；然而，迄今获得的结果表明UNFX细胞具有生成通过外来体-介导的miRNA至靶细胞和组织的转移的治疗上相关的旁分泌作用的潜能。
表5
*Taganov等人，2006.Proc Natl Acad Sci USA103:12481-12486.
**Chen和Gorski,2008.Blood111:1217-1226.
***Rogler等人，2009.Hepatology50:575-584.
数据支持来自生物活性肾细胞培养物的外排囊泡包含减弱由TGFb1/PAI-1反馈回路诱导的PAI-1的组分的结论。
微阵列和RT-PCR分析。将来自路易斯大鼠的未分级(UNFX)的生物活性肾细胞在低氧条件(2%O2)下于基础培养基(不含血清或添加物的DMEM与KSFM的50:50混合物)中培养24小时。收集条件培养基，在4℃下以100,000xg超速离心2小时来沉淀分泌的囊泡(例如微囊泡、外来体)。从所得的沉淀提取总RNA，利用实时RT-PCR(Rat MicroRNA Genome V2.0PCRArray;Qiagen#MAR-100A)测定已知的微小RNA种类。Ilagan等人PCT/US2011/036347的第74页的第26行至第77页的第67行中所列的miRNA miRNA是可检测的。
实施例15–来源于生物活性肾细胞的旁分泌因子
在本研究中，我们利用基于细胞的体外测定来研究生物活性肾细胞可籍以通过调节介质例如溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)调节纤维化的潜在旁分泌机制。
材料和方法:从无血清和无补充物的条件下的大鼠和人的生物活性肾细胞的培养物收集条件培养基(Aboushwareb等人，World J Urol26,295,2008；Presnell等人2010，同上)，将其用于体外测定。商购的大鼠和人来源的系膜细胞在体外测定中用作宿主响应组织的替代者，因为系膜细胞为受损或患病的肾中PAI-1生成的来源(Rerolle等人，KidneyInt58,1841,2000.)。分别通过定量RT-PCR和蛋白质印迹测定PAI-1基因和蛋白质表达。通过利用高速离心(Wang等人，Nuc Acids Res2010,1-12doi:10.1093/nar/gkq601,2010年7月7日)收集由细胞排到培养基的囊泡颗粒(例如，外来体)，利用TRIzol试剂(Invitrogen)从沉淀提取总RNA。使用已知的微小RNA序列的基于PCR的阵列筛选囊泡的RNA内容物(Qiagen)。
结果：来自生物活性肾细胞培养物的条件培养基减弱系膜细胞中TGFβ1-诱导的PAI-1稳定状态蛋白质水平的增加，但不影响稳定状态mRNA水平；观察与微小RNA籍以调节靶基因的机制一致。基于假说：微小RNA可通过细胞外囊泡运输在细胞之间转移(Wang等人，同上，2010)，我们分析条件培养基的微小RNA内容物并且确认了微小RNA30b-5p(miR-30b-5p)，PAI-1的假定抑制剂的存在。
此处显示的数据表明生物活性肾细胞可直接通过miR-30b-5p经外来体至靶系膜细胞的细胞间转移调节纤维化。作为系膜细胞吸收miR-30b-5p的结果，TGFβ1-诱导的稳定状态的PAI-1蛋白水平的增加被减弱(肾组织中可最终减少细胞外基质在肾小球空间内的沉积的响应)。目前的工作正在进行，以确认PAI-1确实是miR-30b-5p的直接靶。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图14A-B显示在对照(CTRL)或向培养基中添加了(+)或未添加(-)TGFβ1的生物活性肾细胞条件培养基(CM)中培养24小时的人系膜细胞的PAI-1和α-肌动蛋白(对照)的蛋白质表达的蛋白质印迹。在CTRL培养物中，TGFβ1增加PAI-1蛋白的表达。在CM培养物中，TGFβ1诱导的响应被减弱。
分析分泌的囊泡的可为PAI-1的假定抑制物的微小RNA。通过高速离心从人和大鼠生物活性肾细胞CM收集分泌的囊泡，使用已知序列的基于PCR的阵列测定囊泡的微小RNA内容物。鉴定了miR-449a，PAI-1的假定调节剂(6)。利用miR-449a或不用miR-449a(CTRL)瞬时转染HRMC。将转染后24小时的细胞暴露于5ng/ml TGFb1(+)或不暴露(-)另外24小时。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图16A显示其中制备总蛋白质并且测定其PAI-1和b肌动蛋白的蛋白质印迹。miR-449a降低稳定状态PAI-1蛋白水平(比较泳道1至泳道3)并且诱导的PAI-1蛋白的水平在miR-449a转染的培养物中也更低(比较泳道2至泳道4)。数据支持外排的囊泡包含miR-449a并且miR-449a至系膜细胞中的吸收减少PAI-1表达的结论。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图16B描述了微小RNA，miR-30b-5p，其也在基于PCR的阵列中被鉴定，并且基于预测算法(http://mirbase.org-miRBase由曼彻斯特大学的生命科学学院托管和维护)为PAI-1的假定调节剂。
