ES2936256T3 - Uso de microvesículas en el diagnóstico, y pronóstico de enfermedades y afecciones médicas - Google Patents

Abstract

El objeto descrito en la presente se refiere a métodos para ayudar al diagnóstico, pronóstico, seguimiento y evaluación de una enfermedad u otra afección médica en un sujeto mediante la detección de un biomarcador en microvesículas aisladas de una muestra biológica del sujeto. Además, la materia descrita está dirigida a métodos de diagnóstico, seguimiento de una enfermedad mediante la determinación de la concentración de microvesículas dentro de una muestra biológica; métodos para administrar un ácido nucleico o una proteína a un objetivo mediante la administración de microvesículas que contienen dicho ácido nucleico o proteína; metodos para realizar una transfusion de fluido corporal introduciendo una fraccion de fluido libre de microvesiculas o enriquecida en microvesiculas en un paciente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de microvesículas en el diagnóstico, y pronóstico de enfermedades y afecciones médicas

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad de las solicitudes provisionales US 61/025,536, presentada el 1 de febrero de 2008 y 61/100,293, presentada el 26 de septiembre de 2008.

Apoyo gubernamental

Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo las subvenciones NCI CA86355 y NCI CA69246 otorgadas por el National Cancer Institute. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a los campos del diagnóstico médico, el monitoreo del paciente, la evaluación de la eficacia del tratamiento, entrega de ácido nucleico y proteína, y la transfusión de sangre.

Antecedentes de la invención

Los glioblastomas son tumores cerebrales altamente malignos con un mal pronóstico a pesar de una intensa investigación y los esfuerzos clínicos (Louis y otros, 2007). La naturaleza invasiva de este tumor hace imposible la resección quirúrgica completa y el tiempo de supervivencia medio es sólo de 15 meses aproximadamente (Stupp y otros, 2005). Las células de glioblastoma así como también muchas otras células tumorales tienen una notable capacidad para moldear su medio ambiente estromal en su propio beneficio. Las células tumorales alteran directamente las células circundantes normales para facilitar el crecimiento de la célula tumoral, invasión, quimioresistencia, inmune-evasión y metástasis (Mazzocca y otros, 2005; Muerkoster y otros, 2004; Singer y otros, 2007). Las células tumorales además secuestran la vasculatura normal y estimulan la rápida formación de nuevos vasos sanguíneos para suministrar nutrientes al tumor (Carmeliet y Jain, 2000). Aunque el sistema inmune puede suprimir inicialmente el crecimiento del tumor, frecuentemente se embota progresivamente por la activación del tumor de las rutas inmunosupresivas (Gabrilovich, 2007).

Las pequeñas microvesículas desprendidas por las células se conocen como exosomas (Thery y otros, 2002). Los exosomas se reportan como que tienen un diámetro de aproximadamente 30-100 nm y se desprenden de muchos tipos de células diferentes tanto bajo condiciones normales y patológicas (Thery y otros, 2002). Estas microvesículas se describieron por primera vez como un mecanismo para retirar receptores de transferrina de la superficie celular de los reticulocitos maduros (Pan y Johnstone, 1983). Los exosomas se forman a través de la gemación interna de las membranas endosomales que dan lugar a cuerpos multivesiculares intracelulares (MVB) que luego se fusionan con la membrana plasmática, liberando los exosomas al exterior (Thery y otros, 2002). Sin embargo, ahora hay pruebas para una liberación más directa de los exosomas. Ciertas células, tales como las células T Jurkat, se dice que desprenden directamente exosomas por gemación hacia el exterior de la membrana plasmática (Booth y otros, 2006). Todas las vesículas de membrana desprendidas por las células se refieren colectivamente en la presente invención como microvesículas.

Las microvesículas en Drosophila melanogaster, llamadas argosomas, se dice que contienen morfógenos tales como la proteína Wingless y que se mueven a grandes distancias a través del epitelio del disco imaginal en embriones deDrosophila melanogaster en desarrollo (Greco y otros, 2001). Las microvesículas encontradas en el semen, conocidas como prostasomas, se expone que tienen una amplia variedad de funciones que incluye la promoción de la movilidad de los espermatozoides, la estabilización de la reacción del acrosoma, la facilitación de la inmunosupresión y la inhibición de la angiogénesis (Delves y otros, 2007). Por otro lado, los prostasomas liberados por las células de próstata malignas se dice que promueven la angiogénesis. Las microvesículas se dice que transfieren proteínas (Mack y otros, 2000) y estudios recientes exponen que esas microvesículas aisladas a partir de líneas celulares diferentes además pueden contener ARN mensajero (ARNm) y microARN (miARN) y pueden transferir ARNm a otros tipos de células (Baj-Krzyworzeka y otros, 2006; Valadi y otros, 2007)

Las microvesículas derivadas de las células B y las células dendríticas se establece que tienen efectos inmuno estimuladores y antitumorales potentes in vivo y se usan como vacunas antitumorales (Chaput y otros, 2005). Las microvesículas derivadas de las células dendríticas se exponen que contienen las proteínas coestimuladoras necesarias para la activación de las células T, mientras que la mayoría de las microvesículas derivadas de células tumorales no (Wieckowski y Whiteside, 2006). Las microvesículas aisladas a partir de células tumorales pueden actuar para suprimir la respuesta inmune y acelerar el crecimiento tumoral (Clayton y otros, 2007; Liu y otros, 2006a). Las microvesículas de cáncer de mama pueden estimular la angiogénesis, y las microvesículas derivadas de plaquetas pueden promover la progresión tumoral y la metástasis de células de cáncer de pulmón (Janowska-Wieczorek y otros, 2005; Millimaggi y otros, 2007).

Los cánceres surgen a través de la acumulación de alteraciones genéticas que promueven el crecimiento celular ilimitado. Se ha expuesto que cada uno de esos tumores albergan, en promedio, alrededor de 50 a 80 mutaciones que están ausentes en las células no tumorales (Jones y otros, 2008; Parsons y otros, 2008; Wood y otros, 2007). Las técnicas actuales para detectar estos perfiles de mutación incluyen el análisis de muestras de biopsia y el análisis no invasivo de fragmentos de ADN de tumores mutantes que circulan en fluidos corporales tales como la sangre (Diehl y otros, 2008). El primer método es invasivo, complicado y posiblemente nocivo para los sujetos. El último método carece intrínsecamente de sensibilidad debido al número muy bajo de copias de ADN de cáncer mutante en el fluido corporal (Gormally y otros, 2007). Por lo tanto, un desafío orientado al diagnóstico del cáncer es desarrollar un método de diagnóstico que pueda detectar celulas tumorales en las diferentes etapas de forma no invasiva, sin embargo con alta sensibilidad y especificidad. Además se ha expuesto que esos perfiles de expresión génica (que codifican ARNm o microARN) pueden distinguir el tejido canceroso y no canceroso (Jones y otros, 2008; Parsons y otros, 2008; Schetter y otros, 2008). El documento WO2005121369 se refiere a vesículas que contienen ARN y sus métodos. Sin embargo, las técnicas actuales de diagnóstico para la detección de perfiles de expresión génica requieren biopsia invasiva de tejidos. Algunos procedimientos de biopsia causan alto riesgo y son potencialmente nocivos. Por otra parte, en un procedimiento de biopsia, las muestras de tejido se toman a partir de un área limitada y pueden dar falsos positivos o falsos negativos, especialmente en tumores que son heterogéneos y/o dispersados dentro del tejido normal. Por lo tanto, un método de diagnóstico no invasivo y sensible para la detección de biomarcadores sería altamente deseable.

Resumen de la invención

La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. Generalmente, la divulgación se refiere a un nuevo método para detectar en un sujeto la presencia o ausencia de una diversidad de biomarcadores contenidos en las microvesículas, ayudando de ese modo al diagnóstico, seguimiento y evaluación de enfermedades, otras afecciones médicas y la eficacia del tratamiento asociado con biomarcadores de microvesículas. El método de la invención se define en la presente reivindicación 1.

Se divulgan, pero no definen la invención reivindicada, métodos para ayudar en el diagnóstico o monitoreo de una enfermedad u otra condición médica en un sujeto, que comprenden las etapas de: a) aislar una fracción de microvesículas de una muestra biológica del sujeto; yb) detectar la presencia o ausencia de un biomarcador dentro de la fracción de microvesículas, en donde el biomarcador está asociado con la enfermedad u otra condición médica. Los métodos pueden comprender además la etapa o etapas de comparar el resultado de la etapa de detección con un control (por ejemplo, comparar la cantidad de uno o más biomarcadores detectados en la muestra con uno o más niveles de control), donde se diagnostica que el sujeto tiene la enfermedad u otra afección médica (por ejemplo, cáncer) si existe una diferencia medible en el resultado de la etapa de detección en comparación con un control.

Se divulga, pero no define la invención reivindicada, un método para ayudar en la evaluación de la eficacia del tratamiento en un sujeto, que comprende las etapas de: a) aislar una fracción de microvesícula a partir de una muestra biológica del sujeto; y b) detectar la presencia o ausencia de un biomarcador dentro de la fracción de microvesícula, en donde el biomarcador se asocia con la eficacia del tratamiento para una enfermedad u otra afección médica. El método puede comprender además la etapa de proporcionar una serie de muestras biológicas durante un periodo de tiempo del sujeto. Además, el método puede comprender además la etapa o etapas de determinar cualquier cambio medible en los resultados de la etapa de detección (por ejemplo, la cantidad de uno o más biomarcadores detectados) en cada una de las muestras biológicas a partir de la serie para así evaluar la eficacia del tratamiento para la enfermedad u otra afección médica.

En ciertas realizaciones preferidas, la muestra biológica del sujeto es una muestra de fluido corporal. Los fluidos corporales particularmente preferidos son la sangre y la orina. De acuerdo con la invención reivindicada, la muestra es suero u orina.

En ciertas realizaciones preferidas de los aspectos anteriores de la invención, los métodos comprenden además el aislamiento de una fracción de microvesículas selectiva derivada de células de un tipo específico (por ejemplo, células cancerosas o tumorales). Además, la fracción selectiva de microvesículas puede consistir esencialmente en microvesículas urinarias.

En ciertas realizaciones de los aspectos anteriores de la invención, el biomarcador asociado con una enfermedad u otra condición médica es i) una especie de ácido nucleico; ii) un nivel de expresión de uno o más ácidos nucleicos; iii) una variante de ácido nucleico; o iv) una combinación de cualquiera de los anteriores. Las realizaciones preferidas de dichos biomarcadores incluyen ARN mensajero, microARN, ADN, ADN monocatenario, ADN complementario y ADN no codificante.

En ciertas realizaciones de los aspectos anteriores de la invención, la enfermedad u otra afección médica es una enfermedad o afección neoplásica (por ejemplo, glioblastoma, cáncer de páncreas, cáncer de mama, melanoma y cáncer colorrectal), una enfermedad o afección metabólica (por ejemplo, diabetes, inflamación, afecciones perinatales o una enfermedad o afección asociada con el metabolismo del hierro), una afección posterior al trasplante o una afección fetal.

Se divulga, pero no es parte de invención reivindicada, un método para ayudar en el diagnóstico o monitoreo de una enfermedad u otra afección médica en un sujeto, que comprende las etapas de a) obtener una muestra biológica del sujeto; y b) determinar la concentración de microvesículas dentro de la muestra biológica.

Se divulga, pero no es parte de invención reivindicada, un método para entregar un ácido nucleico o una proteína a una célula diana en un individuo que comprende las etapas de administración de las microvesículas que contienen el ácido nucleico o la proteína, o una o más células que producen tales microvesículas, al individuo de manera que las microvesículas entran en la célula diana del individuo. En una realización preferida de este aspecto de la invención, las microvesículas pueden ser suministradas a las células del cerebro.

Se divulga, pero no es parte de invención reivindicada, un método para realizar transfusión de fluido corporal (por ejemplo, sangre, suero o plasma), que comprende las etapas de obtener una fracción de fluido corporal del donante libre libre de todas o sustancialmente todas las microvesículas, o libre de todas o sustancialmente todas las microvesículas de tipo de célula particular (por ejemplo, células tumorales), e introducir la fracción libre de microvesícula en un paciente. Se divulga, pero no es parte de invención reivindicada, una composición de materia que comprende una muestra de fluido corporal (por ejemplo, sangre, suero o plasma) libre de todas o sustancialmente todas las microvesículas, o libre de todas o sustancialmente todas las microvesículas de un tipo de célula particular.

Se divulga, pero no es parte de invención reivindicada, un método para realizar transfusión de fluido corporal (por ejemplo, sangre, suero o plasma), que comprende las etapas de obtener una fracción enriquecida de microvesículas de fluido corporal del donante e introducir la fracción enriquecida de microvesículas a un paciente. En una realización preferida, la fracción es enriquecida con microvesículas derivadas de un tipo de célula particular. Se divulga, pero no es parte de invención reivindicada, una composición de materia que comprende una muestra de fluido corporal (por ejemplo, sangre, suero o plasma) enriquecida con microvesículas.

Se divulga, pero no es parte de invención reivindicada, un método para ayudar en la identificación de nuevos biomarcadores asociados con una enfermedad u otra afección médica, que comprende las etapas de obtener una muestra biológica de un sujeto; aislar una fracción de microvesícula de la muestra; y detectar dentro de la fracción de microvesícula especies de ácido nucleico; sus niveles de expresión respectivos o concentraciones; variantes de ácido nucleico; o combinaciones de los mismos.

Varios aspectos y realizaciones de la invención se describirán ahora con más detalle. Además, a menos que de cualquier otra manera sea requerido por el contexto, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular.

Todas las patentes, solicitudes de patentes y publicaciones identificadas describen y divulgan, por ejemplo, las metodologías descritas en dichas publicaciones que podrían usarse en relación con la presente invención. Estas publicaciones se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en este sentido debe interpretarse como una admisión de que los inventores no tienen derecho a anteceder dicha divulgación en virtud de una invención anterior o por cualquier otro motivo. Todas las declaraciones en cuanto a la fecha o representaciones en cuanto al contenido de estos documentos se basan en la información disponible para los solicitantes y no constituyen ninguna admisión en cuanto a la exactitud de las fechas o el contenido de estos documentos.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Las células de glioblastoma producen microvesículas que contienen ARN.

(a) Imagen de microscopía electrónica de barrido de una célula glioblastoma primario (bar = 10 m). (b) Un mayor aumento que muestra las microvesículas en la superficie celular. Las vesículas varían de tamaño con diámetros entre alrededor de 50 nm y alrededor de 500 nm (bar = 1 m). (c) Gráfico que muestra la cantidad de ARN total extraído a partir de microvesículas que se trataron o no se trataron con Ribonucleasa A. Las cantidades se indican como la absorbancia (Abs, eje y) de la longitud de onda de 260 nm (eje x). Los experimentos se repitieron 5 veces y se muestra un gráfico representativo. (d) Datos del Bioanalizador que muestran la distribución de tamaño del ARN total extraído a partir de células de glioblastoma primario y (e) datos del Bioanalizador que muestran la distribución de tamaño del ^a Rⁿ total extraído a partir de microvesículas aisladas a partir de células de glioblastoma primario. El pico 25 nt representa un estándar interno. Los dos picos prominentes en (d) (flechas) representan el ARN ribosomal 18S (flecha izquierda) y 28S (flecha derecha). Los picos ribosomales están ausentes del ARN extraído a partir de las microvesículas (e). (f) Imagen de microscopía electrónica de transmisión de microvesículas secretadas por las células de glioblastoma primario (bar = 100 nm).

Figura 2. Análisis del ARN de la microvesícula. Las FIGS. 2 (a) y 2 (b) son gráficos de dispersión de los niveles de ARNm en microvesículas y niveles de ARNm en células de glioblastoma de donante a partir de dos experimentos diferentes. Las regresiones lineales muestran que los niveles de ARNm en las células del donante contra las microvesículas no se correlacionan bien. Las FIGS. 2 (c) y 2 (d) son los niveles de ARNm en dos células de donantes diferentes o dos preparaciones de microvesículas diferentes. En contraste a las FIGS. 2 (a) y 2 (b), las regresiones lineales muestran que los niveles de ARNm entre células del donante FIG. 2 (c) o entre las microvesículas FIG. 2 (d) se correlacionan estrechamente.

Figura 3. Análisis del ADN de la microvesícula.

a) Amplificación del gen GAPDH con plantillas de ADN de exosomas tratados con DNasa antes de la extracción de ácido nucleico Los carriles se identifican como sigue:

1. MW en escalera de 100bp

2. Control negativo

3. Control de ADN genómico de células GBM 20/3

4. ADN de exosomas séricos normales (control libre de células tumorales)

5. ADN de exosoma de fibroblastos humanos normales (NHF19)

6. ADN de exosoma de células de meduloblastoma primario (D425)

b) amplificación del gen GAPDH con plantillas de ADN de exosomas sin tratamiento previo con DNasa. Los carriles se identifican como sigue:

1. MW en escalera de 100bp

2. ADN de célula de melanoma primario 0105

3. ADN de exosoma del melanoma 0105

4. Control negativo

5. ADNc de GBM 20/3 primario (control positivo)

c) Amplificación del gen Retrovirus K endógeno humano. Los carriles se identifican como sigue:

1. MW en escalera de 100 bp

2. ADN de exosoma del meduloblastoma D425 a

3. ADN de exosoma del meduloblastoma D425 b

4. ADN de exosoma de los fibroblastos humanos normales (NHF19)

5. ADN de exosoma de suero humano normal

6. ADN. genómico de GBM 20/3.

7. Control negativo

d) amplificación del gen Tenascina C. Los carriles se enumeran identificados de la siguiente manera:

1. MW en escalera de 100bp

2. Exosomas de fibroblastos humanos normales (NHF19)

3. Exosomas de suero (individuo A libre de célula tumoral)

4. Exosomas de suero (individuo B libre de célula tumoral)

5. Exosomas de célula de meduloblastoma primario D425

e) Amplificación del elemento transponible Carril 1. Los carriles se identifican como sigue:

1. MW en escalera de 100bp

2. ADN de exosoma de suero humano normal

3. ADN de exosoma de fibroblastos humanos normales

4. ADN de exosoma del meduloblastoma D425 a

5. ADN de exosoma de meduloblastoma D425 b

f) El ADN está presente en exosomas de célula de medulloblastoma D425. Los carriles se identifican como sigue: 1. marcador de 100bp

2. D425 sin DNasa

3. D425 con DNasa

4. marcador de 1kb

g) Análisis de ácidos nucleico monocatenario usando un chip pico de ARN. Panel superior: El ADN purificado no se trató con DNasa, panel inferior: El ADN purificado se trató con DNasa La flecha en el panel superior se refiere a los ácidos nucleicos detectados. El pico a 25 nt es un estándar interno.

h) Análisis de ácidos nucleicos contenidos en exosomas a partir de meduloblastoma primario D425. Panel superior: ácidos nucleicos monocatenarios detectados por un chip pico de ARN. Panel inferior: ácidos nucleicos bicatenarios detectados por un chip de ADN 1000. La flecha en el panel superior se refiere a los ácidos nucleicos detectados. Los dos picos (15 y 1500 bp) son estándar internos.

i) Análisis del ADN de exosoma a partir de distintos orígenes usando un chip pico de ARN.Panel superior: el ADN se extrajo de exosomas de células de glioblastoma. Panel inferior: el ADN se extrajo de exosomas de fibroblastos humanos normales.

Figura 4. La extracción de ARN extracelular a partir de suero es más eficiente cuando se incluye una etapa de aislamiento de exosomas de suero. a) ARN de exosoma de suero. b) la extracción completa directa de suero. c) pocillo vacío. Las flechas se refieren al ARN detectado en las muestras.

Figura 5. Comparación de los niveles de expresión génica entre microvesículas y células de origen. Se encontró que 3426 genes se distribuyeron diferencialmente en más de 5 veces en las microvesículas en comparación con las células de las que se derivaron (valor de p < 0.01).

Figura 6. Análisis ontológico de los ARN microvesiculares. (a) El gráfico circular visualiza la ontología de los procesos biológicos de las 500 especies más abundantes de ARNm en las microvesículas. (b) Gráfico que muestra la intensidad de los ARNs de microvesículas pertenecientes a ontologías relacionadas al crecimiento del tumor. El eje x representa el número de transcritos de ARNm presentes en la ontología. Los niveles medios de intensidad en los arreglos fueron 182.

Figura 7. Diagrama de agrupación de los niveles de ARNm. Se analizaron los datos del microarreglo sobre los perfiles de expresión de ARNm en las líneas celulares y los exosomas aislados a partir de los medios de cultivo de estas líneas celulares y se generaron grupos de perfiles de expresión. Las etiquetas de las especies de ARN son las siguientes:

20/3C-1: ARN celular Glioblastoma 20/3, réplica del arreglo 1

20/3C-2: ARN celular Glioblastoma 20/3, réplica del arreglo 2

11/5C: ARN celular Glioblastoma 11/5

0105C: ARN celular Melanoma 01050664C: ARN celular Melanoma 0664

0664 E-1: ARN del exosoma del Melanoma 0664, réplica del arreglo 1

0664 E-2: ARN del exosoma del Melanoma 0664, réplica del arreglo 2

0105E: ARN del exosoma del Melanoma 0105

20/3E: ARN del exosoma del Glioblastoma 20/3

11/5E-1: Exosomas del Glioblastoma 11/5, réplica del arreglo 1

11/5E-2: Exosomas del Glioblastoma 11/5, réplica del arreglo 2

GBM: glioblastoma. La escala se refiere a la distancia entre los grupos.

