KR102238108B1 - 장기 확대를 위한 주사가능 제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 활성 작용제, 예를 들면, 생체활성 세포 집단을 내포하는 치료 제제, 그리고 이들을 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

장기 확대를 위한 주사가능 제제{INJECTABLE FORMULATIONS FOR ORGAN AUGMENTATION}
발명의 분야
본 발명은 활성 작용제, 예를 들면, 생체활성 세포 집단의 치료 제제, 이들을 제조하는 방법, 그리고 치료가 필요한 피험자에 이들 제제를 투여하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
콜라겐과 젤라틴-기반 생체물질은 다양한 조직 공학 적용을 위해 성공적으로 이용되고 있다 [Rohanizadeh et al. J Mater Sci Mater Med 2008; 19: 1173-1182; Takemoto et al. Tissue Eng Part A 2008; 14: 1629-1638; Young et al. J Control Release 2005; 109: 256-274]. 이들 양쪽 거대분자는 우수한 생체적합성 및 낮은 항원성으로 특징지어진다 [Cenni et al. J Biomater Sci Polym Ed 2000; 11: 685-699; Lee et al. Int J Pharm 2001; 221: 1-22; Waksman et al. J Immunol 1949; 63: 427-433]; 하지만, 젤라틴이 콜라겐의 가수분해에 의해 수득되기 때문에, 젤라틴은 후자에 비하여 일정한 이점을 갖는다: (a) 이것은 쉽게 입수가능하고 이용하기 간편하다; (b) 분자량과 블럼 (bloom)에 관하여 옵션 (즉, 물리적 성질의 제어)을 제공한다; 그리고 (c) 화학적 변형에 대하여 더욱 유연하고 제조가 더욱 간단하다. 게다가, 생물학적 관점으로부터, 젤라틴은 콜라겐과 유사한 세포적합성과 세포 부착 성질을 유지한다 [Engvall et al. Int J Cancer 1977; 20: 1-5; Kim et al. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2009; 108: e94-100].
이들 거대분자의 생물분해를 지연시켜 그들의 생체내 체류를 연장 (조직 공학 적용에서)하거나, 또는 그들의 약물 방출 능력을 맞춤 (약물 담체로서 이용될 때)하는 목적으로 이들의 가교를 위한 다양한 방법이 보고되었다. 콜라겐 또는 젤라틴의 화학적 또는 광화학적 가교를 위한 다수의 방법이 공개되었다 [Adhirajan et al. J Microencapsul 2007; 24: 647-659; Chang et al. Macromol Biosci 2007; 7: 500-507; Gagnieu et al. Biomed Mater Eng 2007; 17: 9-18; Kimura et al. J Biomater Sci Polym Ed 2010; 21: 463-476; Ma et al. J Biomed Mater Res A 2004; 71: 334-342; Vandelli et al. Int J Pharm 2001; 215: 175-184; Vandelli et al. J Control Release 2004; 96: 67-84]. 이들 절차 중에서 대부분은 효소 분해에 대한 이들 생체물질의 감수성을 감소시키고 그들의 생체내 체류 시간을 연장하기 위해 표적화된다 [Chang et al. supra 2007; Ma et al. supra 2004]. 기타 가교 방법은 느린 방출 약물, 단백질 또는 핵산 담체로서 적합한 젤라틴 또는 콜라겐-기반 생체물질을 산출하는데 전형적으로 이용된다 [Kimura supra 2010; Vandelli supra 2004; Kommareddy et al. Nanomedicine 2007; 3: 32-42; Sehgal et al. Expert Opin Drug Deliv 2009; 6: 687-695; Sutter et al. J Control Release 2007; 119: 301-312]. 콜라겐과 젤라틴뿐만 아니라 기타 조직 공학-적합성 시스템을 위해 폭넓게 이용되는 가교제 부류는 카르보디이미드이다 [Adhirajan supra 2007; Olde Damink et al. Biomaterials 1996; 17: 765-773; Pieper et al. Biomaterials 2000; 21: 581-593; Cornwell et al. Clin Podiatr Med Surg 2009; 26: 507-523]. 이들 분자는 제로-길이 가교제로서 공지되고, 그리고 가교되는 종류 상에 존재하는 카르복실과 일차 아민 기능성 사이에 아미드 결합의 형성을 매개함으로써 작용한다. 게다가, 카르보디이미드는 다른 통상의 가교제 (가령, 글루타르알데히드)와 비교하여 독성이 덜하다 [Lai et al. J Mater Sci Mater Med 2010; 21: 1899-1911). 글루타르알데히드는 CultispherTM 비드에서 가교제로서 이용된다. Burg U.S. 특허 번호 6,991,652는 피험자에 전달될 수 있는 세포에 대한 3차원 지지 구조물을 내포하는 조직 공학 복합물을 기술한다.
재생 의학 기술은 만성 신장 질환 (CKD)에 대한 차세대 치료 옵션을 제공한다. Presnell et al. W0/2010/056328 및 Ilagan et al. PCT/US2011/036347은 세뇨관과 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 신장 세포 집단을 포함하는 분리된 생체활성 신장 세포, 이들을 분리하고 배양하는 방법, 그리고 치료가 필요한 피험자를 이들 세포 집단으로 치료하는 방법을 기술한다.
치료가 필요한 피험자에, 조직 공학과 재생 의학 적용에서 활성 작용제, 예를 들면, 생체활성 세포의 전달에 적합한 치료 제제가 요구된다.
발명의 요약
한 양상에서, 본 발명은 활성 작용제, 예를 들면, 생체활성 세포를 내포하는 주사가능, 치료 제제를 제공한다. 한 양태에서, 주사가능 제제는 생체활성 세포 및 온도-민감성 세포-안정화 생체물질을 포함한다. 또 다른 양태에서, 온도-민감성 세포-안정화 생체물질은 (i) 약 8℃ 또는 그 이하에서 실질적으로 고형 상태 및/또는 (ii) 주위 온도 또는 그 이상에서 실질적으로 액상 상태를 유지시킨다. 다른 양태에서, 생체활성 세포는 본원에서 기술되는 같이, 신장 세포를 포함한다. 또 다른 양태에서, 생체활성 세포는 세포-안정화 생체물질의 부피 전체에 실질적으로 균일하게 분산된다. 다른 양태에서, 생체물질은 약 8℃ 내지 약 주위 온도 또는 그 이상에서 고체에서 액체로의 과도기 상태를 갖는다. 한 양태에서, 실질적으로 고형 상태는 겔 상태이다. 또 다른 양태에서, 세포-안정화 생체물질은 하이드로겔을 포함한다. 다른 양태에서, 하이드로겔은 젤라틴을 포함한다. 다른 양태에서, 젤라틴은 제제 내에 약 0.5% 내지 약 1% (w/v)로 존재한다. 한 양태에서, 젤라틴은 제제 내에 약 0.75% (w/v)로 존재한다. 또 다른 양태에서, 제제는 세포 생존능 작용제를 더욱 포함한다. 다른 양태에서, 세포 생존능 작용제는 항산화제, 산소 캐리어, 면역조절 인자, 세포 동원 인자, 세포 부착 인자, 소염제, 면역억제제, 혈관생성 인자, 그리고 상처 치유 인자로 구성된 군에서 선택되는 작용제를 포함한다. 일부 양태에서, 세포 생존능 작용제는 항산화제이다. 한 양태에서, 항산화제는 6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산이다. 또 다른 양태에서, 6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산은 약 50 μM 내지 약 150 μM으로 존재한다. 다른 양태에서, 6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산은 약 100 μM으로 존재한다. 일부 양태에서, 세포 생존능 작용제는 산소 캐리어이다. 한 양태에서, 산소 캐리어는 과불화탄소이다. 다른 양태에서, 세포 생존능 작용제는 면역조절제이다. 한 양태에서, 세포 생존능 작용제는 면역억제제이다.
다른 양상에서, 본 발명은 생체활성 신장 세포를 내포하는 주사가능, 치료 제제를 제공한다. 한 양태에서, 제제는 생체활성 신장 세포, 약 0.75% (w/v) 젤라틴, 그리고 약 100 μM 6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산을 포함하고, 상기 제제는 (i) 약 8℃ 또는 그 이하에서 실질적으로 고형 상태, 그리고 (ii) 주위 온도 또는 그 이상에서 실질적으로 액상 상태를 갖는다. 또 다른 양태에서, 생체활성 신장 세포는 세포-안정화 생체물질의 부피 전체에 실질적으로 균일하게 분산된다. 다른 양태에서, 생체물질은 약 8℃ 내지 약 주위 온도에서 고체에서 액체로의 과도기 상태를 포함한다. 다른 양태에서, 실질적으로 고형 상태는 겔 상태이다. 일부 양태에서, 제제는 세포 생존능 작용제를 더욱 포함한다. 또 다른 양태에서, 세포 생존능 작용제는 항산화제, 산소 캐리어, 면역조절 인자, 세포 동원 인자, 세포 부착 인자, 소염제, 혈관생성 인자, 그리고 상처 치유 인자로 구성된 군에서 선택되는 작용제를 포함한다. 한 양태에서, 세포 생존능 작용제는 산소 캐리어이다. 또 다른 양태에서, 산소 캐리어는 과불화탄소이다. 다른 양태에서, 세포 생존능 작용제는 면역조절제이다. 다른 양태에서, 세포 생존능 작용제는 면역억제제이다.
다른 양상에서, 본 발명은 생체적합성 비드를 더욱 포함하는 본원에서 기술되는 제제를 제공한다. 한 양태에서, 생체적합성 비드는 생체물질을 포함한다. 또 다른 양태에서, 비드는 가교된다. 다른 양태에서, 가교된 비드는 비-가교된 생체적합성 비드와 비교하여 효소 분해에 대한 감소된 감수성을 갖는다. 다른 양태에서, 가교된 비드는 카르보디이미드-가교된 비드이다. 한 양태에서, 카르보디이미드는 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카르보디이미드 염산염 (EDC), DCC - N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), 그리고 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DDPC)로 구성된 군에서 선택된다. 또 다른 양태에서, 카르보디이미드는 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카르보디이미드 염산염 (EDC)이다. 다른 양태에서, 가교된 비드는 비-가교된 비드와 비교하여 감소된 숫자의 유리 일차 아민을 포함한다. 다른 양태에서, 유리 일차 아민의 숫자는 약 355 nm에서 분광광도적으로 검출가능하다. 일부 양태에서, 비드는 생체활성 세포로 파종된다. 한 양태에서, 생체활성 세포는 신장 세포이다. 또 다른 양태에서, 제제는 (i) 주위 온도 또는 그 이하에서 실질적으로 고형 상태, 그리고 (ii) 약 37℃ 또는 그 이상에서 실질적으로 액상 상태를 유지시키는 온도-민감성 생체물질을 포함하는 추가의 생체적합성 비드를 더욱 포함한다. 다른 양태에서, 비드의 생체물질은 주위 온도와 약 37℃ 사이에 고체에서 액체로의 과도기 상태를 포함한다. 다른 양태에서, 실질적으로 고형 상태는 겔 상태이다. 한 양태에서, 비드의 생체물질은 하이드로겔을 포함한다. 또 다른 양태에서, 하이드로겔은 젤라틴을 포함한다. 다른 양태에서, 비드는 약 5% (w/v) 내지 약 10% (w/v)에서 젤라틴을 포함한다. 일부 양태에서, 추가의 생체적합성 비드는 스페이서 비드이다. 다른 양태에서, 스페이서 비드는 생체활성 세포로 파종되지 않는다.
다른 양상에서, 본 발명의 제제는 신장 세포 집단에 의해 분비된 생성물을 내포한다. 한 양태에서, 제제는 신장 세포 집단 및/또는 생체활성 세포에 의해 분비된 생성물을 포함한다. 다른 양태에서, 생체활성 세포는 신장 세포이다. 또 다른 양태에서, 생성물은 측분비 인자 (paracrine factor), 내분비 인자 (endocrine factor), 그리고 곁분비 인자 (juxtacrine factor) 중에서 하나 이상을 포함한다. 다른 양태에서, 생성물은 소포 (vesicle)를 포함한다. 다른 양태에서, 소포는 미세소포 (microvesicle)를 포함한다. 한 양태에서, 소포는 엑소솜 (exosome)을 포함한다. 또 다른 양태에서, 소포는 측분비 인자, 내분비 인자, 곁분비 인자, 그리고 RNA로 구성된 군에서 선택되는 분비된 생성물을 포함한다.
본 발명은 활성 작용제, 예를 들면, 생체활성 세포 집단의 치료 제제, 이들을 제조하는 방법, 그리고 치료가 필요한 피험자에 이들 제제를 투여하는 방법을 제공한다.
도 1. 가교되지 않은 젤라틴 비드의 온도 반응성.
도 2. 현탁된 개체 신장 세포를 내포하는 매트릭스.
도 3. 세포 집괴를 내포하는 매트릭스.
도 4. 마이크로캐리어 비드에 부착된 세포를 내포하는 매트릭스.
도 5. 세포 + 가용성 인자 (히알루론산)를 내포하는 매트릭스.
도 6. 매트릭스에서 4℃에서 3일 후 세포 생존능.
도 7. 비드의 생체적합성 및 그들의 공간 창출 능력 (space creating capacity)을 예증하는, Cultispher S 비드와 혼합된 스페이서 비드가 주사된 신장의 조직학 (1주).
도 8. 매트릭스의 구조적 완전성의 상실의 도해 (좌측 패널: 고체; 우측 패널: 유체).
도 9. 반응에 관여하는 아미노산 잔기 (비-가교된 젤라틴에서) 및 이들이 형성하는 아미드 결합 (가교된 젤라틴에서)을 표시하는, 카르보디이미드-매개된 젤라틴 가교에 대한 합성 계획.
도 10 A-B. 젤라틴 비드의 형태학. A - 비-가교된 젤라틴 비드의 전체 형태학과 크기 분포를 보여주는 주사 전자 현미경법 이미지 (기준자 1 mm). B - 비드의 다공성, 공동 구조를 보여주는 고 배율 주사 전자 현미경법 이미지 (기준자 100 ㎛).
도 11. 비드의 크기 분포 프로필.
도 12 A-B. 비드의 표면 지형학. 위쪽 열 (A) - 건성 비드의 SEM 이미지. 아래쪽 열 (B) - 습성 비드의 명시야 현미경 이미지. 양쪽 이미지 세트는 비드의 다공성 표면을 예증한다. SEM 이미지는 또한, 비어있는 내부를 예증한다.
도 13 A-B. 가교된 젤라틴에서 아민 정량. A - 일차 아민과 피크릴술폰산 사이에 오렌지색 부가물의 형성을 설명하는 반응식. B - 효소적으로 분해된 차등적으로 가교된 젤라틴 비드 내에 존재하는 일차 아민 기의 정량 (n=3). ANOVA 통계학적 분석 P = 0.007.
도 14 A-B. Cultispher S 비드 (B)와 비교되는, 차등적으로 가교된 젤라틴 비드 (A)의 효소 분해 프로필.
도 15. 비드에 대한 세포 부착 및 세포 생존능을 증명하는, 10 mM EDC 가교된 비드의 세포적합성 (녹색 = 생존 세포; 적색 = 사멸 세포).
도 16. 가교된 비드의 세포적합성. 가교된 젤라틴 비드 상에서 일차 래트 신장 세포의 LIVE/DEAD® 염색.
도 17. 비드의 생체적합성을 예증하는, 0.1M EDC 가교된 젤라틴 비드가 주사된 신장의 조직학 (1주).
도 18. 주사 후 1주 시점에, 가교된 젤라틴 비드의 분해를 보이는 신장 단편의 조직학적 평가.
도 19. 주사 후 4주 시점에, 가교된 젤라틴 비드의 분해를 보이는 신장 단편의 조직학적 평가.
도 20: NKA 원형의 산출을 위한 전략의 개요.
도 21 A-C: 선별된 설치류 재생 신장 세포 생체물질 구조물의 대표적인 생존/사멸 염색 (A: 세포/PBS; B: 세포/GBH; C: 세포/비드).
도 22 A-C: 이식 후 4주 시점에 핵심 신장 생리학적 지수의 요약 (ANOVA 분석). (A) 체중; (B) 혈액 요소성 질소 (BUN); (C) 혈청 크레아티닌 (Scre)
도 23 A-B: 이식 후 4주 시점에 신장 생리학적 지수로서 (A) 소변 단백질/크레아티닌 (UPC) 및 (B) 소변 단백질 (U단백질)의 요약 (ANOVA 분석).
도 24 A-B: 이식 후 4주 시점에 신장 생리학적 지수로서 (A) 비중 및 (B) 소변 크레아티닌 (Ucre)의 요약 (ANOVA 분석).
도 25: 부분-신장절제술 모델에서 설치류 신장 내에 세포/생체물질 구조물의 이식과 연관된 대표적인 조직학적 결과.
도 26은 다층 단계 구배 기술 (좌측 패널) 또는 단층 혼합 구배 기술 (우측 패널)을 이용한 새로이 분해된 신장 조직으로부터의 epo-생성 세포 분획물의 농축을 도시한다. 2가지 방법 모두에 의해 1.025 g/mL과 1.035 g/mL 사이에서 보이는 epo 밴드로부터 비 epo-생성 세포 성분 (주로 세뇨관 세포)이 부분적으로 고갈되었다.
도 27은 개별적으로 수거된 이후 동일한 단계 구배물에 나란히 적용된 "표준산소" (21% 산소)와 "저산소" (2% 산소) 설치류 배양물의 단계 구배를 도시한다.
도 28은 개별적으로 수거된 이후 동일한 단계 구배물에 나란히 적용된 "표준산소" (21% 산소)와 "저산소" (2% 산소) 개 배양물의 단계 구배를 도시한다.
도 29: UNFX 조건화 배지의 제조와 분석을 위한 개략도를 제공한다.
도 30A-B은 세포 집괴를 제조하는 방법을 도시한다. A - 낮은 결합 플레이트를 갖는 궤도형 회전자; B - 세포를 포함하는 스피너 플라스크.
도 31은 세포 집괴 또는 회전타원체를 도시한다.
도 32는 세포 집괴를 도시한다 - NKCC2 녹색; 핵 - 청색.
도 33은 세포 집괴를 도시한다 - GGT-1 녹색; 핵 - 청색.
도 34는 세포 집괴를 도시한다 - 아쿠아포린1 녹색; 핵 - 청색.
도 35는 세포 집괴를 도시한다 - 류신 아미노펩티다아제 3 적색; 핵 청색.
도 36은 세포 집괴를 도시한다 - 유기 이온 트랜스포터 (Organic Ion Transporter 1, OAT1) 적색; 핵 청색.
도 37은 세포 집괴를 도시한다 - 쿠빌린 적색; 핵 청색.
발명의 상세한 설명
본 발명은 활성 작용제, 예를 들면, 생체활성 세포에 대한 치료 제제, 그리고 이들을 제조하는 방법 및 치료가 필요한 피험자를 이들 제제로 치료하는 방법에 관한 것이다. 생체활성 세포 제제는 생체활성 신장 세포 (BRCs)의 이질성 혼합물 또는 분획물에 적합할 수 있다. 생체활성 신장 세포는 세뇨관 및 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 신장 세포를 포함하는 분리된 신장 세포일 수 있다. BRC 세포 집단은 농축 세뇨관 및 EPO-생성 세포 집단을 포함할 수 있다. BRC는 건강한 개체로부터의 그 자신의 신장 세포 분획물일 수 있다. 또한, 본 발명은 건강한 개체의 상응하는 신장 세포 분획물과 비교하여 특정 세포 성분은 결여될 수 있으나 여전히 치료적 특성은 보유하는 비건강한 개체로부터 수득되는 신장 세포 분획물을 제공한다. 또한, 본 발명은 건강한 개체와 비교하여 세포 성분이 결여되는 치료학적-활성 세포 집단을 제공하며, 이때 상기 세포 집단은 한 양태에서, 다양한 질환 상태의 자가 공급원으로부터 분리되고 증대될 수 있다.
비록 생체활성 세포 제제가 본원에서 기술되긴 하지만, 본 발명은 다양한 다른 활성 작용제를 내포하는 제제를 고려한다. 다른 적절한 활성 작용제에는 세포 집괴, 무세포성 생체물질, 생체활성 세포로부터 분비된 생성물, 크고 작은 분자 치료제, 그리고 이들의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 가령, 한 유형의 생체활성 세포는 치료 분자 또는 다른 유형의 생체활성 세포와 함께 또는 이들 없이, 생체물질-기반 마이크로캐리어와 조합될 수 있고, 부착되지 않은 세포는 무세포성 입자와 조합될 수 있다.
정의
다른 정의가 없는 한, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들이 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 문헌 [참조: Principles of Tissue Engineering, 3rd Ed. (Edited by R Lanza, R Langer, & J Vacanti), 2007]은 본원에 사용되는 많은 용어들에 대해 전반적인 지침을 당업자에게 제공한다. 당업자는 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있는 본원에서 기술되는 것과 유사한 또는 등가의 많은 방법 및 물질들을 인지할 수 있을 것이다. 사실, 본 발명은 결코 본원에 기술된 방법 및 물질들에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "세포 집단"은 직접적으로 적합한 조직 공급원, 통상 포유동물로부터 분리에 의해 수득되는 다수의 세포를 일컫는다. 분리된 세포 집단은 후속적으로 시험관내에서 배양될 수 있다. 당업자는 본 발명에서 사용하기 위한 세포 세포 집단을 분리하고 배양하는 다양한 방법과, 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 집단의 다양한 세포를 인식할 것이다. 세포 집단은 장기 또는 조직, 예를 들면, 신장으로부터 유래된 비분획된 (unfractionated) 이질성 (heterogeneous) 세포 집단일 수 있다. 가령, 이질성 세포 집단은 조직 생검 또는 전체 장기 조직으로부터 분리될 수 있다. 대안으로, 이질성 세포 집단은 조직 생검 또는 전체 장기 조직으로부터 확립된 포유동물 세포의 시험관내 배양물로부터 유래될 수 있다. 비분획된 이질성 세포 집단은 또한 비-농축 세포 집단으로 불릴 수 있다. 한 양태에서, 이들 세포 집단은 생체활성 세포를 내포한다.
용어 "고유 장기 (native organ)"는 살아있는 피험자의 장기를 의미한다. 피험자는 건강하거나 건강하지 않을 수 있다. 건강하지 않은 피험자는 특정 장기와 연관된 질환을 가질 수 있다.
용어 "고유 신장 (native kidney)"은 살아있는 피험자의 신장을 의미한다. 피험자는 건강하거나 건강하지 않을 수 있다. 건강하지 않은 피험자는 신장 질환을 가질 수 있다.
용어 "재생 효과"는 고유 장기, 예를 들면, 신장에 이점을 제공하는 효과를 의미한다. 상기 효과는 이로 제한됨이 없이, 고유 장기에 대한 손상 정도의 감소, 또는 고유 장기 기능의 개선, 회복 또는 안정화를 포함할 수 있다. 신장 손상은 섬유증, 염증, 사구체 비대 등의 형태이고 피험자에서 고유 장기와 연관된 질환과 관련될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "혼합물"은 비분획된 이질성 세포 집단으로부터 유래된 2개 이상의 분리되고 농축된 세포 집단의 조합을 말한다. 특정 양태에 따르면, 본 발명의 세포 집단은 신장 세포 집단이다.
"농축 (enriched)" 세포 집단 또는 제조물은 특정 세포 유형을 초기 세포 집단에서의 비율 (%)보다 높은 비율로 포함하는, 초기 장기 세포 집단 (가령, 비분획된 이질성 세포 집단)으로부터 유래된 세포 집단을 말한다. 가령, 초기 신장 세포 집단은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 등의 관심 세포 집단에 대해 농축될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "세포 집단", "세포 제조물" 및 "세포 원형 (prototype)"은 교환가능하게 사용된다.
한 양상에서, 본원에서 사용되는 용어 "농축" 세포 집단은 EPO를 생성할 수 있는 세포의 비율 (%)이 초기 세포 집단에서 EPO를 생성할 수 있는 세포 비율보다 큰, 초기 장기 세포 집단으로부터 유래된 세포 집단 (가령, 신장 생검 또는 배양된 포유동물 신장 세포로부터의 세포 현탁액)을 말한다. 가령, 용어 "B4"는 초기 세포 집단과 비교하여, EPO-생성 세포, 사구체 세포 및 혈관 세포를 높은 비율 (%)로 포함하는 초기 신장 세포 집단으로부터 유래된 세포 집단이다. 본 발명의 세포 집단은 하나 이상의 세포 유형에 대해 농축되며, 하나 이상의 다른 세포 유형은 고갈될 수 있다. 가령, 농축 EPO 생성-세포 집단은 비-농축 세포 집단, 즉 농축 세포 집단이 유래되는 초기 세포 집단에 있는 간질 섬유모세포 및 세뇨관 세포에 비해, 간질 섬유모세포는 농축되고 세뇨관 세포 및 집합관 상피 세포는 고갈될 수 있다. EPO 농축 또는 "B4" 세포 집단을 언급하는 모든 양태에서, 농축 세포 집단은 내생성의 고유 EPO 유전자로부터 산소-조정가능한 EPO 발현으로 입증되는 바와 같이, 산소-조절된 방식으로 EPO를 생성할 수 있는 세포를 함유하는 이질성 세포 집단이다.
또 다른 양상에서, 초기 세포 집단에서의 세포 유형의 비율 (%) 보다 특정 세포 유형, 예를 들면, 혈관, 사구체 또는 내분비 세포의 비율이 높은 농축 신장 세포 집단은 또한, 건강한 개체 또는 피험자로부터 유래되는 초기 신장 세포 집단과 비교하여, 하나 이상의 특정 세포 유형, 예를 들면, 혈관, 사구체 또는 내분비 세포가 결여되거나 결핍될 수 있다. 가령, 용어 "B4'" 또는 "B4 프라임"은 한 양상에서, 건강한 개체와 비교하여, 출발 시료의 질환 상태에 따라, 하나 이상의 세포 유형, 예를 들면, 혈관, 사구체 또는 내분비 세포가 결여되거나 결핍된 초기 신장 세포 집단으로부터 유래되는 세포이다. 한 양태에서, B4' 세포 집단은 만성 신장 질환을 갖는 피험자로부터 유래된다. 한 양태에서, B4' 세포 집단은 초점 분절 사구체경화증 (focal segmental glomerulosclerosis: FSGS)을 갖는 피험자로부터 유래된다. 또 다른 양태에서, B4’세포 집단은 자가면역 사구체신염을 갖는 피험자로부터 유래된다. 또 다른 양상에서, B4'는 후기에 하나 이상의 세포 유형, 예를 들면, 혈관, 사구체 또는 내분비 세포가 고갈되거나 결핍되는, 모든 세포 유형, 예를 들면, 혈관, 사구체 또는 내분비 세포를 포함하는 초기 세포 집단으로부터 유래되는 세포이다. 또 다른 양상에서, B4'는 후기에 하나 이상의 특정 세포 유형, 예를 들면, 혈관, 사구체 또는 내분비 세포가 농축되는, 모든 세포 유형, 예를 들면, 혈관, 사구체 또는 내분비 세포를 포함하는 초기 세포 집단으로부터 유래되는 세포 집단이다. 가령, 한 양태에서, B4' 세포 집단은 혈관 세포는 농축되나 사구체 및/또는 내분비 세포는 고갈될 수 있다. 또 다른 양태에서, B4' 세포 집단은 사구체 세포는 농축되나 혈관 및/또는 내분비 세포는 고갈될 수 있다. 또 다른 양태에서, B4' 세포 집단은 내분비 세포는 농축되나 혈관 및/또는 사구체 세포는 고갈될 수 있다. 또 다른 양태에서, B4' 세포 집단은 혈관 및 내분비 세포는 농축되나 사구체 세포는 고갈될 수 있다. 바람직한 양태에서, B4' 세포 집단은 단독으로 또는 또 다른 농축 세포 집단, 예를 들면, B2 및/또는 B3과 혼합 상태로 치료 특성을 보유한다. 가령, B4' 세포 집단은 실시예, 예를 들면, 실시예 11 내지 13에 기술된다.
다른 양상에서, 농축 세포 집단은 또한, 초기 집단에서 일부 EPO-생성 세포와 함께 하나 이상의 혈관, 사구체와 근위 세뇨관 마커를 발현하는 세포의 비율보다 높은, 일부 EPO-생성 세포와 함께 하나 이상의 혈관, 사구체와 근위 세뇨관 마커를 발현하는 세포의 비율을 내포하는, 앞서 논의된 바와 같은 초기 신장 세포 집단으로부터 유래된 세포 집단을 말한다. 가령, 용어 B3은 초기 집단과 비교하여 높은 비율의 근위 세뇨관 세포, 그리고 혈관과 사구체 세포를 포함하는 초기 신장 세포 집단으로부터 유래된 세포 집단을 말한다. 한 양태에서, B3 세포 집단은 초기 집단과 비교하여 높은 비율의 근위 세뇨관 세포, 하지만 B2 세포 집단과 비교하여 낮은 비율의 근위 세뇨관 세포를 포함한다. 또 다른 양태에서, B3 세포 집단은 초기 집단과 비교하여 높은 비율의 혈관과 사구체 세포 마커 및 일부 EPO-생성 세포, 하지만 B4 세포 집단과 비교하여 낮은 비율의 혈관과 사구체 세포 마커 및 일부 EPO-생성 세포를 포함한다.
또 다른 양상에서, 농축 세포 집단은 또한, 초기 세포 집단에서의 하나 이상의 세뇨관 세포 마커를 발현하는 세포의 비율 (%) 보다 큰 하나 이상의 세뇨관 세포 마커를 발현하는 세포 비율 (%)을 포함하는, 상술된 바와 같은 초기 신장 세포 집단으로부터 유래되는 세포 집단을 말한다. 가령, 용어 "B2"는 초기 세포 집단과 비교하였을 때, 높은 비율 (%)의 세뇨관 세포를 포함하는, 초기 신장 세포 집단으로부터 유래되는 세포 집단을 지칭한다. 또한, 하나 이상의 세뇨관 세포 마커 (또는 "B2")를 발현하는 세포가 농축된 세포 집단은 집합관 시스템으로부터의 일부 상피 세포를 포함할 수 있다. 비록 하나 이상의 세뇨관 세포 마커를 발현하는 세포 (또는 "B2")가 농축된 세포 집단은 EPO-생성 세포, 사구체 세포 및 혈관 세포가 상대적으로 고갈되어 있지만, 농축 세포 집단은 초기 세포 집단과 비교하였을 때, 낮은 비율 (%)의 이들 세포 (EPO-생성, 사구체 및 혈관)를 포함할 수 있다. 일반적으로, 이질 세포 집단은 고갈된 세포 집단이 고갈되기 전 이질 세포 집단에 포함된 해당 세포 유형(들)의 비율과 비교하여 낮은 비율의 세포 유형(들)을 포함하도록, 하나 이상의 세포 유형이 고갈된다. 고갈될 수 있는 세포 유형은 임의 유형의 신장 세포일 수 있다. 가령, 특정 양태에서, 고갈될 수 있는 세포 유형은 밀도가 약 1.045 g/㎖ 미만인 큰 입도의 집합관 및 세뇨관 시스템을 갖는 세포 ("B1"이라고 칭함)을 포함한다. 특정한 다른 양태에서, 고갈될 수 있는 세포 유형은 밀도가 약 1.095 g/㎖ 초과인 낮은 입도 및 생존능의 파편 및 소세포 ("B5"라고 칭함)을 포함한다. 일부 양태에서, 세뇨관 세포가 농축된 세포 집단은 "B1", "B5", 산소-조정가능한 EPO-발현 세포, 사구체 세포 및 혈관 세포 모두가 상대적으로 고갈된다.
본원에서 사용되는 용어 "저산소 (hypoxic)" 배양 조건은 대기 산소 수준 (약 21%)에서 세포를 배양하는 표준 배양 조건과 비교하여, 배양 시스템에서 세포가 이용가능한 산소 수준을 감소시킨 배양 조건을 지칭한다. 비-저산소 상태는 정상 또는 표준 산소 배양 조건을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "산소-조정가능한"은 세포가 이용가능한 산소량에 근거하여 유전자 발현을 조절 (상향 또는 하향)하는 세포의 능력을 말한다. "저산소-유도성"이란 산소 분압의 감소에 반응하여 (사전-유도 또는 초기 산소 분압과 무관하게) 유전자 발현을 상향조절하는 것을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "생체물질"은 살아있는 조직으로 도입하기에 적합한 천연 또는 합성의 생체적합 물질을 말한다. 천연 생체물질은 생물계에 의해 만들어지거나, 또는 생물계로부터 기원하는 물질이다. 합성 생체물질은 생물계에 의해 만들어지지 않거나, 또는 생물계로부터 기원하지 않는 물질이다. 본원에서 기술되는 생체물질은 천연 생체적합 물질과 합성 생체적합 물질의 조합일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 생체물질은 예로써, 폴리머 매트릭스 및 스캐폴드를 포함한다. 당업자는 생체물질(들)이 다양한 형태, 예를 들면, 다공성 포움, 겔, 액체, 비드, 고체로 형성될 수 있으며, 하나 이상의 천연 또는 합성 생체적합 물질을 포함할 수 있다는 것을 인식할 수 있을 것이다. 한 양태에서, 생체물질은 하이드로겔이 될 수 있는 용액의 액상 형태이다.
용어 "변형된 방출" 또는 동등한 용어 "제어된 방출", "지연된 방출", 또는 "느린 방출"은 개체에 투여 후 시간의 흐름에서 또는 하나 이상의 시점에서 활성 작용제, 예를 들면, 생체활성 세포를 방출하는 제제를 말한다. 제제에 따라 원하는 시간 범위, 예를 들면, 수분, 수시간, 수일, 수주, 또는 그 이상 동안 일어날 수 있는, 활성 작용제의 변형된 방출은 실질적으로 전체 투약 단위 (dosage unit)가 투여 직후에 이용가능한 표준 제제와 대조적이다. 조직 공학과 재생 의학 적용의 경우에, 바람직한 변형된 방출 제제는 국부 투여 (가령, 고형 장기에 직접적으로 활성 작용제의 투여) 이후에 복수의 시점에서 활성 작용제의 방출을 제공한다. 가령, 생체활성 세포의 변형된 방출 제제는 투여 즉시 세포의 최초 방출, 그리고 더 늦은 시점에 세포의 후기, 이차 방출을 제공할 것이다. 활성 작용제의 이차 방출에 대한 시간 지연은 최초 투여 후 수분, 수시간, 또는 수일일 수 있다. 일반적으로, 방출의 지연을 위한 기간은 활성 작용제의 생체물질 캐리어가 자신의 구조적 완전성을 상실하는데 소요되는 기간에 상응한다. 활성 작용제의 지연된 방출은 이런 완전성이 붕괴하기 시작함에 따라 시작되고 완전성이 완전하게 소멸할 때 완결된다. 당업자는 방출의 기타 적절한 기전을 인식할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "빈혈증"은 피험자의 EPO-생성 세포에 의한 기능성 EPO 단백질의 부적절한 생성 및/또는 EPO 단백질의 전신 순환계로의 부적절한 방출 및/또는 골수 적아세포의 EPO 단백질에 대한 무능력한 반응으로 인한, 적혈구 세포의 수 및/또는 헤모글로빈 수준의 결핍을 말한다. 빈혈증이 있는 피험자는 적혈구 항상성을 유지할 수 없다. 일반적으로, 빈혈증은 신장 기능의 감퇴 또는 상실 (가령, 만성 신부전), 상대적인 EPO 결핍과 연관된 빈혈증, 충혈성 심부전과 연관된 빈혈증, 화학요법 또는 항-바이러스 요법 (가령, AZT)과 같은 골수-억제성 요법과 연관된 빈혈증, 비-골수성 암과 연관된 빈혈증, HIV와 같은 바이러스 감염과 연관된 빈혈증, 및 자가면역 질환 (가령, 류마티스 관절염), 간질환, 및 다발성-기관계부전과 같은 만성 질환들의 빈혈증으로 발생될 수 있다.
용어 "EPO-결핍"은 에리트로포이에틴 수용체 효현제 (가령, 재조합 EPO 또는 EPO 동족체)로 치료가능한, 빈혈증을 포함하는 임의의 상태 또는 장애를 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "장기-관련된 질환"은 기능을 수행하는 장기의 능력이 상실되는 결과를 초래하는 급성 또는 만성 장기 부전의 임의의 단계 또는 수준과 연관된 장애를 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "신장 질환"은 혈액을 여과하고 과량의 유체, 전해질, 폐기물을 혈액으로부터 제거하는 신장의 능력이 상실되는 결과를 초래하는 급성 또는 만성 신부전의 임의의 단계 또는 수준과 연관된 장애를 말한다. 신장 질환은 또한 빈혈증과 같은 내분비 기능이상 (에리트로포이에틴-결핍), 및 무기물 불균형 (비타민 D 결핍)을 포함한다. 신장 질환은 신장에서 유래하거나 심부전, 고혈압, 당뇨병, 자가면역 질환 또는 간질환을 포함하나 이들에 한정되지 않는 다양한 상태에 부차적일 수 있다. 신장 질환은 신장의 급성 손상 후 발병하는 만성 신부전 상태일 수 있다. 가령, 허혈 및/또는 유독물 노출에 의한 신장 손상은 급성 신부전을 일으킬 수 있으며, 급성 신장 손상 후 불완전한 회복이 만성 신부전을 발병시킬 수 있다.
용어 "치료"는 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 수송 결핍 또는 사구체 여과 결핍의 치료, 예방 또는 방지 수단 모두를 말하며, 이들의 목적은 표적 질환을 역전, 방지 또는 지연 (경감)시키는 것이다. 이와 같은 치료를 요하는 사람은 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 수송 결핍 또는 사구체 여과 결핍을 이미 가지고 있는 사람, 및 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 수송 결핍 또는 사구체 여과 결핍을 가질 경향이 있거나 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 전달 결핍 또는 사구체 여과 결핍을 예방해야 할 사람들을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "치료"는 신장 기능의 안정화 및/또는 개선을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "생체내 접촉"은 농축 세포 집단에 의해 분비되는 생성물 및 고유 장기 간의 생체내에서의 직접적 접촉을 말한다. 가령, 농축 신장 세포 집단에 의해 분비되는 생성물 (또는 신장 세포/신장 세포 분획물을 포함하는 혼합물 또는 구조물)은 생체내에서 고유 신장과 접촉할 수 있다. 직접적 생체내 접촉은 실제로 측분비, 내분비 또는 곁분비일 수 있다. 분비 생성물은 본원에서 기술되는 상이한 생성물의 이질성 집단일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "리보핵산" 또는 "RNA"는 개별 단위가 질소 염기, 리보스 슈가 및 포스페이트로 구성된 뉴클레오타이드 단위의 쇄를 일컫는다. RNA는 단일 또는 이중 가닥 형태일 수 있다. RNA는 소포의 일부이거나, 이에 포함되거나 이와 결합될 수 있다. 소포는 엑소솜일 수 있다. RNA는 이로 제한됨이 없이, mRNA, rRNA, 작은 RNA, snRNA, snoRNA, microRNA (miRNA), 작은 간섭 RNA (siRNA) 및 비암호화 RNA를 포함한다. RNA는 바람직하게는 인간 RNA이다.
용어 "구조물"은 하나 이상의 합성 또는 천연적으로 생성되는 생체적합 물질로 제조된 스캐폴드 또는 매트릭스의 표면 상에 또는 내에 침착된 하나 이상의 세포 집단을 지칭한다. 하나 이상의 세포 집단은 하나 이상의 합성 또는 천연적으로 생성되는 생체적합 생체물질, 폴리머, 단백질 또는 펩타이드로 제조된 생체물질로 코팅, 침착, 포매, 부착 또는 파종될 수 있다. 하나 이상의 세포 집단은 시험관내 또는 생체내에서 생체물질 또는 스캐폴드 또는 매트릭스와 조합될 수 있다. 일반적으로, 스캐폴드/생체물질을 형성하는데 사용되는 하나 이상의 생체적합 물질은 그 위에 침착되는 최소한 하나의 세포 집단의 다세포적 3차원 구조 형성을 지시하거나 촉진하거나 허용하도록 선택된다. 구조물을 생성하는데 사용되는 하나 이상의 생체물질은 또한 구조물 또는 구조물의 세포 성분의 내생성 숙주 조직과의 분산 및/또는 통합을 지시, 촉진 또는 허용하거나, 구조물 또는 구조물의 세포 성분의 생존, 접목, 내성 또는 기능 수행을 지시, 촉진 또는 허용하도록 선택될 수 있다.
용어 "마커" 또는 "바이오마커"는 일반적으로 DNA, RNA, 단백질, 탄수화물 또는 당지질-기반 분자 마커를 말하며, 배양 세포 집단에서 이의 발현 또는 존재는 표준 방법 (또는 본원에 기술된 방법)에 의해 검출될 수 있고, 특정 세포 유형인 배양 세포 집단 중의 하나 이상의 세포와 일치한다. 마커는 세포에 의해 발현되는 폴리펩타이드 또는 염색체 상의 확인가능한 물리적 위치, 예를 들면, 유전자, 제한 엔도뉴클레아제 인지 부위 또는 고유 세포에 의해 발현되는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 (가령, mRNA)일 수 있다. 마커는 "유전자 발현 마커"로 불리는 유전자의 발현 영역 또는 미지의 암호화 기능을 갖는 DNA의 일부 절편일 수 있다. 바이오마커는 세포-유래되는, 예를 들면, 분비되는 생성물일 수 있다.
호환적으로 사용되는 용어 "차등적으로 발현되는 유전자", "차등적 유전자 발현" 및 이들의 동의어는 제2 세포 또는 세포 집단에서의 발현에 비해, 제1 세포 또는 세포 집단에서 높거나 낮은 수준으로 발현이 활성화되는 유전자를 말한다. 이 용어는 또한 배양 중 제1 또는 제2 세포의 계대 동안 시간 경과에 따라 상이한 단계에서 높거나 낮은 수준으로 발현이 활성화되는 유전자를 포함한다. 또한, 차등 발현 유전자는 핵산 수준 또는 단백질 수준에서 활성화되거나 억제될 수 있고, 또는 폴리펩타이드 생성물이 상이하도록 택일적으로 스플라이싱될 수 있다고 믿어진다. 이러한 차이는 예로써, mRNA 수준, 표면 발현, 분비 또는 폴리펩타이드의 다른 구분의 변화에 의해 입증될 수 있다. 차등 유전자 발현은 2개 이상의 유전자 또는 이들 유전자의 생성물 간의 발현 비교 또는 2개 이상의 유전자 또는 이들 유전자 생성물 간의 발현 비율의 비교 또는 심지어, 제1 세포와 제2 세포 간에 상이한, 동일 유전자의 2개의 상이하게 가공 처리된 생성물의 비교를 포함할 수 있다. 차등 발현을 예로써, 제1 세포 및 제2 세포 사이에서, 유전자 또는 이의 발현 생성물의 시간적 (temporal) 또는 세포적 발현 패턴의 정량적 및 정성적 차이 모두를 포함한다. 본 발명의 목적상, 제1 세포와 제2 세포에서 주어진 유전자의 발현 사이에 차이가 있는 경우, "차등 유전자 발현"이 존재하는 것으로 간주된다. 마커의 차등 발현은 (제2 세포) 투여 후 환자로부터의 세포에서의 발현과 비교하여, (제1 세포) 세포 집단, 혼합물 또는 구조물의 투여 전 환자로부터의 세포에 존재할 수 있다.
용어 "억제한다", "하향-조절한다","하향-발현한다" 및 "감소시킨다"는 호환적으로 사용되며, 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 아단위를 암호화하는 RNA 분자 또는 등가 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 아단위의 활성이 하나 이상의 대조군, 예를 들면, 하나 이상의 양성 및/또는 음성 대조군과 비교하여 감소되는 것을 의미한다. 하향-발현은 투여 후 환자로부터의 세포와 비교하여, 세포 집단, 혼합물 또는 구조물 투여 후 환자로부터의 세포에 존재할 수 있다.
용어 "상향-조절한다" 또는 "과다-발현한다"는 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 아단위를 암호화하는 RNA 분자 또는 등가 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 아단위의 활성이 하나 이상의 대조군, 예를 들면, 하나 이상의 양성 및/또는 음성 대조군과 비교하여 증가되는 것을 의미한다. 과다-발현은 투여 전 환자로부터의 세포와 비교하여, 세포 집단, 혼합물 또는 구조물 투여 후 환자로부터의 세포에 존재할 수 있다.
용어 "피험자"는 장기-관련된 질환, 예를 들면, 신장 질환, 빈혈증, 또는 EPO 결핍에 대한 하나 이상의 신호, 증상 또는 다른 표시를 겪거나 겪은 경험이 있는 치료받을 수 있는 환자를 비롯한 임의의 단일 인간 주체를 의미한다. 이러한 피험자는 원인에 관계없이, 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO 결핍으로 새로 진단받은 또는 이미 진단받은 및 재발을 경험한 또는 이들 질환에 걸릴 위험에 처한 피험자를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 피험자는 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO 결핍에 대해 이미 치료를 받았거나, 치료를 받지 않았을 수도 있다.
용어 "환자"는 치료를 바라는 임의의 단일 동물, 더욱 바람직하게는 포유동물 (가령, 개, 고양이, 말, 토끼, 동물원 동물, 소, 돼지, 양 및 비-인간 영장류를 비롯한 인간 동물을 포함)을 말한다. 가장 바람직하게는, 환자는 인간이다.
용어 "시료" 또는 "환자 시료" 또는 "생물학적 시료"는 피험자 또는 환자 체액, 체조직, 세포주, 조직 배양물 또는 다른 공급원으로부터 수득한 임의의 생물학적 시료를 의미한다. 이 용어는 예로써, 신장 생검과 같은 조직 생검을 포함한다. 이 용어는 예로써, 배양된 포유동물 신장 세포와 같은 배양된 세포를 포함한다. 포유동물로부터의 조직 생검 및 배양된 세포를 수득하는 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다. "시료"가 단독으로 사용되는 경우, "시료"는 "생물학적 시료" 또는 "환자 시료"를 의미한다. 즉, 이들 용어는 호환적으로 사용된다.
