KR20120037992A - 핵산 분석 - Google Patents
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Abstract
생물학적 샘플로부터 고품질 핵산을 추출하는 방법이 개시된다. 본원에 기술된 방법에 의해 수득된 추출물은 높은 수율 및 높은 완전성을 특징으로 하여, 추출된 핵산을 고품질 핵산 추출물이 바람직한 다양한 용도, 예를 들어, 의학적 상태에 대한 진단, 예후 또는 치료법 평가에 유용하게 한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 가출원 번호 61,226,025호 및 61,226,106호 (모두 2009년 7월 16일 출원)를 우선권으로 청구하고, 이들 각각은 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 인간 또는 기타 동물 대상체에서의 일반적인 핵산 분석 분야, 특히 생물학적 샘플로부터의, 특히 미세소포(microvesicle)로부터의 고품질 핵산의 획득 및 분석에 관한 것이다.
배경기술
세포에서 쉐딩(shedding)된 소형 미세소포가 "엑소솜(exosome)"으로 공지되어 있다 (문헌 [Thery et al., 2002]). 엑소솜은 직경이 약 30-100 nm인 것으로 보고되어 있고, 정상적인 상태 및 병리학적 상태 양쪽 모두 하에 다수의 상이한 세포 유형으로부터 쉐딩된다 (문헌 [Thery et al., 2002]). 고전적으로, 엑소솜은 후기 엔도솜(endosome) 막의 내향성 함입 및 핀칭 오프(pinching off)로부터 형성된다. 이는 어버이 세포의 세포질의 샘플을 각각 함유하는 소형 지질 이중층 소포들 (직경 ~40-100 nm)이 적재된 다소포체 (MVB)의 형성을 초래한다 (문헌 [Stoorvogel et al., 2002]). MVB와 세포막의 융합은 세포로부터의 이러한 엑소솜들의 방출, 및 혈액, 소변 또는 기타 체액 내로의 이들의 전달을 초래한다.
세포-유래 소포의 또 다른 카테고리는 "쉐딩 미세소포"로 공지되어 있다 (문헌 [Cocucci et al., 2009]). 세포의 형질막의 직접적인 출아(budding off)로부터 형성된 이러한 미세소포들은 엑소솜들보다 크기가 더욱 이질적이고, 엑소솜과 마찬가지로 어버이 세포의 세포질의 샘플을 또한 함유한다. 엑소솜 및 쉐딩 미세소포는 초원심분리 및 초여과 단리 기술을 사용하여 공동으로 단리되고, 따라서 본원에서 미세소포로 총괄적으로 지칭될 것이다.
최근의 연구에서, 미세소포 내의 핵산이 바이오마커(biomarker)로서의 역할이 있는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 스코그(Skog) 등은 GBM 환자 혈청 내의 미세소포로부터 추출된 핵산의 의학적 진단, 예후 및 치료법 평가를 위한 용도를 특히 기술하였다 (문헌 [Skog et al., 2008]). 미세소포로부터 추출된 핵산의 사용은 생검에 대한 요구를 잠재적으로 우회하는 것으로 간주되어, 미세소포 생물학의 막대한 진단 잠재력을 강조한다 (문헌 [Skog et al., 2008]).
핵산 바이오마커의 연구 및 개발, 뿐만 아니라 상업적 용도에서, 일관적이고 신뢰할 수 있는 방식으로 생물학적 샘플로부터 고품질 핵산을 추출하는 것이 바람직하다. 본 발명은 미세소포 및 기타 생물학적 샘플로부터의 고품질 핵산 추출물의 조성물, 이같은 추출물을 제조하는 방법, 및 이러한 고품질 핵산을 다양한 용도에서 사용하는 방법을 제공한다.
발명의 개요
한 측면에서, 본 발명은 18S rRNA 및 28S rRNA가 추출물 내에서 검출가능한, 진핵생물의 생물학적 샘플로부터 단리된 하나 이상의 미세소포로부터의 신규 핵산 추출물이다. 바람직하게는, 신규 추출물 내에서 검출가능한 18S rRNA 대 28S rRNA의 정량적 비율은 약 1:1 내지 약 1:2의 범위 내이고, 바람직하게는 약 1:2이다. 신규 추출물이 수득될 수 있는 생물학적 샘플은, 특히, 임의의 체액, 바람직하게는 소변, 혈청 또는 혈장을 포함하고, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간으로부터의 것이다. 소변과 같이 단백질 농도가 10 ㎎/㎖ 미만인 체액 샘플에 대해, 신규 핵산 추출물은 RNA 완전성 숫자 (RNA Integrity Number) (모든 경우에, 애질런트 바이오애널라이저(Agilent BioAnalyzer) 또는 이의 등가물 상에서 수득됨)가 5 이상인 핵산 추출물을 추가로 포함할 수 있고/있거나, 50 pg/㎖ 이상의 20 ㎖의 생물학적 샘플로부터의 핵산 수율을 추가로 포함할 수 있다. 유사하게, 혈청 또는 혈장과 같이 단백질 농도가 10 ㎎/㎖ 초과인 체액 샘플에 대해, 신규 핵산 추출물은 3 이상의 RNA 완전성 숫자를 추가로 포함할 수 있고/있거나, 50 pg/㎖ 이상의 1 ㎖의 생물학적 샘플로부터의 핵산 수율을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 18S rRNA 및 28S rRNA가 프로파일 내에서 검출가능한, 진핵생물의 생물학적 샘플로부터 단리된 하나 이상의 미세소포로부터의 핵산의 신규 프로파일이다. 바람직하게는, 신규 프로파일 내에서 검출가능한 18S rRNA 대 28S rRNA의 정량적 비율은 약 1:1 내지 약 1:2의 범위 내이고, 바람직하게는 약 1:2이다. 신규 프로파일이 수득될 수 있는 생물학적 샘플은, 특히, 임의의 체액, 바람직하게는 소변, 혈청 또는 혈장을 포함하고, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간으로부터의 것이다. 소변과 같이 단백질 농도가 10 ㎎/㎖ 미만인 체액 샘플에 대해, 신규 프로파일은 5 이상의 RNA 완전성 숫자를 추가로 포함할 수 있고/있거나, 50 pg/㎖ 이상의 20 ㎖의 생물학적 샘플로부터의 핵산 수율을 추가로 포함할 수 있다. 유사하게, 혈청 또는 혈장과 같이 단백질 농도가 10 ㎎/㎖ 초과인 체액 샘플에 대해, 신규 프로파일은 3 이상의 RNA 완전성 숫자를 추가로 포함할 수 있고/있거나, 50 pg/㎖ 이상의 1 ㎖의 생물학적 샘플로부터의 핵산 수율을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 미세소포로부터 RNA를 추출하는 단계; 및 (b) 추출물 내의 18S 및 28S rRNA의 양을 결정함으로써 RNA의 품질을 측정하는 단계를 포함하는, 진핵생물의 생물학적 샘플로부터 단리된 미세소포로부터의 핵산 추출물의 품질을 평가하는 방법이다. 바람직하게는, 신규 방법에서 결정된 18S rRNA 대 28S rRNA의 정량적 비율은 약 1:1 내지 약 1:2의 범위 내이고, 바람직하게는 약 1:2이다. 신규 방법이 수행될 수 있는 생물학적 샘플은, 특히, 임의의 체액, 바람직하게는 소변, 혈청 또는 혈장을 포함하고, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간으로부터의 것이다. 소변과 같이 단백질 농도가 10 ㎎/㎖ 미만인 체액 샘플에 대해, 신규 방법은 RNA 완전성 숫자가 5 이상인 핵산의 추출을 추가로 초래할 수 있고/있거나, 50 pg/㎖ 이상의 20 ㎖의 생물학적 샘플로부터의 핵산 수율을 추가로 초래할 수 있다. 유사하게, 혈청 또는 혈장과 같이 단백질 농도가 10 ㎎/㎖ 초과인 체액 샘플에 대해, 신규 방법은 RNA 완전성 숫자가 3 이상인 핵산의 추출을 추가로 초래할 수 있고/있거나, 50 pg/㎖ 이상의 1 ㎖의 생물학적 샘플로부터의 핵산 수율을 추가로 초래할 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 (a) 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) 생물학적 샘플 상에서 추출 강화 공정을 수행하는 단계; 및 (c) 생물학적 샘플로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플로부터 핵산을 수득하는 방법이다. 추출 강화 공정은 (a) 생물학적 샘플에 하나 이상의 강화제를 첨가하는 것; 또는 (b) 핵산 추출 전에 하나 이상의 강화 단계를 수행하는 것; 또는 (c) 강화제 및 강화 단계의 조합으로 구성된다. 강화제는 (i) RNase 억제제; (ii) 프로테아제(protease); (iii) 환원제; (iv) 합성 RNA와 같은 디코이(decoy) 기질; (v) 가용성 수용체; (vi) 소형 간섭 RNA; (vii) 항-RNA 항체, 샤페론(chaperone) 단백질, 또는 RNase 억제 단백질과 같은 RNA 결합 분자; (ix) 삼투압 농도가 높은 용액 또는 세제와 같은 RNase 변성 물질을 포함할 수 있다. 추출 강화 단계는 (x) 세정; (xi) 샘플로부터 RNase를 크기-분리하는 것; (xii) 온도 감소, 동결/해동 사이클 실행에 의해서와 같이 물리적 변화를 통해 RNase 변성을 달성하는 것을 포함할 수 있다. 신규 방법은 임의의 체액, 바람직하게는 소변, 혈청 또는 혈장을 특히 포함하고, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간으로부터의 것인 생물학적 샘플 상에서 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 유도체가 생물학적 샘플로부터 수득되고, 핵산 추출 전에 추출 강화 공정에 적용된다. 바람직하게는, 유도체는 생물학적 샘플로부터의 미세소포 분획이다. 한 실시양태에서는 미세소포 분획이 여과 농축 기술에 의해 수득되지만, 기타 공지된 단리 기술이 또한 활용될 수 있다. 본 발명의 방법의 추가적인 측면에서, 추출 강화 공정의 수행 전에 유도체가 리보뉴클레아제 (ribonuclease), 데옥시리보뉴클레아제 (deoxyribonuclease), 또는 이들의 조합으로 처리될 수 있다. 일부 측면에서, 추출 강화 공정은 핵산을 추출하기 전에 생물학적 샘플 또는 유도체에 RNase 억제제를 첨가하는 것을 포함한다; 바람직하게는, RNase 억제제의 농도는 1 ㎕ 이상의 샘플에 대해 0.027 AU (1X) 초과이거나, 다르게는 1 ㎕ 이상의 샘플에 대해 0.135 AU (5X) 이상이거나, 다르게는 1 ㎕ 이상의 샘플에 대해 0.27 AU (10X) 이상이거나, 다르게는 1 ㎕ 이상의 샘플에 대해 0.675 AU (25X) 이상이거나, 다르게는 1 ㎕ 이상의 샘플에 대해 1.35 AU (50X) 이상이고, 이때 1X 프로테아제 농도는 0.027 AU 이상의 프로테아제가 1 ㎕ 이상의 체액으로부터 단리된 미세소포를 처리하는데 사용된 효소 조건을 지칭하고, 5X 프로테아제 농도는 0.135 AU 이상의 프로테아제가 1 ㎕ 이상의 체액으로부터 단리된 미세소포를 처리하는데 사용된 효소 조건을 지칭하고, 10X 프로테아제 농도는 0.27 AU 이상의 프로테아제가 1 ㎕ 이상의 체액으로부터 단리된 미세소포를 처리하는데 사용된 효소 조건을 지칭하고; 25X 프로테아제 농도는 0.675 AU 이상의 프로테아제가 1 ㎕ 이상의 체액으로부터 단리된 미세소포를 처리하는데 사용된 효소 조건을 지칭하며, 50X 프로테아제 농도는 1.35 AU 이상의 프로테아제가 1 ㎕ 이상의 체액으로부터 단리된 미세소포를 처리하는데 사용된 효소 조건을 지칭한다. 바람직하게는, RNase 억제제는 프로테아제이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 (a) 핵산 추출 강화제; (b) DNase, RNase, 또는 둘 다; 및 (c) 용해 완충제를 하나 이상의 용기 내에 포함하는, 미세소포로부터 핵산을 수득하기 위한 신규 키트이다. 신규 키트는 키트를 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 신규 키트에서, 핵산 추출 강화제는 (a) RNase 억제제; (b) 프로테아제; (c) 환원제; (d) 디코이 기질; (e) 가용성 수용체; (f) 소형 간섭 RNA; (g) RNA 결합 분자; (h) RNase 변성 물질; 또는 (i) 상기 작용제들 중 임의의 것의 임의의 조합을 혼합물로서 또는 개별적으로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 미세소포의 샘플을 수득하는 단계; (b) 샘플을 DNase로 처리하여 샘플 내의 미세소포의 외부 또는 표면에 위치하는 임의의 DNA를 모두 또는 실질적으로 모두 제거하는 단계; (c) 샘플로부터 RNA를 추출하는 단계; 및 (d) 추출된 RNA를 분석하는 단계를 포함하는, 미세소포로부터의 RNA를 분석하는 신규 방법이다. 신규 방법은 임의의 체액, 바람직하게는 소변, 혈청 또는 혈장을 특히 포함하고, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간으로부터의 것인 생물학적 샘플 상에서 수행될 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 (a) 대상체로부터의 소변 샘플로부터 미세소포 분획을 단리하는 단계; (b) 미세소포 분획 내의 바이오마커의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하고, 이때 바이오마커가 (i) 핵산의 종, (ii) 핵산의 발현 수준, (iii) 핵산 변이체, 및 (iv) 상기의 것들 중 임의의 것의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, 바이오마커가 질환 또는 기타 의학적 상태의 존재 또는 부재, 또는 치료 선택권의 가능성과 관련되는, 대상체를 진단, 모니터링 또는 치료하는 신규 방법이다. 일부 측면에서, 바이오마커는 mRNA 전사물이다; 예를 들어, mRNA 전사물은 NPHS2 (포도신(podocin)), LGALS1 (갈렉틴(Galectin)-1), HSPG2 (헤파린 술페이트 프로테오글리칸); CUBN (큐빌린(cubilin)), LRP2 (메갈린(megalin)), AQP1 (아쿠아포린(aquaporin) 1), CA4 (탄산 탈수효소 4), CLCN5 (클로라이드 채널 단백질 5), BDKRB1 (브라디키닌(bradykinin) B1 수용체), CALCR (칼시토닌(calcitonin) 수용체), SCNN1D (아밀로라이드-민감성 나트륨 채널 서브유닛 델타), SLC12A3 (티아지드-민감성 나트륨-클로라이드 공동수송체), AQP2 (아쿠아포린 2), ATP6V1B1 (V-ATPase B1 서브유닛), SLC12A1 (리보앰프화(RiboAmped) mRNA의 RT-PCR을 통한 신장-특이적 Na-K-Cl 심포터(symporter))로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다; 더욱 바람직하게는, mRNA 전사물은 AQP2 (아쿠아포린 2) 또는 ATP6V1B1 (V-ATPase B1 서브유닛)이다. 신규 방법의 추가적인 측면에서, 바이오마커, 및 질환 또는 기타 의학적 상태는 (a) NPHS2 (포도신) 및 사구체 질환, 예컨대 스테로이드-저항성 신염 증후군; (b) CUBN (큐빌린), 및 이머스룬트-그래스베크(Imerslund-Graesbeck) 증후군과 같은 단백뇨; 및 (c) AQP2 (아쿠아포린 2), 및 요붕증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 1-29로 구성된 군으로부터 선택된 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 90％ 이상 동일한 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자; 서열 1-29로부터 선택된 뉴클레오티드 서열의 절편을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 또는 서열 1-29 중 임의의 서열 내의 임의의 13-뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 13개 이상의 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 특히, 상기 폴리뉴클레오티드 분자들은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드일 수 있다. 다른 측면에서, 본 발명은 상기 단리된 핵산 분자들 중 임의의 것을 포함하는 벡터이다. 추가적인 측면에서, 본 발명은 상기 벡터들 중 임의의 것 또는 상기 단리된 핵산 분자들 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 (a) 생물학적 샘플을 제공하는 단계; (b) 생물학적 샘플로부터 핵산의 추출물을 수득하는 단계; (c) 추출물 내의 서열 1-29로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 절편을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자의 양을 측정하는 단계; 및 (d) 폴리뉴클레오티드 분자의 양을 표준과 비교하여 핵산 추출물의 품질을 평가하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플로부터의 핵산 추출물의 품질을 평가하는 신규 방법이다. 신규 방법은 바람직하게는 포유동물 예컨대 인간으로부터의 것인 임의의 생물학적 샘플, 예를 들어, 체액, 특히 소변, 혈청 또는 혈장 상에서 수행될 수 있다. 이러한 신규 방법은 상기 신규 핵산 추출물 또는 신규 추출 방법 중 임의의 것과 함께 사용될 수 있다. 특히, 핵산 추출물의 품질을 평가하는데 사용되는 표준은 5개를 초과하는 생물학적 샘플로부터의 핵산 추출물 내의 서열 1-29로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 절편을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자의 양을 측정하는 것에 의해 유래될 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1의 프레임 a 내지 f는 소변 다소포체의 전자 현미경 사진이다. 네프론 및 집합관의 다양한 영역에서 다소포체 (MVB)가 확인될 수 있다 (화살표 참조). Podo - 발세포, PT - 근위 세관, TDL - 가는 하행각, TAL - 굵은 상행각, CD-PC - 집합관 주세포, CD-IC - 집합관 개재 세포. 눈금 막대 = a, c, d, e, f에 대해서는 200 nm; b에 대해서는 500 nm.
도 2는 단리된 소변 미세소포의 전자 현미경 사진이다. 분별 초원심분리를 통해 단리되고, 포스포텅스텐산을 염료로 사용하여 TEM을 통해 영상화된 인간 소변 미세소포. 눈금 막대 = 200 nm.
도 3은 100 kDa MWCO 필터의 방법으로 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. 애질런트 바이오애널라이저가 도표를 생성시키는데 사용되었다.
도 4는 초원심분리의 방법으로 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. 애질런트 바이오애널라이저가 도표를 생성시키는데 사용되었다.
도 5는 각각의 경우에 초원심분리가 이어지는, x300g 스핀, x17,000g 스핀 및 0.8 ㎛ 여과의 3단계 예비-프로세싱 방법 (A) 또는 0.8 ㎛ 여과 단독의 1단계 예비-프로세싱 방법 (B)으로 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. 애질런트 바이오애널라이저가 도표를 생성시키는데 사용되었다.
도 6은 각각의 경우에 여과 농축이 이어지는, x300g 스핀, x17,000g 스핀 및 0.8 ㎛ 여과의 3단계 예비-프로세싱 방법 (A) 또는 0.8 ㎛ 여과 단독의 1단계 예비-프로세싱 방법 (B)으로 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. 애질런트 바이오애널라이저가 도표를 생성시키는데 사용되었다.
도 7은 추출 강화 공정이 있는, 소변으로부터 핵산을 추출하는 신규 방법을 도해하는 순서도이다.
도 8은 5X 대 10X 농축 프로테아제를 사용하는 방법으로 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. 20 ㎖ 소변 샘플로부터 여과 농축기를 통해 미세소포가 단리되었다. 도표 A는 5X 프로테아제로 수득된 프로파일을 나타낸다. 도표 B는 10X 프로테아제로 수득된 프로파일을 나타낸다. 1X 프로테아제 농도는 0.027 AU 이상의 프로테아제가 1 ㎕ 이상의 체액으로부터 단리된 미세소포를 처리하는데 사용된 효소 조건을 지칭한다. 5X 프로테아제 농도는 0.135 AU 이상의 프로테아제가 1 ㎕ 이상의 체액으로부터 단리된 미세소포를 처리하는데 사용된 효소 조건을 지칭한다. 1 mAU는 분 당 1 μmol 타이로신에 상응하는 폴린-양성 아미노산 및 펩티드를 방출하는 프로테아제 활성이다.