Figura 8. Las microvesículas de suero contienen microRNAs. Se analizaron los niveles de miARNs maduros extraídos a partir de microvesículas y de células de glioblastoma de dos pacientes diferentes (GBM1 y GBM2) usando la RT-PCR cuantitativa de miARN. El valor de ciclo umbral (Ct) se presenta como la media ± SEM (n = 4).

Figura 9. Diagrama de agrupación de los niveles de microARN. Se analizaron los datos del microarreglo sobre los perfiles de expresión de microARN en las líneas celulares y los exosomas aislados a partir de los medios de cultivo de estas líneas celulares y se generaron grupos de perfiles de expresión. Las etiquetas de las especies de ARN son las siguientes:

0664C-1: ARN celular de Melanoma 0664, réplica del arreglo 1

0664C-2: ARN celular de Melanoma 0664, réplica del arreglo 2

0105C-1: ARN celular de Melanoma 0105, réplica del arreglo 1

0105C-2: ARN celular de Melanoma 0105, réplica del arreglo 2

20/3C-1: ARN celular Glioblastoma 20/3, réplica del arreglo 1

20/3C-2: ARN celular Glioblastoma 20/3, réplica del arreglo 2

11/5C-1: ARN celular de Glioblastoma 11/5, réplica del arreglo 1

11/5C-2: ARN celular de Glioblastoma 11/5, réplica del arreglo 2

11/5E-1: Exosomas del Glioblastoma 11/5, réplica del arreglo 1

11/5E-2: Exosomas del Glioblastoma 11/5, réplica del arreglo 2

20/3E-1: ARN de exosoma de Glioblastoma 20/3, réplica del arreglo 1

20/3E-2: ARN de exosoma de Glioblastoma 20/3, réplica del arreglo 2

0664 E: ARN de exosoma de Melanoma 0664

0105E-1: ARN de exosoma de Melanoma 0105, réplica del arreglo 1

0105E-2: ARN de exosoma de Melanoma 0105, réplica del arreglo 2

GBM: Glioblastoma. La escala se refiere a la distancia entre los grupos.

Figura 10. El nivel de expresión de microARN-21 en microvesículas de suero se asocia con glioma. Se muestra un gráfico de barras, suero control normal en la izquierda, suero glioma a la derecha. La RT-PCR cuantitativa se usó para medir los niveles de microARN-21 (miR-21) en exosomas a partir de suero de pacientes con glioblastoma así como también los controles de pacientes normales. El suero glioblastoma mostró una reducción de 5.4 del valor de Ct, correspondiente a un aumento aproximadamente de 40 (2Act) veces de miR21. Los niveles de miR21 se normalizaron a GAPDH en cada muestra (n=3).

Figura 11. La RT-PCR anidada se usó para detectar ARNm de EGFRvlII en muestras de tumores y exosomas de suero correspondientes. El producto de PCR silvestre EGFR aparece como una banda a 1153 bp y el producto de PCR EGFRvlII aparece como una banda a 352 bp. La RT-PCR de ARNm de GAPDH se incluyó como un control positivo (226 bp). Las muestras que se consideran positivas para EGFRvlII se indican con un asterisco. Los pacientes 11, 12 y 14 mostraron sólo una amplificación débil de EGFRvIII en la muestra de tumor, pero fue evidente cuando se cargaron más muestras.

Figura 12. La RT PCR anidada de EGFRvIII se realizó en microvesículas a partir de 52 sueros controles normales. El EGFRvIII (352 bp) nunca se encontró en los sueros controles normales. La PCR de GAPDH (226 bp) se incluyó como un control.

Figura 13. El ARNm de la hepcidina puede detectarse dentro de exosomas de suero humano. A) Pseudo gel generado por un Bioanalizador Agilent. B) Gráfico primario generado por un Bioanalizador Agilent para el control positivo (Muestra 1). C) Gráfico primario generado por un Bioanalizador Agilent para el control negativo (Muestra 2). D) Gráfico primario generado por un Bioanalizador Agilent para los exosomas (Muestra 3).

Figura 14. Aislamiento de exosomas urinarios e identificación de ácido nucleico dentro de exosomas urinarios. (a) Imagen de microscopía electrónica de un cuerpo multivesicular (MVB) que contiene muchos "exosomas" pequeños en una célula del túbulo renal. (b) Imagen de microscopía electrónica de exosomas urinarios aislados. (c) Análisis de transcritos de ARN contenidos dentro de exosomas urinarios por un Bioanalizador Agilent. Se identificó una extensa variedad de especies de ARN pero estaban ausentes ambos ARNs ribosomales 18S y 28S. (d) Identificación de varios transcritos de ARN en exosomas urinarios mediante PCR. Los transcritos así identificados fueron: Acuaporina 1 (AQP1); Acuaporina 2 (AQP2); Cubilina (CUBN); Megalina (LRP2); Receptor Arginina Vasopresina (Av PR2); Intercambiador sodio/hidrógeno 3 (SLC9A3); subunidad B1 de la ATPasa V (ATP6V1B1); Nefrina (N^p HS1); Podocina (NPHS2); y Canal de cloruro 3 (CLCN3). De arriba a abajo, las cinco bandas en el carril de peso molecular (MW) corresponden a fragmentos de 1000, 850, 650, 500, 400, 300 pares de bases. (e) Diagramas del Bioanalizador de ácidos nucleicos exosomales a partir de las muestras de orinas. Los números se refieren a la numeración de los individuos humanos. (f) Pseudogeles que representan los productos de PCR generados con diferentes pares de iniciadores usando los extractos de ácidos nucleicos descritos en (e). Casa se refiere al gen de la actina y los iniciadores de actina son de Ambion (TX, Estados Unidos). El control ve se refiere a las PCRs que usan ADNc de riñón humano de Ambion (TX, Estados Unidos) como las plantillas y el control -ve se refiere a las PCRs sin plantillas de ácido nucleico. (g) Ilustración del pseudogel que muestra la identificación positiva de ADNc del gen de la actina a través de PCR con y sin el tratamiento con DNasa de los exosomas antes de la extracción del ácido nucleico. (h) Diagramas del Bioanalizador que muestran la cantidad de ácidos nucleicos aislados de exosomas urinarios humanos.

Figura 15. Análisis de biomarcadores de cáncer de próstata en exosoma urinarios. (a) Ilustraciones del gel que muestran los productos de la PCR del genTMPRSS2-ERG y fragmentos digeridos de los productos de la PCR. P1 y P2 se refieren a las muestras de orina del paciente 1 y paciente 2, respectivamente. Para cada muestra, el producto no digerido está en el carril de la izquierda y el producto digerido está en el carril de la derecha. MWM indica los carriles con marcadores de MW. Los tamaños de las bandas (tanto no digerido y digerido) se indican a la derecha del panel. (b) Ilustraciones del gel que muestran los productos de la PCR del gen PCA3 y fragmentos digeridos de los productos de la PCR. P1, P2, P3 y P4 se refieren a las muestra de orina del paciente 1, paciente 2, paciente 3 y paciente 4, respectivamente. Para cada muestra, el producto no digerido está en el carril de la izquierda y el producto digerido está en el carril de la derecha. MWM indica carriles con marcadores de MW. Los tamaños de las bandas (tanto no digerido y digerido) se indican a la derecha del panel. (c) Un sumario de la información de los pacientes y los datos presentados en (a) y (b). TMERG se refiere al gen de fusión TMPRSS2-ERG.

Figura 16. El ARNm de BRAF está contenido dentro de microvesículas desprendidas por las células de melanoma. (a) Una ilustración del gel de electroforesis que muestra los productos de la RT-PCR de la amplificación del gen de BRAF. (b) Una ilustración del gel de electroforesis que muestra los productos de la RT- PCR de la amplificación del gen de GAPDH. Los carriles y sus correspondientes muestras son los siguientes: Carril #1 - marcador de peso molecular de 100 bp; Carril #2 - exo YUMEL-01-06; Carril #3 - células YUMEL-01- 06; Carril # 4 exo YUMEL-06-64; Carril # 5. Células YUMEL-0664; Carril # 6. Exo M34; Carril # 7 células-M34; Carril # 8 - células de fibroblastos; Carril # 9 - Control negativo El término de referencia "exo" significa que el ARN se extrajo a partir de los exosomas en los medios de cultivo. El término de referencia "célula" significa que el ARN se extrajo a partir de las células cultivadas. Los números que siguen a YUMEL se refieren a la identificación de un lote específico de la línea celular YUMEL. (c) Resultados de la secuenciación de los productos de la PCR de exo YUMEL-01-06. Los resultados de células YUMEL-01-06, exo YUMEL-06-64 y células YUMEL-06-64 son los mismos que los de exo YUMEL-01-06. (d) Resultados de la secuenciación de los productos de la PCR de exo M34. Los resultados de las células M34 son los mismos que los de exo M34.

Figura 17. Las microvesículas de glioblastoma pueden liberar ARN funcional a HBMVECs. (a) Las microvesículas purificadas se marcaron con colorante de membrana PKH67 (verde) y se añadieron a HBMVECs. Las microvesículas se internalizaron en estructuras similares a endosomas dentro de una hora. (b) Las microvesículas se aislaron a partir de células de glioblastoma que expresan establemente Gluc. La extracción del ARN y la RT-PCR de los ARNm de Gluc y GAPDH mostraron que ambos se incorporaron a las microvesículas. (c) Las microvesículas se añadieron después a HBMVECs y se incubaron por 24 horas. La actividad Gluc se midió en el medio a 0, 15 y 24 horas luego de la adición de la microvesícula y se normalizó a la actividad Gluc en las microvesículas. Los resultados se presentan como la media ± SEM (n = 4).

Figura 18. Las microvesículas de glioblastoma estimulan la angiogenesis in vitro y contienen proteínas angiogénicas. (a) HBMVECs se cultivaron en Matrigel™ en medio basal (EBM) solo, o suplementado con microvesículas de GBM (EBM+MV) o factores angiogénicos (EGM). La formación de túbulos se midió luego de 16 horas como la longitud promedio del túbulo ± SEM en comparación con las células crecidas en EBM (n = 6). (b) Se analizaron las proteínas totales a partir de células de glioblastoma primario y microvesículas (MV) de estas células (1 mg cada una) en un arreglo de anticuerpos de la angiogénesis humana. (c) Los arreglos se escanearon y las intensidades se analizaron con el programa informático Image J (n = 4).

Figura 19. Las microvesículas aisladas a partir de células de glioblastoma primario promueven la proliferación de la línea celular de glioblastoma U87. Se sembraron 100.000 células U87 en pocillos de una placa de 24 pocillos y se dejaron crecer por tres días en (a) medio de crecimiento normal (DMEM-5% FBS) o (b) medio de crecimiento normal suplementado con 125 |jg de microvesículas. (c) Luego de tres días, las células no suplementadas se expandieron a 480,000 células, mientras que las células suplementadas con microvesículas se expandieron a 810,000 células. NC se refiere a las células crecidas en medio control normal y MV se refiere a las células crecidas en el medio suplementado con microvesículas. El resultado se presenta como la media ± SEM (n=6).

Descripción detallada de la invención

Las microvesículas son desprendidas por las células eucariotas, o germinan fuera de la membrana plasmática, al exterior de la célula. Estas vesículas de membrana son de tamaño heterogéneo con diámetros en el intervalo de aproximadamente 10nm a aproximadamente 5000 nm. Las microvesículas pequeñas (aproximadamente 10 a 1000nm, y más frecuentemente 30 a 200 nm de diámetro) que se liberan por exocitosis de cuerpos intracelulares multivesiculares son referidas en la técnica como "exosomas". Los métodos y composiciones descritos en la presente invención son igualmente aplicables a microvesículas de todos los tamaños; preferentemente de 30 a 800 nm, y con mayor preferencia de 30 a 200 nm.

En algunas literaturas, el término "exosoma" se refiere además a complejos de proteínas que contienen exorribonucleasas que están involucradas en la degradación del ARNm y el procesamiento de los ARNs pequeños nucleolares (snoARNs), ARNs pequeños nucleares (snARN) y ARN ribosomales (ARNr) (Liu y otros, 2006b; van Dijk y otros, 2007). Tales complejos de proteínas no tienen membranas y no son "microvesículas" o "exosomas" tal como se usan aquí estos términos.

Los exosomas como herramientas de diagnóstico y/o pronóstico

Ciertos aspectos de la presente divulgación se basan en el hallazgo sorprendente de que las microvesículas derivadas de glioblastoma pueden aislarse a partir del suero de pacientes con glioblastoma. Este es el primer descubrimiento de microvesículas derivadas de células en el cerebro, presentes en el fluido corporal de un sujeto. Antes de este descubrimiento no se sabía si las células de glioblastoma producían microvesículas o si tales microvesículas podrían cruzar la barrera de hematoencefálica al resto del cuerpo. Se encontró que estas microvesículas contienen ARNm mutante asociado con células tumorales. Las microvesículas contenían además microARNs (miARNs) los que se encontraron abundantes en los glioblastomas. Además se encontraron microvesículas derivadas de glioblastoma para promover potentemente las características angiogénicas en las células primarias endoteliales microvesiculares del cerebro humano (HBMVEC) en cultivo. Este efecto angiogénico fue mediado al menos en parte a través de las proteínas angiogénicas presentes en las microvesículas. Los ácidos nucleicos que se encuentran dentro de estas microvesículas, así como también otros contenidos de las microvesículas tales como proteínas angiogénicas, pueden usarse como biomarcadores valiosos para el diagnóstico de tumores, la caracterización y el pronóstico al proporcionar un perfil genético. El contenido dentro de estas microvesículas puede usarse además para monitorerar la progresión del tumor en el tiempo mediante el análisis de si otras mutaciones se adquieren durante la progresión del tumor así como también si los niveles de ciertas mutaciones favorecen que aumenten o disminuyan en el tiempo o en el curso del tratamiento.

Ciertos aspectos de la presente divulgación se basan en el hallazgo de que las microvesículas son secretadas por células tumorales y circulan en los fluidos corporales. El número de microvesículas aumenta a medida que el tumor crece. La concentración de las microvesículas en los fluidos corporales es proporcional a la carga tumoral correspondiente. Cuanto más grande sea la carga tumoral, mayor será la concentración de microvesículas en los fluidos corporales.

Ciertos aspectos de la presente divulgación se basan en otro sorprendente hallazgo de que la mayoría de los ARNs extracelulares en los fluidos corporales de un sujeto están contenidos dentro de las microvesículas y protegidos así de la degradación por ribonucleasas. Como se muestra en el Ejemplo 3, más del 90% del ARN extracelular en el suero total puede recuperarse en las microvesículas.

Se divulgan, pero no forman parte de la invención reivindicada, los métodos para detectar, diagnosticar, monitorear, tratar o evaluar una enfermedad u otra afección médica en un sujeto mediante la determinación de la concentración de microvesículas en una muestra biológica. La determinación puede realizarse usando la muestra biológica sin aislar primero las microvesículas o aislando primero las microvesículas.

La presente invención se refiere a un método como se define en la presente reivindicación 1, en el que dicho método es para detectar, diagnosticar, monitorear, tratar o evaluar una enfermedad u otra afección médica en un sujeto que comprende las etapas de, aislar exosomas de un fluido corporal de un sujeto, y analizar uno o más ácidos nucleicos contenidos dentro de los exosomas. Los ácidos nucleicos se analizan cualitativa y/o cuantitativamente, y los resultados se comparan con los resultados esperados u obtenidos para uno o más sujetos que tienen o no tienen la enfermedad u otra afección médica. La presencia de una diferencia en el contenido de ácido nucleico microvesicular del sujeto, en comparación con la de uno o más individuos, puede indicar la presencia o ausencia de, la progresión de (por ejemplo, cambios de tamaño tumoral y la malignidad del tumor), o la susceptibilidad a una enfermedad u otra afección medica en el sujeto.

Claramente, los métodos de aislamiento y las técnicas descritas en la presente invención proporcionan las siguientes ventajas sin realizarse hasta ahora: 1) la oportunidad de analizar de forma selectiva ácidos nucleicos específicos de la enfermedad o el tumor, lo que puede realizarse mediante el aislamiento de microvesículas específicas de la enfermedad o el tumor aparte de otras microvesículas dentro de la muestra de fluido; 2) rendimiento significativamente mayor de especies de ácidos nucleicos con una mayor integridad de la secuencia en comparación con el rendimiento/integridad obtenido mediante la extracción de ácidos nucleicos directamente de la muestra del fluido; 3) la escalabilidad, por ejemplo para detectar ácidos nucleicos expresados a bajos niveles, la sensibilidad puede aumentarse mediante la sedimentación de más microvesículas a partir de un mayor volumen de suero; 4) los ácidos nucleicos más puros en los que las proteínas y lípidos, los residuos de células muertas, y otros contaminantes potenciales e inhibidores de la PCR son excluidos de los sedimentos de microvesículas antes de la etapa de extracción del ácido nucleico; y 5) más opciones en los métodos de extracción de ácidos nucleicos como los sedimentos de microvesículas son de volumen mucho más pequeño que el del suero de partida, haciendo posible extraer los ácidos nucleicos a partir de estos sedimentos de microvesículas usando filtros de columnas de pequeño volumen.

Las microvesículas se aíslan preferentemente de una muestra tomada de un fluido corporal de un sujeto. Como se usa en la presente, un "fluido corporal" se refiere a una muestra de fluido aislado a partir de cualquier parte del cuerpo del sujeto, preferentemente una ubicación periférica, que incluye pero sin limitarse a, por ejemplo, sangre, plasma, suero, orina, esputo, fluido de la médula espinal, fluido pleural, aspirados de pezón, fluido linfático, fluido de los tractos respiratorio, intestinal, y genitourinario, fluido lagrimal, saliva, leche materna, el fluido del sistema linfático, semen, fluido cerebroespinal, fluido del sistema intraórgano, fluido ascítico, fluido de quiste tumoral, fluido amniótico y combinaciones de los mismos.

El término "sujeto" incluye todos los animales que muestran o se espera que tengan microvesículas. En realizaciones particulares, el sujeto es un mamífero, un primate humano o no humano, un perro, un gato, un caballo, una vaca, otros animales de granja, o un roedor (por ejemplo ratones, ratas, conejillo de indias. etc.). El término "sujeto" e "individuo" se usa indistintamente en la presente invención.

Los métodos para aislar microvesículas de una muestra biológica son conocidos en la técnica. Por ejemplo, un método de centrifugación diferencial se describe en un artículo de Raposo y otros. (Raposo y otros, 1996),), y métodos similares se detallan en la sección de Ejemplos de este documento. Los métodos de intercambio aniónico y/o cromatografía de permeación en gel se describen en la patente de Estados Unidos núms. 6,899,863 y 6,812,023. Los métodos de gradientes de densidad de sacarosa o electroforesis de organelo se describen en la patente de Estados Unidos núm. 7,198,923. Un método de clasificación magnética de células activadas (MACS) se describe en (Taylor y Gercel-Taylor, 2008). Un método concentrador por ultrafiltración con nanomembrana se describe en (Cheruvanky y otros, 2007). Preferentemente, las microvesículas pueden identificarse y aislarse a partir del fluido corporal de un sujeto mediante una tecnología de microchip de nuevo desarrollo que usa una plataforma de microfluidos única para separar de manera eficiente y selectiva las microvesículas derivadas del tumor. Esta tecnología, como se describe en un artículo de Nagrath y otros (Nagrath y otros, 2007), puede adaptarse para identificar y separar microvesículas usando principios similares de captura y separación como se enseña en el artículo.

En una realización, las microvesículas aisladas de un fluido corporal son enriquecidas para aquellas que se originan a partir de un tipo celular específico, por ejemplo, pulmón, páncreas, estómago, intestino, vejiga, riñón, ovario, testículo, piel, colorrectal, mama, próstata, cerebro, esófago, hígado, placenta, células fetales. Debido a que las microvesículas frecuentemente portan moléculas de la superficie tales como antígenos de las células del donante, las moléculas de la superficie pueden usarse para identificar, aislar y/o enriquecer en microvesículas a partir de un tipo celular específico del donante (Al-Nedawi y otros, 2008;. Taylor y Gercel-Taylor, 2008). De esta manera, las microvesículas que se originan a partir de poblaciones distintas de células pueden analizarse por su contenido de ácido nucleico. Por ejemplo, las microvesículas tumorales (malignas y no malignas) portan los antígenos de superficie asociados a tumores y pueden detectarse, aislarse y/o enriquecerse a través de estos antígenos específicos de la superficie asociados a tumores. En un ejemplo, el antígeno de superficie es la molécula de adhesión a la célula epitelial (EpCAM), que es específica para microvesículas de los carcinomas de pulmón, colorrectal, mama, próstata, cabeza y cuello, y origen hepático, pero no de origen de células hematológicas (Balzar y otros, 1999;. Went y otros, 2004). En otro ejemplo, el antígeno de superficie es CD24, que es una glicoproteína específica de microvesículas de orina (Keller y otros, 2007). En otro ejemplo, el antígeno de superficie se selecciona a partir de un grupo de moléculas CD70, antígeno carcinoembrionario (CEA), EGFR, EGFRvIII y otras variantes, el ligando Fas, TRAIL, el receptor de transferrina, p38.5, p97 y HSP72. Además, las microvesículas específicas de tumores pueden caracterizarse por la carencia de marcadores de superficie, tales como CD80 y CD86.