용어 "시험 시료"는 본 발명의 방법으로 처리된 피험자로부터의 시료를 지칭한다. 시험 시료는 혈액, 정액, 혈청, 소변, 골수, 점막, 조직 등을 포함하나 이들에 한정되지 않는 포유동물 피험자의 다양한 공급원으로부터 유래할 수 있다.
용어 "대조군" 또는 "대조군 시료"는 시험 시료의 결과의 연관성을 보이는데 도움이 되는 음성 또는 양성 결과가 예상되는 음성 또는 양성 대조군을 말한다. 본 발명에 적합한 대조군은 정상적인 적혈구 항상성의 특징적 지표를 나타내는 것으로 알려진 시료, 빈혈증의 특징적 지표를 나타내는 것으로 알려진 시료, 빈혈증이 아닌 것으로 알려진 피험자로부터 수득된 시료, 및 빈혈증인 것으로 알려진 피험자로부터 수득된 시료를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 추가 대조군은 적혈구생성을 조절하는 것으로 알려진 약리학적 물질 (가령, 재조합 EPO 또는 EPO 동족체)로 처리된 피험자로부터 유래되는 시료를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 또한, 대조군은 본 발명의 방법으로 처리되기 전 피험자로부터 수득되는 시료일 수 있다. 추가의 적합한 대조군은 임의 유형 또는 단계의 신장 질환을 갖는 것으로 알려진 피험자로부터 수득되는 시험 시료, 및 임의의 유형 또는 단계의 신장 질환을 가지지 않는 것으로 알려진 피험자로부터 수득되는 시험 시료일 수 있다. 대조군은 정상적인 건강한 비교되는 대조군일 수 있다. 당업자는 본 발명에 사용하기에 적합한 다른 대조군을 알 수 있을 것이다.
"재생 예후", "재생적 예후" 또는 "재생에 대한 예후"는 일반적으로 본원에서 기술되는 세포 집단, 혼합물 또는 구조물의 투여 또는 이식으로부터의 유망한 재생 과정 또는 결과에 대한 예측 또는 예견을 말한다. 재생 예후에 있어, 예측 또는 예견은 하기 중 하나 이상에 알려질 수 있다: 이식 또는 투여 후 기능성 신장의 개선, 이식 또는 투여 후 기능성 신장의 발달, 이식 또는 투여 후 개선된 신장 기능 또는 수용력의 발달 및 이식 또는 투여 후 고유 신장에 의한 특정 마커의 발현.
"재생된 장기"는 본원에서 기술되는 세포 집단, 혼합물 또는 구조물의 이식 또는 투여 이후의 고유 장기를 말한다. 재생된 장기는 고유 장기의 기능 또는 수용력의 발달, 고유 장기의 기능 또는 수용력의 개선 및 고유 장기의 특정 마커의 발현을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 지표로 특징지어진다. 당업자는 다른 지표도 재생 장기를 특징짓는데 적합할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
"재생된 신장"은 본원에서 기술되는 세포 집단, 혼합물 또는 구조물의 이식 또는 투여 이후의 고유 신장을 말한다. 재생된 신장은 고유 신장의 기능 또는 수용력의 발달, 고유 신장의 기능 또는 수용력의 개선 및 고유 신장의 특정 마커의 발현을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 지표로 특징지어진다. 당업자는 다른 지표도 재생 신장을 특징짓는데 적합할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
용어 "세포 집괴" 또는 "회전타원체"는 단층으로서 성장과는 대조적으로 3D 성장이 가능한 배양된 세포의 집합체 또는 어셈블리를 말한다. 주목할 점은 용어 "회전타원체"가 상기 집합체가 기하학적 구체라는 것을 의미하지 않는다는 것이다. 상기 집합체는 충분히 정의된 형태학으로 고도로 조직화되거나, 또는 조직화되지 않은 덩어리일 수 있다; 이것은 단일 세포 유형 또는 하나 이상의 세포 유형을 포함할 수 있다. 세포는 일차 분리물, 또는 영속 세포주, 또는 이들 2가지의 조합일 수 있다. 이러한 정의에는 오르가노이드 및 기관형 배양물이 포함된다.
용어 "주위 온도"는 본 발명의 제제가 피험자에 투여되는 온도를 말한다. 일반적으로, 주위 온도는 온도-제어된 환경의 온도이다. 주위 온도는 약 18℃ 내지 약 30℃ 범위에 있다. 한 양태에서, 주위 온도는 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 또는 약 30℃이다.
2. 세포 집단
본 발명의 제제는 신장 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 즉 신장 기능을 안정화 및/또는 개선 및/또는 재생하기 위한, 특정 생체활성 성분 또는 세포 유형이 농축되고 및/또는 특정한 불활성 또는 목적하지 않는 성분 또는 세포 유형이 고갈된, 분리된 이질적 신장 세포 집단 및 이들의 혼합물을 내포할 수 있고 기존 문헌 [참조: Presnell et al. U.S. 2011-0117162 및 Ilagan et al. PCT/US2011/036347, 이의 전체 내용이 본원에 참고문헌으로 편입됨]에 이미 기술되어 있다. 이들 제제는 본 발명은 건강한 개체와 비교하여 세포 성분은 결여되나 치료 특성을 보유하는, 즉 신장 기능을 안정화 및/또는 개선 및/또는 재생하는 분리된 신장 세포 분획물을 내포할 수 있다. 본원에서 기술되는 세포 집단, 세포 분획물 및/또는 세포 혼합물은 건강한 개체, 신장 질환을 갖는 개체 또는 본원에 기술된 피험자로부터 유래될 수 있다.
본 발명은 분리된 세포 집단(들), 세포 분획물(들), 혼합물(들), 농축 세포 집단(들), 세포 집괴(들), 그리고 이들의 임의의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 생체활성 세포 집단과 함께 이용하기 적합한 본원에서 기술되는 제제를 제공한다. 한 양태에서, 생체활성 세포 집단은 생체활성 신장 세포이다.
생체활성 세포 집단
본 발명은 치료가 필요한 피험자에서 표적 장기 또는 조직에 투여되는 생체활성 세포 집단에 적합한 치료 제제를 고려한다. 생체활성 세포 집단은 일반적으로, 피험자에 투여한 직후에 치료적 성질을 잠재적으로 갖는 세포 집단을 말한다. 가령, 치료가 필요한 피험자에 투여한 직후에, 생체활성 신장 세포 집단은 피험자에서 신장 기능의 안정화 및/또는 개선 및/또는 재생을 제공할 수 있다. 치료적 성질은 재생 효과를 포함할 수 있다.
생체활성 세포 집단에는 제한 없이, 줄기 세포 (가령, 만능성, 다능성, 저능성, 또는 단능성), 예를 들면, 배아 줄기 세포, 양막 줄기 세포, 성체 줄기 세포 (가령, 조혈, 유선, 창자, 중간엽, 태반, 폐, 골수, 혈액, 탯줄, 내피, 치수, 지방, 신경, 후각, 신경관, 고환), 유도된 만능성 줄기 세포; 유전적으로 변형된 세포; 그리고 신체의 임의의 공급원으로부터 유래된 세포 집단 또는 조직 외식체가 포함된다. 본 발명의 제제는 또한, 2011년 6월 9일 제출된 Basu et al. PCT/US11/39859에서 기술된 바와 같이 신장 지방-유래된 세포 집단; 2011년 5월 3일 제출된 Ludlow et al. U.S. 2010-0131075 및 Ludlow et al. PCT/US 11/35058에서 기술된 바와 같이 지방-유래된 또는 말초 혈액-유래된 평활근 세포; 또는 Atala U.S. 6,576,019에서 기술된 바와 같이 방광-유래된 요로상피 또는 평활근 세포와 병용될 수 있고, 이들 각각은 본원에 참고문헌으로 포함된다. 생체활성 세포 집단은 분리되거나, 농축되거나, 정제되거나, 동질성이거나, 또는 이질성일 수 있다. 당업자는 본 발명의 제제에서 이용하기 적합한 다른 생체활성 세포 집단을 인식할 것이다.
한 양태에서, 세포의 공급원은 의도된 표적 장기 또는 조직과 동일하다. 가령, 신장 세포는 신장에 투여되는 제제에 이용되는 신장으로부터 기원될 수 있다. 또 다른 양태에서, 세포의 공급원은 의도된 표적 장기 또는 조직과 동일하지 않다. 가령, 에리트로포이에틴-발현 세포는 신장에 투여되는 제제에 이용되는 신장 지방으로부터 기원될 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 초기 세포 집단 보다 우수한 치료 및 재생적 결과를 제공하는, 생체활성 성분들은 농축되고 비활성 또는 바람직하지 못한 성분들은 고갈된, 이질성 신장 세포 집단의 특정 아분획물을 내포하는 제제를 제공한다. 가령, 비활성 또는 바람직하지 못한 성분, 예를 들면, B1 및 B5는 고갈된, 본원에서 기술되는 생체활성 신장 세포, 예를 들면, B2, B4 및 B3은 단독으로 또는 혼합되었을 때, 신장 기능을 안정화 및/또는 개선 및/또는 재생하는데 이용되는 제제의 일부일 수 있다.
또 다른 양상에서, 이들 제제는 단독으로 또는 다른 생체활성 아분획물, 예를 들면, B2 및/또는 B3과 혼합되었을 때, 치료 특성을 보유, 예를 들면, 신장 기능을 안정화 및/또는 개선 및/또는 재생하는 하나 이상의 세포 유형, 예를 들면, 혈관, 내분비 또는 내피, 즉 B4'가 고갈되거나 결핍된, 특정 아분획물 B4를 내포한다. 바람직한 양태에서, 생체활성 세포 집단은 B2이다. 특정 양태에서, B2 세포 집단은 B4 또는 B4'와 혼합된다. 특정 양태에서, B2 세포 집단은 B3과 혼합된다. 다른 양태에서, B2 세포 집단은 B3 및 B4 둘 모두, 또는 B3 및/또는 B4의 특정 세포 성분과 혼합된다.
B2 세포 집단은 메갈린, 쿠빌린, 히알루론산 신타제 2 (HAS2), 비타민 D3 25-하이드록실라제 (CYP2D25), N-카드헤린 (Ncad), E-카드헤린 (Ecad), 아쿠아포린-1 (Aqp1), 아쿠아포린-2 (Aqp2), RAB17, 멤버 RAS 종양유전자 패밀리 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인-포함 이온 수송 조절자 4 (Fxyd4), 용질 캐리어 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 멤버 4 (Slc9a4), 알데하이드 디하이드로게나제 3 패밀리, 멤버 B1 (Aldh3b1), 알데하이드 디하이드로게나제 1 패밀리, 멤버 A3 (Aldh1a3), 및 칼파인-8 (Capn8), 및 집합관 마커 아쿠아포린-4 (Aqp4) 중 하나 이상으로 구성된 군에서 선택되는 세뇨관 세포 마커의 발현으로 특징지어진다. B2는 B3 및/또는 B4보다 크고 더욱 많이 과립화되어, 약 1.045 g/㎖ 내지 약 1.063 g/㎖ (설치류), 약 1.045 g/㎖ 내지 1.052 g/㎖ (인간) 및 약 1.045 g/㎖ 내지 약 1.058 g/㎖ (개)의 부력 밀도를 갖는다.
B3 세포 집단은 일부 EPO-생성 세포와 함께 혈관, 사구체 및 근위 세뇨관 마커의 발현으로 특징지어지며, B2 및 B4와 비교하여 중간 정도의 크기 및 입도를 가져 약 1.063 g/㎖ 내지 약 1.073 g/㎖ (설치류), 약 1.052 g/㎖ 내지 약 1.063 g/㎖ (인간) 및 약 1.058 g/㎖ 내지 약 1.063 g/㎖ (개)의 부력 밀도를 갖는다. B3은 아쿠아포린 7 (Aqp7), FXYD 도메인-포함 이온 수송 조절자 2 (Fxyd2), 용질 캐리어 패밀리 17 (인산나트륨), 멤버 3 (Slc17a3), 용질 캐리어 패밀리 3, 멤버 1 (Slc3a1), 클라우딘 2 (Cldn2), 냅신 A 아스파틱 펩티다제 (Napsa), 용질 캐리어 패밀리 2 (촉진된 글루코즈 수송자), 멤버 2 (Slc2a2), 알라닐 (막) 아미노펩티다제 (Anpep), 막통과 단백질 27 (Tmem27), 아실-CoA 신쎄타제 중쇄 패밀리 멤버 2 (Acsm2), 글루타티온퍼옥시다제 3 (Gpx3), 푸럭토즈-1,6-비포스파타제 1 (Fbp1) 및 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스페라제 2 (Agxt2) 중 하나 이상으로 구성된 군에서 선택되는 마커의 발현으로 특징지어진다. B3은 또한 혈관 발현 마커 혈소판 내피 세포 흡착 분자 (Pecam) 및 사구체 발현 마커 포도신 (Podn)을 특징지어진다.
B4 세포 집단은 PECAM, VEGF, KDR, HIF1a, CD31, CD146 중 하나 이상을 포함하는 혈관 마커 세트; 포도신 (Podn) 및 네프린 (Neph) 중 하나 이상을 포함하는 사구체 마커 세트; 및 비-분획된 (UNFX) B2 및 B3과 비교되는 산소-조정가능한 EPO 농축 세포 집단의 발현으로 특징지어진다. B4는 또한 케모킨 (C-X-C 모티프) 수용체 4 (Cxcr4), 엔도텔린 수용체 타입 B (Ednrb), 콜라겐, 타입 V, 알파 2 (Col5a2), 카드헤린 5 (Cdh5), 플라스미노겐 활성자, 조직 (Plat), 안지오포이에틴 2 (Angpt2), 키나제 삽입 도메인 단백질 수용체 (Kdr), 분비 단백질, 산성의 시스테인-농축 (오스테오넥틴) (Sparc), 세르글리신 (Srgn), TIMP 금속단백질분해효소 억제제 3 (Timp3), 윌름즈 (Wilms) 종양 1 (Wt1), 날개없는-타입 MMTV 통합 부위 패밀리, 멤버 4 (Wnt4), G-단백질 시그널링 4 (Rgs4)의 조절자, 혈소판 내피 세포 흡착 분자 (Pecam) 및 에리트로포이에틴 (Epo) 중 하나 이상의 마커의 발현으로 특징지어진다. B4는 또한 부력 밀도가 약 1.073 g/㎖ 내지 약 1.091 g/㎖ (설치류), 약 1.063 g/㎖ 내지 약 1.091 g/㎖ (인간 및 개)이고 B2 또는 B3과 비교하여 더 작고 덜 과립화된 세포로 특징지어진다.
B4' 세포 집단은 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL의 부력 밀도를 갖고 PECAM, vEGF, KDR, HIF1a, 포도신, 네프린EPO, CK7, CK8/18/19 중 하나 이상의 마커를 발현하는 것으로 정의된다. 한 양태에서, B4' 세포 집단은 PECAM, vEGF, KDR, HIF1a, CD31, CD146 중 하나 이상을 포함하는 혈관 마커 세트의 발현으로 특징지어진다. 또 다른 양태에서, B4' 세포 집단은 내분비 마커 EPO의 발현으로 특징지어진다. 한 양태에서, B4' 세포 집단은 포도신 (Podn) 및 네프린 (Neph) 중 하나 이상을 포함하는 사구체 마커 세트의 발현으로 특징지어진다. 특정 양태에서, B4' 세포 집단은 PECAM, vEGF, KDR, HIF1a 중 하나 이상을 포함하는 혈관 마커 세트의 발현 및 내분비 마커 EPO의 발현으로 특징지어진다. 또 다른 양태에서, B4'는 또한 부력 밀도가 약 1.073 g/ml 내지 약 1.091 g/ml (설치류), 약 1.063 g/ml 내지 약 1.091 g/mL (인간 및 개)이고, B2 또는 B3과 비교하여 더 작고 덜 과립화된 세포로 특징지어진다.
한 양상에서, 본 발명은 밀도가 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL인 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포, 혈관 세포 및 사구체 세포 중 하나 이상을 포함하는 인간 신장 세포의 분리된 농축 B4' 세포 집단을 내포하는 제제를 제공한다. 한 양태에서, B4' 세포 집단은 혈관 마커의 발현으로 특징지어진다. 특정 양태에서, B4' 세포 집단은 사구체 마커의 발현으로 특징지어지지 않는다. 일부 양태에서, B4' 세포 집단은 산소-조정가능한 에리트로포이에틴 (EPO) 발현을 할 수 있다.
한 양태에서, 제제는 B4' 세포 집단을 내포하지만 밀도가 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL인 세뇨관 세포를 포함하는 B2 세포 집단을 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, B4' 세포 집단 제제는 밀도가 1.045 g/ml 미만인 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함하는 B1 세포 집단을 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, B4' 세포 집단 제제는 밀도가 1.091 g/ml 초과인 낮은 입도 및 생존능의 파편 및 소세포를 포함하는 B5 세포 집단을 포함하지 않는다.
한 양태에서, B4' 세포 집단-내포 제제는 밀도가 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL인 세뇨관 세포를 포함하는 B2 세포 집단; 밀도가 1.045 g/ml 미만인 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함하는 B1 세포 집단; 및 밀도가 1.091 g/ml 초과인 낮은 입도 및 생존능의 파편 및 소세포를 포함하는 B5 세포 집단을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, B4' 세포 집단은 신장 질환을 갖는 피험자로부터 유래될 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 밀도가 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL인 분리된 농축 세뇨관 세포 집단을 포함하는 제1 세포 집단인 B2 및 밀도가 약 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL인 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포 및 혈관 세포는 포함하나 사구체 세포는 고갈된 제2 세포 집단인 B4'를 포함하는 인간 신장 세포의 혼합물을 내포하는 제제를 제공하며, 이 혼합물은 밀도가 1.045 g/ml 미만인 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함하는 B1 세포 집단, 또는 밀도가 1.091 g/ml 초과인 낮은 입도 및 생존능을 갖는 파편 및 소세포를 포함하는 B5 세포 집단을 포함하지 않는다. 특정 양태에서, B4' 세포 집단은 혈관 마커의 발현으로 특징지어진다. 한 양태에서, B4' 세포 집단은 사구체 마커의 발현으로 특징지어지지 않는다. 특정 양태에서, B2는 추가로 집합관 상피 세포를 포함한다. 한 양태에서, 제제는 수용체-매개된 알부민 흡수를 할 수 있는 세포의 혼합물을 내포한다. 또 다른 양태에서, 세포의 혼합물은 산소-조정가능한 에리트로포이에틴 (EPO) 발현을 할 수 있다. 한 양태에서, 혼합물은 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 고분자량의 히알루론산 (HA) 종을 생성하고/하거나 생성을 자극할 수 있는 HAS-2-발현 세포를 포함한다. 모든 양태에서, 제1 및 제2 세포 집단은 신장 조직 또는 배양된 신장 세포로부터 유래될 수 있다 (Basu et al. Lipids in Health and Disease, 2011, 10:171).
한 양태에서, 제제는 생체내 전달시 재생 자극을 제공할 수 있는 혼합물을 내포한다. 다른 양태에서, 상기 혼합물은 생체내 전달시 사구체 여과, 세뇨관 재흡수, 소변 생성 및/또는 내분비 기능의 감퇴를 감소시키거나, 안정화시키거나 개선할 수 있다. 한 양태에서, B4' 세포 집단은 신장 질환을 갖는 피험자로부터 유래된다.
한 양상에서, 본 발명은 밀도가 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL인 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포, 혈관 세포 및 사구체 세포 중 하나 이상을 포함하는 인간 신장 세포의 분리된 농축 B4' 세포 집단을 내포하는 제제를 제공한다. 한 양태에서, B4' 세포 집단은 혈관 마커의 발현으로 특징지어진다. 특정 양태에서, B4' 세포 집단은 사구체 마커의 발현으로 특징지어지지 않는다. 발현되지 않는 사구체 마커는 포도신일 수 있다 (실시예 10). 일부 양태에서, B4' 세포 집단은 산소-조정가능한 에리트로포이에틴 (EPO) 발현을 할 수 있다.
한 양태에서, B4' 세포 집단-내포 제제는 밀도가 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL인 세뇨관 세포를 포함하는 B2 세포 집단을 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, B4' 세포 집단 제제는 밀도가 1.045 g/ml 미만인 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함하는 B1 세포 집단을 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, B4' 세포 집단 제제는 밀도가 1.091 g/ml 초과인 낮은 입도 및 생존능의 파편 및 소세포를 포함하는 B5 세포 집단을 포함하지 않는다.
한 양태에서, B4' 세포 집단-내포 제제는 밀도가 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL인 세뇨관 세포를 포함하는 B2 세포 집단; 밀도가 1.045 g/ml 미만인 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함하는 B1 세포 집단; 및 밀도가 1.091 g/ml를 초과하는 낮은 입도 및 생존능의 파편 및 소세포를 포함하는 B5 세포 집단을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, B4' 세포 집단은 신장 질환을 갖는 피험자로부터 유래될 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 밀도가 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL인 분리된 농축 세뇨관 세포 집단을 포함하는 제1 세포 집단인 B2 및 밀도가 약 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL인 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포 및 혈관 세포는 포함하나 사구체 세포는 고갈된 제2 세포 집단인 B4'를 포함하는 인간 신장 세포의 혼합물을 내포하는 제제를 제공하며, 이 혼합물은 밀도가 1.045 g/ml 미만인 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함하는 B1 세포 집단, 또는 밀도가 1.091 g/ml 초과인 낮은 입도 및 생존능을 갖는 파편 및 소세포를 포함하는 B5 세포는 포함하지 않는다. 특정 양태에서, B4' 세포 집단은 혈관 마커의 발현으로 특징지어진다. 한 양태에서, B4' 세포 집단은 사구체 마커의 발현으로 특징지어지지 않는다. 특정 양태에서, B2는 추가로 집합관 상피 세포를 포함한다. 한 양태에서, 세포의 혼합물은 수용체-매개된 알부민 흡수를 할 수 있다. 또 다른 양태에서, 세포의 혼합물은 산소-조정가능한 에리트로포이에틴 (EPO) 발현을 할 수 있다. 한 양태에서, 세포의 혼합물은 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 고분자량의 히알루론산 (HA) 종을 생성하고/하거나 생성을 자극할 수 있는 HAS-2-발현 세포를 포함한다. 모든 양태에서, 제1 및 제2 세포 집단은 신장 조직 또는 배양된 신장 세포로부터 유래될 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 세포 분획물 또는 농축 세포 집단의 조합 (가령, B1, B2, B3, B4 (또는 B4'), 그리고 B5)을 포함하는 이질성 신장 세포 집단을 내포하는 제제를 제공한다. 한 양태에서, 이러한 조합은 약 1.045 g/ml 내지 약 1.091 g/ml의 부력 밀도를 갖는다. 다른 양태에서, 이러한 조합은 약 1.045 g/ml 미만 내지 약 1.099 g/ml 또는 약 1.100 g/ml의 부력 밀도를 갖는다. 또 다른 양태에서, 이러한 조합은 밀도 구배에서 분리, 예를 들면, 원심분리에 의해 측정된 부력 밀도를 갖는다. 또 다른 양태에서, 세포 분획물의 조합은 B1 및/또는 B5가 고갈된 B2, B3, 그리고 B4 (또는 B4')를 내포한다. 일부 양태에서, 세포 분획물의 조합은 B2, B3, B4 (또는 B4'), 그리고 B5를 내포하지만 B1이 고갈된다. 일단 B1 및/또는 B5가 고갈되면, 이러한 조합은 B2, B3, 그리고 B4 (또는 B4') 세포 분획물의 조합을 포함하는 제제의 제조에 앞서, 시험관내에서 차후 배양될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도, B2, B3, B4, 그리고 B5의 B1-고갈된 조합의 시험관내 배양이 B5의 고갈을 유발한다는 것을 발견하였다. 한 양태에서, B5는 적어도 1회, 2회, 3회, 4회, 또는 5회 계대배양 후 고갈된다. 다른 양태에서, 본원에서 기술되는 조건 하에 계대배양 되는 B2, B3, B4, 그리고 B5 세포 분획물 조합은 계대배양된 세포 집단 중에서 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만, 또는 약 0.5% 미만인 비율에서 B5를 갖는 계대배양된 세포 집단을 제공한다.
또 다른 양태에서, B4'는 세포 분획물의 조합의 일부이다. 다른 양태에서, B5의 시험관내 배양 고갈은 저산소 조건 하에 발생한다.
한 양태에서, 제제는 생체내 전달시 재생 자극을 제공할 수 있는 혼합물을 내포한다. 다른 양태에서, 상기 혼합물은 생체내 전달시 사구체 여과, 세뇨관 재흡수, 소변 생성 및/또는 내분비 기능의 감퇴를 감소시키거나, 안정화시키거나 개선할 수 있다. 한 양태에서, B4' 세포 집단은 신장 질환을 갖는 피험자로부터 유래된다.
바람직한 양태에서, 제제는 B3 및/또는 B4와 조합된 B2를 포함하는 혼합물을 내포한다. 또 다른 바람직한 양태에서, 상기 혼합물은 B3 및/또는 B4'와 조합된 B2를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 상기 혼합물은 (i) B3 및/또는 B4와 조합된 B2 또는 (ii) B3 및/또는 B4'와 조합된 B2로 구성되거나 본질적으로 구성된다.
B4' 세포 집단을 포함하는 혼합물은 건강하지 않는 피험자로부터도 수득되는 B2 및/또는 B3 세포 집단을 포함할 수 있다. 건강하지 않은 피험자는 B4' 분획물이 수득되는 동일한 피험자일 수 있다. B4' 세포 집단과는 대조적으로, 건강하지 않은 피험자로부터 수득된 B2 및 B3 세포 집단은 건강한 개체로부터 유래되는 초기 신장 세포 집단과 비교하여, 통상적으로 하나 이상의 특정 세포 유형이 결핍되지 않는다.
Presnell et al. W0/2010/056328에서 기술되는 바와 같이, B2 및 B4 세포 제조물은 히알루론산 신타제-2 (HAS-2) (특히 B2세포 집단에 농축되는 마커)의 작용을 통하여 더욱 큰 분자량의 히알루론산 (HA) 종을 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 발현할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 5/6 Nx 모델을 B2로 처리함으로써 섬유증이 감소되었고, 동시에 생체내에서 HAS-2가 강력한 발현되고 처리된 조직내에 고분자량의 HA가 예상되어 생성되었다. 특히, 처리되지 않은 5/6 Nx 모델에서는 HAS-2의 제한적인 검출과 함께 섬유증이 초래되고, 고분자량의 HA가 거의 생성되지 않았다. 이론에 구애됨이 없이, B2 (및 어느 정도는 B4)에 의해 주로 생성되는 항-염증성 고분자량 HA 종이 신장 섬유증 감소 및 신장 재생을 돕는데 있어 세포 제조물과 상승적으로 작용하는 것으로 가정된다. 따라서, 본 발명은 히알루론산을 포함하는 생체물질과 함께 본원에서 기술되는 생체활성 신장 세포를 내포하는 제제를 포함한다. 이식된 세포에 의한 직접 생성 또는 생성의 자극을 통한 재생 자극 생체물질 성분의 제공 또한 본 발명에서 고려된다.
한 양상에서, 본 발명은 신장 질환, 빈혈증 및/또는 EPO 결핍의 치료를 요하는 피험자에서 이를 치료하는데 사용하기 위한 EPO-생성 신장 세포의 분리된 이질성 세포 집단을 내포하는 제제를 제공한다. 한 양태에서, 상기 세포 집단은 신장 생검으로부터 유래된다. 또 다른 양태에서, 상기 세포 집단은 전체 신장 조직으로부터 유래된다. 또 다른 양태에서, 상기 세포 집단은 신장 생검 또는 전체 신장 조직으로부터 확립된 포유동물 신장 세포의 시험관내 배양물로부터 유래된다. 모든 양태에서, 이들 세포 집단은 비분획된 세포 집단이며, 본원에서는 비-농축 세포 집단이라고도 한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 농축 아집단 (subpopulation)에서 EPO-생성 세포의 비율이 초기 또는 최초 세포 집단에서의 EPO-생성 세포의 비율보다 높도록 추가 농축된, 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 신장 세포의 분리된 세포 집단을 내포하는 제제를 제공한다. 한 양태에서, 농축 EPO-생성 세포 분획물은 비농축 초기 세포 집단에 포함된 간질 섬유모세포 및 세뇨관 세포와 비교하여 높은 비율의 간질 섬유모세포와 낮은 비율의 세뇨관 세포를 포함한다. 특정 양태에서, 농축 EPO-생성 세포 분획물은 비농축 초기 세포 집단에 포함된 사구체 세포, 혈관 세포 및 집합관 세포와 비교하여 높은 비율의 사구체 세포 및 혈관 세포와 낮은 비율의 집합관 세포를 포함한다. 이와 같은 양태에서, 이들 세포 집단은 본원에서 "B4" 세포 집단이라고 한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 추가 신장 세포 집단과 혼합된 EPO-생성 신장 세포 집단을 내포하는 제제를 제공한다. 한 양태에서, EPO-생성 세포 집단은 EPO-생성 세포가 농축된 제1 세포 집단, 예를 들면, B4이다. 또 다른 양태에서, EPO-생성 세포 집단은 EPO-생성 세포가 농축되지 않은 제1 세포 집단, 예를 들면, B2이다. 또 다른 양태에서, 제1 세포 집단은 제2 신장 세포 집단과 혼합된다. 일부 양태에서, 제2 세포 집단은 세뇨관 세포가 농축되며, 이는 세뇨관 세포 표현형의 존재로 입증될 수 있다. 또 다른 양태에서, 세뇨관 세포 표현형은 하나의 세뇨관 세포 마커의 존재로 표시될 수 있다. 또 다른 양태에서, 세뇨관 세포 표현형은 하나 이상의 세뇨관 세포 마커의 존재로 표시될 수 있다. 세뇨관 세포 마커는 메갈린, 쿠빌린, 히알루론산 신타제 2 (HAS2), 비타민 D3 25-하이드록실라제 (CYP2D25), N-카드헤린 (Ncad), E-카드헤린 (Ecad), 아쿠아포린-1 (Aqp1), 아쿠아포린-2 (Aqp2), RAB17, 멤버 RAS 종양유전자 패밀리 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인-포함 이온 수송 조절자 4 (Fxyd4), 용질 캐리어 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 멤버 4 (Slc9a4), 알데하이드 디하이드로게나제 3 패밀리, 멤버 B1 (Aldh3b1), 알데하이드 디하이드로게나제 1 패밀리, 멤버 A3 (Aldh1a3) 및 칼파인-8 (Capn8)을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 또 다른 양태에서, 제1 세포 집단은 간질-유래된 세포, 세뇨관 세포, 집합관-유래 세포, 사구체-유래 세포 및/또는 혈액 또는 혈관구조로부터 유래된 세포를 포함하나 이들에 한정되지 않는 수개의 신장 세포 유형 중 최소한 하나와 혼합된다.
본 발명의 제제는 B2 및/또는 B3과의 혼합물의 형태, 또는 농축 세포 집단, 예를 들면, B2+B3+B4/B4'의 형태로 B4 또는 B4'를 내포하는 EPO-생성 신장 세포 집단을 포함할 수 있다.
한 양상에서, 제제는 EPO 발현 및 산소에 대한 생체반응성으로 특징되는 EPO-생성 신장 세포 집단을 내포하고, 배양 시스템에서 산소 분압의 감소로 EPO 발현이 유도된다. 한 양태에서, EPO-생성 세포 집단은 EPO-생성 세포가 농축된다. 한 양태에서, EPO 발현은 세포가 정상적인 대기 수준 (~21%)의 이용가능한 산소 수준에서 배양된 세포 집단과 비교하여 배양 시스템에서 이용가능한 산소 수준이 감소되는 조건에서 세포 집단이 배양되었을 때 유도된다. 한 양태에서, 낮은 산소 조건에서 배양된 EPO-생성 세포가 정상적인 산소 조건에서 배양된 EPO-생성 세포와 비교하여 높은 수준의 EPO를 발현한다. 일반적으로, 이용가능한 산소 수준의 감소 상태 (또한 저산소 배양 조건이라고 함)에서 세포를 배양한다는 것은 이용가능한 산소의 수준이 정상적인 대기 수준 (정상 또는 표준 산소 배양 조건이라고 부르기도 함)에서 세포를 배양한 것과 비교하여 산소 수준이 감소되었다는 것을 의미한다. 한 양태에서, 저산소 세포 배양 조건은 약 1% 미만의 산소, 약 2% 미만의 산소, 약 3% 미만의 산소, 약 4% 미만의 산소 또는 약 5% 미만의 산소에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 또 다른 양태에서, 정상 또는 표준 산소 배양 조건은 약 10% 산소, 약 12% 산소, 약 13% 산소, 약 14% 산소, 약 15% 산소, 약 16% 산소, 약 17% 산소, 약 18% 산소, 약 19% 산소, 약 20% 산소 또는 약 21% 산소에서의 세포 배양을 포함한다.
또 다른 양태에서, EPO의 유도 또는 증가된 발현은 약 5% 미만의 이용가능한 산소에서 세포를 배양하고 대기 (약 21%) 산소에서 배양된 세포와 EPO 수준을 비교함으로써 수득되고 관찰될 수 있다. 또 다른 양태에서, EPO의 유도는 세포를 대기 산소 (약 21%)에서 얼마간의 시간 동안 배양하는 제1 배양 단계 및 이용가능한 산소 수준을 감소시키고 약 5% 미만의 이용가능한 산소에서 동일한 세포를 배양하는 제2 배양 단계를 포함하는 방법에 의해 EPO를 발현할 수 있는 세포를 배양함으로써 수득된다. 또 다른 양태에서, 저산소 상태에 반응적인 EPO 발현은 HIF1α에 의해 조절된다. 당업자는 본원에 기술된 세포에 대해 당업계에 공지된 다른 산소 조절 배양 조건을 이용할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
한 양상에서, 제제는 관류 (perfusion) 조건에 대한 생물-반응성 (가령, EPO 발현)으로 특징되는 EPO-생성 포유동물 세포의 농축 세포 집단을 내포한다. 한 양태에서, 관류 조건은 일시적, 간헐적 또는 연속적 유체 유동 (관류)을 포함한다. 한 양태에서, EPO 발현은 동력이 유동을 통해 세포에 전달되도록 세포가 배양되는 배지를 간헐적으로 또는 연속적으로 순환시키거나 교반시켰을 때 기계적으로 유도된다. 한 양태에서, 일시적, 간헐적 또는 연속적 유체 흐름을 겪는 세포는 이들이 3차원 구조로 존재하거나 이와 같은 3차원 구조를 형성하기 위한 골격 및/또는 공간을 제공하는 물질 내에 또는 물질 상에 존재하도록 배양된다. 한 양태에서, 세포는 다공성 비드 상에서 배양되거나, 흔들리는 플랫폼, 궤도를 선회하는 플랫폼 또는 스피너 플라스크를 통하여 간헐적 또는 연속적 유체 흐름을 받게 된다. 또 다른 양태에서, 세포는 3차원 스캐폴딩에서 배양되며, 스캐폴드는 고정되고 유체는 스캐폴딩를 통하여 또는 가로질러 방향성 있게 흐르도록 한 장치에 놓인다. 당업자는 당업계에 공지된 다른 관류 배양 조건이 본원에서 기술되는 세포에 대해 이용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
세포 집괴
또 다른 양상에서, 본 발명의 제제는 세포 집괴 또는 회전타원체를 내포한다. 한 양태에서, 세포 집괴는 본원에서 기술되는 생체활성 세포 집단을 포함한다. 또 다른 양태에서, 세포 집괴는 생체활성 신장 세포, 예를 들면, 신장 세포 혼합물, 농축 신장 세포 집단, 그리고 신장 세포 분획물의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 생체활성 신장 세포는 본원에서 더욱 기술된 바와 같이 3D 형식으로 배양될 수 있다. 일부 양태에서, 용어 "오르가노이드"는 고유 신장과 일치하는 표현형 및/또는 기능을 갖는 세포의 축적을 말한다. 일부 양태에서, 오르가노이드는 다양한 계통의 세포의 혼성 집단을 포함하고, 이들은 전형적으로, 소정의 조직에서 생체내에서 발견된다. 일부 양태에서, 본 발명의 오르가노이드는 임의의 수단을 통해 시험관내에서 형성되는데, 여기서 본 발명의 세포는 집합체를 형성하고, 이들은 차례로, 회전타원체, 오르가노이드, 또는 이들의 조합을 형성할 수 있다. 이런 집합체, 회전타원체 또는 오르가노이드는 일부 양태에서, 특정 장기와 일치하는 구조를 취한다. 일부 양태에서, 이런 집합체, 회전타원체 또는 오르가노이드는 표면 마커를 발현하고, 이들은 특정 장기의 세포에 의해 전형적으로 발현된다. 일부 양태에서, 이런 집합체, 회전타원체 또는 오르가노이드는 화합물 또는 물질을 생성하고, 이들은 특정 장기의 세포에 의해 전형적으로 발현된다. 일부 양태에서, 본 발명의 세포는 천연 기질, 예를 들면, 젤라틴에서 배양될 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명의 세포는 합성 기질, 예를 들면, PGLA에서 배양될 수 있다. 세포 집괴를 제공하기 위한 예시적인 방법은 실시예 20에서 제공된다.
비활성 세포 집단
본원에서 기술되는 바와 같이, 본 발명은 생체활성 성분이 농축되고 비활성 또는 바람직하지 못한 성분은 고갈된, 이질성 신장 세포 집단의 특정 아분획물이 초기 세포 집단 보다 우수한 치료 및 재생 결과를 제공한다는 놀라운 발견에 일부 근거한다. 바람직한 양태에서, 본 발명에 의해 제공된 제제는 B1 및/또는 B5 세포 집단이 고갈되는 세포 집단을 내포한다. 가령, 하기 세포 집단은 B1 및/또는 B5: B2, B3 및 B4 (또는 B4') 중 2개 이상의 혼합물; B2, B3 및 B4 (또는 B4')의 농축 세포 집단이 고갈될 수 있다.
B1 세포 집단은 부력 밀도가 약 1.045 g/㎖ 미만인 세포 집단을 갖는, 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함한다. B5 세포 집단은 부력 밀도가 약 1.091 g/㎖ 초과인 낮은 입도와 생존능의 파편 및 소세포를 포함한다.
세포 집단의 분리 및 배양 방법
한 양상에서, 본 발명의 제제는 신장 조직으로부터 분리된 및/또는 배양된 세포 집단을 내포한다. 본원에서는 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 수송 결핍, 및 사구체 여과 결핍 치료를 비롯한 치료 목적으로 제제에 이용되는 신장 세포 성분, 예를 들면, 농축 세포 집단을 분리 및 단리하는 방법이 제공된다. 한 양태에서, 상기 세포 집단은 새로 분해된, 다시 말하면, 기계적으로 또는 효소로 분해된 신장 조직으로부터 단리되거나 포유동물 신장 세포의 이질성 시험관내 배양물로부터 단리된다.
이들 제제는 밀도 구배물 상에서 분리하기 전 저산소 배양 조건에서 배양되면 B4'를 비롯한 B4, 및 B2 및/또는 B3 분획물 모두에서 세포의 분포 및 조성을 향상시키는 이질성 신장 세포 혼합물을 내포할 수 있다. 질환이 있는 신장 및 질환이 없는 신장으로부터 분리된 신장 세포에 대해 B2로부터 B4에서 산소-의존적 세포 농축이 관찰되었다. 이론에 구속되지 않고, 이는 다음 중 하나의 현상 때문일 수 있다: 1) 저산소 배양 기간 동안 특정 세포 성분들의 선택적 생존, 사멸 또는 증식; 2) 저산소 배양에 반응하여 세포 입도 및/또는 크기의 변화 (이에 의해 부력 밀도 변화 및 후속적으로 밀도 구배 분리 동안 국지화에 영향을 줌); 및 3) 저산소 배양 기간에 반응하여 세포 유전자/단백질 발현의 변화 (이에 의해 구배물의 임의의 소정 분획물 내에서 세포의 차등적 특징을 초래함). 따라서, 한 양태에서, 이들 제제는 세뇨관 세포가 농축된 세포 집단, 예를 들면, B2를 내포하고, 저산소-저항성이다.
본 발명의 세포 집단을 분리 및 단리하기 위한 예시적인 기술은 관심 세포 집단에 포함된 상이한 세포 유형의 상이한 근거하여 밀도 구배물 상에서 분리하는 것을 포함한다. 임의의 소정의 세포 유형의 비중은 세포내 입도, 세포내 물의 용적 및 기타 인자들에 의해 영향을 받을 수 있다. 한 양상에서, 본 발명은 인간, 개 및 설치류를 포함하나 이들에 한정되지 않는 다수 종에 걸쳐 본 발명의 세포 제조물, 예를 들면, B4'를 비롯하여 B2 및 B4의 분리를 위한 최적의 구배 조건을 제공한다. 바람직한 한 양태에서, 밀도 구배를 이용하여 이질성 신장 세포 집단으로부터 유래된 세뇨관 세포 분획물의 새로운 농축 세포 집단, 즉 B2 세포 집단을 수득한다. 한 양태에서, 밀도 구배를 이용하여 이질성 신장 세포 집단으로부터 유래된 새로운 EPO-생성 농축 세포 집단, 즉 B4 세포 집단을 수득한다. 다른 양태에서, 밀도 구배를 이용하여 신장의 세뇨관 세포, 사구체 세포 및 내피 세포의 농축 아집단을 수득한다. 한 양태에서, EPO-생성 세포 및 세뇨관 세포 모두가 적혈구 및 세포 파편으로부터 분리된다. 한 양태에서, EPO-생성, 사구체 및 혈관 세포가 다른 세포 유형 및 적혈구 및 세포 파편으로부터 분리되며, 동시에 세뇨관 세포 및 집합관 세포의 아집단이 다른 세포 유형 및 적혈구 및 세포 파편으로부터 분리된다. 한 양태에서, 내분비, 사구체 및/또는 혈관 세포가 다른 세포 유형 및 적혈구 및 세포 파편으로부터 분리되며, 동시에 세뇨관 세포 및 집합관 세포의 아집단이 다른 세포 유형 및 적혈구 및 세포 파편으로부터 분리된다.
한 양상에서, 본 발명의 제제는 하기에서 설명되는 특정한 주요 특징에 근거하여, 물에서 60% 비이온성 요오드처리된 화합물인 요오딕사놀을 포함하는 OPTIPREP® (Axis-Shield) 밀도 구배 배지를 부분적으로 사용하여 생성된 세포 집단을 내포한다. 그러나, 당업자는 본 발명의 세포 집단을 분리하는데 필수적인 특징을 포함하는 당해 기술분야에 공지된 세포 표면 마커를 사용하는 임의의 밀도 구배 또는 면역학적 분리와 같은 다른 수단이 본 발명에 따라 이용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또한, 밀도 구배를 통하여 아집단을 분리하는데 기여하는 동일한 세포 특징 (크기 및 입도)을 개발하여 유세포분석을 통하여 세포의 아집단을 분리할 수 있다는 것 또한 인식해야 한다 (전방 산란 = 유세포분석을 통한 크기 반영, 측면 산란 = 입도 반영). 중요한 것은 밀도 구배 배지가 특정 관심 세포에 대해 독성이 낮아야 한다는 점이다. 밀도 구배 배지는 특정 관심 세포에 대해 독성이 낮아야 하고, 본 발명은 관심 세포의 선별 과정에서 역할을 하는 구배 배지의 사용을 고려한다. 이론에 구속되지 않고, 적하와 회수 단계 사이에서 상당한 세포 손상이 있기 때문에, 요오딕사놀을 포함하는 구배에 의해 회수되는 본 발명의 세포 집단은 요오딕사놀-저항성으로 보이며, 이는 구배 조건하에서 요오딕사놀에의 노출로 특정 세포가 제거된다는 것을 제시한다. 요오딕사놀 구배 후에 특정 밴드에 나타나는 세포는 요오딕사놀 및/또는 밀도 구배 노출의 임의의 부적당한 효과에 저항성이다. 따라서, 본원에서 기술되는 제제를 위한 세포 집단의 분리 및/또는 선별에서 약하거나 중간 정도의 신장독소인 추가 대비 배지의 사용 역시 고려된다. 또한, 밀도 구배 배지는 인간 혈장에 있는 단백질에 결합하지 않아야 하거나 관심 세포의 주요 기능에 역효과를 주지 않아야 한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)를 이용하여 신장 세포 유형이 농축 및/또는 고갈된 세포 집단을 내포하는 제제를 제공한다. 한 양태에서, 신장 세포 유형은 BD FACSAria™ 또는 등가물을 이용하여 농축 및/또는 고갈될 수 있다.
또 다른 양상에서, 이들 제제는 자기 세포 분류를 이용하여 신장 세포 유형이 농축 및/또는 고갈된 세포 집단을 내포한다. 한 양태에서, 신장 세포 유형은 Miltenyi autoMACS® 시스템 또는 등가물을 이용하여 농축 및/또는 고갈될 수 있다.
또 다른 양상에서, 이들 제제는 3차원 배양이 수행된 신장 세포 집단을 내포할 수 있다. 한 양상에서, 이들 세포 집단을 배양하는 방법은 연속적 관류를 통한다. 한 양태에서, 3차원 배양 및 연속 관류를 통하여 배양된 세포 집단은 정적으로 배양된 세포 집단과 비교하였을 때, 더욱 큰 세포충실성 및 상호연결성을 나타낸다. 또 다른 양태에서, 3차원 배양 및 연속 관류를 통하여 배양된 세포 집단은 이러한 세포 집단의 정치 배양과 비교하였을 때, 더욱 큰 EPO 발현과 e-카드헤린과 같은 신장 세뇨관-연관된 유전자의 증진된 발현을 나타낸다. 추가적인 또 다른 양태에서, 연속적 관류를 통하여 배양된 세포 집단은 정적으로 배양된 세포 집단과 비교하였을 때, 더욱 높은 수준의 글루코즈 및 글루타민 소비를 나타낸다.
본원 (실시예 7을 포함)에서 기술되는 바와 같이, 본 발명의 제제를 위한 세포 집단을 제조하는 방법에 저산소 조건이 이용될 수 있다. 그러나, 세포 집단을 제조하는 방법은 낮은 산소 조건화 단계 없이도 이용될 수 있다. 한 양태에서, 표준산소 조건이 이용될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 세포 집괴 또는 회전타원체를 제조하기 위한 프로토콜을 제공한다 (예로써, 실시예 20을 참조한다).