도 9는 25X 대 50X 농축 프로테아제를 사용하는 방법으로 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. 40 ㎖ 소변 샘플로부터 여과 농축기를 통해 미세소포가 단리되었다. 도표 A는 25X 프로테아제로 수득된 프로파일을 나타낸다. 도표 B는 50X 프로테아제로 수득된 프로파일을 나타낸다. 1X 프로테아제는 0.027 AU를 지칭한다. 1 mAU는 분 당 1 μmol 타이로신에 상응하는 폴린-양성 아미노산 및 펩티드를 방출하는 프로테아제 활성이다.
도 10은 흑색종 혈청인 샘플 1의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인(Superase-In) (앰비온 인코포레이티드(Ambion, Inc))을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 1.6 유닛이다.
도 11은 흑색종 혈청인 샘플 2의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 1.6 유닛이다.
도 12는 흑색종 혈청인 샘플 3의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 1.6 유닛이다.
도 13은 흑색종 혈청인 샘플 4의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 1.6 유닛이다.
도 14는 흑색종 혈청인 샘플 5의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 3.2 유닛이다.
도 15는 흑색종 혈청인 샘플 6의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 3.2 유닛이다.
도 16은 정상 혈청인 샘플 7의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 1.6 유닛이다.
도 17은 정상 혈청인 샘플 8의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 1.6 유닛이다.
도 18은 정상 혈청인 샘플 9의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 1.6 유닛이다.
도 19는 정상 혈청인 샘플 10의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 1.6 유닛이다.
도 20은 정상 혈청인 샘플 11의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 3.2 유닛이다.
도 21은 정상 혈청인 샘플 12의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 3.2 유닛이다.
도 22는 추출 강화 공정을 사용하여 생물학적 샘플로부터 핵산을 추출하는 신규 방법을 도해하는 순서도이다.
도 23은 DNase 처리가 있는 방법 또는 DNase 처리가 없는 방법으로 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. 미세소포 내부에 위치하지 않은 DNA가 용해 및 핵산 추출 전에 소변 샘플로부터 단리된 미세소포 펠릿의 DNase 소화에 의해 제거되었다. a - 알엔이지 마이크로 키트(RNeasy Micro Kit)를 사용한 DNase 소화가 없는 프로파일. b - 알엔이지 마이크로 키트를 사용한 DNase 소화가 있는 프로파일. c - 미르바나 키트(MirVana Kit)를 사용한 DNase 소화가 없는 프로파일. d - 미르바나 키트를 사용한 DNase 소화가 있는 프로파일. 화살표로 지시된 소형 RNA 피크 높이 및 면적에서의 변화를 주지한다. d는 페놀/클로로포름 기반 추출 후에 샘플 내로 약간의 DNA가 넘겨지는 것을 시사한다.
도 24는 DNase 처리가 있는 방법 또는 DNase 처리가 없는 방법으로 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. 미세소포 내부에 위치하지 않은 DNA가 용해 및 핵산 추출 전에 소변 샘플로부터 단리된 미세소포 펠릿의 DNase 소화에 의해 제거되었다. a - DNase 소화가 없는 프로파일. b - DNase 소화가 있는 프로파일. c - 혈청-유래 미세소포와 공동-단리될 수 있는 "세포자멸사체"-유사 래더(ladder)를 나타내는 슈도(pseudo) 젤.
도 25는 RNase 처리가 있는 방법 또는 RNase 처리가 없는 방법으로 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. 미세소포 내부에 위치하지 않은 RNA가 용해 및 핵산 추출 전에 소변 샘플로부터 단리된 미세소포 펠릿의 RNase 소화에 의해 제거되었다. A - RNase 소화가 없는 프로파일. B - RNase 소화가 있는 프로파일.
도 26은 소변 미세소포 및 래트 신장 조직으로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. A - 래트 신장 조직으로부터의 프로파일. B - 소변 미세소포로부터의 프로파일.
도 27은 소형 RNA 추출을 강화할 수 있는 방법을 사용하여 소변 미세소포 및 래트 신장 조직으로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. A - 래트 신장 조직으로부터의 프로파일. B - 소변 미세소포로부터의 프로파일.
도 28은 DNase 처리와 함께 또는 DNase 처리 없이, 미세소포를 제외한 전체 소변으로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다 (본 발명의 단리 기술에 의해 포획되지 않음). A - DNase 처리 없이 전체 소변으로부터 단리된 핵산. B - DNase 처리와 함께 전체 소변으로부터 단리된 핵산.
도 29는 소변 미세소포로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. A - DNase 처리 없이 소변 미세소포로부터 단리된 핵산. B - DNase 처리와 함께 미세소포로부터 단리된 핵산.
도 30은 300g 스핀 동안 형성된 펠릿으로부터 추출된 핵산으로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. A - DNase 처리 없이 300g 스핀 펠릿으로부터 단리된 핵산. B - DNase 처리와 함께 300g 스핀 펠릿으로부터 단리된 핵산.
도 31은 17,000g 스핀 동안 형성된 펠릿으로부터 추출된 핵산으로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. A - DNase 처리가 없는 17,000g 스핀 펠릿으로부터의 핵산 프로파일. B - DNase 처리가 있는 17,000g 펠릿으로부터의 핵산 프로파일.
도 32는 미세소포내 RNase 소화와 함께 또는 미세소포내 RNase 소화 없이, 미세소포 용해 전에 외부에서 RNase 및 DNase 소화가 진행된 미세소포로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. A - 미세소포내 RNase 소화가 없는 핵산 프로파일. B - 미세소포내 RNase 소화가 있는 핵산 프로파일.
도 33은 미세소포내 DNase 소화와 함께 또는 미세소포내 DNase 소화 없이, 미세소포 용해 및 미세소포내 RNase 소화 전에 외부에서 RNase 및 DNase 소화가 진행된 미세소포로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. A - 미세소포내 DNase 소화가 없는 핵산 프로파일. B - 미세소포내 DNase 소화가 있는 핵산 프로파일. 도표 B에서, 20s 직후의 피크가 도표 A에서의 필적하는 피크와 비교하여 감소된다. 이러한 감소는 소량의 DNase 소화성 물질이 엑소솜 내에 존재한다는 것을 시사한다.
도 34 A)는 RT-PCR에 의한 소변 미세소포 내의 베타-액틴 및 GAPDH에 대한 리보앰프(RiboAmp) 증폭 mRNA 전사물이 양성으로 확인되는, 바이오애널라이저에 의해 생성된 '슈도 젤' 프로파일이다; B)는 6개의 기능적으로 별개인 영역을 강조하는, 네프론 및 집합관의 삽화이다. 1. 사구체; 2. 근위 세관; 3. 가는 하행각; 4. 수질 굵은 상행각; 5. 원위 곱슬 세관; 6. 집합관.
도 35는 소변 미세소포로부터 리보앰프화 mRNA의 RT-PCR에 의해 검출된 네프론 및 집합관의 영역 1 및 2로부터의 특이적 유전자를 코딩하는 mRNA 전사물들이 확인되는, 바이오애널라이저에 의해 생성된 슈도 젤 프로파일을 나타내고, 구체적으로는 하기와 같다: 1. 사구체: NPHS2 - 포도신, LGALS1 - 갈렉틴-1, HSPG2 - 헤파린 술페이트 프로테오글리칸 2. 근위 세관: CUBN - 큐빌린, LRP2 - 메갈린, AQP1 - 아쿠아포린 1, CA4 - 탄산 탈수효소 4, CLCN5 - 클로라이드 채널 단백질 5.
도 36은 소변 미세소포로부터 리보앰프화 mRNA의 RT-PCR에 의해 검출된 네프론 및 집합관의 영역 3-6으로부터의 특이적 유전자를 코딩하는 mRNA 전사물들이 확인되는, 바이오애널라이저에 의해 생성된 슈도 젤 프로파일을 나타내고, 구체적으로는 하기와 같다: 3. 가는 하행각: BDKRB1 - 브라디키닌 B1 수용체. 4. 수질 굵은 상행각: CALCR - 칼시토닌 수용체, SCNN1D - 아밀로라이드-민감성 나트륨 채널 서브유닛 델타. 5. 원위 곱슬 세관: SLC12A3 - 티아지드-민감성 나트륨-클로라이드 공동수송체. 6. 집합관: AQP2 - 아쿠아포린 2, ATP6V1B1 - vATPase B1 서브유닛, SLC12A1 - 신장-특이적 Na-K-Cl 심포터.
도 37 A)는 V-ATPase B1 KO (B1 -/-) 및 야생형 (B1 +/+) 마우스에서의 RT-PCR에 의한 V-ATPase B1 서브유닛 및 AQP2 mRNA의 발현을 도해하는 한 쌍의 바이오애널라이저 슈도 젤이다; B)는 실시간 PCR 분석에 의한 V-ATPase B1 KO (B1 -/-) 및 야생형 (B1 +/+) 마우스로부터의 소변 미세소포 및 신장 세포 내의 V-ATPase B2 서브유닛의 발현을 도해하는 한 쌍의 차트이다. "NS" - 통계적으로 유의하지 않음.
도 38은 소변 미세소포로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 3개의 도표이다. 미세소포 막이 핵산 추출을 위해 파괴되기 전에, 소변 미세소포가 어떠한 추출 강화제로도 세정 또는 처리되지 않았다. 3개의 샘플이 이러한 추출 군에서 사용되었다. 프로파일이 A, B 및 C에서 각각 제시된다.
도 39는 소변 미세소포로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 3개의 도표이다. 미세소포 막이 핵산 추출을 위해 파괴되기 전에, 소변 미세소포가 세정되지 않았지만, RNase 억제제인 RNase-In (프로메가(Promega))으로 처리되었다. 3개의 샘플이 이러한 추출 군에서 사용되었다. 프로파일이 A, B 및 C에서 각각 제시된다.
도 40은 소변 미세소포로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 3개의 도표이다. 미세소포 막이 핵산 추출을 위해 파괴되기 전에, 소변 미세소포가 세정되었지만 어떠한 RNase 억제제로도 처리되지 않았다. 3개의 샘플이 이러한 추출 군에서 사용되었다. 프로파일이 A, B 및 C에서 각각 제시된다.
도 41은 소변 미세소포로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 3개의 도표이다. 미세소포 막이 핵산 추출을 위해 파괴되기 전에, 소변 미세소포가 세정되었고 RNase 억제제로 처리되었다. 3개의 샘플이 이러한 추출 군에서 사용되었다. 프로파일이 A, B 및 C에서 각각 제시된다.
도 42는 소변 미세소포로부터 단리된 RNA의 딥 시퀀싱(deep sequencing) 분석에서 500을 초과하는 전사물 히트(hit) ("스파이크(spike)")가 있는 염색체 영역의 목록이다. 숫자는 각각의 염색체 영역의 시작점 및 종점을 지시한다. 예를 들어, "chr1.-1.91625366.91625741"은 뉴클레오티드 번호 91625366과 91625741 사이의 인간 염색체 1 상의 영역을 지칭한다. 상응하는 서열 번호가 또한 지시된다.
도 43은 지시된 바와 같은 10개의 염색체 영역 내의 서열을 증폭시키기 위해 PCR 반응에 사용된 프라이머의 목록이다. 예를 들어, "chr1.-1.91625366.91625741"은 뉴클레오티드 번호 91625366과 91625741 사이의 인간 염색체 1 상의 영역을 지칭한다. 이러한 영역을 증폭시키는데 사용된 프라이머 쌍은 "tccagctcacgttccctatt 1L 및 ccaggtggggagtttgact 1R"이었다. 프라이머는 왼쪽에서 오른쪽으로 5' → 3'이다.
도 44는 10개의 스파이크-풍부 염색체 영역의 PCR 증폭 결과를 도해하는 한 쌍의 바이오애널라이저 슈도 젤이다. 각각의 프레임의 상부의 레인의 번호매김은 도 43에 제시된 염색체 영역의 번호매김에 상응한다. A에서는, 소변 미세소포로부터의 핵산 추출물이 PCR용 주형으로 사용되었다. B에서는, 신장 조직으로부터의 핵산 추출물이 PCR용 주형으로 사용되었다.
도 45-73은 29개의 염색체 영역에서의 스파이크를 도해하는 도표이다. 각각의 도표의 상부에 영역이 지시된다. 예를 들어, 도 46의 도표는 뉴클레오티드 번호 91625366과 91625741 사이의 인간 염색체 1 상의 영역인 "chr1.-1.91625366.91625741"의 영역을 지칭한다.
도 1의 프레임 a 내지 f는 소변 다소포체의 전자 현미경 사진이다. 네프론 및 집합관의 다양한 영역에서 다소포체 (MVB)가 확인될 수 있다 (화살표 참조). Podo - 발세포, PT - 근위 세관, TDL - 가는 하행각, TAL - 굵은 상행각, CD-PC - 집합관 주세포, CD-IC - 집합관 개재 세포. 눈금 막대 = a, c, d, e, f에 대해서는 200 nm; b에 대해서는 500 nm.
도 2는 단리된 소변 미세소포의 전자 현미경 사진이다. 분별 초원심분리를 통해 단리되고, 포스포텅스텐산을 염료로 사용하여 TEM을 통해 영상화된 인간 소변 미세소포. 눈금 막대 = 200 nm.
도 3은 100 kDa MWCO 필터의 방법으로 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. 애질런트 바이오애널라이저가 도표를 생성시키는데 사용되었다.
도 4는 초원심분리의 방법으로 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. 애질런트 바이오애널라이저가 도표를 생성시키는데 사용되었다.
도 5는 각각의 경우에 초원심분리가 이어지는, x300g 스핀, x17,000g 스핀 및 0.8 ㎛ 여과의 3단계 예비-프로세싱 방법 (A) 또는 0.8 ㎛ 여과 단독의 1단계 예비-프로세싱 방법 (B)으로 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. 애질런트 바이오애널라이저가 도표를 생성시키는데 사용되었다.
도 6은 각각의 경우에 여과 농축이 이어지는, x300g 스핀, x17,000g 스핀 및 0.8 ㎛ 여과의 3단계 예비-프로세싱 방법 (A) 또는 0.8 ㎛ 여과 단독의 1단계 예비-프로세싱 방법 (B)으로 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. 애질런트 바이오애널라이저가 도표를 생성시키는데 사용되었다.
도 7은 추출 강화 공정이 있는, 소변으로부터 핵산을 추출하는 신규 방법을 도해하는 순서도이다.
도 8은 5X 대 10X 농축 프로테아제를 사용하는 방법으로 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. 20 ㎖ 소변 샘플로부터 여과 농축기를 통해 미세소포가 단리되었다. 도표 A는 5X 프로테아제로 수득된 프로파일을 나타낸다. 도표 B는 10X 프로테아제로 수득된 프로파일을 나타낸다. 1X 프로테아제 농도는 0.027 AU 이상의 프로테아제가 1 ㎕ 이상의 체액으로부터 단리된 미세소포를 처리하는데 사용된 효소 조건을 지칭한다. 5X 프로테아제 농도는 0.135 AU 이상의 프로테아제가 1 ㎕ 이상의 체액으로부터 단리된 미세소포를 처리하는데 사용된 효소 조건을 지칭한다. 1 mAU는 분 당 1 μmol 타이로신에 상응하는 폴린-양성 아미노산 및 펩티드를 방출하는 프로테아제 활성이다.
도 9는 25X 대 50X 농축 프로테아제를 사용하는 방법으로 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. 40 ㎖ 소변 샘플로부터 여과 농축기를 통해 미세소포가 단리되었다. 도표 A는 25X 프로테아제로 수득된 프로파일을 나타낸다. 도표 B는 50X 프로테아제로 수득된 프로파일을 나타낸다. 1X 프로테아제는 0.027 AU를 지칭한다. 1 mAU는 분 당 1 μmol 타이로신에 상응하는 폴린-양성 아미노산 및 펩티드를 방출하는 프로테아제 활성이다.
도 10은 흑색종 혈청인 샘플 1의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인(Superase-In) (앰비온 인코포레이티드(Ambion, Inc))을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 1.6 유닛이다.
도 11은 흑색종 혈청인 샘플 2의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 1.6 유닛이다.
도 12는 흑색종 혈청인 샘플 3의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 1.6 유닛이다.
도 13은 흑색종 혈청인 샘플 4의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 1.6 유닛이다.
도 14는 흑색종 혈청인 샘플 5의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 3.2 유닛이다.
도 15는 흑색종 혈청인 샘플 6의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 3.2 유닛이다.
도 16은 정상 혈청인 샘플 7의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 1.6 유닛이다.
도 17은 정상 혈청인 샘플 8의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 1.6 유닛이다.
도 18은 정상 혈청인 샘플 9의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 1.6 유닛이다.
도 19는 정상 혈청인 샘플 10의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 1.6 유닛이다.
도 20은 정상 혈청인 샘플 11의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 3.2 유닛이다.
도 21은 정상 혈청인 샘플 12의 RNA 프로파일을 도해하는 도표이다. RNase 억제제인 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드)을 사용하는 방법으로 1 ㎖ 혈청으로부터 RNA가 추출되었다. RNase 억제제의 최종 농도는 미세소포 현탁액 완충제 1 ㎕ 당 3.2 유닛이다.
도 22는 추출 강화 공정을 사용하여 생물학적 샘플로부터 핵산을 추출하는 신규 방법을 도해하는 순서도이다.
도 23은 DNase 처리가 있는 방법 또는 DNase 처리가 없는 방법으로 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. 미세소포 내부에 위치하지 않은 DNA가 용해 및 핵산 추출 전에 소변 샘플로부터 단리된 미세소포 펠릿의 DNase 소화에 의해 제거되었다. a - 알엔이지 마이크로 키트(RNeasy Micro Kit)를 사용한 DNase 소화가 없는 프로파일. b - 알엔이지 마이크로 키트를 사용한 DNase 소화가 있는 프로파일. c - 미르바나 키트(MirVana Kit)를 사용한 DNase 소화가 없는 프로파일. d - 미르바나 키트를 사용한 DNase 소화가 있는 프로파일. 화살표로 지시된 소형 RNA 피크 높이 및 면적에서의 변화를 주지한다. d는 페놀/클로로포름 기반 추출 후에 샘플 내로 약간의 DNA가 넘겨지는 것을 시사한다.
도 24는 DNase 처리가 있는 방법 또는 DNase 처리가 없는 방법으로 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. 미세소포 내부에 위치하지 않은 DNA가 용해 및 핵산 추출 전에 소변 샘플로부터 단리된 미세소포 펠릿의 DNase 소화에 의해 제거되었다. a - DNase 소화가 없는 프로파일. b - DNase 소화가 있는 프로파일. c - 혈청-유래 미세소포와 공동-단리될 수 있는 "세포자멸사체"-유사 래더(ladder)를 나타내는 슈도(pseudo) 젤.
도 25는 RNase 처리가 있는 방법 또는 RNase 처리가 없는 방법으로 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. 미세소포 내부에 위치하지 않은 RNA가 용해 및 핵산 추출 전에 소변 샘플로부터 단리된 미세소포 펠릿의 RNase 소화에 의해 제거되었다. A - RNase 소화가 없는 프로파일. B - RNase 소화가 있는 프로파일.