El aislamiento de microvesículas a partir de tipos celulares específicos puede lograrse, por ejemplo, mediante el uso de anticuerpos, aptámeros, análogos de aptámeros o polímeros impresos molecularmente específicos para un antígeno de superficie deseado. En una realización, el antígeno de superficie es específico para un tipo de cáncer. En otra realización, el antígeno de superficie es específico para un tipo celular que no es necesariamente canceroso. Un ejemplo de un método de separación de microvesículas basado en un antígeno de superficie celular se proporciona en la patente de Estados Unidos núm. 7,198,923. Como se describe en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 5,840,867 y5,582,981, WO/2003/050290 y una publicación de Johnson y otros (Johnson y otros, 2008), los aptámeros y sus análogos se unen específicamente a las moléculas de superficie y pueden usarse como una herramienta de separación para recuperar microvesículas celulares de un tipo específico. Los polímeros impresos molecularmente reconocen específicamente además moléculas de superficie como se describe en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 6,525,154, 7,332,553 y 7,384,589 y una publicación de Bossi y otros (Bossi y otros, 2007) y son una herramienta para recuperar y aislar microvesículas celulares de un tipo específico.

Puede ser beneficioso o de cualquier otra manera deseable extraer el ácido nucleico de los exosomas antes del análisis. Las moléculas de ácido nucleico pueden aislarse de una microvesícula usando cualquier número de procedimientos, que son bien conocidos en la materia, siendo adecuado el procedimiento de aislamiento particular elegido para la muestra biológica en particular. Los ejemplos de métodos para la extracción se proporcionan en la sección de Ejemplos en la presente invención. En algunos casos, con algunas técnicas, es posible analizar además el ácido nucleico sin extraerlo de la microvesícula.

En una realización, los ácidos nucleicos extraídos, que incluyen el ADN y/o el ARN, son analizados directamente sin una etapa de amplificación. El análisis directo puede realizarse con diferentes métodos que incluyen, pero sin limitarse a, la tecnología de nanocadena. La tecnología de nanocadena permite la identificación y cuantificación de moléculas diana individuales en una muestra biológica mediante la unión de un indicador fluorescente codificador de color a cada molécula diana. Este enfoque es similar al concepto de medición de inventario mediante el escaneo de códigos de barras. Los indicadores pueden hacerse con cientos o aun miles de códigos diferentes que permiten el análisis altamente multiplexado. La tecnología se describe en una publicación de Geiss y otros (Geiss y otros, 2008) En otra realización, puede ser beneficioso o de cualquier otra manera deseable amplificar el ácido nucleico de la microvesícula antes de analizarlo. Los métodos de amplificación de ácidos nucleicos son usados comúnmente y se conocen generalmente en la materia, muchos ejemplos de los que se describen en la presente invención. Si se desea, la amplificación puede realizarse de manera cuantitativa. La amplificación cuantitativa permitirá la determinación cuantitativa de las cantidades relativas de varios ácidos nucleicos, para generar un perfil como se describe más abajo.

En una realización, el ácido nucleico extraído es ARN. Los ARNs después son preferentemente transcritos de manera inversa a ADN complementarios antes de su amplificación. Tal transcripción inversa puede realizarse sola o en combinación con una etapa de amplificación. Un ejemplo de un método que combina las etapas de transcripción inversa y de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), que puede modificarse más aun para ser cuantitativos, por ejemplo, la RT-PCR cuantitativa como se describe en la patente de Estados Unidos núm. 5,639,606.

Los métodos de amplificación de ácidos nucleicos incluyen, sin limitarse a, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (la patente de Estados Unidos núm. 5,219.727 ) y sus variantes tal como la reacción en cadena de la polimerasa in situ (la patente de Estados Unidos núm. 5,538,871), la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (la patente de Estados Unidos núm. 5,219,727), la reacción en cadena de la polimerasa anidada (la patente de Estados Unidos núm. 5,556,773), la replicación de secuencia autosostenida y sus variantes (Guatelli y otros, 1990), sistema de amplificación transcripcional y sus variantes (Kwoh y otros, 1989), replicasa Qb y sus variantes (Miele y otros, 1983), PCR en-frío (Li y otros, 2008) o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos, seguido por la detección de las moléculas amplificadas usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Son especialmente útiles aquellos esquemas de detección diseñados para la detección de moléculas de ácido nucleico si tales moléculas están presentes en números muy bajos.

El análisis de ácidos nucleicos presentes en las microvesículas es cuantitativo y/o cualitativo. Para el análisis cuantitativo, las cantidades (niveles de expresión), ya sean relativas o absolutas, de los ácidos nucleicos específicos de interés dentro de las microvesículas se miden con métodos conocidos en la técnica (descritos más abajo). Para el análisis cualitativo, las especies de ácidos nucleicos específicos de interés dentro de las microvesículas, ya sea silvestres o sus variantes, se identifican con los métodos conocidos en la técnica (descritos más abajo).

"Aberraciones genéticas" se usa en la presente invención para referirse a las cantidades de ácidos nucleicos así como también las variantes de ácido nucleico dentro de las microvesículas. Específicamente, las aberraciones genéticas incluyen, sin limitarse a, la sobreexpresión de un gen (por ejemplo, oncogenes) o un panel de genes, la subexpresión de un gen (por ejemplo, genes supresores de tumores tales como p53 o RB) o un panel de genes, producción alternativa de variantes de empalme de un gen o un panel de genes, las variantes del número de copias del gen (CNV) (por ejemplo, ADN de minutos dobles) (Hahn, 1993), modificaciones de ácido nucleico (por ejemplo, la metilación, acetilación y fosforilaciones), polimorfismos de nucleótido individual (SNPs), reordenamientos cromosómicos (por ejemplo, inversiones, deleciones y duplicaciones), y mutaciones (inserciones, deleciones, duplicaciones, cambio de sentido, sin sentido, sinónimos o cualquier otro cambio de nucleótidos) de un gen o un panel de genes, cuyas mutaciones, en muchos casos, en última instancia afectan a la actividad y función de los productos génicos, conducen a variantes de empalme transcripcional alternativo y/o cambios del nivel de la expresión génica.

La determinación de tales aberraciones genéticas puede realizarse por una diversidad de técnicas conocidas por el profesional experto. Por ejemplo, los niveles de expresión de ácidos nucleicos, variantes de corte y empalme alternativo, reordenamiento cromosómico y los números de copias de genes pueden determinarse mediante el análisis de microarreglo (la patente de Estados Unidos núm. 6,913,879, 7,364,848 , 7,378,245, 6,893,837 y 6,004,755) y la PCR cuantitativa. Particularmente, los cambios del número de copias pueden detectarse con el ensayo de genotipaje del genoma completo de llumina Infinium II o Microarreglo CGH del Genoma Humano de Agilent (Steemers y otros, 2006). Las modificaciones a los ácido nucleico pueden ensayarse mediante los métodos descritos en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 7,186,512 y la publicación de la patente WO/2003/023065. Particularmente, los perfiles de metilación pueden determinarse mediante el Panel de Cáncer OMA003 de metilación de ADN de Illumina. Los SNPs y las mutaciones pueden detectarse mediante la hibridación con sondas específicas de alelo, la detección de mutaciones enzimáticas, el clivaje químico de heteroduplos mal apareados (Cotton y otros, 1988), clivaje con ribonucleasa de bases mal apareadas (Myers y otros, 1985), espectrometría de masas (la Patente de Estados Unidos núm. 6,994,960, 7,074,563, y 7,198,893), secuenciación de ácidos nucleicos, polimorfismo de conformación monocatenaria (SSCP) (Orita y otros, 1989), electroforesis de gel en gradiente desnaturalizante (DGGE) (Fischer y Lerman, 1979a; Fischer y Lerman, 1979b), electroforesis de gel en gradiente de temperatura (TGGE) (Fischer y Lerman, 1979a; Fischer y Lerman, 1979b), polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) (Kan y Dozy, 1978a; Kan y Dozy, 1978b), ensayo de ligación de oligonucleótidos (OLA), la PCR específica de alelo (ASPCR) (la patente de Estados Unidos núm. 5,639,611), reacción en cadena de ligación (LCR) y sus variantes (Abravaya y otros, 1995;. Landegren y otros, 1988; Nakazawa y otros, 1994), análisis de heteroduplos por citometría de flujo (WO/2006/113590) y combinaciones/modificaciones de los mismos. Notablemente, los niveles de expresión génica pueden determinarse mediante la técnica de análisis en serie de la expresión génica (SAGE) (Velculescu y otros, 1995). Generalmente, los métodos para el análisis de aberraciones genéticas se presentan en numerosas publicaciones, sin limitarse a las citadas en la presente invención, y están disponibles para los profesionales expertos. El método de análisis adecuado dependerá de las metas específicas del análisis, la afección/historia del paciente y el(los) tipo(s) de cáncer específico(s), enfermedades u otras afecciones médicas a detectar, monitorear o tratar.

Se ha identificado una diversidad de aberraciones genéticas para producir y/o contribuir a la generación inicial o progresión del cáncer. Los ejemplos de genes que son comúnmente regulados positivamente (es decir, sobreexpresados) en cáncer se proporcionan en la Tabla 4 (cánceres de diferentes tipos) y la Tabla 6 (cáncer pancreático). Los ejemplos de microARNs que están regulados positivamente en el tumor cerebral se proporcionan en la Tabla 8. En una realización de la divulgación hay un aumento en el nivel de expresión de ácido nucleico de un gen enumerado en la Tabla 4 y/o en la Tabla 6 y/o de un microARN enumerados en la Tabla 8. Los ejemplos de genes que son comúnmente regulados negativamente (por ejemplo sub expresado) en cáncer se proporcionan en la Tabla 5 (cánceres de diferentes tipos) y la Tabla 7 (cáncer de páncreas). Los ejemplos de microARN que son regulados negativamente en el tumor cerebral se proporcionan en la Tabla 9. En una realización de la divulgación hay una disminución en el nivel de expresión de ácido nucleico de un gen enumerado en la Tabla 5 y/o en la Tabla 7 y/o un microARN enumerado en la Tabla 9. Los ejemplos de genes que son comúnmente subexpresados, o sobreexpresados en tumores cerebrales se revisan en (Furnari y otros, 2007). Con respecto al desarrollo de tumores cerebrales, RB y p53 están frecuentemente regulados negativamente para disminuir de cualquier otra manera su actividad supresora del tumor. Por lo tanto, en estas realizaciones, la presencia o ausencia de un aumento o disminución en el nivel de expresión del ácido nucleico de un(os) gen(es) y/o un(os) microARN(s) cuyo nivel de expresión desregulado es específico de un tipo de cáncer puede usarse para indicar la presencia o ausencia del tipo de cáncer en el sujeto.

De lmanera similar, las variantes de ácido nucleico, por ejemplo, modificaciones del ADN o el ARN, los polimorfismos de nucleótidos individuales (SNPs) y mutaciones (por ejemplo, cambio de sentido, sin sentido, inserciones, deleciones, duplicaciones) además pueden analizarse dentro de las microvesículas del fluido corporal de un sujeto, que incluyen las mujeres embarazadas donde las microvesículas derivadas del feto pueden estar en el suero así como también en el fluido amniótico. Los ejemplos no limitantes se proporcionan en la Tabla 3. En aún una realización adicional, la variante de nucleótido está en el gen EGFR. En una todavía realización adicional, la variante de nucleótido es la mutación/variante de EGFRvIII. Los términos "EGFR", "receptor del factor de crecimiento epidérmico" y "ErbB1" se usan indistintamente en la materia, por ejemplo como se describe en un artículo de Carpenter (Carpenter, 1987). Con respecto al desarrollo de tumores cerebrales, RB, PTEN, p16, p21 y p53 se mutan frecuentemente para disminuir de cualquier otra manera su actividad supresora del tumor. Los ejemplos de mutaciones específicas en formas específicas de tumores cerebrales se discuten en un artículo de Furnari y otros (Furnari y otros, 2007)

Adicionalmente, más aberraciones genéticas asociadas con los cánceres se identificaron recientemente en algunos proyectos de investigación en curso. Por ejemplo, el programa Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) explora un espectro de cambios genómicos involucrados en los cánceres humanos. Los resultados de este proyecto y otros esfuerzos de investigación similares están publicados (Jones y otros, 2008; McLendon y otros, 2008; Parsons y otros, 2008; Wood y otros, 2007). Específicamente, estos proyectos de investigación han identificado las aberraciones genéticas, tales como mutaciones (por ejemplo, pérdida de sentido, sin sentido, inserciones, deleciones y duplicaciones), las variaciones del nivel de expresión génica (ARNm o microARN), variaciones del número de copia y modificación de los ácidos nucleicos (por ejemplo, metilación), en glioblastoma humano, cáncer de páncreas, cáncer de mama y/o cáncer colorrectal. Los genes mutados más frecuentemente en estos cánceres se enumeran en la Tabla 11 y la Tabla 12 (glioblastoma), Tabla 13 (cáncer de páncreas), Tabla 14 (cáncer de mama) y Tabla 15 (cáncer colorrectal). Las aberraciones genéticas en estos genes, y de hecho cualquier gen que contiene cualquiera de las aberraciones genéticas en un cáncer, son dianas que pueden seleccionarse para su uso en el diagnóstico y/o monitoreo del cáncer mediante los métodos descritos en la presente invención.

La detección de una o más variantes de nucleótidos puede lograrse mediante la realización de un tamiz de variante de nucleótidos en los ácidos nucleicos dentro de las microvesículas. Tal tamiz puede ser tan amplio o estrecho como se determine necesario o deseable por el profesional experto. Puede ser un tamiz amplio (configurado para detectar todas las posibles variantes de nucleótidos en los genes conocidos por estar asociados con uno o más cánceres o estados de la enfermedad). Cuando se sospecha o se sabe que existe un cáncer o una enfermedad específica, el tamiz puede ser específico para ese cáncer o enfermedad. Un ejemplo es un tamiz para cáncer cerebral/tumor cerebral (por ejemplo, configurado para detectar todas las posibles variantes de nucleótidos en los genes asociados con varios subtipos clínicamente distintos de cáncer cerebral o conocidas mutaciones resistentes o sensibles a fármacos de ese cáncer).

En una realización, el análisis es de un perfil de las cantidades (niveles) de ácidos nucleicos específicos presentes en la microvesícula, en la presente invención referido como un "perfil de ácidos nucleicos cuantitativo" de las microvesículas. En otra realización, el análisis es de un perfil de las especies de ácidos nucleicos específicos presentes en las microvesículas (silvestre así como también las variantes), en la presente invención se refiere como un "perfil de las especies de ácidos nucleicos". Un término usado en la presente invención para referirse a una combinación de estos tipos de perfiles es "perfil genético" que se refiere a la determinación de la presencia o ausencia de especies de nucleótidos, las variantes y además aumentos o disminuciones en los niveles de ácido nucleico.

Una vez generados, estos perfiles genéticos de las microvesículas se comparan con aquellos esperados en, o derivados de cualquier otra manera de un individuo normal sano. Un perfil puede ser un perfil amplio del genoma (configurado para detectar todos los posibles genes expresados o secuencias de ADN). Puede ser así más estrecho, tal como un perfil amplio de cáncer (configurado para detectar todos los posibles genes o ácidos nucleicos derivados de ellos, o que se sabe están asociados con uno o más cánceres). Cuando se sospecha o se sabe que existe un tipo específico de cáncer, el perfil puede ser específico para ese cáncer (por ejemplo, configurado para detectar todos los posibles genes o ácidos nucleicos derivados de ellos, asociados con varios subtipos clínicamente distintos de ese cáncer o mutaciones conocidas de ese cáncer resistentes o sensibles a los fármacos).

El profesional experto puede seleccionar cuáles ácidos nucleicos han de amplificarse y/o analizarse. La totalidad del contenido de ácido nucleico de los exosomas o sólo un subconjunto de ácidos nucleicos específicos que son probables o se sospeche que están influenciados por la presencia de una enfermedad u otra afección médica tal como el cáncer, puede amplificarse y/o analizarse. La identificación de una(s) aberración(es) del ácido nucleico en el ácido nucleico de la microvesícula analizada puede usarse para diagnosticar el sujeto para la presencia de una enfermedad tal como cáncer, enfermedades hereditarias o infección viral con la que esa(s) aberración(es) se asocia(n). Por ejemplo, el análisis de la presencia o ausencia de una o más variantes del ácido nucleico de un gen específico de un cáncer (por ejemplo, la mutación EGFRvIII) puede indicar la presencia del cáncer en el individuo. Alternativamente, o adicionalmente, el análisis de ácidos nucleicos para un aumento o disminución en los niveles del ácido nucleico específico de un cáncer puede indicar la presencia del cáncer en el individuo (por ejemplo, un aumento relativo en el ácido nucleico del EGFR, o una disminución relativa en un gen supresor tumoral como p53).

En una realización, las mutaciones de un gen que está asociado con una enfermedad tal como el cáncer (por ejemplo a través de variantes de nucleótidos, sobreexpresión o subexpresión) son detectadas mediante el análisis de ácidos nucleicos en microvesículas, cuales ácidos nucleicos se derivan del propio genoma en la célula de origen o de genes exógenos introducidos a través de los virus. Las secuencias de ácidos nucleicos pueden ser completas o parciales, como se espera que ambos rindan información útil en el diagnóstico y el pronóstico de una enfermedad. Las secuencias pueden ser sentido o antisentido para el presente gen o secuencias transcritas. El profesional experto será capaz de concebir métodos de detección para una discrepancia en un nucleótido ya sea de los ácidos nucleicos sentido o antisentido que pueden estar presentes en una microvesícula. Muchos de estos métodos involucran el uso de sondas que son específicas para las secuencias de nucleótidos que flanquean directamente, o contienen las discrepancias de nucleótidos. El profesional experto puede diseñar tales sondas dado el conocimiento de las secuencias de genes y la ubicación de las variantes de ácido nucleico dentro del gen. Tales sondas pueden usarse para aislar, amplificar, y/o en realidad hibridar para detectar las variantes del ácido nucleico, tal como se describe en la técnica y en la presente invención.

La determinación de la presencia o ausencia de una variante particular de nucleótido o una pluralidad de variantes en el ácido nucleico dentro de las microvesículas de un sujeto puede realizarse en una diversidad de maneras. Una diversidad de métodos está disponible para tal análisis, que incluyen, pero sin limitarse a, la PCR, hibridación con sondas específicas de alelo, la detección de mutaciones enzimáticas, el clivaje químico de desapareamientos, la espectrometría de masas o secuenciación de ADN, que incluye la minisecuenciación. En realizaciones particulares, la hibridación con sondas específicas de alelo puede efectuarse en dos formatos: 1) oligonucleótidos específicos de alelo unidos a una fase sólida (vidrio, silicio, membranas de nailon) y la muestra marcada en solución, como en muchas aplicaciones de chip de ADN, o 2) muestra unida (frecuentemente ADN clonado o ADN amplificado por PCR) y oligonucleótidos marcados en solución (ya sea alelo específico o corto de manera que permite la secuenciación mediante hibridación). Las pruebas de diagnóstico pueden involucrar un panel de discrepancias, frecuentemente en un soporte sólido, que permite la determinación simultánea de más de una discrepancia. En otra realización, la determinación de la presencia de al menos una discrepancia del ácido nucleico en el ácido nucleico de la microvesícula implica una prueba de determinación del haplotipo. Los métodos de determinación de haplotipos son conocidos por los expertos en la materia, como por ejemplo, en WO 00/04194.

En una realización, la determinación de la presencia o ausencia de una(s) variante(s) de ácido(s) nucleico(s) involucra la determinación de la secuencia del sitio o sitios de variación (la ubicación exacta dentro de la secuencia donde se produce la variación del ácido nucleico respecto a la norma) mediante métodos tales como reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secuenciación de terminación de cadena de ADN (la patente de Estados Unidos núm. 5,547,859), minisecuenciación (Fiorentino y otros, 2003), hibridación de oligonucleótidos, pirosecuenciación, analizador de genoma de Illumina, secuenciación profunda, espectrometría de masas u otros métodos de detección de secuencia de ácido nucleico. Los métodos para la detección de variantes de ácido nucleico son bien conocidos en la técnica y se describen en WO 00/04194. En un método ilustrativo, la prueba de diagnóstico comprende la amplificación de un segmento de ADN o ARN (generalmente luego de la conversión del ARN a ADN complementario) que abarca una o más variantes conocidas en la secuencia génica deseada. Este segmento amplificado se secuenció después, y/o se sometió a electroforesis con el fin de identificar las variantes del nucleótido en el segmento amplificado.

