JP5755326B2 - 腎機能の特徴を決定する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2010年6月11日に提出された米国仮出願第61/354,098号の利益を主張するものであり、この仮出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする。
発明の分野
本開示は、腎機能の特徴を決定する方法に関する。いくつかの実施形態は、腎疾患の診断に関し、より具体的には、本開示は、腎機能の特徴を決定するために、小胞中に含まれる腎臓関連RNAを定量化することにより特徴を決定するという分野に関する。
多くの場合、医師は、患者の症状、病歴、および身体検査の結果を解釈して、最初の診断を導く。医学的検査は、最初の診断の確認または変更の、欠かせない部分である。現在、健康な患者には存在しない生化学的パターンまたは以前に採取した患者試料から変化した生化学的パターンから疾患を決定するために、患者から抽出された血液に対していくつかの診断医学的検査が行われている。これらの検査では、一般に血漿または血清が利用され、例えば電解質、尿素、クレアチニン、およびグルコースが測定される。他の検査では、血漿タンパク質、例えばアルブミン、免疫グロブリン、フィブリノーゲン、および制御タンパク質などが測定される。さらに他の検査では、他の生物学的化合物、例えばチアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンB6、葉酸、ビタミンD、ビオチン、鉄、ならびに凝固因子である第V因子、および第X因子などが測定される。
これらの必要性に基づき、本明細書において、RNAに関連する小胞を含む尿の試料を患者から採取すること、前記小胞を前記試料から捕捉すること、前記小胞を溶解させて、腎機能に関連するRNAを含む前記小胞関連RNAを放出させること、前記腎機能に関連するRNAを定量化すること;および前記患者からの前記腎機能に関連するRNAの量を、正常な腎機能を有する個体からの対応するRNAの量と比較することを含む、腎機能の特徴を決定する方法であって、前記患者と前記個体との間の前記腎機能に関連するRNAの量の差が、前記患者の腎機能の変化を示す方法、が提供されている。
球体を含む。いくつかの実施形態においては、前記腎臓の特定の領域は近位尿細管を含む。いくつかの実施形態においては、前記腎臓の特定の領域は遠位尿細管を含む。
一般
医師の診断は、典型的には、現在の症状に基づくものであるのはもちろんのこと、患者の病歴に基づくものでもある。基礎疾患の徴候を明らかにする可能性のある身体検査に加え、最初の診断を確認するために、診断検査が発注されることもある。腎機能の評価によって、臓器の尿を産生する機能として、診断分析のための独特な状況が提供され、その結果の構成は、血液中の化合物の濃度変化に伴って反映される。よって、腎機能は、尿および/または血液の2種類の流体を用いて評価することができる。
て尿中に存在する。
本明細書において開示されているいくつかの実施形態においては、患者体液の試料からのRNAの捕捉および疾患および/または組織特異的マーカーについてのそのRNAのその後の分析のための方法が提供されている。いくつかの実施形態において当該方法は、RNAに関連する小胞の、患者尿試料からの単離を含む。他の実施形態においては、小胞は、血漿、血清、脳脊髄流体、痰、唾液、粘液、涙等から得る。多くの診断検査は、小量の患者流体試料を使用することを中心に設計され、またいくつかの実施形態においては、少量(例えば15〜50mLの尿)を用いる。しかしながら、いくつかの実施形態では、大量の患者尿が容易に利用可能であるため、特に有利である。
ヒトの腎臓は、通常、豆形の構造を有し、各腎臓は凹状表面と凸状表面とを有する。腎門は、凹状表面であり、また、腎臓に腎動脈が入り、腎静脈と尿管とが出る箇所である。腎臓の内部の解剖学的構造は、2つの主要構造(組織型)、腎皮質(表面領域)、および腎髄質(より内部の領域)に分けられる。腎臓の機能単位であるネフロンは皮質と髄質とにまたがる。ネフロンの最初の濾過部は、皮質中に位置する腎小体であり、その後に皮質から髄質深くへと通過する腎尿細管が続く。
またはモニターするために用いられる。
いるが、それらの早期症状は彼らの生活または健康の他の局面に関連しているとして忘れられてしまう。例えば、食後の吐き気は、この症状が実際には血中グルコースレベルの上昇に起因する場合であっても、胸やけとして無視される可能性がある。長期にわたるこうした症状の無視は、実際の診断の前に、他の症状の中でもとりわけ極端な腎臓損傷につながる可能性がある。いくつかの実施形態においては、本明細書において開示されている方法は、不可逆的腎臓損傷を既に受けるほど症状が重篤になる前に、糖尿病に起因する腎臓損傷の早期マーカーを検出するために、定期身体検査において行うことができる。