도 26은 소변 미세소포 및 래트 신장 조직으로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. A - 래트 신장 조직으로부터의 프로파일. B - 소변 미세소포로부터의 프로파일.
도 27은 소형 RNA 추출을 강화할 수 있는 방법을 사용하여 소변 미세소포 및 래트 신장 조직으로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. A - 래트 신장 조직으로부터의 프로파일. B - 소변 미세소포로부터의 프로파일.
도 28은 DNase 처리와 함께 또는 DNase 처리 없이, 미세소포를 제외한 전체 소변으로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다 (본 발명의 단리 기술에 의해 포획되지 않음). A - DNase 처리 없이 전체 소변으로부터 단리된 핵산. B - DNase 처리와 함께 전체 소변으로부터 단리된 핵산.
도 29는 소변 미세소포로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. A - DNase 처리 없이 소변 미세소포로부터 단리된 핵산. B - DNase 처리와 함께 미세소포로부터 단리된 핵산.
도 30은 300g 스핀 동안 형성된 펠릿으로부터 추출된 핵산으로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. A - DNase 처리 없이 300g 스핀 펠릿으로부터 단리된 핵산. B - DNase 처리와 함께 300g 스핀 펠릿으로부터 단리된 핵산.
도 31은 17,000g 스핀 동안 형성된 펠릿으로부터 추출된 핵산으로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. A - DNase 처리가 없는 17,000g 스핀 펠릿으로부터의 핵산 프로파일. B - DNase 처리가 있는 17,000g 펠릿으로부터의 핵산 프로파일.
도 32는 미세소포내 RNase 소화와 함께 또는 미세소포내 RNase 소화 없이, 미세소포 용해 전에 외부에서 RNase 및 DNase 소화가 진행된 미세소포로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. A - 미세소포내 RNase 소화가 없는 핵산 프로파일. B - 미세소포내 RNase 소화가 있는 핵산 프로파일.
도 33은 미세소포내 DNase 소화와 함께 또는 미세소포내 DNase 소화 없이, 미세소포 용해 및 미세소포내 RNase 소화 전에 외부에서 RNase 및 DNase 소화가 진행된 미세소포로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 한 쌍의 도표이다. A - 미세소포내 DNase 소화가 없는 핵산 프로파일. B - 미세소포내 DNase 소화가 있는 핵산 프로파일. 도표 B에서, 20s 직후의 피크가 도표 A에서의 필적하는 피크와 비교하여 감소된다. 이러한 감소는 소량의 DNase 소화성 물질이 엑소솜 내에 존재한다는 것을 시사한다.
도 34 A)는 RT-PCR에 의한 소변 미세소포 내의 베타-액틴 및 GAPDH에 대한 리보앰프(RiboAmp) 증폭 mRNA 전사물이 양성으로 확인되는, 바이오애널라이저에 의해 생성된 '슈도 젤' 프로파일이다; B)는 6개의 기능적으로 별개인 영역을 강조하는, 네프론 및 집합관의 삽화이다. 1. 사구체; 2. 근위 세관; 3. 가는 하행각; 4. 수질 굵은 상행각; 5. 원위 곱슬 세관; 6. 집합관.
도 35는 소변 미세소포로부터 리보앰프화 mRNA의 RT-PCR에 의해 검출된 네프론 및 집합관의 영역 1 및 2로부터의 특이적 유전자를 코딩하는 mRNA 전사물들이 확인되는, 바이오애널라이저에 의해 생성된 슈도 젤 프로파일을 나타내고, 구체적으로는 하기와 같다: 1. 사구체: NPHS2 - 포도신, LGALS1 - 갈렉틴-1, HSPG2 - 헤파린 술페이트 프로테오글리칸 2. 근위 세관: CUBN - 큐빌린, LRP2 - 메갈린, AQP1 - 아쿠아포린 1, CA4 - 탄산 탈수효소 4, CLCN5 - 클로라이드 채널 단백질 5.
도 36은 소변 미세소포로부터 리보앰프화 mRNA의 RT-PCR에 의해 검출된 네프론 및 집합관의 영역 3-6으로부터의 특이적 유전자를 코딩하는 mRNA 전사물들이 확인되는, 바이오애널라이저에 의해 생성된 슈도 젤 프로파일을 나타내고, 구체적으로는 하기와 같다: 3. 가는 하행각: BDKRB1 - 브라디키닌 B1 수용체. 4. 수질 굵은 상행각: CALCR - 칼시토닌 수용체, SCNN1D - 아밀로라이드-민감성 나트륨 채널 서브유닛 델타. 5. 원위 곱슬 세관: SLC12A3 - 티아지드-민감성 나트륨-클로라이드 공동수송체. 6. 집합관: AQP2 - 아쿠아포린 2, ATP6V1B1 - vATPase B1 서브유닛, SLC12A1 - 신장-특이적 Na-K-Cl 심포터.
도 37 A)는 V-ATPase B1 KO (B1 -/-) 및 야생형 (B1 +/+) 마우스에서의 RT-PCR에 의한 V-ATPase B1 서브유닛 및 AQP2 mRNA의 발현을 도해하는 한 쌍의 바이오애널라이저 슈도 젤이다; B)는 실시간 PCR 분석에 의한 V-ATPase B1 KO (B1 -/-) 및 야생형 (B1 +/+) 마우스로부터의 소변 미세소포 및 신장 세포 내의 V-ATPase B2 서브유닛의 발현을 도해하는 한 쌍의 차트이다. "NS" - 통계적으로 유의하지 않음.
도 38은 소변 미세소포로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 3개의 도표이다. 미세소포 막이 핵산 추출을 위해 파괴되기 전에, 소변 미세소포가 어떠한 추출 강화제로도 세정 또는 처리되지 않았다. 3개의 샘플이 이러한 추출 군에서 사용되었다. 프로파일이 A, B 및 C에서 각각 제시된다.
도 39는 소변 미세소포로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 3개의 도표이다. 미세소포 막이 핵산 추출을 위해 파괴되기 전에, 소변 미세소포가 세정되지 않았지만, RNase 억제제인 RNase-In (프로메가(Promega))으로 처리되었다. 3개의 샘플이 이러한 추출 군에서 사용되었다. 프로파일이 A, B 및 C에서 각각 제시된다.
도 40은 소변 미세소포로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 3개의 도표이다. 미세소포 막이 핵산 추출을 위해 파괴되기 전에, 소변 미세소포가 세정되었지만 어떠한 RNase 억제제로도 처리되지 않았다. 3개의 샘플이 이러한 추출 군에서 사용되었다. 프로파일이 A, B 및 C에서 각각 제시된다.
도 41은 소변 미세소포로부터 생성된 RNA 프로파일을 도해하는 3개의 도표이다. 미세소포 막이 핵산 추출을 위해 파괴되기 전에, 소변 미세소포가 세정되었고 RNase 억제제로 처리되었다. 3개의 샘플이 이러한 추출 군에서 사용되었다. 프로파일이 A, B 및 C에서 각각 제시된다.
도 42는 소변 미세소포로부터 단리된 RNA의 딥 시퀀싱(deep sequencing) 분석에서 500을 초과하는 전사물 히트(hit) ("스파이크(spike)")가 있는 염색체 영역의 목록이다. 숫자는 각각의 염색체 영역의 시작점 및 종점을 지시한다. 예를 들어, "chr1.-1.91625366.91625741"은 뉴클레오티드 번호 91625366과 91625741 사이의 인간 염색체 1 상의 영역을 지칭한다. 상응하는 서열 번호가 또한 지시된다.
도 43은 지시된 바와 같은 10개의 염색체 영역 내의 서열을 증폭시키기 위해 PCR 반응에 사용된 프라이머의 목록이다. 예를 들어, "chr1.-1.91625366.91625741"은 뉴클레오티드 번호 91625366과 91625741 사이의 인간 염색체 1 상의 영역을 지칭한다. 이러한 영역을 증폭시키는데 사용된 프라이머 쌍은 "tccagctcacgttccctatt 1L 및 ccaggtggggagtttgact 1R"이었다. 프라이머는 왼쪽에서 오른쪽으로 5' → 3'이다.
도 44는 10개의 스파이크-풍부 염색체 영역의 PCR 증폭 결과를 도해하는 한 쌍의 바이오애널라이저 슈도 젤이다. 각각의 프레임의 상부의 레인의 번호매김은 도 43에 제시된 염색체 영역의 번호매김에 상응한다. A에서는, 소변 미세소포로부터의 핵산 추출물이 PCR용 주형으로 사용되었다. B에서는, 신장 조직으로부터의 핵산 추출물이 PCR용 주형으로 사용되었다.
도 45-73은 29개의 염색체 영역에서의 스파이크를 도해하는 도표이다. 각각의 도표의 상부에 영역이 지시된다. 예를 들어, 도 46의 도표는 뉴클레오티드 번호 91625366과 91625741 사이의 인간 염색체 1 상의 영역인 "chr1.-1.91625366.91625741"의 영역을 지칭한다.
상세한 설명
미세소포는 세포의 외부로 진핵생물 세포에 의해 쉐딩되거나 또는 형질막으로부터 출아된다. 직경이 약 10 nm 내지 약 5000 nm 범위이면서 이러한 막 소포는 크기가 이질적이다. 세포내 다소포체의 세포외배출에 의해 방출되는 소형 미세소포 (직경이 약 10 내지 1000 nm, 더욱 종종 약 10 내지 200 nm)가 당업계에서 "엑소솜"으로 지칭된다. 본원에 기술된 조성물, 방법 및 용도는 모든 크기, 바람직하게는 10 내지 800 nm, 더욱 바람직하게는 10 내지 200 nm의 미세소포에 동등하게 적용가능하다.
일부 문헌에서, 용어 "엑소솜"은 mRNA 분해 및 소형 핵소체 RNA (snoRNA), 소형 핵 RNA (snRNA) 및 리보솜 RNA (rRNA)의 프로세싱에 수반되는 엑소리보뉴클레아제(exoribonuclease)를 함유하는 단백질 복합체를 또한 지칭한다 (문헌 [Liu et al., 2006]; [van Dijk et al., 2007]). 이같은 단백질 복합체는 막이 없으며, 본원에서 사용되는 이러한 용어와 같은 "미세소포" 또는 "엑소솜"이 아니다.
본 발명은 유해 인자가 생물학적 샘플로부터의 핵산의 효과적인 추출을 방지할 수 있고, 뜻밖의 신규 작용제 및 단계가 이러한 유해 인자를 완화 또는 제거하는데 사용되어, 추출된 핵산의 품질을 극적으로 개선할 수 있다는 발견을 부분적으로 기초로 한다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 생물학적 샘플로부터 고품질 핵산을 추출하는 신규 방법이다. 본원에 기술된 신규 방법에 의해 수득된 고품질 추출물은 높은 수율 및 높은 완전성을 특징으로 하여, 추출된 핵산을 고품질 핵산 추출물이 바람직한 다양한 용도에 유용하게 한다.
대략적으로 기술하면, 신규 방법은, 예를 들어, 생물학적 샘플을 수득하는 단계, 생물학적 샘플로부터의 핵산의 효과적인 추출을 방지하는 유해 인자를 완화시키거나 제거하는 단계, 및 생물학적 샘플로부터 핵산을 추출하는 단계 (임의적으로 핵산 분석이 이어짐)를 포함한다.
적용가능한 생물학적 샘플에는, 예를 들어, 세포, 일군의 세포, 세포 단편, 미세소포가 예를 들어 포함되는 세포 산물, 세포 배양물, 대상체로부터의 신체 조직, 또는 체액이 포함된다. 체액은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 가래, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 소화관액, 비뇨생식관액, 눈물, 타액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 및 이들의 조합을 예를 들어 포함하지만 이에 한정되지 않는, 대상체의 신체 내의 임의의 장소, 바람직하게는 말초 위치로부터 단리된 유체일 수 있다.
생물학적 샘플은 종종 대상체로부터 유래될 수 있다. 용어 "대상체"는 미세소포가 있는 것으로 나타났거나 미세소포가 있을 것으로 예상되는 모든 동물을 포함하도록 의도된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 인간 또는 비-인간 영장류, 개, 고양이, 말, 소, 기타 가축, 또는 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트, 기니 피그 등)이다. 용어 "대상체" 및 "개체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
유해 효과를 완화 또는 제거하는 단계를 수행하기 전, 후 또는 이와 동시에 생물학적 샘플을 임의적으로 프로세싱하여 생물학적 샘플 유도체를 수득할 수 있다. 생물학적 샘플 유도체는 세포, 세포 잔해물, 막 소포, 또는 미세소포일 수 있다.
생물학적 샘플이 종종 예비-프로세싱된 후 생물학적 샘플 유도체 예컨대 미세소포가 수득된다. 일부 예에서, 예비-프로세싱 단계가 바람직하다. 예를 들어, 소변 샘플이 예비-프로세싱되어 소변 미세소포를 수득할 수 있다. 예비-프로세싱은 당업계에 공지된 기술 예컨대 저속 원심분리 및 예비-여과에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 소변 샘플에 300g의 제1 원심분리 단계를 적용하여, 샘플 내의 대형 입자를 제거할 수 있다. 소변 샘플에 17,000g의 제2 원심분리 단계를 적용하여 샘플 내의 더 작은 입자를 제거할 수 있다. 제2 원심분리 단계 후, 소변 샘플에 예비-여과 단계, 예를 들어, 0.8 ㎛ 예비-여과 단계를 추가로 적용할 수 있다. 다르게는, 1회 이상의 원심분리 단계를 먼저 적용하지 않으면서 소변 샘플을 예비-여과 단계에 의해 예비-프로세싱할 수 있다.
막 소포, 예를 들어, 미세소포가 생물학적 샘플로부터 단리될 수 있다. 일부 경우에, 생물학적 샘플의 예비-프로세싱 없이 이같은 단리가 일부 경우에 수행될 수 있다. 또 다른 경우에, 생물학적 샘플이 예비-프로세싱된 후에 이같은 단리가 수행될 수 있다. 생물학적 샘플로부터의 고품질 핵산 추출에 단리 단계가 유리할 수 있다. 예를 들어, 단리는 하기와 같은 장점들을 초래할 수 있다: 1) 질환- 또는 종양-특이적 미세소포를 체액 샘플 내의 다른 미세소포로부터 단리함으로써 수득될 수 있는, 질환- 또는 종양-특이적 핵산을 선택적으로 분석할 기회; 2) 체액 샘플로부터 핵산을 직접적으로 추출함으로써 수득되는 수율/완전성과 비교하여 핵산 종의 유의하게 더 높은 수율 + 더 높은 완전성; 3) 확장성, 예를 들어, 낮은 수준으로 발현된 핵산을 검출하는 확장성 (더 많은 양의 혈청으로부터 더 많은 미세소포를 펠릿화함으로써 감도가 증가될 수 있다); 4) 단백질 및 지질, 죽은 세포로부터의 잔해물, 및 기타 잠재적인 오염물 및 PCR 억제제가 핵산 추출 단계 전에 미세소포 펠릿으로부터 제외된다는 점에서 더 순수한 핵산; 및 5) 미세소포 펠릿의 부피가 출발 혈청보다 훨씬 작아서, 소량의 칼럼 필터를 사용하여 이러한 미세소포 펠릿으로부터 핵산을 추출하는 것을 가능하게 하기 때문에, 핵산 추출 방법에서의 더 많은 선택권.
생물학적 샘플로부터 미세소포를 단리하는 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 분별 원심분리 방법이 라포소(Raposo) 등의 논문 (문헌 [Raposo et al., 1996]), 스코그(Skog) 등의 논문 (문헌 [Skog et al., 2008]) 및 닐슨(Nilsson) 등의 논문 (문헌 [Nilsson et al., 2009])에 기술되어 있다. 음이온 교환 및/또는 젤 투과 크로마토그래피 방법이 미국 특허 번호 6,899,863 및 6,812,023에 기술되어 있다. 수크로스 밀도 구배 또는 세포소기관 전기영동 방법이 미국 특허 번호 7,198,923에 기술되어 있다. 자기 활성화 세포 분류 (MACS) 방법이 테일러(Taylor) 및 저슬-테일러(Gercel-Taylor)의 논문 (문헌 [Taylor and Gercel-Taylor, 2008])에 기술되어 있다. 나노막 초여과 농축 방법이 쉐루반키(Cheruvanky) 등의 논문 (문헌 [Cheruvanky et al., 2007])에 기술되어 있다. 추가로, 독특한 미세유체 플랫폼을 사용하여 종양-유래 미세소포를 효율적으로, 그리고 선택적으로 분리하는 새롭게 개발된 마이크로칩 기술에 의해 대상체의 체액으로부터 미세소포가 확인 및 단리될 수 있다 (문헌 [Chen et al.]). 상기 언급한 문헌들 각각은 이러한 방법들의 교시에 대해 본원에 참고로 포함된다.
본원에 기술된 방법들의 한 실시양태에서, 체액으로부터 단리된 미세소포가 특정 세포 유형, 예를 들어, 폐, 췌장, 위, 장, 방광, 신장, 난소, 정소, 피부, 결장직장, 유방, 전립선, 뇌, 식도, 간, 태반, 태아 세포에서 유래되는 것들에 대해 강화된다. 미세소포는 종종 자신의 도너(donor) 세포로부터의 표면 분자 예컨대 항원을 보유하기 때문에, 표면 분자가 특이적 도너 세포 유형으로부터의 미세소포를 확인, 단리 및/또는 강화하는데 사용될 수 있다 (문헌 [Al-Nedawi et al., 2008]; [Taylor and Gercel-Taylor, 2008]). 이러한 방식으로, 별개의 세포 집단으로부터 유래된 미세소포를 이의 핵산 함량에 대해 분석할 수 있다. 예를 들어, 종양 (악성 및 비-악성) 미세소포는 종양-관련 표면 항원을 보유하고, 이러한 특이적인 종양-관련 표면 항원을 통해 검출, 단리 및/또는 강화될 수 있다. 한 예에서, 표면 항원은 상피-세포-부착-분자 (EpCAM)이고, 이는 폐, 결장직장, 유방, 전립선, 두경부 및 간 기원의 암종으로부터의 미세소포에 대해 특이적이지만, 혈액학적 세포 기원의 암종에 대해서는 그렇지 않다 (문헌 [Balzar et al., 1999]; [Went et al., 2004]). 또 다른 예에서, 표면 항원은 CD24이고, 이는 소변 미세소포에 대해 특이적인 당단백질이다 (문헌 [Keller et al., 2007]). 또 다른 예에서, 표면 항원은 CD70, 암배아 항원 (CEA), EGFR, EGFRvIII 및 기타 변이체, Fas 리간드, TRAIL, 트랜스페린 수용체, p38.5, p97 및 HSP72와 같은 분자들의 군으로부터 선택된다. 추가적으로, 종양 특이적 미세소포는 CD80 및 CD86과 같은 표면 마커의 결여를 특징으로 할 수 있다.