Se divulga, pero no es parte de la invención reivindicada, un método de tamizaje para las variantes del nucleótido en el ácido nucleico de las microvesículas aisladas como se describe en el presente documento. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante PCR o, alternativamente, en una reacción en cadena de ligación (LCR) (Abravaya y otros, 1995; Landegren y otros, 1988; Nakazawa y otros, 1994). La LCR puede ser particularmente útil para detectar mutaciones puntuales en un gen de interés (Abravaya y otros, 1995). El método de la LCR comprende las etapas de diseño de iniciadores redundantes para la amplificación de la secuencia diana, los iniciadores que corresponden a una o más regiones conservadas del ácido nucleico que corresponde al gen de interés, la amplificación de productos de PCR con los iniciadores usando, como una plantilla, un ácido nucleico obtenido a partir de una microvesícula, y el análisis de los productos de PCR. La comparación de los productos de PCR del ácido nucleico de la microvesícula con una muestra control (ya sea que tenga la variante de nucleótidos o no) indica variantes en el ácido nucleico de la microvesícula. El cambio puede ser ya sea una ausencia o presencia de una variante del nucleótido en el ácido nucleico de la microvesícula, dependiendo del control.

El análisis de los productos de amplificación puede realizarse usando cualquier método capaz de separar los productos de amplificación de acuerdo con su tamaño, que incluye la electroforesis en gel automatizada y manual, la espectrometría de masas, y similares.

Alternativamente, los productos de amplificación pueden analizarse basado en las diferencias en la secuencia, usando SSCP, DGGE, TGGE, clivaje químico, OLA, polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción, así como también la hibridación, por ejemplo, los microarreglos de ácidos nucleicos.

Los métodos de aislamiento de ácidos nucleicos, la amplificación y el análisis son rutinarios para un experto en la técnica y los ejemplos de los protocolos pueden encontrarse, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (conjunto de 3 volúmenes) Ed. Joseph Sambrook, David W. Russel, y Joe Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 3a edición (15 de enero de 2001), ISBN: 0879695773. Una fuente útil en particular de protocolos para los métodos usados en la amplificación por PCR es PCR Basics: From Background to Bench by Springer Verlag; ia edición (15 de octubre de 2000), ISBN:0387916008.

Muchos métodos de diagnóstico realizados en una muestra de biopsia del tumor pueden realizarse con microvesículas desde células tumorales, así como también se conocen algunas células normales que desprenden microvesículas en el fluido corporal y las aberraciones genéticas dentro de estas microvesículas reflejan aquellas dentro de las células tumorales como se demuestra en la presente invención. Además, los métodos de diagnóstico usando microvesículas tienen características que están ausentes en los métodos de diagnóstico realizados directamente en una muestra de biopsia del tumor. Por ejemplo, una ventaja particular del análisis de ácidos nucleicos microvesiculares, a diferencia de otras formas de toma de muestras de ácido nucleico de tumor/cáncer, es la disponibilidad para el análisis de ácidos nucleicos de tumor/cáncer derivados de todos los focos de un tumor o tumores genéticamente heterogéneos presentes en un individuo. Las muestras de biopsia se limitan en que ellas proporcionan información únicamente sobre el enfoque específico del tumor a partir del cual se obtiene la biopsia. Diferentes focos tumorales/cancerosos que se encuentran dentro del cuerpo, o aun dentro de un tumor individual frecuentemente tienen diferentes perfiles genéticos y no se analizan en una biopsia estándar. Sin embargo, el análisis de los ácidos nucleicos microvesiculares de un individuo supuestamente proporciona un muestreo de todos los focos dentro de un individuo. Esto proporciona información valiosa con respecto a los tratamientos recomendados;. la efectividad del tratamiento, el pronóstico de la enfermedad, y el análisis de recurrencia de la enfermedad, que no pueden proporcionarse mediante una biopsia simple.

La identificación de aberraciones genéticas asociadas con enfermedades específicas y/o afecciones médicas mediante los métodos descritos en la presente invención puede usarse además para las decisiones de pronóstico y tratamiento de un individuo diagnosticado con una enfermedad u otra afección médica tal como el cáncer. La identificación de la base genética de una enfermedad y/o afección médica proporciona información útil que orienta el tratamiento de la enfermedad y/o afección médica. Por ejemplo, muchas formas de quimioterapia han mostrado ser más efectivas en cánceres con anomalías/aberraciones genéticas específicas. Un ejemplo es la efectividad de los tratamientos dirigidos al EGFR con medicamentos, como los inhibidores de cinasa gefitinib y erlotinib. Tal tratamiento ha demostrado ser más efectivo en las células cancerosas cuyo gen de EGFR alberga mutaciones específicas de nucleótido en el dominio cinasa de la proteína EGFR (la publicación de la patente de Estados Unidos 20060147959). En otras palabras, la presencia de al menos una de las variantes de nucleótidos identificadas en el dominio cinasa del mensaje del ácido nucleico de EGFR indica que un paciente probablemente se beneficiará del tratamiento con el compuesto gefitinib o erlotinib dirigido al EGFR . Tales variantes de nucleótidos pueden identificarse en los ácidos nucleicos presentes en las microvesículas mediante los métodos descritos en la presente invención, y se ha demostrado que los transcritos de EGFR de origen tumoral se aíslan de las microvesículas en el fluido corporal.

Se ha encontrado además que las aberraciones genéticas en otros genes influyen en la efectividad de los tratamientos. Como se describe en la publicación de Furnari y otros (Furnari y otros, 2007), las mutaciones en una diversidad de genes afecta la efectividad de los medicamentos específicos usados en la quimioterapia para el tratamiento de tumores cerebrales. La identificación de estas aberraciones genéticas en los ácidos nucleicos dentro de las microvesículas orientará la selección de planes de tratamiento apropiados.

Como tal, los aspectos de la presente divulgación se relacionan con un método para el monitoreo de la progresión de la enfermedad (por ejemplo cáncer) en un sujeto, y un método para el monitoreo de la recurrencia de la enfermedad en un individuo. Estos métodos comprenden las etapas de aislamiento de las microvesículas de los fluidos corporales de un individuo, como se discute en la presente invención, y el análisis del ácido nucleico dentro de las microvesículas como se discute en la presente invención (por ejemplo para crear un perfil genético de las microvesículas). La presencia/ausencia de un cierto perfil/aberración genética se usa para indicar la presencia/ausencia de la enfermedad (por ejemplo, cáncer) en el sujeto como se discute en la presente invención. El proceso se realiza periódicamente en el tiempo, y los resultados se revisaron, para monitorear la progresión o regresión de la enfermedad, o para determinar la recurrencia de la enfermedad. Dicho de otra manera, un cambio en el perfil genético indica un cambio en el estado de la enfermedad en el sujeto. El período de tiempo que transcurre entre el muestreo de las microvesículas del sujeto, para la realización del aislamiento y el análisis de la microvesícula, dependerá de las circunstancias del sujeto, y se determinará por el profesional experto. Tal método resultaría sumamente beneficioso cuando se analice un ácido nucleico de un gen que está asociado con la terapia sometida al sujeto. Por ejemplo, un gen que está dirigido por la terapia puede monitorerase para el desarrollo de mutaciones que lo hacen resistente a la terapia, tiempo tras el que la terapia puede modificarse en consecuencia. El gen monitoreado puede ser además uno que indica la receptividad específica a una terapia específica.

Los aspectos de la presente divulgación también se relacionan con el hecho de que una diversidad de enfermedades no cancerosas y/o afecciones médicas además tienen vínculos y/o causas genéticas, y tales enfermedades y/o afecciones médicas pueden diagnosticarse y/o monitorearse de manera similar mediante los métodos descritos en la presente invención. Muchas de estas enfermedades son de naturaleza metabólicas, infecciosas o degenerativas. Una de esas enfermedades es la diabetes (por ejemplo diabetes insípida) en la que se modifica el receptor de la vasopresina tipo 2 (V2R). Otra de esas enfermedades es la fibrosis renal en la que se cambian los perfiles genéticos para los genes de colágenos, fibronectina y TGF-. Los cambios en el perfil genético debido al abuso de sustancias (por ejemplo uso de esteroides o fármacos), la infección viral y/o bacteriana, y los estados de enfermedad hereditaria pueden detectarse de manera similar mediante los métodos descritos en la presente invención.

Las enfermedades u otras condiciones médicas para las cuales las invenciones descritas en este documento son aplicables incluyen, pero no se limitan a, nefropatía, diabetes insípida, diabetes tipo I, diabetes tipo II, enfermedad renal glomerulonefritis, glomerulonefritides bacterianas o virales, nefropatía por IgA, Púrpura de Henoch-Schonlein, glomerulonefritis membranoproliferativa, nefropatía membranosa, síndrome de Sjogren, síndrome nefrótico de enfermedad de cambios mínimos, glomeruloesclerosis focal y trastornos relacionados, insuficiencia renal aguda, nefritis tubulointersticial aguda, pielonefritis, enfermedad inflamatoria del tracto GU, preclampsia, rechazo al injerto renal, lepra, nefropatía por reflujo, nefrolitiasis, enfermedad renal genética, quística medular, esponja medular, enfermedad renal poliquística, enfermedad renal poliquística autosómica dominante, enfermedad renal poliquística autosómica recesiva, esclerosis tuberosa, enfermedad de von Hippet-Lindau, enfermedad de la membrana delgada basal glomerular familiar, glomerulopatía por colágeno III, glomerulopatía por fibronectina, síndrome de Alport, enfermedad de Fabry, síndrome de Nail-Patella, anomalías urológicas congénitas, gammapatías monoclonales, mieloma múltiple, amiloidosis y trastornos relacionados, malestar febril, fiebre mediterránea familiar, infección por VIH-SIDA, enfermedad inflamatoria, vasculitis sistémicas, poliarteritis nodosa, granulomatosis de Wegener, poliarteritis, glomerulonefritis crecentic y necrotizante, polimiositis-dermatomiositis, pancreatitis, artritis reumatoidea, lupus eritematoso sistémico, gota, trastornos de la sangre, anemia de células falciformes, la trombocitopénica trombótica púrpura, el síndrome de Fanconi, trasplante, lesión renal aguda, síndrome de intestino irritable, síndrome hemolíticourémico, necrosis corticol aguda, tromboembolismo renal, trauma y cirugía, lesión extensa, quemaduras, cirugía abdominal y vascular, inducción de la anestesia, efecto secundario del uso de fármacos o abuso de fármacos, enfermedad circulatoria infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca, enfermedad vascular periférica, hipertensión, enfermedad coronaria, enfermedad cardiovascular no aterosclerótica, enfermedad cardiovascular aterosclerótica, enfermedad de la piel, soriasis, esclerosis sistémica, enfermedad respiratoria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la apnea obstructiva del sueño, hipoxia a gran altura o enfermedad erdocrina, acromegalia, diabetes mellitus o diabetes insípida.

La selección de un individuo del que se aíslan las microvesículas se realiza por el profesional experto sobre la base del análisis de una o más de una diversidad de factores. Tales factores a considerar son si el sujeto tiene antecedentes familiares de una enfermedad específica (por ejemplo un cáncer), tiene una predisposición genética para tal enfermedad, tiene un riesgo aumentado de una enfermedad debido a antecedentes familiares, la predisposición genética, otra enfermedad o síntomas físicos que indican una predisposición, o motivos medioambientales. Los motivos medioambientales incluyen el estilo de vida, la exposición a agentes que causan o contribuyen a la enfermedad, tales como en el aire, la tierra, el agua o la dieta. Adicionalmente, tras tener previamente la enfermedad, ser diagnosticado actualmente con la enfermedad antes de la terapia o luego de la terapia, ser tratado actualmente para la enfermedad (sometiéndose a la terapia), estar en remisión o en recuperación de la enfermedad, son otros motivos para seleccionar un individuo para realizar los métodos.

Los métodos descritos en la presente invención se realizan opcionalmente con la etapa adicional de selección de un gen o ácido nucleico para el análisis, antes de la etapa de análisis. Esta selección puede basarse en cualquiera de las predisposiciones del sujeto, o cualquier exposición o diagnósticos previos, o tratamientos terapéuticos experimentados o al los que se somete al mismo tiempo el sujeto.

El cáncer diagnosticado, monitoreado o de cualquier otra manera perfilado, puede ser cualquier tipo de cáncer. Esto incluye, sin limitarse a, los cánceres de células epiteliales tales como cáncer de pulmón, ovario, cuello uterino, endometrio, mama, cerebro, colon y próstata. Además se incluyen el cáncer gastrointestinal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer del sistema nervioso, cáncer de riñón, cáncer de retina, cáncer de piel, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer genital urinario y cáncer de vejiga, melanoma, y leucemia. Adicionalmente, los métodos y composiciones de la presente divulgación son igualmente aplicables a la detección, diagnóstico y pronóstico de tumores no malignos en un individuo (por ejemplo neurofibromas, meningiomas y schwannomas).

En una realización, el cáncer es cáncer de cerebro. Los tipos de tumores cerebrales y cáncer son bien conocidos en la técnica. Glioma es un nombre general para los tumores que surgen del tejido glial (de apoyo) del cerebro. Los gliomas son los tumores cerebrales primarios más comunes. Los astrocitomas, ependimomas, oligodendrogliomas y tumores con mezclas de dos o más tipos de células, llamados gliomas mixtos, son los gliomas más comunes. Los siguientes son otros tipos comunes de tumores cerebrales: neuroma acústico (neurilemmoma, schwannoma, neurinoma), adenoma, astracitoma, astrocitoma de bajo grado, astrocitomas de células gigantes, astrocitoma de grado medio y alto, tumores recurrentes, glioma del tronco encefálico, cordoma, Papiloma del plexo coroideo, linfoma del SNC (linfoma maligno primario), quistes, quistes dermoides, quistes epidermoides, craneofaringioma, ependimoma ependimoma anaplásico, gangliocitoma (ganglioneuroma), ganglioglioma, glioblastoma multiforme (GBM), astracitoma maligno, glioma, hemangioblastoma, tumores cerebrales inoperables, Linfoma, meduloblastoma (MDL), meningioma, tumores cerebrales metastásicos, glioma mixto, neurofibromatosis, oligodendroglioma. Glioma del nervio óptico, tumores de la región pineal, adenoma hipofisario, PNET (tumor neuroectodérmico primitivo), tumores espinales, subependimoma y esclerosis tuberosa (enfermedad de Bourneville).

Adicionalmente para identificar las aberraciones de ácidos nucleicos previamente conocidas (como asociada con enfermedades), los métodos de la presente invención pueden usarse para identificar previamente secuencias/modificaciones de ácido nucleico no identificadas previamente (por ejemplo modificaciones post transcripcionales) cuyas aberraciones son asociadas con una cierta enfermedad y/o afección médica. Esto se logra, por ejemplo, mediante el análisis del ácido nucleico dentro de las microvesículas de un fluido corporal de uno o más sujetos con una enfermedad/afección médica dada (por ejemplo un tipo clínico o subtipo de cáncer) y la comparación con e l ácido nucleico dentro de las microvesículas de uno o más sujetos sin la enfermedad/afección médica dada, para identificar las diferencias en su contenido de ácido nucleico. Las diferencias pueden ser cualquiera de las aberraciones genéticas que incluyen, sin limitarse a, nivel de expresión del ácido nucleico, variantes alternativas de empalme, variantes del número de copias del gen (CNV), modificaciones del ácido nucleico, polimorfismos de nucleótido individual (SNP), y mutaciones (inserciones, deleciones o cambios de nucleótido individual) del ácido nucleico. Una vez que se identifica una diferencia en un parámetro genético de un ácido nucleico en particular para una cierta enfermedad, estudios adicionales que involucran un número de sujetos significativo clínica y estadísticamente pueden llevarse a cabo para establecer la correlación entre la aberración genética del ácido nucleico en particular y la enfermedad. El análisis de las aberraciones genéticas puede hacerse mediante uno o más métodos descritos en la presente invención, tal como se determina de manera adecuada por el profesional experto.

Exosomas como vehículos de entrega

Los aspectos de la presente divulgación también se refieren a las microvesículas reales descritas en el presente documento. Se describe, pero no forma parte de la invención reivindicada, una microvesícula aislada como se describe en este documento, aislada de un individuo. En una realización, la microvesícula es producida por una célula dentro del cerebro del individuo (por ejemplo, una célula tumoral o no tumoral). En otra realización, la microvesícula se aísla de un fluido corporal de un individuo, como se describe en el presente documento. Los métodos de aislamiento se describen en este documento.

Se divulga, pero no forma parte de la invención reivindicada, el hallazgo de que las microvesículas aisladas a partir de las células de glioblastoma humano contienen ARNs mensajeros, miARNs y proteínas angiogénicas. Tales microvesículas de glioblastoma se abosorbieron por las células endoteliales cerebrales humanas primarias, probablemente a través de un mecanismo de endocitosis, y se tradujo en esas células un ARNm de proteína indicadora incorporada a las microvesículas. Esto indica que los mensajes entregados por las microvesículas pueden cambiar el perfil genético y/o traduccional de una célula diana (una célula que absorbe una microvesícula). Las microvesículas contenían además miARNs que son conocidos por ser abundantes en los glioblastomas (Krichevski y otros, manuscrito en preparación). Así las microvesículas derivadas de tumores de glioblastoma funcionan como vehículos de entrega para ARNm, miARN y proteínas que pueden cambiar el estado traduccional de otras células a través de la entrega de especies de ARNm específicos, al promover la angiogénesis de las células endoteliales, y estimular el crecimiento tumoral.

En una realización, las microvesículas son reducidas de un fluido corporal de un sujeto donante antes de que dicho fluido corporal se entregue a un sujeto receptor. El sujeto donante puede ser un sujeto con un tumor indetectable y las microvesículas en el fluido corporal se derivan del tumor. Las microvesículas tumorales en el fluido corporal del donante, si no se eliminan, serían nocivas puesto que los materiales genéticos y proteínas en la microvesícula pueden promover el crecimiento incontrolado de las células en el sujeto receptor.

Se divulga, pero no es parte de la invención reivindicada el uso de las microvesículas identificadas en la presente invención para entregar un ácido nucleico a una célula. En una realización, la célula está dentro del cuerpo de un individuo. El método comprende la administración de una(s) microvesícula(s) que contiene(n) el ácido nucleico, o una célula que produce dichas microvesículas, al individuo de manera que las microvesículas contacten y/o penetren a la célula del individuo. La célula a la que el ácido nucleico se entrega se refiere como la célula diana.

La microvesícula puede ser diseñada para contener un ácido nucleico que no lo contiene de forma natural (es decir, que es exógeno para el contenido normal de la microvesícula). Esto puede lograrse mediante la inserción física del ácido nucleico en las microvesículas. Alternativamente, una célula (por ejemplo, crecida en cultivo) puede ser diseñada para dirigir uno o más ácidos nucleicos específicos al exosoma, y el exosoma puede aislarse de la célula. Alternativamente, la propia célula diseñada puede administrarse al individuo.

En una realización, la célula que produce el exosoma para la administración es del mismo o similar origen o ubicación en el cuerpo que la célula diana. Es decir, para la entrega de una microvesícula a una célula del cerebro, la célula que produce la microvesícula sería una célula del cerebro (por ejemplo una célula primaria crecida en cultivo). En una realización, la célula que produce el exosoma es de un tipo celular diferente de la célula diana. En una realización, la célula que produce el exosoma es de un tipo que se ubica de manera próxima en el cuerpo a la célula diana.

Una secuencia de ácido nucleico que puede entregarse a una célula a través de un exosoma puede ser ARN o ADN, y puede ser monocatenario o bicatenario, y puede ser seleccionado de un grupo que comprende: ácido nucleico que codifica una proteína de interés, oligonucleótidos, análogos de ácidos nucleicos, por ejemplo ácido péptido nucleico (PNA), PNA pseudocomplementario (PC-PNA), ácido nucleico bloqueado (LNA) etcétera. Tales secuencias de ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, pero sin limitarse a, secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas, por ejemplo que actúan como represores transcripcionales, moléculas antisentido, ribozimas, pequeñas secuencias de ácidos nucleicos inhibitorios, por ejemplo pero sin limitarse a ARNi, ARNhc, ARNip, miARN, oligonucleótidos antisentido, y combinaciones de los mismos.

Las microvesículas aisladas a partir de un tipo de célula se entregan a un sujeto receptor. Dichas microvesículas pueden beneficiar médicamente al sujeto receptor. Por ejemplo, los efectos de la angiogénesis y la proproliferación de los exosomas tumorales pueden ayudar a la regeneración de los tejidos lesionados en el sujeto receptor. En una realización, los medios de entrega son por transfusión de fluidos corporales en donde las microvesículas se añaden en un fluido corporal de un sujeto donante antes que dicho fluido corporal se entregue a un sujeto receptor.

En otra realización, la microvesícula es un ingrediente (por ejemplo el ingrediente activo en una formulación farmacéuticamente aceptable apropiada para la administración al sujeto (por ejemplo en los métodos descritos en la presente invención). Generalmente, esto comprende un portador farmacéuticamente aceptable para el ingrediente activo. El portador específico dependerá de un número de factores (por ejemplo, la vía de administración).