在利用生物活性肾细胞处理通过5/6肾切除术诱导的CKD后，体内检查肾小球中的PAI-1蛋白水平。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图17A-C显示已经历单侧肾切除术(A)、5/6肾切除术(B)或5/6肾切除术和生物活性肾细胞的肾内递送(C)的路易斯大鼠肾的PAI-1(A-C)的代表性免疫组织化学图像。由于5/6肾切除术(B)，PAI-1在肾小球(箭头)中的积累作为处理的结果(C)而减少。
在独立的研究中，对在尸检时收获的肾组织进行qRT-PCR，将相对基因表达值针对研究的天数作图。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图17D显示5/6肾切除的大鼠(红色方块)相对于利用生物活性肾细胞(蓝色荾形)和假手术对照假手术对照(绿色三角形)处理的大鼠显示更强劲的PAI-1表达。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图17E显示在处理后3个月和6个月关于肾样品的代表性蛋白质印迹分析。5/6肾切除的大鼠(Nx)的处理的组织(Nx+Tx)已减少了PAI-1和纤连蛋白(FN)蛋白质的积累(Kelley等人2010，同上)。
数据支持在利用生物活性肾细胞处理由5/6肾切除术诱导的CKD后，肾小球疾病中体内PAI-1蛋白水平降低的结论。综上所述，实施例15-16支持假说：生物活性肾细胞的肾内递送籍以增强肾功能的一个机制可能是通过调节驻留肾细胞中的纤维化途径的组分的细胞间转移。
实施例16-来自生物活性肾细胞的分泌的因子减弱NFκB信号转导途径
在本研究中，我们在5/6肾切除术模型中研究了NFκB途径在NKA介导的疾病进展的减弱中的作用并且鉴定了可通过直接调节NFκB激活促成再生结果的生物活性肾细胞的性质。Ilagan等人PCT/US2011/036347的图17G描述了TNFα对NFkB途径的典型激活。
材料和方法:从其中在利用PBS中的B2+B4(NKA原型)处理之前6周进行两步5/6肾切除术过程的路易斯大鼠收获残余肾。通过免疫组织化学、RT-PCR、蛋白质印迹分析以及电泳迁移率变化测定(EMSA)分析NKA-处理(TX)或未处理(UNTX)的组织的NFκB激活。将从在无血清和无补充物的培养基中生长的离体NKA细胞培养物收集的条件培养基(CM)用于体外功能测定。将人近端肾小管细胞系(HK-2)用作用于基于分子和免疫荧光的测定读出的靶细胞类型。通过高速离心收集由细胞排到培养基的囊泡颗粒(外来体)。使用已知微小RNA序列的基于PCR的阵列(Qiagen)筛选从外来体分离的总RNA。
结果：在来自5/6肾切除的大鼠的残余肾中观察到NFκB亚单位RelA/p65的核定位，这表明UNTX组织中的炎症途径的激活。通过RT-PCR进行的与TX组织的初步比较显示RelA基因表达的减少，这表明NKA处理可通过抑制RelA/p65表达来影响NFκB途径的激活。该假说得到这样的观察的支持：CM在体外减弱TNFα-诱导的NFκB激活，如通过相对于响应肿瘤坏死因子-α(TNFα)看到的暴露于CM的HK-2细胞中减少的RelA/p65的核定位(Ilagan等人PCT/US2011/036347的图17F)所证明的。不断发展的NKA外来体微小RNA的RT-PCR分析研究是否存在已知影响NFκB途径的序列。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图17F显示在免疫荧光测定中，对NKA CM的2小时暴露减少了HK-2中NFκB p65(绿色)的核定位(与在用TNFα预处理的对照培养物中观察到的相比较)。在HK-2中，在暴露于TNFα(对照培养基)30分钟后，NFkB p65(绿色)定位至细胞核。然而，在添加TNFα之前利用NKA条件培养基预处理HK-2细胞2小时减弱了NFkB p65的核定位响应。用DAPI(蓝色)对细胞核进行染色，用Alexa594-鬼笔环肽(红色)对丝状肌动蛋白进行染色以帮助定性评估NFκB核定位的强度(注意底排的合并图像中TNFα-处理的对照细胞的略微减小的鬼笔环肽边界)。在合并图像中，复染色为NFkB定位提供了参照。
路易斯大鼠的肾组织的NFkB p65亚单位的免疫组织化学显示具有通过5/6肾切除术(图框B)引起的进行性CKD的动物相对于对照动物的通过单侧肾切除(图框A)引起的非进行性肾功能不全具有更强劲的NFkB p65亚单位的核定位(特别地在肾小管上皮细胞(黑色箭头)中)。肾切除术后6周收获组织。放大倍数为200X。