특정 세포 유형으로부터의 미세소포의 단리가, 예를 들어, 원하는 표면 항원에 대해 특이적인 항체, 압타머(aptamer), 압타머 유사체 또는 분자적으로 각인된 중합체를 사용함으로써 달성될 수 있다. 한 실시양태에서, 표면 항원은 암 유형에 대해 특이적이다. 또 다른 실시양태에서, 표면 항원은 반드시 암성이지는 않은 세포 유형에 대해 특이적이다. 세포 표면 항원을 기초로 하는 미세소포 분리 방법의 한 예가 미국 특허 번호 7,198,923에서 제공된다. 미국 특허 번호 5,840,867 및 5,582,981, WO/2003/050290 및 존슨(Johnson) 등의 간행물 (문헌 [Johnson et al., 2008])에 예를 들어 기술된 바와 같이, 압타머 및 이의 유사체는 표면 분자에 특이적으로 결합하고, 세포 유형-특이적 미세소포를 회수하기 위한 분리 도구로서 사용될 수 있다. 분자적으로 각인된 중합체 또한 미국 특허 번호 6,525,154, 7,332,553 및 7,384,589 및 보시(Bossi) 등의 간행물 (문헌 [Bossi et al., 2007])에 예를 들어 기술된 바와 같이 표면 분자를 특이적으로 인식하고, 세포 유형-특이적 미세소포를 회수 및 단리하기 위한 도구이다. 상기 참고문헌들 각각은 이러한 방법들의 교시에 대해 본원에 포함된다.
의도되는 생물학적 유도체가 미세소포와 같은 막 소포인 경우에, 미세소포의 내부에 있지 않은 핵산을 제거하는 단계가 종종 수행된다. 핵산을 제거하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 샘플로부터 이같은 핵산을 제거하기 위해, 효소 소화 단계가 수행될 수 있다. 이같은 효소는 리보핵산의 효소 소화를 촉매하는 리보뉴클레아제 유형, 또는 데옥시리보핵산의 효소 소화를 촉매하는 데옥시리보뉴클레아제 유형일 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 신규 핵산 추출 방법은 생물학적 샘플로부터의 고품질 핵산 추출을 방지하는 유해 인자를 제거 또는 완화하는 단계를 포함한다. 이같은 유해 인자는 상이한 생물학적 샘플들이 다양한 종의 이같은 유해 인자를 함유할 수 있다는 점에서 이질적이다. 일부 생물학적 샘플에서, 과량의 미세소포외 DNA와 같은 인자가 이같은 샘플로부터의 핵산 추출 품질에 영향을 미칠 수 있고, 미세소포 내로부터 추출된 DNA를 오염시킬 수 있다. 다른 샘플에서, 과량의 내인성 RNase와 같은 인자가 이같은 샘플로부터의 핵산 추출 품질에 영향을 미칠 수 있다. 다수의 작용제 및 방법이 이러한 유해 인자를 제거하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법 및 작용제들이 총괄적으로 "추출 강화 공정"으로 지칭된다.
일부 경우에, 추출 강화 공정은 생물학적 샘플 또는 유도체에 핵산 추출 강화제를 첨가하는 것을 수반할 수 있다. 내인성 RNase와 같은 유해 인자를 제거하기 위해, 본원에서 정의된 바와 같은 이같은 추출 강화제는 시판되는 RNase 억제제 예컨대 수퍼라제-인 (앰비온 인코포레이티드), RNaseIN (프로메가 코포레이션Promega Corp.), 또는 유사한 방식으로 기능하는 기타 작용제; 프로테아제; 환원제; 합성 RNA와 같은 디코이 기질; RNase에 결합할 수 있는 가용성 수용체; 소형 간섭 RNA (siRNA); 항-RNA 항체 또는 샤페론 단백질과 같은 RNA 결합 분자; 삼투압 농도가 높은 용액, 세제와 같은 RNase 변성 물질, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 강화제들은, 예를 들어, RNase 활성을 억제하는 것 (예를 들어, RNase 억제제), 단백질의 편재성 분해 (예를 들어, 프로테아제), 또는 RNA에 결합하고 이를 보호하는 샤페론 단백질 (예를 들어, RNA-결합 단백질)을 통해서와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 다양한 방식으로 자신의 기능을 발휘할 수 있다. 모든 경우에, 이같은 추출 강화제는 제거 또는 완화되지 않으면 생물학적 샘플로부터의 고품질 핵산 추출을 방지 또는 방해할 생물학적 샘플 내의 유해 인자의 일부 또는 전체를 제거 또는 완화한다.
다른 예에서, 추출 강화 공정은 1회 이상의 공정 단계들의 수행을 수반할 수 있다. 이같은 공정들은 샘플의 핵산-함유 성분 예컨대 미세소포의 집중적인 또는 실질적으로 완전한 세정; 생물학적 샘플로부터의 RNase의 크기 분리; 특정 pH 조건, 온도 조건 (예를 들어, 감소되는 온도 또는 더 낮은 온도의 유지), 동결/해동 사이클 및 이들의 조합을 생성시키는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 기술에 의한 생물학적 샘플 내의 단백질의 변성을 포함한다.
본원에 기술된 것과 같은 추출 강화 공정의 사용의 한가지 놀라운 현시는 미세소포로부터의 핵산 추출물에서 유의한 양의 리보솜 RNA (rRNA)의 존재를 검출하는 능력이다. 미세소포 핵산 추출물 내의 18S 및 28S rRNA의 검출을 실연한 종래의 연구가 공지되지 있지 않다. 반면에, 종래의 연구에서는 rRNA가 미세소포로부터의 핵산 추출물 내에 존재하지 않거나 거의 존재하지 않는 것으로 제안되었다 (문헌 [Skog et al., 2008]; [Taylor and Gercel-Taylor, 2008]; [Valadi et al., 2007]).
본 발명의 또 다른 측면에서, 추출 강화 공정의 수행은 추출된 RNA의 품질을 RNA 완전성 숫자 (RIN)의 관점에서 개선시킬 것이다. 애질런트 테크놀러지즈(Agilent Technologies)에서 디자인된 RNA 완전성 숫자 (RIN) (http://www.chem.agilent.com/en-us/products/instruments/lab-on-a-chip/pages/gp14975.aspx, 2010년 7월 15일 액세스)는 전체 RNA 샘플의 완전성을 추정하도록 디자인된 소프트웨어 툴(tool)의 산물이다. 이러한 소프트웨어는 진핵생물 전체 RNA 샘플에 완전성 숫자를 자동으로 할당한다. 이러한 툴을 사용하여, 샘플 완전성이 18S 및 28S 리보솜 밴드의 비율에 의해서가 아니라, RNA 샘플의 전체 전기영동 트레이스(trace)에 의해서 결정된다. 이는 분해 생성물의 존재 또는 부재를 포함한다. 할당된 RIN은 샘플 농도, 설비, 및 분석가에 독립적이고, RNA 완전성에 대한 표준으로서의 구실을 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 추출 강화 공정의 수행은 추출된 핵산의 양 또는 수율을 개선할 것이다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 추출 강화 공정을 사용하여, 소변과 같은 저-단백질 생물학적 샘플 20 ㎖로부터 50 pg/㎖ 이상의 핵산 수율을 수득할 수 있다. 다르게는, 혈청 또는 혈장과 같은 고-단백질 생물학적 샘플 1 ㎖로부터 50 pg/㎖ 이상의 핵산 수율을 수득할 수 있다.
본원에 기술된 방법에 의해 수득된 신규 고품질 핵산 추출물은 바람직하게는 약 1:1 내지 약 1:2, 더욱 바람직하게는 약 1:2의 비율의 18S 및 28S rRNA의 검출; 저-단백질 생물학적 샘플에 대한 5 이상의 RNA 완전성 숫자, 또는 고-단백질 생물학적 샘플에 대한 3 이상의 RNA 완전성 숫자; 및 20 ㎖의 저-단백질 생물학적 샘플 또는 1 ㎖의 고-단백질 생물학적 샘플로부터의 50 pg/㎖ 이상의 핵산 수율의 조합을 나타낼 수 있다.
RNA 분해는 추출된 RNA의 후속 평가, 예컨대 유전자 발현 및 mRNA 분석, 뿐만 아니라 비-코딩 RNA 예컨대 소형 RNA 및 마이크로 RNA의 분석에 중대하게 영향을 미칠 수 있기 때문에 고품질 RNA 추출물이 고도로 바람직하다. 본원에 기술된 신규 방법은 미세소포와 같은 생물학적 샘플로부터 고품질 핵산을 추출할 수 있게 하여, 엑소솜 내에서의 유전자 발현 및 돌연변이 수준의 정확한 분석이 수행될 수 있게 한다. 한 실시양태에서, 예를 들어, 증가된 농도의 프로테아제 (5X, 10X)가 추출 강화제로서 사용되는 경우, 소변 미세소포로부터 단리된 RNA의 양 및 완전성이 유의하게 증가된다.
본 발명의 또 다른 측면은 소변과 같은 생물학적 샘플로부터 고품질 소형 RNA를 추출하는 방법을 제공한다. 핵산 추출 공정 동안 소형 RNA, 예컨대 miRNA는 특히 분해 및 손실되기 쉽다. 본원에 개시된 신규 방법에서, 고농도의 프로테아제가 사용되어 소형 RNA의 고품질 추출을 방지하는 유해 인자를 제거하거나 완화한다. 한 실시양태에서, 핵산, 특히 소형 RNA를 추출하는 방법이 25X 및 50X 프로테아제를 추출 강화제로서 사용하고, 유의하게 증가된 양의 소형 RNA를 수득할 수 있다. 본원에서 사용된 5X, 10X, 25X 및 50X와 같은 표현은 퀴아앰프 민일루트 바이러스 스핀 키트(QIAamp MinElute Virus Spin Kit)와 같은 시판되는 핵산 추출 키트에서 현재 사용되거나 권장되는 프로테아제의 활성 수준의 5배, 10배 등을 의미한다.
추출에 영향을 미치는 유해 인자가 제거 또는 완화된 경우, 당업계에 주지된 다수의 절차를 사용하여 생물학적 샘플로부터 핵산 분자를 단리할 수 있다. 당업자는 특정 단리 절차를 특정 생물학적 샘플에 적합한 것으로 선택할 것이다. 추출 방법의 예가 본원의 실시예 섹션에서 제공된다. 일부 경우에, 일부 기술로, 미세소포로부터의 추출 없이 핵산을 분석하는 것이 또한 가능할 수 있다.
한 실시양태에서, DNA 및/또는 RNA가 포함되는 추출된 핵산이 증폭 단계 없이 직접적으로 분석된다. 직접적인 분석은 나노스트링(NanoString) 기술을 포함하지만 이에 한정되지 않는 여러 방법으로 수행될 수 있다. 나노스트링 기술은 색깔로 코딩되는 형광 리포터를 각각의 표적 분자에 부착시킴으로써 생물학적 샘플 내의 개별적인 표적 분자의 확인 및 정량을 가능하게 한다. 이러한 접근법은 바코드를 스캐닝함으로써 품목을 측정하는 개념과 유사하다. 리포터가 수백 개, 심지어 수천 개의 상이한 코드로 제조될 수 있어, 고도로 다중화된 분석을 허용한다. 이러한 기술은 가이스(Geiss) 등의 간행물 (문헌 [Geiss et al., 2008])에 기술되어 있고, 이러한 교시내용에 대해 본원에 참조로 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 미세소포의 핵산을 분석하기 전에 이를 증폭시키는 것이 유익하거나 또는 다른 방식으로 바람직할 수 있다. 핵산 증폭 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되고 일반적으로 공지되어 있으며, 이의 많은 예가 본원에서 기술된다. 원한다면, 정량적이도록 증폭이 수행될 수 있다. 정량적 증폭은 다양한 핵산의 상대적인 양을 정량적으로 결정하도록 하여, 하기에 기술되는 바와 같은 프로파일이 생성될 것이다.
한 실시양태에서, 추출된 핵산은 RNA이다. 그후, 바람직하게는 RNA가 추가적인 증폭 전에 상보적인 DNA (cDNA)로 역전사된다. 이같은 역전사는 단독으로 또는 증폭 단계와 조합되어 수행될 수 있다. 역전사와 증폭 단계를 조합하는 방법의 한 예는 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)이며, 이는 정량적이도록 추가로 변형될 수 있고, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,639,606 (이러한 교시내용에 대해 본원에 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같은 정량적 RT-PCR이다.
핵산 증폭 방법에는, 비제한적으로, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) (미국 특허 번호 5,219,727) 및 이의 변형 예컨대 원위치(in situ) 중합효소 연쇄 반응 (미국 특허 번호 5,538,871), 정량적 중합효소 연쇄 반응 (미국 특허 번호 5,219,727), 네스티드(nested) 중합효소 연쇄 반응 (미국 특허 번호 5,556,773), 자립형 서열 복제 및 이의 변형 (문헌 [Guatelli et al., 1990]), 전사 증폭 시스템 및 이의 변형 (문헌 [Kwoh et al., 1989]), 큐비 리플리카제(Qb Replicase) 및 이의 변형 (문헌 [Miele et al., 1983]), 콜드(cold)-PCR (문헌 [Li et al., 2008]), 또는 임의의 기타 핵산 증폭 방법이 포함되고, 증폭된 분자를 당업자에게 주지된 기술을 사용하여 검출하는 것이 이에 이어진다. 핵산 분자가 매우 낮은 개수로 존재하는 경우 핵산 분자의 검출을 위해 디자인된 이러한 검출 계획이 특히 유용하다. 상기 참고문헌들은 이러한 방법들의 교시에 대해 본원에 포함된다.
미세소포 내에 존재하는 핵산의 분석은 정량적 및/또는 정성적이다. 정량적 분석을 위해, 미세소포 내의 관심 대상인 특정 핵산의 양 (발현 수준)이, 상대적이든지 또는 절대적이든지, 당업계에 공지된 방법 (하기 기술됨)으로 측정된다. 정성적 분석을 위해, 미세소포 내의 관심 대상인 특정 핵산의 종이, 야생형이든지 또는 변이체이든지, 당업계에 공지된 방법으로 확인된다.
본원에 개시된 발명은 18S 및 28S rRNA가 추출물 내에서 검출가능한 미세소포로부터의 핵산 추출물을 신규 조성물로서 또한 포함한다. 이같은 핵산 추출물은 본 발명에 개시된 신규 핵산 추출 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 생물학적 샘플 내의 미세소포로부터의 고품질 핵산 추출물은 다수의 경우에 바람직하다. 일부 경우에, 조직 샘플이 쉽게 입수가능하지 않다. 예를 들어, 뇌 종양 샘플은 뇌 수술 없이 일반적으로 수득될 수 없다. 대신, 뇌 종양 환자 혈청으로부터의 미세소포 샘플은 쉽게 입수가능하다. 뇌 종양 세포 내의 핵산을 분석하기 위해, 뇌 종양 세포에 의해 분비되는 혈청 미세소포 내의 핵산을 분석하는 것이 더 용이하다. 따라서, 조직 세포에 의해 분비되는 미세소포 내의 핵산이 조직 세포로부터의 핵산을 대체하는데 사용되는 경우에, 조직 세포로부터 직접적으로 수득되는 것과 유사하게, 검출가능한 품질의 대조물, 예컨대 18S 및 28S rRNA를 함유하는 고품질 핵산을 수득하는 것이 바람직하다. 다른 경우에, 고품질 소형 RNA가 바람직하다. 본원에 개시된 핵산 추출물은 이같은 고품질 소형 RNA를 18S 및 28S rRNA와 함께 함유한다. 이같은 고품질 소형 RNA는 다양한 목적, 예를 들어, 특정 miRNA의 발현 수준을 위한 핵산의 정확한 평가에 중요하다.
본원에 개시된 발명은 생물학적 샘플 내의 미세소포로부터의 핵산의 신규 고품질 프로파일을 추가로 포함한다. 이같은 프로파일은 18S 및 28S rRNA를 함유하는 핵산 추출물을 분석함으로써 생성된다. 이같은 프로파일은 본원에 개시된 신규 방법으로 수득될 수 있다. 고품질 핵산 프로파일은 다수의 용도, 예컨대 의학적 상태 또는 치료법 선택을 위한 바이오마커로서의 용도에 고도로 바람직하다. 이는 이같은 프로파일이 샘플들 간에 일관된다는 점에서 바람직하다. 이같은 일관성은 고품질 핵산 추출물 없이는 거의 달성될 수 없다. 본 발명의 한 실시양태에서, 기원 세포에 의해 분비되는 미세소포 내의 핵산을 분석함으로써 핵산의 프로파일이 수득될 수 있다. 이같은 미세소포는 쉽게 입수가능한 생물학적 샘플, 예를 들어, 소변, 혈청 또는 혈장으로부터 단리될 수 있다. 이같은 핵산 프로파일은 소형 RNA, 메신저 RNA, 마이크로RNA, 비-코딩 RNA 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 추가적인 실시양태에서, 더욱 정확하게 특정 결과를 달성하도록 이같은 핵산 프로파일이 다른 바이오마커와 조합될 수 있다.
핵산 프로파일은 예를 들어 유전적 이상의 선집일 수 있고, 이는 미세소포 내의 핵산 양, 뿐만 아니라 핵산 변이체를 지칭하도록 본원에서 사용된다. 구체적으로, 유전적 이상에는, 비제한적으로, 유전자 (예를 들어, 종양유전자) 또는 유전자 패널의 과다발현, 유전자 (예를 들어, 종양 억제제 유전자 예컨대 p53 또는 RB) 또는 유전자 패널의 과소발현, 유전자 또는 유전자 패널의 스플라이스(splice) 변이체의 별법적인 생산, 유전자 카피 수 변이체 (CNV) (예를 들어 DNA 이중 미소체) (문헌 [Hahn, 1993]), 핵산 변형 (예를 들어, 메틸화, 아세틸화 및 인산화), 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP), 염색체 재배열 (예를 들어, 역전, 결실 및 중복), 및 유전자 또는 유전자 패널의 돌연변이 (삽입, 결실, 중복, 미스센스, 논센스, 동의성 변화 또는 임의의 기타 뉴클레오티드 변화) (돌연변이는 다수의 경우에 궁극적으로 유전자 산물의 활성 및 기능에 영향을 미치고, 별법적인 전사 스플라이스 변이체 및/또는 유전자 발현 수준의 변화에 이른다)가 포함된다.
이같은 유전적 이상의 결정은 당업자에게 공지된 다양한 기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 핵산의 발현 수준, 별법적인 스플라이싱 변이체, 염색체 재배열 및 유전자 카피 수를 마이크로어레이(microarray) 분석 (미국 특허 번호 6,913,879, 7,364,848, 7,378,245, 6,893,837 및 6,004,755) 및 정량적 PCR에 의해 결정할 수 있다. 특히, 카피 수 변화를 일루미나(Illumina)의 인피늄 II(Infinium II) 전체 게놈 유전자형결정 분석법 또는 애질런트(Agilent)의 휴먼 게놈 CGH 마이크로어레이(Human Genome CGH Microarray)로 검출할 수 있다 (문헌 [Steemers et al., 2006]). 핵산 변형을 미국 특허 번호 7,186,512 및 특허 공보 WO/2003/023065에 예를 들어 기술된 방법에 의해 분석할 수 있다. 특히, 메틸화 프로파일을 일루미나의 DNA 메틸레이션 OMA003 캔서 패널(DNA Methylation OMA003 Cancer Panel)에 의해 결정할 수 있다. SNP 및 돌연변이는 대립유전자-특이적 프로브와의 혼성화, 효소에 의한 돌연변이 검출, 미스매치(mismatched) 헤테로듀플렉스(heteroduplex)의 화학적 절단 (문헌 [Cotton et al., 1988]), 미스매치 염기의 리보뉴클레아제 절단 (문헌 [Myers et al., 1985]), 질량 분광법 (미국 특허 번호 6,994,960, 7,074,563, 및 7,198,893), 핵산 서열분석, 단일 가닥 형상 다형성 (SSCP) (문헌 [Orita et al., 1989]), 변성 구배 젤 전기영동 (DGGE) (문헌 [Fischer and Lerman, 1979a]; [Fischer and Lerman, 1979b]), 온도 구배 젤 전기영동 (TGGE) (문헌 [Fischer and Lerman, 1979a]; [Fischer and Lerman, 1979b]), 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) (문헌 [Kan and Dozy, 1978a]; [Kan and Dozy, 1978b]), 올리고뉴클레오티드 결찰 분석법 (OLA), 대립유전자-특이적 PCR (ASPCR) (미국 특허 번호 5,639,611), 결찰 연쇄 반응 (LCR) 및 이의 변형 (문헌 [Abravaya et al., 1995]; [Landegren et al., 1988]; [Nakazawa et al., 1994]), 유동-세포측정식 헤테로듀플렉스 분석 (WO/2006/113590) 및 이들의 조합/변형에 의해 검출될 수 있다. 특히, 유전자 발현 수준은 유전자 발현의 연속 분석 (SAGE) 기술 (문헌 [Velculescu et al., 1995])에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 유전적 이상을 분석하는 방법들이 본원에서 인용된 것에 한정되지 않는 다수의 간행물에 보고되어 있고, 당업자에게 입수가능하다. 적합한 분석 방법은 특정한 분석 목적, 환자의 상태/병력, 및 검출, 모니터링 또는 치료될 특정 암(들), 질환 또는 기타 의학적 상태에 좌우될 것이다. 상기 참고문헌들은 이러한 방법들에 대한 이들의 교시내용에 대해 본원에 포함된다.