El "portador farmacéuticamente aceptable" significa cualquier medio farmacéuticamente aceptable para mezclar y/o entregar la composición de entrega dirigida a un sujeto. Esto incluye un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptables, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, disolvente o material de encapsulación, involucrados en portar o transportar los agentes del sujeto desde un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o porción del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y ser compatible con la administración a un sujeto, por ejemplo un humano

La administración al sujeto puede ser sistémica o ubicada. Esto incluye, sin limitarse a, dispensar, entregar o aplicar un compuesto activo (por ejemplo en una formulación farmacéutica) al sujeto por cualquier vía apropiada para la entrega del compuesto activo a la ubicación deseada en el sujeto, que incluye la entrega por cualquiera vía parenteral u oral, inyección intramuscular, inyección subcutánea/intradérmica, inyección intravenosa, administración bucal, entrega transdérmica y administración por vía rectal, colónica, vaginal, intranasal o el tracto respiratorio.

Debe entenderse que esa invención no se limita a las metodologías particulares, protocolos y reactivos descritos en la presente invención, y como tal puede variar. La terminología usada en la presente invención es con el propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no se pretende limitar el alcance de la presente invención, que se define únicamente por las reivindicaciones.

En un aspecto, la presente divulgación se relaciona con las composiciones, métodos y los componentes respectivos de ellos descritos en la presente invención, como esencial para la divulgación, pero abierto a la inclusión de elementos no especificados, esenciales o no ("que comprende"). En algunas realizaciones, otros elementos que deben incluirse en la descripción de la composición, método o componente respectivo de ellos se limitan a los que no afectan materialmente a la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s) de la divulgación ("que consiste prácticamente en"). Esto se aplica igualmente a las etapas dentro de un método descrito así como también a composiciones y componentes del mismo. En otras realizaciones, las composiciones, métodos, y los respectivos componentes de ellos, descritos en la presente invención están destinados a ser exclusivos de cualquier elemento que no se considere un elemento esencial para el componente, composición o método ("que consiste de").

Ejemplos

Ejemplos 1-7. Células tumorales desprenden microvesículas que contienen ARNs, que incluyen ARNs mensajeros y microARNs, y esas microvesículas contienen más de 90% del ARN extracelular en los fluidos corporales.

Ejemplo 1: Las microvesículas se desprenden de células de glioblastoma humano primario.

El tejido del glioblastoma se obtuvo a partir de resecciones quirúrgicas y las células tumorales se disociaron y se cultivaron en forma de monocapas. Específicamente, los especímenes de tumor cerebral de los pacientes diagnosticados por un neuropatólogo como glioblastoma multiforme se tomaron directamente de la cirugía y se colocaron en medio Neurobasal estéril frío (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Los especímenes se disociaron en células individuales dentro de 1 hora a partir del momento de la cirugía usando un Kit de Disociación de Tejido Neural (Miltenyi Biotech, Berisch Gladbach, Alemania) y se sembraron en DMEM 5% dFBS suplementado con penicilina-estreptomicina (10 UI ml-1 y 10 |jg ml-1, respectivamente, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Estados Unidos).

Debido a que las microvesículas pueden encontrarse en el suero bovino fetal (FBS) usado tradicionalmente para cultivar células, y estas microvesículas contienen cantidades sustanciales de ARNm y miARN, fue importante crecer las células tumorales en medios que contenían FBS reducido en microvesículas (dFBS). Se encontró que las células primarias cultivadas obtenidas de tres tumores de glioblastoma producían microvesículas tanto en pases tempranos como posteriores (un pase es una generación celular definida por la división de las células, que es una técnica común de cultivo celular y es necesaria para mantener vivas las células). Las microvesículas fueron capaces de detectarse mediante microscopía electrónica de barrido (FIGS. 1a y 1b) y microscopía electrónica de transmisión (FIG. 1f). Brevemente, las células de glioblastoma humano se colocaron sobre cubreobjetos recubiertos con ornitina, se fijaron en fijador de Karnovskys 0.5x y después se lavaron con PBS 2x5min (2 veces con 5 minutos cada uno). Las células se deshidrataron en 35% EtOH 10 min, 50% EtOH 2x 10 min, 70% EtOH 2x 10 min, 95% EtOH 2x 10 min, y 100% EtOH 4x 10 min. Las células se transfirieron después a secado de punto crítico en una secadora de punto crítico Tousimis SAMDR1-795 semiautomática seguido por el recubrimiento con cromo en un recubridor de haz de iones de alta resolución GATAN Modelo 681. Como se muestra en las FIGS. 1a y 1b, las células tumorales se cubrieron con microvesículas que varían en tamaño de aproximadamente 50 - 500 nm.

Ejemplo 2: Las microvesículas de glioblastoma contienen ARN.

Para aislar las microvesículas, se cultivaron células de glioblastoma en el pase 1-15 en medio libre de microvesículas (DMEM que contenía 5% dFBS preparado mediante ultracentrifugación a 110,000 x g por 16 horas para eliminar las microvesículas bovinas). El medio condicionado a partir de 40 millones de células se recogió después de 48 horas. Las microvesículas se purificaron mediante centrifugación diferencial. Específicamente, el medio condicionado de glioblastoma se centrifugó por 10 min a 300 x g para eliminar cualquier contaminación celular. Los sobrenadantes se centrifugaron más aún por 20 min a 16,500 x g y se filtraron a través de un filtro de 0.22 m. Después las microvesículas se sedimentaron mediante ultracentrifugación a 110,000 x g por 70 min. Los sedimentos de microvesículas se lavaron en 13 ml de PBS, se sedimentaron de nuevo y se resuspendieron en PBS.

Las microvesículas aisladas se midieron para su contenido total de proteína usando el ensayo DC Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, Estados Unidos).

Para la extracción del ARN de las microvesículas, se añadió Ribonucleasa A (Fermentas, Glen Burnie, MD, Estados Unidos) a una concentración final de 100 pg/ml a las suspensiones de microvesículas y se incubó por 15 min a 37°C para deshacerse del ARN fuera de las microvesículas y así asegurarse de que el ARN extraído vendría del interior de las microvesículas. Después el ARN total se extrajo de las microvesículas usando el kit de aislamiento de ARN mirVana (Ambion, Austin TX, Estados Unidos) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después del tratamiento con DNasa de acuerdo con el protocolo del fabricante, el ARN total se cuantificó usando un instrumento de nanogotas ND-1000 (Thermo Fischer Scientific, Wilmington, DE, Estados Unidos).

Se encontró que las microvesículas de glioblastoma contienen ARN y proteína en una relación de aproximadamente 1:80 (pg ARN:pg proteína). El rendimiento promedio de las proteínas y los ARNs aislados de las microvesículas en un período de 48 horas en cultivo fue de alrededor de 4 pg de proteína y 50 ng de ARN/millón de células.

Para confirmar que el ARN estaba contenido dentro de las microvesículas, las microvesículas se expusieron a Ribonucleasa A o a tratamiento simulado antes de la extracción del ARN (FIG.1c). Nunca hubo más de una disminución del 7% en el contenido de ARN después del tratamiento con Ribonucleasa. Así, parece que casi todo el ARN extracelular del medio está contenido dentro de las microvesículas y de ese modo está protegido de las Ribonucleasas externas por la membrana vesicular circundante.

El ARN total de las microvesículas y de sus células del donante se analizó con un Bioanalizador, mostrando que las microvesículas contienen una extensa variedad de tamaños de ARN consistente con una diversidad de ARNs mensajeros y miARNs, pero carecen de los picos de ARN ribosomal 18S y 28S característicos del ARN celular (FIGS.

1d y 1e).

Ejemplo 3: Las microvesículas contienen ADN.

Para probar si las microvesículas además contienen ADN, se aislaron los exosomas como se menciona en el Ejemplo 2 y después se trataron con DNasa antes de ser lisados para liberar los contenidos. La etapa de tratamiento con DNasa fue para eliminar el ADN fuera de los exosomas para que sólo se extrajera el ADN que reside dentro de los exosomas.

Específicamente, se realizó el tratamiento con DNasa usando el kit libre de ADN de Ambion de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Catálogo # AM 1906). Para la etapa de purificación del ADN, se lisó una alícuota de los exosomas aislados en 300pl de amortiguador de lisis que era parte del kit de aislamiento de ARN mirVana (Ambion) y los ADNs se purificaron a partir de la mezcla lisada usando un kit de purificación de ADN (Qiagen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Para examinar si el ADN extraído contiene genes comunes, se realizaron PCRs usando pares de iniciadores específicos para GAPDH, retrovirus K endógeno humano, Tenascina c y LINE-1.Para el gen GAPDH, se usaron los siguientes iniciadores: Forw3GAPDHnew (sec. con núm. de ident.: 1) y Rev3GAPDHnew (sec. con núm. de ident.: 2).

El par de iniciadores amplifica un amplicón de 112bp si la plantilla es un ADNc de GAPDH empalmado y una amplicón de 216bp si la plantilla es un ADN genómico de GAPDH sin empalmar. En un experimento, los exosomas aislados se trataron con DNasa antes de ser lisados para la extracción del a Dn (FIG. 3a). Los fragmentos de 112bp se amplificaron como se esperaba a partir de los exosomas del suero tumoral Ver Carril 4 en la FIG. 3a) y las células tumorales primarias (Ver Carril 6 en la FIG. 3a) pero no de los exosomas de fibroblastos humanos normales (Ver Carril 5 en la FIG. 3a). El fragmento de 216bp no pudo amplificarse a partir de los exosomas de los tres orígenes. Sin embargo, se amplificaron ambos fragmentos de 112bp y 216bp cuando se usó como plantilla el ADN genómico aislado de células de glioblastoma (Ver Carril 3 en la FIG. 3a). Así, el ADN de GAPDH empalmado existe dentro de los exosomas aislados de las células tumorales pero no dentro de los exosomas aislados de las células de fibroblastos normales.

En cambio, en otro experimento, los exosomas aislados no se trataron con DNasa antes de ser lisados para la extracción del ADN (FIG.3b). No sólo los fragmentos de 112bp sino además los fragmentos de 216bp se amplificaron a partir de los exosomas aislados de células de melanoma primario (Ver Carril 3 en la FIG. 3b), lo que sugiere que fuera de los exosomas existe ADN de GAPDH no empalmado o ADNc parcialmente empalmado que se ha transcrito de manera inversa.

Para el gen de retrovirus K endógeno humano (HERV-K), se usaron los siguientes iniciadores: HERVK_6Forw (sec. con núm. de ident.: 3) y HERVK_6Rev (sec. con núm. de ident.: 4). El par iniciador amplifica un amplicón de 172bp . Se extrajo el ADN de los exosomas que se aislaron y se trataron con DNasa, y se usó como plantilla para la amplificación por PCR. Como se muestra en la FIG. 3c, se amplificaron fragmentos de 172bp en todos los exosomas tumorales y del suero humano normal pero no en los exosomas de los fibroblastos humanos normales. Estos datos sugieren que a diferencia de los exosomas de los fibroblastos humanos normales, los exosomas tumorales y del suero humano normal contienen secuencias de ADN de retrovirus endógenos. Para examinar si los exosomas tumorales contienen además elementos de transposición, se usaron los siguientes iniciadores específicos de LINE-1 para las amplificaciones por PCR: Line1_Forw (sec. con núm. de ident.: 5) y Linel_Rev (sec. con núm. de ident.: 6). Estos dos iniciadores están diseñados para detectar LINE-1 en todas las especies puesto que cada iniciador contiene cantidades iguales de dos oligos diferentes. Para el iniciador Linel_Forw, un oligo contiene una C y el otro oligo contiene una G en la posición designada con "s". Para el iniciador Line1_Rev, un oligo contiene una A y el otro oligo contiene una G en la posición designada con "r". El par iniciador amplifica un amplicón de 290bp. La plantilla fue el ADN extraído de los exosomas que se trataron con DNasa (como se describió anteriormente). Como se muestra en la FIG. 3e, pudieron amplificarse fragmentos LINE-1 de 290bp a partir de los exosomas de células tumorales y suero humano normal pero no de los exosomas de los fibroblastos humanos normales.

Para probar si los exosomas además contienen ADN de Tenascina-C, se usó el siguiente par de iniciadores para realizar la PCR: Tenascin C Forw (sec. con núm. de ident.: 7) y Tenascin C Rev (sec. con núm. de ident.: 8). El par de iniciadores amplifica un amplicón de 197bp. La plantilla fue el ADN extraído de los exosomas que se aislaron y que después se trataron con DNasa antes de la lisis. Como se muestra en la FIG. 3d, se amplificaron fragmentos de tenascina C de 197bp en exosomas de células tumorales o suero humano normal pero no en exosomas de fibroblastos humanos normales. Así, el ADN de Tenascina C existe en los exosomas tumorales y del suero humano normal pero no en los exosomas de fibroblastos humanos normales.

Para confirmar más aún la presencia de ADN en los exosomas, se extrajo el ADN exosomal de células de meduloblastoma D425 usando el método descrito anteriormente. Específicamente, los exosomas se aislaron y se trataron con DNasa antes de la lisis. Volúmenes iguales del extracto final de ADN se trataron ya sea con DNasa o no se trataron con DNasa antes de ser visualizados mediante tinción con bromuro de etidio en gel de agarosa al 1%. El bromuro de etidio es un colorante que tiñe específicamente los ácidos nucleicos y puede visualizarse bajo la luz ultravioleta. Como se muestra en la FIG. 3f, la tinción con bromuro de etidio desapareció después del tratamiento con DNasa Ver Carril 3 en la FIG. 3f) mientras que pudo visualizarse la tinción fuerte en la alícuota sin tratar Ver Carril 2 en la FIG. 3f). Los extractos tratados y no tratados con DNasa se analizaron además en un chip pico de ARN (Agilent Technologies). Como se muestra en la FIG. 3g, el ADN monocatenario pudo detectarse fácilmente en el extracto no tratado con DNasa (Ver panel superior en la FIG. 3g) pero apenas pudo detectarse en el extracto tratado con DNasa (Ver panel inferior en la FIG. 3g).

Para probar si el ADN extraído era monocatenario, los ácidos nucleicos se extrajeron de los exosomas tratados como se describe en el párrafo anterior y se trataron más aún con RNAsa para eliminar cualquier contaminación con ARN. Los ácidos nucleicos tratados se analizaron después en un chip pico de Bioanalizador de ARN y en un chip de ADN 1000. El chip pico de ARN detecta solamente ácidos nucleicos monocatenarios. El chip de ADN 1000 detecta ácidos nucleicos bicatenarios. Como se muestra en la FIG. 3h, los ácidos nucleicos monocatenarios se detectaron Ver panel superior) pero los ácidos nucleicos bicatenarios no se detectaron Ver panel inferior). Así, los ADN contenidos dentro de los exosomas del tumor son principalmente monocatenarios.

Para demostrar que existe ADN monocatenario en las células tumorales pero no en los fibroblastos humanos normales, los ácidos nucleicos se extrajeron de los exosomas ya sean del suero de un paciente con glioblastoma o de fibroblastos humanos normales. Los exosomas se trataron con DNasa antes de la lisis y los ácidos nucleicos purificados se trataron con RNasa antes del análisis. Como se muestra en la FIG. 3i, los ácidos nucleicos exosomales extraídos del suero del paciente con glioblastoma puede detectarse mediante un chip pico de ARN. En contraste, solamente muy poca cantidad de ADN monocatenario se extrajo de los fibroblastos humanos normales.

En consecuencia, se encontró que los exosomas de células tumorales y de suero humano normal contienen ADN monocatenario. El ADN monocatenario es un producto de la transcripción inversa puesto que los productos de amplificación no contienen intrones (FIG. 3a y FIG. 3b). Se sabe que las células tumorales así como también las células progenitoras normales/células madre tienen actividad de la transcriptasa inversa (RT) activa aunque la actividad en las células progenitoras normales/células madre es relativamente mucho menor. Esta actividad de la RT hace que sea posible que los transcritos de ARN en la célula puedan transcribirse de manera inversa y empaquetarse en los exosomas como ADNc.

Curiosamente, los exosomas de células tumorales contienen más ADNs complementarios correspondientes a transcritos de genes específicos de tumor puesto que las células tumorales tienen por lo general la actividad de la transcriptasa inversa regulada positivamente. Por lo tanto, los ADNc específicos de tumor en los exosomas pueden usarse como biomarcadores para el diagnóstico o el pronóstico de diferentes tipos de tumores. El uso de ADNs complementarios como biomarcadores podría omitir la etapa de transcripción inversa en comparación con el uso de ARNm como biomarcadores para tumores. Adicionalmente, el uso de ADNc exosomal es ventajoso sobre el uso del ADN completo en suero/plasma porque el suero/plasma contiene ADN genómico liberado a partir de las células que mueren. Cuando se pruebe el a Dn completo en suero/plasma amplificado, habrá más fondo.

Ejemplo 4: La mayoría del ARN extracelular en suero humano está contenido dentro de los exosomas.

Para determinar la cantidad de ARN que circula en el suero como "ARN libre'Vcomplejo ARN-proteína contra la cantidad de ARN contenido dentro de los exosomas, aislamos el suero de un sujeto humano sano, y dividimos igualmente el suero en dos muestras con igual volumen. Para la muestra 1, el suero se ultracentrifugó para eliminar la mayoría de las microvesículas. Después el sobrenadante del suero se recogió y el ARN que quedó en el sobrenadante se extrajo usando Trizol lS. Para la muestra 2, el suero no se ultracentrifugó y el ARN total se extrajo del suero usando Trizol LS. Se midió la cantidad de ARN en el sobrenadante de la muestra 1 y el suero de la muestra 2. Como resultado, se encontró que la cantidad de ARN libre en el sobrenadante de la muestra 1 fue de menos del 10% de la cantidad de ARN total aislado del suero de la muestra 2. Por lo tanto, la mayoría del ARN en el suero está asociado con los exosomas.

Ejemplo 5: La alta eficiencia de la extracción del ácido nucleico extracelular en suero se logra mediante la incorporación de una etapa de aislamiento de exosomas en suero.

El suero y el plasma completos contienen grandes cantidades de ADN circulante y posiblemente además de ARN protegido en complejos de proteínas, mientras que el ARN libre tiene una vida media de unos pocos minutos en el suero. Los perfiles de ácido nucleico extracelular en el suero varían entre los mamíferos normales y enfermos y así pueden ser biomarcadores para ciertas enfermedades. Para examinar los perfiles, se necesita extraer los ácidos nucleicos. Sin embargo, la extracción directa de los ácidos nucleicos de suero y plasma no es práctica, especialmente a partir de grandes volúmenes de suero/plasma. En este caso, se usan grandes volúmenes de Trizol LS (un reactivo de extracción de ARN) para inactivar instantáneamente todas las nucleasas del suero antes de la extracción de los ácidos nucleicos exosomales.

Subsecuentemente, los contaminantes precipitan en la muestra y afectan a los análisis subsecuentes. Como se muestra en el Ejemplo 4, la mayoría de los ARNs extracelulares en suero están contenidos en los exosomas del suero. Por lo tanto, hemos probado si es más eficiente aislar los ácidos nucleicos extracelulares mediante el aislamiento de los exosomas del suero antes de la extracción del ácido nucleico.

Se dividieron cuatro mililitros (ml) de suero de la sangre de un paciente en 2 alícuotas de 2 ml cada una. Los exosomas del suero de una alícuota se aislaron antes de la extracción del ARN. Los métodos de aislamiento de exosomas y extracción del ARN son los mismos mencionados en el Ejemplo 2. Para la otra alícuota, se extrajo el ARN directamente usando Trizol LS de acuerdo con la recomendación del fabricante. Los ácidos nucleicos de estas dos extracciones se analizaron en un chip de Bioanalizador de ARN (Agilent Technologies). Como se muestra en la Figura 4, la cantidad de ARN extraído con el primer método es significativamente mayor que la obtenida a partir del último método. Además, la calidad del ARN extraído con el último método es relativamente pobre en comparación con la del primer método. Así, la etapa de aislamiento de los exosomas contribuye a la eficiencia de la extracción del ARN extracelular del suero.

Ejemplo 6: Análisis de microarreglo de ARNm.

El análisis de microarreglo de la población de ARNm en las células de glioblastoma y las microvesículas derivadas de ellas se realizó por Miltenyi Biotech (Auburn, CA, Estados Unidos) usando el arreglo de dos colores, Microarreglo del Genoma Humano Completo de Agilent, 4x44K. El análisis de microarreglo se realizó en dos preparaciones diferentes de ARN de células de glioblastoma primario y sus preparaciones correspondientes de ARN de microvesículas preparadas como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Los datos se analizaron usando el programa informático GeneSifter (Vizxlabs, Seattle, WA, Estados Unidos). El programa informático Intersector (Vizxlabs) se usó para extraer los genes detectados fácilmente en ambos arreglos. Los datos de microarreglo se han depositado en el Gene Expression Omnibus del NCBI y son accesibles a través del número de acceso GSE13470 de las series GEO.