試料またはその後の試料を、その患者から回収し、特異的RNAのレベルを決定する。よって、患者の腎臓における変化は、第一試料RNAレベルを第二試料RNAレベルと比較することによって決定してもよく、またはこれら試料を対照または標準と比較することによって決定してもよい。いくつかの実施形態においては、第一および/または第二患者試料の回収の前または後に、患者に薬が投与されていてもよい。いくつかの実施形態においては、当該薬は、薬剤、栄養補助食品、ビタミン、免疫抑制剤、抗炎症剤、麻酔薬もしくは鎮痛薬、幹細胞、移植片または腎臓移植であってもよい。いくつかの実施形態においては、当該モニタリングは、患者の、例えばカロリー摂取量の減少などの栄養の変化、または増加した水分補給、または運動ルーチンの変化、または睡眠パターンの変化に関するものであってもよい。
遊離の細胞外RNAは、ヌクレアーゼによって急速に分解され、このヌクレアーゼが、当該RNAを潜在的に乏しい診断マーカーにしている。上述したように、いくらかの細胞外RNAは、尿中にみられる粒子または小胞に関連する。mRNAを含むこの小胞関連RNAは、尿における分解プロセスから保護される。微小胞は、ほとんどの細胞型から抜け落ちるものであり、また細胞膜の断片からなるものである。微小胞は、RNA、mRNA、マイクロRNA、およびタンパク質を含有するものであり、またそれらが抜け落ちる際の起源となる細胞の組成を反映するものである。エキソソームは、広い範囲の哺乳類細胞により分泌される小さな微小胞であり、また正常条件および病的条件の下で分泌される。これらの小胞は、特定のタンパク質、ならびにmRNAおよびマイクロRNAなどのRNAを含有する。また、エキソソームは腎臓によって尿中へ放出され得るので、それらの検出は本明細書におけるいくつかの実施形態において記載されているように、診断ツールとして役立つ可能性がある。エキソソーム様小胞は、尿の他にも多くの体液にもみられ、とりわけ血液、腹水、および羊水などが挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸が評価され、とりわけ低分子干渉RNA(siRNA)、tRNA、および低分子活性化RNA(saRNA)などが挙げられる。
5号、第11/376,018号、第11/803,593号、第11/803,594号、および第11/803,663号により詳細に記載されており、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする。
算出される。いくつかの実施形態においては、当該基準値は、病気でない健康な患者にみられるmRNAの量である。他の実施形態においては、当該基準値はハウスキーピング遺伝子の発現レベルである。特定のこのような実施形態においては、ベータ−アクチンまたは他の適切なハウスキーピング遺伝子が、当該基準値として用いられる。また、当該分野においてよく知られている多数の他のハウスキーピング遺伝子を、基準値として用いてもよい。他の実施形態においては、最終的な比較が、病気の患者からのマーカーの発現レベルの、病気でない(対照)試料からの同じマーカーの発現レベルとの比較となるように、ハウスキーピング遺伝子を補正因子として用いる。いくつかの実施形態においては、当該ハウスキーピング遺伝子は、組織特異的遺伝子またはマーカー、例えば上記で検討したものなどである。さらに他の実施形態においては、当該基準値は、マーカーの定量化が絶対数により表されるようにゼロである。いくつかの実施形態においては、病気の患者からの1種類以上のマーカーの発現を、病気でない人からの1種類以上の他のマーカーの発現と比較する割合が作成される。
潜在的に大量の患者尿試料の入手のしやすさを考慮すると、診断試料として尿を使用するのは一般的である。現在のほとんどの診断検査では、腎機能または損傷もしくは疾患に起因するその喪失の特徴を決定するために、尿中に排出される溶質が測定されるか、または尿生産速度が測定される。しかしながらここでは、RNA種に関連する尿中に存在する小胞の存在を利用して、高感度かつ特異的な腎機能の診断分析を腎臓特異的マーカーの単離および増幅に基づいて行う。
3人の健康なドナーからのヒト尿試料(各3つずつ)を、真空圧を印加しながら(上述したような)小胞捕捉フィルタープレートのフィルター膜に対して添加し、その後2000×gで5分間遠心を行った。遠心後、50μLの溶解緩衝液を各ウェルに加え、次いでそれを37℃にて10分間インキュベートして、小胞を溶解させた。当該溶解緩衝液に、5nMの標的遺伝子のリバースプライマーおよび/またはアンチセンスプライマーを追加した。プライマー配列を表1に示す。当該溶解緩衝液には、所望により、対照として働く
合成RNAも追加した。次いで、このフィルタープレートを、96ウェルオリゴ(dT)固定化プレート(GENEPLATE(登録商標))上に置き、小胞溶解物をこのGENEPLATE(登録商標)へと移動させるために2,000×gで5分間遠心した。遠心後、このGENEPLATE(登録商標)を、オリゴ(dT)とmRNAのポリAテールとの間のハイブリダイゼーションのために、冷蔵庫に一晩入れた。次いで、このGENEPLATE(登録商標)を、150μLの洗浄緩衝液(0.5M NaCl、10mM Tris(pH7.4)、1mM EDTA)で6回洗浄した。1.25mMの各デオキシヌクレオシド三リン酸、4ユニットのrRNasin、および80UのMMLV逆転写酵素を追加した、30μLの逆転写緩衝液(50mM KCl、10mM Tris−HCl(pH8.3)、5.5mM MgCl2、0.1% Tween20)を各ウェル