图框C：已经历5/6肾切除术的路易斯大鼠肾组织的细胞质(‘C’)和细胞核(‘N’)蛋白质提取物中NFkB p65的蛋白质印迹分析。比较第1周与第13周，其中gtubulin水平(上样对照)相对一致，细胞核NFkBp65随时间过去增加，与免疫组织化学结果一致。
图框D：关于细胞核提取物的电泳迁移率变化测定(EMSA)确认了在5/6肾切除术后定位至细胞核的NFkB被激活以进行DNA结合。泳道代表在每一个时间点上从两个动物制备的核提取物。
NFkB途径在慢性肾病的5/6肾切除术模型中被逐渐激活。对路易斯大鼠的肾组织的NFkB p65亚单位进行免疫组织化学。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图18A-D显示具有由5/6肾切除术(图框B)引起的进行性CKD的动物相对于对照动物的由单侧肾切除术(图A)引起的非进行性肾功能不全具有更强劲的NFkB p65亚单位的核定位(特别地在肾小管上皮细胞(黑色箭头))。肾切除术后6周收获组织。放大倍数为200X。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图18C显示已经历5/6肾切除术的路易斯大鼠肾组织的细胞质(‘C’)和细胞核(‘N’)蛋白质提取物中NFkB p65的蛋白质印迹分析。比较第1周与第13周，其中gtubulin水平(上样对照)相对一致，细胞核NFkB p65随时间过去增加，与免疫组织化学结果一致。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图18D显示关于细胞核提取物的电泳迁移率变化测定(EMSA)并且确认在5/6肾切除术后定位至细胞核的NFkB被激活以进行DNA结合。泳道代表在每一个时间点上从两个动物制备的细胞核提取物。将1mg核蛋白与5ng NFkB DNA结合位点一起孵育，将其在6%DNA阻滞凝胶上进行电泳，随后用溴化乙锭染色。
NKA细胞的肾内递送减少NFkB的核定位。多个确定的肾细胞亚群已被分离，并且已在CKD的5/6肾切除术模型中体内测定了其在促进肾功能中的生物活性(Presnell等人2010，同上)。NKA细胞显示生物活性，然而其它亚群未显示生物活性(Kelley等人2010，同上)。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图18E显示接受NKA(A)或无生物活性肾细胞(B)的肾内注射的具有已建立的CKD的路易斯大鼠。具有已建立的CKD的路易斯大鼠接受NKA(A)或无生物活性肾细胞(B)的肾内注射。在处理后6个月，收获组织，通过免疫组织化学测定其NFkB p65亚单位。来自NKA处理的动物的组织与来自利用无生物活性肾细胞处理的动物的组织相比较显示更少的NFkB p65的核定位(特别地在近端肾小管细中)，这表明NKA处理在体内参与减弱NFkB途径活性。
使用已知序列的基于PCR的阵列通过高速离心进行的从人和大鼠NKA条件培养基分离的分泌囊泡的微小RNA内容物的分析鉴定了几个微小RNA种类，基于文献报导(MarquezRT等人(2010)Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 298:G535；Taganov KD等人(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103:12481)或预测算法(http://mirbase.org -miRBase由曼彻斯特大学的生命科学学院托管和维护)，所述微小RNA种类可通过NFkB影响免疫响应。
体内和体外发现提供了关于生物活性肾细胞(NKA)如何能够通过调节免疫响应途径例如受NFkB激活影响的免疫调节响应途径来增强患慢性病的肾的肾功能的见解。激活的NFkB(p65核定位，特别地在近端肾小管细胞中)与5/6肾切除啮齿类动物模型中慢性肾病的建立相关并且被NKA处理减弱。近端肾小管细胞(HK-2)对NKA条件培养基的体外响应模拟NFkB核定位响应NKA处理的体内减弱。在NKA条件培养基中鉴定了NFkB激活的细胞间抑制的假定介质(微小RNA)。综上所述，这些数据支持假说：生物活性肾细胞的肾内递送籍以增强肾功能的一个机制是通过调节驻留肾细胞的免疫响应的组分例如RNA的细胞间转移。
实施例17-NKA构建体的功能评估
接种在明胶或基于HA的水凝胶上的肾细胞群体是能够存活的并且在3天的体外成熟过程中维持肾小管上皮功能表型，如通过转录物组学、蛋白质组学、分泌蛋白质组学和共聚焦免疫荧光测定所测量的。为了研究NKA构建体可籍以影响疾病状态的潜在机制，评估条件培养基对与与CKD进展相关的小管间质性纤维化(tubulo-interstitial fibrosis)相关的TGF-β信号转导途径的作用。在人近端肾小管细胞系(HK2)中观察到条件培养基在体外减弱TGF-β-诱导的上皮细胞-间质细胞转化(EMT)。材料和方法描述于Ilagan等人PCT/US2011/036347(实施例15)中。