Encontramos aproximadamente 22,000 transcritos de genes en las células y 27,000 transcritos de genes en las microvesículas que se detectaron muy por encima de los niveles de fondo (intervalo de confianza 99%) en ambos arreglos. Aproximadamente 4,700 ARNs mensajeros diferentes se detectaron exclusivamente en microvesículas en ambos arreglos, lo que indica un proceso de enriquecimiento selectivo dentro de las microvesículas. Consistente con esto, hubo una correlación general pobre en los niveles de ARNs mensajeros en las microvesículas en comparación con sus células de origen de dos preparaciones de células tumorales (FIGS. 2a y 2b). En contraste, hubo una buena correlación de los niveles de ARNm de un cultivo de células (A) contra el segundo cultivo de células (B) (FIG. 2c) y una correlación similar de los niveles de ARNm de las microvesículas correspondientes (A) y (B) (FIG. 2d). En consecuencia, existe una consistencia de la distribución del ARNm dentro de las células tumorales y las microvesículas. En la comparación de la relación de los transcritos en las microvesículas contra sus células de origen, encontramos 3,426 transcritos distribuidos diferencialmente más de 5 veces (valor de p <0.01). De estos, 2,238 transcritos estaban enriquecidos (hasta 380 veces) y 1,188 transcritos fueron menos abundantes (hasta 90 veces) que en las células (FIG. 5). Se documentaron las intensidades y las relaciones de todos los transcritos de genes. Las ontologías de los transcritos de ARNm enriquecidos o reducidos más de 10 veces se registraron y se revisaron.

Los transcritos de ARNm que estaban altamente enriquecidos en las microvesículas no siempre eran los que estaban más abundantes en las microvesículas. Los transcritos más abundantes serían más propensos a generar un efecto en la célula receptora tras la entrega, y por lo tanto los 500 transcritos de ARNm más abundantes presentes en las microvesículas se dividieron en diferentes procesos biológicos basados en sus descripciones de la ontología (FIG.

6a). De las varias ontologías, la angiogénesis, la proliferación celular, la respuesta inmune, la migración celular y la modificación de histonas se seleccionaron para el estudio adicional ya que representan funciones específicas que podrían estar involucradas en la remodelación del estroma tumoral y el incremento del crecimiento del tumor. Los ARNs mensajeros de las microvesículas de glioblastoma pertenecientes a estas cinco ontologías se graficaron para comparar sus niveles y su contribución al espectro de ARNm (FIG. 6b). Todas los cinco ontologías contenían ARNs mensajeros con niveles de expresión muy altos en comparación con el nivel de intensidad media de la señal del arreglo.

Un análisis exhaustivo de los ARNs mensajeros que están enriquecidos en las microvesículas contra las células del donante, sugiere que puede haber un mecanismo celular para la ubicación de estos mensajes en las microvesículas, posiblemente a través de un "código postal" en la 3'UTR como se describe para los ARNs mensajeros traducidos en ubicaciones celulares específicas, tal como aquel para la beta actina (Kislauskis y otros, 1994). Las configuraciones moleculares de los ARNs mensajeros en las microvesículas no se conoce, pero pueden estar presentes como partículas ribonucleares (RNPs) (Mallardo y otros, 2003) lo que después prevendrá la degradación y la traducción prematuras en la célula del donante.

El análisis de microarreglo de las poblaciones de ARNm en células de glioblastoma y microvesículas derivadas de células de glioblastoma, células de melanoma, y microvesículas derivadas de células de melanoma se realizó por Illumina Inc (San Diego, CA, Estados Unidos) usando el ensayo Apareamiento, Selección, Extensión, y Ligación mediados por ADNc de Genoma Completo (DASL). El ensayo DASL del Genoma Completo combina las etapas de PCR y marcaje del ensayo DASL de Illumina con la hibridación basada en los genes y el conjunto de sondas del genoma completo del HumanRef-8 BeadChip de Illumina. Este BeadChip cubre más de 24,000 genes anotados derivados de RefSeq (Construcción 36.2, Liberación 22). El análisis de microarreglo se realizó en dos preparaciones diferentes de ARN de células de glioblastoma primario, microvesículas de células de glioblastomas (derivadas con el método descrito en los Ejemplos 1 y 2), células de melanoma, y microvesículas de células de melanoma (derivadas con el método descrito en los Ejemplos 1 y 2).

Los datos de expresión para cada preparación de ARN se agruparon juntos y se usaron para generar un diagrama de grupos. Como se muestra en la FIG. 7, los perfiles de expresión del ARNm de células de glioblastoma, microvesículas de células glioblastomas, células de melanoma, y microvesículas de células de melanoma se agruparon juntas, respectivamente. Los perfiles de expresión de las dos líneas celulares de glioblastoma primario 20/3C y 11/5c se agruparon con una distancia de aproximadamente 0.06. Los perfiles de expresión de las dos líneas celulares de melanoma primario 0105C y 0664^c se agruparon con una distancia de aproximadamente 0.09. Los perfiles de expresión de exosomas de las dos líneas celulares de melanoma primario 0105C y 0664C se agruparon juntos con una distancia de alrededor de 0.15. Los perfiles de expresión de exosomas de las dos líneas celulares de glioblastomas primarios 20/3C y 11/5c se agruparon juntos con una distancia de alrededor de 0.098. Así, los exosomas de glioblastoma y melanoma tienen firmas distintivas de expresión del ARNm y la firma de la expresión génica de los exosomas se diferencia de la de sus células originales. Estos datos demuestran que los perfiles de expresión del ARNm de las microvesículas pueden usarse en los métodos descritos en la presente invención para el diagnóstico y el pronóstico de los cánceres.

Ejemplo 7: Las microvesículas de glioblastoma contienen miARN.

El miARN maduro de las microvesículas y de las células del donante se detectó usando una PCR cuantitativa de transcripción inversa de miARN. Específicamente, el ARN total se aisló de las microvesículas y de las células del donante usando el kit de aislamiento de ARN mirVana (Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos). Usando los kits TaqMan® MicroRNA Assay (Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos), 30 ng de ARN total se convirtieron en ADNc usando iniciadores específicos para miR y se amplificaron después de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Un subconjunto de 11 miARNs entre aquellos conocidos por estar regulados positivamente y abundantes en los gliomas se analizó en las microvesículas purificadas de dos glioblastomas primarios diferentes (GBM1 y GBM 2).Estos subconjuntos contenían let-7a, miR-15b, miR-16, miR-19b, miR-21, miR-26a, miR-27a, miR-92, miR-93, miR-320 y miR-20. Todos estos miARN se detectaron fácilmente en las células del donante y en las microvesículas (FIG. 8). Los niveles fueron generalmente más bajos en las microvesículas por |jg de ARN total que en las células parentales (10%, que corresponde a aproximadamente 3 valores de Ct), pero los niveles se correlacionaron bien, lo que indica que estas 11 especies de miARN no están enriquecidas en las microvesículas.

El análisis de microarreglo de las poblaciones de microARN en células de glioblastoma y microvesículas derivadas de células de glioblastoma, células de melanoma, y microvesículas derivadas de células de melanoma se realizó por Illumina Inc (San Diego, CA, Estados Unidos) usando el Panel de Perfiles de Expresión de MicroARN, potenciado por el ensayo DASL. Los paneles de microARN humanos incluyen 1146 especies de microARN. El análisis de microarreglo se realizó en dos preparaciones diferentes de ARN de células de glioblastoma primario, microvesículas de células de glioblastomas (derivadas usando el método descrito en los Ejemplos 1 y 2), células de melanoma, y microvesículas de células de melanoma (derivadas usando el método descrito en los Ejemplos 1 y 2).

Los datos de expresión para cada preparación de ARN se agruparon juntos y se usaron para generar un diagrama de grupos. Como se muestra en la FIG. 9, los perfiles de expresión de microARN de células de glioblastoma, microvesículas de células de glioblastomas, células de melanoma, y microvesículas de células de melanoma se agruparon juntos, respectivamente. Los perfiles de expresión de las dos líneas celulares de melanoma primario 0105C y 0664C se agruparon con una distancia de aproximadamente 0.13. Los perfiles de expresión de las dos líneas celulares de glioblastomas primarios 20/3C y 11/5c se agruparon con una distancia de aproximadamente 0.12. Los perfiles de expresión de los exosomas de las dos líneas celulares de glioblastomas primarios 20/3C y 11/5c se agruparon juntos con una distancia de alrededor de 0.12. Los perfiles de expresión de los exosomas de las dos líneas celulares de melanoma primario 0105C y 0664C se agruparon juntos con una distancia de alrededor de 0.17. Así, los exosomas de glioblastoma y melanoma tienen firmas distintivas de expresión de microARN y la firma de la expresión génica de los exosomas se diferencia de la de sus células originales. Además, como se demuestra en la presente invención, los perfiles de expresión de microARN de microvesículas pueden usarse en los métodos descritos en la presente invención para el diagnóstico y el pronóstico de los cánceres.

El hallazgo de miARNs en las microvesículas sugiere que las microvesículas derivadas del tumor pueden modificar las células normales circundantes al cambiar sus perfiles transcripcionales/traduccionales. Además, como se demuestra en la presente invención, el perfil de expresión de los miARN de las microvesículas pueden usarse en los métodos descritos en la presente invención para el diagnóstico y el pronóstico de los cánceres, que incluyen pero sin limitarse al glioblastoma.

Ejemplos 8-15. Estos ejemplos muestran que los ácidos nucleicos dentro de los exosomas de los fluidos corporales pueden usarse como biomarcadores para enfermedades u otras afecciones médicas.

Ejemplo 8: Los perfiles de expresión de miARNs en las microvesículas pueden usarse como biomarcadores sensibles para el glioblastoma.

Para determinar si los microARNs dentro de los exosomas pueden usarse como biomarcadores de una enfermedad y/o afección médica, examinamos la existencia de una correlación entre el nivel de expresión de microARN y el estado de la enfermedad. Puesto que el microARN-21 se expresa en altos niveles en células de glioblastoma y es fácilmente detectable en los exosomas aislados del suero de pacientes con glioblastoma, medimos cuantitativamente los números de copias del microARN-21 dentro de los exosomas de los sueros de pacientes con glioblastoma mediante RT-PCR cuantitativa. Específicamente, los exosomas se aislaron de muestras de suero de 4 ml de 9 sujetos humanos normales y 9 pacientes con glioblastoma. El procedimiento de extracción del ARN fue similar al procedimiento de extracción del ARN descrito en el Ejemplo 2. El nivel de miR-21 se analizó usando qPCR uniplex (Applied Biosystems) y se normalizó al nivel de expresión de GAPDH.

Como se muestra en la FIG. 10, el valor promedio del Ct fue 5.98 más bajo en la muestra de suero de glioblastoma, lo que sugiere que los niveles de expresión de miARN-21 exosomal en pacientes con glioblastoma es aproximadamente 63 veces más alto que en un sujeto humano normal. La diferencia es estadísticamente significativa con un valor p de 0.01. Por lo tanto, existe una correlación entre el nivel de expresión del microARN-21 y el estado de la enfermedad de glioblastoma, que demuestra la validez y la aplicabilidad de los métodos de diagnóstico no invasivos descritos en la presente invención. Por ejemplo, en un aspecto, el método comprende las etapas de aislamiento de los exosomas del fluido corporal de un sujeto y el análisis de los niveles de expresión del microARN-21 dentro de los exosomas mediante la medición del número de copias de microARN-21 y comparando el número con aquel dentro de los exosomas de un sujeto normal o con un número estándar generado mediante el análisis de los contenidos del micro-ARN-21 dentro de los exosomas de un grupo de sujetos normales. Un número de copias aumentado indica la existencia de glioblastoma en el sujeto; mientras que la ausencia de un número de copias aumentado indica la ausencia de glioblastoma en el sujeto. Este método básico puede extrapolarse para diagnosticar/monitorear otras enfermedades y/o afecciones médicas asociadas con otras especies de microARNs.

Ejemplo 9: Los ARNs mensajeros en las microvesículas pueden usarse como biomarcadores sensibles para el diagnóstico

Los ácidos nucleicos son de alto valor como biomarcadores debido a su capacidad de ser detectados con alta sensibilidad mediante métodos de PCR. En consecuencia, se diseñaron y llevaron a cabo las siguientes pruebas para determinar si los ARNs mensajeros en las microvesículas podrían usarse como biomarcadores para una enfermedad o afección médica, en este caso los tumores de glioblastoma. El ARNm del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se seleccionó debido a que la expresión de la mutación EGFRvIII es específica de algunos tumores y define un subtipo clínicamente distinto de glioma (Pelloski y otros, 2007). Adicionalmente, las mutaciones EGFRvIII no pueden detectarse tradicionalmente usando tejidos que no sean los tejidos de la lesión puesto que estas mutaciones son mutaciones somáticas pero no mutaciones de la línea germinal. Por lo tanto, una biopsia de los tejidos de la lesión tal como un tumor de glioma se requiere convencionalmente para la detección de mutaciones EGFRvIII. Como se detalla más abajo, se usó la RT-PCR anidada para identificar el ARNm de EGFRvIII en muestras de biopsia de tumor de glioma y los resultados se compararon con las especies de ARNm que se encuentran en microvesículas purificadas de una muestra de suero del mismo paciente.

Las microvesículas se purificaron a partir de células de glioblastoma humano primario seguido de la extracción del ARN de las microvesículas y las células del donante (biopsia). Las muestras se codificaron y las PCRs se realizaron de una manera a ciegas. Se incluyó como un control positivo Gli-36EGFRvIII (células de glioma humano que expresan EGFRvIII de forma estable). Las microvesículas de muestras de 0.5 a 2 ml de suero congelado se sedimentaron como se describe en el Ejemplo 2 y el ARN se extrajo usando el kit MirVana de aislamiento del ARN de microvesículas. Después se usó la RT-PCR anidada para amplificar tanto el EGFR silvestre (1153 bp) como los transcritos EGFRvIII (352 bp) de las microvesículas y las células del donante usando el mismo conjunto de iniciadores. Específicamente, el ARN se convirtió en ADNc usando el kit Omniscript RT (Qiagen Inc, Valencia, CA, Estados Unidos) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. Los iniciadores GAPDH fueron GAPDH Directo (sec. con núm. de ident.: 9) y GAPDH Reverso (sec. con núm. de ident.: 10). Los iniciadores EGFR/EGFRvIII PCR1 fueron sec. con núm. de ident.: 11 y sec. con núm. de ident.: 12. Los iniciadores EGFR/EGFRvIII PCR2 fueron sec. con núm. de ident.: 13 y sec. con núm. de ident.: 14. El protocolo de ciclos de PCR fue 94 °C por 3 minutos; 94 °C por 45 segundos, 60 °C p or 45 seconds, 72 °C por 2 minutos por 35 ciclos; y una etapa final a 72 °C por 7 minutos.

Analizamos la muestra de biopsia para determinar si el ARNm de EGFRvIII estaba presente y el resultado se comparó con el ARN extraído de exosomas purificados a partir de una muestra de suero congelado del mismo paciente. Catorce de las 30 muestras de tumores (47%) contenían el transcrito EGFRvIII, lo que es consistente con el porcentaje de glioblastomas que se han encontrado que contienen esta mutación en otros estudios (Nishikawa y otros, 2004). El EGFRvIII pudo amplificarse a partir de exosomas en siete de los 25 pacientes (28%) de los que se extrajo el suero alrededor del momento de la cirugía (FIG. 11 y Tabla 1). Cuando un nuevo par de iniciadores de EGFR/EGFRvIII PCR3: sec. con núm. de ident.: 15 y sec. con núm. de ident.: 16, se usaron como el segundo par de iniciadores para la amplificación por PCR anidada anterior, se encontraron más individuos que albergan mutaciones EGFRvIII (Tabla 1). El EGFRvIII pudo amplificarse a partir de exosomas en los seis pacientes que se identificaron como negativos con el viejo par de iniciadores EGFRvIII PCR2: sec. con núm. de ident.: 13 y sec. con núm. de ident.: 14. Notablemente, los exosomas del individuo 13, cuya biopsia no mostró mutación EGFRvIII, mostraron que contiene la mutación EGFRvIII, lo que sugiere un aumento de la sensibilidad de detección de la mutación EGFRvIII usando la tecnología de exosomas. El EGFRvIII no pudo ser amplificado a partir de los exosomas aislados de 52 muestras de suero control normales (FIG. 12). Curiosamente, dos pacientes con una muestra de tumor negativa a EGFRvIII resultaron ser positivos a EGFRvIII en los exosomas del suero, apoyando focos heterogéneos de expresión de EGFRvIII en el tumor de glioma. Además, nuestros datos mostraron además que los ARN intactos en las microvesículas fueron, de manera inesperada, capaces de aislarse del suero corporal congelado de los pacientes con glioblastoma. Estas muestras de suero a ciegas de pacientes confirmados con glioblastoma se obtuvieron del Centro de Investigación del Cáncer (centro médico VU, Amsterdam, Países Bajos) y se mantuvieron a -80°C hasta su uso. La identificación de los ARNs específicos de tumores en microvesículas del suero permite la detección de mutaciones somáticas que están presentes en las células tumorales. Tal tecnología deberá resultar en mejores diagnósticos y decisiones terapéuticas.

El ARN que se encuentra en las microvesículas contiene una "instantánea" de un arreglo sustancial del perfil de expresión génica celular en un momento dado. Entre el ARNm que se encuentra en microvesículas derivadas de glioblastoma, el ARNm de EGFR es de especial interés puesto que la variante de empalme de EGFRvIII se asocia específicamente con glioblastomas (Nishikawa y otros, 2004). Aquí se demuestra que los tumores cerebrales liberan microvesículas al torrente sanguíneo a través de la barrera hematoencefálica (BBB), lo que no se ha mostrado antes. Se demuestra además que las variantes de ARNm, tales como EGFRvIII en los tumores cerebrales, son capaces de detectarse mediante un método que comprende las etapas de aislamiento de los exosomas a partir de una pequeña cantidad de suero del paciente y análisis del ARN en dicha microvesículas.

El conocimiento de la mutación EGFRvIII en los tumores es importante en la elección de un régimen de tratamiento óptimo. Los gliomas positivos a EGFRvIII son más de 50 veces más propensos a responder al tratamiento con inhibidores de EGFR como erlotinib o gefitinib (Mellinghoff y otros, 2005).

Ejemplo 10: Diagnóstico de los trastornos del metabolismo del hierro

El método de diagnóstico de exosoma puede adaptarse para otros fines como se muestra en el siguiente ejemplo.

La hepcidina, un péptido antimicrobiano, es el regulador hormonal principal del metabolismo del hierro. Este péptido se produce principalmente en el hígado de los mamíferos y se controla por la actividad eritropoyética de la médula ósea, la cantidad de hierro corporal circulante y almacenado, y la inflamación. Tras la estimulación, la hepcidina se secreta a la circulación o a la orina donde puede actuar sobre las células diana que expresan ferroportina. La ferroportina es el único exportador de hierro identificado hasta la fecha y cuando se une a la hepcidina, se internaliza y se degrada. La destrucción resultante de la ferroportina conduce a la retención de hierro en las células que expresan ferroportina tales como macrófagos y enterocitos. Este mecanismo fisiopatológico subyace en la anemia de las enfermedades crónicas. Más específicamente, los niveles inadecuadamente altos de hepcidina y el contenido de hierro elevado dentro del sistema retículoendotelial caracterizan a la anemia. Claramente, la anemia puede estar asociada con muchas enfermedades y/o afecciones médicas tales como las infecciones (agudas y crónicas), el cáncer, la autoinmunidad, el rechazo crónico tras el trasplante de órganos sólidos, y la enfermedad renal crónica y la inflamación (Weiss y Goodnough, 2005). Por otro lado, en una enfermedad genética de sobrecarga de hierro tal como la hemocromatosis hereditaria, los niveles de expresión de hepcidina inadecuadamente bajos fomentan un eflujo excesivo de hierro potencialmente fatal desde dentro del sistema reticuloendotelial. Por lo tanto, la hepcidina está regulada positivamente en la anemia asociada con la enfermedad crónica, pero está regulada negativamente en la hemocromatosis.

Actualmente, no hay ningún ensayo apropiado para medir cuantitativamente los niveles de hepcidina en la circulación o en la orina (Kemna y otros, 2008) excepto la espectrometría de masas de tiempo de vuelo (TOF MS), que necesita un equipo altamente especializado, y por lo tanto no es fácilmente accesible. Recientemente, se ha propuesto el método de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) para medir cuantitativamente niveles de la hormona hepcidina pero este método no es consistente debido a la carencia de correlaciones claras con la hepcidina (Kemna y otros, 2005, Kemna y otros, 2007) y otros parámetros relacionados con el hierro (Brookes y otros, 2005, Roe y otros, 2007).

El ARNm de hepcidina se detectó en exosomas de suero humano, de la siguiente manera. Los exosomas se aislaron primero del suero humano y sus contenidos de ARNm se extrajeron antes de la conversión a ADNc y la amplificación por PCR. Los iniciadores de PCR se diseñaron para amplificar un fragmento de 129 nucleótidos de hepcidina humana. Las secuencias de los iniciadores son sec. con núm. de ident.: 57 y sec. con núm. de ident.: 58. Se detectó fácilmente mediante Bioanalizador un transcrito de hepcidina de 129 nucleótidos (el pico medio en la FIG. 13D). Como un control positivo (FIG. 13B), se extrajo el ARN de una línea celular de hepatoma humano Huh-7 y se convirtió en ADNc. El control negativo (FIG. 13C) es sin ARNm. Estos datos del Bioanalizador se muestran además en el pseudogel en la FIG. 13A.