당업자는 당업계에 공지된 기타 분리 및 배양 방법을 본원에서 기술되는 세포에 이용할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
3. 생체물질
다양한 생체물질은 본 발명의 치료 제제를 제공하기 위해 활성 작용제와 조합될 수 있다. 생체물질은 임의의 적절한 형상 (가령, 비드) 또는 형태 (가령, 액체, 겔 등)일 수 있다. 문헌 [참조: Bertram et al., 미국 공개 출원 20070276507, 본원에 전체가 참고문헌으로 편입된다]에서 기술하고 있는 바와 같이, 폴리머 매트릭스 또는 스캐폴드는 다수의 전체 시스템, 기하학 또는 공간 제약을 만족시키는 다수의 바람직한 배치로 성형될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 매트릭스 또는 스캐폴드는 3차원이며 기관 또는 조직 구조의 크기 및 모양에 맞도록 성형될 수 있다. 가령, 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 수송 결핍 또는 사구체 여과 결핍 치료용 폴리머 스캐폴드를 사용할 때, 3차원 (3-D) 매트릭스가 사용될 수 있다. 상이한 형태의 다양한 3-D 스캐폴드가 사용될 수 있다. 당연히, 폴리머 매트릭스는 상이한 체격의 환자에 맞도록 상이한 크기 및 형태로 성형될 수 있다. 또한, 폴리머 매트릭스는 환자의 특별 요구를 수용하도록 다른 방법으로 성형될 수 있다. 또 다른 양태에서, 폴리머 매트릭스 또는 스캐폴드는 생체적합성의 다공성 폴리머 스캐폴드일 수 있다. 스캐폴드는 개방-셀 폴리락트산 (OPLA®), 셀룰로오즈 에테르, 셀룰로오즈, 셀룰로오즈 에스테르, 불소 처리된 폴리에틸렌, 페놀, 폴리-4-메틸펜텐, 폴리아크릴니트릴, 폴리아미드, 폴리아미드이미드, 폴리아크릴레이트, 폴리벤조옥사졸, 폴리카보네이트, 폴리시아노아릴에테르, 폴리에스테르, 폴리에스테르카보네이트, 폴리에테르, 폴리에테르에테르케톤, 폴리에테르이미드, 폴리에테르케톤, 폴리에테르술폰, 폴리에틸렌, 폴리플루오르올레핀, 폴리이미드, 폴리올레핀, 폴리옥사디아졸, 폴리페닐렌 옥사이드, 폴리페닐렌 설파이드, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리설파이드, 폴리술폰, 폴리테트라플루오르에틸렌, 폴리티오에테르, 폴리트리아졸, 폴리우레탄, 폴리비닐, 폴리비닐리덴 불화물, 재생 셀룰로오즈, 실리콘, 우레아-포름알데하이드, 콜라겐, 젤라틴, 알기네이트, 라미닌, 피브로넥틴, 실크, 엘라스틴, 알기네이트, 히알루론산, 아가로즈 또는 코폴리머 또는 이의 물리적 블렌드를 포함하나 이들에 한정되지 않는 다수의 합성 또는 천연-발생 물질로부터 형성될 수 있다. 스캐폴딩 배치는 액상 현탁액부터 부드러운 다공성 스캐폴드 내지 딱딱한 모양을 가진 다공성 스캐폴드까지 다양하다. 한 양태에서, 배치는 하이드로겔이 될 수 있는 용액의 액상 형태이다.
하이드로겔은 다양한 폴리머 물질로부터 형성될 수 있고, 다양한 생의학적 용도에 유용하다. 하이드로겔은 친수성 폴리머의 3차원적 네트워크로서 물리적으로 설명될 수 있다. 하이드로겔 유형에 따라, 비록 물에 용해되지는 않지만, 다양한 비율의 물을 포함한다. 하이드로겔은 높은 수분 함량에도 불구하고 친수성 잔기의 존재로 인하여 추가적으로 큰 용적의 액체를 결합할 수 있다. 하이드로겔은 이들의 젤라틴성 구조의 변화 없이 상당히 팽창된다. 하이드로겔의 기본적인 물리적 특징은 이용되는 폴리머의 성질 및 생성물에 대한 추가적인 특정 장비에 따라 특정하게 변형될 수 있다.
바람직하게는, 하이드로겔은 생물학적 비활성이고 포유동물 조직과 생리학적으로 양립가능한, 폴리머, 생물학적으로 유도된 물질, 합성에 의해 유도된 물질 또는 이의 조합으로 제조된다. 하이드로겔 물질은 바람직하게는 염증 반응을 유도하지 않는다. 하이드로겔을 형성하는데 사용될 수 있는 다른 물질의 예는 (a) 개질된 알기네이트, (b) 일가 양이온에의 노출로 겔화되는 폴리사카라이드 (즉, 겔란 검 및 카라지난), (c) 매우 점성이 큰 용액이거나 틱소트로픽 (thixotropic)이며 구조의 느린 발달에 의해 시간을 두고 겔을 형성하는 폴리사카라이드 (가령, 히알루론산), (d) 젤라틴 또는 콜라겐 및 (e) 폴리머 하이드로겔 전구물질 (가령, 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 글리콜 블록 코폴리머 및 단백질)을 포함한다. 미국 특허 6,224,893 B1은 본 발명에 따른 하이드로겔을 제조하는데 적합한 다양한 폴리머 및 이와 같은 폴리머의 화학적 특성에 대한 상세한 설명을 제공한다.
스캐폴딩 또는 생체물질 특성은 세포가 스캐폴딩 또는 생체물질 물질에 부착되어 이와 상호작용할 수 있고/있거나 세포가 포착될 수 있는 다공성 공간을 제공할 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 다공성 스캐폴드 또는 생체물질은 다공성 스캐폴드로 설계된 생체물질 상 (가령, 세포의 부착에 의해) 및/또는 스캐폴드의 세공 내에 (가령, 세포의 포착에 의해) 하나 이상의 세포 집단 또는 혼합물의 첨가 또는 침착을 허용한다. 또 다른 양태에서, 스캐폴드 또는 생체물질은 본원에서 기술되는 바와 같은 구조물을 형성하기 위하여 스캐폴드 내에서 세포:세포 및/또는 세포:생체물질 상호작용을 허용하거나 촉진시킨다.
한 양태에서, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 생체물질은 5.1 kDA부터 > 2 x 106 kDa까지의 크기를 갖는 HA 분자를 포함하는 하이드로겔 형태의 히알루론산 (HA)으로 구성된다. 또 다른 양태에서, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 생체물질은 5.1 kDA부터 > 2 x 106 kDa까지의 크기를 갖는 HA 분자를 포함하는 다공성 포움 형태의 히알루론산 (HA)으로 구성된다. 추가의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 생체물질은 약 50 미크론 내지 약 300 미크론의 세공 크기와 개방-셀 구조를 갖는 폴리-락트산 (PLA)-기반 포움으로 구성된다. 또 다른 양태에서, 특정 세포 집단, 바람직하게는 B2 및 B4는 특히 신장내 이식 후, 히알루론산 신타제-2 (HAS-2)를 통하여 고분자량 히알루론산의 합성을 직접적으로 제공하고/하거나 촉진한다.
본원에서 기술되는 생체물질은 또한, 일정한 외부 조건, 예를 들면, 시험관내 또는 생체내 조건에 반응하도록 설계되거나 개조될 수 있다. 한 양태에서, 생체물질은 온도-민감성이다 (가령, 시험관내에서 또는 생체내에서). 또 다른 양태에서, 생체물질은 효소 분해에 대한 노출에 반응하도록 개조된다 (가령, 시험관내에서 또는 생체내에서). 외부 조건에 대한 생체물질의 반응은 본원에서 기술되는 바와 같이 정교하게 조율될 수 있다. 기술된 제제의 온도 민감성은 제제 내에 생체물질의 비율을 조정함으로써 변화될 수 있다. 가령, 용액 내에 젤라틴의 비율은 최종 제제 (가령, 액체, 겔, 비드 등)에서 젤라틴의 온도 민감성을 조절하기 위해 조정될 수 있다. 대안으로, 생체물질은 효소 분해에 대한 더욱 큰 내성을 제공하기 위해 화학적으로 가교될 수 있다. 가령, 카르보디이미드 가교제는 젤라틴 비드를 화학적으로 가교하여 내생성 효소에 대한 감소된 감수성을 제공하는데 이용될 수 있다.
한 양상에서, 외부 조건에 대한 생체물질에 의한 반응은 생체물질의 구조적 완전성의 상실에 관계한다. 비록 온도-민감성 및 효소 분해에 대한 내성이 상기 제공되긴 하지만, 물질 완전성의 상실이 상이한 생체물질에서 일어날 수 있는 다른 기전이 존재한다. 이들 기전에는 열역학 기전 (가령, 용융과 같은 상 전이, 확산 (가령, 생체물질로부터 이온 가교제의 주변 조직 내로 확산)), 화학적 기전, 효소적 기전, pH 기전 (가령, pH-민감성 리포좀), 초음파 기전, 그리고 광불안정성 기전 (광 투과)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 생체물질이 구조적 완전성을 상실하는 정확한 기전은 변하지만, 전형적으로 이러한 기전은 이식의 시점에서 또는 이식 후 촉발된다.
당업자는 당업계에 공지된 다른 타입의 합성 또는 천연 생성 물질이 본원에서 기술되는 것과 같은 스캐폴드를 형성하는데 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
한 양상에서, 본 발명은 상기 언급된 스캐폴드 또는 생체물질로부터 제조된 본원에서 기술되는 것과 같은 구조물을 제공한다.
4. 구조물
한 양상에서, 본 발명은 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO 결핍의 치료를 요하는 피험자의 치료를 위한 본원에서 기술되는 하나 이상의 세포 집단을 갖는 이식가능한 구조물을 내포하는 제제를 제공한다. 한 양태에서, 상기 구조물은 하나 이상의 합성 또는 천연-발생 생체적합 물질로 구성된 스캐폴드 또는 매트릭스인 생체적합 물질 또는 생체물질, 및 부착 및/또는 포착에 의해 스캐폴드 표면상에 침착되거나 표면 내에 포매된 하나 이상의 세포 집단 또는 세포 혼합물로 구성된다. 특정 양태에서, 구조물은 생체물질 및 생체물질 성분(들)으로 코팅된, 생체물질 성분(들) 상에 침착된, 생체물질 성분(들) 내에 침착된, 생체물질 성분(들)에 부착된, 생체물질 성분(들) 내에 포착된, 생체물질 성분(들) 내에 포매된, 생체물질 성분(들)이 파종된, 또는 생체물질 성분(들)과 조합된 본원에서 기술되는 하나 이상의 세포 집단 또는 세포 혼합물로 구성된다. 농축 세포 집단 또는 이들의 혼합물을 비롯한 본원에서 기술되는 어떠한 세포 집단도 구조물을 형성하기 위해 매트릭스와 조합하여 사용될 수 있다.
한 양상에서, 제제는 본원에서 기술되는 바와 같이 외부 조건에 반응하도록 설계되거나 개조된 생체물질로 만들어진 구조물을 내포한다. 결과적으로, 구조물 내에서 세포 집단과 생체물질의 결합의 성격은 외부 조건에 따라 변할 것이다. 가령, 세포 집단의 온도-민감성 생체물질과의 결합은 온도에 따라 변한다. 한 양태에서, 구조물은 세포 집단, 그리고 약 8℃ 또는 그 이하에서 실질적으로 고형 상태 및 약 주위 온도 또는 그 이상에서 실질적으로 액상 상태를 갖는 생체물질을 내포하고, 여기서 세포 집단은 약 8℃ 또는 그 이하에서 생체물질 내에 현탁된다.
하지만, 세포 집단은 약 주위 온도 또는 그 이상에서 생체물질의 부피 전역에서 실질적으로 자유롭게 이동한다. 세포 집단을 더욱 낮은 온도에서 실질적으로 고형 상태에서 현탁시키는 것은 유체에서 세포와 비교하여, 세포, 예를 들면, 부착 의존성 (anchorage-dependent) 세포에 대한 안정성 이점을 제공한다. 게다가, 세포를 실질적으로 고형 상태에서 현탁시키는 것은 하기 이점 중에서 하나 이상을 제공한다: i) 세포의 침전을 예방하고, ii) 세포가 현탁 상태에서 생체물질에 부착되어 있도록 하고; iii) 세포가 생체물질의 부피 전역에서 더욱 균일하게 분산되어 있도록 하고; iv) 세포 집괴의 형성을 예방하고; 그리고 v) 제제의 보관과 수송 동안 세포에 대한 더욱 우수한 보호를 제공한다. 피험자에 투여로 귀결되는 이런 특징을 유지할 수 있는 제제는 적어도, 제제 내에 세포의 전반적인 건강이 더욱 우수하고 세포의 더욱 균일하고 지속적인 용량이 투여될 것이기 때문에, 유리하다.
또 다른 양태에서, 상기 구조물의 침착된 세포 집단 또는 세포 성분은 산소-조정가능 EPO-생성 세포가 농축된 제1 신장 세포 집단이다. 또 다른 양태에서, 제1 신장 세포 집단은 산소-조정가능 EPO-생성 세포에 추가하여 사구체 및 혈관 세포를 포함한다. 한 양태에서, 제1 신장 세포 집단은 B4' 세포 집단이다. 또 다른 양태에서, 상기 구조물의 침착된 세포 집단 또는 세포 성분은 제1 농축 신장 세포 집단 및 제2 신장 세포 집단 모두를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 세포 집단은 산소-조정가능 EPO 생성 세포가 농축되지 않는다. 또 다른 양태에서, 제2 세포 집단은 신장 세뇨관 세포가 농축된다. 또 다른 양태에서, 제2 세포 집단은 신장 세뇨관 세포가 농축되고 집합관 상피 세포를 포함한다. 다른 양태에서, 신장 세뇨관 세포는 메갈린, 쿠빌린, 히알루론산 신타제 2 (HAS2), 비타민 D3 25-하이드록실라제 (CYP2D25), N-카드헤린 (Ncad), E-카드헤린 (Ecad), 아쿠아포린-1 (Aqp1), 아쿠아포린-2 (Aqp2), RAB17, 멤버 RAS 종양유전자 패밀리 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인-포함 이온 수송 조절자 4 (Fxyd4), 용질 캐리어 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 멤버 4 (Slc9a4), 알데하이드 디하이드로게나제 3 패밀리, 멤버 B1 (Aldh3b1), 알데하이드 디하이드로게나제 1 패밀리, 멤버 A3 (Aldh1a3) 및 칼파인-8 (Capn8)을 포함하나 이들에 한정되지 않는 하나 이상의 세뇨관 세포 마커의 발현으로 특징지어진다.
한 양태에서, 본 발명의 구조물을 형성을 위한 생체물질 또는 스캐폴드 상에 침착되거나 이와 조합되는 세포 집단은 다양한 공급원, 예를 들면, 자가 공급원으로부터 유래된다. 또한, 동종이계 또는 동계 (자가유전자형 또는 동종유전자형) 공급원을 포함하나 이로 제한되지 않는 비-자가 공급원도 사용에 적합하다.
당업자는 구조물을 형성하기 위하여 세포 집단을 생체물질에 침착시키거나 생체물질과 조합하는 수 가지의 적합한 방법이 있다는 것을 인지할 것이다.
한 양상에서, 본 발명의 구조물은 본원에서 기술되는 이용 방법에 사용하기에 적합하다. 한 양태에서, 상기 구조물은 임의 병인의 신장 질환, 빈혈증 또는 임의 병인의 EPO 결핍의 치료를 요하는 피험자에게 투여하기에 적합하다. 다른 양태에서, 상기 구조물은 적혈구 항상성의 개선 또는 회복을 요하는 피험자에게 투여하기에 적합하다. 또 다른 양태에서, 상기 구조물은 신장 기능을 개선시킬 필요가 있는 피험자에게 투여하기에 적합하다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 a) 하나 이상의 생체적합 합성 폴리머 또는 천연-발생 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 생체물질; 및
b) 생체물질로 코팅되고/되거나, 생체물질 상에 침착되고/되거나, 생체물질 내에 포착되고/되거나, 생체물질 중에 현탁되고/되거나, 생체물질 내에 포매되고/되거나, 달리 생체물질과 조합되는, 밀도가 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL인 분리된 농축 세뇨관 세포 집단을 포함하는 제1 세포 집단인 B2 및 밀도가 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL인 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포 및 혈관 세포는 포함하나 사구체 세포는 고갈된 제2 세포 집단인 B4'를 포함하는 신장 질환을 갖는 피험자로부터 유래되는 포유동물 신장 세포의 혼합물을 포함하는, 신장 기능의 개선이 필요한 피험자에게 이식하기 위한 구조물을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 혼합물은 밀도가 1.045 g/ml 미만인 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함하는 B1 세포 집단 또는 밀도가 1.091 g/ml 초과인 낮은 입도 및 생존능을 갖는 파편 및 소세포를 포함하는 B5 세포는 포함하지 않는다.
한 양태에서, 상기 구조물은 혈관 마커의 발현으로 특징지어지는 B4' 세포 집단을 포함한다. 일부 양태에서, B4' 세포 집단은 사구체 마커의 발현으로 특징지어지지 않는다. 특정 양태에서, 상기 혼합물은 산소-조정가능 에리트로포이에틴 (EPO) 발현을 할 수 있다. 모든 양태에서, 상기 혼합물은 포유동물 신장 조직 또는 배양된 신장 세포로부터 유래될 수 있다.
한 양태에서, 상기 구조물은 상기 혼합물의 포착 및/또는 부착에 적합한 3차원 (3-D)의 다공성 생체물질로 구성된 생체물질을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 구조물은 포유동물 세포를 포매, 부착, 현탁 또는 코팅하기에 적합한 액체 또는 반-액체 겔로 구성된 생체물질을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 구조물은 하이드로겔 형태의 고분자량 히알루론산 (HA) 종으로 주로 구성된 생체물질을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 구조물은 다공성 포움 형태의 고분자량 히알루론산 종으로 구성된 생체물질을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 구조물은 약 50 마이크론 내지 약 300 마이크론의 세공을 갖는 폴리-락트산-기반 포움으로 구성된 생체물질을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 구조물은 개선된 신장 기능이 필요한 피험자에 대해 자가인 신장 시료로부터 유래될 수 있는 하나 이상의 세포 집단을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 시료는 신장 생검이다. 일부 양태에서, 피험자는 신장 질환을 갖는다. 추가의 다른 양태에서, 상기 세포 집단은 비-자가 신장 시료로부터 유래된다. 한 양태에서, 상기 구조물은 적혈구 항상성을 제공한다.
5. 분비 생성물
다른 양상에서, 본 발명은 본원에서 기술되는 바와 같이, 농축 신장 세포 집단 또는 농축 신장 세포 집단의 혼합물로부터 분비되는 생성물과 조합으로, 활성 작용제, 예를 들면, 세포 집단을 내포하는 제제에 관한 것이다. 한 양태에서, 상기 생성물은 측분비 인자, 내분비 인자, 곁분비 인자 및 소포 중 하나 이상을 포함한다. 소포는 측분비 인자, 내분비 인자, 곁분비 인자, 미세소포, 엑소솜 및 RNA 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 분비 생성물은 또한 측분비 인자, 내분비 인자, 곁분비 인자 및 RNA를 포함하나 이로 제한되지 않는 미세소포 내에 있지 않는 생성물을 포함할 수 있다. 가령, 세포외 miRNA는 소포 외적으로 검출되었다 [참조: Wang et al., Nuc Acids Res 2010, 1-12 doi:10.1093/nar/gkq601, July 7, 2010]. 분비 생성물은 또한 세포-유래 생성물, 예를 들면, 세포-유래 소포로 불릴 수 있다.
또 다른 양태에서, 제제는 신장 세포로부터 유래되는 소포의 일부인 분비 생성물을 내포한다. 상기 소포는 상기 인자들은 다른 목적지로 전달할 수 있다. 한 양태에서, 소포는 분비 소포이다. 엑소솜, 미세소포, 엑토솜, 막 입자, 엑소솜-유사 소포 및 아폽토시스 소포를 포함하나 이로 제한되지 않는 다양한 유형의 분비 소포가 고려된다 [참조: Thery et al., 2010. Nat. Rev. Immunol. 9:581-593]. 한 양태에서, 분비 소포는 엑소솜이다. 또 다른 양태에서, 분비소포는 미세소포이다. 또 다른 양태에서, 분비 소포는 하나 이상의 세포 성분을 포함한다. 상기 성분은 막 지질, RNA, 단백질, 대사산물, 세포질 성분 및 이들의 임의의 조합 중 하나 이상일 수 있다. 바람직한 양태에서, 분비 소포는 microRNA를 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 필수적으로 구성된다. 바람직하게는, miRNA는 인간 miRNA이다. 한 양태에서, 하나 이상의 miRNA는 하기로 구성된 군에서 선택된다: miR-30b-5p, miR-449a, miR-146a, miR-130a, miR-23b, miR-21, miR-124 및 miR-151. 또 다른 양태에서, 하나 이상의 miRNA는 하기로 구성된 군에서 선택될 수 있다: let-7a-1; let-7a-2; let-7a-3; let-7b; let-7c; let-7d; let-7e; let-7f-1; let-7f-2; let-7g; let-7i; mir-1-1; mir-1-2; mir-7-1; mir-7-2; mir-7-3; mir-9-1; mir-9-2; mir-9-3; mir-10a; mir-10b; mir-15a; mir-15b; mir-16-1; mir-16-2; mir-17; mir-18a; mir-18b; mir-19a; mir-19b-1; mir-19b-2; mir-20a; mir-20b; mir-21; mir-22; mir-23a; mir-23b; mir-23c; mir-24-1; mir-24-2; mir-25; mir-26a-1; mir-26a-2; mir-26b; mir-27a; mir-27b; mir-28; mir-29a; mir-29b-1; mir-29b-2; mir-29c; mir-30a; mir-30b; mir-30c-1; mir-30c-2; mir-30d; mir-30e; mir-31; mir-32; mir-33a; mir-33b; mir-34a; mir-34b; mir-34c; mir-92a-1; mir-92a-2; mir-92b; mir-93; mir-95; mir-96; mir-98; mir-99a mir-99b; mir-100; mir-101-1; mir-101-2; mir-103-1; mir-103-1-as; mir-103-2; mir-103-2-as; mir-105-1; mir-105-2; mir-106a; mir-106b; mir-107; mir-122; mir-124-1; mir-124-2; mir-124-3; mir-125a; mir-125b-1; mir-125b-2; mir-126; mir-127; mir-128-1; mir-128-2; mir-129-1; mir-129-2; mir-130a; mir-130b; mir-132; mir-132; mir-133a-1; mir-133a-2; mir-133b; mir-134; mir-135a-1; mir-135a-2; mir-135b; mir-136 MI101351120; mir-137; mir-138-1; mir-138-2; mir-139; mir-140; mir-141; mir-142; mir-143; mir-144; mir-145; mir-146a; mir-146b; mir-147; mir-147b; mir-148a; mir-148b; mir-149; mir-150; mir-151; mir-152; mir-153-1; mir-153-2; mir-154; mir-155; mir-181a-1; mir-181a-2; mir-181b-1; mir-181b-2; mir-181c; mir-181d; mir-182; mir-183; mir-184; mir-185; mir-186; mir-187; mir-188; mir-190; mir-190b; mir-191; mir-192; mir-193a; mir-193b; mir-194-1; mir-194-2; mir-195; mir-196a-1; mir-196a-2; mir-196b; mir-197; mir-198; mir-199a-1; mir-199a-2; mir-199b; mir-200a; mir-200b; mir-200c; mir-202; mir-203; mir-204; mir-205; mir-206; mir-208a; mir-208b; mir-210; mir-211; mir-212; mir-214; mir-215; mir-216a; mir-216b; mir-217; mir-218-1; mir-218-2; mir-219-1; mir-219-2; mir-221; mir-222; mir-223; mir-224; mir-296; mir-297; mir-298; mir-299; mir-300; mir-301a; mir-301b; mir-302a; mir-302b; mir-302c; mir-302d; mir-302e; mir-302f; mir-320a; mir-320b-1; mir-320b-2; mir-320c-1; mir-320c-2; mir-320d-1; mir-320d-2; mir-320e; mir-323; mir-323b; mir-324; mir-325; mir-326; mir-328; mir-329-1; mir-329-2; mir-330; mir-331; mir-335; mir-337; mir-338; mir-339; mir-340; mir-342; mir-345; mir-346; mir-361; mir-362; mir-363; mir-365-1; mir-365-2; mir-367; mir-369; mir-370; mir-37; mir-372; mir-373; mir-374a; mir-374b; mir-374c; mir-375; mir-376a-1; mir-376a-2; mir-376b; mir-376c; mir-377; mir-378; mir-378b; mir-378c; mir-379; mir-380; mir-381; mir-382; mir-383; mir-384; mir-409; mir-410; mir-411; mir-412; mir-421; mir-422a; mir-423; mir-424; mir-425; mir-429; mir-431; mir-432; mir-433; mir-448; mir-449a; mir-449b; mir-449c; mir-450a-1; mir-450a-2; mir-450b; mir-451; mir-452; mir-454; mir-455; mir-466; mir-483; mir-484; mir-485; mir-486; mir-487a; mir-487b; mir-488; mir-489; mir-490; mir-491; mir-492; mir-493; mir-494; mir-495; mir-496; mir-497; mir-498; mir-499; mir-500a; mir-500b; mir-501; mir-502; mir-503; mir-504; mir-505; mir-506; mir-507; mir-508; mir-509-1; mir-509-2; mir-509-3; mir-510; mir-511-1; mir-511-2; mir-512-1; mir-512-2; mir-513a-1; mir-513a-2; mir-513b; mir-513c; mir-514-1; mir-514-2; mir-514-3; mir-514b; mir-515-1; mir-515-2; mir-516a-1; mir-516a-2; mir-516b-1; mir-516b-2; mir-517a; mir-517b; mir-517c; mir-518a-1; mir-518a-2; mir-518b; mir-518c; mir-518d; mir-518e; mir-518f; mir-519a-1; mir-519a-2; mir-519b; mir-519c; mir-519d; mir-519e; mir-520a; mir-520b; mir-520c; mir-520d; mir-520e; mir-520f; mir-520g; mir-520h; mir-521-1; mir-521-2; mir-522; mir-523; mir-524; mir-525; mir-526a-1; mir-526a-2; mir-526b; mir-527; mir-532; mir-539; mir-541; mir-542; mir-543; mir-544; mir-544b; mir-545; mir-548a-1; mir-548a-2; mir-548a-3; mir-548aa-1; mir-548aa-2; mir-548b; mir-548c; mir-548d-1; mir-548d-2; mir-548e; mir-548f-1; mir-548f-2; mir-548f-3; mir-548f-4; mir-548f-5; mir-548g; mir-548h-1; mir-548h-2; mir-548h-3; mir-548h-4; mir-548i-1; mir-548i-2; mir-548i-3; mir-548i-4; mir-548j; mir-548k; mir-548l; mir-548m; mir-548n; mir-548o; mir-548p; mir-548s; mir-548t; mir-548u; mir-548v; mir-548w; mir-548x; mir-548y; mir-548z; mir-549; mir-550a-1; mir-550a-2; mir-550b-1; mir-550b-2; mir-551a; mir-551b; mir-552; mir-553; mir-554; mir-555; mir-556; mir-557; mir-558; mir-559; mir-561; mir-562; mir-563; mir-564; mir-566; mir-567; mir-568; mir-569; mir-570; mir-571; mir-572; mir-573; mir-574; mir-575; mir-576; mir-577; mir-578; mir-579; mir-580; mir-581; mir-582; mir-583; mir-584; mir-585; mir-586; mir-587; mir-588; mir-589; mir-590; mir-591; mir-592; mir-593; mir-595; mir-596; mir-597; mir-598; mir-599; mir-600; mir-601; mir-602; mir-603; mir-604; mir-605; mir-606; mir-607; mir-608; mir-609; mir-610; mir-611; mir-612; mir-613; mir-614; mir-615; mir-616; mir-617; mir-618; mir-619; mir-620; mir-621; mir-622; mir-623; mir-624; mir-625; mir-626; mir-627; mir-628; mir-629; mir-630; mir-631; mir-632; mir-633; mir-634; mir-635; mir-636; mir-637; mir-638; mir-639; mir-640; mir-641; mir-642a; mir-642b; mir-643; mir-644; mir-645; mir-646; mir-647; mir-648; mir-649; mir-650; mir-651; mir-652; mir-653; mir-654; mir-655; mir-656; mir-657; mir-658; mir-659; mir-660; mir-661; mir-662; mir-663; mir-663b; mir-664; mir-665; mir-668; mir-670; mir-671; mir-675; mir-676; mir-708; mir-711; mir-718; mir-720; mir-744; mir-758; mir-759; mir-760; mir-761; mir-762; mir-764; mir-765; mir-766; mir-767; mir-769; mir-770; mir-802; mir-873; mir-874; mir-875; mir-876; mir-877; mir-885; mir-887; mir-888; mir-889; mir-890; mir-891a; mir-891b; mir-892a; mir-892b; mir-920; mir-921; mir-922; mir-924; mir-933; mir-934; mir-935; mir-936; mir-937; mir-938; mir-939; mir-940; mir-941-1; mir-941-2; mir-941-3; mir-941-4; mir-942; mir-942; mir-943; mir-944; mir-1178; mir-1179; mir-1180; mir-1181; mir-1182; mir-1183; mir-1184-1; mir-1184-2; mir-1184-3; mir-1185-1; mir-1185-2; mir-1193; mir-1197; mir-1200; mir-1202; mir-1203; mir-1204; mir-1205; mir-1206; mir-1207; mir-1208; mir-1224; mir-1225; mir-1226; mir-1227; mir-1228; mir-1229; mir-1231; mir-1233-1; mir-1233-2; mir-1234; mir-1236; mir-1237; mir-1238; mir-1243; mir-1244-1; mir-1244-2; mir-1244-3; mir-1245; mir-1246; mir-1247; mir-1248; mir-1249; mir-1250; mir-1251; mir-1252; mir-1253; mir-1254; mir-1255a; mir-1255b-1; mir-1255b-2; mir-1256; mir-1257; mir-1258; mir-1260; mir-1260b; mir-1261; mir-1262; mir-1263; mir-1264; mir-1265; mir-1266; mir-1267; mir-1268; mir-1269; mir-1270-1; mir-1270-2; mir-1271; mir-1272; mir-1273; mir-1273c; mir-1273d; mir-1273e; mir-1274a; mir-1274b; mir-1275; mir-1276; mir-1277; mir-1278; mir-1279; mir-1280; mir-1281; mir-1282; mir-1283-1; mir-1283-2; mir-1284; mir-1285-1; mir-1285-2; mir-1286; mir-1287; mir-1288; mir-1289-1; mir-1289-2; mir-1290; mir-1291; mir-1292; mir-1293; mir-1294; mir-1295; mir-1296; mir-1297; mir-1298; mir-1299; mir-1301; mir-1302-1; mir-1302-10; mir-1302-11; mir-1302-2; mir-1302-3; mir-1302-4; mir-1302-5; mir-1302-6; mir-1302-7; mir-1302-8; mir-1302-9; mir-1303; mir-1304; mir-1305; mir-1306; mir-1307; mir-1321; mir-1322; mir-1323; mir-1324; mir-1468; mir-1469; mir-1470; mir-1471; mir-1537; mir-1538; mir-1539; mir-1825; mir-1827; mir-1908; mir-1909; mir-1910; mir-1911; mir-1912; mir-1913; mir-1914; mir-1915; mir-1972-1; mir-1972-2; mir-1973; mir-1976; mir-2052; mir-2053; mir-2054; mir-2110; mir-2113; mir-2114; mir-2115; mir-2116; mir-2117; mir-2276; mir-2277; mir-2278; mir-2355; mir-2861; mir-2909; mir-3065; mir-3074; mir-3115; mir-3116-1; mir-3116-2; mir-3117; mir-3118-1; mir-3118-2; mir-3118-3; mir-3118-4; mir-3118-5; mir-3118-6; mir-3119-1; mir-3119-2; mir-3120; mir-3121; mir-3122; mir-3123; mir-3124; mir-3125; mir-3126; mir-3127; mir-3128; mir-3129; mir-3130-1; mir-3130-2; mir-3131; mir-3132; mir-3133; mir-3134; mir-3135; mir-3136; mir-3137; mir-3138; mir-3139; mir-3140; mir-3141; mir-3142; mir-3143; mir-3144; mir-3145; mir-3146; mir-3147; mir-3148; mir-3149; mir-3150; mir-3151; mir-3152; mir-3153; mir-3154; mir-3155; mir-3156-1; mir-3156-2; mir-3156-3; mir-3157; mir-3158-1; mir-3158-2; mir-3159; mir-3160-1; mir-3160-2; mir-3161; mir-3162; mir-3163; mir-3164; mir-3165; mir-3166; mir-3167; mir-3168; mir-3169; mir-3170; mir-3171; mir-3173; mir-3174; mir-3175; mir-3176; mir-3177; mir-3178; mir-3179-1; mir-3179-2; mir-3179-3; mir-3180-1; mir-3180-2; mir-3180-3; mir-3180-4; mir-3180-5; mir-3181; mir-3182; mir-3183; mir-3184; mir-3185; mir-3186; mir-3187; mir-3188; mir-3189; mir-3190; mir-3191; mir-3192; mir-3193; mir-3194; mir-3195; mir-3196; mir-3197; mir-3198; mir-3199-1; mir-3199-2; mir-3200; mir-3201; mir-3202-1; mir-3202-2; mir-3605; mir-3606; mir-3607; mir-3609; mir-3610; mir-3611; mir-3612; mir-3613; mir-3614; mir-3615; mir-3616; mir-3617; mir-3618; mir-3619; mir-3620; mir-3621; mir-3622a; mir-3622b; mir-3646; mir-3647; mir-3648; mir-3649; mir-3650; mir-3651; mir-3652; mir-3653; mir-3654; mir-3655; mir-3656mir-3657; mir-3658; mir-3659; mir-3660; mir-3661; mir-3662; mir-3663; mir-3664; mir-3665; mir-3666; mir-3667; mir-3668; mir-3669; mir-3670; mir-3670; mir-3671; mir-3671; mir-3673; mir-3673; mir-3675; mir-3675; mir-3676; mir-3663; mir-3677; mir-3678; mir-3679; mir-3680; mir-3681; mir-3682; mir-3683; mir-3684; mir-3685; mir-3686; mir-3687; mir-3688; mir-3689a; mir-3689b; mir-3690; mir-3691; mir-3692; mir-3713; mir-3714; mir-3907; mir-3908; mir-3909; mir-3910-1; mir-3910-2; mir-3911; mir-3912; mir-3913-1; mir-3913-2; mir-3914-1; mir-3914-2; mir-3915; mir-3916; mir-3917; mir-3918; mir-3919; mir-3920; mir-3921; mir-3922; mir-3923; mir-3924; mir-3925; mir-3926-1; mir-3926-2; mir-3927; mir-3928; mir-3929; mir-3934; mir-3935; mir-3936; mir-3937; mir-3938; mir-3939; mir-3940; mir-3941; mir-3942; mir-3943; mir-3944; mir-3945; mir-4251; mir-4252; mir-4253; mir-4254; mir-4255; mir-4256; mir-4257; mir-4258; mir-4259; mir-4260; mir-4261; mir-4262; mir-4263; mir-4264; mir-4265; mir-4266; mir-4267; mir-4268; mir-4269; mir-4270; mir-4271; mir-4272; mir-4273; mir-4274; mir-4275; mir-4276; mir-4277; mir-4278; mir-4279; mir-4280; mir-4281; mir-4282; mir-4283-1; mir-4283-2; mir-4284; mir-4285; mir-4286; mir-4287; mir-4288; mir-4289; mir-4290; mir-4291; mir-4292; mir-4293; mir-4294; mir-4295; mir-4296; mir-4297; mir-4298; mir-4299; mir-4300; mir-4301; mir-4302; mir-4303; mir-4304; mir-4305; mir-4306; mir-4307; mir-4308; mir-4309; mir-4310; mir-4311; mir-4312; mir-4313; mir-4314; mir-4315-1; mir-4315-2; mir-4316; mir-4317; mir-4318; mir-4319; mir-4320; mir-4321; mir-4322; mir-4323; mir-4324; mir-4325; mir-4326; mir-4327; mir-4328; mir-4329; mir-4329; 및 mir-4330.
본 발명은 본원에 기술된 세포 집단 또는 구조물로부터 수득가능한 세포-유래되거나 분비되는 miRNA를 내포하는 제제에 관한 것이다. 대안으로, 이들 제제는 본원에서 기술된 miRNA의 서열을 포함하는 핵산 분자를 내포한다. 한 양태에서, 이들 제제는 고유 신장에 재생 효과를 제공하는데 사용될 수 있는 하나 이상의 개별 miRNA를 내포한다. 개별 miRNA의 조합이 이러한 효과를 제공하는데 적합할 수 있다. 예시적 조합은 하기 중 2개 이상을 포함한다: miR-21; miR-23a; miR-30c; miR-1224; miR-23b; miR-92a; miR-100; miR-125b-5p; miR-195; miR-10a-5p; 및 이들의 임의의 조합. 또 다른 예시적 조합은 하기 중 2개 이상을 포함한다: miR-30b-5p, miR-449a, miR-146a, miR-130a, miR-23b, miR-21, miR-124, miR-151 및 이들의 임의의 조합. 한 양태에서, miRNA의 조합은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 개별 miRNA를 포함할 수 있다. 당업자는 다른 miRNA 및 miRNA의 조합이 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 추가의 miRNA의 공급원은 맨체스터 대학의 생명과학부에서 관리하고 유지하는 http://mirbase.org에서의 miRBase를 포함한다.
한 양태에서, 제제는 측분비 인자 및/또는 곁분비 인자, 예를 들면, 알파-1 마이크로글로불린, 베타-2-마이크로글로불린, 칼빈딘, 클러스테린, 연결 조직 성장 인자, 시스타틴-C, 글루타티온-S-전이효소 알파, 신장 손상 분자-1, 호중구성 젤라티나아제-연관된 리포칼린, 오스테오폰틴, 트레포일 인자 3, tam-horsfall 요 당단백질, 금속단백질분해효소 1의 조직-억제제, 혈관 내피 성장 인자, 피브로넥틴, 인터류킨-6, 단핵구 화학주성 단백질-1을 포함하는 분비된 생성물을 내포한다.
일반적으로, 측분비 인자는 이웃 세포의 변화, 즉 측분비 상호작용을 유도하거나 초래하기 위해 짧은 거리에 걸쳐 확산할 수 있는 세포에 의해 합성되는 분자이다. 확산가능한 분자를 측분비 인자라 한다. 일반적으로, 곁분비 인자는 세포 막의 올리고사카라이드, 지질, 또는 단백질 성분을 통해 전송되는 세포내 연락을 조장하고, 그리고 방출 세포 또는 즉시 인접하는 세포에 영향을 줄 수 있는 분자이다. 곁분비 시그널링은 전형적으로, 관련된 두 세포 사이에 물리적 접촉을 수반한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에서 기술되는 바와 같은 하나 이상의 분리된 신장-세포 유래의 분비 소포를 내포하는 제제에 관한 것이다. 당업자는 분비 소포를 내포하는 다양한 유형의 제제가 적합할 것이라는 것을 인지할 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 신장 세포 분비 생성물, 예를 들면, 소포를 내포하는 제제를 제조하는 방법을 제공한다. 한 양상에서, 상기 방법은 하나 이상의 농축 신장 세포 집단의 혼합물을 포함하는 신장 세포 집단을 제공하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 적합한 조건 하에서 세포 집단을 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 조건은 낮은 산소 상태일 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 신장 세포 집단으로부터의 분비 생성물을 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 분비 소포는 세포 집단의 세포 배양 배지로부터 수득될 수 있다. 분비 생성물은 분리된 이후, 본원에서 기술되는 제제의 일부로서 이용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 분비 생성물을 제공하는 신장 세포는 배양 시스템의 산소 분압 감소가 소포 생성 및/또는 분비를 유도하도록 산소 수준에 생체반응성인 소포 생성 및/또는 분비로 특징지어진다. 한 양태에서, 소포 생성 및/또는 분비는 세포 집단이 정상적인 대기 수준 (~21%)의 이용가능한 산소 수준에서 배양된 세포 집단과 비교하여 배양 시스템에서 이용가능한 산소 수준이 감소되는 조건에서 배양되었을 때 유도된다. 한 양태에서, 낮은 산소 조건에서 배양된 세포 집단은 정상 산소 조건에서 배양된 세포 집단에 비해 높은 수준의 소포를 생성 및/또는 분비한다. 일반적으로, 감소된 수준의 이용가능한 산소 (또한 저산소 배양 조건이라고도 함)에서 세포를 배양한다는 것은 감소된 산소 수준이 정상 대기 수준의 이용가능한 산소 (또한 정상 또는 표준산소 배양 조건이라고도 함)에서 세포를 배양하는 것에 비해 감소된다는 것을 의미한다. 한 양태에서, 저산소 세포 배양 조건은 세포를 약 1% 미만의 산소, 약 2% 미만의 산소, 약 3% 미만의 산소, 약 4% 미만의 산소 또는 약 5% 미만의 산소에서 배양하는 것을 포함한다. 또 다른 양태에서, 정상 또는 표준 산소 배양 조건은 세포를 약 10% 산소, 약 12% 산소, 약 13% 산소, 약 14% 산소, 약 15% 산소, 약 16% 산소, 약 17% 산소, 약 18% 산소, 약 19% 산소, 약 20% 산소 또는 약 21% 산소에서 배양하는 것을 포함한다. 바람직한 양태에서, 상기 방법은 신장 세포로부터의 엑소솜 및/또는 미세소포의 분리를 위한 방법을 제공한다.
한 양태에서, 제제는 신장 세포로부터 분비되는 생성물을 내포한다. 상기 생성물은 스캐폴드 상에 있지 않은 신장 세포, 예를 들면, 본원에서 기술되는 바와 같은 구조물의 일부가 아닌 신장 세포로부터 분비될 수 있다.
또 다른 양태에서, 제제는 스캐폴드, 예를 들면, 구조물 상에 파종된 신장 세포에 의해 분비되는 생성물을 내포한다. 상기 구조물은 스캐폴드 상에 또는 스캐폴드 내에 직접적으로 파종된 하나 이상의 농축 신장 세포 집단 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 제제화에 앞서, 하나 이상의 농축 신장 세포 집단 및 이를 포함하는 혼합물 또는 구조물의 생물치료 효과를 스크리닝/최적화/모니터링하는 시험관내 방법을 제공한다. 한 양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 시험군, 시험 혼합물 또는 시험 구조물 ("시험 물품")을 제공하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 본원에서 기술되는 바와 같은 적합한 조건 하에서 시험 물품을 배양하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 배양된 시험 물품으로부터 세포 배양 배지를 수집하는 단계를 포함한다. 이러한 배지를 "조건화 배지 (conditioned medium)"라 할 수 있고, 시험 물품의 신장 세포에 의해 분비된 생성물을 포함할 것으로 예상된다.
다른 양상에서, 상기 조건화 배지는 시험 물품의 생물치료 효과를 시험하기 위해 하나 이상의 시험관내 검정을 수행하는데 사용될 수 있다. 한 양태에서, 상기 조건화 배지에 대해 상피-중간엽 이행 (EMT) 검정이 수행된다. 이 검정은 TGFβ1에 위해 유도되는 EMT을 시험할 수 있다. 실시예 18은 이러한 검정의 예시적 프로토콜을 제공한다.
또 다른 양태에서, 상기 조건화 배지에 대해 예로써, PCR-기반 검정을 통한, RNA를 검출 및/또는 예로써, FACS를 통한 소포 또는 엑소솜 검출이 수행된다. 또 다른 양태에서, 상기 조건화 배지에 대해 시그널링 경로 검정, 예를 들면, 면역 반응 (가령, NFκB), 섬유증 반응 (PAI-1) 및 혈관형성 검정이 수행된다. 실시예 15 내지 17은 이들 검정의 예시적 프로토콜을 제공한다.