HK2细胞的TGF-β介导的EMT的分析。将HK2细胞(ATCC)在纤连蛋白或胶原(IV)包被的培养皿(BD Biosciences)中培养于50:50培养基中。为了进行EMT测定，利用50:50培养基或从二维(2D)人UNFX培养物或用在培养基收集之前进行3天成熟的人UNFX制备的NKA构建体收集的条件培养基将HK2细胞以70-80%的汇合度接种在24-孔胶原(IV)包被的板中。通过在从细胞分离RNA用于EMT测定之前3天将10ng/ml TGF-β添加至培养基来起始TGF-β诱导。利用qRT-PCR，通过分析在3天孵育期结束时E-钙粘蛋白(上皮标志物)和钙调节蛋白(间质标志物)的相对表达来监测EMT。从收获的HK2细胞制备RNA以用于TaqMan qRT-PCR分析，如上文中所描述的。使用标准双尾学生t检验来进行统计分析，假定对于每一个样品存在相同的变化。将95%(p-值＜0.05)和99%(p-值＜0.01)的置信区间用于测定统计显著性。
结果：来自NKA构建体的条件培养基对HK2细胞的TGF-β诱导的EMT的作用。在CKD的进展过程中小管-间质性纤维化的发展与肾小管上皮细胞的TGF-β介导的EMT相关(Zeisberg等人Am J Pathol160(6):2001-2008;2002)。同样地，也在进行性CKD的啮齿类动物模型中体内观察到TGF-β途径的减弱，其中存活被延长并且肾功能通过利用UNFX和B2细胞的处理得到增强(Presnell等人WO/2010/056328)。人近端肾小管细胞系HK2已被良好地建立为测试小分子或蛋白质对TGF-β诱导的EMT的刺激或抑制作用的体外模型系统(Dudas等人Nephrol Dial Transplant24(5):1406-1416;2009；Hills等人Am J Physiol RenalPhysiol296(3):F614-621;2009)。为了研究NKA构建体可能籍以影响植入后肾组织响应的潜在机制，在HK2EMT测定系统中评估从利用UNFX细胞与水凝胶生成的NKA构建体收集的条件培养基。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图26显示来自NKA构建体的条件培养基在体外减弱HK2细胞的TGF-β诱导的EMT。通过定量ECAD(上皮)和CNN1(间质)标志物的相对表达来监测EMT。将HK2细胞培养在50:50培养基(对照和TGFB对照样品)或来自人UNFX细胞(TC)的2D培养物或从人UNFX细胞与所示明胶或HA/明胶生成的NKA构建体的条件培养基(CM)中。为了诱导EMT，将10ng/ml TGF-β添加至每一个样品(除对照外)进行3天，然后进行测定。当将HK2细胞培养在50:50培养基(对照)中时，ECAD(上皮标志物)以比CNN1(间质标志物)高的水平表达。当将TGF-β添加至培养基中进行3天(TGFB对照)时，ECAD表达被显著下调，同时伴随CNN1的上调，这与EMT事件的诱导一致。来自2D UNFX细胞培养物的条件培养基显著(p＜0.05，对于ECAD和CNN1)减弱HK2细胞对TGF-β的EMT响应(TC CM)。来自NKA构建体(明胶CM和HA/明胶CM)的条件培养基也减弱对TGF-β的EMT响应；然而，总体作用小于对于来自2D UNFX细胞培养物的条件培养基观察到的作用(对于两种NKA构建体，对于ECAD而言，p＜0.05是显著的，并且趋向于对照，虽然对于CNN1而言在统计上不显著)。筛选另外的间质标志物，并且所述标志物生成相似的结果(数据未显示)。这些数据表明NKA构建体可在体内以与对于基于细胞的处理观察到的方式(Presnell等人WO/2010/056328)相似的方式潜在地影响与小管间质性纤维化相关的TGF-β途径。这些数据还表明如果体内响应经显示可与体外EMT响应具有统计上显著的关联性，则体外EMT测定具有用于筛选/最优化/监测NKA构建体的生物治疗功效的潜在应用，从而潜在地减少了对耗时昂贵的体内测定的需要。
实施例18-培养的人肾细胞的缺氧暴露诱导细胞迁移和附着的介质以及有助于肾 小管细胞单层的体外修复
研究氧张力在于慢性肾病(CKD)的模型中具有证实的治疗功能的肾上皮细胞(B2)的选择的群体的分离和功能中的作用。本研究检查在处理过程中低氧暴露是否改变选择的人肾细胞(SRC)或生物活性肾细胞(BRC)的组成和功能。在暴露于2%的氧后，观察到下列现象：细胞跨密度梯度的分布的改变(参见Presnell等人WO10/056328，通过引用整体并入本文)，总体梯度后产率的提高，氧调节的基因表达的调节(先前报导于Kelley等人，同上，(2010)中)，增加的红细胞生成素、VEGF、HIF1-α和KDR(VEGFR2)的表达。在处理中，对低氧的暴露增强选择的生物活性肾细胞修复/再生受损肾小管的能力。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图27描述了在处理过程中将细胞暴露于低氧的方法。Ilagan等人PCT/US2011/036347的图28显示在暴露于2%的氧后，观察到下列现象：改变细胞的跨密度梯度的分布，提高了总体梯度后产率。缺氧暴露(＜3%)增加了培养的人CKD来源的肾细胞从基于碘克沙醇的密度梯度的回收(相对于大气氧张力(21%))(96%对74%)和增加了选择的细胞(B2)至高密度(>9%碘克沙醇)级分(21.6%对11.2%)的相对分布。