본 발명이 본원에 기술된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 한정되지 않고, 이들이 변할 수 있음을 이해하여야 한다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 목적이고, 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않으며, 본 발명의 범주는 청구항에 의해서만 정의된다.
본원에 개시된 내용의 실시예들이 하기에 기재된다. 본원에 개시된 내용의 다른 특색, 목표 및 장점이 상세한 설명, 도면, 실시예 및 청구항으로부터 명백할 것이다. 본원에 기술된 것들과 실질적으로 유사하거나 등가인 방법, 기구 및 물질이 본원에 개시된 내용의 실행 또는 테스트에서 사용될 수 있다. 이제 예시적인 방법, 기구, 용도 및 물질이 기술된다.
소변 내의 미세소체
실시예
1:
신세포가
다소포체를
함유한다
신세포에서 미세소포가 쉐딩되는지 여부를 조사하기 위해, 투과 전자 현미경 (TEM)을 사용하여 신세포가 미세소포를 제공할 수 있는 다소포체를 함유하는지 여부를 결정하였다. 래트 신장을 0.1 M 소듐 카코딜레이트 완충제, pH 7.4 (일렉트론 마이크로스코피 사이언시즈(Electron Microscopy Sciences), 펜실베이니아주) 내의 2.0％ 글루타르알데히드의 정맥내 관류로 고정하고, 신장 절편을 4℃에서 하룻밤 동안 추가로 고정시켰다. 샘플 절편을 0.1 M 소듐 카코딜레이트 완충제에서 헹구고, 1시간 동안 실온에서 카코딜레이트 완충제 내의 1.0％ 사산화오스뮴 내에 후-고정시키고, 완충제에서 다시 헹군 후, 증류수 (dH2O)에서 헹구고, 1시간 동안 실온에서 2.0％ 아세트산우라닐의 수용액에서 일괄적으로 염색하였다. 샘플을 증류수에서 헹구고, 100％까지의 일련의 에탄올 구배를 통해 탈수시켰다. 이폰(Epon):에탄올의 1:1 용액에서 하룻밤 동안 함침시킴으로써 샘플에 이폰 수지 (테드 펠라(Ted Pella), 캘리포니아주)를 침윤시켰다. 다음날, 샘플을 신선한 이폰 내에 수시간 동안 놓고, 60℃에서 하룻밤 동안 이폰에 매립시켰다. 박편을 레이체르트 울트라컷 E(Reichert Ultracut E) 초미세절단기 상에서 절단하고, 폼바(formvar)-코팅 격자 상에서 수집하고, 아세트산우라닐 및 시트르산납으로 염색하였다. 샘플을 80 kV의 JEOL JEM 1011 투과 전자 현미경에서 조사하였다. 영상을 AMT (어드밴스드 마이크로스코피 테크닉스(Advanced Microscopy Techniques), 매사추세츠주) 디지털 영상화 시스템을 사용하여 수집하였다. 도 1에 제시된 바와 같이, MVB의 투과 전자 현미경 (TEM) 영상이 래트 신조직 세포에서 나타난다. 다소포체 (MVB)를 발세포, 근위 세관, 가는 하행각, 굵은 상행각, 집합관 주세포, 및 집합관 개재 세포가 포함되는, 네프론 및 집합관의 다양한 영역에서 확인할 수 있다. 이는 네프론, 뿐만 아니라 집합관의 개재 세포 및 주세포 둘 다의 다양한 영역으로부터 엑소솜이 실제로 방출될 수 있음을 실연한다.
실시예
2: 미세소포가 소변 내에 존재한다
미세소포 자체를 조사하기 위해, 인간 소변 미세소포를 TEM에 의해 조사하였다. 인간 소변을 매사추세츠 제네럴 호스피탈(Massachusetts General Hospital)의 인가된 IRB 지침 하에 수득하였다. 그 후, 소변을 3단계로 구성된 방법에 의해 예비-프로세싱하였다: 4℃에서 10분 동안 300g에서 소변을 원심분리함, 4℃에서 20분 동안 17,000g에서 상등액을 원심분리함, 및 상등액을 0.8 ㎛ 필터 (셀룰로스 니트레이트 막 필터 유닛, 날진(Nalgene), 뉴욕주)를 통해 여과함. 다르게는, 어떠한 예비-원심분리 단계도 없이 0.8 ㎛ 필터를 통해 직접적으로 1단계에 의해 소변을 예비-프로세싱하였다. 양쪽 경우에, 여액에 4℃에서 70분 동안 118,000g에서의 초원심분리를 적용하였고, 상등액을 제거하고, 미세소포-함유 펠릿을 PBS에서 세정하고, 4℃에서 70분 동안 118,000g에서 다시 펠릿화시켰다.
초원심분리 대신, 예비-프로세싱된 샘플로부터 미세소포를 단리하는데 여과 농축이 또한 사용되었다. 여액 농축기 (100 kDa MWCO) (밀리포어(Millipore), 매사추세츠주)를 제조사의 설명서에 따라 제조하였다. 예비-프로세싱된 여액을 여과 농축기에 첨가하고, 4,000g에서 4분 동안 실온에서 원심분리하였다. 15 ㎖의 PBS 세정 단계가 포함되었다.
미세소포 펠릿을 dH2O 내의 4％ 파라포름알데히드로 1:1 고정시켰다. 10 ㎕ 액적을 폼바-코팅 200 메시(mesh) 금 격자 상에 파이펫팅하고, 1분 후에 배수시켰다. 샘플을 몇 방울의 dH2O로 2회 헹궜다. 수성 2.0％ 포스포텅스텐산 (PTA)을 10초 동안 적용하고 (10 ㎕), 배수시키고, dH2O로 1회 헹궜다. 샘플을 80 kV의 JEOL JEM 1011 투과 전자 현미경에서 조사하였다. 영상을 AMT (어드밴스드 마이크로스코피 테크닉스, 매사추세츠주) 디지털 영상화 시스템을 사용하여 수집하였다. 도 2에 제시된 바와 같이, 펠릿에 미세소포가 실제로 풍부하였다. TEM 영상에서 미세소포들은 때때로 함께 응집되거나 또는 단수로 존재한다.
생물학적 샘플로부터의 핵산 추출을 위한 개선된 방법
실시예
3: 미세소포 단리의 목적을 위해
초원심분리가
여과 농축기로 교체가능하다
여과 농축기가 초원심분리 방법과 유사한 RNA 추출을 위한 실행가능한 미세소포를 산출할 수 있다는 것이 본 실시예에서 나타난다. 실시예 2에 상술된 바와 같이 75 ㎖ 소변을 4℃에서 10분 동안 300g에서의 원심분리 및 4℃에서 20분 동안 17,000g에서의 원심분리에 의해 예비-프로세싱한 후, 0.8 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 그 후, 미세소포를 100 kDa MWCO 여과 농축기 (밀리포어, 매사추세츠주) 및 초원심분리를 통해 단리하였고, 이때 둘 다 각각 RNase 소화가 존재하였고, DNase 소화는 존재 또는 부재하여, 미세소포외 핵산 오염을 제거하였다. 도 3 및 4에 나타난 바와 같이, 초원심분리 (도 4)는 410 ± 28 pg/㎕, 여과 농축기 (도 3)는 381 ± 47 pg/㎕ (평균 ± SD)로, 초원심분리 방법 및 여과 농축 방법에서 75 ㎖ 소변 샘플로부터 유사한 RNA 농도가 산출되었다. 2개의 수율 간에 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 이러한 데이터는 여과 농축기의 사용이 RNA 분석을 위해 소변 미세소포를 단리하기 위한 신뢰할 수 있는 방법이라는 것을 실연한다.
실시예
4: 0.8 ㎛ 예비-여과 단계만으로의 샘플 예비-프로세싱이 미세소포 단리 목적에 충분하다
추가로, 0.8 ㎛ 예비-여과 단계만으로의 소변 예비-프로세싱이 저속 원심분리 단계를 포함하는 방법만큼 효과적이었기 때문에 300g 및 17,000g에서의 저속 원심분리 단계가 제거될 수 있음을 발견하였다. 도 5 및 6에 나타난 바와 같이, 0.8 ㎛ 예비-여과와 커플링된 저속 원심분리의 방법 (A)을 사용한 핵산 프로파일이 0.8 ㎛ 예비-여과만의 방법 (B)을 사용하는 프로파일과 동일하였다.
실시예
5: 유해 인자의 제거 또는 완화를 포함하는 방법으로의 소변 미세소포로부터의 핵산 추출
미세소포로부터의 핵산 추출을 위한 개선된 방법을 사용하였다. 이러한 방법에서, 미세소포 막을 파괴하기 전에 고품질 핵산 추출물을 위해 유해 인자를 제거하였다. 도 7에 제시된 바와 같이, 소변 샘플 100을 0.8 ㎛ 필터 막 110을 통해 여과함으로써 예비-프로세싱하였다. 그 후, 여액 내의 미세소포를 초원심분리 또는 여과 농축에 의해 단리하였고 (120), 이때 상세사항은 실시예 2에 기술된 것과 유사하였다. 그 후, 단리된 미세소포에 RNase 및/또는 DNase 소화를 적용하여, 미세소포 내부에 함유되지 않은 핵산을 제거하였다 (130). 구체적으로, 미세소포를 PBS 내의 1 ㎕/㎖ RNase A (DNase 및 프로테아제 없음) (퍼멘타스(Fermentas), 메릴랜드주)에 재현탁시키고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 샘플을 PBS에서 70분 동안 118,000g에서 다시 펠릿화시켰다. DNase I 소화를 위해, (제조사의 설명서에 따라) RDD 완충제에 용해된 DNase I (RNase 없음) (퀴아젠(Qiagen), 캘리포니아주) 및 PBS 500 ㎕에 펠릿을 재현탁시키고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 PBS에서 70분 동안 118,000g에서 다시 펠릿화시켰다. 여과 농축기를 통해 단리된 미세소포의 RNase A 및 DNase I 소화를 위해, 동일한 농도의 RNase 및 DNase가 사용되었고, 인큐베이션이 여과 농축기에서 수행되었다. 추출 강화 단계 140, 예를 들어, 15 ㎖의 PBS로의 3회 재현탁/세정 단계 단독 또는 프로테아제 처리와 커플링된 재현탁/세정 단계를 수행하였다. 미세소포를 단리하고, 뉴클레아제로 소화시키고, 프로테아제로 처리한 후, 핵산을 추출하였다 (150). 제조사의 설명서에 따라 알엔이지 마이크로 키트 (퀴아젠, 캘리포니아주)를 사용하여 RNA 추출을 수행하였다. 간략하게, 350 ㎕ RLT 완충제 (RLT 1 ㎖ 당 10 ㎕ 베타-메르캅토에탄올이 있음)를 사용하여 엑소솜을 용해시키고, 뉴클레아제가 없는 물 16 ㎕를 용출에 사용하였다. 게놈 DNA (gDNA)를 제거하도록 디자인된 알엔이지 플러스 마이크로(RNeasy Plus Micro) 키트 (퀴아젠, 캘리포니아주)를 제조사의 설명서에 따라 수행하였고, 뉴클레아제가 없는 물 16 ㎕에 용출시켰다. 알엔이지 마이크로 키트 또는 알엔이지 플러스 마이크로 키트를 사용하는 소형 RNA 단리를 위해, 제조사의 설명서에 따라 miRNA 단리 방법을 따랐다. 단리된 RNA를 애질런트 바이오애널라이저 (애질런트(Agilent), 캘리포니아주)를 사용하여 RNA 피코(Pico) 6000 칩 (애질런트, 캘리포니아주) 상에서 분석하였고 (160), 이에 의해 샘플의 전기영동 프로파일 및 상응하는 '슈도 젤'이 생성되었다.
도 8 및 9에 제시된 바와 같이, 미세소포의 막을 파괴하기 전에 더 많은 프로테아제가 미세소포를 처리하는데 사용됨에 따라 소변 미세소포로부터의 RNA 추출물의 품질 (수율 및 완전성 면에서의 품질)이 증가되었다. 도 8에서, RNA 추출이 퀴아젠의 퀴아앰프 민일루트 바이러스 스핀 키트를 사용하여 수행된 것을 제외하고는 상기의 개선된 방법을 사용하여 20 ㎖ 소변 내의 미세소포로부터의 핵산이 추출되었다. 소변 샘플이 여과 농축으로 농축되었고, 200 ㎕ PBS 내에 용출되었다. 여기에서, 1X 프로테아제는 0.027 AU로; 5X 프로테아제는 0.135 AU로; 10X 프로테아제는 0.27 AU로; 25X 프로테아제는 0.675 AU로; 50X는 1.35 AU로 정의된다. 프로테아제의 농도가 5X (A)에서 10X (B)로 증가되었을 때 더 큰 완전성의 18S 및 28S rRNA 피크가 관찰되었다. 유사하게, 도 9에 제시된 바와 같이, 더 높은 프로테아제 농도인 25X (A) 및 50X (B)에서, 증가된 소형/miRNA 수준에 더하여, 더 높은 완전성의 18S 및 28S rRNA가 관찰되었다. 이러한 데이터는 프로테아제의 첨가가 18S 및 28S rRNA, 뿐만 아니라 소형 RNA 및 microRNA의 수율 및 완전성을 증가시킬 수 있음을 시사한다. 프로테아제의 효과는 RNase 및 기타 억제 인자를 소화해 버리는 이의 능력에 기인할 수 있는 것으로 추측된다.
미세소포를 여러 번 세정하는 단계의 추가 또한 소변 미세소포로부터 추출된 핵산의 품질을 극적으로 개선시켰다. 세정 단계는 소변 미세소포로부터의 고품질 핵산 추출을 방지하는 유해 인자를 효과적으로 제거할 수 있다. 각각 20 ㎖의 소변 샘플이 약간의 변형을 제외한 상기의 방법 후에 4가지 군의 핵산 추출 테스트에 사용되었다. 군 1에서는, 단리된 미세소포가 어떠한 개입 단계도 없이 핵산 추출에 직접적으로 사용되었다. 군 2에서는, 미세소포가 핵산 추출 전에 RNase 억제제로 처리되었다. 군 3에서는, 미세소포가 핵산 추출 전에 어떠한 RNase 억제제로도 처리되지 않으면서 세정되었다. 군 4에서는, 미세소포가 세정되었고, RNase 억제제로 처리되었다. 도 38에 제시된 바와 같이, 군 1 테스트에서, 3.63 ± 2.3의 RIN 및 101.3 ± 27.6 pg/㎕의 RNA 농도로, 추출된 핵산의 품질이 매우 불량하였다. 군 2 테스트에서 (도 39), 1.83 ± 2.2의 RIN 및 101.6 ± 88 pg/㎕의 RNA 농도로, 추출된 핵산의 품질이 군 1 테스트에서의 것과 대략적으로 유사하였다. 군 3 테스트에서 (도 40), 9.2 ± 0.0의 RIN 및 347.7 ± 97.7 pg/㎕의 RNA 농도로, 추출된 핵산의 품질이 극적으로 개선되었다. 군 4 테스트에서 (도 41), 7.43 ± 0.2의 RIN 및 346.3 ± 32.7 pg/㎕의 RNA 농도로, 추출된 핵산의 품질이 군 3에서의 것과 유사하였다. 이러한 데이터는 세정 단계 없이는, 미세소포가 핵산 추출 전에 세정된 추출물보다 비교적 변화량이 더 높으면서, 미세소포로부터의 추출 품질이 일관적이지 않았음을 나타냈다.
실시예
6: 혈청 미세소포로부터의 핵산 추출을 위한
RNase
억제제의 사용
상기의 개선된 방법으로, 고품질 핵산 추출물이 혈청 미세소포로부터 또한 수득될 수 있다. 이때, 흑색종 및 정상 환자 혈청 양쪽으로부터 혈청을 수득하였고, RNase 억제제 칵테일 수퍼라제-인(SUPERase-In)™ (앰비온 인코포레이티드)을 사용하여 재현탁에 의해 미세소포 펠릿을 처리하였다. 1가지 테스트 뱃치에서, 1 ㎖ 흑색종 혈청 샘플의 4개의 복제물로부터 미세소포를 단리하였고, 미세소포 펠릿을 1 ㎕ 당 1.6 유닛의 최종 농도의 수퍼라제-인으로 처리하였다. 미세소포 단리 방법은 초원심분리였고, 미세소포 펠릿을 20분 동안 실온에서 DNase로 처리하였다. 도 10-13에 제시된 바와 같이, 4개의 흑색종 혈청 샘플로부터의 RNA 추출 품질이 낮고 일관적이지 않았으며, 이때 RNA 수율은 각각 543 pg/㎕, 607 pg/㎕, 1084 pg/㎕, 1090 pg/㎕이었고, 28s/18s 비율에 의해 평가된 RNA 완전성은 각각 1.7, 1.8, 1.3, 및 0.6이었다. 또다른 테스트 뱃치에서, 1 ㎖ 흑색종 혈청 샘플의 2개의 복제물로부터 미세소포를 단리하였고, 1 ㎕ 당 3.2 유닛의 최종 농도의 수퍼라제-인으로 처리하였다. 도 14 및 15에 제시된 바와 같이, 3.2 유닛의 수퍼라제-인/㎕로 처리된 2개의 흑색종 혈청 샘플로부터의 RNA 추출 품질이 1.6 유닛의 수퍼라제-인/㎕로 처리된 것들로부터의 RNA 추출 품질보다 일반적으로 더 양호하였다. 2개의 흑색종 혈청 샘플에 대한 RNA 수율은 각각 3433 pg/㎕ 및 781 pg/㎕이었고, 28S/18S 비율은 각각 1.4 및 1.5였다.