へ添加して、37℃にて2時間でcDNAを合成した。
図1Aに示されるように、対照遺伝子(β−アクチン、ACTB)および図1Bの腎臓特異的遺伝子(溶質キャリアファミリー12A1(SLC12A1、ナトリウム・カリウム・塩化物トランスポーター))は、100μLの全尿から、用量依存的に検出された。100μLと1000μLとの間(10倍)のデルタCtは、およそ3(23=8倍)で
あった。これは、理論値の範囲内である。これらの結果が示しているのは、本明細書に記載されている方法の実施形態によって、使用可能なRNAは尿小胞から得ることができるということである。全粗尿を用いた場合は、細胞残屑が存在するため、各フィルタープレートウェルに添加可能な最大尿量はおよそ1mLであった。しかしながら、尿試料を当該フィルタープレートに(ペレット細胞残屑に)加えるよりも前に、2000×gで15分間遠心した場合には、20mLを超える上清をフィルタープレートに添加することができた(データ不掲載)。よって、大量の尿は容易に入手可能かつ処理可能であるため、いくつかの実施形態は尿に対して特に有用である。
CRの結果は、非凍結新鮮尿試料の結果と類似していた。さらに、凍結−解凍サイクルの回数は、mRNA分析に影響を与えなかった(図3B)。また、粗尿を、遠心して細胞分画を除去しておいた尿と比較した。尿の2,000×g上清中のmRNAの量は、粗尿のそれよりもわずかに低かったが(図3C)、mRNAは尿の非細胞分画中においてはっきりと検出され、それにより尿の非細胞分画から単離された小胞はRNA分析に使用することができるということが示された。
上記に提示されているデータは、患者尿試料中に存在する小胞から単離すれば、RNAは、単離でき、処理でき、そして首尾よく遺伝子発現を評価することができるということを示す。この実験において使用したマーカーの組織発現プロファイルの特徴を決定するために、組織特異的な(体全体の)発現データを表2にまとめた。
れは、太い上行脚において、ナトリウム・塩化物再吸収の程度が大きいことの説明となる。さらに、これは、例えばフロセミドおよびブメタニドなどの特定の利尿薬、高血圧の治療の際に用いられる薬剤に対して感度がある。よって、いくつかの実施形態においては、SLC12A1の発現の検出変化は、変化した塩バランス、降圧療法に起因する腎臓の機能の変化または腎臓に対する損傷等を示すものである可能性がある。いくつかの実施形態においては、これは、SLC12A1の変化が、認識可能な症状があらわれるよりずっと前に特定の治療に対するそれぞれの患者の感受性を同定するのを助ける可能性があるため、特に有利である。よって、いくつかの実施形態においては、SLC12A1発現のバリエーションは、特定の腎疾患、疾患の段階、および/または治療に対する応答性により様々である(また、これらに相関し得る)。
尿試料は、10人の健康な成人のドナー(1人のドナーから3つの異なる試料、計12試料)および68人の腎臓移植後の患者から採集した。移植後の患者を、血清クレアチニンの値によってさらに分類した(28人の患者は≦1.2mg/dLであり、40人の患者は>1.2mg/dLであった)。クレアチニンは、腎臓によって濾過(かつ血流から除去)されるべき筋肉分解老廃物であるため、血清クレアチニンは、一般に使用される腎機能の尺度である。正常血清クレアチニンレベルは、約0.8〜約1.2mg/dLの範囲である。上昇したクレアチニンレベルは、腎機能の低下(例えば、低下した濾過効率)を示す。尿試料を、上述したように処理した。
性があり、損なわれた尿細管構造または機能亢進のいずれも、結果として尿エキソソームからのアルブミンの過剰な除去をもたらし得るであろう。
Claims (29)
- 患者から採取した、RNAに関連する小胞を含む尿の試料を用意すること;
小胞捕捉材料は、ガラス繊維の、少なくとも第一層および第二層を含み、
直径が1.6ミクロン以上である前記尿からの小胞を捕捉するために、前記尿を、前記ガラス繊維の第一層に通過させること、および/または、
直径の最小サイズが0.6ミクロン〜0.8ミクロンであり、かつ、最大サイズが1.6ミクロン未満である小胞を捕捉するために、前記尿を、前記ガラス繊維の第二層に通過させること;
前記小胞を溶解させて、腎機能に関連するRNAを含む前記小胞に関連するRNAを放出させること;
前記腎機能に関連するRNAを定量化すること;および
前記患者からの前記腎機能に関連するRNAの量を、正常な腎機能を有する個体からの対応するRNAの量と比較すること;
を含み、超遠心することを含まない、腎機能の特徴を決定する方法であって、前記患者と前記個体との間の前記腎機能に関連するRNAの量の差が、前記患者の腎機能の変化を示す、方法。 - 前記小胞を前記試料から捕捉することは、前記尿を濾過することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記濾過により、前記小胞がフィルター上に捕集される、請求項2に記載の方法。