竞争性体外测定显示预暴露于缺氧条件24小时的B2细胞比在21%的氧张力下培养的B2细胞更精于修复受损的近端肾小管细胞单层培养物，58.6%±3%的修复在损害的两小时内发生。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图29A描述了被开发来体外观察肾小管细胞单层的修复的测定。1.用荧光染料标记细胞(2%的氧，21%的氧和HK2肾小管细胞)。2.建立肾小管细胞单层，损害所述单层。3.加入暴露于氧的标记细胞(暴露于2%和21%的氧的细胞)。将它们同样地以20,000/cm2接种。在5%O2下于无血清培养基中培养24小时。4.定量修复损害的细胞。图29B-定量成像分析(BD Pathway855BioImager)-红圆圈=在2%O2下培养的细胞，蓝圆圈=21%O2。图29C-观察到2%的氧诱导的细胞更快地(2小时)附着并且保持微弱优势24小时。利用2%的氧诱导的细胞更精于肾小管上皮单层的修复。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图30A描述了被开发来体外观察肾小管细胞单层的修复的测定。1.用荧光染料标记细胞。2.在8μm孔径的transwell插入物的底部建立肾小管细胞单层，然后损害所述单层。3.倒转插入物，添加暴露于氧的标记细胞(暴露于2%和21%的氧的细胞)。将它们同样地以50,000/cm2接种。在5%O2下于无血清培养基中培养24小时。4.定量修复损害的细胞。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图30B显示利用2%的氧诱导细胞与未诱导的(21%的氧)相比较增强了迁移和伤口修复。图30C将迁移细胞%对迁移时间作图。细胞的平均数目和细胞的平均百分比提供于表6中。
缺氧还诱导CXCR4、MMP9、ICAM1和肌营养不良蛋白聚糖、介导细胞迁移和粘附的基因的mRNA表达。通过免疫细胞化学确认MMP9在细胞膜上的局部积累和连接蛋白43聚集体在细胞膜上的增加。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图31A显示骨桥蛋白由肾小管细胞分泌并且响应损害而被上调(骨桥蛋白免疫组织化学：赫斯特核染色(蓝色)，骨桥蛋白(红色)，10x)。骨桥蛋白为分泌型磷酸化糖蛋白(Kelly等人J Am Soc Soc Nephrol,1999)。骨桥蛋白在肾小管中表达并且参与粘附和迁移。骨桥蛋白在已建立的肾小管细胞单层中因损害而被上调，如通过免疫荧光(Ilagan等人PCT/US2011/036347的图31A)和ELISA(Ilagan等人PCT/US2011/036347的图31B)显示的。
表6
使用样品PCI的定理图像分析
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图32A显示细胞的迁移响应部分由骨桥蛋白介导(绿色=迁移的细胞(5x))。Ilagan等人PCT/US2011/036347的图32B显示针对骨桥蛋白的中和抗体(NAb)减少肾细胞迁移响应50%。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图33显示细胞的低氧诱导调节组织重构基因的表达。窖蛋白1为参与整联蛋白信号转导的调控的支架蛋白质。MMP9为通过细胞外基质降解帮助迁移的金属蛋白酶。ICAM1为与上皮细胞运动相关的细胞内粘附分子。CXCR4为介导细胞迁移的趋化因子表面受体。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的图34描述了导致肾再生的细胞的生物活性的低氧增强的假定机制。
综上所述，这些结果表明缺氧暴露有利于显示具有肾小管损害的体外修复的生物活性的特定肾细胞亚群的分离，从而可在体内递送后潜在地增强此类细胞迁移和移入患病组织的能力。SRC在进行性CKD的啮齿类动物模型中显示稳定肾功能和增强存活的能力。低氧水平(2%O2)提供了下列方面：增加的选择的再生细胞的培养后回收；增强的响应肾小管损害的细胞粘附和单层修复；和响应肾小管损害的刺激的细胞迁移。此外，细胞迁移和粘附部分由骨桥蛋白体外介导，低氧上调整联蛋白、分泌型蛋白质以及介导组织重构、迁移和细胞间通信的细胞粘附分子。