추가로, 1 ㎖ 정상 혈청 샘플의 4개의 복제물을 1.6 유닛의 수퍼라제-인/㎕에서, 1 ㎖ 정상 혈청 샘플의 2개의 복제물을 3.2 수퍼라제-인/㎕에서 테스트하였다. 도 16-19에 제시된 바와 같이, 1.6 유닛의 수퍼라제-인/㎕에서의 RNA 추출 품질이 낮았고, 이때 RNA 수율은 각각 995 pg/㎕, 1257 pg/㎕, 1027 pg/㎕, 및 1206 pg/㎕이었고, 28S/18S 비율은 각각 1.3, 1.6, 1.6, 1.8이었다. 대조적으로, 도 20 및 21에 제시된 바와 같이, 3.2 유닛의 수퍼라제-인/㎕에서의 RNA 추출 품질이 증가되었고, 이때 RNA 수율은 각각 579 pg/㎕ 및 952 pg/㎕, 28S/18S 비율은 각각 1.6 및 2.3이었다.
실시예
7: 생물학적 샘플로부터의 핵산 추출을 위한 추출 강화제의 사용
실시예 3 및 4에서, 테스트 결과는 추출 강화제로의 처리가 미세소포로부터의 RNA 추출 품질을 증가시킬 수 있음을 시사한다. 이같은 추출 강화제가 다른 생물학적 샘플에 대해 유사한 효과가 있을 것으로 예측된다. 도 22에 제시된 바와 같이, 본 발명에서의 신규 핵산 추출 방법은 생물학적 샘플에 추출 강화 공정을 수행하는 단계를 필요로 할 것이다. 이같은 방법이 하기의 핵산 추출 실험 발상에서 실험될 수 있다. 의사가 환자에 대한 종양 바이오마커의 테스트를 처방한다. 그 후 5 ㎖ 혈액을 환자로부터 채취한다. 때때로 혈액 샘플 200을 예비-프로세싱하여 혈청을 얻는다. 그 후, 강화 공정 210을 수행하고, 예를 들어, 적합한 양의 추출 강화제를 혈청에 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 그 후, 처리된 혈청으로부터의 핵산을 실시예 5에 상술된 바와 같이 정규 추출 방법을 사용하여 추출하고 (220), 애질런트 바이오애널라이저를 사용하여 분석한다 (230). 이같은 추출은 생물학적 샘플로부터 고품질 핵산을 생산할 것으로 예상된다.
바이오마커로서의
소변 미세소포로부터의 핵산
실시예
8: 소변 미세소포가 자유로운
미세소포외
비-세포
DNA
로 오염된다
소변 샘플을 2개의 25 ㎖ 복제물 샘플로 분리하고, 상기 상술된 바와 같이 분별 원심분리에 의해 2개의 하위 샘플로부터 미세소포를 단리하였다. 1개의 하위 샘플에서, 상기 상술된 바와 같이, 미세소포를 DNase로 처리하고, 처리된 미세소포로부터 핵산을 추출하였다. 또 다른 하위 샘플에서는, 미세소포를 DNase로 처리하지 않았고, 처리되지 않은 미세소포로부터 핵산을 추출하였다. 도 23에 제시된 바와 같이, 자유로운 미세소포외 비-세포 DNA가 단리된 소변 미세소포를 오염시켰다. 알엔이지 마이크로 키트가 핵산 추출에 사용된 경우 (도 23 a 및 b), (a)에서의 피크가 (b)에서의 피크보다 일반적으로 더 높았기 때문에 결과는 처리되지 않은 샘플 (a)에 처리된 샘플 (b)보다 더 많은 핵산이 나타났음을 제시하였다.
또 다른 테스트에서, 혈청 샘플이 소변 샘플 대신 사용된 것을 제외하고는 유사한 테스트를 수행하였다. 도 24에 제시된 바와 같이, 자유로운 미세소포외 비-세포 DNA가 단리된 혈청 미세소포를 또한 오염시켰다. (a)에서의 피크가 (b)에서의 피크보다 일반적으로 더 높았기 때문에, DNase로 처리되지 않은 샘플 (a)에서 DNase로 처리된 샘플 (b)보다 더 많은 핵산이 나타났다. 유사하게, 미르바나 키트가 핵산 추출에 사용되었을 때, 도 23 (c) 및 (d)에 제시된 바와 같이, (c)에서의 피크가 (d)에서의 피크보다 일반적으로 더 높았기 때문에 결과는 처리되지 않은 샘플 (c)에 처리된 샘플 (d)보다 더 많은 핵산이 나타났음을 또한 제시하였다. 도 24 c에서의 슈도 젤에서 제시된 바와 같이 DNase에 감수성인 "세포자멸사체"-유사 래더가 나타났기 때문에, 처리되지 않은 샘플로부터의 추가적인 핵산은 아마도 DNase에 감수성인 "세포자멸사체"로부터의 것이었을 것이다. 소변 및 혈청 샘플 둘 다에서, 자유로운 미세소포외 비-세포 DNA의 양은 대상체들 간에 달랐지만, 이러한 DNA의 크기는 약 25 내지 1500개의 염기쌍 범위 내였다.
실시예 9: 소변 미세소포가 자유로운 미세소포외 비-세포 RNA 로 거의 오염되지 않는다
소변 샘플을 2개의 25 ㎖ 복제물 샘플로 분리하고, 상기 상술된 바와 같이 분별 원심분리에 의해 2개의 하위 샘플로부터 미세소포를 단리하였다. 1개의 하위 샘플에서, 상기 상술된 바와 같이, 미세소포를 RNase로 처리하고, 처리된 미세소포로부터 핵산을 추출하였다. 또 다른 하위 샘플에서는, 미세소포를 RNase로 처리하지 않았고, 처리되지 않은 미세소포로부터 핵산을 추출하였다. 도 25에 제시된 바와 같이, 자유로운 미세소포외 비-세포 RNA가 단리된 소변 미세소포를 거의 오염시키지 않았다. RNase로 처리되지 않은 샘플 (A)의 곡선이 RNase로 처리된 샘플 (B)의 곡선과 거의 중첩되었고, 이는 단리된 미세소포와 회합된 자유로운 미세소포외 비-세포 RNA가 없음을 시사한다. 이는 소변 내의 리보뉴클레아제의 존재로 인한 것일 수 있다.
실시예
10: 핵산 프로파일이
애질런트
바이오애널라이저에 의해 측정된 소변 미세소포 및
신세포에서
유사하다.
소변 미세소포 및 신 (신장) 조직 양쪽으로부터 핵산을 추출하였고, 이들의 프로파일을 비교하였다. 소변 미세소포로부터의 추출 방법은 실시예 5에 상술된 바와 같았다. 래트 신장 샘플을 알엔이지(RNeasy) 미니(Mini) 키트 및 알엔지이 플러스(Plus) 키트를 통해 프로세싱하였다. 래트 신장 샘플 내의 소형 RNA의 양을 결정하기 위해, 이를 제조사의 설명서에 따라 miRNA 단리 방법을 사용하여 양쪽 키트에 의해 또한 프로세싱하였다.
도 26에 제시된 바와 같이, 이들의 프로파일 (A - 신장, B - 미세소포)이 18S 및 28S rRNA 피크의 존재 및 완전성을 포함하여 매우 유사하였다. 이전에 보고된 혈청-유래 또는 세포 배양 배지-유래 미세소포에서는 이같은 18S 및 28S rRNA 피크가 나타나지 않았다.
rRNA 피크에서의 유사성에 더하여, 소변 미세소포는 신세포로부터 수득된 것와 유사한 소형 RNA 프로파일을 또한 함유하였다. 도 27에 제시된 바와 같이, 소변 미세소포 (B) 및 신 조직 (A) 둘 다 소형 RNA (약 25-200개의 염기쌍)를 함유하였고, 유사한 패턴을 공유하였다.
이러한 데이터는 본 발명에 개시된 신규 핵산 추출 방법을 사용하여, 소변 미세소포 내의 프로파일이 미세소포가 유래되는 신세포 내의 프로파일을 시험하는데 사용될 수 있음을 시사한다.
실시예
11: 소변 미세소포 내의
RNA
프로파일이 전체 소변으로부터의 것과 상이하다
소변 미세소포 내의 RNA 프로파일이 전체 소변으로부터의 것과 상이하다는 것을 발견하였다. 75 ㎖ 복제물 소변 샘플이 테스트에 사용되었다. 4℃에서 10분 동안 300g, 4℃에서 20분 동안 17,000g에서 상등액의 원심분리, 및 0.8 ㎛ 필터 (셀룰로스 니트레이트 막 필터 유닛, 날진, 뉴욕주)를 통한 상등액의 여과에 의해 소변을 1차로 예비-프로세싱한 후, 실시예 5에서 상술된 바와 같은 단계들에 의해, 소변 미세소포로부터 RNA를 단리하였다. 전체 소변으로부터의 RNA를 제조사의 설명서에 따라 ZR 소변 RNA 단리 키트 (자이모 리서치(Zymo Research), 캘리포니아주)를 사용하여 단리하였다. 자이모로 프로세싱된 샘플로부터 DNA를 제거하기 위해, 용출된 RNA를 350 ㎕ RLT 완충제에 재현탁시키고, 회합된 DNA를 DNase를 사용하여 제거하는 알엔이지 플러스 마이크로 키트를 통해 프로세싱하고, 16 ㎕의 뉴클레아제가 없는 물에 용출시켰다.
도 28에 제시된 바와 같이, DNase가 사용되지 않았을 때 ZR 소변 RNA 단리 키트를 사용하여 다량의 핵산을 단리할 수 있었다 (A). 그러나, 프로파일의 폭이 넓게 나타났고, 18S 및 28S rRNA 피크가 없었다. 추가로, DNase가 사용되었을 때 프로파일이 유의하게 변화되었고 (B), 이는 대부분의 추출물이 성질 면에서 DNA였음을 시사한다. 대조적으로, 도 29에 제시된 바와 같이, 동일한 소변 샘플로부터의 미세소포로부터의 RNA 프로파일은 전체 소변 추출물로부터의 프로파일과 일반적으로 매우 상이하였다. 미세소포 프로파일에는, 18S 및 28S 피크가 있었다. 또한, 미세소포로부터의 RNA가 전체 소변으로부터의 것보다 더욱 풍부하였다. DNase 처리가 없을 때의 프로파일 (A)을 DNase 처리가 있을 때의 프로파일 (B)과 비교했을 때, 미세소포로부터의 추출물의 DNase 소화는 rRNA 피크에 유의하게 영향을 미치지 않았다. 300g 펠릿 (도 30) 및 17,000g 펠릿 (도 31)으로부터의 RNA 프로파일은 전체 소변 추출물로부터의 것과 유사하였다. 이러한 프로파일 둘 다에서, DNase 처리가 없을 때의 프로파일 (A)을 DNase 처리가 있을 때의 프로파일 (B)과 비교했을 때, DNase 처리 후 피크가 실질적으로 감소되었다. 이러한 데이터는 추출물 내에서 DNA가 우세한 종이었음을 시사하였고, 18S 및 28S rRNA 피크가 검출가능하지 않았다. 따라서, 실시예 10에서의 데이터와 함께, 소변 미세소포로부터의 RNA 프로파일은 전체 소변으로부터의 프로파일보다는 신세포 프로파일과 더 유사하였다. 추가로, 미세소포로부터의 RNA 추출물의 완전성이 전체 소변으로부터의 것보다 10배 이상 더 양호하였다.
실시예
12: 소변 미세소포가
RNA
및
DNA
둘 다를 함유한다
펠릿을 먼저 RNase 및 DNase로 처리하여 자유로운 미세소포외 비-세포 오염물을 제거한 후, 칼럼 기반 핵산 단리 동안 미세소포내 핵산을 RNase 및/또는 DNase로 소화시킴으로써, 소변 미세소포가 RNA, DNA, 또는 둘 다를 함유하였는지 여부를 결정하였다. RNase 소화 (B)는 RNase 소화가 없는 것 (A)과 비교하여 핵산 프로파일을 거의 완전히 폐지시켰다 (도 32). 이러한 데이터는 RNA가 미세소포 내의 가장 풍부한 핵산을 나타낸다는 것을 시사한다. 도 33에 제시된 바와 같이, RNase로 처리된 샘플을 칼럼 상에서 DNase로 소화시킨 후 (B), 추가적인 DNase 소화 전의 피크 (A)와 비교하여 내부에서의 추가적인 DNase 소화 후에 20s 직후의 피크가 감소된다. 이러한 감소는 소량의 DNase-소화성 물질, 가능하게는 DNA가 미세소포 내에 존재하였음을 실연하였다.
실시예
13: 소변 미세소포가
네프론
및
집합관의
다양한 영역으로부터의 특이적 유전자를 코딩하는
mRNA
전사물을
함유한다
실시예 10에서 제시된 바와 같이, 애질런트 바이오애널라이저에 의해 측정된 소변 미세소포 및 신세포에서 핵산 프로파일이 유사하다. 여기에서, 미세소포가 네프론 및 집합관의 다양한 영역으로부터의 특이적 유전자를 코딩하는 mRNA 전사물을 함유한다는 것이 추가로 제시된다. 소변 미세소포를 4명의 인간 대상체 (23세 내지 32세)으로부터의 200 ㎖ 소변으로부터 단리하였고, 실시예 5에 상술된 바와 같이 RNase 및 DNase로 소화시킨 후 엑소솜을 용해시키고 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA에 리보앰프 (몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices), 캘리포니아주)를 사용하여 2회 라운드의 mRNA 증폭을 적용하였다. 시험관내 전사 단계의 제1 라운드를 위한 리보증폭(riboamplification)을 위해 샘플을 42℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였고, 제2 시험관내 전사 단계를 위해 샘플을 42℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 증폭된 RNA를 5분 동안 65℃에서 변성시키고, 퀴아젠의 옴니스크립트(Omniscript) 프로토콜 (퀴아젠, 캘리포니아주)에 기술된 바와 같이 제1 가닥 cDNA 합성에 적용하였다. GAPDH 및 베타-액틴 유전자 둘 다가 모든 샘플에서 확인되었다 (도 34A). 네프론 및 집합관의 다양한 영역 (도 34B)에 특징적인 15개의 전사물을 시험하였다. 여기에는 사구체로부터의 포도신, 근위 세관으로부터의 큐빌린 및 집합관으로부터의 아쿠아포린 2를 비롯하여 다양한 신장병에 연루되는 단백질 및 수용체가 포함되었다.
인간 샘플에 대해, 사용된 PCR 프라이머는 하기와 같았다:
"UTR"은 UTR에서 디자인된 프라이머를 지칭하고, "EX"는 엑손에 걸쳐 디자인된 프라이머를 지칭한다. PCR 프로토콜은 30 사이클 동안 94℃에서 5분, 94℃에서 40초, 55℃에서 30초, 65℃에서 1분; 및 68℃에서 4분이었다. 마우스 샘플에 대해, 사용된 프라이머는 하기와 같았다:
PCR 프로토콜은 30 사이클 동안 94℃에서 5분, 94℃에서 40초, 55℃에서 30초, 65℃에서 1분; 및 68℃에서 4분이었다.
도 34, 패널 A에 제시된 바와 같이, 리보앰프로 증폭된, 베타-액틴 및 GAPDH에 대한 mRNA 전사물이 4명의 인간 대상체로부터의 소변 미세소포에서 바이오애널라이저에 의해 생성된 슈도 젤에서 쉽게 검출가능하였다. 설명의 목적을 위해, 네프론 및 집합관의 6개의 영역이 도 34, 패널 B에서 제시된다. 소변 엑소솜으로부터의 리보앰프화 mRNA의 RT-PCR 분석의 결과로서, 6개의 영역 내의 하기의 전사물들이 또한 쉽게 검출가능하였다: 영역 1 사구체: NPHS2 - 포도신, LGALS1 - 갈렉틴-1, 및 HSPG2 - 헤파린 술페이트 프로테오글리칸 (도 35); 영역 2 근위 세관: CUBN - 큐빌린, LRP2 - 메갈린, AQP1 - 아쿠아포린 1, CA4 - 탄산 탈수효소 4, 및 CLCN5 - 클로라이드 채널 단백질 5 (도 35); 영역 3 가는 하행각: BDKRB1 - 브라디키닌 B1 수용체 (도 36); 영역 4 수질 굵은 상행각: CALCR - 칼시토닌 수용체, 및 SCNN1D - 아밀로라이드-민감성 나트륨 채널 서브유닛 델타 (도 36); 영역 5 원위 곱슬 세관: SLC12A3 - 티아지드-민감성 나트륨-클로라이드 공동수송체 (도 36); 영역 6 집합관: AQP2 - 아쿠아포린 2, ATP6V1B1 - vATPase B1 서브유닛, 및 SLC12A1 - 신장-특이적 Na-K-Cl 심포터 (도 36).
따라서, 시험된 모든 신장 영역으로부터의 mRNA 전사물이 확인될 수 있었고, 이는 mRNA를 함유하는 미세소포가 네프론 및 집합관의 모든 영역으로부터 방출되고 미세소포가 신장병에 대한 핵산 바이오마커의 신규 비-침습성 공급원일 수 있음을 시사한다.
실시예
14: 소변 미세소포 내부의 일부
mRNA
전사물이
신세포에
대해 특이적이다
미세소포 내의 핵산이 질환에서 신장 유전자를 비-침습적으로 시험하는데 사용되는 경우, 미세소포 내의 전사물이 신세포에 대해 특이적이어야 한다. 여기에서, mRNA 전사물이 신세포에 대해 특이적이라는 것이 제시된다. V-ATPase B1 서브유닛이 없는 녹아웃(knockout) 마우스가 사용되었다. V-ATPase B1 서브유닛의 부재는 마우스에서 신장 산증에 이른다 (문헌 [Finberg KE, Wagner CA, Bailey MA, et al., The B1-subunit of the H(+) ATPase is required for maximal urinary acidification. Proc Natl Acad Sci USA 102:13616-13621, 2005]).
모든 동물 실험은 매사추세츠 제네럴 호스피탈의 인가된 동물 윤리 지침에 따라 수행되었다. V-ATPase B1 서브유닛 녹아웃 동물이 문헌 [Finberg KE, Wagner CA, Bailey MA, et al. The B1-subunit of the H(+) ATPase is required for maximal urinary acidification. Proc Natl Acad Sci USA 102:13616-13621, 2005]에 기술되어 있다. 소변 수집을 위해, 2개의 군 (군 당 n = 동물 4마리)으로 72시간의 기간에 걸쳐 동물을 대사 우리에 넣어 두었고 (우리 당 1 마리의 동물을 넣어 둠으로써 충분한 RNA가 또한 수득될 수 있다), 인간 소변에 대해 상기 기술된 바와 같이 미세소포 단리 및 분석을 위해 소변을 수집하였다. 신장 추출을 위해, 펜토바르비탈 소듐 (넴부탈(Nembutal)) (애보트 래버러토리즈(Abbott Laboratories), 일리노이주) (체중 1 ㎏ 당 65 mg i.p.)을 사용하여 동물을 마취시키고, 신장을 즉각적으로 제거하고 액체 질소 내에 동결시켰다. 액체 질소 배스(bath) 내의 막자 및 막자 사발을 사용하여, 동결된 신장을 분쇄하고, RNA레이터(RNAlater) (퀴아젠, 캘리포니아주) 내에 재현탁시키고, 1 ㎖ 분취량으로 -80℃에서 보관하였다. RNA 추출을 위해, 분취량을 얼음 상에서 해동시키고, 50 ㎕을 350 ㎕ RLT 완충제 (RLT 1 ㎖ 당 10 ㎕ 베타-메르캅토에탄올이 있음)에 용해시켰다. 마우스 신장 샘플을 DNA 소화 단계가 포함된 알엔이지 미니 키트 (퀴아젠, 캘리포니아주)를 통해 프로세싱하였다.