El ARNm de hepcidina en las microvesículas en la circulación se correlaciona con el ARNm de hepcidina en las células hepáticas. Por lo tanto, la medición del ARNm de hepcidina dentro de las microvesículas en una muestra de fluido corporal permitiría diagnosticar o monitorear la anemia o la hemocromatosis en el sujeto.

Así, es posible diagnosticar y/o monitorear la anemia y la hemocromatosis en un sujeto mediante el aislamiento de microvesículas de un fluido corporal y la comparación del ARNm de hepcidina en dichas microvesículas con el ARNm de un sujeto normal. Con un sujeto anémico, el número de copias del ARNm aumenta por encima del nivel normal, sin anemia. En un sujeto que sufre de hemocromatosis, el número de copias disminuye con relación al ARNm en un sujeto normal.

Ejemplo 11: Perfil transcripcional no invasivo de los exosomas para el diagnóstico de la nefropatía diabética

La nefropatía diabética (DN) es una complicación que amenaza la vida que actualmente carece de tratamientos específicos. Así, existe una necesidad de desarrollar herramientas de diagnóstico sensibles para identificar a los pacientes que desarrollan o en riesgo de desarrollar DN, lo que permite la intervención temprana y el monitoreo.

El análisis de orina proporciona una manera de examinar la función renal sin tener que tomar una biopsia. Hasta la fecha, este análisis se ha limitado al estudio de proteínas en la orina. Este Ejemplo expone un método para obtener de la orina perfiles transcripcionales derivados de las células que normalmente sólo se podrían obtener mediante biopsia renal. Específicamente, el método comprende las etapas de aislamiento de los exosomas de la orina y el análisis de los ARNs dentro de dichos exosomas para obtener perfiles transcripcionales, que pueden usarse para examinar los cambios moleculares hechos por las células renales en individuos diabéticos y proporcionar una 'instantánea' de cualquier nueva proteína hecha por el riñón. Las tecnologías del estado del arte para la obtención de perfiles de transcripción exosomal incluyen, pero sin limitarse a, los arreglos de hibridación contemporáneos, las tecnologías basadas en la PCR, y los métodos de secuenciación de nueva generación. Puesto que la secuenciación directa no requiere de iniciadores prediseñados u oligos situados de ADN, proporcionará una descripción no sesgada de los perfiles de ARN exosomal. El analizador del genoma de Illumina proporciona un ejemplo de tecnología de secuenciación de nueva generación, que usa la tecnología de secuenciación paralela de manera masiva que le permite secuenciar el equivalente de 1/3 de un genoma humano por corrida. Los datos que pueden obtenerse de este análisis permitirán examinar con rapidez y de manera exhaustiva el perfil transcripcional exosomal urinario y permitirán la comparación del riñón completo. Con el uso de tal método, se podría obtener información muy necesaria con respecto al perfil de transcripción de los exosomas urinarios. Una comparación de los transcritos en el control contra los exosomas urinarios derivados de diabetes podría proporcionar además una lista exhaustiva de biomarcadores nuevos y predichos para la nefropatía diabética.

Con el fin de probar la viabilidad del método de diagnóstico descrito anteriormente, se diseñó un experimento y se llevó a cabo para aislar los exosomas urinarios y para confirmar la presencia de biomarcadores renales específicos dentro de estos exosomas. En este experimento, se recogió una muestra de 220 ml de orina fresca de la mañana de un sujeto macho sano de 28 años de edad y se procesó a través de centrifugación diferencial para aislar los exosomas urinarios. Específicamente, la orina se centrifugó primero a 300 x g por 10 minutos para eliminar cualquier célula de la muestra. El sobrenadante se recogió y después se sometió a una centrifugación a 16,500 x g 20 minutos para bajar cualquier resto de células o agregados de proteínas. Después el sobrenadante se pasó a través de un filtro de membrana de 0.22 uM para eliminar los restos con diámetros más grandes que 0.22 uM. Finalmente, la muestra se sometió a ultracentrifugación a 100,000 x g por 1 hora para sedimentar los exosomas (Thery y otros, 2006). El sedimento se lavó suavemente en solución salina regulada con fosfato (PBS) y se extrajo el ARN usando un kit RNeasy de Qiagen conforme a las instrucciones del fabricante. El ARN aislado se convirtió a ADNc usando el kit Omniscript RT (Qiagen) seguido de la amplificación por PCR de genes renales específicos.

Los genes renales específicos examinados y su área renal correspondiente en donde se expresa el gen son las siguientes: AQP1- túbulos proximales; AQP2 - túbulo distal (células principales); CUBN - túbulos proximales; LRP2 -túbulos proximales; AVP^r 2 - túbulos proximales y distales; SLC9A3 (NHE-3) - túbulo proximal; ATP6V1B1 - túbulo distal (células intercaladas); NPHS1 - glomérulo (células podocitos); NPHS2 - glomérulo (células podocitos) y CLCN3-células intercaladas Tipo B de los conductos colectores.Las secuencias de los iniciadores designados para amplificar cada gen son AQP1-F (sec. con núm. de ident.: 17) y AQP1-R (sec. con núm. de ident.: 18); AQP2-F (sec. con núm. de ident.: 19) y AQP2-R (sec. con núm. de ident.: 20); CUBN-F (sec. con núm. de ident.: 21) y CUBN-R (sec. con núm. de ident.: 22); LRP2-F (SEQ y ID NO: 23) y LRP2-R (sec. con núm. de ident.: 24); AVPR2-F (sec. con núm. de ident.: 25) y AVPR2-R (sec. con núm. de ident.: 26); SLC9A3-F (sec. con núm. de ident.: 27) y SLc 9a 3-R (sec. con núm. de ident.: 28); ATp6v 1B1-F (sec. con núm. de ident.: 29) y ATP6V1B1-R (sec. con núm. de ident.: 30); NPHS1-F (sec. con núm. de ident.: 31) y NPHS1-R (sec. con núm. de ident.: 32); NPHS2-F (sec. con núm. de ident.: 33) y NPHS2-R (sec. con núm. de ident.: 34); CLCN5-F (sec. con núm. de ident.: 35) y CLCN5-R (sec. con núm. de ident.: 36).

Los tamaños esperados de los productos de PCR para cada gen son AQP1-226bp, AQP2-208bp, CUBN-285bp, LRP2-220bp, AVPR2-290bp, SLC9A3-200bp, ATP6V1B1-226bp, NPHS1-201bp, NPHS2-266bp y CLCN5-204bp. El protocolo de ciclos de PCR fue 95 °C por 8 minutos; 95 °C por 30 segundos, 60 °C por 30 segundos, 72 °C por 45 segu ndos por 30 ciclos; 30 ciclos; y una etapa final a 72 °C por 10 minutos.

Como se muestra en la FIG. 14a, las células tubulares renales contienen cuerpos multivesiculares, que son una etapa intermedia durante la generación de los exosomas. Los exosomas aislados de estas células pueden identificarse mediante microscopía electrónica (FIG. 14b). El análisis del ARN total extraído de los exosomas urinarios indica la presencia de especies de ARN con una extensa variedad de tamaños (FIG. 14c). No se encontraron ARNs ribosomales 18S y 28S. El análisis por PCR confirmó la presencia de transcritos renales específicos dentro de los exosomas urinarios (FIG. 14d). Estos datos muestran que las células renales desprenden exosomas en la orina y estos exosomas urinarios contienen transcritos de origen renal, y que el método de exosoma puede detectar biomarcadores renales asociados con ciertas enfermedades renales y/u otras afecciones médicas.

Para confirmar más aún la presencia de transcritos de ARNm renales específicos en exosomas urinarios, se realizó un conjunto independiente de experimentos usando muestras de orina de seis individuos. Los ácidos nucleicos exosomales se extrajeron de muestras de 200ml de orina de la mañana de cada individuo siguiendo un procedimiento como se mencionó anteriormente. Específicamente, las muestras de orina se sometieron a centrifugación diferencial partiendo de una centrifugación a 1000 x g para centrifugar las células completas y los restos celulares. El sobrenadante se eliminó cuidadosamente y se centrifugó a 16,500 g por 20 minutos. Después se eliminó el siguiente sobrenadante y se filtró a través de un filtro de 0.8pm para eliminar los restos residuales del sobrenadante que contenía a los exosomas. Después el sobrenadante final se sometió a ultracentrifugación a 100,000 g por 1 hora y 10 minutos. El sedimento se lavó en PBS libre de nucleasa y se volvió a centrifugar a 100,000 g por 1 hora y 10 minutos para obtener el sedimento de exosomas que está listo para la extracción del ácido nucleico. Los ácidos nucleicos se extrajeron de los exosomas sedimentados usando el kit de aislamiento de ARN PicoPure de Arcturus y la concentración y la integridad del ácido nucleico se analizaron usando un chip pico de Bioanalizador (Agilent). Como se muestra en la FIG. 14e, los ácidos nucleicos aislados de los exosomas urinarios varían de individuo a individuo. Para probar si la presencia de biomarcadores renales además varía de individuo a individuo, se llevaron a cabo amplificaciones de PCR para los genes de Acuaporina1, Acuaporina2 y cubilina usando un nuevo conjunto de pares de iniciadores: nuevo par de iniciadores para AQP1: sec. con núm. de ident.: 37 y sec. con núm. de ident.: 38; nuevo par de iniciadores para AQP2: sec. con núm. de ident.: 39 y sec. con núm. de ident.: 40; nuevo par de iniciadores para CUBN: sec. con núm. de ident.: 41 y sec. con núm. de ident.: 42 Estos pares de iniciadores se diseñaron específicamente para amplificar los fragmentos de ADNc empalmados y transcritos de manera inversa. La transcripción inversa se realizó usando el kit Sensiscript de Qiagen. Como se muestra en la FIG. 14f, no se observó amplificación en el individuo 1, probablemente debido a la extracción fallida de ácido nucleico. AQP1 se amplificó solamente en el individuo 2. CUBⁿ se amplificó en el individuo 2 y 3. Y AQP2 se amplificó en el individuo 2, 3, 4 y 5. En comparación el gen de actina (indicado por "Casa" en la FIG. 14f) se amplificó en los individuos 2, 3, 4, 5 y 6. Estos datos proporcionan más evidencia de que los exosomas urinarios contienen transcritos de ARNm renales específicos aunque los niveles de expresión son diferentes entre individuos diferentes.

Para probar la presencia de ADNs complementarios en los exosomas urinarios, una muestra de 200 ml de orina humana se dividió en dos muestras de orina de 100 ml. Los exosomas urinarios se aislaron de cada muestra. Los exosomas de una muestra se trataron con DNasa y los de la otra muestra se trataron de forma simulada. Después los exosomas de cada muestra se lisaron para la extracción del ácido nucleico usando el kit de aislamiento de ARN PicoPure (Acturus). Los ácidos nucleicos se usaron como plantillas para la amplificación por PCR anidada (protocolos de PCR descritos en el Ejemplo 9) sin transcripción inversa previa. Los pares de iniciadores para amplificar el gen de actina fueron Actin-FOR (sec. con núm. de ident.: 43) y Actin-REV (sec. con núm. de ident.: 44); Actin-nest-FOR (sec. con núm. de ident.: 45) y Actin-nest-REV (sec. con núm. de ident.: 46) con un amplicón final esperado de 100bp basado en la secuencia del ADNc del gen de actina. Como se muestra en la FIG. 14g, los fragmentos de 100bp estaban presentes en el control positivo (ADNc de riñón humano como plantillas), los exosomas tratados con DNasa y los no tratados, pero ausentes en el carril del control negativo (sin plantillas). En consecuencia, el ADNc de actina está presente tanto en los exosomas urinarios tratados con DNasa como en los no tratados.

Para probar si la mayoría de los ácidos nucleicos extraídos usando el método estaban presentes dentro de los exosomas, los ácidos nucleicos extraídos de los exosomas tratados con DNasa y los no tratados se disolvieron en volúmenes iguales y se analizaron usando un chip pico de ARN (Agilent Technologies). Como se muestra en la FIG.

14h, la concentración de los ácidos nucleicos aislados de la muestra tratada con DNasa fue de 1,131 pg/ul y la de la muestra no tratada fue 1,378 pg/ul. Así, más del 80% de los ácidos nucleicos extraídos de los exosomas urinarios usando el método anterior eran del interior de los exosomas.

Para identificar sistemáticamente el contenido de los exosomas urinarios, los ácidos nucleicos se extrajeron de los exosomas urinarios y se entregaron al Broad Institute para la secuenciación. Se generaron aproximadamente 14 millones de lecturas de secuencia, cada 76 nucleótidos de longitud. Estas lecturas de secuencia corresponden a fragmentos de transcritos de ADN/ARN presentes dentro de los exosomas urinarios. Con el uso de un parámetro de alineación extremadamente estricto (100% de identidad sobre la longitud total de la secuencia), aproximadamente 15% de las lecturas se alinearon al genoma humano. Este porcentaje podría aumentar si se usaran criterios de alineación menos estrictos. La mayoría de este 15% de lecturas no se alineó con genes que codifican proteínas sino más bien con elementos genómicos no codificantes tales como transposones y varios elementos de repetición LINE & SINE. Notablemente, para aquellas lecturas que no están alineadas al genoma humano, muchas están alineadas a secuencias virales. En la medida en que las composiciones y los niveles de ácidos nucleicos contenidos en los exosomas urinarios cambian con respecto a un estado de la enfermedad, los perfiles de los ácidos nucleicos podrían usarse de acuerdo con los métodos presentes como biomarcadores para el diagnóstico de la enfermedad.

Este ejemplo demuestra que el método de exosoma de analizar exosomas de la orina puede usarse para determinar los cambios celulares en el riñón en la enfermedad renal relacionada con la diabetes sin tener que tomar una biopsia renal invasiva, de alto riesgo. El método proporciona una herramienta de diagnóstico nueva y sensible usando exosomas para la detección temprana de las enfermedades renales tal como la nefropatía diabética. Esto permitirá la intervención y el tratamiento inmediatos. En resumen, el método de diagnóstico de exosoma y la tecnología descrita en la presente proporciona un medio de diagnóstico muy necesario para la nefropatía diabética y otras enfermedades que se asocian con determinados perfiles de ácidos nucleicos contenidos en los exosomas urinarios.

Ejemplo 12: Diagnóstico de cáncer de próstata y exosomas urinarios

El cáncer de próstata es el cáncer más común en los hombres actualmente. El riesgo del cáncer de próstata es aproximadamente 16%. Más de 218,000 hombres en los Estados Unidos fueron diagnosticados en el 2008. Mientras más temprano se detecte el cáncer de próstata, mayores son las posibilidades de un tratamiento exitoso. De acuerdo con la Sociedad Americana del Cáncer, si se encuentran los cánceres de próstata mientras que todavía están en la próstata en sí o en zonas cercanas, la tasa de supervivencia relativa a cinco años estará sobre el 98%.

Un método de diagnóstico establecido se lleva a cabo mediante la medición del nivel de antígeno prostático específico (PSA) en la sangre, en combinación con un examen rectal digital. Sin embargo, tanto la sensibilidad como la especificidad de la prueba de PSA requieren de una mejora significativa. Esta baja especificidad resulta en un alto número de falsos positivos, que generan numerosas biopsias innecesarias y costosas. Otros métodos de diagnóstico se llevan a cabo mediante la detección de los perfiles genéticos de biomarcadores identificados recientemente que incluyen, pero sin limitarse a, gen del cáncer de próstata 3 (PCA3) (Groskopf y otros, 2006; Nakanishi y otros, 2008), un gen de fusión entre la proteasa transmembranal de serina 2 y el gen relacionado con ETS (TMPRSS2-ERG) (Tomlins y otros, 2005), glutatión S-transferasa pi (Goessl y otros, 2000; Gonzalgo y otros, 2004), y alfa-metilacil CoA racemasa (AMACR) (Zehentner y otros, 2006; Zielie y otros, 2004) en células de cáncer de próstata encontradas en fluidos corporales tales como suero y orina (Groskopf y otros, 2006; Wright y Lange, 2007) Aunque estos biomarcadores pueden dar una especificidad aumentada debido a la sobreexpresión en células de cáncer de próstata (por ejemplo, la expresión de PCA3 se aumenta 60 a 100 veces en las células de cáncer de próstata), se requiere un examen rectal digital para ordeñar células de la próstata en la orina justo antes de la recogida del espécimen (Nakanishi y otros, 2008). Tales exámenes rectales tienen desventajas inherentes tales como el sesgo en la recogida de las células cancerosas que son fácilmente ordeñadas en la orina y la participación de los médicos que es costosa y consume mucho tiempo.

Aquí, se propone un nuevo método de detección de los perfiles genéticos de estos biomarcadores para superar la limitación mencionada anteriormente. El método comprende las etapas de aislamiento de los exosomas de un fluido corporal y el análisis del ácido nucleico de dichos exosomas. Los procedimientos del método son similares a los detallados en el Ejemplo . En este ejemplo, las muestras de orina fueron de cuatro pacientes diagnosticados con cáncer de próstata. Como se muestra en la FIG. 15c, las etapas del cáncer se caracterizaron en términos de grado, etapa Gleason y niveles de PSA. Adicionalmente, los ácidos nucleicos analizados por RT-PCR anidada como se detalla en el Ejemplo 7 fueron TMPRSS2- ERG y de PCA3, dos de los biomarcadores de cáncer de próstata identificados recientemente. Para la amplificación de TMPRSS2-ERG, el par de iniciadores para la primera etapa de amplificación fue TMPRSS2-ERG F1 (sec. con núm. de ident.: 47) y TMPRSS2-ERG R1 (sec. con núm. de ident.: 48); y el par de iniciadores para la segunda etapa de amplificación fue TMPRSS2-ERG F2 (sec. con núm. de ident.: 49) y TMPRSS2-ERG R2 (sec. con núm. de ident.: 50). El amplicón esperado es de 122 pares de bases (bp) y da dos fragmentos (uno es de 68 bp, el otro es de 54 bp) después de la digestión con la enzima de restricción HaeII. Para la amplificación de PCA3, el par de iniciadores para la primera etapa de amplificación fue PCA3 F1 (sec. con núm. de ident.: 51) y PCA3 R1 (sec. con núm. de ident.: 52); y el par de iniciadores para la segunda etapa de amplificación fue PCA3 F2 (sec. con núm. de ident.: 53) y PCA3 R2 (sec. con núm. de ident.: 54) El amplicón esperado es de 152 bp de longitud y da dos fragmentos (uno es de 90 bp, el otro es de 62 bp) después de la digestión con la enzima de restricción Sca1.

Como se muestra en la FIG. 15a, tanto en el paciente 1 como el 2, pero no en los pacientes 3 y 4, el amplicón esperado de TMPRSS2-ERG pudo detectarse y digerirse en dos fragmentos de tamaños esperados. Como se muestra en la FIG. 15b, en los cuatro pacientes, el amplicón esperado de PCA3 pudo detectarse y digerirse en dos fragmentos de tamaños esperados. Por lo tanto, la expresión de PCA3 pudo detectarse en las muestras de orina de los cuatro pacientes, mientras que la expresión de TMPRSS2-ERG sólo pudo detectarse en las muestras de orina de los pacientes 1 y 2 (FIG. 15c). Estos datos, aunque no son concluyentes debido al pequeño tamaño de la muestra, demuestran la aplicabilidad del nuevo método en la detección de biomarcadores de cáncer de próstata. Más aún, el método de exosoma no se limita al diagnóstico sino que puede emplearse para el pronóstico y/o el monitoreo de otras afecciones médicas relacionadas con el cáncer de próstata.

Ejemplo 13: Las microvesículas en el diagnóstico prenatal no invasivo

El diagnóstico prenatal es ahora parte de la práctica obstétrica establecida en todo el mundo. Los métodos convencionales de obtención de tejidos fetales para el análisis genético incluyen la amniocentesis y el muestreo de vellosidades coriónicas, los que son invasivos y confieren riesgo para el feto no nato. Existe una necesidad largamente sentida en genética clínica de desarrollar métodos de diagnóstico no invasivo. Un enfoque que se ha investigado extensivamente se basa en el descubrimiento de células fetales circulantes en el plasma materno. Sin embargo, hay una serie de barreras que impide su aplicación en el ámbito clínico. Tales barreras incluyen la escasez de células fetales (sólo 1.2 células/ml de sangre materna), que requiere muestras de sangre de volúmenes relativamente grandes, y la larga vida media de las células fetales residuales del embarazo anterior, lo que puede causar falsos positivos. Otro enfoque se basa en el descubrimiento de ADN fetal en el plasma materno. Las cantidades suficientes de ADN fetal y el tiempo de eliminación corto superarán las barreras asociadas con el método de células fetales. Sin embargo, el ADN sólo confiere información genética hereditaria y algo de epigenética, las cuales no pueden representar a los perfiles dinámicos de expresión génica que están vinculados a las afecciones médicas fetales. El descubrimiento del ARN fetal circulante en el plasma materno (Ng y otros, 2003b; Wong y otros, 2005) puede ser el método de elección para el diagnóstico prenatal no invasivo.