实施例19-尿来源的微囊泡
进行排入尿中的肾来源的微囊泡的腔内容物中的miRNA和蛋白质的分析以确定它们是否可能用作评估再生结果的生物标志物。由于过量微囊泡排入细胞外空间中，因此一些微囊泡与相邻细胞融合，而其它微囊泡排入尿中(Zhou等人2008.Kidney Int.74(5):613-621)。此类尿微囊泡现成为测定发展(以更好地理解治疗结果)的优良生物标志物。
使用具有慢性进行性肾功能衰竭的代谢疾病的ZSF1啮齿类动物模型。将B2+B4细胞注射入ZSF1动物的肾实质。将健康动物和PBS媒介物用作对照。如下所概述的，在不同时间点上分析尿来源的囊泡。
1:ZSF1动物-注射PBS媒介物；在注射后197天收集尿
2:ZSF1动物-注射PBS囊泡；在注射后253天收集尿
3:ZSF1动物-注射B2+B4级分；在注射后197天收集尿
4:ZSF1动物-注射B2+B4级分；在注射后253天收集尿
5.ZSF1动物-无注射；在研究的第197天收集尿
6.ZSF1动物-无注射；在研究的第253天收集尿
7.健康动物-无注射；在研究的第197天收集尿
8.健康动物-无注射；在研究的第253天收集尿
在处理后第197天和约253天从测试动物收集尿。通过本领域已知的标准方法(例如，参见Zhou等人Kidney Int.2008年9月;74(5):613-621)从尿回收微囊泡。如由Ilagan等人PCT/US2011/036347的图35中的标准蛋白质印迹所显示的，从处理的动物(泳道3-4)的尿回收的微囊泡，当与媒介物处理的(泳道1-2)或未处理的对照(泳道5-8)相比较时，显示与祖细胞相关的蛋白质(CD133及WNT7A)的增加。事实上，仅从患病动物(泳道1-6)而未从健康对照(泳道7-8)回收到微囊泡，如通过微囊泡特异性蛋白CD63的表达显示的(Ilagan等人PCT/US2011/036347的图35)。含CD133的微囊泡似乎为从肾细胞排出的prominosome。CD133和WNT7A都与再生和干细胞分裂相关(Romagnani P和Kalluri R.2009.FibrogenesisTissue Repair.2(1):3；Lie等人2005.Nature.437(7063):1370-5；Willert等人2003.Nature.423(6938):448-52；Li等人2009.Am J Physiol Renal Physiol.297(6):F1526-33)。综上所述，这支持微囊泡中表达的靶蛋白为用于被设计来监测再生的测定发展的生物标志物。
miRNA微阵列和RT-PCR。利用本领域已知的标准方法(例如，参见Wang等人，同上，2010)进行来自尿来源的囊泡的miRNA的微阵列和RT-PCR分析。除了蛋白质外，还在分离的微囊泡的内容物中发现了miRNA。Ilagan等人PCT/US2011/036347的表17.1提供了经发现因处理而增加的miRNA的实例。分析随时间过去(第197和第253天)用B2+B4处理的ZSF1动物的miRNA的改变。观察了从Ilagan等人PCT/US2011/036347的第98页的第1行至第100页的第50行所列的miRNA的倍数变化。分析利用B2+B4(第253天)处理的ZSF1动物的miRNA水平，将其与利用PBS媒介物(第253天)处理的ZSF1动物的miRNA水平相比较。观察了Ilagan等人PCT/US2011/036347的第100页的第53行至第103页的第7行所列的miRNA的倍数变化。分析利用B2+B4(第197天)处理的ZSF1动物的miRNA水平，将其与利用PBS媒介物(第197天)处理的ZSF1动物的miRNA水平相比较。观察了Ilagan等人PCT/US2011/036347的第103页第12行至第105页第10行所列的miRNA的倍数变化。
Ilagan等人PCT/US2011/036347的表17.1中所列的miRNA提供了已牵涉与组织再生相关的过程的miRNA的实例。miR-15b已牵涉通过BCL-2和半胱天冬酶(caspase)调控调节细胞凋亡(Guo等人2009.J Hepatol.50(4):766-78)以及通过细胞周期蛋白的调控调节细胞周期进展(Xia等人2009.Biochem Biophys Res Commun.380(2):205-10)。已显示miR-21通过调节存活途径MAPK/ERK抑制细胞凋亡。miRNA的miR-30家族对于足细胞(podocyte)结构和功能是至关重要的，这表明增加可能是肾小球发生(glomerulargenisis)所必需的。miR-141、200a、200c和429全都参与调节响应可能减少纤维化的TGF-β信号转导的上皮至间质转化(EMT)(Saal等人2009.Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.18:317-323)。