실시간 PCR 분석을 위해, 마우스 소변 미세소포로부터 추출된 RNA를 5분 동안 65℃에서 변성시키고, 퀴아젠의 센시스크립트(Sensiscript) 프로토콜 (퀴아젠, 메릴랜드주)에 기술된 바와 같이 제1 가닥 cDNA 합성에 적용하였다. 센시스크립트 역전사를 위해, 올리고-dT 프라이머들이 1 μM의 최종 농도로 사용되었다 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 캘리포니아주). 생성된 cDNA를 14회의 예비증폭 사이클을 사용하여 제조사의 지침에 따라 택맨 프리앰프 마스터 믹스 키트(TaqMan PreAmp Master Mix Kit) (어플라이드 바이오시스템즈, 캘리포니아주)에서 사용하였다. 그 후 예비증폭 생성물을 1X TE 완충제 (프로메가, 위스콘신주)로 1:20 희석하였다. 그 후 생성된 cDNA를 택맨 프리앰프 지침 (어플라이드 바이오시스템즈, 캘리포니아주)에 따라 실시간 PCR용 주형으로 사용하였다. 마우스 신장 RNA 농도를 스마트스펙(SmartSpec) 3000 (바이오-래드(Bio-Rad), 캘리포니아주)에서 측정하고, 모든 샘플을 90 ng/㎕로 희석하였다. 마우스 신장 RNA를 5분 동안 65℃에서 변성시키고, 퀴아젠의 옴니스크립트 프로토콜 (퀴아젠, 메릴랜드주)에 기술된 바와 같이 제1 가닥 cDNA 합성에 적용하였다. 옴니스크립트 역전사에서, 올리고-dT 프라이머들이 1 μM의 최종 농도로 사용되었고 (어플라이드 바이오시스템즈, 캘리포니아주), 그 후 웰 당 1 ㎕의 생성된 cDNA가 이어지는 실시간 PCR 반응에서 사용되었다. ABI 7300 리얼 타임 PCR 시스템(Real Time PCR System) (어플라이드 바이오시스템즈, 캘리포니아주) 상에서 택맨(TaqMan) 진 익스프레션 마스터 믹스(Gene Expression Master Mix) 및 익스프레션 어세이(Expression Assays) (마우스 GAPD 파트 넘버 4352339E 및 마우스 Atp6v1b2 분석법 아이디 Mm00431996_mH)를 사용하여 실시간 PCR 반응을 수행하였다.
녹아웃 마우스로부터 신장 조직, 뿐만 아니라 소변 미세소포로부터 RNA를 추출하였다. RT-PCR을 사용하여 V-ATPase B1 서브유닛 및 아쿠아포린 2 (AQP2) mRNA의 발현을 시험하였다. 도 37, 패널 A에 제시된 바와 같이, V-ATPase B1 서브유닛 전사물이 이중 돌연변이체 마우스 (B1-/-)로부터의 신장 및 소변 미세소포 샘플 둘 다에서 검출되지 않았고, 이는 V-ATPase B1 서브유닛 유전자가 이러한 마우스에서 녹아웃되었다는 사실과 일치한다. 대조적으로, V-ATPase B1 서브유닛 전사물이 야생형 마우스 (B1/+/+)로부터의 신장 및 미세소포 샘플 내에 존재하였다. AQP2 mRNA는 B1 녹아웃 또는 야생형 마우스 둘 다로부터의 신장 및 미세소포 샘플 둘 다에서 쉽게 검출되었고, 이는 V-ATPase B1 서브유닛 결실이 AQP2의 발현에 영향을 미치지 않기 때문에 예상된다. 추가로, 도 37, 패널 B에 제시된 바와 같이, B1 녹아웃으로부터의 미세소포에서의 V-ATPase B2 서브유닛의 발현 수준이 야생형 마우스로부터의 미세소포에서의 수준과 통계적으로 상이하지 않았다. 이는 야생형 마우스로부터의 신장 세포에서의 수준과 비교했을 때 녹아웃 마우스로부터의 신장 세포에서의 V-ATPase B2 서브유닛의 발현 수준에 대해서 또한 참이었다. 그러므로, 신장 세포 내에 존재하는 전사물을 신장 세포에 의해 분비되는 소변 미세소포에서 검출할 수 있고, 신장 세포 내에 부재하는 전사물을 신장 세포에 의해 분비되는 소변 미세소포에서 검출할 수 없다. 따라서, 소변 미세소포 내의 전사물이 신세포에 대해 특이적이고, 신세포 전사물에 대한 비-침습성 바이오마커이다.
실시예
15: 소변 미세소포가 비-코딩
RNA
전사물을
함유한다
실시예 5에 상술된 상기 방법에 따라 소변 미세소포를 단리하고 핵산을 추출하였다. 소변 미세소포 RNA의 딥-시퀀싱을 수행하였고, 과도한 전사를 나타낸 특정 염색체 상의 무작위 구역이 있었음을 발견하였다. 전사물 개수 대 염색체 상의 위치를 도표화했을 때, 이러한 전사물들은 "스파이크(Spike)"로 나타났다. 이러한 전사물들은 GAPDH 또는 액틴과 같은 주지된 내인성 마커들보다 더욱 풍부하게 발현되었고, 일반적으로 염색체의 비-코딩 영역이었다. 이러한 스파이크 서열들의 비교적 높은 발현 수준은 이러한 서열들이 염색체 활성화 및 세포 조절에서 또한 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다.
500을 초과하는 스파이크가 있는 29개의 영역이 확인되었다. 29개의 영역이 도 42에서 제시되고, 서열 1-29에 상응한다. 이러한 29개의 영역에서의 도표화된 스파이크가 도 45-73에서 제시된다. 가장 고도로 발현된 스파이크 전사물들의 서열의 PCR 분석은 이들이 인간 소변 미세소포 및 인간 신장 세포 둘 다 내에 실재로 존재하였음을 실연하였고, 이는 이러한 서열들이 딥 시퀀싱의 인공물이 아니었음을 시사한다. 10개의 이같은 스파이크 풍부 영역을 증폭하는데 사용된 프라이머가 도 43에서 제시된다. 하기의 프로그램에 따라 PCR이 수행되었다: 95℃에서 8분 동안의 초기 변성; 95℃에서 40초 동안의 변성, 55℃에서 30초 동안의 어닐링(annealing), 및 65℃에서 1분 동안의 신장인 3단계 30 사이클; 68℃에서 5분 동안의 최종 신장; 반응물의 바이오애널라이저 분석 전에 4℃에서 유지시킴. 도 44에 제시된 바와 같이, 이러한 10개의 영역 각각의 증폭이 인간 소변 미세소포 (A) 및 인간 신장 세포 (B) 둘 다에서의 주형을 사용하여 양성 결과를 제공하였고, 이는 이러한 스파이크 전사물이 미세소포 및 인간 신장 세포 내에 실재로 존재하였음을 시사한다.
이러한 풍부한 스파이크 전사물들이 생물학적 샘플로부터의 핵산 추출물의 품질을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 임의의 스파이크 전사물의 양이 GAPDH 또는 ACTIN 폴리뉴클레오티드 분자와 같은 통상적인 마커 대신 소변 미세소포로부터의 핵산의 품질을 평가하는데 사용될 수 있다. 소변 미세소포 내의 GAPDH 또는 ACTIN RNA의 양은 너무 낮아서, 추가적인 증폭 단계, 예를 들어, 리보 AMP(RiboAMP)가 이의 양을 측정하기 위해 요구되었다. 대조적으로, 스파이크 전사물들 중 임의의 것의 양은 매우 높아서, 추가적인 증폭 단계가 필요하지 않았다. 그러므로, 이러한 스파이크 전사물의 사용은 핵산 추출 품질의 평가를 더욱 효율적이고 더욱 단순하게 할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 본 발명의 또 다른 측면은 생물학적 샘플, 예를 들어, 인간 소변 샘플로부터의 핵산 추출물의 품질을 평가하는 신규 방법이다. 이러한 방법은 생물학적 샘플로부터 핵산을 추출하고, 임의의 스파이크 전사물의 양을 측정하고, 이러한 양을 특정 생물학적 샘플에 대해 확립된 표준과 비교함으로써 달성될 수 있다. 확립된 이같은 표준은, 예를 들어, 숙달된 생물공학 전문가에 의해 수행된 10개의 정상인 소변 샘플로부터 추출된 이같은 스파이크 전사물의 평균량일 수 있다.
본 발명이 특정 실시양태들을 참조로 개시되었지만, 기술된 실시양태들에 대한 다양한 변형, 변경 및 변화가 첨부된 청구항에서 정의된 바와 같은 본 발명의 범위 및 범주를 벗어나지 않으면서 가능하다. 따라서, 기술된 실시양태들에 본 발명이 한정되지 않고, 본 발명의 전체 범주가 하기의 청구항의 언어 및 이의 등가물에 의해 정의되는 것으로 의도된다.
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<210> 1
<211> 376
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 1
tcatttccgg ggacagtgcc aggtggggag tttgactggg gctgtacacc tgtcaaacgg 60
taacgcaggt gtcctaaggc gagctcaggg aggacagaaa cctcccgtgg agcagaaggg 120
caaaagctcg cttgatcttg attttcagta cgaatacaga ccgtgaaagc ggggcctcac 180
gatccttctg accttttggg ttttaagcag gaggtgtcag aaaagttacc acagggataa 240
ctggcttgtg gcggccaagc gttcatagcg acgtcgcttt ttgatccttc gatgtcggct 300
cttcctatca ttgtgaagca gaattcacca agcgttggat tgttcaccca ctaataggga 360
acgtgagctg gaggtt 376
<210> 2
<211> 378
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 2
gaacctccag ctcacgttcc ctattagtgg gtgaacaatc caacgcttgg tgaattctgc 60
ttcacaatga taggaagagc cgacatcgaa ggatcaaaaa gcgacgtcgc tatgaacgct 120
tggccgccac aagccagtta tccctgtggt aacttttctg acacctcctg cttaaaaccc 180
aaaaggtcag aaggatcgtg aggccccgct ttcacggtct gtattcgtac tgaaaatcaa 240
gatcaagcga gcttttgccc ttctgctcca cgggaggttt ctgtcctccc tgagctcgcc 300
ttaggacacc tgcgttaccg tttgacaggt gtacagcccc agtcaaactc cccacctggc 360
actgtccccg gaaatgat 378
<210> 3
<211> 226
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 3
gatccgccac cgggttgaat cctccgggcg gactgcgcgg acctgaccca tttacctctt 60
aacggtttca cgccctcttg tactctctct tcaaagttct tttcaacttt cccttacggt 120
acttgttgac tatcggtctc gtgccggtat ttagccttaa atggagttta ccacccgctt 180
tgggctgcat tcccaagcaa cccgactcct ggaagacccg ggccaa 226
<210> 4
<211> 223
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 4
ttggcccggg tcttccagga gtcgggttgc ttgggaatgc agcccaaagc gggtggtaaa 60
ctccatttaa ggctaaatac cggcacgaga ccgatagtca acaagtaccg taagggaaag 120
ttgaaaagaa ctttgaagag agagtacaag agggcgtgaa accgttaaga ggtaaatggg 180
tcaggtccgc gcagtccgcc cggaggattc aacccggtgg cgg 223
<210> 5
<211> 107
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 5
gtggggaacc tggcgctaaa ccattcgtag acgacttgct tctgggtcgg ggtttcgtac 60
gtagcagagc agctccctcg ctgcgatcta ttgaaagtca gatctcc 107
<210> 6
<211> 160
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 6
cgcagacccg ctcgggggtc gcgtaactag ttagcatgcc agagtctcgt tcgttatcgg 60
aattaaccag acaaatcgct ccaccaacta agaacggcca tgcaccacca cccacggaat 120
cgagaaagag ctatcaatct gtcaatcctg tccgtaaatc 160
<210> 7
<211> 105
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 7
agatctgact ttcaatagat cgcagcgagg gagctgctct gctacgtacg aaaccccgac 60
ccagaagcaa gtcgtctacg aatggtttag cgccaggttc cccac 105
<210> 8
<211> 159
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 8
gatttacgga caggattgac agattgatag ctctttctcg attccgtggg tggtggtgca 60
tggccgttct tagttggtgg agcgatttgt ctggttaatt ccgataacga acgagactct 120
ggcatgctaa ctagttacgc gacccccgag cgggtctgc 159
<210> 9
<211> 271
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 9
aacactcagc taagagcatc gagggggcgc caagaggcaa ggggcgggga cgggcagtgg 60
ctcgcctcat ggcggactgc ccgcccgctc ccaagatcca actaggagct ttttaactgc 120
agcaacttta atatacgcta ttggagctgg aattaccgcg gctgctggca ctaaacttgc 180
cctccaatgg atcttcgtta aaggatttaa agtggactca ttccaattac aggacctcga 240
aagagtcctg tattgttatg tttcatcact a 271
<210> 10
<211> 143
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 10
gtccctctta atcatggcct cagttccata aaccaacaaa atagaaccgc ggtcctattc 60
cattattcct agctgcggta tccaggcggc ttggacctgc tttgaacact ctaatttttt 120
caaagtaaac gctttgggcc gcg 143
<210> 11
<211> 212
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 11
ccacgtaggg taggcacacg ctgagccagt cagtgtagcg cgcgtgcagt cccggacatc 60
taagggcatc acagatctgt tattgctcaa tttcgggtgg ctgaaggcca cttgtccctc 120
taagaagttg ggggacgccg accgctcggg ggtcacgtaa ctagttagca tgccagagtc 180
tcgttggtta ttggaattaa ccagacaaat ca 212
<210> 12
<211> 588
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 12
tagtgatgaa acataacaat acaggactct ttcgaggtcc tgtaattgga atgagtccac 60
tttaaatcct ttaacgaaga tccattggag ggcaagttta gtgccagcag ccgcggtaat 120
tccagctcca atagcgtata ttaaagttgc tgcagttaaa aagctcctag ttggatcttg 180
ggagcgggcg ggcagtccgc catgaggcga gccactgccc gtccccgccc cttgcctctt 240
ggcgccccct cgatgctctt agctgagtgt tccgcggccc aaagcgttta ctttgaaaaa 300
attagagtgt tcaaagcagg tccaagccgc ctggataccg cagctaggaa taatggaata 360
ggaccgcggt tctattttgt tggtttatgg aactgaggcc atgattaaga gggacagctg 420
ggggcatttg tattgcaccg ctagaggtga aattcttgga ccggcgcagt ttggaccaga 480
gtgaaagcat ttgccaagaa tgttttcatt aatcaagaat gaaagtcgga ggttcgaaga 540
cgatcagata ccgtggtagt tctgaccata aacgatgccg actggcaa 588
<210> 13
<211> 137
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 13
gatttgtctg gttaattcca ataaccaacg agactctggc atgctaacta gttacgtgac 60
ccccgagcgg tcggcgtccc ccaacttctt agagggacaa gtggccttca gccacccgaa 120
attgagcaat aacagat 137
<210> 14
<211> 266
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 14
agaatccccg ccccgcggtg gggcgcggga aatgtggcgt acggaagacc cactccccgg 60
cgccgctcgt gtggggccca agtccttctg atcgaggccc gcgacctcag atcagacgtg 120
gcgacccgct gaatttaagc atatttgtca gcggaggaaa agaaactaac caggattccc 180
tcagtaatgg cgagtgaaca gggaagagcc cagcgccgaa tccccgcccc gcggtggggc 240
gcgggaaatg tggcgtacgg aaaaat 266
<210> 15
<211> 167
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 15
atttttccgt acgccacatt tcccgcgccc caccgcgggg cggggattcg gcgctgggct 60
cttccctgtt cactcgccat tactgaggga atcctggtta gtttcttttc ctccgctgac 120
aaatatgctt aaattcagcg ggtcgccacg tctgatctga ggtcgcg 167
<210> 16
<211> 171
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 16
tgactgctgg cgatggccgg gtatgggcct gatgctccag tgccatccat tttcagggct 60
agttgattcg gcaggtgagt tgttacacac tccttagtgg attctgactt ccatggccac 120
cgtcctgctg tctatatcaa ccaacacctt ttctggggtc tgatgagcga g 171
<210> 17
<211> 164
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 17
ctcgctcatc agaccccaga aaaggtgttg gttgatatag acagcaggac ggtggccatg 60
gaagtcagaa tccactaagg agtgtgtaac aactcacctg ccgaatcaac tagccctgaa 120
aatggatggc actggagcat caggcccata cccggccatc gcca 164
<210> 18
<211> 121
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 18
cttggaataa tggaatagga ccacagttct attttgttgg ttttcggaac tgaggccatg 60
attaagaggg acggccgggg gcattcatat tgcaccgcta gaggtgaaat tcttggactg 120
g 121
<210> 19
<211> 97
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 19
gtgcagatct tggtggtagt agcaaatttt caaatgagaa ctttgaaggc cgaagtggag 60
aagggttcca tgtgaacagc agttgaacat gggtccc 97
<210> 20
<211> 245
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 20
atcgccagtt ggcatcgttt atggtcggaa ttacaacggt atctgatcgt cttcgaacct 60
ccgactttcg ttcttgatta atgaaaacat tcttggcaaa tgctttcgct ctggtctaaa 120
ctgccagtcc aagaatttca cctctagcgg tgcaatatga atgcccccgg ccgtccctct 180
taatcatggc ctcagttccg aaaaccaaca aaatagaact gtggtcctat tccattattc 240
caagc 245
<210> 21
<211> 95
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 21
gggacccatg ttcaactgct gttcacatgg aacccttctc cacttcggcc ttcaaagttc 60
tcatttgaaa atttgctact accaccaaga tctgc 95
<210> 22
<211> 216
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 22
tttgcgtgcg gccgggcgct tggcgccaga agcgagagcc cctcagggct cgcccccccg 60
cctcaccggg tcagtgaaaa aacgatcaga gtagtggtat ttcaccggcg gcccgcaggg 120
ccggcagacc ccgccctgga cccctcgcgg ggacaccggg gggcgccggg ggcctcccac 180
ttattctaca cctctcacgt ctcttcaccg tgccag 216
<210> 23
<211> 229
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 23
gcttgactct agtctggcac ggtgaagaga cgtgagaggt gtagaataag tgggaggccc 60
ccggcgcccc ccggtgtccc cgcgaggggt ccagggcggg gtctgccggc cctgcgggcc 120
gccggtgaaa taccactact ctgatcgttt tttcactgac ccggtgaggc gggggggcga 180
gccctgaggg gctctcgctt ctggcgccaa gcgcccggcc gcacgcaaa 229
<210> 24
<211> 592
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 24
tctacctacc tacctggttg atcctgccag tagcatatgc ttgtctcaaa gattaagcca 60
tgcatgtcta agtacgcacg gccggtacag tgaaactgcg aatggctcat taaatcagtt 120
atggttcctt tggtcgctcg ctcctctcct acttggataa ctgtggtaat tctagagcta 180
atacatgccg acgggcgctg acccccttcg cgggggggat gcgtgcattt atcagatcaa 240
aaccaacccg gtcagcccct ctccggcccc ggccgggggg cgggcgccgg cggctttggt 300
gactctagat aacctcgggc tgatcgcacg ccccccgtgg cggcgacgac ccattcgaac 360
gtctgcccta tcaactttcg atggtagtcg ccgtgcctac catggtgacc acgggtgacg 420
gggaatcagg gttcgattcc ggagagggag cctgagaaac ggctaccaca tccaaggaag 480
gcagcaggcg cgcaaattac ccactcccga cccggggagg tagtgacgaa aaataacaat 540
acaggactct ttcgaggccc tgtaattgga atgagtccac tttaaatcta at 592
<210> 25
<211> 670
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 25
atttaaagtg gactcattcc aattacaggg cctcgaaaga gtcctgtatt gttatttttc 60
gtcactacct ccccgggtcg ggagtgggta atttgcgcgc ctgctgcctt ccttggatgt 120
ggtagccgtt tctcaggctc cctctccgga atcgaaccct gattccccgt cacccgtggt 180
caccatggta ggcacggcga ctaccatcga aagttgatag ggcagacgtt cgaatgggtc 240
gtcgccgcca cggggggcgt gcgatcagcc cgaggttatc tagagtcacc aaagccgccg 300
gcgcccgccc cccggccggg gccggagagg ggctgaccgg gttggttttg atctgataaa 360
tgcacgcatc ccccccgcga agggggtcag cgcccgtcgg catgtattag ctctagaatt 420
accacagtta tccaagtagg agaggagcga gcgaccaaag gaaccataac tgatttaatg 480
agccattcgc agtttcactg taccggccgt gcgtacttag acatgcatgg cttaatcttt 540
gagacaagca tatgctactg gcaggatcaa ccaggtaggt aggtagagcg cggcgaggcc 600
ccgacgcggc cggacggccg gccggggggc ctcgcgagga cgggcccggc gccccgcaag 660
cgaggaggac 670
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<211> 210
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 26
gtgttgagat ttacaccctc tcccccggat tttcaagggc cagcgagagc tcaccggatg 60
ccgccagaac cgcgacgctt tccaaggcac gggcccctct ctcggggcga acccattcca 120
gggcgccctg cccttcacaa agaaaagaga actctccccg gggctcccgc cggcttctcc 180
gggatcggtc acgttaccgc actggaagaa 210
<210> 27
<211> 207
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 27
ttcttccagt gcggtaacgt gaccgatccc ggagaagccg gcgggagccc cggggagagt 60
tctcttttct ttgtgaaggg cagggcgccc tggaatgggt tcgccccgag agaggggccc 120
gtgccttgga aagcgtcgcg gttctggcgg catccggtga gctctcgctg gcccttgaaa 180
atccggggga gagggtgtaa atctcaa 207
<210> 28
<211> 94
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 28
ccgaaggtag tgagttatct caattgattg ttcacagtca gttacagatc gaactccttg 60
ttctactctt tccccccttc tcactactgc actt 94
<210> 29
<211> 99
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 29
gtcaagtgca gtagtgagaa ggggggaaag agtagaacaa ggagttcgat ctgtaactga 60
ctgtgaacaa tcaattgaga taactcacta ccttcggac 99
Claims (86)
18S rRNA 및 28S rRNA가 추출물 내에서 검출가능한, 진핵생물의 생물학적 샘플로부터 단리된 하나 이상의 미세소포로부터의 핵산 추출물.