Varios estudios sugieren que los ARNs fetales son de alto valor diagnóstico. Por ejemplo, la expresión elevada del transcrito de la hormona liberadora de corticotropina (CRH) fetal está asociada con preeclampsia (una afección clínica que se manifiesta por hipertensión, edema y proteinuria) durante el embarazo (Ng y otros, 2003a). Adicionalmente, el ARNm de placenta específico-4 (PLAC4) en el plasma materno se usó con éxito en una prueba no invasiva para el embarazo aneuploide (tal como la trisomía 21, síndrome de Down) (Lo y otros, 2007). Además, el transcrito de la gonadotropina coriónica humana (hCG) fetal en el plasma materno puede ser un marcador de enfermedades trofoblásticas de la gestación (GTDs), que son un crecimiento tumoral de los tejidos fetales en un huésped materno. Los ARNs fetales circulantes son principalmente de origen placentario (Ng y otros, 2003b). Estos ARNs fetales pueden detectarse tan temprano como en la cuarta semana de gestación y tal ARN se elimina rápidamente después del parto.

El diagnóstico prenatal usando ARNs fetales circulantes en el plasma materno, sin embargo, tiene varias limitaciones. La primera limitación es que el ARN fetal circulante se mezcla con el ARN materno circulante y no se separa de manera efectiva. Actualmente, los transcritos fetales se identifican, basado en una suposición, como aquellos que se detectan en las mujeres embarazadas antes del parto así como también en la sangre del cordón de su bebé, sin embargo están reducidos significativamente o ausentes en la sangre materna dentro de 24 o 36 horas después del parto (Maron y otros, 2007). La segunda limitación es que no se establece un método para enriquecer el ARN fetal circulante para incrementar la sensibilidad del diagnóstico, puesto que aún se desconoce cómo se empaqueta y se libera el ARN fetal. La manera de superar estas limitaciones puede estar en el aislamiento de las microvesículas y el análisis de los ARNs fetales en ellas.

Varios hechos sugieren que las microvesículas, que se desprenden de las células eucariotas, son los vehículos de los ARNs fetales circulantes en el plasma materno. Primero, los ARNs circulantes dentro de las microvesículas están protegidos de la degradación por Ribonucleasa. Segundo, se ha demostrado que los ARNs fetales circulantes permanecen en la fracción no celular del plasma materno, lo que es consistente con la noción de que las microvesículas que abarcan estos ARNs fetales son capaces de filtrarse a través de una membrana de 0.22 um. Tercero, de forma similar a los tejidos tumorales que se conoce que desprenden microvesículas, las células de la placenta, que son un tejido fetal pseudomaligno, son capaces con más probabilidad de desprender microvesículas. Así, un nuevo método de diagnóstico prenatal no invasivo se compone de aislar microvesículas fetales de plasma de sangre materna y después analizar los ácidos nucleicos dentro de las microvesículas para cualquiera de las variantes genéticas asociadas con ciertas enfermedades y/u otras afecciones médicas.

Un caso hipotético de diagnóstico prenatal no invasivo es el siguiente: se recogen muestras de sangre periférica de las mujeres embarazadas y se someten a la separación magnética de células activadas (MACS) u otra purificación por afinidad para aislar y enriquecer las microvesículas específicas del feto. El sedimento microvesicular se resuspende en PBS y se usa inmediatamente o se almacena a -20°C para su proces amiento adicional. El ARN se extrae de las microvesículas aisladas usando el kit de extracción de ARN de Qiagen según las instrucciones del fabricante. El contenido de ARN se analiza para el nivel de expresión del transcrito de gonadotropina coriónica humana (hCG) fetal. Un nivel de expresión de hCG aumentado en comparación con el intervalo estándar apunta al desarrollo de las enfermedades trofoblásticas gestacionales (GTDs) e implica además la necesidad del tratamiento clínico para este crecimiento anormal en el feto. La sensibilidad de la tecnología de microvesículas hace que sea posible detectar las GTDs en una etapa muy temprana antes de que cualquier manifestación sintomática o cambios estructurales se hagan detectables bajo examen ultrasónico. El intervalo estándar de los niveles del transcrito de hCG puede determinarse mediante el examen de un número estadísticamente significativo de muestras de ARN fetal circulante de embarazos normales.

Este método de diagnóstico prenatal puede extrapolarse al diagnóstico prenatal y/o monitoreo de otras enfermedades o afecciones médicas mediante el examen de esos transcritos asociados con estas enfermedades o afecciones médicas. Por ejemplo, la extracción y el análisis del ácido nucleico de la cinasa del linfoma anaplásico (ALK) de microvesículas de origen fetal a partir de la sangre materna es un diagnóstico prenatal no invasivo de neuroblastoma, que está estrechamente asociado con mutaciones en el dominio cinasa o la expresión elevada de ALK (Mosse y otros, 2008). En consecuencia, los métodos de microvesículas y la tecnología descritos en la presente invención pueden conducir a una nueva era del tan necesario, diagnóstico genético prenatal no invasivo.

Ejemplo 14: Diagnóstico del melanoma

El melanoma en un tumor maligno de los melanocitos (células de pigmento) y se encuentra predominantemente en la piel. Es una forma grave de cáncer de piel y es responsable del 75 por ciento de todas las muertes asociadas al cáncer de piel. Las mutaciones de la activación somática (por ejemplo V600E) de BRAF son las anomalías genéticas más comunes y tempranas detectadas en la génesis del melanoma humano. El BRAF activado promueve la progresión del ciclo celular y/o la supervivencia del melanoma.

Actualmente, el diagnóstico de melanoma se hace sobre la base de un examen físico y la biopsia por escisión. Sin embargo, una biopsia puede muestrear sólo un número limitado de focos dentro de la lesión y puede dar falsos positivos o falsos negativos. El método de exosoma proporciona un medio más preciso para el diagnóstico de melanoma. Como se discutió anteriormente, el método se comprende de las etapas de aislamiento de los exosomas de un fluido corporal de un sujeto y el análisis del ácido nucleico de dichos exosomas.

Para determinar si los exosomas desprendidos por las células de melanoma contienen ARNm de BRAF, cultivamos células de melanoma primario en medio DMEM suplementado con FBS reducido en exosomas y se recogieron los exosomas en el medio usando un procedimiento similar al detallado en el Ejemplo 2. Las líneas de células primarias fueron Yumel y M34. Las células Yumel no tienen la mutación V600E en BRAF, mientras que las células M34 tienen la mutación V600E en BRAF. Los ARNs se extrajeron de los exosomas y después se analizaron para la presencia de ARNm de BRAF mediante RT-PCR. Los iniciadores usados para la amplificación por PCR fueron: BRAF directo (sec. con núm. de ident.: 55) y BRAF reverso (sec. con núm. de ident.: 56). El amplicón es de 118 pares de bases (bp) de longitud y cubre la parte de la secuencia del ADNc de BRAF donde se ubica la mutación V600E. Como se muestra en la FIG. 16a, se detectó una banda de 118 bp en los exosomas de las células de melanoma primario (células Yumel y M34), pero no en los exosomas de células de fibroblastos humanos o controles negativos. La detección negativa de una banda de producto de PCR de 118 bp no se debe a una extracción de ARN errónea puesto que los transcritos GAPDH pudieron detectarse en los exosomas tanto de células de melanoma como de células de fibroblastos humanos (FIG. 16b). Los productos de PCR de 118 bp se secuenciaron además para detectar la mutación V600E. Como se muestra en las FIGS. 16c y 16d, los productos de PCR a partir de células YUMEL, como se esperaba, contienen el ARNm de BRAF silvestre. En contraste, los productos de PCR a partir de las células M34, como se esperaba, contienen ARNm de BRAF mutante con una mutación puntual T-A, que hace que el aminoácido valina (V) se sustituya por ácido glutámico (E) en la posición del aminoácido 600 de la proteína BRAF. Además, el ARNm de BRAF no puede detectarse en los exosomas de las células de fibroblastos humanos normales, lo que sugiere que el ARNm de BRAF no está contenido en los exosomas de todos los tejidos de orígen.

Estos datos sugieren que las células del melanoma desprenden exosomas a la circulación de la sangre y así el melanoma puede diagnosticarse mediante el aislamiento de estos exosomas del suero de la sangre y el análisis del ácido nucleico de los mismos para la presencia o ausencia de mutaciones (por ejemplo, V600E) en BRAF. El método descrito anteriormente puede emplearse además para diagnosticar los melanomas que se asocian con otras mutaciones de BRAF y las mutaciones en otros genes. El método puede emplearse además para diagnosticar los melanomas que se asocian con los perfiles de expresión de BRAF y otros ácidos nucleicos.

Ejemplo 15: Detección de los niveles de MMP de exosomas para monitorear las afecciones posteriores al trasplante.

Los trasplantes de órganos por lo general son tratamientos efectivos para insuficiencias de órganos. La insuficiencia renal, las enfermedades del corazón, la enfermedad pulmonar en etapa terminal y la cirrosis del hígado son todas afecciones que pueden tratarse de manera efectiva mediante un trasplante. Sin embargo, los rechazos de órganos causados por complicaciones posteriores al trasplante son los principales obstáculos para la supervivencia a largo plazo de los receptores de aloinjertos. Por ejemplo, en los trasplantes de pulmón, el síndrome de bronquiolitis obliterante es una complicación grave que afecta a las tasas de supervivencia. En los trasplantes renales, la nefropatía crónica del aloinjerto sigue siendo una de las principales causas de fallo del aloinjerto renal. Las lesiones por isquemiareperfusión dañan el corazón del donante después del trasplante de corazón, así como también el hígado del donante después del trasplante hepático ortotópico. Estas complicaciones posteriores al trasplante pueden mejorarse una vez que se detecta en etapas tempranas. Por lo tanto, es esencial monitorear las afecciones posteriores al trasplante con el fin de aliviar las complicaciones adversas.

Las alteraciones en la matriz extracelular contribuyen a la remodelación intersticial en las complicaciones posteriores al trasplante. Las metaloproteinasas de matriz (m Mp ) están involucradas tanto en el recambio como en la degradación de las proteínas de la matriz extracelular (ECM). Las MMPs son una familia de enzimas proteolíticas, dependientes de zinc, con 27 miembros descritos hasta la fecha, que muestran estructuras multidominio y especificidades de sustrato, y funcionan en el procesamiento, la activación, o desactivación de una diversidad de factores solubles. Los niveles de MMP en suero pueden indicar el estado de las afecciones posteriores al trasplante. Claramente, la MMP-2 circulante está asociada con la cistatina C, la duración posterior al trasplante, y la diabetes mellitus en receptores de trasplante renal (Chang y otros, 2008). La expresión desproporcionada de MMP-9 está vinculada al desarrollo del síndrome de bronquiolitis obliterante después del trasplante de pulmón (Hubner y otros, 2005).

Los ARNs mensajeros de MMP (MMP1, 8, 12, 15, 20, 21, 24, 26 y 27) pueden detectarse en los exosomas desprendidos por células de glioblastoma como se muestra en el Ejemplo 4 y la Tabla 10.El presente método de exosoma, el aislamiento de exosomas de un fluido corporal y el análisis de los ácidos nucleicos de dichos exosomas, puede usarse para monitorear las afecciones de trasplante. El procedimiento de aislamiento de exosomas es similar al que se detalla en el Ejemplo 2. Los presentes procedimientos para analizar el ácido nucleico contenido dentro de los exosomas se detallan en el Ejemplo 9. Un aumento significativo en el nivel de expresión de MMP-2 después del trasplante renal indicará la aparición y/o el deterioro de complicaciones posteriores al trasplante. De manera similar, un nivel significativamente elevado de MMP-9 después del trasplante de pulmón, sugiere la aparición y/o el deterioro del síndrome de bronquiolitis obliterante.

Por lo tanto, el método de exosoma puede usarse para monitorear las afecciones posteriores al trasplante mediante la determinación de los niveles de expresión de las proteínas MMP asociadas con complicaciones posteriores al trasplante. Además se espera que el método pueda extrapolarse para monitorear las afecciones posteriores al trasplante mediante la determinación de la expresión de otros genes marcadores así como también monitorear otras afecciones médicas mediante la determinación del perfil genético de los ácidos nucleicos asociados con estas afecciones médicas.

Ejemplos 16-18. Las microvesículas pueden ser agentes terapéuticos o vehículos de entrega de agentes terapéuticos.

Ejemplo 16: Las proteínas de la microvesícula inducen angiogenesis in vitro.

Se diseñó y se llevó a cabo un estudio para demostrar que las microvesículas de glioblastoma contribuyen a la angiogénesis. HBMVECs (30,000 células), una línea de células endoteliales del cerebro, (Cell Systems, Catálogo # ACBRI- 376, Kirkland, WA, Estados Unidos) se cultivaron en pocillos recubiertos con Matrigel en una placa de 24 pocillos en medio basal solo (EBM) (Lonza Biologics Inc., Portsmouth, NH, Estados Unidos), medio basal suplementado con microvesículas de glioblastoma (EBM+ MV) (7 pg/pocillo), o medio basal suplementado con un cóctel de factores angiogénicos (EGM; hidrocortisona, EGF, FGF, v Eg F, IGF, ácido ascórbico, FBS, y heparina; Singlequots (control positivo EBM) La formación de túbulos se midió después de 16 horas y se analizó con el programa informático Image J. Las HBMVECs cultivadas en la presencia de microvesículas de glioblastoma demostraron una duplicación de la longitud del túbulo dentro de 16 horas. El resultado fue comparable con el resultado obtenido con HBMCECs cultivadas en presencia de factores angiogénicos (FIG. 18a). Estos resultados muestran que las microvesículas derivadas de glioblastoma juegan un papel en la iniciación de la angiogénesis en las células endoteliales cerebrales.

Además, se analizaron los niveles de proteínas angiogénicas en las microvesículas y se compararon con los niveles en las células de glioblastoma del donante. Usando un arreglo de anticuerpos de la angiogénesis humana, fuimos capaces de detectar 19 proteínas involucradas en la angiogénesis. Específicamente, las proteínas totales tanto de células de glioblastoma primario como de microvesículas purificadas aisladas de dichas células se lisaron en amortiguador de lisis (Promega, Madison, WI, Estados Unidos) y se añadieron al arreglo de anticuerpos de la angiogénesis humana (Panomics, Fremont CA, Estados Unidos) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los arreglos se escanearon y se analizaron con el programa informático Image J. Como se muestra en la FIG. 18b, de las siete de las 19 proteínas angiogénicas que se detectaron fácilmente en las microvesículas, 6 (angiogenina, IL-6, 1L-8, TIMP-I, VEGF y TIMP-2) estaban presentes en niveles más altos sobre una base de proteína total en comparación con las células de glioblastoma (FIG. 18c). Las tres proteínas angiogénicas más enriquecidas en microvesículas en comparación con las células tumorales fueron angiogenina, IL-6 y 1L-8, las que han sido implicadas en la angiogénesis de glioma con niveles más altos asociados con el aumento de la malignidad (25-27).

Además se encontró que las microvesículas aisladas de células de glioblastoma primario promueven la proliferación de una línea celular ^u 87 de glioma humano. En estos estudios, se sembraron 100000 células U87 en pocillos de una placa de 24 pocillos y se dejaron crecer por tres días (DMEM-5%FBS) o DMEM-5%FBS suplementado con 125 |jg de microvesículas aisladas de células de glioblastoma primario. Después de tres días, las células U87 no tratadas (FIG.

19a) se encontraron en menor número como se determinó usando una cámara de Burker, que las suplementadas con microvesículas (FIG. 19b). Ambas células U87 no suplementadas y suplementadas se habían aumentado 5 y 8 veces en número durante este período, respectivamente (FIG. 19c). Así, las microvesículas de glioblastoma parecen estimular la proliferación de otras células de glioma.

Ejemplo 17: Las microvesículas de glioblastoma son absorbidas por HBMVECs.

Para demostrar que las microvesículas de glioblastoma son capaces de ser absorbidas por las células endoteliales microvesiculares del cerebro humano (HBMVEC), las microvesículas de glioblastoma purificadas se marcaron con el kit de marcaje PKH67 fluorescente verde (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Estados Unidos). Las microvesículas marcadas se incubaron con HBMVEC en cultivo (5 jg/50,000 células) por 20 min a 4°C. Las célulad se lavaron e incub aron a 37°C por 1 hora. En 30 minutos las microvesículas marcadas con PKH67 se internalizaron en estructuras similares a endosomas dentro de las HBMVECs (FIG. 17a). Estos resultados muestran que las células endoteliales del cerebro pueden internalizar las microvesículas de glioblastoma.

Se obtuvieron resultados similares cuando se añadieron microvesículas marcadas con fluorescencia a las células de glioblastoma primario.

Ejemplo 18: Los ARNm entregados por las microvesículas de glioblastoma pueden traducirse en las células receptoras.

Para determinar si el ARNm de las microvesículas derivadas de glioblastoma podría entregarse a y expresarse en las células receptoras, se infectaron células de glioblastoma humano primario con un vector lentiviral de autoinactivación que expresa la luciferasa Gaussia (Gluc) secretada usando un promotor de CMV a una eficiencia de infección de >95%. Las células se transdujeron de forma estable y generaron microvesículas durante los pases subsecuentes (se analizaron 2-10 pases). Las microvesículas se aislaron de las células y se purificaron como se describió anteriormente. El análisis de RT- PCR mostró que el ARNm para Gluc (555 bp) así como también el de GAPDH (226 bp) estaban presentes en las microvesículas (FIG. 17b). El nivel de ARNm de Gluc fue aún más alto que el de GAPDH como se evaluó con RT-PCR cuantitativa.

Se añadieron cincuenta microgramos de microvesículas purificadas a 50,000 células HBMVE y se incubaron por 24 horas. La actividad Gluc en el sobrenadante se midió directamente después de la adición de las microvesículas (0 horas), y después de 15 horas y 24 horas. La actividad Gluc en el sobrenadante se normalizó a la actividad de la proteína Gluc asociada con las microvesículas. Los resultados se presentan como la media ± SEM (n=4). Específicamente, la actividad en las células receptoras HBMVE demostró una traducción continua del ARNm de Gluc microvesicular. Así, el ARNm incorporado en las microvesículas tumorales puede entregarse en las células receptoras y generar una proteína funcional.

Los análisis estadísticos en todos los ejemplos se realizaron usando la prueba t de Student.

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Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar un perfil genético de todo el genoma en microvesículas de un sujeto, ayudando así en el diagnóstico, monitoreo y/o evaluación de una enfermedad u otra afección médica en un sujeto, que comprende las etapas de:

(a) aislar una fracción de microvesículas de una muestra biológica del sujeto, en el que la muestra biológica del sujeto es una muestra de fluido corporal, en el que la muestra de fluido corporal es suero u orina;

(b) extraer ácidos nucleicos de la fracción de microvesículas, en donde los ácidos nucleicos extraídos comprenden ARNm; y

(c) detectar el nivel de expresión de los ARNm, detectando así el perfil genético de todo el genoma en las microvesículas;

(d) comparar el perfil genético de todo el genoma detectado en (c) con un perfil genético de todo el genoma derivado de un individuo sano, ayudando así en el diagnóstico, monitoreo y/o evaluación de una enfermedad u otra afección médica en un sujeto.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa (a) comprende procesar una fracción de microvesículas para excluir proteínas, lípidos, restos de células muertas y otros contaminantes.

3. El método de la reivindicación 2, en el que el procesamiento de la fracción de microvesículas comprende el filtrado, preferiblemente en el que el filtrado comprende el filtrado a través de un filtro de 0.8 pm o 0.22 pm.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (a) comprende purificar microvesículas de la fracción de microvesículas usando cromatografía de exclusión por tamaño, centrifugación en gradiente de densidad, centrifugación, centrifugación diferencial, ultracentrifugación, ultrafiltración con nanomembrana, captura inmunoabsorbente, purificación por afinidad, separación microfluídica, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de permeación en gel o cualquier combinación de las mismas.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de detección c) se realiza mediante análisis de microarreglos, PCR, hibridación con sondas específicas de alelo, detección de mutaciones enzimáticas, reacción en cadena de ligadura (LCR), ensayo de ligadura de oligonucleótidos (OLA), análisis heterodúplex de citometría de flujo, escisión química mal apareada, espectrometría de masas, secuenciación de ácidos nucleicos, polimorfismo de conformación monocatenaria (SSCP), electroforesis de gel en gradiente desnaturalizante (DGGE), electroforesis de gel en gradiente de temperatura (TGGE), polimorfismos de fragmentos de restricción, análisis en serie de la expresión génica (SAGE), secuenciación de próxima generación, secuenciación paralela masiva o cualquier combinación de las mismas.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la enfermedad u otra afección médica es cáncer.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el cáncer es melanoma, glioblastoma o cáncer de próstata.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la enfermedad u otra afección médica es el glioblastoma.

Figura 1 a-e

Figura 1 f

Figura 2



Figura 3c

1 2 3 4 5 6 7

Figura 3e



Fi ura 3

Fi ura 3h

Figura 3i

ı 33

Figura 5

Figura 6



miARN

Figura 8

Figura 9

Figura 10

Biopsia de EGFR

Microvesicula de suero de EGFR

Microvesicula de suero de GAPDFI

Figura 11

Figura 12

Figura 13

Figura 14a-d

ı 44

Figura 14g

control de Actina ve control de Actina -ve Actina DNasa Actina -DNasa

Figura 15



Figura 17

Figura 18

Figura 19