miR-146a和151牵涉NFκB调节，因此潜在地减少体内炎症响应(Taganov等人2006.Proc Natl Acad SciU S A.103(33):12481-6；Griffiths-Jones等人2006.NAR.34Database Issue:D140-D144)。综上所述，此类miRNA调控与成功的再生结果相关的过程；因此使它们成为测定发展的候选生物标志物。总之，该数据支持这样的概念：除了为医生提供监测治疗的非侵袭性方法外，尿微囊泡和/或其腔内容物还可为再生测定的可行的靶，因为它们包含能够调控多个途径的蛋白质和miRNA，所述途径包括：TGFβ-1、NFκB、细胞凋亡、细胞分裂和多能性。
实施例20–制备人肾细胞聚集体的方法
使用上文中描述的用于生成NKA的标准操作方法分离人肾细胞。扩增细胞，在暴露于低氧环境(2%O2)进行18小时之前，通过两次代继代培养。暴露后，收获细胞，将其经历两步骤密度梯度(7%和16%w/v Optiprep)，在无制动装置的情况下以800x g离心20分钟。收集在7与16%的层之间形成的所得的条带，洗涤条带(B2、B3、B4)。计数细胞，评估活力。通过在被多聚-HEMA包被以阻止附着的多孔板中培养细胞(20-30x103个细胞/cm2)，将细胞置于轨道旋转器上于培养箱中进行24小时(图30A)。或者，将形成条带的细胞以1x106个细胞/ml的浓度重悬浮于75ml的肾生长培养基中，将其置于125ml旋转瓶(BD)中，在37℃/5%CO2下置于培养箱内的磁搅拌器(4-40rpm)上(图30B)。在测定表型变化之前，使细胞自我聚集以生成球状体，进行24-48小时(图31)。可在旋转瓶内测定细胞，或可将细胞转移至更小的多聚-HEMA包被的多孔板以进行测定，所述细胞保持球状体。进行任何适当的测定来测量表型变化、功能、活力和细胞凋亡。表7提供了示例性测定和相应的结果。
表7.肾球状体上功能性标志物的实例。

Claims (65)

1.一种注射制剂，其包含生物活性细胞和温度敏感性细胞稳定化生物材料，所述生物材料
(i)在8℃和更低温度下维持固体状态，和
(ii)在环境温度和更高温度下维持液体状态，
其中所述生物材料包括具有8℃与环境温度之间的固体至液体的过渡状态的水凝胶，并且
其中所述生物活性细胞在8℃或更低温度悬浮及分散在所述生物材料中，
其中所述水凝胶包含明胶，其中所述明胶以0.5％至1％(w/v)存在于所述制剂中。
2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述生物活性细胞包括肾细胞。
3.根据权利要求1所述的制剂，其中所述生物活性细胞均匀地分散在所述细胞稳定化生物材料的整个体积中。
4.根据权利要求1所述的制剂，其中所述固体状态是凝胶状态。
5.根据权利要求1所述的制剂，其中所述明胶以0.75％(w/v)存在于所述制剂中。
6.根据权利要求1所述的制剂，其还包含细胞活性剂。
7.根据权利要求6所述的制剂，其中所述细胞活性剂包含选自抗氧化剂、氧载体、免疫调节因子、细胞募集因子、细胞附着因子、抗炎剂、免疫抑制剂、血管生成因子和伤口愈合因子的试剂。
8.根据权利要求6所述的制剂，其中所述细胞活性剂是抗氧化剂。
9.根据权利要求8所述的制剂，其中所述抗氧化剂是6-羟基-2,5,7,8-四甲基色原烷-2-羧酸。
10.根据权利要求9所述的制剂，其中所述6-羟基-2,5,7,8-四甲基色原烷-2-羧酸以50μM至150μM存在。
11.根据权利要求9所述的制剂，其中所述6-羟基-2,5,7,8-四甲基色原烷-2-羧酸以100μM存在。
12.根据权利要求7所述的制剂，其中所述细胞活性剂是氧载体。
13.根据权利要求12所述的制剂，其中所述氧载体是全氟化碳。
14.根据权利要求7所述的制剂，其中所述细胞活性剂是免疫调节因子。
15.根据权利要求7所述的制剂，其中所述细胞活性剂是免疫抑制剂。
16.一种注射制剂，其包含生物活性肾细胞、0.75％(w/v)的明胶和100μM的6-羟基-2,5,7,8-四甲基色原烷-2-羧酸，其中所述制剂
(i)在8℃和更低温度下具有大体上固体状态，和
(ii)在环境温度和更高温度下具有大体上液体状态，
其中所述生物活性肾细胞在8℃或更低温度大体上均匀地分散在所述明胶的整个体积中。
17.根据权利要求16所述的制剂，其中所述制剂具有8℃与环境温度之间的固体至液体的过渡状态。
18.根据权利要求16所述的制剂，其中大体上固体状态是凝胶状态。
19.根据权利要求16所述的制剂，其还包含细胞活性剂。
20.根据权利要求19所述的制剂，其中所述细胞活性剂包含选自抗氧化剂、氧载体、免疫调节因子、免疫抑制剂、细胞募集因子、细胞附着因子、抗炎剂、血管生成因子和伤口愈合因子的试剂。
21.根据权利要求20所述的制剂，其中所述细胞活性剂是氧载体。
22.根据权利要求21所述的制剂，其中所述氧载体是全氟化碳。