제1항에 있어서, 생물학적 샘플이 체액인 핵산 추출물.
제2항에 있어서, 체액이 소변인 핵산 추출물.
제2항에 있어서, 체액이 혈청 또는 혈장인 핵산 추출물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 포유동물로부터의 것인 핵산 추출물.
제5항에 있어서, 생물학적 샘플이 인간으로부터의 것인 핵산 추출물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 추출물 내에서 검출가능한 18S rRNA 대 28S rRNA의 정량적 비율이 약 1:1 내지 약 1:2의 범위 내이고, 바람직하게는 약 1:2인 핵산 추출물.
제7항에 있어서, 생물학적 샘플이 소변과 같이 단백질 농도가 10 ㎎/㎖ 미만인 체액이고, 추출물의 RNA 완전성 숫자(RNA Integrity Number)가 5 이상인 핵산 추출물.
제7항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈청 또는 혈장과 같이 단백질 농도가 10 ㎎/㎖ 초과인 체액이고, 추출물의 RNA 완전성 숫자가 3 이상인 핵산 추출물.
제8항에 있어서, 20 ㎖의 생물학적 샘플로부터의 핵산 수율이 50 pg/㎖ 이상인 핵산 추출물.
제9항에 있어서, 1 ㎖의 생물학적 샘플로부터의 핵산 수율이 50 pg/㎖ 이상인 핵산 추출물.
18S rRNA 및 28S rRNA가 프로파일 내에서 검출가능한, 진핵생물의 생물학적 샘플로부터 단리된 하나 이상의 미세소포로부터의 핵산의 프로파일.
제12항에 있어서, 생물학적 샘플이 체액인 프로파일.
제13항에 있어서, 체액이 소변인 프로파일.
제13항에 있어서, 체액이 혈청 또는 혈장인 프로파일.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 포유동물로부터의 것인 프로파일.
제16항에 있어서, 생물학적 샘플이 인간으로부터의 것인 프로파일.
제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 18S rRNA 대 28S rRNA의 정량적 비율이 약 1:1 내지 약 1:2의 범위 내이고, 바람직하게는 약 1:2인 프로파일.
제18항에 있어서, 생물학적 샘플이 소변과 같이 단백질 농도가 10 ㎎/㎖ 미만인 체액이고, 핵산의 RNA 완전성 숫자가 5 이상인 프로파일.
제18항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈청 또는 혈장과 같이 단백질 농도가 10 ㎎/㎖ 초과인 체액이고, 핵산의 RNA 완전성 숫자가 3 이상인 프로파일.
제19항에 있어서, 20 ㎖의 생물학적 샘플로부터의 핵산 수율이 50 pg/㎖ 이상인 프로파일.
제20항에 있어서, 1 ㎖의 생물학적 샘플로부터의 핵산 수율이 50 pg/㎖ 이상인 프로파일.
(a) 미세소포로부터 RNA를 추출하는 단계; 및
(b) 추출물 내의 18S 및 28S rRNA의 양을 결정함으로써 RNA의 품질을 측정하는 단계
를 포함하는, 진핵생물의 생물학적 샘플로부터 단리된 미세소포로부터의 핵산 추출물의 품질을 평가하는 방법.
(b) 추출물 내의 18S 및 28S rRNA의 양을 결정함으로써 RNA의 품질을 측정하는 단계
를 포함하는, 진핵생물의 생물학적 샘플로부터 단리된 미세소포로부터의 핵산 추출물의 품질을 평가하는 방법.
제23항에 있어서, 생물학적 샘플이 체액인 방법.
제24항에 있어서, 체액이 소변인 방법.
제24항에 있어서, 체액이 혈청 또는 혈장인 방법.
제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 포유동물로부터의 것인 방법.
제27항에 있어서, 생물학적 샘플이 인간으로부터의 것인 방법.
제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 18S rRNA 대 28S rRNA의 정량적 비율이 약 1:1 내지 약 1:2의 범위 내이고, 바람직하게는 약 1:2인 방법.
제29항에 있어서, 생물학적 샘플이 소변과 같이 단백질 농도가 10 ㎎/㎖ 미만인 체액이고, 핵산의 RNA 완전성 숫자가 5 이상인 프로파일.
제29항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈청 또는 혈장과 같이 단백질 농도가 10 ㎎/㎖ 초과인 체액이고, 핵산의 RNA 완전성 숫자가 3 이상인 프로파일.
제30항에 있어서, 20 ㎖의 생물학적 샘플로부터의 핵산 수율이 50 pg/㎖ 이상인 프로파일.
제31항에 있어서, 1 ㎖의 생물학적 샘플로부터의 핵산 수율이 50 pg/㎖ 이상인 프로파일.
(a) 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
(b) 생물학적 샘플 상에서 추출 강화 공정을 수행하는 단계; 및
(c) 생물학적 샘플로부터 핵산을 추출하는 단계
를 포함하는, 생물학적 샘플로부터 핵산을 수득하는 방법.
(b) 생물학적 샘플 상에서 추출 강화 공정을 수행하는 단계; 및
(c) 생물학적 샘플로부터 핵산을 추출하는 단계
를 포함하는, 생물학적 샘플로부터 핵산을 수득하는 방법.
제34항에 있어서, 추출 강화 공정이
(a) 생물학적 샘플에 하기의 작용제들 중 하나 이상을 첨가하는 것:
(i) RNase 억제제;
(ii) 프로테아제(protease);
(iii) 환원제;
(iv) 합성 RNA와 같은 디코이(decoy) 기질;
(v) 가용성 수용체;
(vi) 소형 간섭 RNA,
(vii) 항-RNA 항체, 샤페론(chaperone) 단백질, 또는 RNase 억제 단백질과 같은 RNA 결합 분자;
(ix) 삼투압 농도가 높은 용액, 세제와 같은 RNase 변성 물질; 또는
(b) 핵산 추출 전에 하기의 단계들 중 하나 이상을 수행하는 것:
(x) 세정;
(xi) 샘플로부터 RNase를 크기-분리하는 것;
(xii) 온도 감소, 동결/해동 사이클에 의해서와 같이 물리적 변화를 통해 RNase 변성을 달성하는 것; 또는
(c) 상기 작용제들 또는 단계들의 임의의 조합
으로 구성되는 방법.
(a) 생물학적 샘플에 하기의 작용제들 중 하나 이상을 첨가하는 것:
(i) RNase 억제제;
(ii) 프로테아제(protease);
(iii) 환원제;
(iv) 합성 RNA와 같은 디코이(decoy) 기질;
(v) 가용성 수용체;
(vi) 소형 간섭 RNA,
(vii) 항-RNA 항체, 샤페론(chaperone) 단백질, 또는 RNase 억제 단백질과 같은 RNA 결합 분자;
(ix) 삼투압 농도가 높은 용액, 세제와 같은 RNase 변성 물질; 또는
(b) 핵산 추출 전에 하기의 단계들 중 하나 이상을 수행하는 것:
(x) 세정;
(xi) 샘플로부터 RNase를 크기-분리하는 것;
(xii) 온도 감소, 동결/해동 사이클에 의해서와 같이 물리적 변화를 통해 RNase 변성을 달성하는 것; 또는
(c) 상기 작용제들 또는 단계들의 임의의 조합
으로 구성되는 방법.
제34항 또는 제35항에 있어서, 생물학적 샘플이 체액인 방법.
제36항에 있어서, 체액이 소변인 방법.
제36항에 있어서, 체액이 혈청 또는 혈장인 방법.
제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 유도체가 생물학적 샘플로부터 수득되고, 핵산 추출 전에 추출 강화 공정에 적용되는 방법.
제39항에 있어서, 유도체가 생물학적 샘플로부터의 미세소포 분획인 방법.
제40항에 있어서, 미세소포 분획이 분별 원심분리, 친화성 정제, 여과 농축, 부력 밀도 구배, 미세유체 분리, 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환, 및 상기의 것들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 기술에 의해 수득되는 방법.
제41항에 있어서, 미세소포 분획이 여과 농축 기술에 의해 수득되는 방법.
제42항에 있어서, 생물학적 샘플이 기공 크기가 0.8 ㎛ 이하인 필터에 통과되는 방법.
제34항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플 또는 유도체가 추출 강화 공정의 수행 전에 리보뉴클레아제 (ribonuclease), 데옥시리보뉴클레아제 (deoxyribonuclease), 또는 이들의 조합으로 처리되는 방법.
제32항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 추출 강화 공정이 핵산을 추출하기 전에 생물학적 샘플 또는 유도체에 RNase 억제제를 첨가하는 것을 포함하는 방법.
제45항에 있어서, RNase 억제제의 농도가 [1X] 농도 초과이거나, 다르게는 [5X] 농도 이상이거나, 다르게는 [10X] 농도 이상이거나, 다르게는 [25X] 농도 이상이거나, 다르게는 [50X] 농도 이상인 방법.
제45항 또는 제46항에 있어서, RNase 억제제가 프로테아제인 방법.
(a) 핵산 추출 강화제;
(b) DNase, RNase, 또는 둘 다; 및
(c) 용해 완충제
를 하나 이상의 용기 내에 포함하는, 미세소포로부터 핵산을 수득하기 위한 키트.
(b) DNase, RNase, 또는 둘 다; 및
(c) 용해 완충제
를 하나 이상의 용기 내에 포함하는, 미세소포로부터 핵산을 수득하기 위한 키트.
제48항에 있어서, 키트를 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함하는 키트.
제48항 또는 제49항에 있어서, 핵산 추출 강화제가
(a) RNase 억제제;
(b) 프로테아제;
(c) 환원제;
(d) 디코이 기질;
(e) 가용성 수용체;
(f) 소형 간섭 RNA;
(g) RNA 결합 분자;
(h) RNase 변성 물질; 또는
(i) 상기의 것들 중 임의의 것의 임의의 조합
으로 구성된 군으로부터 선택되는 키트.
(a) RNase 억제제;
(b) 프로테아제;
(c) 환원제;
(d) 디코이 기질;
(e) 가용성 수용체;
(f) 소형 간섭 RNA;
(g) RNA 결합 분자;
(h) RNase 변성 물질; 또는
(i) 상기의 것들 중 임의의 것의 임의의 조합
으로 구성된 군으로부터 선택되는 키트.
(a) 미세소포의 샘플을 수득하는 단계;
(b) 샘플을 DNase로 처리하여 샘플 내의 미세소포의 외부 또는 표면에 위치하는 임의의 DNA를 모두 또는 실질적으로 모두 제거하는 단계;
(c) 샘플로부터 RNA를 추출하는 단계; 및
(d) 추출된 RNA를 분석하는 단계
를 포함하는, 미세소포로부터의 RNA를 분석하는 방법.
(b) 샘플을 DNase로 처리하여 샘플 내의 미세소포의 외부 또는 표면에 위치하는 임의의 DNA를 모두 또는 실질적으로 모두 제거하는 단계;
(c) 샘플로부터 RNA를 추출하는 단계; 및
(d) 추출된 RNA를 분석하는 단계
를 포함하는, 미세소포로부터의 RNA를 분석하는 방법.
제51항에 있어서, 미세소포가 생물학적 샘플로부터 단리된 방법.
제52항에 있어서, 생물학적 샘플이 체액인 방법.
제53항에 있어서, 체액이 소변인 방법.
제53항에 있어서, 체액이 혈청 또는 혈장인 방법.
제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 포유동물로부터의 것인 방법.
제56항에 있어서, 생물학적 샘플이 인간으로부터의 것인 방법.
(a) 대상체로부터의 소변 샘플로부터 미세소포 분획을 단리하는 단계;
(b) 미세소포 분획 내의 바이오마커(biomarker)의 존재 또는 부재를 검출하는 단계
를 포함하고,
이때 바이오마커가 (i) 핵산의 종, (ii) 핵산의 발현 수준, (iii) 핵산 변이체, 및 (iv) 상기의 것들 중 임의의 것의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, 바이오마커가 질환 또는 기타 의학적 상태의 존재 또는 부재, 또는 치료 선택권의 가능성과 관련되는 것인,
대상체를 진단, 모니터링 또는 치료하는 방법.
(b) 미세소포 분획 내의 바이오마커(biomarker)의 존재 또는 부재를 검출하는 단계
를 포함하고,
이때 바이오마커가 (i) 핵산의 종, (ii) 핵산의 발현 수준, (iii) 핵산 변이체, 및 (iv) 상기의 것들 중 임의의 것의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, 바이오마커가 질환 또는 기타 의학적 상태의 존재 또는 부재, 또는 치료 선택권의 가능성과 관련되는 것인,
대상체를 진단, 모니터링 또는 치료하는 방법.
제58항에 있어서, 바이오마커가 mRNA 전사물인 방법.
제59항에 있어서, mRNA 전사물이 NPHS2 (포도신(podocin)), LGALS1 (갈렉틴(Galectin)-1), HSPG2 (헤파린 술페이트 프로테오글리칸); CUBN (큐빌린(cubilin)), LRP2 (메갈린(megalin)), AQP1 (아쿠아포린(aquaporin) 1), CA4 (탄산 탈수효소 4), CLCN5 (클로라이드 채널 단백질 5), BDKRB1 (브라디키닌(bradykinin) B1 수용체), CALCR (칼시토닌(calcitonin) 수용체), SCNN1D (아밀로라이드-민감성 나트륨 채널 서브유닛 델타), SLC12A3 (티아지드-민감성 나트륨-클로라이드 공동수송체), AQP2 (아쿠아포린 2), ATP6V1B1 (V-ATPase B1 서브유닛), SLC12A1 (리보앰프화(RiboAmped) mRNA의 RT-PCR을 통한 신장-특이적 Na-K-Cl 심포터(symporter))로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제60항에 있어서, mRNA 전사물이 AQP2 (아쿠아포린 2) 또는 ATP6V1B1 (V-ATPase B1 서브유닛)인 방법.
제58항에 있어서, 바이오마커, 및 질환 또는 기타 의학적 상태가
(a) NPHS2 (포도신) 및 사구체 질환, 예컨대 스테로이드-저항성 신염 증후군;
(b) CUBN (큐빌린), 및 이머스룬트-그래스베크(Imerslund-Graesbeck) 증후군과 같은 단백뇨;
(c) AQP2 (아쿠아포린 2), 및 요붕증
으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
(a) NPHS2 (포도신) 및 사구체 질환, 예컨대 스테로이드-저항성 신염 증후군;
(b) CUBN (큐빌린), 및 이머스룬트-그래스베크(Imerslund-Graesbeck) 증후군과 같은 단백뇨;
(c) AQP2 (아쿠아포린 2), 및 요붕증
으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
서열 1-29로 구성된 군으로부터 선택된 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 90％ 이상 동일한 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
제63항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 분자가 데옥시리보뉴클레오티드인 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
제63항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 분자가 리보뉴클레오티드인 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
제63항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
제63항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
서열 1-29로부터 선택된 뉴클레오티드 서열의 절편을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제68항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 분자가 데옥시리보뉴클레오티드인 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
제68항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 분자가 리보뉴클레오티드인 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
제68항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
제68항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
서열 1-29 중 임의의 서열 내의 임의의 13-뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 13개 이상의 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제73항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 분자가 데옥시리보뉴클레오티드인 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
제79항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 분자가 리보뉴클레오티드인 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
제73항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
제73항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
a. 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
b. 생물학적 샘플로부터 핵산의 추출물을 수득하는 단계;
c. 추출물 내의 서열 1-29로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 절편을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자의 양을 측정하는 단계; 및
d. 폴리뉴클레오티드 분자의 양을 표준과 비교하여 핵산 추출물의 품질을 평가하는 단계
를 포함하는, 생물학적 샘플로부터의 핵산 추출물의 품질을 평가하는 방법.
b. 생물학적 샘플로부터 핵산의 추출물을 수득하는 단계;
c. 추출물 내의 서열 1-29로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 절편을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자의 양을 측정하는 단계; 및
d. 폴리뉴클레오티드 분자의 양을 표준과 비교하여 핵산 추출물의 품질을 평가하는 단계
를 포함하는, 생물학적 샘플로부터의 핵산 추출물의 품질을 평가하는 방법.
제78항에 있어서, 생물학적 샘플이 체액인 방법.
제78항에 있어서, 체액이 소변인 방법.
제78항에 있어서, 체액이 혈청 또는 혈장인 방법.
제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 포유동물로부터의 것인 방법.
제82항에 있어서, 생물학적 샘플이 인간으로부터의 것인 방법.
제78항에 있어서, 추출물이 제1항의 추출물인 방법.
제78항에 있어서, 추출물이 제34항의 방법으로 수득되는 방법.
제78항에 있어서, 5개를 초과하는 생물학적 샘플로부터의 핵산 추출물 내의 서열 1-29로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 절편을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자의 양을 측정하는 것에 의해 표준이 유래되는 방법.
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