6. 이용 방법
또 다른 양상에서, 본 발명의 제제는 질환의 치료를 위해 투여될 수 있다. 가령, 생체활성 세포는 본원에서 기술되는 제제의 일부로서 고유 장기에 투여될 수 있다. 한 양태에서, 생체활성 세포는 투여의 대상인 고유 장기로부터, 또는 표적 고유 장기가 아닌 공급원으로부터 기원될 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 본원에서 기술되는 신장 세포 집단 및 신장 세포의 혼합물을 내포하는 제제로 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO 결핍의 치료를 요하는 피험자를 치료하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 상기 방법은 EPO-생성 세포가 농축된 제1 신장 세포 집단을 포함하는 조성물을 내포하는 제제를 피험자에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 양태에서, 제1 세포 집단은 EPO-생성 세포, 사구체 세포 및 혈관 세포가 농축된다. 한 양태에서, 제1 신장 세포 집단은 B4' 세포 집단이다. 또 다른 양태에서, 상기 조성물은 하나 이상의 추가의 신장 세포 집단을 추가로 포함한다. 한 양태에서, 추가 세포 집단은 EPO-생성 세포가 비농축된 제2 세포 집단이다. 또 다른 양태에서, 추가 세포 집단은 EPO-생성 세포, 사구체 세포 또는 혈관 세포가 비농축된 제2 세포 집단이다. 또 다른 양태에서, 상기 조성물은 또한 본원에서 기술되는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 본원에서 기술되는 바와 같은 이식가능한 구조물을 형성하기 위하여 생체물질 내에 침착되거나, 생체물질 상에 침착되거나, 생체물질 내에 포매되거나, 생체물질로 코팅되거나, 생체물질 내에 현탁되거나, 또는 생체물질 내에 포착된 신장 세포 집단 또는 신장 세포의 혼합물을 포함한다. 한 양태에서, 상기 세포 집단은 단독으로 사용되거나, 또는 급성 또는 만성 질환 상태에서 재생을 자극하기 위한 다른 세포 또는 생체물질, 예를 들면, 하이드로겔, 다공성 스캐폴드, 또는 천연 또는 합성 펩타이드 또는 단백질과 병용하여 사용될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 방법에 의한 피험자에서의 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO 결핍의 효과적인 치료는 적혈구생성 및/또는 신장 기능의 다양한 지표들을 통하여 관찰될 수 있다. 한 양태에서, 적혈구 항상성의 지표는 헤마토크릿 (HCT), 헤모글로빈 (HB), 평균 소체 (corpuscular) 헤모글로빈 (MCH), 적혈구 카운트 (RBC), 망상적혈구 수, 망상적혈구 %, 평균 소체 용적 (MCV) 및 적혈구 분포 폭 (RDW)을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 다른 양태에서, 신장 기능의 지표는 혈청 알부민, 알부민/글로불린 비율 (A/G 비율), 혈청 인, 혈청 나트륨, 신장 크기 (초음파에 의해 측정가능), 혈청 칼슘, 인:칼슘 비율, 혈청 칼륨, 단백뇨, 소변 크레아티닌, 혈청 크레아티닌, 혈액 질소 우레아 (BUN), 콜레스테롤 수준, 트리글리세라이드 수준 및 사구체 여과율 (GFR)을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 또한, 전반적인 건강 및 웰빙에 대한 몇 가지 지표는 체중 증감, 생존, 혈압 (평균 전신 혈압, 확장기 혈압 또는 수축기 혈압) 및 신체 지구 능력을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
또 다른 양태에서, 생체활성 신장 세포 제제로 효율적인 치료는 하나 이상의 신장 기능 지표의 안정화에 의해 증명된다. 신장 기능의 안정화는 본 발명의 방법으로 치료를 받지 않은 피험자에서의 동일한 지표와 비교하여 본 발명의 방법에 의해 치료를 받은 피험자의 지표 변화의 관찰로 입증된다. 대안으로, 신장 기능의 안정화는 치료를 받기 전 피험자에서 동일한 지표와 비교하여 본 발명의 방법에 의해 치료를 받은 동일 피험자의 동일 지표의 변화의 관찰로 입증될 수 있다. 제1 지표의 변화는 값의 증가 또는 감소일 수 있다. 한 양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 치료는 피험자에서 혈액 우레아 질소 (BUN) 수준의 안정화를 포함할 수 있으며, 여기서 피험자에서 관찰된 BUN 수준은 본 발명에 의한 방법으로 치료를 받지 않은 유사한 질환 상태를 가진 피험자에 비해 낮다. 다른 양태에서, 치료는 피험자에서 혈청 크레아티닌 수준의 안정화를 포함할 수 있으며, 여기서 피험자에서 관찰된 혈청 크레아티닌 수준은 본 발명에 의한 방법으로 치료를 받지 않은 유사한 질환 상태를 가진 피험자에 비해 낮다. 또 다른 양태에서, 치료는 피험자에서 헤마토크릿 (HCT) 수준의 안정화를 포함할 수 있으며, 여기서 피험자에서 관찰된 헤마토크릿 (HCT) 수준은 본 발명에 의한 방법으로 치료를 받지 않은 유사한 질환 상태를 가진 피험자에 비해 높다. 또 다른 양태에서, 치료는 피험자에서 적혈구 (RBC) 수준의 안정화를 포함할 수 있으며, 여기서 피험자에서 관찰된 RBC 수준은 본 발명에 의한 방법으로 치료를 받지 않은 유사한 질환 상태를 가진 피험자에 비해 높다. 당업자는 피험자에서 신장 질환의 효과적인 치료를 결정하기 위하여 본원에서 기술되거나 당업계에 공지된 하나 이상의 추가 지표들을 측정할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 적혈구 항상성을 요하는 피험자에게 적혈구 항상성을 제공하는 방법에서 이용을 위한 제제에 관한 것이다. 한 양태에서, 상기 방법은 (a) 신장 세포 집단, 예를 들면, 본원에서 기술되는, B2 또는 B4', 또는 신장 세포의 혼합물, 예를 들면, B2/B4' 및/또는 B2/B3, 또는 농축 신장 세포 집단을 내포하는 제제를 피험자에게 투여하는 단계; 및 (b) 피험자로부터의 생물학적 시료에서, 적혈구생성 지표의 수준이 대조군의 지표 수준과 비교하여 상이한 지를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 지표 수준의 차이는 (i) 피험자가 투여 단계 (a)에 반응성이거나, 또는 (ii) 피험자에서 적혈구 항상성을 나타낸다는 것을 지시한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 (a) 본원에서 기술되는 신장 세포 집단 또는 신장 세포의 혼합물을 포함하는 제제를 피험자에게 투여하는 단계; 및 (b) 피험자로부터의 생물학적 시료에서, 적혈구생성 지표의 수준이 대조군의 지표 수준과 비교하여 상이한 지를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 지표 수준의 차이는 (i) 피험자가 투여 단계 (s)에 반응성이거나, 또는 (ii) 피험자에서 적혈구 항상성을 나타낸다는 것을 지시한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 (a) 생체물질 또는 생체적합성 폴리머 스캐폴드를 제공하는 단계; (b) 본 발명의 신장 세포 집단 또는 신장 세포 혼합물을 본원에서 기술되는 방법으로 생체물질 또는 스캐폴드 위에 또는 안에 침착시켜 이식가능한 구조물을 형성하는 단계; (c) 구조물을 내포하는 제제를 제조하는 단계; (d) 피험자에게 구조물을 이식하는 단계; 및 (e) 피험자로부터의 생물학적 시료에서, 적혈구생성 지표의 수준이 대조군의 지표 수준과 비교하여 상이한 지를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 지표 수준의 차이는 (i) 피험자가 투여 단계 (a)에 반응성이거나, 또는 (ii) 피험자에서 적혈구 항상성을 나타낸다는 것을 지시한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 신장 기능의 안정화 및 적혈구 항상성의 회복을 요하는 피험자에게 이를 제공하는 방법에서 이용을 위한 제제에 관한 것으로, 여기서 피험자는 신장 기능의 결핍 및 빈혈증 및/또는 EPO-결핍을 모두 가지고 있다. 한 양태에서, 상기 방법은 세뇨관-유래 세포, 사구체-유래 세포, 간질-유래 세포, 집합관-유래 세포, 간질 조직-유래 세포 또는 혈관구조로부터 유래된 세포 중 최소한 하나를 포함하는 본원에서 기술되는 신장 세포 집단 또는 신장 세포의 혼합물을 내포하는 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 세포 집단 또는 혼합물은 EPO-생성 세포 및 세뇨관 상피 세포를 모두 포함하며, 여기서 세뇨관 세포는 다음 중 최소한 하나의 마커에 의해 확인된다: 메갈린, 쿠빌린, 히알루론산 신타제 2 (HAS2), 비타민 D3 25-하이드록실라제 (CYP2D25), N-카드헤린 (Ncad), E-카드헤린 (Ecad), 아쿠아포린-1 (Aqp1), 아쿠아포린-2 (Aqp2), RAB17, 멤버 RAS 종양유전자 패밀리 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인을 포함하는 이온 수송 조절자 4 (Fxyd4), 용질 캐리어 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 멤버 4 (Slc9a4), 알데하이드 디하이드로게나제 3 패밀리, 멤버 B1 (Aldh3b1), 알데하이드 디하이드로게나제 1 패밀리, 멤버 A3 (Aldh1a3) 및 칼파인-8 (Capn8). 이러한 양태에서, 피험자의 치료는 치료를 받지 않은 피험자의 지표 또는 피험자의 치료전 지표들과 비교하여 적혈구생성에 대한 최소한 하나의 지표의 개선과 함께 신장 기능에 대한 최소한 하나의 지표 개선으로 증명될 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 본원에서 기술되는 바와 같은 EPO-생성 세포가 농축된 신장 세포 집단 또는 EPO-생성 세포가 농축된 세포 집단을 포함하는 신장 세포 혼합물을 투여함으로써, (i) 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO-결핍의 치료; (ii) 신장 기능의 안정화, (iii) 적혈구 항상성의 회복 또는 (iv) 이들의 임의의 조합을 위한 방법에서 이용되는 제제를 제공하며, 투여의 유익한 효과는 EPO-생성 세포가 비농축된 세포 집단을 투여할 때의 효과보다 크다. 또 다른 양태에서, 농축 세포 집단은 개선된 수준의 혈청 혈액 우레아 질소 (BUN)를 제공한다. 또 다른 양태에서, 농축 세포 집단은 혈청에서 개선된 단백질 정체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 농축 세포 집단은 개선된 수준의 혈청 콜레스테롤 및/또는 트리글리세라이드를 제공한다. 또 다른 양태에서, 농축 세포 집단은 개선된 수준의 비타민 D를 제공한다. 한 양태에서, 농축 세포 집단은 비-농축 세포 집단과 비교하여 개선된 인:칼슘 비율을 제공한다. 또 다른 양태에서, 농축 세포 집단은 비-농축 세포 집단과 비교하여 개선된 수준의 헤모글로빈을 제공한다. 추가 양태에서, 농축 세포 집단은 비-농축 세포 집단과 비교하여 개선된 수준의 혈청 크레아티닌을 제공한다. 추가의 또 다른 양태에서, 농축 세포 집단은 비-농축 세포 집단과 비교하여 개선된 수준의 헤마토크릿을 제공한다. 추가 양태에서, 농축 세포 집단은 비-농축 세포 집단과 비교하여 개선된 수준의 적혈구 수 (RBC#)를 제공한다. 한 양태에서, 헤마토크릿의 개선된 수준은 정상적인 건강한 수준의 95%로 회복하는 것이다. 추가 양태에서, 농축 세포 집단은 비-농축 세포 집단과 비교하여 개선된 망상적혈구 수를 제공한다. 다른 양태에서, 농축 세포 집단은 비-농축 세포 집단과 비교하여 개선된 망상적혈구 비율 (%)을 제공한다. 추가의 다른 양태에서, 농축 세포 집단은 비-농축 세포 집단과 비교하여 개선된 수준의 적혈구 용적 분포 폭 (RDW)을 제공한다. 추가의 또 다른 양태에서, 농축 세포 집단은 비-농축 세포 집단과 비교하여 개선된 수준의 헤모글로빈을 제공한다. 추가의 또 다른 양태에서, 농축 세포 집단은 골수에서 조혈 반응을 제공하며, 골수 세포질은 거의-정상이며, 골수:적혈구 비율도 거의 정상적이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 농축 세포 집단을 투여함으로써 (i) 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO-결핍의 치료; (ii) 신장 기능의 안정화, (iii) 적혈구 항상성의 회복 또는 (iv) 이들의 임의의 조합을 위한 방법에서 이용되는 제제를 제공하며, 여기서, 본원에서 기술되는 신장 세포 집단 또는 신장 세포 집단 혼합물의 투여의 유익한 효과는 재조합 EPO (rEPO)를 투여하여 제공되는 유익한 효과들과 비교하여 개선된 적혈구 항상성을 특징으로 한다. 한 양태에서, 상기 세포 집단 또는 혼합물을 필요한 피험자로 투여하였을 때 재조합 EPO 단백질을 투여하였을 때와 비교하여, 개선된 적혈구 항상성 (헤마토크릿, 헤모글로빈 또는 RBC#으로 측정)을 제공한다. 한 양태에서, 상기 세포 집단 또는 혼합물은 투여시, 재조합 EPO와 비교하였을 때 개선된 수준의 헤마토크릿, RBC 또는 헤모글로빈을 제공하며, 대조군에서의 헤마토크릿보다 약 10% 이하로 낮거나 높다. 추가 양태에서, 상기 세포 집단 또는 혼합물의 단일 용량 또는 전달은 투여시, 재조합 EPO 단백질의 단일 용량 또는 전달이 적혈구 항상성의 개선을 제공하는 기간을 상당히 초과한 기간 동안 치료된 피험자에서 적혈구 항상성 (헤마토크릿, 헤모글로빈 또는 RBC#의 증가로 측정)의 개선을 제공한다. 또 다른 양태에서, 상기 세포 집단 또는 혼합물은 본원에서 기술되는 용량으로 투여시 헤마토크릿, 헤모글로빈 또는 RBC#이 필적하는 건강한 대조군에서의 정상 수준의 약 110%를 초과하지 않는다. 추가 양태에서, 세포 집단 또는 혼합물은 본원에서 기술되는 용량으로 투여되었을 때, 본원에서 기술되는 용량으로 전달된 재조합 EPO 단백질과 비교하여 더 우수한 적혈구 항상성 (헤마토크릿, 헤모글로빈 또는 RBC#에 의해 결정됨)을 제공한다. 또 다른 양태에서, 재조합 EPO는 약 100 IU/kg, 약 200 IU/kg, 약 300 IU/kg, 약 400 IU/kg 또는 약 500 IU/kg의 용량으로 전달된다. 당업자는 당업계에서 공지된 재조합 EPO의 다른 용량이 적합할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본원에서 기술되는 농축 세포 집단 및 이들의 혼합물을 비롯한 하나 이상의 세포 집단, 또는 본원에서 기술되는 이식가능한 구조물, 또는 본원에서 기술되는 바와 같은 분비 생성물을 내포하는 제제의 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO 결핍의 치료가 필요한 환자에서 이를 치료하기 위한 약물의 제조를 위한, 적혈구 항상성이 필요한 피험자에서 이를 제공하기 위한, 신장 기능의 개선이 필요한 피험자에서 이의 개선을 위한, 또는 고유 신장에 재생 효과를 제공하기 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 특정한 입증된 치료적 특성에 기초한 특정 세포 아집단(들)의 선별에 기초하여 특정 병인의 신장 질환을 치료하기 위한 특정 농축 세포 집단(들) (본원에서 기술되는)을 내포하는 제제에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 밀도가 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL인 분리된 농축 세뇨관 세포 집단을 포함하는 제1 세포 집단인 B2 및 밀도가 약 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL인 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포 및 혈관 세포는 포함하나 사구체 세포는 고갈된 제2 세포 집단인 B4'를 포함하는 포유동물 신장 세포의 혼합물을 포함하는 제제를 피험자에게 투여함을 포함하여, 신장 질환의 치료가 필요한 피험자에서 이를 치료하는 방법에서 이용을 위한 제제를 제공하고, 여기서 상기 혼합물은 밀도가 1.045 g/ml 미만인 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함하는 B1 세포 집단 또는 밀도가 1.091 g/ml 초과인 낮은 입도 및 생존능을 갖는 파편 및 소세포를 포함하는 B5 세포 집단을 포함하지 않는다. 특정 양태에서, 상기 방법은 피험자로부터의 시험 시료에서 신장 기능 지표의 수준이 대조군에서의 지표 수준과 비교하여 상이한가를 측정하는 것을 포함하며, 이때 지표 수준의 차이는 피험자에서 하나 이상의 신장 기능의 감퇴 감소, 안정화 또는 개선을 나타낸다. 한 양태에서, 상기 방법에 사용되는 B4' 세포 집단은 혈관 마커의 발현으로 특징지어진다. 특정 양태에서, 상기 방법에 사용되는 B4' 세포 집단은 사구체 마커의 발현으로 특징지어지지 않는다. 한 양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포의 혼합물은 산소-조정가능한 에리트로포이에틴 (EPO) 발현을 할 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 치료될 신장 질환은 에리트로포이에틴 (EPO) 결핍을 수반한다. 특정 양태에서, EPO 결핍은 빈혈증이다. 일부 양태에서, EPO 결핍 또는 빈혈증은 피험자의 신부전에 대해 부차적으로 발생한다. 일부 다른 양태에서, EPO 결핍 또는 빈혈증은 만성 신부전, 원발성 EPO 결핍, 화학요법 또는 항-바이러스 요법, 비-골수성 암, HIV 감염, 간질환, 심부전, 류마티스 관절염 또는 다발성 기관계부전으로 구성된 군에서 선택되는 질환에 대해 부차적으로 발생한다. 특정 양태에서, 상기 방법에 사용되는 조성물은 하나 이상의 생체적합 합성 폴리머 및/또는 천연-발생 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 생체물질을 추가로 포함하며, 이때 혼합물은 생체물질로 코팅, 생체물질 상에 침착, 생체물질 내에 침착, 생체물질 내에 포착, 생체물질 내에 현탁, 생체물질 내에 포매 및/또는 생체물질과 조합된다. 특정 양태에서, 본 발명의 제제에 사용되는 혼합물은 포유동물 신장 조직 또는 배양된 포유동물 신장 세포로부터 유래된다. 다른 양태에서, 상기 혼합물은 치료가 필요한 피험자에 대해 자가인 신장 시료로부터 유래된다. 한 양태에서, 상기 시료는 신장 생검이다. 다른 양태에서, 제제는 비-자가 신장 시료로부터 유래되는 혼합물을 내포한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO 결핍의 치료가 필요한 피험자에서 이를 치료하는데 유용한 약물을 제조하기 위한 본원에서 기술되는 세포 제조물과 혼합물 또는 본 발명의 이식가능한 구조물을 내포하는 제제의 용도를 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 고유 신장의 재생이 필요한 피험자에서 이를 위한 방법에서 이용을 위한 제제를 제공한다. 한 양태에서, 상기 방법은 피험자에게 본원에서 기술되는 세포 집단, 혼합물 또는 구조물을 투여 또는 이식하는 단계를 포함한다. 재생된 고유 신장은 고유 신장의 기능 또는 수용력의 발달, 고유 신장의 기능 또는 수용력의 개선 및 고유 신장의 특정 마커의 발현을 포함하고 이로 제한되지 않는 다수의 지표로 특징지어질 수 있다. 한 양태에서, 발달되거나 개선된 기능 또는 수용력은 상술된 적혈구 항상성 및 신장 기능의 다양한 지표에 기초하여 관찰될 수 있다. 또 다른 양태에서, 재생 신장은 하나 이상의 줄기 세포 마커의 차등 발현으로 특징지어진다. 줄기 세포 마커는 하기 중 하나 이상일 수 있다. SRY (성 결정 영역 Y)-박스 2 (Sox2); 미분화된 배아 세포 전사 인자 (UTF1); 마우스로부터의 결절 동족체 (NODAL); 프로미닌 1 (PROM1) 또는 CD133 (CD133); CD24; 및 이들의 임의의 조합. [참조: Dagan et al. PCT/US2011/036347, 이의 전체 내용이 본원에 참고문헌으로 편입됨]. 또 다른 양태에서, 줄기 세포 마커(들)의 발현은 대조군에 비해 상향조절된다.
농축 세포 집단 및 이들의 혼합물을 비롯한 본원에서 기술되는 세포 집단 및 이를 포함하는 구조물을 사용하여 고유 신장에 대한 재생 효과를 제공할 수 있다. 재생 효과는 세포 자체에 의해 및/또는 세포에 의해 분비되는 생성물에 의해 제공될 수 있다. 재생 효과는 하기 중 하나 이상으로 특징지어진다: (TGF-β 시그널링의 약화를 통해 이루어질 수 있는) 상피-중간엽 이행의 감소; 신장 섬유증의 감소; 신장 염증의 감소; 고유 신장에서 줄기 세포 마커의 차등 발현; 신장 손상, 예를 들면, 세뇨관 손상 부위로 이식 세포 및/또는 고유 세포의 이동; 신장 손상, 예를 들면, 세뇨관 손상 부위에 이식 세포의 접목; (본원에서 기술되는 바와 같은) 신장 기능에 대한 하나 이상의 지표의 안정화; (본원에서 기술되는 바와 같은) 적혈구 항상성의 회복; 및 이들의 임의의 조합.
7. 재생 모니터링 방법
또 다른 양상에서, 본 발명은 피험자에게 본원에서 기술되는 세포 집단, 혼합물 또는 구조물을 내포하는 제제를 투여 또는 이식한 이후, 고유 신장의 재생을 모니터링하는 예후 방법을 제공한다. 한 양태에서, 상기 방법은 피험자 및 대조군 시료로부터 수득된 시험 시료에서 마커 발현 수준을 검출하는 단계를 포함하며, 이때 시험 시료에서 대조군 시료와 비교하여 높은 수준의 마커 발현은 피험자의 고유 신장의 재생을 예후한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 시료 중 하나 이상의 줄기 세포 마커의 발현을 검출하는 것을 포함한다. 상기 줄기 세포 마커는 Sox2; UTF1; NODAL; CD133; CD24; 및 이들의 임의의 조합 중에서 선택될 수 있다 [참조: Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 실시예 11]. 상기 검출 단계는 줄기 세포 마커(들)의 발현이 시험 시료에서 대조군 시료에 비해 상향조절되거나 높은지를 측정하는 것을 포함할 수 있으며, 이때 높은 수준의 발현은 피험자의 고유 신장의 재생을 예후한다. 또 다른 양태에서, 줄기 세포 마커(들)의 mRNA 발현이 검출된다. 다른 양태에서, mRNA 발현의 검출은 PCR-기반 방법, 예를 들면, qRT-PCR을 통할 수 있다. 또한, 제자리 (In situ) 혼성화도 mRNA 발현의 검출에 이용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 줄기 세포 마커의 폴리펩타이드 발현 역시 항-줄기 세포 마커 제제를 사용하여 검출될 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 제제는 마커에 대한 항체이다. 또 다른 양태에서, 줄기 세포 마커 폴리펩타이드 발현은 면역조직화학 또는 웨스턴 블롯을 이용하여 검출된다. 당업자는 마커의 mRNA 및/또는 폴리펩타이드를 검출하기 위한 다른 방법을 알 수 있을 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에서 기술되는 세포 집단, 혼합물 또는 구조물을 내포하는 제제의 이식 또는 투여 후 환자의 예후를 평가하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 상기 방법은 피험자로부터 수득되는 시험 시료에서 마커 발현 수준을 검출하는 단계; (b) 대조군 시료의 마커 발현 수준 (또는 대조군 참조 값)과 비교하여 시험 시료에서 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 마커 발현 수준 측정에 기초하여 환자의 재생 예후를 예측하는 단계를 포함하며, 이때 시험 시료에서 대조군 시료 (또는 대조군 참조 값)와 비교하여 높은 수준의 마커 발현은 피험자에서 재생을 예후한다.
다른 양상에서, 본 발명은 피험자에게 본원에서 기술되는 세포 집단, 혼합물 또는 구조물을 내포하는 제제의 투여 또는 이식 후 고유 신장의 재생을 모니터링하는 예후적 방법을 제공하며, 이때 비-침습적 방법이 이용된다. 조직 생검에 대한 대안으로서, 치료를 받는 피험자의 재생 결과는 체액, 예를 들면, 소변 검사로 평가될 수 있다. 피험자-유래 소변으로부터 수득되는 미세소포가 궁극적으로는 본 발명의 세포 집단으로의 처리에 의해 영향을 받은 신장 세포 집단으로부터 유래되는 특정 단백질 및 miRNA를 포함하나 이로 제한되지 않는 특정 성분을 포함한다는 것이 밝혀졌다. 이들 성분은 줄기 세포 복제 및 분화, 아폽토시스 및 염증 및 면역-조절에 수반되는 인자들을 포함할 수 있다. 미세소포-관련 miRNA/단백질 발현 패턴의 시간적 (temporal) 분석은 본 발명의 세포 집단, 혼합물 또는 구조물을 수령하는 피험자의 신장에서의 재생 결과를 연속적으로 모니터링하는 것을 가능하게 한다. 실시예 19는 피험자의 소변 분석을 위한 예시적인 프로토콜을 기술한다.
이들 신장-유래된 소포 및/또는 피험자의 소변으로 나오는 신장 유래된 소포의 내강 내용물을 재생 결과를 나타내는 바이오마커에 대해 분석할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 신장 질환 (KD) 환자가 치료 제제로 처리에 반응하는지의 여부를 평가하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료제로 처리된 KD 환자로부터 수득되는 시험 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 양을 대조군 시료 중의 소포 양과 비교하여 또는 상대적으로 측정하는 단계를 포함할 수 있으며, 이때 대조군 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 양과 비교하여 시험 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 많거나 적은 양은 치료제로의 처리에 대한 처리된 환자 반응성을 나타내는 것이다.
또한, 본 발명은 KD 환자에서 치료제로의 처리 효능을 모니터링하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 상기 방법은 치료제로 처리된 KD 환자로부터 수득된 시험 시료 중의 소포의 양을 대조군 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 양과 비교하여 또는 상대적으로 측정 또는 검출하는 단계를 포함하며, 이때 대조군 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 양과 비교하여 시험 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 많거나 적은 양은 KD 환자에서 치료제로의 처리 효능을 나타내는 것이다.
본 발명은 제제가 신장 질환 (KD)를 치료하기에 효과적인 환자 아집단을 동정하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 상기 방법은 제제의 효능과, 대조군 시료로부터 수득되는 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 양과 비교하여 환자 아집단으로부터의 시료 중 소포 또는 이의 내강 내용물의 양의 존재 간의 상관관계를 측정하는 단계를 포함하며, 이때 대조군 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 양과 비교하여 환자 아집단으로부터의 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 많거나 적은 양은 제제가 환자 아집단에서 KD를 치료하는데 효과적이라는 것을 나타내는 것이다.
측정 또는 검출 단계는 시험 시료에 존재할 수 있는 miRNA 또는 다른 분비 생성물의 양을 분석하는 것을 포함할 수 있다 (실시예 19 참조).
비-침습적 예후적 방법은 본원에서 기술되는 세포 집단, 혼합물 또는 구조물의 투여 또는 이식 전 및/또는 후 피험자로부터 소변 시료를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 소포 및 다른 분비 생성물은 원치않는 파편을 제거하기 위한 원심분리를 포함하나 이로 제한되지 않는 표준 기술을 이용하여 소변 시료로부터 분리될 수 있다 [참조: Zhou et al., 2008. Kidney Int. 74(5):613-621; Skog et al., 미국 공개 특허 출원 번호 20110053157, 각각 전체가 참고문헌으로 본원에 편입됨].
본 발명은 치료 후 피험자에서 재생 결과를 검정하는 비-침습적 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 치료된 피험자로부터의 소변에서 소포 또는 이의 내강 내용물을 검정하는 것을 포함한다. 상기 내강 내용물은 하나 이상의 miRNA일 수 있다. 개별 miRNA의 조합 또는 패널의 검출이 이러한 예후적 방법에 적합할 수 있다. 예시적 조합은 하기 중 2개 이상을 포함한다: miR-24; miR-195; miR-871; miR-30b-5p; miR-19b; miR-99a; miR-429; let-7f; miR-200a; miR-324-5p; miR-10a-5p; 및 이들의 임의의 조합. 한 양태에서, miRNA의 조합은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 이상의 개별 miRNA를 포함할 수 있다. 당업자는 다른 miRNA 및 miRNA의 조합이 이러한 예후적 방법에 사용하기에 적합할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 추가의 miRNA의 공급원은 맨체스터 대학의 생명과학부에서 관리하고 유지하는 http://mirbase.org에서의 miRBase를 포함한다.
당업자는 재생을 검정하는 예후적 방법이 본원에서 기술되는 세포 집단 및 구조물과는 별개로 당해 기술 분야에 공지된 다른 치료제로 치료되는 피험자에게 적합할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
일부 양태에서, 상기 측정 단계는 (i) 시험 시료 및 대조군에서 마커 (또는 소포/소포 내용물)의 차등 발현 수준을 측정하고/하거나; (ii) 시험 시료 및 대조군에서 마커의 차등 발현 수준 측정으로부터 수득된 자료를 분석하기 위해 적합한 프로세서에 의해 실행되는 소프트웨어 프로그램의 이용을 포함한다. 적합한 소프트웨어 및 프로세서는 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있고 시판되고 있다. 상기 프로그램은 CD-ROM, 플로피 디스크, 하드 디스크, DVD 또는 프로세서와 연관된 메모리와 같은 실재하는 매질에 저장되는 소프트웨어에 수록될 수 있으나, 당업자는 전체 프로그램 또는 이의 일부가 대안적으로 프로세서 이외의 장치에 의해 실행되고/되거나 널리 알려진 방식으로 펌웨어 및/또는 전용 하드웨어에 수록될 수 있다는 것을 쉽게 알 수 있을 것이다.
측정 단계 이후, 측정 결과, 발견, 진단, 예측 및/또는 치료 권장사항이 통상적으로 기록되며, 예로써 기술자, 의사 및/또는 환자에게 전해진다. 특정 양태에서, 컴퓨터를 이용하여 이러한 정보를 관심자, 예를 들면, 환자 및/또는 담당 의사에게 전달할 수 있다. 일부 양태에서, 검정은 결과 또는 진단이 전달되는 나라 또는 관할구와는 다른 나라 또는 관할구에서 수행되거나 검정 결과가 분석될 것이다.
바람직한 양태에서, 차등 마커 발현 수준을 갖는 시험 피험자에서 측정된 마커 발현 수준에 기초하는 예후, 예측 및/또는 치료 권장사항은 검정이 완결되고 예후 및/또는 예측이 나온 직후에 피험자에게 전달된다. 결과 및/또는 관련 정보는 피험자의 주치의에 의해 피험자에게 전달될 수 있다. 달리, 결과는 편지, 전자 형태의 교류, 예를 들면, 이메일 또는 전화를 포함하는 임의의 통신 수단을 통해 시험 피험자에게 직접적으로 전달될 수 있다. 가령, 이메일 전달의 경우, 컴퓨터의 사용으로 전달이 수월해질 수 있다. 특정 양태에서, 예후적 시험 결과 및/또는 이로부터의 결론 및/또는 시험에 기초한 치료 권장 사항을 포함하는 정보는 원격통신 기술자에게 익숙할 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어의 조합을 이용하여 만들어지고 피험자에게 자동적으로 전달될 수 있다. 건강관리-지향 통신 시스템에 대한 하나의 예가 문헌 [참조: 미국 특허 번호 6,283,761]에 기재되어 있으나, 본 발명은 이러한 특정 통신 시스템을 이용하는 방법에 제한되지 않는다. 본 발명의 방법의 특정 양태에서, 시료 검정, 재생 예후 및/또는 예측 및 검정 결과 또는 예후의 전달을 포함하는 상기 방법의 단계 모두 또는 일부는 다양한 (가령, 해외) 관할권에서 수행될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본원에서 기술되는 예후적 방법은 이식 또는 투여의 재생 성공에 대해 관심이 있는 자에게 정보를 제공한다.
모든 양태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 치료가 필요한 피험자에게 재생 신장을 제공하는 방법은 상술되는 바와 같이 재생의 예후적 평가에 대한 이식 후 단계를 포함할 수 있다.
8. 생체활성 세포 제제
본원에서 기술되는 제제는 피험자에 투여되는 활성 작용제, 예를 들면, 생체활성 신장 세포에 대한 긍정적인 환경을 발생시키는 성질을 갖는 생체물질을 통합한다. 한 양태에서, 제제는 활성 작용제가 생체물질로 제제화되는 시점에서부터 피험자에 투여 시점까지 긍정적인 환경을 제공하는 일차 생체물질을 내포한다. 다른 양태에서, 긍정적인 환경은 피험자에 투여에 앞서, 유체에서 세포와 대비하여 생체활성 세포를 실질적으로 고형 상태에서 현탁시키는 이점에 관계한다 (본원에서 기술되는 바와 같이). 또 다른 양태에서, 일차 생체물질은 온도-민감성 생체물질이다. 온도-민감성 생체물질은 (i) 약 8℃ 또는 그 이하에서 실질적으로 고형 상태, 그리고 (ii) 주위 온도 또는 그 이상에서 실질적으로 액상 상태를 가질 수 있다. 한 양태에서, 주위 온도는 약 실온이다.
다른 양상에서, 제제는 제제화의 시점에서부터 피험자에 투여 후 시점까지 조합된 세포에 대한 긍정적인 환경을 제공하는 이차 생체물질과 조합된 생체활성 세포를 내포한다. 한 양태에서, 이차 생체물질에 의해 제공되는 긍정적인 환경은 피험자에 투여의 시점까지, 그리고 투여 후 기간 동안 구조적 완전성을 유지하는 생체물질에 담아 세포를 투여하는 이점에 관계한다. 한 양태에서, 이식 후 이차 생체물질의 구조적 완전성은 수분, 수시간, 수일, 또는 수주이다. 한 양태에서, 구조적 완전성은 1개월 미만, 1주 미만, 1일 미만, 또는 1시간 미만이다. 상대적으로 단기 구조적 완전성은 통합된 요소 및 이것이 배치되는 조직 또는 장기의 상호작용에 방해 또는 장애물이 되지 않으면서 제어된 취급, 배치 또는 분산으로 조직 또는 장기 내에 표적 장소에 활성 작용제와 생체물질을 전달할 수 있는 제제를 제공한다.
또 다른 양태에서, 이차 생체물질은 일차 생체물질과 상이한 민감성을 갖는 온도-민감성 생체물질이다. 이차 생체물질은 (i) 약 주위 온도 또는 그 이하에서 실질적으로 고형 상태, 그리고 (ii) 약 37℃ 또는 그 이상에서 실질적으로 액상 상태를 가질 수 있다. 한 양태에서, 주위 온도는 약 실온이다.
한 양태에서, 이차 생체물질은 가교된 비드이다. 가교된 비드는 본원에서 기술되는 바와 같이, 가교의 정도에 따라 정교하게 조정가능한 생체내 체류 시간을 가질 수 있다. 또 다른 양태에서, 가교된 비드는 생체활성 세포를 포함하고 본원에서 기술되는 바와 같이 효소 분해에 내성이다.
본 발명의 제제는 활성 작용제, 예를 들면, 생체활성 세포와 조합된 이차 생체물질과 함께 또는 이러한 생체물질 없이, 활성 작용제, 예를 들면, 생체활성 세포와 조합된 일차 생체물질을 포함할 수 있다. 제제가 이차 생체물질을 포함하는 경우에, 이것은 온도 민감성 비드 및/또는 가교된 비드일 수 있다. 다양한 대표적인 제제는 하기 실시예에서 제공된다 (또한 도 3-7을 참조한다).
본원에서 기술되는 생체활성 세포 제조물, 혼합물, 및/또는 구조물은 생체활성 세포 제제로서 투여될 수 있다. 한 양상에서, 제제는 이들 세포, 그리고 본원에서 기술되는 생체활성 세포 제조물, 혼합물, 및/또는 구조물에 안정성을 제공하는 하나 이상의 생체물질을 포함한다. 한 양태에서, 생체물질은 온도에 따라 적어도 2가지 상이한 상 또는 상태를 지속할 수 있는 온도-민감성 생체물질이다. 생체물질은 일차 온도에서 일차 상태, 이차 온도에서 이차 상태, 및/또는 삼차 온도에서 삼차 상태를 지속할 수 있다. 일차, 이차 또는 삼차 상태는 실질적으로 고형, 실질적으로 액상, 또는 실질적으로 반-고형 또는 반-액상 상태일 수 있다. 한 양태에서, 생체물질은 일차 온도에서 일차 상태 및 이차 온도에서 이차 상태를 갖고, 여기서 일차 온도는 이차 온도보다 낮다.
다른 양태에서, 온도-민감성 생체물질의 상태는 약 8℃ 또는 그 이하의 온도에서 실질적으로 고형 상태이다. 다른 양태에서, 실질적으로 고형 상태는 약 1℃, 약 2℃, 약 3℃, 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 또는 약 8℃에서 유지된다. 한 양태에서, 실질적으로 고형 상태는 겔의 형태를 갖는다. 다른 양태에서, 온도-민감성 생체물질의 상태는 주위 온도 또는 그 이상에서 실질적으로 액상 상태이다. 한 양태에서, 실질적으로 액상 상태는 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 또는 약 37℃에서 유지된다. 한 양태에서, 주위 온도는 약 실온이다.
또 다른 양태에서, 온도-민감성 생체물질의 상태는 약 주위 온도 또는 그 이하의 온도에서 실질적으로 고형 상태이다. 한 양태에서, 주위 온도는 약 실온이다. 또 다른 양태에서, 실질적으로 고형 상태는 약 17℃, 약 16℃, 약 15℃, 약 14℃, 약 13℃, 약 12℃, 약 11℃, 약 10℃, 약 9℃, 약 8℃, 약 7℃, 약 6℃, 약 5℃, 약 4℃, 약 3℃, 약 2℃, 또는 약 1℃에서 유지된다. 한 양태에서, 실질적으로 고형 상태는 비드의 형태를 갖는다. 또 다른 양태에서, 온도-민감성 생체물질의 상태는 약 37℃ 또는 그 이상의 온도에서 실질적으로 액상 상태이다. 다른 양태에서, 실질적으로 고형 상태는 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 또는 약 40℃에서 유지된다.
온도-민감성 생체물질은 용액의 형태, 비드의 형태, 또는 본원에서 기술되는 및/또는 당업자에게 공지된 다른 적절한 형태로 제공될 수 있다. 본원에서 기술되는 세포 집단과 제조물은 온도-민감성 생체물질로 코팅되거나, 온도-민감성 생체물질에 침착되거나, 온도-민감성 생체물질 내에 포매되거나, 온도-민감성 생체물질에 부착되거나, 온도-민감성 생체물질에 파종되거나, 온도-민감성 생체물질 내에 현탁되거나, 또는 온도-민감성 생체물질 내에 포착될 수 있다. 대안으로, 예로써 스페이서 비드의 형태에서 임의의 세포 없이 온도-민감성 생체물질이 제공될 수도 있다.
다른 양태에서, 온도-민감성 생체물질은 일차 상태와 이차 상태 사이에 과도기 상태를 갖는다. 한 양태에서, 과도기 상태는 약 8℃의 온도 내지 약 주위 온도에서 고체에서 액체로의 과도기 상태이다. 한 양태에서, 주위 온도는 약 실온이다. 다른 양태에서, 고체에서 액체로의 과도기 상태는 약 8℃, 약 9℃, 약 10℃, 약 11℃, 약 12℃, 약 13℃, 약 14℃, 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 그리고 약 18℃ 중에서 하나 이상의 온도에서 일어난다.
온도-민감성 생체물질은 센티푸아즈 (cP) 단위로 측정된, 소정의 온도에서 특정한 점성을 갖는다. 한 양태에서, 생체물질은 25℃에서 약 1 cP 내지 약 5 cP, 약 1.1 cP 내지 약 4.5 cP, 약 1.2 cP 내지 약 4 cP, 약 1.3 cP 내지 약 3.5 cP, 약 1.4 cP 내지 약 3.5 cP, 약 1.5 cP 내지 약 3 cP, 약 1.55 cP 내지 약 2.5 cP, 또는 약 1.6 cP 내지 약 2 cP의 점성을 갖는다. 또 다른 양태에서, 0.75% (w/v) 용액은 37℃에서 약 1.0 cP 내지 약 1.15 cP의 점성을 갖는다. 37℃에서 점성은 약 1.0 cP, 약 1.01 cP, 약 1.02 cP, 약 1.03 cP, 약 1.04 cP, 약 1.05 cP, 약 1.06 cP, 약 1.07 cP, 약 1.08 cP, 약 1.09 cP, 약 1.10 cP, 약 1.11 cP, 약 1.12 cP, 약 1.13 cP, 약 1.14 cP, 또는 약 1.15 cP일 수 있다. 다른 양태에서, 생체물질은 젤라틴 용액이다. 젤라틴은 용액 내에 약 0.5%, 약 0.55%, 약 0.6%, 약 0.65%, 약 0.7%, 약 0.75%, 약 0.8%, 약 0.85%, 약 0.9%, 약 0.95% 또는 약 1% (w/v)로 존재한다. 한 가지 실례에서, 생체물질은 PBS에서 0.75% (w/v) 젤라틴 용액이다. 한 양태에서, 0.75% (w/v) 용액은 25℃에서 약 1.6 cP 내지 약 2 cP의 점성을 갖는다. 한 양태에서, 0.75% (w/v) 용액은 37℃에서 약 1.07 cP 내지 약 1.08 cP의 점성을 갖는다. 젤라틴 용액은 PBS, DMEM, 또는 다른 적절한 용매에서 제공될 수 있다.
한 양상에서, 생체활성 세포 제제는 또한, 세포 생존능 작용제를 포함한다. 한 양태에서, 세포 생존능 작용제는 항산화제, 산소 캐리어, 면역조절 인자, 세포 동원 인자, 세포 부착 인자, 소염제, 혈관생성 인자, 상처 치유 인자, 그리고 생체활성 세포로부터 분비된 생성물로 구성된 군에서 선택된다.
항산화제는 다른 분자의 산화를 억제하는 능력으로 특징지어진다. 항산화제에는 6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산 (트롤록스®), 카로티노이드, 플라보노이드, 이소플라본, 유비퀴논, 글루타티온, 리포산, 슈퍼옥사이드 디스무타아제, 아스코르브산, 비타민 E, 비타민 A, 혼성 카로티노이드 (가령, 베타 카로틴, 알파 카로틴, 감마 카로틴, 루테인, 리코펜, 피토펜, 피토플루엔, 그리고 아스타잔틴), 셀레늄, 조효소 Q10, 인돌-3-카르비놀, 프로안토시아니딘, 레스베라트롤, 케르세틴, 카테킨, 살리실산, 쿠르쿠민, 빌리루빈, 옥살산, 피드산, 리포산, 바닐산, 폴리페놀, 페룰산, 테아플라빈, 그리고 이들의 유도체 중에서 하나 이상이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 당업자는 본 발명에서 이용을 위한 다른 적절한 항산화제를 인식할 것이다.
산소 캐리어는 산소를 운반하고 방출하는 능력으로 특징되는 작용제다. 이들에는 제한 없이, 과불화탄소 및 과불화탄소를 포함하는 약제가 포함된다. 적절한 과불화탄소-기반 산소 캐리어에는 제한 없이, 퍼플루오르옥틸 브롬화물 (C8F17Br); 퍼플루오르디코로탄 (C8F16C12); 퍼플루오르데실 브롬화물; 퍼플루브론; 퍼플루오르데칼린; 퍼플루오르트리프로필아민; 퍼플루오르메틸시클로피페리딘; Fluosol® (퍼플루오르데칼린 & 퍼플루오르트리프로필아민); Perftoran® (퍼플루오르데칼린 & 퍼플루오르메틸시클로피페리딘); Oxygent® (퍼플루오르데실 브롬화물 & 퍼플루브론); OcycyteTM (퍼플루오르 (tert-부틸시클로헥산))이 포함된다. 당업자는 본 발명에서 이용을 위한 다른 적절한 과불화탄소-기반 산소 캐리어를 인식할 것이다.
면역조절 인자에는 제한 없이, 오스테오폰틴, FAS 리간드 인자, 인터류킨, 전환 성장 인자 베타, 혈소판 유래된 성장 인자, 클러스테린, 트랜스페린, 작용 시에 조절되고, 정상 T-세포 발현되고, 분비된 단백질 (RANTES), 플라스미노겐 활성자 억제제 - 1 (Pai-1), 종양 괴사 인자 알파 (TNF-알파), 인터류킨 6 (IL-6), 알파-1 마이크로글로불린, 그리고 베타-2-마이크로글로불린이 포함된다. 당업자는 본 발명에서 이용을 위한 다른 적절한 면역조절 인자를 인식할 것이다.
소염제 또는 면역억제제 (하기에 기술됨) 역시 제제의 일부일 수 있다. 당업자는 본 발명에서 이용을 위한 다른 적절한 항산화제를 인식할 것이다.
세포 동원 인자에는 제한 없이, 단핵구 화학주성 단백질 1 (MCP-1), 그리고 CXCL-1이 포함된다. 당업자는 본 발명에서 이용을 위한 다른 적절한 세포 동원 인자를 인식할 것이다.
세포 부착 인자에는 제한 없이, 피브로넥틴, 프로콜라겐, 콜라겐, ICAM-1, 연결 조직 성장 인자, 라미닌, 프로테오글리칸, 특정한 세포 부착 펩타이드, 예를 들면, RGD와 YSIGR이 포함된다. 당업자는 본 발명에서 이용을 위한 다른 적절한 세포 부착 인자를 인식할 것이다.
혈관생성 인자에는 제한 없이, 매트릭스 금속단백질분해효소 1 (MMP1), 매트릭스 금속단백질분해효소 2 (MMP2), 혈관 내피 성장 인자 F (VEGF), 매트릭스 금속단백질분해효소 9 (MMP-9), 조직 억제제 또는 금속단백질분해효소 - 1 (TIMP-1) 혈관 내피 성장 인자 F (VEGF), 안지오포이에틴-2 (ANG-2)가 포함된다. 당업자는 본 발명에서 이용을 위한 다른 적절한 혈관생성 인자를 인식할 것이다.
상처 치유 인자에는 제한 없이, 케라티노사이트 성장 인자 1 (KGF-1), 조직 플라스미노겐 활성자 (tPA), 칼빈딘, 클러스테린, 시스타틴 C, 트레포일 인자 3이 포함된다. 당업자는 본 발명에서 이용을 위한 다른 적절한 상처 치유 인자를 인식할 것이다.
본원에서 기술되는 생체활성 세포로부터 분비된 생성물 역시 세포 생존능 작용제로서 생체활성 세포 제제에 첨가될 수 있다.
또 다른 양상에서, 제제는 본원에서 기술되는 온도-민감성 생체물질, 그리고 생체물질을 내포하는 생체적합성 비드의 집단을 포함한다. 한 양태에서, 비드는 가교된다. 가교는 당업자에게 공지된 임의의 적절한 가교제, 예를 들면, 카르보디이미드; 알데히드 (가령, 푸르푸랄, 아크롤레인, 포름알데히드, 글루타르알데히드, 글리세릴 알데히드), 숙신이미드-기반 가교제 {비스(술포숙시니미딜) 수베레이트 (BS3), 디숙시니미딜 글루타레이트 (DSG), 디숙시니미딜 수베레이트 (DSS), 디티오비스(숙시니미딜 프로피오네이트), 에틸렌 글리콜비스(술포숙시니미딜숙시네이트), 에틸렌글리콜비스(숙시니미딜숙시네이트) (EGS), 비스(술포숙시니미딜) 글루타레이트 (BS2G), 디숙시니미딜 타르트레이트 (DST)}; 에폭시드 (에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 1,4 부탄디올 디글리시딜 에테르); 당류 (글루코즈와 알도즈 당); 술폰산과 p-톨루엔 술폰산; 카르보닐디이미다졸; 제니핀; 이민; 케톤; 디페닐포스포릴아지드 (DDPA); 테레프탈로일 염화물; 세륨 (III) 질산염 헥사하이드레이트; 미생물유래 트랜스글루타미나아제; 그리고 과산화수소를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 본 발명에서 이용을 위한 다른 적절한 가교제와 가교 방법을 인식할 것이다.