23.根据权利要求20所述的制剂，其中所述细胞活性剂是免疫调节因子。
24.根据权利要求20所述的制剂，其中所述细胞活性剂是免疫抑制剂。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的制剂，其还包含含有生物材料的生物相容性珠粒。
26.根据权利要求25所述的制剂，其中所述珠粒是交联的。
27.根据权利要求26所述的制剂，其中所述交联的珠粒相较于未交联的生物相容性珠粒具有减小的对酶促降解的易感性。
28.根据权利要求26所述的制剂，其中所述交联的珠粒是碳二亚胺交联的珠粒。
29.根据权利要求28所述的制剂，其中所述碳二亚胺选自1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIPC)。
30.根据权利要求28所述的制剂，其中所述碳二亚胺是1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)。
31.根据权利要求27所述的制剂，其中所述交联的珠粒相较于未交联的珠粒包含减少的数目的游离伯胺。
32.根据权利要求31所述的制剂，其中所述游离伯胺的数目是能在355nm通过分光光度计测量检测的。
33.根据权利要求26所述的制剂，其中所述珠粒接种有生物活性细胞。
34.根据权利要求33所述的制剂，其中所述生物活性细胞是肾细胞。
35.根据权利要求26所述的制剂，其还包含另外的包含温度敏感性生物材料的生物相容性珠粒，所述生物材料
(i)在环境温度和更低温度下维持固体状态，和
(ii)在37℃和更高温度下维持液体状态。
36.根据权利要求35所述的制剂，其中所述另外的生物相容性珠粒的生物材料包括环境温度与37℃之间的固体至液体的过渡状态。
37.根据权利要求35所述的制剂，其中固体状态是凝胶状态。
38.根据权利要求35所述的制剂，其中所述另外的生物相容性珠粒的生物材料包含水凝胶。
39.根据权利要求38所述的制剂，其中所述水凝胶包含明胶。
40.根据权利要求39所述的制剂，其中所述另外的生物相容性珠粒包含5％(w/v)至10％(w/v)的明胶。
41.根据权利要求35所述的制剂，其中所述另外的生物相容性珠粒是间隔珠粒，所述间隔珠粒在制剂中提供间隔。
42.根据权利要求41所述的制剂，其中所述另外的生物相容性珠粒未接种有生物活性细胞。
43.根据权利要求2、16-24和33-34中任一项所述的制剂，其还包含由肾细胞群体分泌的产物。
44.根据权利要求43所述的制剂，其中所述产物包括旁分泌因子。
45.根据权利要求43所述的制剂，其中所述产物包括内分泌因子。
46.根据权利要求43所述的制剂，其中所述产物包括邻分泌因子。
47.根据权利要求43所述的制剂，其中所述产物包括囊泡。
48.根据权利要求47所述的制剂，其中所述囊泡包括微囊泡。
49.根据权利要求47所述的制剂，其中所述囊泡包括外来体。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的制剂，其中所述囊泡包含选自旁分泌因子、内分泌因子、邻分泌因子和RNA的分泌产物。
51.根据权利要求25所述的制剂，其还包含由肾细胞群体分泌的产物。
52.根据权利要求51所述的制剂，其中所述产物包括旁分泌因子。
53.根据权利要求51所述的制剂，其中所述产物包括内分泌因子。
54.根据权利要求51所述的制剂，其中所述产物包括邻分泌因子。
55.根据权利要求51所述的制剂，其中所述产物包括囊泡。
56.根据权利要求55所述的制剂，其中所述囊泡包括微囊泡。
57.根据权利要求55所述的制剂，其中所述囊泡包括外来体。
58.根据权利要求55-57中任一项所述的制剂，其中所述囊泡包含选自旁分泌因子、内分泌因子、邻分泌因子和RNA的分泌产物。
59.根据前述权利要求任一项的制剂在制备用于治疗需要治疗的受试者的药物中的用途。
60.权利要求59的用途，其中所述受试者正在经历或已经历器官相关疾病的一个或多个体征、症状或其它指标。
61.权利要求60的用途，其中所述器官相关疾病选自肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷。
62.权利要求59的用途，其中所述治疗为器官相关疾病的稳定化和/或改善。
63.权利要求62的用途，其中要稳定化和/或改善的器官相关疾病选自肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷和肾小球滤过缺陷。
64.权利要求59的用途，其中所述治疗是器官相关疾病的预防。
65.权利要求64的用途，其中要预防的器官相关疾病选自肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷和肾小球滤过缺陷。
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