한 양태에서, 비드는 카르보디이미드-가교된 비드이다. 카르보디이미드-가교된 비드는 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카르보디이미드 염산염 (EDC), DCC - N,N'- 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), 그리고 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIPC)로 구성된 군에서 선택되는 카르보디이미드와 가교될 수 있다. 더욱 낮은 농도의 EDC로 처리된 비드는 더욱 많은 숫자의 유리 일차 아민을 갖는 반면, 높은 농도의 가교제로 처리된 시료는 아미드 결합에 관여하는 일차 아민 중에서 대부분을 가질 것으로 예상되었다. 335 nm에서 분광광도적으로 검출가능한, 일차 아민과 피크릴술폰산 사이에 공유 결합에 의해 현색된 오렌지색의 강도는 시료 내에 존재하는 일차 아민의 숫자에 비례한다. 시료 내에 존재하는 단백질의 밀리그램에 대해 정규화될 때, 존재하는 유리 아민의 숫자 및 가교에 이용된 EDC의 최초 농도 사이에 우수한 역상관이 관찰될 수 있다. 이러한 결과는 반응에 이용된 카르보디이미드의 양에 의해 지배되는 차등 비드 가교를 지시한다. 일반적으로, 가교된 비드는 비-가교된 비드와 비교하여 감소된 숫자의 유리 일차 아민을 나타낸다. 유리 일차 아민의 숫자는 약 335 nm에서 분광광도적으로 검출될 수 있다.
가교된 비드는 비-가교된 생체적합성 비드와 비교하여 효소 분해에 대한 감소된 감수성을 갖고, 따라서 정교하게 조정가능한 생체내 체류 시간을 갖는 비드를 제공한다. 가령, 가교된 비드는 내생성 효소, 예를 들면, 콜라게나아제에 내성이다. 가교된 비드의 공급은 (a) 원하는 부위에 부착 세포의 전달 및 고유 조직과 혈관 공급의 재생과 내방성장을 위한 공간의 창출; (b) 세포가 확립하고, 기능하고, 그들의 미세환경을 리모델링하고, 그리고 그들 자신의 세포외 매트릭스 (ECM)를 분비할 수 있을 만큼 충분히 오랫동안 부위에서 존속하는 능력; (c) 이식된 세포와 주변 조직의 통합의 촉진; (d) 실질적으로 고형 형태에서 세포를 이식하는 능력; (e) 전달된 세포/물질의 조직 내방성장 또는 전달된 세포/물질과 숙주 조직의 통합에 현저한 장애를 제공하지 않는 단기 구조적 완전성; (f) 실질적으로 고형 형태에서 국지화된 생체내 전달, 따라서 이식 동안 조직 내에서 세포의 분산 예방; (g) 유체에서 현탁된 세포와 비교하여 부착 의존성 세포의 개선된 안정성과 생존능; 그리고 (h) 세포가 i) 실질적으로 고형 상태 (가령, 비드에 부착됨), 그리고 ii) 실질적으로 액상 형태 (가령, 유체에서 현탁됨)로 전달될 때, 이상 (biphasic) 방출 프로필 중에서 한 가지를 조장하는 생체물질의 개발과 생산에 중점을 둔 전달 시스템의 일부이다.
한 양태에서, 본 발명은 젤라틴을 내포하는 가교된 비드를 제공한다. 비-가교된 젤라틴 비드는 생체활성 세포 제제에 적합하지 않은데, 그 이유는 이들이 완전성을 급속하게 상실하고 세포가 주사 부위로부터 흩어지기 때문이다. 대조적으로, 고도로 가교된 젤라틴 비드는 주사 부위에서 너무 오랫동안 존속하고, 그리고 de-novo ECM 분비, 세포 통합 및 조직 재생을 방해할 수 있다. 본 발명은 가교된 비드의 생체내 체류 시간이 정교하게 조정될 수 있도록 한다. 생체물질의 생물분해성을 맞춤하기 위하여, 전체 반응 조건을 모든 시료에 대해 일정하게 유지하면서 상이한 가교제 농도의 카르보디이미드를 이용한다. 가령, 카르보디이미드-가교된 비드의 효소적 감수성은 가교제의 농도를 약 0에서부터 약 1M까지 변화시킴으로써 정교하게 조정될 수 있다. 일부 양태에서, 농도는 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM, 약 21 mM, 약 22 mM, 약 23 mM, 약 24 mM, 약 25 mM, 약 26 mM, 약 27 mM, 약 28 mM, 약 29 mM, 약 30 mM, 약 31 mM, 약 32 mM, 약 33 mM, 약 34 mM, 약 35 mM, 약 36 mM, 약 37 mM, 약 38 mM, 약 39 mM, 약 40 mM, 약 41 mM, 약 42 mM, 약 43 mM, 약 44 mM, 약 45 mM, 약 46 mM, 약 47 mM, 약 48 mM, 약 49 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 또는 약 100 mM이다. 가교제 농도는 또한, 약 0.15 M, 약 0.2 M, 약 0.25 M, 약 0.3 M, 약 0.35 M, 약 0.4 M, 약 0.45 M, 약 0.5 M, 약 0.55 M, 약 0.6 M, 약 0.65 M, 약 0.7 M, 약 0.75 M, 약 0.8 M, 약 0.85 M, 약 0.9 M, 약 0.95 M, 또는 약 1 M일 수 있다. 또 다른 양태에서, 가교제는 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카르보디이미드 염산염 (EDC)이다. 한 양태에서, EDC-가교된 비드는 젤라틴 비드이다. 도 10은 젤라틴 비드의 EDC-매개된 가교를 위한 대표적인 개략도를 도시하고, 그리고 도 15는 비드의 분해%가 가교제의 농도에 따라, 어떻게 정교하게 조정될 수 있는 지를 예증한다.
가교된 비드는 파종, 부착, 또는 캡슐화에 우호적인 일정한 특성을 가질 수 있다. 가령, 비드는 다공성 표면을 갖고 및/또는 실질적으로 공동일 수 있다. 구멍의 존재는 비-다공성 또는 매끄러운 표면과 비교하여 더욱 많은 숫자의 세포가 부착할 수 있도록 하는 증가된 세포 부착 표면을 제공한다. 게다가, 구멍 구조는 de novo 조직의 형성을 지지하는 다공성 비드와의 호스트 조직 통합 (host tissue integration)을 지지할 수 있다. 비드는 일반적 입자 분포 패턴에 상응하는 와이블 (Weibull) 플롯에 피팅될 수 있는 크기 분포를 갖는다. 한 양태에서, 가교된 비드는 약 120 ㎛, 약 115 ㎛, 약 110 ㎛, 약 109 ㎛, 약 108 ㎛, 약 107 ㎛, 약 106 ㎛, 약 105 ㎛, 약 104 ㎛, 약 103 ㎛, 약 102 ㎛, 약 101 ㎛, 약 100 ㎛, 약 99 ㎛, 약 98 ㎛, 약 97 ㎛, 약 96 ㎛, 약 95 ㎛, 약 94 ㎛, 약 93 ㎛, 약 92 ㎛, 약 91 ㎛, 또는 약 90 ㎛ 미만의 평균 직경을 갖는다. 가교된 비드의 특성은 주조 과정에 따라 변한다. 가령, 액상 젤라틴 용액을 에어로졸화하고 이를 박층 크로마토그래피 시약 분무기 (ACE Glassware)로 액체 질소 내로 분무하기 위해 기류가 이용되는 공정이 전술한 특성을 갖는 비드를 제공하는데 이용된다. 당업자는 주조 과정의 매개변수를 조정하는 것이 비드의 상이한 특성, 예를 들면, 상이한 크기 분포를 맞춤하는 기회를 제공한다는 것을 인식할 것이다.
가교된 비드의 세포적합성은 세포 배양 기술을 이용한 제제화에 앞서 시험관내에서 검정되고, 여기서 비드는 최종 생체활성 세포 제제에 상응하는 세포와 함께 배양된다. 가령, 비드는 생체활성 신장 세포 제제의 제조에 앞서 일차 신장 세포와 함께 배양되고, 그리고 세포적합성을 확증하기 위해 생존/사멸 세포 검정이 이용된다.
특정한 제제에서, 생체적합성 가교된 비드는 용액 부피의 약 5% (w/w) 내지 약 15% (w/w)에서, 용해 상태의 온도-민감성 생체물질과 조합된다. 가교된 비드는 용액 부피의 약 5% (w/w), 약 5.5% (w/w), 약 6% (w/w), 약 6.5% (w/w), 약 7% (w/w), 약 7.5% (w/w), 약 8% (w/w), 약 8.5% (w/w), 약 9% (w/w), 약 9.5% (w/w), 약 10% (w/w), 약 10.5% (w/w), 약 11% (w/w), 약 11.5% (w/w), 약 12% (w/w), 약 12.5% (w/w), 약 13% (w/w), 약 13.5% (w/w), 약 14% (w/w), 약 14.5% (w/w), 또는 약 15% (w/w)로 존재한다.
다른 양상에서, 본 발명은 대략 수분, 수시간, 또는 수일의 기간에 걸쳐 분해되는 생체물질을 내포하는 제제를 제공한다. 이것은 수일, 수주, 또는 수개월에 걸쳐 천천히 분해되는 고형 물질의 이식에 중점을 두는 가공물의 큰 몸체와 대조적이다
다른 양상에서, 본 발명은 전달 매트릭스와 함께 생체활성 세포로 파종된 생체적합성 가교된 비드를 갖는 제제를 제공한다. 한 양태에서, 전달 매트릭스는 하기 특성 중에서 한 가지 이상을 갖는다: 생체적합성, 생물분해성/생물재흡수성, 피험자 내로 이식 전과 이식 동안 실질적으로 고형 상태, 이식 후 구조적 완전성 (실질적으로 고형 상태)의 상실, 그리고 세포 생존능을 지지하는 세포적합성 환경. 이식 동안, 이식된 입자 (가령, 가교된 비드)를 넓은 간격으로 유지시키는 전달 매트릭스의 능력은 고유 조직 내방성장을 증강시킨다. 전달 매트릭스가 부재하면, 이식 동안 소구획식 비드의 압축이 충분한 조직 내방성장을 위한 부적당한 공간을 유발할 수 있다. 전달 매트릭스는 고형 제제의 이식을 조장한다. 게다가, 구조적 완전성의 짧은 지속 기간은 이식 직후에, 매트릭스가 전달된 세포/물질의 조직 내방성장 또는 전달된 세포/물질과 숙주 조직의 통합에 현저한 장애를 제공하지 않는다는 것을 의미한다. 전달 매트릭스는 본원에서 기술되는 제제의 국지화를 제공하는데, 그 이유는 고형 단위의 삽입이 전달된 물질이 이식 동안 조직 내에서 분산하는 것을 예방하는데 도움을 주기 때문이다. 세포-기반 제제의 경우에, 고형 전달 매트릭스는 유체에서 현탁된 세포와 비교하여 부착 의존성 세포의 안정성과 생존능을 개선한다.
한 양태에서, 전달 매트릭스는 세포로 파종되지 않은 생체적합성 비드의 집단이다. 또 다른 양태에서, 파종되지 않은 비드는 개체 세포-파종된 비드 전역에 및 이들 비드 사이에 분산된다. 파종되지 않은 비드는 이식 전과 직후에 세포-파종된 비드 사이에 "스페이서 비드"로서 기능한다. 스페이서 비드는 일차 온도에서 실질적으로 고형 상태 및 이차 온도에서 실질적으로 액상 상태를 갖는 온도-민감성 생체물질을 내포하고, 여기서 일차 온도는 이차 온도보다 낮다. 가령, 스페이서 비드는 본원에서 기술되는 바와 같이, 약 주위 온도 또는 그 이하에서 실질적으로 고형 상태 및 약 37℃에서 실질적으로 액상 상태를 갖는 생체물질을 내포한다. 한 양태에서, 주위 온도는 약 실온이다. 또 다른 양태에서, 생체물질은 젤라틴 용액이다. 젤라틴 용액은 약 4%, 약 4.5%, 약 5%, 약 5.5%, 약 6%, 약 6.5%, 약 7%, 약 7.5%, 약 8%, 약 8.5%, 약 9%, 약 9.5%, 약 10%, 약 10.5%, 또는 약 11% (w/v)로 존재한다. 젤라틴 용액은 PBS, 세포 배양 배지 (가령, DMEM), 또는 또 다른 적절한 용매에 담겨 제공될 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 실질적으로 고형 형태 (가령, 스페이서 비드)로 이식되고, 체내로 이식 이후에 액화/용해되거나, 또는 만약 그렇지 않으면, 구조적 완전성을 상실하는 생체물질을 내포하는 제제를 제공한다. 이것은 액체로서 주사될 수 있고, 이후 체내에서 응고되는 물질의 이용에 중점을 두는 가공물의 유의미한 몸체와 대조적이다.
스페이서 비드의 온도-민감성은 제제화에 앞서 시험관내에서 검정될 수 있다. 스페이서 비드는 표지되고, 그리고 표지되지 않은 비-온도-민감성 비드와 혼합될 수 있다. 혼합물은 이후, 물리적 전이에서 변화를 관찰하기 위해 37℃에서 항온처리된다. 더욱 높은 온도에서 표지된 온도-민감성 비드의 형상의 상실이 시간의 흐름에서 관찰된다. 가령, 온도-민감성 젤라틴 비드는 물리적 전이의 마커로서 기능하는 Alcian blue 염료로 만들어질 수 있다. 청색 젤라틴 비드가 Cultispher S 비드 (백색)와 혼합되고, 카테터 내로 적하되고, 그 다음 압출되고 1X PBS, pH 7.4, 37℃에서 항온처리된다. 청색 젤라틴 비드의 형상의 상실은 상이한 시점에서 현미경적으로 추적된다. 청색 젤라틴 비드의 물리적 상태에서 변화는 30분 후 눈에 보이고 항온처리 시간이 연장됨에 따라 더욱 현저해진다. 비드는 상기 물질의 점성으로 인하여 완전하게 흩어지지 않는다 (도 2).
본원에서 기술되는 생체활성 세포 제제는 신장 내로 주사를 위한 신장 세포-기반 제제를 제조하는데 이용될 수 있다. 하지만, 당업자는 이들 제제가 많은 다른 유형의 생체활성 세포 집단에 적합하다는 것을 인식할 것이다. 가령, 본 발명은 임의의 고형 장기 또는 조직 내로 주사를 위한 생체활성 세포에 대한 제제를 고려한다.
한 양상에서, 본원에서 기술되는 생체활성 세포 제제는 일단의 숫자의 세포를 내포할 것이다. 한 양태에서, 제제에 대한 세포의 총수는 약 104, 약 105, 약 106, 약 107, 약 108, 또는 약 109이다. 한 양태에서, 본원에서 기술되는 제제에 대한 세포의 용량은 표적 장기 또는 조직의 추정된 질량 또는 기능적 질량에 기초하여 계산될 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 생체활성 세포 제제는 제제에 의한 치료의 대상이 되는 숙주 장기의 중량에 기초된 세포의 숫자에 상응하는 용량을 내포한다. 가령, 생체활성 신장 세포 제제는 인간 신장에 대한 약 150 그램의 평균 중량에 기초된다. 한 양태에서, 신장 그램 (g)당 세포의 숫자는 약 600 세포/g 내지 약 7.0 x 107 세포/g이다. 일부 양태에서, 신장 그램 (g)당 세포의 숫자는 약 600 세포/g, 약 1000 세포/g, 약 1500 세포/g, 약 2000 세포/g, 약 2500 세포/g, 약 3000 세포/g, 약 3500 세포/g, 약 4000 세포/g, 약 4500 세포/g, 약 5000 세포/g, 약 5500 세포/g, 약 6000 세포/g, 약 6500 세포/g, 약 7000 세포/g, 약 7500 세포/g, 약 8000 세포/g, 약 8500 세포/g, 약 9000 세포/g, 약 9500 세포/g, 또는 약 10,000 세포/g이다.
다른 양태에서, 신장 그램당 세포의 숫자는 약 1.5 x 104 세포/g, 약 2.0 x 104 세포/g, 약 2.5 x 104 세포/g, 약 3.0 x 104 세포/g, 약 3.5 x 104 세포/g, 약 4.0 x 104 세포/g, 약 4.5 x 104 세포/g, 약 5.0 x 104 세포/g, 약 5.5 x 104 세포/g, 약 6.0 x 104 세포/g, 약 6.5 x 104 세포/g, 약 7.0 x 104 세포/g, 약 7.5 x 104 세포/g, 약 8.0 x 104 세포/g, 약 9.5 x 104 세포/g이다.
다른 양태에서, 신장 그램당 세포의 숫자는 약 1.0 x 105 세포/g, 약 1.5 x 105 세포/g, 약 2.0 x 105 세포/g, 약 2.5 x 105 세포/g, 약 3.0 x 105 세포/g, 약 3.5 x 105 세포/g, 약 4.0 x 105 세포/g, 약 4.5 x 105 세포/g, 약 5.0 x 105 세포/g, 약 5.5 x 105 세포/g, 약 6.0 x 105 세포/g, 약 6.5 x 105 세포/g, 약 7.0 x 105 세포/g, 약 7.5 x 105 세포/g, 약 8.0 x 105 세포/g, 약 8.5 x 105 세포/g, 약 9.0 x 105 세포/g, 또는 약 9.5 x 105 세포/g이다.
다른 양태에서, 신장 그램당 세포의 숫자는 약 1.0 x 106 세포/g, 약 1.5 x 106 세포/g, 약 2.0 x 106 세포/g, 약 2.5 x 106 세포/g, 약 3.0 x 106 세포/g, 약 3.5 x 106 세포/g, 약 4.0 x 106 세포/g, 약 4.5 x 106 세포/g, 약 5.0 x 106 세포/g, 약 5.5 x 106 세포/g, 약 6.0 x 106 세포/g, 약 6.5 x 106 세포/g, 약 7.0 x 106 세포/g, 약 7.5 x 106 세포/g, 약 8.0 x 106 세포/g, 약 8.5 x 106 세포/g, 약 9.0 x 106 세포/g, 약 9.5 x 106 세포/g, 1.0 x 107 세포/g, 또는 약 1.5 x 107 세포/g이다.
세포의 총수는 제제에 대해 선별될 수 있고, 그리고 제제의 부피는 적절한 용량에 도달하도록 조정될 수 있다.
일부 양태에서, 제제는 단일 용량 또는 단일 용량 + 추가 용량인, 피험자에 대한 세포의 용량을 내포할 수 있다. 다른 양태에서, 용량은 본원에서 기술되는 구조물에 의해 제공될 수 있다. 본원에서 기술되는 신장 세포 집단 또는 신장 세포 집단 혼합물의 치료 유효량은 피험자에 의해 안전하게 수용되는 세포의 최대 수부터, 예로써 안정화, 감퇴율의 감소, 또는 하나 이상의 신장 기능의 개선과 같은 신장 질환의 치료에 필수적인 세포의 최소 수의 범위일 수 있다.
본원에서 기술되는 신장 세포 집단 또는 이들의 혼합물의 치료 유효량은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제에 현탁될 수 있다. 이와 같은 담체는 기초 배양 배지 + 1% 혈청 알부민, 식염수, 완충된 식염수, 덱스트로즈, 물, 콜라겐, 알기네이트, 히알루론산, 피브린 글루, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알콜, 카복시메틸셀룰로오즈 및 이의 조합을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 제제는 투여 방식에 맞아야 한다.
따라서, 본 발명은 피험자에서 신장 질환 치료를 위한 약물 제조용의 예로써, 단독으로 또는 B3 및/또는 B4 또는 B4' 세포 집단과 혼합된 B2 세포 집단과 같은 신장 세포 집단 또는 이들의 혼합물을 내포하는 제제의 용도를 제공한다. 일부 양태에서, 상기 약물은 재조합 폴리펩타이드, 예를 들면, 성장 인자, 케모킨 또는 사이토킨을 추가로 포함한다. 추가 양태에서, 상기 약물은 인간 신장-유래 세포 집단을 포함한다. 약물 제조에 사용되는 세포는 본원에서 기술되는 방법에 의해 제공되는 임의의 변형을 이용하여 분리되거나, 유도되거나 또는 농축될 수 있다.
신장 세포 제조물(들) 또는 이들의 혼합물 또는 조성물은 통상적 절차에 따라 인간에 투여하는데 적합한 약제학적 조성물로 제제화된다. 전형적으로, 정맥 투여, 동맥내 투여 또는 신장 캡슐내 투여용 조성물은 무균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 상기 조성물은 주사 부위에서 임의의 통증을 개선하기 위하여 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분들은 별도로 공급되거나 또는 예로써, 활성 물질의 양을 표시하는 앰플과 같은 밀봉된 용기에 저온보관된 농축물로서 단일 투여형으로 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우 멸균된 약제학적 등급의 물 또는 식염수를 포함하는 주입액 병에 분배될 수 있다. 조성물이 주입에 의해 투여될 때, 주입용 무균수 또는 식염수의 앰플은 투여전에 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체는 부분적으로 투여되는 특정 조성물 및 조성물을 투여하는데 이용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 약제학적 조성물에 적합한 광범위한 다양한 제제가 있다 [참조: Alfonso R Gennaro (ed), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, formerly Remington's Pharmaceutical Sciences 20th ed, Lippincott, Williams & Wilkins, 2003, 전체가 본원에 참고문헌으로 편입됨]. 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균된 실질적으로 등장성인 조성물로 제제화되며, 미국식품의약국의 의약품 제조 품질 관리 기준 (GMP) 규정에 완전히 따른다.
본 발명의 한 양상은 본 발명의 신장 세포 제조물, 예를 들면, B2 세포 제조물 단독 또는 B3 및/또는 B4 또는 B4' 세포 제조물과 병용된 B2 세포 제조물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 제제를 추가로 제공한다. 일부 양태에서, 제제는 104 내지 109개의 포유동물 신장-유래 세포를 포함한다.
변형된 방출 제제
한 양상에서, 본 발명의 제제는 변형된 방출 제제로서 제공된다. 일반적으로, 변형된 방출은 투여 시에 일차 활성 작용제의 최초 방출, 그 이후에 이차 활성 작용제의 적어도 1회 추가 후속 방출로 특징지어진다. 일차와 이차 활성 작용제는 동일하거나 상이할 수 있다. 한 양태에서, 제제는 동일한 제제 내에서 복수 성분을 통해 변형된 방출을 제공한다. 또 다른 양태에서, 변형된 방출 제제는 활성 작용제가 제제의 부피 전역에서 자유롭게 유동할 수 있도록 하여 투여 시에 표적 부위에서 즉시 방출을 허용하는 일차 성분의 일부로서 활성 작용제를 내포한다. 일차 성분은 실질적으로 액체 상 및 실질적으로 고체 상을 갖는 온도-민감성 생체물질일 수 있고, 여기서 일차 성분은 투여 시점에서 실질적으로 액체 상에 있다. 한 양태에서, 활성 작용제는 제제의 부피 전역에서 실질적으로 자유롭게 이동하고, 따라서 투여 시에 표적 부위로 즉시 방출될 만큼 실질적으로 액체 상에 있다.
또 다른 양태에서, 변형된 방출 제제는 이차 성분의 일부로서 활성 작용제를 갖고, 여기서 활성 작용제는 이차 성분에 부착되거나, 이차 성분에 침착되거나, 이차 성분으로 코팅되거나, 이차 성분 내에 포매되거나, 이차 성분에 파종되거나, 또는 이차 성분 내에 포착되고, 이것은 표적 부위에 투여 전후에 존속한다. 이차 성분은 활성 작용제와 결합하고, 따라서 투여 시점에서 이차 성분으로부터 활성 작용제의 즉시 방출을 예방할 수 있는 구조적 요소를 내포한다. 가령, 이차 성분은 실질적으로 고형 형태, 예를 들면, 생체적합성 비드에서 제공되고, 이것은 생체내 효소 분해를 예방하거나 지연시키기 위해 가교될 수 있다. 한 양태에서, 실질적으로 고체 상에서 활성 작용제는 투여 전후에 제제 내에서 구조적 완전성을 유지하고, 따라서 투여 시에 활성 작용제를 표적 부위에 즉시 방출하지 않는다. 변형된 방출 제제에 대한 적절한 담체가 본원에서 기술되긴 하지만, 당업자는 본 발명에서 이용하기 적합한 다른 담체를 인식할 것이다.
한 양태에서, 제제는 세포, 나노입자, 치료 분자 등을 비롯한 전달된 요소의 최초 신속 전달/방출, 그 이후에 요소의 후기 지연된 방출을 제공한다. 본 발명의 제제는 전달되는 작용제가 부착되지 않은 형태 (가령, 용액에서 세포) 및 부착된 형태 (가령, 비드 또는 다른 적절한 캐리어와 함께 세포) 둘 모두로 제공되는 이와 같은 이상 방출 프로필에 대해 설계될 수 있다. 최초 투여 시에, 방해가 없는 작용제는 전달 부위에 즉시 제공되는 반면, 방해된 작용제의 방출은 캐리어 (가령, 비드)의 구조적 완전성이 없어지고 앞서 부착된 작용제가 방출될 때까지 지연된다. 하기에 논의된 바와 같이, 방출의 다른 적절한 기전은 당업자에 의해 인식될 것이다.
방출에 대한 시간 지연은 활성 작용제의 성격에 따라 조정될 수 있다. 가령, 생체활성 세포 제제에서 방출에 대한 시간 지연은 대략 수초, 수분, 수시간, 또는 수일 정도이다. 일부 경우에, 대략 수주 정도의 지연이 적절할 수 있다. 소형 또는 대형 분자와 같은 다른 활성 작용제의 경우에, 제제에서 방출에 대한 시간 지연은 대략 수초, 수분, 수시간, 수일, 수주, 또는 수개월 정도이다. 또한, 제제는 상이한 시간 지연 방출 프로필을 제공하는 상이한 생체물질을 내포할 수도 있다. 가령, 일차 활성 작용제를 갖는 일차 생체물질은 일차 방출 시간을 갖고, 그리고 이차 활성 작용제를 갖는 이차 생체물질은 이차 방출 시간을 갖는다. 일차와 이차 활성 작용제는 동일하거나 상이할 수 있다.
본원에서 논의된 바와 같이, 지연된 방출의 기간은 일반적으로, 생체물질의 구조적 완전성의 상실에 대한 기간에 상응할 수 있다. 하지만, 당업자는 지연된 방출의 다른 기전을 인식할 것이다. 가령, 활성 작용제는 임의의 특정 생체물질의 분해 시간, 예를 들면, 폴리머 매트릭스로부터 약물의 확산과 독립적으로, 시간의 흐름에서 계속적으로 방출될 수 있다. 게다가, 생체활성 세포는 생체물질 및 생체활성 세포를 내포하는 제제로부터 벗어나 고유 조직으로 이동할 수 있다. 한 양태에서, 생체활성 세포는 생체물질, 예를 들면, 비드로부터 벗어나 고유 조직으로 이동한다.
생물분해성, 생체적합성 폴리머, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 그리고 폴리젖산이 이용될 수 있다. 주사가능 제제의 연장된 흡수는 제제 내에, 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염과 젤라틴을 포함시킴으로써 달성될 수 있다. 이런 제제의 제조를 위한 많은 방법이 특허되거나, 또는 당업자에게 전반적으로 공지된다. [참조: Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]. 폴리펩타이드 작용제의 제어된 또는 연장된 방출에 적용될 수 있는 추가의 방법은 예로써, U.S. 특허 번호 6,306,406과 6,346,274, 그리고 예로써, U.S. 특허 출원 번호 US20020182254와 US20020051808에서 기술되고, 이들 모두 본원에 참고문헌으로 편입된다.
9. 투여 방법과 루트
본 발명의 생체활성 세포 제제는 단독으로 또는 다른 생체활성 성분과 조합으로 투여될 수 있다. 이들 제제는 조직을 재생하기 위해 고형 장기의 내부에, 통합된 조직 공학 요소의 주사 또는 이식에 적합하다. 게다가, 이들 제제는 조직을 재생하기 위해 속이 비어있는 장기의 벽에 조직 공학 요소의 주사 또는 이식에 이용된다.
한 양상에서, 본 발명은 본원에서 기술되는 생체활성 세포 제제를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 생체활성 세포의 공급원은 자가, 동종이계 또는 동계 (자가유전자형 또는 동종유전자형) 공급원 및 이들의 임의의 조합이 될 수 있다. 자가 공급원이 아닌 경우, 상기 방법은 면역억제제의 투여를 포함할 수 있다. 적합한 면역억제 약물은 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 미조르빈, 사이클로스포린, 타크롤리무스 하이드레이트, 클로람부실, 로벤자리트 이나트륨, 아우라노핀, 알프로스타딜, 구스페리무스 하이드로클로라이드, 바이오신소르브, 무로모나브, 알레파셉트, 펜토스타틴, 다클리주마브, 시롤리무스, 미코페놀레이트 모페틸, 레플로노미드, 바실릭시마브, 도르나제 α, 빈다리드, 클라드리빈, 피메크롤리무스, 일로데카킨, 세델리주마브, 에팔리주마브, 에베롤리무스, 아니스페리무스, 가빌리모마브, 파랄리모마브, 클로파라빈, 라파마이신, 시플리주마브, 사이레이토, LDP-03, CD4, SR-43551, SK&F-106615, IDEC-114, IDEC-131, FTY-720, TSK-204, LF-080299, A-86281, A-802715, GVH-313, HMR-1279, ZD-7349, IPL-423323, CBP-1011, MT-1345, CNI-1493, CBP-2011, J-695, LJP-920, L-732531, ABX-RB2, AP-1903, IDPS, BMS-205820, BMS-224818, CTLA4-1g, ER-49890, ER-38925, ISAtx-247, RDP-58, PNU-156804, LJP-1082, TMC-95A, TV-4710, PTR-262-MG 및 AGI-1096 [참조: 미국 특허 번호 7,563,822]을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 당업자는 다른 적합한 면역억제 약물을 인식할 것이다.
본 발명의 치료 방법은 본원에서 기술되는 생체활성 세포 제제를 전달하는 것을 포함한다. 한 양태에서, 의도된 부위로 세포를 직접 투여하는 것이 바람직하다. 피험자는 고유 신장을 하나 이상의 농축 신장 세포 집단 및/또는 이를 포함하는 혼합물 또는 구조물로부터 분비되는 생성물과 함께 본원에서 기술되는 생체활성 세포 제제와 생체내에서 접촉시킴으로써 치료될 수 있다.
고유 신장을 분비 생성물과 생체내 접촉시키는 단계는 세포 배양 배지, 예를 들면, 조건화 배지로부터의 일군의 분비 생성물을 내포하는 제제의 사용/투여를 통해 또는 생체내에서 생성물을 분비할 수 있는 농축된 세포 집단 및 혼합물 또는 구조물의 이식에 의해 달성될 수 있다. 생체내 접촉 단계는 고유 신장에 대해 재생 효과를 제공한다.
피험자에게 세포 및/또는 분비 생성물을 투여하는 다양한 수단은 이러한 설명을 고려할 때 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 방법은 피험자의 표적 부위에 세포를 주사하는 것을 포함한다.
세포 및/또는 분비 생성물은 피험자에게 주입 또는 이식에 의한 도입을 가능하게 하는 전달 장치 또는 비히클로 삽입된다. 특정 양태에서, 전달 비히클은 천연 물질을 포함할 수 있다. 특정한 다른 양태에서, 전달 비히클은 합성 물질을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 전달 비히클은 기관의 구조와 유사한 또는 적절하게 맞는 구조를 제공한다. 다른 양태에서, 전달 비히클은 사실상 유체와 유사하다. 이와 같은 전달 장치는 수용 피험자의 체내로 세포 및 유체를 주입하기 위한 튜브, 예를 들면, 카테터를 포함한다. 바람직한 양태에서, 튜브는 추가로 바늘, 예를 들면, 주사기를 가지며, 주사기를 통해 피험자의 원하는 위치에 본 발명의 세포가 도입된다. 일부 양태에서, 포유동물 신장-유래 세포 집단은 카테터를 통하여 혈관으로 투여되도록 제제화된다 (용어 "카테터"는 혈관으로 물질을 전달하기 위한 임의의 다양한 튜브형 시스템을 포함하고자 한다). 대안으로, 세포는 피륙, 니트, 메쉬, 부직포와 같은 직물, 및 비-편직, 천공된 필름, 스폰지 및 포움, 고체 또는 다공성 비드, 미소입자, 나노입자 등 (가령, 쿨티스터-S (Cultispher-S) 젤라틴 비드 - 시그마(Sigma))을 포함하나 이들에 한정되지 않는 생체물질 또는 스캐폴드 내에 또는 상에 삽입될 수 있다. 상기 세포는 다양한 상이한 형태로 전달되도록 제조될 수 있다. 가령, 세포를 용액 또는 겔에 현탁시킬 수 있다. 세포를 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 혼합할 수 있으며, 이때 세포는 여전히 살아있다. 약제학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 식염수, 완충 수용액, 용매 및/또는 분산 매질을 포함한다. 이와 같은 담체 및 희석제의 사용은 당업계에 널리 공지되어 있다. 용액은 바람직하게는 멸균되고, 유체이며, 종종 등장액이 될 수 있다. 바람직하게는, 용액은 제조 및 보관 조건하에 안정하며, 예로써 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로잘 등의 사용을 통하여 세균 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염으로부터 보호된다. 당업자는 본 발명의 세포 집단 및 이들의 혼합물의 전달에 사용되는 전달 비히클이 상기-언급된 특징들의 조합을 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
분리된 신장 세포 집단(들), 예를 들면, 단독으로 또는 B4' 및/또는 B3과 혼합된 B2 세포 집단을 내포하는 제제의 투여 방식은 전신, 신장내 (가령, 실질), 정맥내 또는 동맥내 주사, 그리고 의도된 활성 부위의 조직으로의 직접 주사를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 본 발명에 따라 이용될 수 있는 추가의 투여 방식은 직접적인 개복을 통하여, 직접적인 복강경을 통하여, 복막을 통하여 또는 피하를 통하여 단일 또는 다중 주사(들)을 포함한다. 본 발명에 이용될 수 있는 또 다른 추가의 투여 방식은 예로써, 역행 (retrograde) 및 요관신우 주입 (ureteropelvic infusion)을 포함한다. 외과적 투여 수단은 부분적인 신적출 및 구조물 이식, 부분적인 신적출, 부분적인 신우개구 (pyelectomy), 장막 ± 복막과의 혈관화, 다초점 생검 니들 트랙, 콘 또는 피라미드형 내지 실린더 및 신장 막대형 교체를 포함하나 이들에 한정되지 않는 일-단계 시술뿐만 아니라, 예로써 재이식을 위한 기관양-내부 생체반응기를 포함한 2-단계 시술도 포함한다. 한 양태에서, 세포 혼합물을 내포하는 제제는 동일한 시간에 동일한 경로를 통하여 전달된다. 또 다른 양태에서, 조절된 혼합물을 포함하는 각 세포 조성물은 특정 위치로 별도로 전달되거나 특정 방법을 통하여 동시에 또는 시간-조절 (temporally-controlled) 방식으로 본원에서 기술되는 하나 이상의 방법에 의해 전달된다.
인간에서 적합한 세포 이식 용량은 세포의 활성, 예를 들면, EPO 생성과 관련된 기존 정보로부터 결정되거나 전임상 조사에서 수행된 용량 조사로부터 외삽될 수 있다. 세포의 양은 시험관내 배양 및 생체내 동물 실험으로부터 정량되고 이식 물질의 적합한 용량을 계산하는데 이용될 수 있다. 또한, 상기 환자는 추가의 이식이 수행될 수 있는지 또는 이에 맞게 이식 물질이 감소되어야 하는지를 결정하기 위해 모니터링될 수 있다.
당업계에 공지된 하나 이상의 유형의 콜라겐 또는 히알루론산과 같은 선택된 세포외 매트릭스 성분, 및/또는 성장 인자, 혈소판-농축 혈장 및 약물을 비롯한 하나 이상의 다른 성분이 본 발명의 세포 집단 및 이들의 혼합물에 첨가될 수 있다.
당업자는 본원에서 기술되는 분비 생성물에 적합한 다양한 제제 및 투여 방법을 알 수 있을 것이다.
10. 제조 물품 및 키트
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리머 매트릭스 및 스캐폴드 및 관련 물질, 및/또는 세포 배양 배지 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 포함한다. 사용 설명서는 예로써, 세포 배양을 위한 설명 또는 세포 및/또는 세포 생성물의 투여를 위한 설명을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 본 발명은 본원에서 기술되는 스캐폴드 및 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 또 다른 양태에서, 상기 키트는 마커 발현의 검출을 위한 제제, 이러한 제제의 사용을 위한 시약 및 사용 설명서를 포함한다. 상기 키트는 본원에서 기술되는 세포 집단, 혼합물 또는 구조물의 이식 또는 투여 후 피험자에서 고유 신장의 재생 예후를 측정하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 키트는 본원에서 기술되는 세포 집단, 혼합물 또는 구조물의 생체치료 효능을 측정하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 치료가 필요한 피험자의 치료에 유용한 생체활성 세포를 내포하는 제조 물품이다. 제조 물품은 용기, 그리고 용기 상에 또는 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적절한 용기에는 제한 없이, 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 용기는 다양한 물질, 예를 들면, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 질환을 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하고 무균 접근 포트를 가질 수 있다 (가령, 용기는 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 용액 가방 또는 바이알이다). 제제 내에 적어도 하나의 활성 작용제는 본 발명의 생체활성 세포 집단이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 제제가 특정 질환을 치료하는데 이용된다는 것을 표시한다. 라벨 또는 포장 삽입물은 제제를 환자에 투여하기 위한 사용설명서를 더욱 포함할 것이다. 본원에서 기술되는 조합 치료제 (combinatorial therapy)를 포함하는 제조 물품과 키트 역시 고려된다. 포장 삽입물은 이런 치료적 생성물의 이용과 관련된 징후, 용법, 용량, 투여, 금기 및/또는 경고에 관한 정보를 담고 있는, 치료적 생성물의 상업적 포장에 관례적으로 포함되는 사용설명서를 말한다. 한 양태에서, 포장 삽입물은 제제가 질환 또는 장애, 예를 들면, 신장 질환 또는 장애를 치료하는데 이용된다는 것을 표시한다. 이것은 기타 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 그리고 주사기를 비롯하여, 상업적인 이용자 관점으로부터 바람직한 기타 물질을 더욱 포함할 수 있다. 다양한 목적, 예를 들면, 재생 결과의 평가에 유용한 키트 역시 제공된다. 본원에서 기술되는 바와 같이, 소변-유래된 소포 및/또는 그들의 함량에 대한 검출 작용제, 예를 들면, 핵산 (가령, miRNA), 소포, 엑소솜 등을 내포하는 키트가 제공될 수 있다. 검출 작용제에는 제한 없이, 핵산 프라이머와 프로브, 그리고 원하는 표적의 시험관내 검출을 위한 항체가 포함된다. 제조 물품에서처럼, 키트는 용기, 그리고 용기 상에 또는 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 용기는 적어도 하나의 검출 작용제를 포함하는 조성물을 보유한다. 예로써, 희석제와 완충액 또는 대조군 검출 작용제를 내포하는 추가의 용기가 포함될 수도 있다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물에 관한 설명, 그리고 의도된 시험관내, 예언적, 또는 진단적 용도를 위한 사용설명서를 제공할 수 있다.
11. 리포트
본 발명의 방법은 상업 목적으로 실시되는 경우, 일반적으로 재생 예후에 대한 리포트 또는 개괄을 제공한다. 본 발명의 방법은 본원에서 기술되는 세포 집단, 혼합물 또는 구조물을 내포하는 제제의 임의의 투여 또는 이식 전후에 재생에 대한 예상되는 전개 또는 결과의 예측을 포함하는 리포트를 제공할 것이다. 상기 리포트는 예후에 관계가 있는 임의의 지표에 대한 정보를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 방법 및 리포트는 또한 데이터베이스에 리포트를 저장하는 것을 포함한다. 달리, 상기 방법은 피험자에 대한 데이터베이스에 기록을 만들고 데이터와 함께 기록을 덧붙인다. 한 양태에서 리포트는 페이퍼 리포트이고, 다른 양태에서 리포트는 청각 리포트이며, 또 다른 양태에서 리포트는 전자 기록이다. 리포트는 의사 및/또는 환자에게 제공되는 것으로 의도된다. 리포트의 수신은 데이터 및 리포트를 포함하는 서버 컴퓨터에 네트워크 연결을 설정하고 서버 컴퓨터로부터 데이터 및 리포트를 요청하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 제공되는 방법은 전체 또는 부분적으로 자동화될 수 있다.
본원에서 예시적으로 기술되는 발명은 본원에서 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재에서 적절하게 실시될 수 있다. 따라서 예로써, 각 경우에 본원에서 용어 "포함하는", "본질적으로 구성되는" 및 "구성되는"은 다른 두 용어 중에서 어느 하나로 대체될 수 있다. 따라서 이들 용어 중에서 하나를 이용하는 본 발명의 양태의 경우에, 본 발명은 이들 용어 중에서 하나가 이들 용어 중에서 다른 것으로 대체되는 다른 양태 역시 포함한다. 각 양태에서, 이들 용어는 그들의 확립된 의미를 갖는다. 따라서 예로써, 한 양태는 다수의 성분을 "포함하는" 제제를 포함하고, 다른 양태는 동일한 성분으로 "본질적으로 구성되는" 제제를 포함하고, 그리고 세 번째 양태는 동일한 성분으로 "구성되는" 제제를 포함할 것이다. 이용되는 이들 용어와 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로서 이용되고, 그리고 이런 용어와 표현의 이용에서 본원에서 도시되고 기술된 특징의 임의의 등가물 또는 이들의 일부분을 배제하는 의도가 없고, 다양한 개변이 청구된 본 발명의 범위 내에서 가능한 것으로 인정된다. 따라서 비록 본 발명이 바람직한 양태와 선택적 특징에 의해 구체적으로 기술되긴 했지만, 본원에서 개시된 개념의 개변은 당업자에 의해 실행될 수 있고, 그리고 이런 개변은 첨부된 청구항에 의해 정의되는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주되는 것으로 이해되어야 한다.
상기 서면으로 작성된 설명은 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 할 만큼 충분한 것으로 간주된다. 하기 실시예는 단지 설명의 목적으로 제공되고, 그리고 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 실제로, 본원에서 도시되고 기술된 것들 이외에 본 발명의 다양한 개변은 전술한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이고 첨부된 청구항의 범위 내에 속한다.
본원에 인용되는 모든 특허, 특허 출원 및 참고문헌은 전체가 참고문헌으로 본원에 편입된다.
실시예
실시예 1: 단기 구조적 완전성을 갖는 전달 매트릭스의 이용
본 발명자들은 신규한 생체물질/세포 시스템을 조사하고 본 발명의 설치류 주사 모델에서 그들의 성과를 평가하는 과정에서, 젤라틴에 기초된 열가역적 비드, 그리고 세포-유도된 세포외 매트릭스 리모델링, 세포-세포 상호작용, 세포 이동, 증식 및 조직 재생을 허용하는, 소구획식 비드, 세포 집괴 또는 단일 세포 현탁액 주변에 생체모방 미세환경을 발생시키는 열가역적 젤라틴 연속 상 전달 매트릭스를 생산하기 위한 방법을 고안하고 개발하였다. 본 발명자들은 실온 이하에서 고체이고 체온에서 액체인 젤라틴 용액의 형성에서 전달 매트릭스 기술의 유용성을 구체적으로 증명하였다. 이러한 열가역적 주사가능 매트릭스는 유리 세포, 세포 집괴, 마이크로캐리어 비드 상에 세포, 그리고 유리 세포와 마이크로캐리어 상에 세포의 혼합물을 래트 신장의 연조직 내로 이식하는데 이용되고 있다.
방법
비드 제조. 10% w/v 젤라틴 용액 (Gelita, Inc., Sioux City, LA)은 탈이온수에서 제조되고, 이후 박층 크로마토그래피 시약 분무기로 액체 질소 (LN2) 내로 기압식 분무되었다. LN2는 화학적 가스배출 후드에서 증발되고, 그리고 비드는 수집되었다.
생체물질의 세포적합성과 생체내 이식 평가. 세포적합성을 평가하기 위해 LIVE/DEAD® 포유동물 세포 생존능/세포독성 키트 (Invitrogen, Carlsbad, CA)가 형광 현미경사진 영상화와 병용되었다. Cultispher S 비드와 혼합된 스페이서 비드가 주사된 신장의 조직학적 분석 (이식 후 1주)은 비드의 생체적합성 및 그들의 공간 창출 능력 (space creating capacity)을 평가하기 위해 수행되었다. 조직학 슬라이드는 Masson의 트리크롬 (콜라겐을 파랗게 염색한다) 또는 헤마톡실린 & 에오신 (H&E)으로 염색되었다. 이미지는 양성 지표 (조직 내방성장, 1개월 시점에 검출가능 생체물질이 거의 내지 전혀 없음, 그리고 건강한 조직) & 음성 지표 (대식세포, 거대 세포, 그리고 기타 염증성 세포의 존재; 섬유증 캡슐 형성을 지지하는 생체물질 지속성, 그리고 집합관의 크기에서 증가) 둘 모두에 대해 평가되었다.
결과
열가역적 비드
비드는 물질이 25℃ 미만의 온도에서 겔화/응고되고 30℃ 초과에서 액화될 수 있도록 하는 농도에서 돼지 젤라틴 용액으로부터 생산되었다. 가교되지 않은 젤라틴 비드 (청색)의 온도 반응성이 관찰되었다. Alcian Blue 염료가 물리적 전이의 마커로서 기능하기 위해 최초 젤라틴 용액에 포함되었다. 이후, 청색 젤라틴 비드가 상업적으로 가용한 마이크로캐리어 비드 (백색)와 혼합되고, 카테터 내로 적하되고, 그 다음 압출되고 1X PBS, pH 7.4, 37℃에서 항온처리되었다. 청색 젤라틴 비드의 형상의 상실은 상이한 시점에서 현미경적으로 추적되었다. 청색 젤라틴 비드의 물리적 상태에서 변화는 30분 후 눈에 보이고 항온처리 시간이 연장됨에 따라 더욱 현저해졌다. 비드는 상기 물질의 점성으로 인하여 흩어지지 않았다 (도 1).
열가역적 전달 매트릭스
열가역적 주사가능 매트릭스는 유체 상태에서 전달되는 요소와 조합되고, 세뇨관 카테터 내로 배치되고, 그리고 실온 미만으로 냉각되어 매트릭스가 겔화되었다. 형광 현미경사진 이미지에서, 생존 세포를 녹색으로 염색하고 사멸 세포를 적색으로 염색하는 LIVE/DEAD® 포유동물 세포 생존능/세포독성 키트 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 착색제가 이용되었다 (도 2-6). 본 발명자들은 열가역적 주사가능 매트릭스 내에 포매된 세포가 매트릭스를 겔화시키기 위한 냉각 후, 여전히 생존한다는 것을 발견하였다. 마이크로캐리어 비드를 내포하는 매트릭스가 이식된 조직의 조직학적 분석 (이식 후 1주)은 마이크로캐리어 비드를 짙은 진홍색 구조로서 드러냈다. 매트릭스 물질은 이 슬라이드에서 눈에 보이지 않았고, 그리고 이것이 조직 내방성장에 장애물이라는 증거가 없었다 (도 7).
매트릭스의 구조적 완전성의 상실의 도해는 도 8에 묘사된다. 매트릭스는 실온에서 유동하지 않지만, 37℃에서 유동한다. 매트릭스 물질의 관찰된 특성과 특징은 다수의 조직 공학과 재생 의약 적용에서 통합된 요소의 전달을 가능하게 할 것이다. 구체적으로, 본 발명은 통합된 요소 및 이것이 배치되는 조직 또는 장기의 상호작용에 방해 또는 장애물이 되지 않으면서 제어된 취급, 배치 또는 분산으로 조직 또는 장기 내에 표적 장소에 상기 물질을 전달하기 위해, 1) 이식 이전과 이식 동안 구조적 완전성, 그리고 2) 이식 직후에 일정한 시점에서 구조의 상실 둘 모두의 이점을 이용한다.
실시예 2: 화학적 가교를 통한 생체물질의 효소적 감수성 맞춤
내생성 콜라게나아제에 대한 생체물질의 효소적 감수성을 맞춤하기 위하여, 돼지 젤라틴에 기초된 열가역적 비드의 생산 (실시예 1에서 앞서 기술된 바와 같이)은 이들의 생체내 체류 시간 (residence time)을 조정하기 위해 상이한 정도로 더욱 화학적으로 가교될 수 있다. 이것은 또한, 상기 물질이 별개의 조직 재생 구조물 (가령, 캐리어 비드 상에 파종된 세포) 사이에 스페이서로서 기능하고, 조직 내방성장을 촉진하고, 그리고 생체모방 니치를 산출할 수 있도록 한다. 게다가, 상기 물질은 세포, 약물 또는 기타 분자 전달 시스템으로서 기능하는 잠재력을 갖는다. 이를 위하여, 본 발명자들은 충분히 특징지어지고 폭넓게 이용되는 시약, N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염 (EDC)의 이용을 선택하였다. 이러한 제로-길이 가교제는 분자내 또는 분자간에 소재하는 공간적으로 인접한 카르복실과 일차 아민 기능성 사이에 아미드 결합의 형성을 촉진한다 (도 9).
방법
물질. 저 내독소 젤라틴은 Gelita, Inc., Sioux City, IA로부터 구입되었다. 피크릴술폰산 용액 (TNBS) 및 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염 (EDC)은 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO로부터 구입되었다. LIVE/DEAD® 포유동물 세포 생존능/세포독성 키트는 Invitrogen, Carlsbad, CA로부터 구입되었다. 수산화나트륨(NaOH), 염화칼슘 (CaCl2) 및 2-[모르폴리노]에탄술폰산, 0.9% NaCl, pH 4.7 (MES) 완충액은 Fisher Scientific, Pittsburgh, PA로부터 구입되었다. 콜라게나아제 IV는 Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ로부터 구입되고, 그리고 디스파아제 I (4 U/ml)는 Stemcell Technologies, Vancouver, BC로부터 구입되었다. Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 (DMEM), 케라티노사이트-혈청 없음 배지 (케라티노사이트-SFM) 및 인산염 완충된 염수 (PBS)는 Invitrogen/Gibco, Carlsbad, CA로부터 구입되었다.
화학적 가교. 냉동 건조된 젤라틴 비드는 0.1 M MES 완충액, pH 4.7 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) (20 ml 완충액/비드의 그램)에서 현탁되고 1-3시간 동안, 바람직하게는 4℃에서 재수화되었다. 상기 완충액 (화학적 반응의 pH와 완충 요건에 기초하여 선택됨)은 이후, 제거되고 1:1 (v/v) 현탁액이 비드의 부피에 동등한 EDC (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 염산염)/MES pH 7.4 용액으로 만들어지고, 여기서 EDC 농도는 10-100 mM 범위이고, 그리고 짧은 와동 후, 현탁액은 정적 조건 하에 실온에서 하룻밤 동안 항온처리되었다. 그 후, 비드는 여과되고 탈이온수 (세척 부피 = 20X 비드 부피)로 세척되고, 이후 동결되고 냉동 건조되었다.
시험관내 효소 분해 검정. 다양한 농도의 EDC로 가교된 비드에 대한 분해 속도는 콜라게나아제/디스파아제 분해에 대한 그들의 감수성에 의해 검정되고 상업적으로 가용한 CULTISPHER® 비드와 비교되었다. CULTISPHER® 비드 및 가교된 비드는 칭량되고 PBS, pH 7.4에서 ~20 mg/ml의 농도로 현탁되었다. 0.5 ml 부피 비드 현탁액에, 0.5 mM CaCl2와의 50 ㎕ 30 U/ml 콜라게나아제/디스파아제 혼합물 (Thermo Fisher Scientific)이 첨가되고, 이후 시료는 와동되고 로커에서 37℃에서 1시간 동안 항온처리되었다 (이용된 각 가교제 농도에 대해 n = 3). 그 후, 부분적으로 분해된 시료로부터 20 ㎕ 상층액은 수집되고, 그리고 변형된 Bradford 검정을 이용하여 가용성 단백질 함량에 대해 평가되고, 여기서 염료 대 단백질 용액의 비율은 이의 민감성을 증가시키기 위해 1:9 v/v로 설정되었다. 남아있는 분해 혼합물은 앞서 기술된 바와 같이 하룻밤 동안 항온처리되고, 그리고 총 단백질 함량 결정을 위해 유사하게 검정되었다. 이들 값은 부분적으로 분해된 시료 값을 정규화시키는데 이용되었다. 시료 내에 총 단백질의 양은 완전하게 분해되고, 이후 Bradford 시약으로 검정되는 공지된 양의 젤라틴으로부터 만들어진 용액에 대한 A595 값을 플롯팅 (plotting)함으로써 수득된 젤라틴 표준 곡선으로부터 계산되었다. 시료 내에 총 단백질의 양은 100%인 것으로 간주되었고, 그리고 부분 분해에 의해 수득된 단백질 양은 100%에 상대적으로 정규화되었다. 분해는 Bradford 검정에 의해 측정될 때, 1 시간 시점에서 가용성 단백질/총 가용성 단백질의 비율로서 계산되었다.
아민 정량. 완전하게 분해된 가교된 비드 용액 (앞서 기술된 바와 같이 수득됨) (n = 3)의 pH는 각 바이알에 5 ㎕의 1M NaOH를 첨가함으로써 상승되었다 (최종 pH 값은 ~8.5이었다). 그 후, TNBS가 0.25% w/v의 최종 농도로 각 시료에 첨가되고, 그리고 바이알이 로커에서 37℃에서 2시간 동안 항온처리되었다. A335 값은 이후, 평판 판독기로 측정되고, 그리고 값은 앞서 기술된 바와 같이 측정될 때, 각 시료에서 밀리그램 단백질에 대해 정규화되었다. 시료 내에 총 단백질의 양은 완전하게 분해되고, 이후 Bradford 시약으로 검정되는 공지된 양의 젤라틴으로부터 만들어진 용액에 대한 A595 값을 플롯팅 (plotting)함으로써 수득된 젤라틴 표준 곡선으로부터 계산되었다.
비드 크기산정. 크기 분포를 좁히기 위하여, 가교된 비드는 70% v/v 에탄올에서 현탁되고 정의된 구멍 크기의 나일론 거물눈을 통한 순차적 여과에 의해 64-250 ㎛ 크기로 산정된다.
형태학 및 크기 분포. 냉동 건조된 비드는 탄소 테이프 토막에 적용되고, 증착-코팅되고, 그리고 Philips 515 주사 전자 현미경 (SEM)으로 영상화되었다. 비드의 크기 분포는 SEM 이미지를 분석하고 500 비드에 대한 치수를 집계함으로써 결정되었다 (n = 500).
결과
젤라틴-기반, 화학적으로 가교된 다공성 비드는 농축된 젤라틴 용액을 액체 질소 내로 분무하고, 결과의 비드를 냉동 건조시키고, 이후 이들이 카르보디이미드와 반응하도록 함으로써 수득되었다. 가교 용액의 농도 (0에서부터 1 M EDC까지)를 변화시킴으로써, 본 발명자들은 가교의 정도를 제어하고, 그리고 정교하게 조정가능한 효소적 감수성을 갖는 비드를 합성할 수 있었다.
분무된 비드의 형태학과 크기 분포는 SEM에 의해 분석되었다 (도 10 A-B). 비드는 다공성 표면 및 주로 중공 (hollow core)을 갖는 구체인 것으로 보였다. 수화 또는 가교는 비드의 물리적 특징에 영향을 주지 않았다 (결과 도시되지 않음).
전체 집단의 크기 분포는 입자에 특정한 와이블 (Weilbull) 분포 프로필을 추종하였는데, 비드 직경의 대부분이 100 ㎛보다 작고 전형적으로, 50-75 ㎛ 범위에 있다(도 11). 이러한 형태학과 크기 범위는 이전의 신장 조직 공학-표적화된 생체물질 스크리닝 연구 [Basu supra 2011]와 일치한다.
게다가, 비드의 내부는 비어있고, 따라서 이들은 마이크로캐리어로서 다양한 적용에 적합할 것이다. 비드의 전체 표면은 수화로 인하여, 습성 상태에서 더욱 현저한 다공성 외관을 가졌다 (도 12 A-B). 구멍의 존재는 증가된 세포 부착 표면으로 해석되고, 이것은 매끄러운 표면 대응물과 비교하여 더욱 많은 수의 세포가 부착할 수 있도록 할 것이다. 전술한 물리적 특징, 특히 비드 크기는 주조 과정 (casting process)에 상당히 좌우된다. 이러한 경우에, 비드는 액상 젤라틴 용액을 에어로졸화하고 이를 박층 크로마토그래피 시약 분무기 (ACE Glassware)로 액체 질소 내로 분무하기 위해 공기 흐름을 이용함으로써 수득되었다. 이러한 과정과 연관된 매개변수의 조절은 상이한 크기 분포를 결과할 수 있다.
생리학적 조건 하에, 비-가교된 젤라틴 비드는 수분 내에 그들의 완전성을 상실하고, 이것은 캐리어로서 그들의 적용가능성 스펙트럼 (applicability spectrum)을 제한한다. 목적은 세포가 새로운 환경에서 통합을 시작할 때까지 세포를 보존하면서 이들 세포를 원하는 부위로 전달하는 캐리어 시스템을 개발하는 것이었다. 게다가, 캐리어는 외생성과 내생성 세포의 국지화되고 협력된 상호작용을 통해 조직 재생 과정을 매개할 것이다. 이를 위하여, 젤라틴은 다양한 카르보디이미드 농도를 이용함으로써 공유 가교되었다. 가교의 정도는 반응 완결 후 젤라틴 내에 여전히 존재하는 일차 아민의 숫자를 비색 정량함으로써 결정되었다 (도 13 A-B).
더욱 낮은 농도의 EDC로 처리된 비드는 더욱 많은 숫자의 유리 일차 아민을 갖는 반면, 높은 농도의 가교제로 처리된 시료는 아미드 결합에 관여하는 일차 아민 중에서 대부분을 가질 것으로 예상되었다. 335 nm에서 분광광도적으로 검출가능한, 일차 아민과 피크릴술폰산 사이에 공유 결합에 의해 현색된 오렌지색의 강도는 시료 내에 존재하는 일차 아민의 숫자에 비례한다. 시료 내에 존재하는 단백질의 밀리그램에 대해 정규화될 때, 그 결과는 존재하는 유리 아민의 숫자 및 가교에 이용된 EDC의 최초 농도 사이에 우수한 역상관을 증명하였다. 이러한 결과는 반응에 이용된 카르보디이미드의 양에 의해 지배되는 차등 비드 가교를 지시한다.
본 발명자들은 생리학적 매개변수, 예를 들면, 효소 분해에 대한 가교된 젤라틴 비드의 감수성이 화학적 가교의 정도에 비례하여 변할 것으로 가정하였다. 이를 검사하기 위해, 차등적으로 가교된 비드는 부분적으로 효소 분해되고, 그리고 자료는 총 시료 양에 대해 정규화되었다. 조정가능한 효소적 감수성은 최적화된 Bradford 시약 검정에 기초된 스크리닝 검사를 개발함으로써 시험관내에서 검정되었다. 시료는 30 U의 콜라게나아제/디스파아제 혼합물과 함께 1시간 동안 항온처리되고 분해에 대해 검정되었다 (n=3). 값은 완전한 효소 분해 (하룻밤) 후 측정될 때, 시료 내에 젤라틴의 총량에 정규화되었다. ANOVA 통계학적 분석 P = 0.0008. 콜라게나아제/디스파아제에 노출은 Cultispher 비드 및 가교된 젤라틴 비드 둘 모두로부터 변하는 양의 가용성 단백질을 방출하였다. 젤라틴 비드의 경우에, 이들 시험관내 분해 속도는 가교에 이용된 EDC 농도와 충실히 상관하였다. 가교된 젤라틴 비드의 분해 속도는 콜라게나아제/디스파아제 효소 혼합물에 1시간 노출 후 EDC 가교제의 농도에 거의 비례하였다. 이들 결과는 상기 가설과 부합되게, 최대 가교 정도를 갖는 시료가 효소 분해에 가장 적은 영향을 받고, 그리고 분해 속도가 반응에 이용된 EDC 농도와 충실히 상관 (R2 = 0.97)한다는 것을 지시하였다 (도 14 A-B). 이들 결과는 가교된 비드의 생체내 체류 시간이 가교의 정도와 상관한다는 것을 암시한다.
실시예 3 - 소구획식 가교된 비드의 확인
가교된 비드의 생물분해성은 건강한 성체 래트의 신장 내로 생체물질의 직접 미세주사 후 시험관내와 생체내 둘 모두에서 검정되었다. 가교된 비드의 세포적합성을 짚어보기 위해, 일차 래트 신장 세포는 동적 조건 하에 가교된 비드에서 배양되었다. 24시간 후, 비드는 세포 생존능에 대해 검정되었다. 가교되지 않은 비드는 검정에 포함되지 않았는데, 그 이유는 이들이 배양 조건 (37℃의 온도) 하에 액화하기 때문이다.
방법
선별된 신장 세포 (SRC) 제조. 생검은 Hanks 균형 염 용액 (HBSS)으로 세척되고, 잘게 썰어지고, 칭량되고, 그리고 5mM CaCl2와 함께 HBSS에서 4 단위의 디스파아제 1, 300 단위/ml의 콜라게나아제 타입 IV로 구성되는 완충액에서 분리되었다. 결과의 세포 현탁액은 도말을 위해 5% (v/v) FBS, 2.5 ㎍ 인간 재조합 상피 성장 인자 1-53 (rEGF 1- 53), 25 mg 소 뇌하수체 추출물 (BPE), 1X ITS (인슐린/트랜스페린/셀레늄), 그리고 1X 항생제/항진균제를 내포하는 고-글루코즈 (4.5g/L) DMEM:KSFM의 1:1 혼합물에서 재현탁에 앞서, 5% (v/v) FBS를 내포하는 고-글루코즈 (4.5g/L) DMEM:KSFM의 1:1 혼합물에서 세척된다. 배양은 37℃/5% C02에서 수행된다. 세포는 EDTA를 갖는 0.25% 트립신으로, 계대를 위해 분리된다. 생존능은 트리판 블루 배제에 의해 검정되고, 그리고 혈구계수기 (hemacytometer)를 이용하여 수동으로 계수되었다.
배양 후 분리에 앞서, 배양물은 하룻밤 동안, 대기 산소에 가까운 조건 (16-21%)으로부터 더욱 생리학적으로 관련된 저산소 (2%) 환경으로 이전된다. 세포는 EDTA를 내포하는 0.25% 트립신으로, 수확을 위해 분리된다. 생존능은 트리판 블루 배제에 의해 검정되고, 그리고 혈구계수기 (hemacytometer)를 이용하여 수동으로 계수된다. 세포 현탁액은 2mL 비보충된 KSFM (uKSFM)에서 60 - 75 x 106 세포로서 제조되고, 그리고 실온에서 20분 동안 800xg에서 원심분리에 의해, 15mL 원뿔 폴리프로필렌 튜브에 2-단계 이오딕산올 (OptiPrep®; uKSFM에서 60%) 밀도 구배 (16%, 7%)에서 분리되었다 (중단 없음). 16%와 7% 이오딕산올 층 사이의 계면에서 세포 밴드는 수집되고 제제화에 앞서 무균 염수에서 3x 세척된다.
제제. 밴드분류 (banding) 후, 선별된 신장 세포 (SRC)는 펠릿화되고, 계산되고, 염수에서 세척되고, 그리고 젤라틴에서 최종 세척된다. 최종 원심분리 이후에, 젤라틴 용액 상층액은 제거되고, 그리고 100 uM 트롤록스 등가물을 내포하는 충분한 부피의 0.75% 젤라틴이 표적화된 부피/세포 농도에 첨가된다.
대안으로, SRC는 먼저, 2.5 x 106 세포/35 ㎕의 비드의 비율 (포장 부피)에서, 가교된 비드 위에 파종되고, 그리고 1 rpm으로 설정된 회전 장치에서 튜브 내에 1.5 ml 기본 배지/백만 개 세포와 함께 37℃/5% CO2에서 하룻밤 동안 배양된다. 기본 배지는 1:1 부피 비율에서 케라티노사이트-SFM (Invitrogen)과 혼합된 DMEM-HG (Invitrogen)로 구성된다. 이들 세포 파종된 비드는 이후, 원심분리에 의해 부드럽게 펠릿화되고, 상층액이 제거되고, 그리고 PBS에 담긴 10% 젤라틴 용액에서 재현탁함으로써 더욱 제제화되었다. 10% 젤라틴은 주위 온도에서 겔이지만, 37℃에서 액체이다. 젤라틴:비드 비율은 부피로 1:5이었다.
세포적합성. 제제화된 세포는 LIVE/DEAD® 세포 생존능/세포독성 키트 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용함으로써, 24시간 후 생존능에 대해 검정되었다.
생체물질의 생체내 이식과 평가. 가교된 비드는 세포로 파종되고 앞서 기술된 바와 같이 제제화되었다. 모든 실험 절차는 Carolinas Medical Center의 PHS와 LACUC 가이드라인 하에 수행되었다. 이소플루란 마취 하에, 암컷 루이스 래트는 중간선 절개가 이루어지고, 그리고 좌측 신장이 노출되었다. 제제화된 생체물질 (35 ㎕)은 미세주사에 의해 신장 연조직 내로 도입되었다 [Basu supra 2011]. 래트는 주사 후 1주 또는 4주에 희생되었다. 조기 폐사는 발생하지 않았다.
통계학적 분석. 크기 분포 프로필의 경우에, 비드 직경 값은 2 매개변수 와이블 (Weibull) 방정식으로 피팅되었다. 아민 정량과 효소 분해 자료의 경우에, 값은 단일-인자 ANOVA와 비교되었다.
결과
예상된 바와 같이, 이들 비드는 높은 세포 부착과 생존능을 유지하였다 (도 15). 가교된 비드의 세포적합성은 동적 조건 하에 24시간 배양 후, 25 mM EDC로 가교된 젤라틴 비드 상에서 일차 래트 신장 세포의 LIVE/DEAD® 염색에 의해 검정되었다 (도 16). 25 mM EDC 가교된 비드 상에서 염색된 래트 신장 세포의 이미지는 일련에 대한 대표로서 선별되었다. 현미경적 평가에 의해, 세포 부착과 생존능 둘 모두 EDC 가교된 생체물질의 세포적합성에 관한 기존에 공개된 자료와 일치하는 것으로 밝혀졌다 [Lai et al. supra 2010; Lv et al. J Biomed Mater Res A 2008; 84: 198-207].
시험관내 관찰 결과를 더욱 확인하기 위해, 대표적인 소구획식 가교된 비드 (25, 50과 100 mM EDC)는 암컷 루이스 래트 신장 내로 같은자리 주사되고 1주와 4주 후 조직학적으로 평가되었다. 1주 후, 가교된 물질에 대한 모든 주사 부위는 초점, 경등도 세뇨관 확장/위축 및 경등도 섬유형성 반응과 함께, 만성 염증성 침윤물 (대식세포, 혈장 세포, 림프구 및 거대 세포)로 주로 구성되는 증가된 과세포성 반응으로 특징지어졌다. 전체적으로, 이 시점에서, 생체물질의 온건한 분해, 그리고 보통의 조직 내방성장과 신혈관신생이 주목되었다. 중요하게는, 주사 후 1주 시점에 이미, 관찰된 분해 패턴은 시험관내 자료에 의해 지시된 추세와 충실히 상관하는 것으로 보였다.
설치류에서 이들 생체물질의 생체내 성과의 평가 (신장 주사)는 비드가 생체적합성이고, 그리고 세포가 생리학적으로 기능할 수 있는 세포적합성 니치 (cytocompatible niche)를 공여할 수 있다는 것을 확증하였다 (도 17). 게다가, 가교된 비드의 조정가능한 분해 패턴은 시험관내 관찰 결과와 상관하였다 (도 18). 도 18과 도 19는 래트 세포로 파종된 젤라틴 비드의 조직학적 이미지를 묘사한다. 조직학 슬라이드는 Masson의 트리크롬 (콜라겐을 파랗게 염색한다) 또는 헤마톡실린 & 에오신 (H&E)으로 염색되었다. 이미지는 양성 지표 (조직 내방성장, 1개월 시점에 검출가능 생체물질이 거의 내지 전혀 없음, 그리고 건강한 조직) & 음성 지표 (대식세포, 거대 세포, 그리고 기타 염증성 세포의 존재; 섬유증 캡슐 형성을 지지하는 생체물질 지속성, 그리고 집합관의 크기에서 증가) 둘 모두에 대해 평가되었다. 이들 이미지는 최소 염증성 반응 및 경등도 섬유증 캡슐 형성과 함께, 생체물질 내로 강건한 조직 내방성장을 보여준다. 게다가, 충분히-혈관화된 조직이 이식물과 관련하여 형성되었다.
도 18은 주사 후 1주 시점에 가교된 젤라틴 비드의 분해를 보이는 신장 단편의 조직학적 평가를 도시한다. 백색 화살표는 H&E와 트리크롬 염색된 단편 둘 모두에서 가교된 비드를 지시한다. 트리크롬은 젤라틴을 파랗게 염색하고 비드 분해로부터 발생하는 비드 (백색 화살표)와 젤라틴 자취 (흑색 화살표) 둘 모두의 가시화를 가능하게 한다 (모든 이미지에 대한 기준자는 200 ㎛이다). 4주 시점에, 모든 주사 부위는 온건한 섬유-세포 반응 및 만성 간질성 염증 (단구성)을 보였다.
도 19는 주사 후 4주 시점에 가교된 젤라틴 비드의 분해를 보이는 신장 단편의 조직학적 평가를 도시한다. 백색 화살표는 H&E와 트리크롬 염색된 단편 둘 모두에서 가교된 비드를 지시한다. 트리크롬은 젤라틴을 파랗게 염색하고 비드 분해로부터 발생하는 비드 (백색 화살표)와 젤라틴 자취 (흑색 화살표) 둘 모두의 가시화를 가능하게 한다 (모든 이미지에 대한 기준자는 200 ㎛이다). 생체물질의 분해는 중간 (100 mM EDC 가교됨) 내지 현저 (25 mM EDC 가교됨)로 분류된다 (도 19, 비드는 백색 화살표에 의해 표시된다; 흑색 화살표는 분해된 물질을 지시한다). 25mM EDC 가교된 비드의 경우에, 중간 내지 현저한 조직 내방성장 및 중등도 신혈관신생과 함께 경등도 만성 염증 (대식세포와 거대 세포)에 의해 둘러싸인 최소 잔여 생체물질 (비드)이 있었다. 중간 내지 현저한 분해는 50 mM EDC 가교된 비드의 경우에 관찰되지만, 100 mM EDC 대응물은 대식세포와 거대 세포, 일부 혈장 세포 및 림프구로 주로 구성되는 중등도 만성 염증에 의해 둘러싸인 비드의 부분적으로 (경미하게) 분해된 무정형 집괴로서 나타났다. 또한, 이러한 시료의 경우에, 적절한 조직/세포 내방성장과 함께 주위에서 중간 내지 현저한 섬유세포 반응이 관찰되었다 (도 19). 전체적으로, 양쪽 시점에 대한 조직학적 관찰 결과는 시험관내 검사에서 관찰된 분해 패턴과 일치하였다. 게다가, 차등적으로 가교된 비드는 생체내에서 충분히 관용되고, 생체물질의 섬유증 캡슐화의 형성을 유도하지 않고, 그리고 주변 조직에서 충분히 통합되었다.
젤라틴-기반 비드의 시험관내 효소 분해 속도는 가교에 이용된 ECD의 농도로 합성 동안 제어될 수 있다. 본원에서 제시된 제조 공정은 임상 생성물의 생산에서 현재 이용되는 시약을 이용하여, 조정가능한 효소적 감수성을 갖는 생물분해성 스캐폴드를 생산하기 위한 간단하고 비용-효과적인 공정을 대표할 수 있다. 조정가능한 시험관내 분해의 조정가능한 생체내 분해로의 변환은 현재 연구 중에 있고, 그리고 공간적 특성과 구조적 특성의 시간적 지속성 (temporal persistence)이 장기 및/또는 조직이 재생되는 특정한 요구에 따라 최적화될 수 있는 생체물질을 생산하기 위한 유용한 플랫폼 기술을 잠재적으로 대표할 수 있다.
생체물질의 물리화학적 성질과 생물학적 성질의 제어는 임의의 조직 공학 적용의 성공에 중요하다. 본 발명의 경우에, 한 가지 필요물은 생존 세포를 원하는 부위로 전달하고, 세포 침투와 증식으로부터 재생 변화를 위한 공간을 제공하고, 이후 세포가 새로운 환경 조건에 적응하고 적절한 조직과 장기로 분화할 수 있도록 하면서 점진적으로 재흡수하는, 특정한 생체내 체류 시간을 갖는 생체물질이었다. 본 발명자들은 본원에서, EDC (콜라겐-기반 FDA-승인된 장치의 제조에 폭넓게 이용되는 카르보디이미드) 및 물-기반 화학적 가교 공정을 이용함으로써, 유의미한 범위 전역에 걸치는 생물분해 속도를 갖는 젤라틴 비드를 수득할 수 있다는 것을 증명하였다. 게다가, 이러한 공정은 고도로 재현가능하다. 전체적으로, 이러한 접근법은 장기 특이적 생물분해 속도를 갖는 조직 공학 생체물질을 생산하기 위한 효과적이고 효율적인 수단을 제공한다.
전체적으로, 본 발명자들은 다양한 분자에 대한 스페이서, 세포 전달 시스템 또는 마이크로캐리어로서 기능할 수 있는 젤라틴-기반 마이크로비드를 제조할 수 있었다. 이러한 설계는 젤라틴의 농도 의존성 용융 온도를 탐구하고 이러한 특징을 적용하여 온도 반응성 스페이서 비드를 산출한다. 게다가, 단순하고 충분히 특징화된 화학을 이용함으로써, 이들 비드는 생체내와 시험관내 둘 모두에서 원하는 효소 분해 속도를 추종하도록 맞춤될 수 있다. 기존에 보고된 유사하게 가교된 시스템은 본원에서 보고된 물리적 특징을 갖지 못하였고, 따라서 본 발명의 시스템은 마이크로캐리어 또는 세포 전달 적용에 더욱 적합하다.
실시예 4 - 선별된 신장 세포와 생체물질로 구성되는 네오-신장 확대 원형의 이식에 대한 설치류 부분-신장절제술 모델의 생물-반응
신장 기능을 복원하는 새로운 치료에 대한 필요를 짚어보기 위하여, 조직과 장기의 재생을 촉진할 수 있는 독특한 통합된 재생 의학 기술 플랫폼이 개발되었다.
생체물질 및 선별된 재생 신장 세포 (SRC)로 구성되는 네오-신장 확대 (NKA) 생성물 원형은 신장 조직의 재생을 촉진할 수 있는 이와 같은 한 가지 플랫폼이다. SRC는 세포의 신장 생검과 밀도 구배 분리의 효소 분해로부터 수득된다. 젤라틴 기반 하이드로겔 (GBH)이 생체물질로서 이용되었다. NKA 원형의 이식을 향한 포유동물 신장의 생체반응은 건강한 성체 설치류에서 사전에 평가되었다 [Basu et al., 2011, Cell Transplantation, in press]. 하지만, 설치류로부터 단일 신장의 제거 (부분-신장절제술)은 상기 모델의 민감성을 증가시키고, 전신적으로 작용하는 독물학적 효과의 검출을 허용한다. 이 연구에서, 15마리의 부분-신장절제된 설치류는 나머지 신장의 신장 연조직 내에 NKA 원형이 주사되고 핵심 신장 생리학적 지수에 대해 평가되었다.
방법
네오-신장 확대 원형은 선별된 신장 세포를 표 1에서 도시된 바와 같은 생체물질과 조합함으로써 만들어졌다. 세포/생체물질 구조물은 도 20에서 도시된 바와 같이 제조되었다 (NKA 구조물의 산출을 위한 전략의 개요).
젤라틴 용액 제조:
0.75% 또는 1.0% w/v 젤라틴/100 μM 트롤록스 등가 용액을 만드는데 필요한 분말 젤라틴과 트롤록스 등가물/PBS의 양이 계산된다. PBS가 자성 교반 막대가 있는 비커 내에 배치되고, 그리고 50℃로 설정된 교반 열판에서 15분 동안 가온되었다. 젤라틴이 천천히 첨가되고, 그리고 혼합물은 50℃에서 1시간 동안 교반된다. 결과의 젤라틴 용액은 미리-가온된 무균 필터 어셈블리를 이용하여 여과된다. 무균 젤라틴 용액은 이후, 더욱 작은 부피 (15 ml 튜브에서 10 ml)로 등분되고 사용 때까지 4℃에서 보관된다.
바람직한 접근법은 PBS에서 0.76% 또는 1.01% 젤라틴 용액을 만들고, 이후 SRC와 혼합될 때 충분한 부피의 100X (1O mM) 트롤록스 등가물을 첨가하여 원하는 0.75% (또는 1.0%) 젤라틴/100 μM 트롤록스 등가 용액을 산출하는 것이다.
부분-신장절제된 설치류 군에 생체물질 전달의 요약.

군
동물
물질		 주사 #/
신장		 주사 부피
(폴(pole)
(ul)당)
세포 (B2, B3, B4)
/ 주사
전달
시스템
A HN07 PBS에서 세포 2 150 2.5x10e6 18 게이지
A HN11 PBS + 트롤록스 2 150 7.5x10e6 18 게이지
A HN15 PBS에서 세포 + 트롤록스 2 150 7.5x10e6 18 게이지
A HN21 PBS No 트롤록스 + 세포 2 150 7.5x10e6 (신장당 15백만) 18 게이지
B HN08 젤라틴 (1.0%) + PBS에서 세포 2 150 2.5x10e6 18 게이지'
B HN12 젤라틴 (1.0%) + PBS에서 세포 + 트롤록스 2 150 7.5x10e6 18 게이지
B HN16 PBS에서 젤라틴 (0.75%) + 트롤록스 2 150 7.5x10e6 18 게이지
B HN23 젤라틴 (0.75%) + 트롤록스 + 세포 2 150 7.5x10e6 (신장당 15백만) 18 게이지
C HN09 젤라틴 (1.0%) +
PBS에서 10% Tng 비드 (0.50M) 		2 50 2.5x10e6 18 게이지
C HN10 젤라틴 (1.0%) + PBS에서 10% Tng 비드 (25mM) + 트롤록스 2 150 7.5x10e6 18 게이지
C HN13 젤라틴 (1.0%) + PBS에서 10% Tng 비드 (25mM) + 트롤록스 2 50 2.5x10e6 18 게이지
C HN14 젤라틴 (1.0%) + PBS에서 10% Tng 비드 (25mM) + 트롤록스 2 150 7.5x10e6 18 게이지
C HN18 젤라틴 (0.75%)
+ 기본 배지에서 10% Tng 비드 (25mM) +		 2 50 2.5x10e6 18 게이지
C HN24 젤라틴 (0.75%) + 트롤록스 + 10% TNG 비드 + 세포 2 150 7.5x10e6 (신장당 15백만) 18 게이지
C HN25 젤라틴 (0.75%) + 트롤록스 + 10% TNG 비드 + 세포 2 150 7.5x10e6 (신장당 15백만) 18 게이지
결과:도 21A-C는 선별된 설치류 재생 신장 세포 생체물질 구조물의 대표적인 생존/사멸 염색을 도시한다. 이들 구조물은 18 게이지 바늘을 통해, 부분-신장절제된 루이스 래트 (2개월령)의 나머지 신장에 전달되었다. 전혈, 혈청과 소변 화학으로부터 유래된 생리학적 지수는 이식에 앞서, 또는 이식 후 4주 시점에 평가되었다. 동물은 주사 후 4주 시점에 희생되고, 그리고 나머지 신장은 염증성 또는 섬유증 생체반응의 증거에 대해 조직학적으로 조사되었다.NKA 원형의 이식은 핵심 신장 생리학적 지수에 별다른 영향을 주지 않았고, 그리고 염증성, 괴사성 또는 섬유증 생체반응의 최소의 증거를 제공하였다. 이런 이유로, GBH에서 SRC에 기반한 NKA 원형은 설치류 부분신장절제술 모델에서 나머지 신장에 의해 충분히 관용된다.
도 22는 이식 후 4주 시점에 군별로 체중 (A), 혈액 요소성 질소 수준 (B) 및 혈청 크레아틴 수준 (C)에서 변화의 요약을 도시한다 (ANOVA 분석) - A: 군 ID에 의한 델타 중량의 일원 분석; B: 군 ID에 의한 델타 sBUN의 일원 분석 (BUN: 혈액 요소성 질소); C: 군 ID에 의한 델타 Scre의 일원 분석 (Scre: 혈청 크레아티닌).
도 23은 이식 후 4주 시점에 군별로 소변 단백질/크레아티닌 (A) 및 소변 단백질 (B)에서 변화의 요약을 도시한다 (ANOVA 분석) - A: 군 ID에 의한 델타 UPC의 일원 분석 (UPC: 소변 단백질/크레아티닌); B: 군 ID에 의한 델타 U단백질의 일원 분석 (U단백질: 소변 단백질).
도 24는 이식 후 4주 시점에 군별로 비중 (A) 및 소변 크레아티닌 (B)에서 변화의 요약을 도시한다 (ANOVA 분석) - A: 군 ID에 의한 델타 비중의 일원 분석; B: 군 ID에 의한 델타 Ucre의 일원 분석 (Ucre: 소변 크레아티닌). 전체적으로, 부분-신장절제술 설치류 모델 내에 세포/생체물질 구조물의 도입은 SRC와 비교하여, 1개월의 기간에 걸쳐 신장 생리학의 핵심 지표에 영향을 주지 않았다.
부분-신장절제술 설치류 모델 내에 세포/생체물질 구조물의 도입은 또한, 나머지 신장의 조직학에 별다른 영향을 주지 않았다.
도 25는 부분-신장절제 후 4주된 래트를 도시한다; 신장 외부 수질 (내측부); HE, x400. 배치 A (도 25의 위쪽 열), 농축핵으로 특징되는 세뇨관 괴사 (배치 1에서 기술됨) 역시 래트 번호 (HN-16과 HN-18)에서 관찰되었지만 HN-7과 HN-10에서 관찰되지 않았는데, 이들은 신장 연조직 내에 유의미한 병소를 보이지 않았다. 배치 B (도 25의 아래쪽 열); 외부 수질의 내측부에서 농축핵을 보이는 최소, 초점 세뇨관 괴사가 1마리 래트 (HN11)에서 관찰되었지만 나머지 동물 (HN-12, HN-13과 HN-14)에서 관찰되지 않았고, 따라서 정상 한계 (normal limit) 내에 있는 것으로 간주되었다.
요약하면, 설치류 부분-신장절제술 모델 내로 선별된 신장 세포/생체물질 네오-신장 확대 원형의 이식은 나머지 신장 생리학 또는 조직학에 영향을 주지 않는다.
실시예 5 - 생체반응 신장 세포의 분리 & 특성화
빈혈증과 함께 특발적 진행성 만성 신장 질환 (CKD)을 갖는 수컷 돼지 성체 (Sus scrofa)가 연령이 대등한 정상 돼지 신장 조직과 직접 비교하여 세포 성분을 평가하고 특징을 분석하기 위한 미가공의 (fresh) 병든 신장 조직을 제공하였다. 수거시의 신장 조직에 대한 조직학적 조사 결과, 신장 조직은 다병소 섬유증과 함께 중증의 광범위 만성 간질 섬유증 및 반월상 사구체신염으로 특징지어졌다. 임상 화학은 질소혈증 (혈중 우레아 질소 및 혈청 크레아티닌의 증가) 및 약한 빈혈증 (약간의 헤마토크릿 감소 및 떨어진 헤모글로빈 수준)을 확인시켜 주었다. 세포를 분리하고, 증대시키고, 병든 신장 조직 및 정상 신장 조직 모두로부터 특성화되었다. 문헌 [참조: Presnell et al., WO/2010/056328, 전체가 참고문헌으로 본원에 편입됨]의 도 1에 도시되는 바와 같이, 고모리 (Gomori) 트리크롬 염색은 정상 신장 조직과 비교하여 병든 신장 조직에서 섬유증 (화살표로 나타내는 청색 염색)을 강조한다. 쿠불린:메갈린을 발현하고 수용체-매개된 알부민 수송을 할 수 있는 기능성 세뇨관 세포가 정상 및 병든 신장 조직 모두로부터 증식되었다. 또한, 에리트로포이에틴 (EPO)-발현 세포가 배양물 중에 존재하고, 다수의 계대 및 동결/해동 사이클을 통해 유지되었다. 또한, 분자 분석은 정상 및 병든 조직 모두로부터의 EPO-발현 세포가, EPO 및 vEGF를 비롯한 다른 저산소-조절되는 유전자 표적물의 HIF1α-유도된 유도와 함께, 시험관내에서 저산소 상태에 반응한다는 것을 확인시켜 주었다. 세포는 콜라게나아제 + 디스파아제를 사용한 효소적 분해를 통해 돼지 신장 조직으로부터 분리되었으며, 또한 단순 기계적 분해 및 체외이식 실험을 수행함으로써 별도의 실험에서 분리되었다. 계대 2에서, epo-발현 세포를 포함하는 체외이식-유래된 세포 배양물을 대기 (21%) 및 가변 저산소 (< 5%) 배양 조건 모두에서 배양함으로써 저산소 노출이 EPO 유전자 발현을 상향조절하는가를 측정하였다. 설치류 배양물로 주목되는 바와 같이 (실시예 3 참조), 정상 돼지는 산소-의존적 발현 및 EPO 유전자 조절을 보였다. 놀랍게도, 문헌 [참조: Presnell et al., WO/2010/056328, 전체가 참고문헌으로 본원에 편입됨]의 도 2에 도시되는 바와 같이, CKD 돼지의 요독/빈혈 상태에도 불구하고 (헤마토크릿 < 34, 크레아티닌 > 9.0), EPO 발현 세포는 조직으로부터 용이하게 분리 및 증식되었으며, EPO 유전자의 발현이 여전히 저산소 상태로 조절되었다. 문헌 [참조: Presnell et al., WO/2010/056328, 전체가 참고문헌으로 본원에 편입됨]의 도 3에 도시되는 바와 같이, 증식된 배양물 중의 세포는 세뇨관-유사 구조물로의 자가-형성 능력을 나타내었다. 문헌 [참조: Presnell et al., WO/2010/056328, 전체가 참고문헌으로 본원에 편입됨]의 도 4에 도시되는 바와 같이, 배양물 (계대 3) 중 기능성 세뇨관 세포의 존재가 배양된 세포에 의한 FITC-컨주게이션된 알부민의 수용체-매개된 흡수를 관찰함으로써 확인되었다. 녹색 도트 (가는 백색 화살표로 표시됨)는 세뇨관 세포-특이적 수용체인 메갈린 및 쿠빌린에 의해 매개되는 세포내이입된 플루오레세인-컨주게이션된 알부민을 나타내며, 이는 기능성 세뇨관 세포에 의한 단백질 재흡수를 나타낸다. 청색 염색 (굵은 백색 화살표로 표시됨)은 훽스트 (Hoescht)-염색된 핵이다. 종합하면, 이들 데이터는 기능성 세뇨관 및 내분비 세포가 돼지 신장 조직으로부터, 심지어 CKD로 심각하게 손상된 신장 조직에서도 분리되고 증식될 수 있다는 것을 제시한다. 또한, 이들 발견은 CKD를 치료하기 위한 자가 세포-기반 치료 생성물의 진전을 지지한다.
또한, EPO-생성 세포가 (실시예 1에서 기술되는 바와 같이) 정상 성인 인간 신장으로부터 효소적으로 분리되었다. 문헌 [참조: Presnell et al., WO/2010/056328, 전체가 참고문헌으로 본원에 편입됨]의 도 5에 도시되는 바와 같이, 분리 절차는 초기 조직에서보다 분리 후 더욱 많은 상대적 EPO 발현을 초래하였다. 문헌 [참조: Presnell et al., WO/2010/056328, 전체가 참고문헌으로 본원에 편입됨]의 도 6에 도시되는 바와 같이, 인간 EPO 생성 세포를 EPO 유전자 발현 보유와 함께 배양물에 유지시킬 수 있다. 인간 세포를 단순한 조직-배양 처리된 플라스틱 또는 예를 들어 피브로넥틴 또는 콜라겔과 같은 일부 세포외 매트릭스로 코팅된 플라스틱 상에서 배양/증식시켰으며, 모두가 시간 경과에 따른 EPO 발현을 지지하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 6 - 특정 생체반응성 신장 세포의 분리 & 농축
신장 세포 분리: 간단히, 10개의 2주령 수컷 루이스 (Lewis) 래트 신장의 배치를 시판자 (Hilltop Lab Animals Inc.)로부터 구입하고, 약 4℃의 비아스판 (Viaspan) 보존 배지에서 하룻밤 동안 운반하였다. 본원에서 기술되는 모든 단계를 멸균 유지를 위해 생물학적 안전 캐비넷 (BSC)에서 수행하였다. 신장을 행크 (Hank) 균형 염 용액 (HBSS)에 3회 세척하여 비아스판 보전 배지를 세척하였다. 3회 세척한 후, 잔류 신장 캡슐 및 모든 잔류 간질 조직을 제거하였다. 또한, 대신배를 마이크로 박리 기술을 이용하여 제거하였다. 그 이후, 신장을 무균 메스를 사용하여 슬러리로 세분하였다. 그 이후, 슬러리를 50 ml 원추형 원심분리 튜브에 옮기고 무게를 재었다. 소규모의 시료를 RNA를 위해 수집하고, RNAse-비함유 무균 1.5 ml 마이크로-원심분리 튜브에 놓고, 액체 질소에서 빠르게 냉동시켰다. 냉동시킨 후 분석할 때까지 -80℃ 냉동기로 옮겼다. 10개의 어린 (juvenile) 신장의 조직 중량은 약 1 g이었다. 배치의 중량에 기초하여, 분해 배지를 조직 1 g 당 분해 배지 20 ml가 되도록 조절하였다. 이러한 절차를 위한 분해 완충액은 HBSS 중의 4 단위의 디스파아제 1 (Stem Cell Tech), 300 단위/ml의 콜라게나아제 타입 IV (Worthington) 및 5 mM CaCl2 (Sigma)를 포함하였다.
적합한 용적의 미리-가온된 분해 완충액을 튜브에 가한 후, 밀폐시키고, 20분 동안 37℃의 록커에 놓았다. 이러한 첫 번째 분해 단계는 적혈구 세포를 제거하고, 잔류 조직의 분해를 증진시킨다. 20분 후, 튜브를 꺼내어 BSC에 놓았다. 조직을 튜브의 바닥에 가라앉히고, 상등액을 제거하였다. 그 이후, 잔류 조직을 출발 용적과 같은 새로운 분해 완충액으로 보충하였다. 튜브를 다시 추가의 30분 동안 37℃의 록커 상에 놓았다.
30분 후, 분해 혼합물을 70 ㎛ 세포 여과기 (BD Falcon)를 통해 동일 용적의 중화 완충액 (DMEM w/10% FBS)으로 피펫팅하여 분해 반응을 정지시켰다. 그 이후, 세포 현탁액을 5분 동안 300 xg에서 원심분리하여 세척하였다. 원심분리 후, 펠릿을 20 ml KSFM 배지에 재현탁시키고, 트리판 블루 배제를 이용한 세포 계수 및 생존능 평가를 위한 시료를 수득하였다. 세포 계수 후, 1 x 106개의 세포를 RNA를 위해 수집하고, PBS로 세척한 후, 액체 질소에 급속 냉동시켰다. 나머지 세포 현탁액을 KSFM 배지로 50 ml이 되게 한 후, 5분 동안 300 xg에서 원심분리하여 재차 세척하였다. 세척 후, 세포 펠릿을 KSFM ml 당 1.5 x 107개 세포의 농도로 재현탁시켰다.
이어서, 5 ml의 신장 세포 현탁액을 15 ml 원추형 원심분리 튜브 (BD Falcon)에서 5 ml의 30% (w/v) Optiprep®에 가하고, 6번 역위시켜 혼합하였다. 이로써 15% (w/v) Optiprep®의 최종 혼합물을 형성하였다. 역위 후, 튜브를 1 mL PBS로 조심스럽게 층지게 하였다. 튜브를 브레이크 없이 15분 동안 800 xg에서 원심분리시켰다. 원심분리 후, 튜브를 꺼내고, 혼합 구배물의 상단에 세포 밴드를 형성하였다. 여기에는 또한 적혈구, 죽은 세포, 및 얼마간의 소과립 세포, 얼마간의 epo-생성 세포, 얼마간의 세뇨관 세포 및 얼마간의 내피 세포를 포함하는 소수의 생존 세포 집단을 포함하는 펠릿이 존재하였다. 밴드를 피펫을 사용하여 조심스럽게 꺼내어 또 다른 15 ml 원추형 튜브로 옮겼다. 구배 배지을 흡인시켜 제거하고, 펠릿을 1 ml KSFM에 재현탁시켰다. 그 이후, 밴드 세포 및 펠릿 세포를 다시 합하고, KSFM을 사용하여 수집된 밴드 용적의 적어도 3배 희석물에 재현탁시킨 후, 5분 동안 300 xg에서 원심분리시켜 세척하였다. 세척 후, 세포를 20 ml의 KSFM에 재현탁시키고, 세포 계수를 위한 시료를 수집하였다. 트리판 블루 배제로 세포를 계수한 후, 1 x 106개의 세포를 RNA 시료를 위해 수집하고, PBS로 세척한 후, 액체 질소에 급속 냉동시켰다.
밀도 구배 분리를 이용한 특정한 생체활성 신장 세포의 생존능 및 배양 성능을 증진시키기 위한 전-배양물 (pre-culture) '정화 (clean-up)': 배양을 위한 순수한 생존 세포 집단을 수득하기 위해서, 먼저 세포 현탁액을 "신장 세포 분리"에서 상술된 바와 같이 생성하였다. 임의 단계로서 또한 초기 제제를 정화하기 위한 수단으로서, 무균 등장 완충액에 현탁된 총 1 x 108개 이하의 세포를, 스톡 60% 요오딕산올로부터 실온에서 제조된 동일 용적의 30% Optiprep®과 1:1로 철저히 혼합하고 (이로써 최종 15% Optiprep®를 수득함), 6번 역위시켜 철저히 혼합하였다. 혼합 후, 1 ml PBS 완충액을 혼합된 세포 현탁액 상단에 조심스럽게 층지게 하였다. 그 이후, 구배 튜브를 원심분리기에 조심스럽게 적하하여 적절히 균형을 맞추었다. 구배 튜브를 브레이크 없이 25℃에서 15분 동안 800 xg에서 원심분리하였다. 정화된 세포 집단 (생존 및 기능성 집합관, 세뇨관, 내분비, 사구체 및 혈관 세포를 포함)은 6%와 8% (w/v) Optiprep® 사이에 분할되며, 이는 1.025 내지 1.045 g/mL의 밀도에 상응한다. 다른 세포 및 파편은 튜브의 바닥에 펠릿화되었다.
신장 세포 배양: 이어서, 합한 세포 밴드 및 펠릿을 항생제/항진균제와 함께 5% (v/v) FBS, 2.5 ㎍ EGF, 25 mg BPE, 1X ITS (인슐린/트랜스페린/나트륨 셀레나이트 배지 보충물)를 포함하는 DMEM (높은 글루코즈)/KSFM의 50:50 혼합물 150 ml에서 30,000개 세포/cm2의 세포 농도로 조직 배양 처리된 삼중 플라스크 (Nunc T500) 또는 등가물에 플레이팅하였다. 세포를 세포에 대해 21% 대기 산소 수준을 제공하면서 2 내지 3일 동안 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 2일 후, 배지를 교환하고, 배양물을 24시간 동안 CO2/질소 가스 멀티가스 가습 인큐베이터 (Sanyo)에 의해 제공되는 2% 산소-수준 환경에 놓았다. 24시간 배양한 후, 세포를 1X PBS 60 ml로 세척한 후, 0.25% (w/v) 트립신/EDTA (Gibco) 40 ml를 사용하여 떼어내었다. 떼어낸 후, 세포 현탁액을 10% FBS를 포함하는 동일 용적의 KSFM으로 중화시켰다. 그 이후, 세포를 10분 동안 300 xg에서 원심분리하여 세척하였다. 세척 후, 세포를 KSFM 20 ml에 재현탁시키고, 50 ml 원추형 튜브로 옮긴 후, 세포 계수를 위해 시료를 수집하였다. 트리판 블루 배제로 생존 세포를 계수한 후, RNA 시료를 위해 1 x 106개 세포를 수집하고, PBS로 세척한 후, 액체 질소에 급속 냉동시켰다. 세포를 PBS로 다시 세척하고, 5분 동안 300 xg에서 원심분리시켜 수집하였다. 세척된 세포 펠릿을 3.75 x 107개 세포/ml의 농도로 KSFM에 재현탁시켰다.
밀도 단계 구배 분리를 이용한 특정한 생체활성 신장 세포의 농축: 주로 신장 세뇨관 세포로 구성되나 소수 아집단의 다른 세포 유형 (집합관, 사구체, 혈관 및 내분비 세포)을 포함하는 배양된 신장 세포를 다중 농도 (w/v)의 요오딕산올 (Optiprep)로 제조된 밀도 단계 구배를 이용하여 이들의 성분 아집단으로 분리하였다. 배양물을 수거하고 구배물에 적용하기 최대 24시간 전 동안 저산소 환경에 놓았다. 4개의 상이한 밀도 배지를 멸균된 15 mL 원추형 튜브에서 각각의 상단에 층을 이루게 하되, 바닥에는 가장 밀도가 높은 용액을 놓고 상단에는 가장 밀도가 낮은 용액이 층을 이루게 함으로써 단계적 구배물을 제조하였다. 세포를 단계 구배물의 상단에 적용하고, 원심분리시켜, 세포 집단을 크기 및 입도에 기초하여 다수의 밴드로 분리시켰다.
간단히, 희석제로서 KFSM 배지를 사용하면서 7, 11, 13 및 16% Optiprep® (60% w/v 요오딕산올) 밀도를 만들었다. 가령, 7%(w/v) Optiprep® 50 ml에 대해 스톡 60% (w/v) 요오딕산올 5.83 ml를 KSFM 배지 44.17 ml에 가하고, 역위시켜 잘 혼합하였다. 무균 모세관에 연결된 무균 L/S 16 타이곤 (Tygon) 튜빙이 적하된 연동 펌프 (Master Flex L/S)를 2 ml/min의 유속으로 설정하고, 2 ml의 4개의 용액 각각을 무균 원추형 15 mL 튜브로 적하하되, 16% 용액을 사용하여 개시한 후, 13% 용액, 11% 용액 및 7% 용액으로 이어졌다. 마지막으로, 7.5 x 107개 배양된 설치류 신장 세포를 포함하는 세포 현탁액 2 mL를 단계 구배물의 상단에 적하하였다 (현탁액은 '신장 세포 배양'에서 상술된 바와 같이 생성하였다). 중요한 것으로서, 펌프가 구배 용액을 튜브로 전달하는 것을 개시할 때, 적절한 계면이 각각의 구배층 간에 형성되도록 유체를 45°각도에서 튜브의 측면 아래로 서서히 유동시키는 주의가 필요하다. 그 이후, 세포가 적하된 단계 구배물을 브레이크 없이 20분 동안 800 xG에서 원심분리시켰다. 원심분리 후, 각각의 계면이 방해되지 않도록 튜브를 조심스럽게 이동시켰다. 5개의 상이한 세포 분획물이 생겼다 (4개의 밴드 및 펠릿) (B1-B4 + 펠릿) [참조: 도 26, 좌측 원추형 튜브]. 각각의 분획물을 멸균된 1회용 망울 (bulb) 피펫 또는 5 ml 피펫을 사용하여 수집하고, 표현형 및 기능을 특징지었다 (문헌 [참조: Presnell et al., WO/2010/056328, 전체가 참고문헌으로 본원에 편입됨]의 실시예 10 참조). 설치류 신장 세포 현탁액을 분리한 직후 단계-구배 분획화시키는 경우, 분획물은 1.062 내지 1.088 g/mL의 밀도로 세뇨관 세포 (및 집합관으로부터의 일부 세포를 포함) 절편을 농축시켰다. 이와는 대조적으로, 밀도 구배 분리를 생체외 배양한 후 수행하는 경우, 분획물은 1.051 내지 1.062 g/mL의 밀도로 세뇨관 세포 (및 집합관으로부터의 일부 세포를 포함) 절편을 농축시켰다. 유사하게, 설치류 신장 세포 현탁액을 분리한 직후 단계-구배 분획화하는 경우, 분획물은 1.025 내지 1.035 g/mL의 밀도에서 epo-생성 세포, 사구체 족세포 및 혈관 세포 ("B4") 분리물을 농축시켰다. 이와는 대조적으로, 밀도 구배 분리를 생체외 배양 후 수행하는 경우, 분획물은 1.073 내지 1.091 g/mL의 밀도에서 epo-생성 세포, 사구체 족세포 및 혈관 세포 ("B4") 분리물을 농축시켰다. 중요하게는, 세포의 "B2" 및 "B4" 분획물로의 배양후 (post-culture) 분포는 배양물을 저산소 배양 환경 (저산소는 수거 및 단계-구배 절차 전 21% (대기) 미만의 산소 수준으로 정의됨)에 (약 1시간 내지 약 24시간의 기간 동안) 노출시킴으로써 증진되었다 (밴드 분포에 대한 저산소-효과에 관한 추가의 상세한 사항은 실시예 7에 제공된다).
각각의 밴드를 3배 용적의 KSFM으로 희석시켜 제척하고, 잘 혼합한 후, 300 xg에서 5분 동안 원심분리시켰다. 펠릿을 KSFM 2 ml에 재현탁시키고, 생존 세포를 트리판 블루 배제 및 혈구계를 사용하여 계수하였다. RNA 시료를 위해 1 x 106개 세포를 수집하고, PBS에 세척한 후, 액체 질소에 급속 냉동시켰다. B2 및 B4로부터의 세포를, 챨스 리버 래보러토리즈 (Charles River Laboratories)에서 2-단계 5/6 신장절제술을 통해 만들어진 요독 및 빈혈 암컷 래트로의 이식 조사에 사용하였다. 에리트로포이에틴 및 vEGF의 산소-조절된 발현, 사구체 마커 (네프린, 포도신)의 발현 및 혈관 마커 (PECAM)의 발현을 비롯한 B4의 특징을 정량적 실시간 PCR로 확인하였다. 'B2' 분획물의 표현형을 E-카드헤린, N-카드헤린 및 아쿠아포린-2의 발현을 통해 확인하였다. 문헌 [참조: Presnell et al., WO/2010/056328]의 도 49a 및 49b를 참조한다.
따라서, 단계 구배 방법이 이용은 희박한 epo-생성 세포 집단 (B4)의 농축뿐만 아니라 상대적으로 농축된 기능성 세뇨관 세포 분획물 (B2)을 생성하는 수단을 제공한다 (문헌 [참조: Presnell et al., WO/2010/056328, 전체가 참고문헌으로 본원에 편입됨]의 도 50 & 51 참조). 또한, 단계 구배 방법은 EPO-생성 및 세뇨관 세포를 적혈구, 세포 파편 및 다른 잠재적으로 바람직하지 못한 세포 유형, 예를 들면, 큰 세포 응집체 및 특정 유형의 면역 세포로부터 분리시킨다.
단계 구배 절차는 세포 성분의 우수한 분리를 제공하기 위해 이용되는 특정 밀도와 관련하여 조정이 필요할 수 있다. 구배를 조정하는 바람직한 접근법은 1) 구배물의 바닥에서는 최고 밀도 (가령, 16 내지 21% Optiprep)이고 구배물의 상단에서는 상대적으로 저밀도 (가령, 5 내지 10% Optiprep)인 연속 밀도 구배를 수행하는 것을 포함한다. 표준 방법에 따라 (Axis Shield) 임의의 표준 밀도 구배 용액 (피콜, 퍼콜, 슈크로즈, 요오딕산올)을 사용하는 연속 구배물이 제조될 수 있다. 관심 세포를 연속 구배물에 적하하고, 브레이크 없이 20분 동안 800 xg에서 원심분리한다. 유사한 크기 및 입도의 세포가 구배물에서 함께 분리되는 경향이 있으므로, 구배물에서의 상대적 위치가 측정될 수 있고 또한 그 위치의 용액의 비중이 측정될 수 있다. 따라서, 그 후에 특정 조건 하에서 밀도 구배물을 가로지르는 능력에 기초하여 특정 세포 집단을 분리하는 것에 초점을 맞춘 규정된 단계 구배가 유도될 수 있다. 이러한 최적화는 건강한 조직과 대비하여 비건강 조직으로부터 세포를 분리하는 경우 또는 상이한 종으로부터 특정 세포를 분리하는 경우에 이용하기 위해 필요할 수 있다. 가령, 최적화는 래트에서 확인된 특정 B2 및 B4 아집단이 다른 종으로부터 분리가능하다는 것을 확실히 하기 위해 개 및 인간 신장 세포 배양물 모두에 대해 수행되었다. 설치류 B2 및 B4 아집단의 분리를 위한 최적 구배는 7%, 11%, 13% 및 16% Optiprep (w/v)으로 이루어진다. 개 B2 및 B4 아집단의 분리를 위한 최적 구배는 7%, 10%, 11% 및 16% Optiprep (w/v)으로 이루어진다. 인간 B2 및 B4 아집단의 분리를 위한 최적 구배는 7%, 9%, 11%, 16% (w/v)로 이루어진다. 따라서, 배양된 설치류, 개 및 인간 신장 세포로부터의 B2 및 B4의 국지화 밀도 범위가 표 2에 제공된다.
종 밀도 범위
　 종 밀도 범위 g/ml
단계 구배 밴드 설치류 개 인간
B2 1.045-1.063g/ml 1.045-1.058g/ml 1.045-1.052g/ml
B4 1.073-1.091g/ml 1.063-1.091g/ml 1.063-1.091g/ml
실시예 7 - 구배 전 저-산소 배양이 밴드 분포, 조성 및 유전자 발현에 영향을 준다 원형 B2 및 B4의 분포 및 조성에 대한 산소 조건의 영향을 측정하기 위해서, 상이한 종으로부터의 neo-신장 세포 제조물을 구배 단계 전에 상이한 산소 조건에 노출시켰다. 설치류 neo-신장 증대 (NKA) 세포 제조물 (RK069)을 상술된 바와 같이 래트 세포 분리 및 배양 개시를 위한 표준 절차를 이용하여 확립하였다. 모든 플라스크를 21% (대기) 산소 조건에서 2 내지 3일 동안 배양하였다. 배지를 교환한 후, 절반의 플라스크를 2% 산소로 설정된 산조-조절 인큐베이터로 옮기고 나머지 플라스크는 추가의 24시간 동안 21% 산소 조건에서 유지시켰다. 그 이후, 상술된 표준 효소적 수거 절차를 이용하여 세포를 각 세트의 조건으로부터 수거하였다. 표준 절차에 따라 단계 구배물을 제조하고, "표준산소" (21% 산소) 및 "저산소" (2% 산소) 배양물을 개별적으로 수거한 후, 동일한 단계 구배물에 나란히 적용하였다 (도 27). 구배물을 통한 세포의 분포는 21% 및 2% 산소-배양된 배치에서 상이하였다 (표 3). 구체적으로, B2의 수율이 저산소 조건에서 증가하고, 동시에 B3은 감소하였다. 또한, B4-특이적 유전자 (가령, 에리트로포이에틴)의 발현은 저산소-배양된 세포로부터 생성되는 구배물에서 향상되었다 (문헌 [참조: Presnell et al., WO/2010/056328, 전체가 본원에 참고문헌으로 편입됨]의 도 73 참조).개 세포 분리 및 배양에 대한 표준 절차 (설치류 분리 및 배양 절차와 유사)를 이용하여 상술된 바와 같이 개 NKA 세포 제조물 (DK008)을 확립하였다. 모든 플라스크를 21% (대기) 산소 조건에서 4일 동안 배양한 후, 일 서브세트의 플라스크는 24시간 동안 저산소 (2%) 조건으로 옮기고 일 서브세트의 플라스크는 21%의 산소 조건에 유지시켰다. 그 이후, 각 세트의 플라스크를 수거하고 동일한 단계 구배물에 적용시켰다 (도 28). 래트 결과 (실시예 6)과 유사하게, 저산소-배양된 개 세포는 대기 산소-배양된 개 세포와는 상이하게 구배물을 통해 분포되었다 (표 3). 또한, B2의 수율은 구배 전 저산소 노출로 증가하였고, 동시에 B3로의 분포는 감소되었다.
　 래트 (RK069) 개 (DK008)
　 2% O2 21% O2 2% O2 21% O2
B1 0.77% 0.24% 1.20% 0.70%
B2 88.50% 79.90% 64.80% 36.70%
B3 10.50% 19.80% 29.10% 40.20%
B4 0.23% 0.17% 4.40% 21.90%
상기 자료는 저산소로의 구배전 (pre-gradient) 노출이 B2의 조성 및 B4로의 특정한 특수 세포 (에리트로포이에틴-생성 세포, 혈관 세포 및 사구체 세포)의 분포를 증진시킨다는 것을 보여준다. 따라서, 저산소 배양 및 이어지는 상술된 바와 같은 밀도-구배 분리가 종 전체에 걸쳐서 ‘B2’ 및 ‘B4’ 세포 집단을 생성하는데 효과적인 방법이다. 실시예 8 - 인간 신장으로부터 세뇨관/사구체 세포의 분리
상술된 바와 같은 효소적 분리 방법에 의해 정상 인간 신장 조직으로부터 세뇨관 및 사구체 세포를 분리하고 증대시켰다. 상술된 구배 방법으로 세뇨관 세포 분획물을 생체외에서 배양후 농축시켰다. 문헌 [참조: Presnell et al., WO/2010/056328, 전체가 본원에 참고문헌으로 편입됨]의 도 68에 도시되는 바와 같이, 표현형적 특성은 분리 및 증대시 유지되었다. 표지된 알부민의 흡수로 평가되는 세뇨관 세포 기능도 반복적 계대 및 저온보관 후 유지되었다. 문헌 [참조: Presnell et al., WO/2010/056328, 전체가 본원에 참고문헌으로 편입됨]의 도 69는 세뇨관-농축된 세포 집단 및 세뇨관-고갈된 세포 집단을 3D 동적 배양으로 배양하는 경우 세뇨관 마커인 카드헤린이 세뇨관-농축된 세포 집단에서 현저히 증가한다는 것을 보여준다. 이는 세뇨관 세포의 농축이 세포를 3D 동적 환경에서 배양하는 경우 초기 농축도 이상으로 유지될 수 있다는 것을 입증한다. 실시예 7에서 기술된 바와 같은, 동일하게 배양된 신장 세포 집단을 유동 세포 분석하여 전방 산란 및 측면 산란을 조사하였다. 작고 덜 과립형인 EPO-생성 세포 집단이 인식가능했으며 (8.15%), 유동 세포 분석기의 분류능을 이용하여 작고 덜 과립형인 세포 집단의 양성 선별을 통해 분리하였다 (문헌 (참조: Presnell et al., WO/2010/056328, 전체가 본원에 참고문헌으로 편입됨]의 도 70 참조).
실시예 9 - 자가면역 사구체신염 환자 시료로부터 분리된 비분획된 신장 세포 혼합물의 특성화
비분획된 신장 세포 혼합물을 상술된 바와 같이 자가면역 사구체신염 환자 시료로부터 분리하였다. 신장 조직으로부터 분리되고 증대된 특정 신장 세포 아집단의 비편향적 유전자형 조성을 측정하기 위해서, 정량적 실시간 PCR (qRTPCR) 분석 [참조: Brunskill et al., supra 2008]을 이용하여 세포 아분획물 사이에서 차등적 세포-유형-특이적 및 경로-특이적 유전자 발현 패턴을 확인하였다. Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 표 6.1에 나타난 바와 같이, HK20은 자가면역 사구체신염 환자 시료이다. Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 표 6.2에 나타난 바와 같이, HK20 세포로부터 생성된 세포는 qRTPCR로 측정되는 바와 같이, 사구체 세포를 결여한다.
실시예 10 - 초점 분절 사구체경화증 피험자로부터 분리된 치료학적으로 관련된 신장 생체활성 세포 집단의 유전적 프로파일링
신장 조직으로부터 분리되고 증대된 특정한 신장 세포 아집단의 비편향적 유전자형 조성을 측정하기 위해서, 정량적 실시간 PCR (qRTPCR) 분석 [참조: Brunskill et al., supra 2008]를 이용하여 세포 아분획물 사이에서 차등적 세포-유형-특이적 및 경로-특이적 유전자 발현 패턴을 확인하였다. 사구체 대부분이 파괴된 초점 분절 사구체경화증 (FSGS) 피험자로부터 유래된 인간 제제 HK023을 수거 시의 B4 분획 중 사구체 세포의 존재에 대해 평가하였다. 간단히, 비분획된 (UNFX) 배양물을 생성하고 [참조: Aboushwareb et al., supra 2008], 표준 생검 절차를 이용하여 신장으로부터 취한 (4) 코어 생검 각각으로부터 독립적으로 유지시켰다. 생체외에서 UNFX를 (2) 계대한 후, 세포를 수거하고, (실시예 6에 기술되는 바와 같이) 밀도 구배 방법을 수행하여, 설치류, 개 및 기타 인간 표본에서 수행된 작업에 기초하여 내분비, 혈관 및 사구체 세포가 농축된 것으로 알려진, 아분획물 B4를 포함하는 아분획물을 생성하였다.
B4 분획물을 부력 밀도가 1.063 내지 1.091 g/mL인 선명한 밴드의 세포로 보이는, HK023의 각각의 독립적인 UNFX 시료로부터 분리하여 수집하였다. 각각의 시료로부터 RNA를 분리하고 정량적 실시간 PCR에 의해 포도신 (사구체 세포 마커) 및 PECAM (내피 세포 마커)의 발현에 대해 조사하였다. 중증의 FSGS 피험자로부터의 생검-유래 시료로부터 예상되는 바와 같이, B4 분획물에서 포도신(+) 사구체 세포의 존재가 일치하지 않았으며, 시료의 2/4에서 포도신이 검출되지 않았다. 이와는 대조적으로, PECAM+ 혈관 세포는 생검-개시된 배양물의 4/4의 B4 분획물에 일관되게 존재하였다. 따라서, B4 분획물은 심지어 중증 질환 상태의 인간 신장으로부터도, 1.063 내지 1.091 g/mL의 밀도 범위에서 분리될 수 있다.
FSGS 피험자로부터 분리된 아분획물 B4에서 사구체 및 혈관 세포의 검출을 위한 포도신 및 PECAM의 발현.
HK023 / 생검 RQ (포도신)/B4 RQ (PECAM)/B4
#1 / p2 0.188 0.003
#2 / p2 ND 0.02
#3 / p2 40.1 0.001
#4 / p2 ND 0.003
또한, Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 표 7.2에 나타난 바와 같이, 인간 시료 (HK018)는 밀도 구배 원심분리 후 qRTPCR에 의해 포도신 (사구체 마커)이 검출되지 않음을 보여주었다. 실시예 11 - 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)를 이용한 생존 신장 세포 유형의 농축/고갈
하나 이상의 분리된 신장 세포를 농축시키고/시키거나 하나 이상의 특정한 신장 세포 유형을 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)를 이용하여 분리된 일차 신장 조직으로부터 고갈시킬 수 있다.
시약: 70% 에탄올; 세척 완충액 (PBS); 50:50 신장 세포 배지 (50% DMEM 높은 글루코즈): 50% 각질세포-SFM; 트리판 블루 0.4%; 표적 신장 세포 집단에 대한 일차 항체, 예를 들면, 신장 내피 세포에 대한 CD31 및 신장 사구체 세포에 대한 네프린. 짝지은 이소형 특이적 형광 이차 항체; 염색 완충액 (0.05% BSA, PBS 중)
절차: 생물학적 안전 캐비넷 (BSC)를 세척하기 위한 표준 절차 후, 일차 분리 또는 배양된 세포로부터의 신장 세포의 단일 세포 현탁액을 T500 T/C 처리된 플라스크로부터 수득하고, 신장 세포 배지에 재현탁한 후, 얼음 상에 놓을 수 있다. 그 이후, 세포수 및 생존능을 트리판 블루 배제 방법을 이용하여 측정한다. 예를 들어 이질 세포 집단으로부터의 사구체 세포 또는 내피 세포의 신장 세포 농축/고갈을 위해 적어도 70%의 생존능을 갖는 10 내지 50e6의 생존 세포를 수득한다. 그 이후, 이질 신장 세포 집단을 출발 농도 1 ug/0.1 ml 염색 완충액/1 x 106 세포 (필요한 경우, 적정)의 표적 세포 유형에 특이적인 일차 항체로 염색한다. 표적 항체를 CD31 PE (신장 내피 세포에 특이적)와 같은 항체와 컨주게이션되거나 네프린 (신장 사구체 세포에 특이적)과 같은 항체와 컨쥬게이션되지 않을 수 있다.
이어서, 세포를 얼음 상에서 또는 빛으로부터 보호된 4℃에서 30분 동안 염색한다. 30분 배양한 후, 세포를 5분 동안 300 xg에서 원심분리시켜 세척한다. 그 이후, 펠릿을 컨주게이션된 이소타입 특이적 이차 항체가 필요한지의 여부에 따라 PBS 또는 염색 완충액에 재현탁시킨다. 세포가 형광색소 컨주게이션된 일차 항체로 표지되는 경우, 세포를 10e7 세포 당 2 ml의 PBS에 재현탁시키고, FACS Aria 또는 동등한 세포 분류기에서 분류를 수행한다. 세포가 형광색소 컨주게이션된 항체로 표지되지 않는 경우, 세포를 개시 농도 1 ㎍/0.1 ml/1e6 세포로 이소타입 특이적 형광염색 컨주게이션된 이차 항체로 표지한다.
이어서, 세포를 얼음 상에서 또는 빛으로부터 보호된 4℃에서 30분 동안 염색한다. 30분 배양한 후, 세포를 5분 동안 300 xg에서 원심분리시켜 세척한다. 원심분리 후, 펠릿을 5e6/ml PBS의 농도로 PBS에 재현탁시킨 후, 4 ml/12x75mm를 무균 튜브에 옮긴다.
FACS Aria는 제조자의 교시 (BD FACs Aria User Manual)에 따라 생존 세포 무균 분류를 위해 준비된다. 시료 튜브를 FACs Aria에 적하하고, 수집이 개시된 후 PMT 전압을 조절한다. 특정 파장을 이용하여 형광 강도로 신장 특이적 세포 유형을 선별하도록 게이트를 드로잉한다. 또 다른 게이트를 음성 집단을 선별하도록 드로잉한다. 양성 표적 집단 및 음성 집단을 캡슐화하도록 목적하는 게이트를 드로잉하자마자, 세포를 제조업체의 교시에 따라 분류한다.
양성 표적 집단을 하나의 15 ml 원추형 튜브에 수집하고, 음성 집단을 1 ml의 신장 세포 배지로 채워진 또 다른 15 ml 원추형 튜브에 수집한다. 수집 후, 각각의 튜브로부터의 시료를 유동 세포 분석하여 순도를 측정한다. 수집된 세포를 5분 동안 300 xg에서 원심분리하여 세척하고, 펠릿을 추가 분석 및 실험을 위해 신장 세포 배지에 재현탁시킨다.
실시예 12 - 자기적 세포 분류를 이용한 신장 세포 유형의 농축/고갈
하나 이상의 분리된 신장 세포를 농축시키고/시키거나 하나 이상의 특정한 신장 세포 유형을 분리된 일차 신장 조직으로부터 고갈시킬 수 있다.
시약: 70% 에탄올; 세척 완충액 (PBS); 50:50 신장 세포 배지 (50% DMEM 높은 글루코즈): 50% 각질세포-SFM; 트리판 블루 0.4%; 러닝 완충액 (PBS, 2 mM EDTA, 0.5% BSA), 세정 완충액 (PBS, 2 mM EDTA), 세척 용액 (70% v/v 에탄올), Miltenyi FCR 차단 시약, IgG 이소타입에 특이적인 Miltenyi 마이크로비드, 표적 항체, 예를 들면, CD31(PECAM) 또는 네프린 또는 이차 항체.
절차: 생물학적 안전 캐비넷 (BSC)를 세척하기 위한 표준 절차 후, 일차 분리 또는 배양된 세포로부터의 신장 세포의 단일 세포 현탁액을 수득하고, 신장 세포 배지에 재현탁한다. 세포수 및 생존능을 트리판 블루 배제 방법을 이용하여 측정한다. 예로써, 이질 세포 집단으로부터의 사구체 세포 또는 내피 세포의 신장 세포 농축/고갈을 위해 적어도 70%의 생존능을 갖는 10e6 내지 4e9의 생존 세포를 수득한다.
농축/고갈 접근을 위한 최적 분리를 관심 표적 세포에 기초하여 측정한다. 네프린 항체를 사용한 표적 빈도 10% 미만의 예로써, 사구체 세포의 농축을 위해, Miltenyi autoMACS 또는 등가 장치 프로그램 POSSELDS (민감 모드에서 이중 양성 선별)을 이용한다. 표적 빈도 10% 초과의 고갈을 위해, Miltenyi autoMACS 또는 등가 장치 프로그램 DEPLETES (민감 모드에서 고갈)을 이용한다.
생존 세포를 15 ml 원추형 원심분리 튜브에 0.05% BSA와 함께 1 ㎍/10e6 세포/0.1 ml PBS를 가함으로써 표적물 특이적 일차 항체, 예를 들면, 네프린 rb 폴리클로날 항체로 표지한 후, 4℃에서 15분 동안 배양하였다.
표지 후, 1 내지 2 ml 완충액/10e7 세포를 가하고 5분 동안 300 xg에서 원심분리하여 세포를 세척함으로써 결합되지 않은 일차 항체를 제거하였다. 세척 후, 0.05% BSA를 갖는 1 ㎍/10e6/0.1 ml PBS의 이소타입 특이적 이차 항체, 예를 들면, 치킨 항-토끼 PE를 가한 후, 4℃에서 15분 동안 배양한다.
배양 후, 1 내지 2 ml 완충액/10e7 세포를 가한 후 5분 동안 300 xg에서 원심분리시켜 세포를 세척함으로써 결합되지 않는 이차 항체를 제거한다. 상등액을 제거하고, 세포 펠릿을 60 ㎕ 완충액/10e7 총 세포에 재현탁시킨 후, 20 ㎕ FCR 차단 시약/10e7 총 세포를 가하고, 이어서 잘 혼합한다. 20 ㎕의 직접적 MACS 마이크로비드 (가령, 항-PE 마이크로비드)를 가하고, 혼합한 후, 4℃에서 15분 동안 배양한다.
배양 후, 10 내지 20배 표지물 용적의 완충액을 가하고 5분 동안 300 xg에서 세포 현탁액을 원심분리하여 세포를 세척하고, 세포 펠릿을 500 ㎕ 내지 2 ml 완충액/10e8 세포로 재현탁시킨다.
제조업체의 교시에 따라, autoMACS 시스템을 세척하고, autoMACS를 사용하는 자기 세포 분리를 준비한다. 새로운 무균 수집관을 배출구 포트 아래에 놓는다. autoMACS 세포 분리 프로그램을 선택한다. 선별을 위해서는 POSSELDS 프로그램을 선택하고, 고갈을 위해서는 DEPLETES 프로그램을 선택한다.
표지된 세포를 수집 포트 (uptake port)에 삽입하고, 이어서 프로그램을 시작한다. 세포 선택 또는 고갈 후, 시료를 수집하고 사용시까지 얼음에 놓는다. 고갈되거나 선택된 시료의 순도를 유동 세포 분석으로 확인한다.
실시예 13 - 치료 가능성을 갖는 세포를 정상 및 만성-질환 신장 조직으로부터 분리하고 증대시킬 수 있다
본 조사의 목적은 고함량 분석 (HCA)을 통해 인간 NKA 세포의 기능 특성을 측정하는 것이다. 고함량 영상화 (HCI)는 다수의 시료에 걸쳐 2개 이상의 형광 프로브 (다중처리)를 사용하여 다수의 아세포 이벤트를 동시에 영상화하는 것을 제공한다. 고함량 분석 (HCA)는 고함량 영상화에 포착된 다수의 세포 파라미터를 동시에 정량적으로 측정하는 것을 제공한다. 간단히, 표준 생검 절차를 이용하여 진행된 만성 신장 질환 (CKD)을 갖는 5개의 인간 신장 및 3개의 비-CKD 인장 신장으로부터 취한 코어 생검으로부터의 비분획된 (UNFX) 배양물을 생성하고 [참조: Aboushwareb et al., supra 2008] 독립적으로 유지시킨다. 생체외에서 UNFX를 (2) 계대한 후, 세포를 수거하고, (도 2에서와 같이) 밀도 구배 방법을 수행하여 아분획물 B2, B3 및/또는 B4를 포함한 아분획물을 생성하였다.
인간 신장 조직을 Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 표 10.1에 요약되어 있는 바와 같이 비-CKD 및 CKD 인간 공여자로부터 생성하였다. Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 4는 HK17 및 HK19 시료의 조직병리학 특징을 나타낸다. 생체외 배양물을 모든 비-CKD (3/3) 및 CKD (5/5) 신장으로부터 확립하였다. 관심 영역 (ROI)를 규정하는 인간 NKA 세포에서의 알부민 수송에 대한 고함량 분석 (HCA)이 Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 5 (인간 NKA 세포에서 알부민 수송에 대한 HCA)에 나타나 있다. 비-CKD 및 CKD 신장으로부터 유래된 NKA 세포에서의 알부민 수송의 정량 비교가 Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 6에 나타나 있다. Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 6에 도시되는 바와 같이, 알부민 수송은 CKD-유래된 NKA 배양물에서 약화되지 않는다. 세뇨관-농축된 B2와 세뇨관 세포-고갈된 B4 아분획물 사이의 마커 발현에 대한 비교 분석이 Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 7 (CK8/18/19)에 도시된다.
세뇨관-농축된 B2와 세뇨관 세포-고갈 B4 아분획물 사이의 알부민 수송에 대한 비교 기능 분석이 Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 8에 도시되어 있다. 아분획물 B2는 근위 세뇨관 세포에 농축되므로 증가된 알부민-수송 기능을 나타낸다.
알부민 흡수: 24-웰 콜라겐 IV 플레이트 (BD Biocoat™)에서 컨플루언시 (confluency) 상태로 성장된 세포의 배양 배지를 18 내지 24시간 동안 1X 항진균제/항생제 및 2 mM 글루타민을 포함하는 페놀 레드-비함유, 혈청-비함유, 저-글루코즈 DMEM (pr-/s-/lg DMEM)으로 대체하였다. 검정 직전, 세포를 세척하고, 30분 동안 pr-/s-/lg DMEM + 10 mM HEPES, 2 mM 글루타민, 1.8 mM CaCl2 및 1 mM MgCl2와 함께 배양하였다. 세포를 30분 동안 25 ㎍/mL 로다민-컨주게이션된 소 알부민 (Invitrogen)에 노출시킨 후, 얼음같이 차가운 PBS로 세척하여 세포내이입을 정지시키고, 25 ㎍/mL 훽스트 핵 염료를 포함하는 2% 파라포름알데하이드로 즉시 고정시켰다. 억제 실험을 위해, 1 μM 수용체-연관 단백질 (RAP) (Ray Biotech, Inc., Norcross GA)을 알부민 첨가 10분에 첨가하였다. 현미경적 영상화 및 분석을 BD Pathway™ 855 고함량 바이오영상촬영기 (Becton Dickinson)를 사용하여 수행하였다 [참조: Kelley et al., Am J Physiol Renal Physiol. 2010 Nov;299(5):F1026-39. Epub Sep 8, 2010]
결론적으로, HCA는 세포 수준 자료를 제공하고 다른 검정에 의해서는 검출될 수 없는 세포 집단 동태, 즉 유전자 또는 단백질 발현을 밝힐 수 있다. 알부민 수송 (HCA-AT) 기능을 측정하기 위한 정량가능한 생체외 HCA 검정을 이용하여 인간 신장 세뇨관 세포를 인간 NKA 원형의 성분으로서의 특징지을 수 있다. HCA-AT는 세포 기능의 비교 평가를 가능하게 하였으며, 알부민 수송-적격 (competent) 세포가 인간 CKD 신장으로부터 유래된 NKA 배양물에 보유된다는 것을 보였다. 또한, NKA 배양물의 특정 아분획물인 B2 및 B4가 표현형 및 기능 면에서 다르고, B2는 증진된 알부민 수송 활성을 갖는 세뇨관 세포-농축 분획물에 해당한다. 인간 CKD로부터의 B2 세포 아집단은 (상기에 나타낸 바와 같이) 생체내에서 효능을 나타낸 설치류 B2 세포와 표현형적으로 및 기능적으로 유사하다.
실시예 14 - 일차 신장 세포로부터 유래된 엑소솜은 microRNA를 포함한다
본 발명자들은 재생 결과를 제공하는 기작을 설명하기 위한 생체내 조사에 대한 디자인을 특징짓기 위해 특정 엑소솜-유래된 miRNA를 표적 세포에서의 기능적으로 연관된 결과와 서로 연관시키고자 했다.
방법: 재생 복구 반응과 관련된 시그널링 경로에 대한 조건화 배지의 효과를 시판 세포: HK-2 (인간 근위 세뇨관 세포주), 일차 인간 신장 혈관사이 세포 (HRMC) 및 인간 제대 내피 세포 (HUVEC)를 사용하여 조사하였다. 인간 및 래트 일차 신장 세포 배양물 (UNFX)로부터의 조건화 배지 중의 엑소솜의 RNA 내용물을 공지된 miRNA를 검출하도록 디자인된 PCR-기반 어레이에 의해 스크리닝하였다. 저산소는 엑소솜 방출에 영향에 끼치는 것으로 보고되었다; 따라서, 일 그룹의 배양물을 배지 수집 전 24시간 동안 저산소 (2% O2)에 노출시켰다. 엑소솜을 FACS에 의해 세포 파편으로부터 분리하였다. 도 29는 UNFX 조건화 배지의 제조 및 분석을 위한 도식도를 제공한다.
결과: UNFX-조건화 배지가 재생 복구 반응과 연관된 시그널링 경로에 영향을 끼치는 것으로 밝혀졌다; 이들 반응은 비-조건화 배지를 사용하는 대조군에서는 관찰되지 않았다. 구체적으로, NFκB (면역 반응) 및 상피-내지-중간엽 이행 (섬유증 반응)은 HK-2 세포에서 약화되었으며, PAI-1 (섬유증 반응)은 HRMC 세포에서 약화되었으며, 혈관형성은 HUVEC에서 증진되었다. UNFX-조건화 배지로부터의 엑소솜 내용물에 대한 PCR 어레이 스크리닝으로부터의 예비 자료는 UNFX이, UNFX-조건화 배지에 대해 관찰된 결과와 일치하는, miRNA 서열을 포함하는 엑소솜을 생성한다는 것을 나타낸다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 13A-C는 UNFX 배양물로부터의 조건화 배지가, 잠재적으로 재생 결과와 연관되는, 시험관내에서의 다수의 세포 과정에 영향을 끼친다는 것을 나타낸다. NFκB 시그널링은 신장 질환에서 염증 과정의 주요 매개자로서 제시되며 [참조: Rangan et al., 2009. Front Biosci 12:3496-3522; Sanz et al., 2010. J Am Soc Nephrol 21:1254-1262], 종양 괴사 인자 (TNF)에 의해 활성화될 수 있다. HK-2 세포를 37℃에서 1시간 동안 비조건화 배지 (좌측) 또는 UNFX 조건화 배지 (우측)와 함께 미리배양한 후, 10 ng/ml TNFa와 함께 또는 부재 하에 활성화시켰다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 13A는 UNFX-조건화 배지가 NF-κB의 TNF-a 매개된 활성화를 약화시킨다는 것을 나타낸다. NFκB 활성화는 RelA/p65 면역형광 염색 (녹색)으로 측정되었다. 훽스트-대조-염색된 핵 (청색) 및 팔로이딘-염색된 필라멘트형 액틴 (적색)은 RelA/p65 핵 국지화 (백색 화살표) 평가를 용이하게 한다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 13B는 UNFX-조건화 배지가 HUVEC 세포 배양물의 프로혈관형성 (proangiogenic) 거동을 증가시킨다는 것을 나타낸다. HUVEC 세포 (100,000개/웰)를 배지 200 + 0.5% BSA 중의 폴리머화된 마트리겔 (Matrigel) 상에 놓았다. 비조건화 배지 (좌측) 또는 UNFX-조건화 배지 (우측)를 가하고, 세포 조직적 반응을 이미지 포착과 함께 3 내지 6시간 동안 시각적으로 모니터링하였다. 세포 조직화를 세포 이동 (백색 화살촉), 정렬 (검은색 화살촉), 세뇨관 형성 (적색 화살촉) 및 폐다각형의 형성 (별표)으로 평가하였다. UNFX 조건화 배지는 비조건화 배지에 비해 더욱 많은 세뇨관 및 폐다각형을 유도하였으며, 이는 프로혈관형성 인자가 배지에 존재한다는 것을 나타낸다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 13C는 UNFX-조건화 배지가 상피 세포에서 섬유증 경로를 약화시킨다는 것을 도시한다. HK-2 세포는 상피 특성을 상실하고, 시험관내에서 전환 성장 인자 (TGF)에 노출시 중간엽 표현형을 획득하며, 이는 신장 섬유증의 진행과 관련이 있는 상피-내지-중간엽 이행 (EMT)를 모사한다 [참조: Zeisberg et al., 2003 Nat Med 9:964-968]. HK-2 세포를 72시간 동안 비조건화 배지 (CTRL), 10 ng/ml TGFβ1을 포함하는 비조건화 배지 (TGFβ1) 또는 10 ng/ml TGFβ1을 포함하는 UNFX 조건화 배지 (TGFβ1+CM)에서 배양하였다. 세포를 정량적 RT-PCR로 CDH1 (상피 마커), CNN1 (중간엽 마커) 및 MYH11 (중간엽 마커)에 검정하였다. 조건화 배지는 CDH1, CNN1 및 MYH11 유전자 발현으로 측정시, TGFβ1-유도된 EMT의 수준을 저하시킨다. 에러 바는 3개 실험 반복의 평균에 대한 표준 에러 (SEM)을 나타낸다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 13D는 비점검시 세포외 매트릭스 단백질의 점진적 축적을 이끌 수 있는, TGFβ1 및 플라스미노겐 활성자 억제제-1 (PAI-1)에 의해 구축되는 양성 피드백 루프를 도시한다 [참조: Seo et al., 2009. Am J Nephrol 30:481-490].
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 14A-B는 혈관사이 세포에서 섬유증 경로의 약화를 나타낸다. HRMC를 5 ng/ml TGFβ1의 첨가 (+) 또는 부재 (-) 하에 대조군 (CTRL) 또는 UNFX 조건화 배지 (UNFX CM)에서 24시간 동안 배양하였다. PAI-1에 대한 웨스턴 블롯 분석은 UNFX CM이 TGFβ1-유도된 PAI-1 단백질 수준의 증가를 약화시킨다는 것을 입증한다. b액틴은 적하 대조군으로서 표시된다. 인간 신장 혈관사이 세포 (HRMC)는 5 ng/ml TGFb1의 존재 (+) 하에서 PAI-1의 증가된 수준을 나타낸다. 인간 생체활성 신장 세포로부터 유래된 조건화 배지 (CM)와의 공동배양은 TGFb1-유도된 PAI-1 단백질 발현을 약화시킨다. mRNA 수준에서의 PAI-1 발현은 CM에 의해 바뀌지 않았다 (자료 도시되지 않음).
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 14B는 래트 생체활성 신장 세포로부터의 CM이 TGFb1로 유도된 (+) 및 비유도된 (-) 배양된 HRMC에 대해 유사한 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 원심분리 후 수집된 CM 상등액 (래트 CM을 고갈시킴)은 PAI-1 발현을 약화시키는데 덜 효과적이었으며, 이는 관찰된 PAI-1 단백질의 약화에 책임이 있는 CM 성분이 래트 생체활성 신장 세포에 의해 분비되는 소포와 관련될 수 있다는 것을 제시한다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 15는 UNFX로부터의 조건화 배지가 분비되는 소포를 포함한다는 것을 도시한다. Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 15A는 세포질-유래된 내부 성분 (녹색)을 포함하는 이중지질 (bilipid) 구조물 (적색)인 분비되는 소포 (엑소솜 포함)을 도시한다. 포스파티딜세린 (청색 삼각형)은 소포 생합성 동안 세포외 공간에 노출되는 막의 성분이다 [참조: Thery et al., 2010. Nat Rev Immunol 9:581-593].
PKH26 및 CFSE는 각각 분비되는 소포의 지질막 및 세포질을 표지하며 [참조: Aliotta et al., 2010. Exp Hematol 38:233-245], 아넥신 V는 포스파티딜세린을 결합한다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 15B-C는 FACS 분류를 도시한다. UNFX 조건화 배지를 PKH26, CFSE 및 APC-컨주게이션된 아넥신 V로 표지한 후, 형광-조력된 세포 분류 (FACS)로 분류하였다. 분비된 소포를 나타내는 삼중-양성 입자를 수집하고, TRIZol 시약을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. microRNA 내용물을 시판되는 RT-PCT-기반 어레이를 사용하여 공지된 서열에 대해 스크리닝하였다.
표 5는 분비된 소포가 예측된 치료 결과를 갖는 microRNA를 포함한다는 것을 나타낸다. UNFX 세포는 공지된 miRNA 서열을 포함하는 엑소솜을 방출하였다. UNFX-조건화 배지는 인간 세포주에서 기능적으로 관련된 재생 반응에 영향을 끼친다. 검출된 miRNA와 관찰된 재생 반응 사이의 원인 및 효과 관계가 활발한 연구 하에 있다; 그러나, 지금까지 수득된 결과는 UNFX 세포가 표적 세포 및 조직으로 엑소솜-매개된 전달을 통해 치료학적으로 관련된 측분비 효과를 갖는 잠재력을 갖는다는 것을 지지한다.
엑소솜에서 miRNA 유전자 표적물 예상 효과
miR-146a TRAF6, IRAK1* NFκB 억제
miR-130a GAX, HOXA5** 혈관형성 촉진
miR-23b Smad 3/4/5*** TGFβ 신호 전달 억제 (항-섬유증)
* 문헌 [참조: Taganov et al, 2006. Proc Natl Acad Sci USA 103:12481-12486]** 문헌 [참조: Chen and Gorski, 2008. Blood 111:1217-1226]
*** 문헌 [참조: Rogler et al., 2009. Hepatology 50:575-584]
상기 자료는 생체활성 신장 세포 배양물로부터 배출된 소포가 TGFb1/PAI-1 피드백 루프에 의해 유도되는 PAI-1을 약화시키는 성분을 포함한다는 결론을 지지한다.
마크로어레이 및 RT-PCR 분석. 루이스 래트로부터의 비분획된 (UNFX) 생체활성 신장 세포를 저산소 조건 (2% O2)의 조건 하에 24시간 동안 기초 배지 (혈청 또는 보충물이 없는 DMEM과 KSFM의 50:50 혼합물)에서 배양하였다. 조건화 배지를 수집하고, 4℃에서 2시간 동안 100,000 xg로 초원심분리하여 분비된 소포 (예: 미세소포, 엑소솜)을 펠릿화시켰다. 총 RNA를 생성된 펠릿으로부터 추출하고, 실시간 RT-PCT (Rat MicroRNA Genome V2.0 PCR Array; Qiagen #MAR-100A)로 공지된 microRNA 종을 검정하였다. Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 74 페이지에서 26번째 줄 내지 77 페이지에서 67번째 줄에 열거된 miRNA가 검출가능하였다.
실시예 15 - 생체활성 신장 세포로부터 유래된 측분비 인자
본 연구에서, 본 발명자들은 생체활성 신장 세포가 플라스미노겐 활성자 억제제-1 (PAI-1)과 같은 매개자를 통해 섬유증을 조절할 수 있는 잠재적인 측분비 기작(들)을 조사하기 위해 시험관내 세포-기반 검정을 이용하였다.
재료 및 방법: 조건화 배지를 혈청- 및 보충물-비함유 조건 하에 생체활성 신장 세포의 래트 및 인간 배양물 [참조: Aboushwareb et al., World J Urol 26, 295, 2008; Presnell et al., 2010 supra]로부터 수집하고, 시험관내 검정에 사용하였다. 혈관사이 세포는 손상되거나 병에 걸린 신장에서 PAI-1 생성의 공급원이므로 [참조: Rerolle et al., Kidney Int 58, 1841, 2000], 시판되는 래트- 및 인간-유래된 혈관사이 세포를 시험관내 검정에서 숙주-반응 조직의 대용물로 사용하였다. PAI-1 유전자 및 단백질 발현을 각각 정량 RT-PCR 및 웨스턴 블롯으로 검정하였다. 세포에 의해 배양 배지로 방출되는 소포 입자 (가령, 엑소솜)를 고속 원심분리로 수집하고 [참조: Wang et al., Nuc Acids Res 2010, 1-12 doi:10.1093/nar/gkq601, July 7, 2010], 총 RNA를 TRIzol 시약 (Invirogen)을 사용하여 펠릿으로부터 추출하였다. 소포의 RNA 내용물을 공지된 microRNA 서열의 PCR-기반 어레이 (Qiagen)를 사용하여 스크리닝하였다.
결과: 생체활성 신장 세포 배양물로부터의 조건화 배지는 혈관사이 세포에서 PAI-1 정상 상태 단백질 수준의 TGFβ1-유도된 증가를 약화시켰으나, 정상 상태 mRNA 수준에는 영향을 끼치지 않았으며, 이러한 관찰은 microRNA가 표적 유전자를 조절하는 기작과 일치한다. microRNA가 세포외 소포 트래피킹 (trafficking)을 통해 세포 사이에 전달될 수 있다는 가설에 기초하여 [참조: Wang et al., supra 2010], 본 발명자들은 microRNA에 대해 조건화 배지를 분석하고, PAI-1의 추정적 억제제인 microRNA 30b-5p (miR-30b-5p)의 존재를 확인하였다.
본원에 제시되는 자료는 생체활성 신장 세포가 엑소솜을 통한 혈관사이 세포 표적을 위해 miR-30b-5p의 세포-대-세포 전달을 통해 직접적으로 섬유증을 조절할 수 있다는 것을 제시한다. 혈관사이 세포에 의한 miR-30b-5p 흡수의 결과로서, 궁극적으로 사구체 공간 내 세포외 매트릭스의 침착을 감소시킬 수 있는 신장 조직에서의 반응인, 정상 상태 PAI-1 단백질 수준의 TGFβ1-유도된 증가가 약화된다. PAI-1이 실제로 miR-30b-5p의 직접적 표적물인지를 확인하는 작업이 진행중이다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 14A-B는 배양 배지 중 TGFβ1의 첨가 (+) 또는 부재(-) 하에 대조군 (CTRL) 또는 생체활성 신장 세포 조건화 배지 (CM)에서 24시간 동안 배양된 사람 혈관사이 세포에서의 PAI-1 및 α-액틴 (대조군) 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯을 나타낸다. CTRL 배양에서, TGFβ1은 PAI-1 단백질 발현을 증가시켰다. CM 배양에서, TGFβ1-유도된 반응이 약화되었다.
PAI-1에 대한 추정의 억제제일 수 있는 microRNA에 대해 분비되는 소포를 분석하였다. 사람 및 래트 생체활성 신장 세포 CM으로부터 분비되는 소포를 고속 원심분리로 수집하고, 공지된 서열의 PCR-기반 어레이를 사용하여 microRNA에 대해 검정하였다. PAI-1 (6)에 대한 추정의 조절자인 miR-449a가 확인되었다. HRMC를 miR-449a로 또는 없이 (CTRL) 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션시킨 지 24시간 후, 세포를 추가의 24시간 동안 5 ng/ml TGFb1에 노출 (+) 또는 비노출 (-)시켰다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 16A는 총 단백질이 제조되고 PAI-1 및 b액틴에 대해 검정되는 웨스턴 블롯을 나타낸다. miR-449a는 정상 상태 PAI-1 단백질 수준을 감소시켰으며 (레인 1 및 3을 비교), 또한 유도된 PAI-1 단백질 수준이 miR-449a 트랜스펙션된 배양물에서 낮았다 (레인 2 및 4를 비교). 상기 자료는 분비된 소포가 miR-449a를 포함하고 miR-449a의 혈관사이 세포로의 흡수가 PAI-1 발현을 감소시킨다는 결론을 지지한다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 16B는 PCR-기반 어레이에서도 확인되고 예측 알로리즘 (http://mirbase.org - miRBase는 맨체스터 대학의 생명과학부에서 관리하고 유지한다)에 기초한 PAI-1의 추정적 조절자인, microRNA인 miR-30b-5p를 도시한다.
사구체에서의 PAI-1 단백질 수준을 5/6 신장절제에 의해 유도된 CKD를 생체활성 신장 세포로 처리한 후 생체내에서 조사하였다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 17A-C는 일측 신장절제를 겪은 루이스 래트 신장 (A), 5/6 신장절제를 겪은 루이스 래트 신장 (B) 또는 생체활성 신장 세포의 신장내 전달을 갖는 5/6 신장절제를 겪은 루이스 래트 신장 (C)에서의 PAI-1 (A-C)의 대표적인 면역조직화학 이미지이다. 5/6 신장절제술 (B) 결과로서의 사구체에서의 PAI-1 축적 (화살표)이 처리 (C)에 의해 감소되었다.
별도의 연구에서, qRT-PCR을 부검시 수거된 신장 조직에 대해 수행하였으며, 상대적 유전자 발현값을 조사일에 대해 플로팅하였다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 17D는 5/6 신장절제된 래트 (적색 네모)가 생체활성 신장 세포 (청색 다이아몬드) 및 모의-시술된 대조군 (녹색 세모)으로 처리된 래트에 비해 더욱 강건한 PAI-1 발현을 나타낸다는 것을 도시한다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 17E는 처리후 3개월 및 6개월에 채취한 신장 시료에 대한 대표적인 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 5/6 신장절제된 래트 (Nx)의 처리된 조직 (Nx+Tx)은 PAI-1 및 피브로넥틴 (FN) 단백질 축적이 감소되었다 [참조: Kelley et al., 2010 supra].
상기 자료는 사구체에서의 생체내 PAI-1 단백질 수준이 5/6 신장절제에 의해 유도된 CKD를 생체활성 신장 세포로 처리한 후 감소된다는 것을 지지한다. 종합하면, 실시예 15 및 16은 생체활성 신장 세포의 신장내 전달이 신장 기능을 증진시키는 하나의 기작이 내재적 신장 세포에서 섬유증 경로를 조절하는 성분의 세포-세포 전달을 통해 이루어질 수 있다는 것을 지지한다.
실시예 16 - 생체활성 신장 세포로부터의 분비 인자가 NFκB 시그널링 경로를 약화시킨다
본 연구에서 본 발명자들은 5/6 신장절제 모델의 NKA-매개된 질환 진행 약화에서 NFκB 경로의 역할을 조사하고, NFκB 활성화의 직접적 조절을 통한 재생 결과에 기여할 수 있는 생체활성 신장 세포의 특성을 확인하였다. Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 17G는 TNFα에 의한 NFκB 경로의 표준 활성화를 도시한다.
재료 및 방법: PBS 중의 B2 + B4로 처리하기 6주 전에 2-단계 5/6 신장절제술을 받은 루이스 래트로부터 잔류 신장을 수거하였다 (NKA 원형). NKA-처리된 (TX) 또는 비처리된 (UNTX) 조직을 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯 분석 및 전기영동 이동 쉬프트 검정 (EMSA)으로 NFκB 활성화를 검정하였다. 혈청- 및 보충물-비함유 배지에서 성장된 생체외 NKA 세포 배양물로부터 수집된 조건화 배지 (CM)를 시험관내 기능 검정에 사용하였다. 인간 근위 세뇨관 세포주 (HK-2)를 분자 및 면역형광-기반 검정 판독을 위한 표적 세포 유형으로 사용하였다. 세포에 의해 배양 배지로 분비되는 소포 입자 (엑소솜)을 고속 원심분리로 수집하였다. 엑소솜으로부터 분리되는 총 RNA를 공지된 microRNA 서열의 PCR-기반 어레이 (Qiagen)를 사용하여 스크리닝하였다.
결과: NFκB 아단위인 RelA/p65의 핵 국지화가 5/6 신장절제된 래트로부터의 잔존 신장에서 관찰되었으며, 이는 UNTX 조직에서 염증 경로의 활성화를 제시한다. RT-PCR에 의한 TX 조직과의 예비적 비교는 RelA 유전자 발현의 감소를 나타내었으며, 이는 NKA 처리가 RelA/p65 발현 억제를 통해 NFκB 경로 활성화에 영향을 줄 수 있다는 것을 제시한다. 이러한 가설은 종양 괴사 인자-α (TNFα)에 대한 반응에서 나타난 것과 비교하여 CM-노출된 HK-2 세포에서 RelA/p65의 핵 국지화가 감소하는 것으로 입증되는 바와 같이 (Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 17F), CM이 시험관내에서의 TNFα-유도된 NFκB 활성화를 약화시킨다는 관찰에 의해 지지된다. NKA 엑소솜 microRNA의 진행식 RT-PCR (ongoing RT-PCR) 분석은 NFκB 경로에 영향을 끼치는 것으로 공지된 서열이 존재하는 지의 여부를 조사한다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 17F는 NKA CM에 대한 2시간 노출이 면역형광 검정에서 TNFα로 전처리된 대조군 배양물에서 관찰되는 NFκB p65의 핵 국지화와 비교하여 HK-2에서 NFκB p65 (녹색)의 핵 국지화를 감소시킨다는 것을 나타낸다. HK-2에서, NFκB p65 (녹색)은 TNFα (대조군 배지)에 30분 노출후 핵으로 국지화된다. 그러나, TNFα 첨가 2시간 전 NKA 조건화 배지로 HK-2 세포를 전처리함으로써 NFκB p65 핵 국지화 반응이 약화되었다. 핵은 DAPI (청색)으로 염색되고, 필라멘트형 액틴은 알렉사594 (Alexa594)-팔로이딘 (적색)으로 염색되며 NFκB 핵 국지화의 강건함을 정량적으로 평가하는 것을 돕는다 (하부 열의 합쳐진 패널 중 TNFα-처리된 대조군 세포에서 약간 감소된 팔로이딘 경계를 주목). 대조염색은 합쳐진 이미지에서 NFkB 국지화에 대한 참조를 제공한다.
루이스 래트의 신장 조직 중의 NFkB p65 아단위에 대한 면역조직화학은 5/6 신장절제에 의해 개시되는 진행성 CKD를 갖는 동물 (패널 B)이 대조군 동물에서 일측 신장절제에 의해 개시되는 비-진행성 신부전 동물 (패널 A)에 비해, 특히 세뇨관 상피 세포 (검은색 화살촉)에서 NFkB p65 아단위의 더욱 강건한 핵 국지화를 갖는다는 것을 보인다. 확대율: 200X.
패널 C: 5/6 신장절제를 겪은 루이스 래트 신장 조직의 세포질 ('C') 및 핵 ('N') 단백질 추출물 중 NFκB p65에 대한 웨스턴 블롯 분석. g튜불린 수준 (로딩 대조군)이 비교적 일정한 1주 및 13주째를 비교시, 핵 NFkB p65가 시간이 경과함에 따라 증가하였으며, 이는 면역조직화학 결과와 일치한다.
패널 D: 핵 추출물에 대한 전기영동 이동 쉬프트 검정 (EMSA)은 5/6 신장절제후 핵으로 국지화되는 NFkB가 DNA 결합에 대해 활성화된다는 것을 확인시켜 준다. 레인은 각각의 시점에서 2마리의 동물로부터 제조된 핵 추출물을 나타낸다.
NFkB 경로는 만성 신장 질환의 5/6 신장절제 모델에서 서서히 활성화된다. 루이스 래트의 신장 조직 중 NFkB p65 아단위에 대한 면역조직화학을 수행하였다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 18A-D는 5/6 신장절제에 의해 개시되는 진행성 CKD를 갖는 동물 (패널 B)이 대조군 동물에서 일측 신장절제에 의해 개시되는 비-진행성 신부전 동물 (패널 A)에 비해, 특히 세뇨관 상피 세포 (검은색 화살촉)에서 NFkB p65 아단위의 더욱 강건한 핵 국지화를 갖는다는 것을 도시한다. 조직은 신장절제후 6주에 회수하였다. 확대율: 200X.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 18C는 5/6 신장절제를 겪은 루이스 래트 신장 조직의 세포질 ('C') 및 핵 ('N') 단백질 추출물 중 NFkB p65에 대한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. g튜불린 수준 (로딩 대조군)이 비교적 일정한 1주 및 13주째를 비교시, 핵 NFkB p65가 시간이 경과함에 따라 증가하였으며, 이는 면역조직화학 결과와 일치한다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 18D는 핵 추출물에 대한 전기영동 이동 쉬프트 검정 (EMSA)를 나타내며, 5/6 신장절제후 핵으로 국지화되는 NFkB 가 DNA 결합에 대해 활성화된다는 것을 확인시켜 준다. 레인은 각각의 시점에서 2마리의 동물로부터 제조된 핵 추출물을 나타낸다. 1 mg의 핵 단백질을 5 ng의 NFkB DNA 결합 부위와 함께 배양하고, 6% DNA 지연 겔 상에서 전기영동한 후, 에티듐 브로마이드로 염색하였다.
NKA 세포의 신장내 전달은 NFkB 핵 국지화를 감소시킨다. 다수의 규정된 신장 세포 아집단을 분리하고, CKD의 5/6 신자 절제 모델에서 신장 기능을 개선하는 생체활성에 대해 생체내에서 검정하였다 [참조: Presnell et al., 2010 supra]. NKA 세포는 생체활성을 나타내나, 다른 아집단은 그렇지 아니하였다 [참조: Kelley et al., 2010 supra].
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 18E는 NKA (A) 또는 비-생체활성 신장 세포 (B)가 신장내 주사된 확립된 CKD를 갖는 루이스 래트를 나타낸다. NKA (A) 또는 비-생체활성 신장 세포 (B)가 신장내 주사된 확립된 CKD를 갖는 루이스 래트. 처리후 6개월에, 조직을 수거하고, NFkB p65 아단위에 대해 면역조직화학으로 검정하였다. NKA-처리된 동물로부터의 조직은 비-생체활성 신장 세포로 처리된 동물로부터의 조직과 비교하여, 특히 근위 세뇨관에서 NFkB p65의 약한 핵 국지화를 나타내었으며, 이는 NKA 처리가 생체내에서 NFkB 경로 활성을 약화시키는데 관여한다는 것을 제시한다.
인간 및 래트 NKA 조건화 배지로부터 고속 원심분리에 의해 분리되는 분비된 소포의 microRNA 내용물을 공지된 서열의 PCR-기반 에레이를 사용하여 분석함으로써, 문헌 [참조: Marquez RT et al., (2010) Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 298:G535; Taganov KD et al., (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:12481] 또는 예측 알고리즘 (http://mirbase.org - miRBase는 맨체스터 대학의 생명과학부에서 관리하고 유지한다)에 기초하여, NFkB를 통해 면역 반응에 영향을 끼칠 수 있는 수개의 microRNA 종을 확인하였다.
소포내 microRNA 표적 mRNA
miR-21 Pellino-1 (Marquez et al.)
miR-146a IRAK1, TRAF6 (Taganov et al.)
miR-124, miR-151 NFKB /RelA (miRBase)
생체내 및 시험관내 발견은 생체활성 신장 세포 (NKA)가 NFκB 활성화에 의해 영향을 받는 면역 반응 경로와 같은 면역 반응 경로를 조절함으로써 만성-질환 신장에서 신장 기능을 개선시킬 수 있는 방법에 대한 통찰을 제공한다. 활성화된 NFkB (p65 핵 국지화, 특히 근위 세뇨관 세포에서의 p65 핵 국지화)는 5/6 신장절제 설치류 모델에서 만성 신장 질환의 확립과 연관이 있으며, NKA 처리에 의해 약화되었다. 근위 세뇨관 세포 (HK-2)의 NKA 조건화 배지에 대한 시험관내 반응은 NKA 처리에 반응하는 NFkB 핵 국지화의 생체내 약화를 모방한다. NFkB 활성화의 세포-세포 억제에 대한 추정의 매개자 (microRNA)가 NKA 조건화 배지에서 확인되었다. 종합하면, 이들 자료는 생체활성 신장 세포의 신장내 전달이 신장 기능을 증진시키는 하나의 기작이 내재적 신장 세포에서 면역 반응을 조절하는 성분의 세포-세포 전달을 통해 이루어질 수 있다는 것을 지지한다.
실시예 17 - NKA 구조물의 기능 평가
젤라틴 또는 HA-기반 하이드로겔에 파종된 신장 세포 집단은 생존가능하였으며, 전사체 (transcriptomic) 검정, 단백질체 (proteomic) 검정, 분비체 (secretomic) 검정 및 공초점 면역형광 검정으로 측정시 3일의 시험관내 성숙 동안 세뇨관 상피 기능 표현형을 유지하였다. NKA 구조물이 질환 상태에 영향을 줄 수 있었던 가능한 기작을 조사하기 위해서, CKD 진행과 관련된 세뇨관-간질 섬유증에 대한 TGF-β 시그널링 경로에 대한 조건화 배지의 효과를 평가하였다. 조건화 배지는 인간 근위 세뇨관 세포주 (HK2)에서 시험관내에서의 TGF-β-유도된 상피-중간엽 이행 (EMT)을 약화시키는 것으로 관찰되었다. 재료 및 방법은 Ilagan et al. PCT/US2011/036347에서 기술된다 (실시예 15).
HK2 세포에서 TGF-β 매개된 EMT의 분석. HK2 세포 (ATCC)를 피브리넥틴 또는 콜라겐 (IV) 코팅된 배양 접시 (BD Biosciences) 중 50:50 배지에서 배양하였다. EMT 검정을 위해, HK2 세포를 24-웰 콜라겐 (IV) 코팅 플레이트에 50:50 배지 또는 2차원 (2D) 인간 UNFX 배양물 또는 배지 수집 전 3일 동안 성숙된 인간 UNFX로 제조된 NKA 구조물로부터 수집된 조건화 배지와 함께 70 내지 80% 컨플루언시로 파종하였다. EMT 검정을 위해 세포로부터 RNA를 분리하기 3일 전에 배양 배지에 10 ng/ml의 TGF-β를 가함으로써 TGF-β 유도를 개시하였다. EMT를 3일의 배양 기간 말기에 E-카드헤린 (상피 마커) 및 칼포닌 (중간엽 마커)의 상대적 발현을 분석함으로서 qRT-PCR로 모니터링하였다. RNA를 상술된 바와 같이 TaqMan qRT-PCR 분석을 위해 수거된 HK2 세포로부터 제조하였다. 각각의 시료에 대한 변수가 동일하다는 가정하에 표준 양측 스튜던츠 t-검증 (standard two tailed Student's t-test)을 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 95%의 신뢰 구간 (p-값 < 0.05) 및 99% (p-값 < 0.01)을 이용하여 통계학적 유의성을 측정하였다.
결과: HK2 세포에서 TGF-β 유도된 EMT에 대한 NKA 구조물로부터의 조건화 배지의 효과. CKD의 진행 동안 세뇨관-간질 섬유증의 발병은 세뇨관 상피 세포의 TGF-β 매개된 EMT와 연관된다 [참조: Zeisberg et al., Am J Pathol 160(6):2001-2008; 2002]. 또한, TGF-β 경로의 약화가 진행성 CKD의 설치류 모델에서 생체내에서 관찰되었으며, 이때 생존은 연장되고 신장 기능이 UNFX 및 B2 세포로의 처리로 개선되었다 [참조: Presnell et al., WO/2010/056328]. 인간 근위 세뇨관 세포주 HK2는 소분자 또는 단백질의 TGF-β 유도된 EMT에 대한 자극 또는 억제 효과를 시험하기 위해 시험관내 모델 시스템으로 잘 확립되어 있다 [참조: Dudas et al., Nephrol Dial Transplant 24(5):1406-1416; 2009; Hills et al., Am J Physiol Renal Physiol 296(3):F614-621; 2009]. NKA 구조물이 이식 후 신장 조직 반응에 영향을 끼칠 수 있는 잠재적 기작을 조사하기 위해서, UNFX 세포 및 하이드로겔을 사용하여 생성된 NKA 구조물로부터 수집되는 조건화 배지를 HK2 EMT 검정 시스템에서 평가하였다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 26은 NKA 구조물로부터의 조건화 배지가 시험관내에서 HK2 세포에서의 TGF-β 유도된 EMT를 약화시킨다는 것을 나타낸다. EMT는 ECAD (상피) 및 CNN1 (중간엽) 마커의 상대적 발현을 정량함으로써 모니터링된다. HK2 세포를 50:50 배지 (대조군 및 TGFB 대조군 시료) 또는 인간 UNFX 세포 (TC)의 2D 배양물 또는 인간 UNFX 세포 및 상술된 바와 같은 젤라틴 또는 HA/젤라틴으로부터 생성된 NKA 구조물로부터의 조건화 배지 (CM)에서 배양하였다. EMT를 유도하기 위해서, 10 ng/ml TGF-β를 검정 전 3일 동안 각각의 시료 (대조군 제외)에 가하였다. HK2 세포를 50:50 배지 (대조군)에서 배양하는 경우, ECAD (상피 마커)가 CNN1 (중간엽 마커)보다 높은 수준으로 발현되었다. TGF-β를 3일 동안 배지에 가하는 경우 (TGFB 대조군), ECAD 발현이 상당히 하향-조절되고 동시에 CNN1이 상향조절되었으며, 이는 EMT 사건의 유도와 일치한다. 2D UNFX 세포 배양물로부터의 조건화 배지는 TGF-β에 대한 HK2 세포의 EMT 반응을 유의미하게 (ECAD 및 CNN1 모두에 대해 p < 0.05) 약화시켰다 (TC CM). 또한, NKA 구조물 (젤라틴 CM 및 HA/젤라틴 CM)으로부터의 조건화 배지도 TGF-β에 대한 EMT 반응을 약화시켰다; 그러나, 전체 효과는 2D UNFX 세포 배양으로부터의 조건화 배지를 사용하여 관찰된 효과보다 더하였다 (유의도 - p < 0.05 - 2개의 NKA 구조물 모두를 사용한 ECAD에 대한 유의도, 비록 CNN1에 대한 통계학적 유의성은 없지만 대조군에 가까운 동향). 추가의 중간엽 마커를 스크리닝하여 유사한 결과를 얻었다 (자료 제시되지 않음). 이들 자료는 NKA 구조물이 세포-기반 처리로 관찰되는 것과 유사한 방식으로 생체내에서 세뇨관-간질 섬유증과 연관된 TGF-β 경로에 잠재적으로 영향을 끼칠 수 있다는 것을 제시한다 [참조: Presnell et al., WO/2010/056328]. 또한, 이들 자료는 생체내 반응이 시험관내 EMT 반응과 통계학적으로 유의한 관계를 갖는 것으로 입증될 수 있다면, 시험관내 EMT 검정이 NKA 구조물의 생물치료 효능을 스크리닝/최적화/모니터링하기 위한 잠재적 적용을 가지고, 따라서 시간 소모적이고 고비용인 생체내 검정에 대한 필요성을 잠재적으로 감소시킬 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 18 - 배양된 인간 신장 세포의 저산소 노출은 시험관내에서 세포 이동 및 부착 매개자를 유도하고 세뇨관 세포 단층 복구를 촉진시킨다
만성 신장 질환 (CKD) 모델에서 입증된 치료학적 기능을 갖는 선택된 신장 상피 세포 집단 (B2)의 분리 및 기능에서의 산소 분압의 역할을 조사하였다. 본 연구는 가공 처리 동안의 저산소 노출이 인간의 선택된 신장 세포 (SRC) 또는 생체활성 신장 세포 (BRC)의 조성 및 기능을 변화시키는 지의 여부를 조사한다. 2% 산소 노출시, 하기 사항이 관찰되었다: 밀도 구배물에 걸친 세포 분포의 변화 [참조: Presnell et al., WO 10/056328, 전부 참고문헌으로 본원에 편입됨], 구배후 총 수율의 개선, 산소-조절되는 유전자 발현의 조절 (문헌 [참조: Kelley et al., supra (2010)]에 이미 보고됨), 에리트로포이에틴, VEGF, HIF1-알파 및 KDR(VEGFR2)의 증가된 발현. 저산소의 진행중 노출은 선택된 생체활성 신장 세포가 손상된 신장 세뇨관을 복구/재생하는 능력을 증진시킨다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 27은 가공 처리 동안 세포를 저산소에 노출시키는 절차를 도시한다. Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 28은 2% 산소 노출시 밀도 구배에 걸친 세포 분포가 변화되고 구배후 총 수율이 개선된다는 관찰을 도시한다. 저산소 노출 (<3%)은 대기 산소 분압 (21%)가 비교하여 요오딕산올-기반 밀도 구배로부터의 배양된 CKD-유래된 신장 세포의 회수율을 증가시키고 (96% 대 74%), 선택된 세포 (B2)의 고밀도 (>9% 요오딕산올) 분획으로의 상대적 분포를 증가시켰다 (21.6% 대 11.2%).
경쟁적 시험관내 검정은 저산소 조건에 24시간 동안 사전노출된 B2 세포가 21% 산소 분압에서 배양된 B2 세포보다 손상된 신장 근위 세뇨관을 복구하는데 있어서 더욱 능숙하여 58.6% ± 3%의 복구가 손상 2시간 내에 일어난다는 것을 입증하였다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 29A는 시험관내에서의 세뇨관 단층 복구를 관찰하기 위해 개발된 검정을 도시한다. 1. 세포를 형광 염료로 표지한다 (2% 산소, 21% 산소 및 HK2 세뇨관 세포). 2. 세뇨관 세포 단층을 확립하고, 상처를 내었다. 3. 산소-노출된 표지 세포를 가하였다 (2% 및 21% 노출된 세포). 이들을 20,000/cm2로 균일하게 파종하였다. 24시간 동안 5% O2에서 혈청-비함유 배지에서 배양하였다. 4. 상처를 복구하는 세포를 정량하였다. 도 29B - 정량적 이미지 분석 (BD Pathway 855 BioImager) - 적색 원 = 2% O2에서 배양된 세포, 청색 원 = 21% O2. 도 29C - 2% 산소-유도된 세포가 더욱 신속하게 (2시간) 부착되고 24시간 동안 온건한 이점이 지속되었다. 2% 산소로 유도된 세포는 세뇨관 상피 단층 복구에 더욱 능숙하였다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 30A는 시험관내에서의 세뇨관 단층의 복구를 관찰하기 위해 개발된 검정을 도시한다. 1. 세포를 형광 염료로 표지하였다. 2. 세뇨관 세포 단층을 8 ㎛ 세공 크기의 트랜스웰 삽입물의 바닥에 확립하고 상처를 내었다. 3. 삽입물을 뒤집고 산소-노출된 표지 세포를 가하였다 (2% 및 21% 노출된 세포). 이들을 50,000/cm2로 균일하게 파종하였다. 24시간 동안 5% O2 하에 혈청-비함유 배지에서 배양하였다. 4. 상처를 복구하는 세포를 정량하였다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 30B는 2% 산소로의 세포 유도가 비-유도 (21% 산소)에 비해 이동 및 상처 복구를 증진시킨다는 것을 도시한다. 도 30C는 이동 시간에 대한 이동 세포의 비율 (%)을 플로팅한다. 세포의 평균수 및 세포의 평균 비율 (%)이 표 6에 제공된다.
또한, 저산소는 CXCR4, MMP9, ICAM1 및 디스트로글리칸 (세포 이동 및 부착을 매개하는 유전자)의 mRNA 발현을 유도하였다. 세포 혈장 막 상의 MMP9의 구소 축적 및 코넥신 43 응집체의 증가가 면역세포화학으로 확인되었다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 31A는 오스테오폰틴이 세뇨관 세포에 의해 분비되고 손상에 반응하여 상향조절된다는 것을 나타낸다 (오스테오폰틴 면역세포화학: 훽스트 핵 착색제 (청색), 오스테오폰틴 (적색), 10x). 오스테오폰틴은 분비되는 포스포릴화된 당단백질이다 [참조: Kelly et al., J Am Soc Soc Nephrol, 1999]. 오스테오폰틴은 신장 세뇨관에서 발현되며, 부착 및 이동에 관여된다. 오스테오폰틴은 면역형광 (Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 31A) 및 ELISA (Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 31B)에 의해 도시되는 바와 같이 확립된 세뇨관 세포 단층에서 손상에 의해 상향조절된다.
N=3 3시간 24시간
평균 세포수 # 평균 % 평균 세포수 # 평균 %
2% O2 26.33 61.51% 117.67 60.35%
21% O2 16.67 38.49% 76.33 39.65%
Simple PCI를 이용한 정량적 이미지 분석Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 32A는 세포의 이동 반응이 오스테오폰틴에 의해 부분적으로 매개된다는 것을 나타낸다 (녹색 = 이동된 세포 (5x)). Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 32B는 오스테오폰틴에 대한 중화 항체 (NAb)가 신장 세포 이동 반응을 50% 감소시킨다는 것을 나타낸다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 33은 세포의 저-산소 유도가 조직 리모델링 유전자의 발현을 조절한다는 것을 도시한다. 카베올린 1은 인테그린 시그널링의 조절에 수반되는 스캐폴딩 단백질이다. MMP9는 세포외 매트릭스 분해를 통해 이동을 촉진하는 금속단백질분해효소이다. ICAM1은 상피 세포 운동과 연관된 세포간 부착 분자이다. CXCR4는 세포 이동을 매개하는 케모카인 표면 수용체이다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 34는 신장 재생을 이끄는 세포의 생체활성의 저산소 증대에 대한 추정적 기작을 도시한다.
종합하면, 이들 결과는 저산소 노출이 시험관내에서 세뇨관 손상 복구에 대해 입증된 생체활성을 갖는 특정 신장 세포 아집단의 분리를 용이하게 하므로, 잠재적으로 생체내 전달후 이들 세포의 병든 조직으로의 이동 및 주입 능력을 증진시킬 수 있다는 것을 제시한다. SRC는 진행성 CKD의 설치류 모델에서 신장 기능을 안정화시키고 생존을 증진시키는 능력을 나타내었다. 저산소 수준 (2% O2)은 선택된 재생 세포의 배양후 회수를 증진시키고; 세뇨관 손상에 반응하여 세포 부착 및 단층 복구를 증진시키고; 세뇨관 손상에 반응하여 세포 이동을 자극하였다. 또한, 세포 이동 및 부착은 부분적으로 시험관내에서의 오스테오폰틴, 저-산소 상향조절 인테그린, 분비 단백질, 및 조직 리모델링, 이동 및 세포-세포 교류를 매개하는 세포 부착 분자에 의해 매개되었다.
실시예 19 - 소변-유래된 미세소포
소변으로 방출되는 신장 유도된 미세소포의 내강 내용물에 포함된 miRNA 및 단백질이 재생 결과를 평가하기 위한 바이오마커로서 사용될 수 있는지를 결정하기 위해 이에 대한 분석을 수행하였다. 과량의 미세소포가 세포외 공간으로 방출되기 때문에, 일부는 이웃 세포와 융합되고, 다른 일부는 소변으로 배출된다 [참조: Zhou et al., 2008. Kidney Int. 74(5):613-621]. 이러한 소변 미세소포가 처리 결과를 더욱 잘 이해하기 위한 검정 개발용의 우수한 바이오마커가 된다.
만성 진행성 신부전을 갖는 대사 질환의 ZSF1 설치류 모델을 사용하였다. B2+B4 세포를 ZSF1 동물의 신장 실질에 주사하였다. 건강한 동물 및 PBS 비히클을 대조군으로 사용하였다. 소변-유래된 소포를 하기에 요약되는 바와 같이 상이한 시점에서 분석하였다.
1: ZSF1 동물 - PBS 비히클 주사; 주사한 지 197일 후에 수집된 소변
2: ZSF1 동물 - PBS 비히클 주사; 주사한 지 253일 후에 수집된 소변
3: ZSF1 동물 - B2 + B4 분획물 주사; 주사한 지 197일 후에 수집된 소변
4: ZSF1 동물 - B2 + B4 분획물 주사; 주사한 지 253일 후에 수집된 소변
5. ZSF1 동물 - 비주사; 연구한 지 197일에 수집된 소변
6. ZSF1 동물 - 비주사; 연구한 지 253일에 수집된 소변
7. 건강한 동물 - 비주사; 연구한 지 197일에 수집된 소변
8. 건강한 동물 - 비주사; 연구한 지 253일에 수집된 소변
소변을 처리한 지 197일 및 약 253일 후에 시험 동물로부터 수집하였다. 미세소포를 당해 기술 분야에 공지된 표준 방법에 의해 [참조: Zhou et al., Kindey Int. 2008 September; 74(5): 613-621]에 의해 회수하였다. Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 35의 표준 웨스턴 블롯팅에 의해 보여지는 바와 같이, 처리된 동물의 소변으로부터 회수된 미세소포 (레인 3-4)는 비히클 처리되거나 (레인 1-2) 비처리된 (레인 5-8)대조군과 비교하여, 전구 세포 (CD133 & WNT7A)와 관련된 단백질의 증가를 나타내었다. 사실, 미세소포 특이 단백질 CD63의 발현으로 나타나는 바와 같이 (Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 35), 미세소포는 단지 질환을 갖는 동물 (레인 1-6)의 소변으로부터만 회수되고, 건강한 대조군 (레인 7-8)에서는 회수되지 않았다. CD133-포함 미세소포는 신장 세포로부터 방출되는 프로미노솜인 것으로 보인다. CD133 및 WNT7A는 모두 재생 및 줄기 세포 분열과 연관되어 있다 [참조: Romagnani P and Kalluri R. 2009. Fibrogenesis Tissue Repair. 2(1):3; Lie et al., 2005. Nature. 437(7063):1370-5; Willert et al., 2003. Nature. 423(6938):448-52; Li et al., 2009. Am J Physiol Renal Physiol. 297(6):F1526-33]. 종합하면, 이것은 재생을 모니터링하기 위해 고안되는 검정 개발용의 바이오마커로서 미세소포에서 발현되는 단백질의 표적화를 지지한다.
miRNA 마이크로어레이 및 RT-PCR. 소변-유래된 소포로부터의 miRNA의 마이크로어레이 및 RT-PCR 분석을 당해 기술 분야에 공지된 표준 방법 [참조: Wang et al., supra 2010]으로 수행하였다. 단백질에 추가하여, miRNA가 분리된 미세소포의 내용물에서 발견되었다. Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 표 17.1은 처리에 의해 증가되는 것으로 밝혀진 miRNA의 예를 제공한다. miRNA 변화를 시간 경과에 따라 (197일 및 253일) B2+B4로 처리된 ZSF1 동물에서 분석하였다. Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 98 페이지에서 첫 번째 줄 내지 100 페이지에서 50번째 줄에 열거된 miRNA에 대한 폴드 (fold) 변화를 관찰하였다. miRNA 수준을 B2+B4로 처리된 (253일) ZSF1 동물에서 분석하였으며, PBS 비히클로 처리된 (253일) ZSF1 동물에서의 miRNA 수준과 비교하였다. Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 100 페이지에서 53번째 줄 내지 103 페이지에서 7번째 줄에 열거된 miRNA에 대한 폴드 (fold) 변화를 관찰하였다. miRNA 수준을 B2+B4로 처리된 (197일) ZSF1 동물에서 분석하였으며, PBS 비히클로 처리된 (197일) ZSF1 동물에서의 miRNA 수준과 비교하였다. Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 103 페이지에서 12번째 줄 내지 105 페이지에서 10번째 줄에 열거된 miRNA에 대한 폴드 변화를 관찰하였다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 표 17.1에 열거된 miRNA는 조직 재생에 관한 과정과 관련된 miRNA의 예를 제공한다. miR-15b는 BCL-2 및 카스파제 조절을 통한 아폽토시스 [참조: Guo et al., 2009. J Hepatol. 50(4):766-78] 및 사이클린의 조절을 통한 세포 주기 진행 [참조: Xia et al., 2009. Biochem Biophys Res Commun. 380(2):205-10]의 조절과 관련되었다. miR-21은 생존 경로 MAPK/ERK를 조절함으로써 아폽토시스를 억제하는 것으로 밝혀졌다. miRNA의 miR-30은 발세포 구조 및 기능에 중요하며, 이의 증가가 사구체형성에 필수적일 수 있다는 것을 제시한다. miR-141, 200a, 200c 및 429는 모두 TGF-β 시그널링에 반응하여 상피-중간엽 이행 (EMT)을 조절하는데 수반되며 가능하게는 섬유증을 감소시킨다 [참조: Saal et al., 2009. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 18:317-323]. miR-146a 및 151은 NFκB 조절에 관련되었으므로 잠재적으로 생체내에서 염증 반응을 감소시킨다 [참조: Taganov et al., 2006. Proc Natl Acad Sci U S A. 103(33):12481-6; Griffiths-Jones et al., 2006. NAR. 34 Database Issue: D140-D144]. 종합하면, 이들 miRNA는 성공적인 재생 결과와 관련된 과정을 조절하므로, 이들은 검정 개발을 위한 후보 바이오마커이다. 결론적으로, 이러한 자료는 소변의 미세소포 및/또는 이의 내강 내용물이 의사에게 치료를 모니터링하는 비-침습적 수단을 제공할 뿐만 아니라 TGFβ-1, NFκB, 아폽토시스, 세포 분열 및 전분화능을 비롯한 다수의 과정을 조절할 수 있는 단백질 및 miRNA를 포함하므로 재생 검정을 위한 유망한 표적물이라는 것을 지지한다.
실시예 20 - 인간 신장 세포 집괴를 제조하는 방법
앞서 기술된 바와 같이, NKA를 생성하기 위한 표준 작업 절차를 이용하여 인간 신장 세포를 분리하였다. 저 산소 환경 (2% 02)에 18시간 동안 노출하기에 앞서, 세포를 확대하고 2회 계대-배양하였다. 노출 후, 이들 세포를 수확하고, 2-단계 밀도 구배 (7%와 16% w/v Optiprep)를 수행하고, 그리고 중단 없이 800 x g에서 20분 동안 원심분리하였다. 7%와 16% 층 사이에 형성된 결과의 밴드를 수집하고 세척하였다 (B2,B3,B4). 이들 세포를 계산하고 생존능을 평가하였다. 부착을 예방하기 위해 코팅되고 배양기 내에 궤도 회전기 상에 24시간 동안 배치된 폴리-HEMA인 다중-웰 평판에서 세포 (20-30 x 103 세포/cm2)를 배양함으로써 세포 집괴 또는 회전타원체를 생성하였다 (도 30A). 대안으로, 밴드 세포를 ml당 1x106 세포의 농도에서 75ml의 신장 성장 배지에서 재현탁시키고, 그리고 37℃/5% CO2에서 배양기 내에 자성 교반기 (4-40 rpm) 상에서 125ml 스피너 플라스크 (BD) 내로 배치하였다 (도 30B). 표현형적 변화를 검정하기에 앞서 24-48시간 동안, 이들 세포를 자기 집합하도록 방치하여 회전타원체를 생성하였다 (도 31). 이들 세포는 스피너 플라스크 내에서 검정되거나, 또는 검정(들)을 위하여, 회전타원체를 유지하는 더욱 작은 폴리-HEMA 코팅된 다중웰 평판으로 이전될 수 있다. 표현형적 변화, 기능, 생존능, 그리고 아폽토시스를 측정하기 위해 다수의 적절한 검정이 수행된다. 표 7은 예시적인 검정 및 상응하는 결과를 제공한다.
신장 회전타원체 상에서 기능적 마커의 실례
마커 기능
NKCC2
(도 32)		 염화나트륨의 활성 재흡수가 매개되는 신장에서 발현됨
GGT-1
(도 33)
GGT-1은 세포외 글루타티온 붕괴 (GSH)를 개시한다
Aqp-1
(도 34)
물 수송과 연관된 근위 세뇨관 마커
LAP-3
(도 35)		 세포내 단백질과 아미노산의 가공처리와 전환에 관여
OAT-1
(도 36)		 음이온성 기질을 수송하고 독소를 제거하는데 중요
쿠빌린
(도 37)		 쿠빌린 결합된 리간드, 예를 들면, 알부민, 비타민 B12, 아포리포단백질 Al의 내재화에 요구되는 메갈린에 결합될 때 기능적으로 이입

Claims (18)

  1. 인간 피험자에서 신장 질환을 치료하기 위한, 생체활성 신장 세포를 포함하는 약제학적 제제이며,
    상기 생체활성 신장 세포가 제1 농축 신장 세포 집단을 포함하고;
    상기 제1 농축 신장 세포 집단은 (a) 신장 세뇨관 세포; 또는 (b) 신장 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포로 농축되고,
    상기 생체활성 신장 세포가 생체물질 부피 전체에 현탁되고 분산되며;
    상기 생체물질은 하이드로겔을 포함하고 온도-민감성이며;
    상기 온도-민감성은
    (i) 8℃ 또는 그 이하에서 고형 상태이고, 상기 고형 상태가 겔 상태이며;
    (ii) 37℃에서 액상 상태이고;
    (iii) 8℃ 내지 주위 온도 또는 그 이상에서 전이(transitional) 상태이고, 상기 주위 온도가 18℃ 내지 30℃ 범위인 것이고;
    상기 생체물질은 상기 생체활성 신장 세포가 인간 피험자의 고유 신장과 통합하는 것을 허용하는 것이고,
    인간 피험자에서 신장 질환을 치료하는 것이 피험자의 신장에 재생 효과를 제공하는 것을 포함하는 것인, 약제학적 제제.
  2. 제1항에 있어서, 제1 농축 신장 세포 집단이 신장 세뇨관 세포로 농축된 것인, 약제학적 제제.
  3. 제1항에 있어서, 제1 농축 신장 세포 집단이 신장 EPO-생성 세포로 농축된 것인, 약제학적 제제.
  4. 제3항에 있어서, 신장 세뇨관 세포로 농축된 제2 농축 신장 세포 집단을 추가로 포함하는 약제학적 제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생체물질이 젤라틴을 포함하는 것인, 약제학적 제제.
  6. 제5항에 있어서, 젤라틴이 생체물질 내에 0.5% 내지 1.0% w/v 농도로 존재하는 것인, 약제학적 제제.
  7. 제6항에 있어서, 젤라틴이 생체물질 내에 0.75% w/v 농도로 존재하는 것인, 약제학적 제제.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 신장 세포로부터 분리된 소포(vesicle)를 추가로 포함하는 약제학적 제제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 소포가 엑소솜(exosome)을 포함하는 것인, 약제학적 제제.
  10. 제8항에 있어서, 상기 소포가 미세소포(microvesicle)를 포함하는 것인, 약제학적 제제.
  11. 제8항에 있어서, 상기 소포가 마이크로RNA(microRNA)를 포함하는 것인, 약제학적 제제.
  12. 제11항에 있어서, 상기 마이크로RNA가 플라스미노겐 활성자 억제제-1(PAI-1)을 억제하는 것인, 약제학적 제제.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생체활성 신장 세포가 신장 시료로부터 유래되는 것인, 약제학적 제제.
  14. 제13항에 있어서, 신장 시료가 신장 생검인 것인, 약제학적 제제.
  15. 제13항에 있어서, 신장 시료가 피험자로부터 수득되는 것인, 약제학적 제제.
  16. 제15항에 있어서, 신장 시료가 신장 생검 시료인 것인, 약제학적 제제.
  17. 삭제
  18. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 재생 효과는 신장 섬유증을 감소시키는 것인, 약제학적 제제.
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