- 前記小胞が前記フィルター上に捕集されている間に、前記溶解が行われる、請求項3に記載の方法。
- 細胞残屑を除去するために前記試料を遠心することをさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遠心が、前記小胞を捕捉することよりも前に行われる、請求項5に記載の方法。
- 前記小胞を捕捉することは、前記遠心した尿の上清を濾過することをさらに含む、請求項5または6に記載の方法。
- 前記定量化することは、PCRを用いて前記腎機能に関連するRNAを増幅することを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記腎機能が、腎臓損傷に起因して変化する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記腎臓損傷が、糸球体に対する損傷、内皮に対する損傷、近位尿細管に対する損傷、ヘンレ係蹄に対する損傷、遠位尿細管に対する損傷、集合管に対する損傷、および尿管に対する損傷の1つ以上を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記腎機能が、腎臓に入る血流または腎臓から出る血流の変化に起因して変化する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記腎機能が、疾患に起因して変化する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患が、慢性腎疾患、急性腎不全、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、糸球体硬化症、巣状分節性糸球体硬化症、膜性腎症、微小変化群、ならびにアテローム性動脈硬化症、高血圧、心血管疾患、肥満症、高コレステロール血症、糖尿病、膠原病、自己免疫疾患、および感染症のいずれかである他の疾患に続発する腎疾患、からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記腎機能が、前記患者への薬理学的物質の投与に起因して変化する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬理学的物質が、疾患を治療するために前記患者へと投与される、請求項14に記載の方法。
- 前記腎機能に関連するRNAは、腎臓の特定の領域から採取されたものである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記腎機能に関連するRNAが、腎臓の特定の領域の機能に関連する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記腎臓の特定の領域が糸球体を含む、請求項16または請求項17に記載の方法。
- 前記腎臓の特定の領域が近位尿細管を含む、請求項16または請求項17に記載の方法。
- 前記腎臓の特定の領域が遠位尿細管を含む、請求項16または請求項17に記載の方法。
- 前記腎機能に関連するRNAがポドシンをコードする、請求項18に記載の方法。
- 前記腎機能に関連するRNAが、SLC12A1、UMOD、およびアルブミンからなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項19に記載の方法。
- 前記腎機能に関連するRNAがAQP9をコードする、請求項20に記載の方法。
- 前記腎機能に関連するRNAが、SLC12A1、UMOD、vWF、MMP1、MMP3、SLC22A6、SLC22A8、SLC22A12、ポドシン、キュビリン、LRP2、AQP9、およびアルブミンからなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記腎機能に関連するRNAがSLC12A1をコードする、請求項24に記載の方法。
- 前記小胞が、
(a)前記尿の試料の少なくとも一部を小胞捕捉デバイスの試料装填領域中へ装填すること;
(b)前記尿を前記試料装填領域から前記小胞捕捉デバイス中の前記小胞捕捉材料を通過させ、上清を得ること;ならびに
(c)前記上清を前記小胞捕捉デバイスの試料受け取り領域へと通過させることおよびその上清を捨てること、
を含む方法により単離される、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法であって、
前記通過の結果として前記小胞捕捉材料上または前記小胞捕捉材料中の前記尿試料からの前記小胞の捕捉がもたらされ、それにより前記小胞が捕捉される、方法。 - 患者から採取した、細胞残屑およびRNAに関連する小胞を含む尿の試料を用意すること;
小胞捕捉材料は、ガラス繊維の、少なくとも第一層および第二層を含み、
直径が1.6ミクロン以上である前記尿からの小胞を捕捉するために、前記尿を、前記ガラス繊維の第一層に通過させること、および/または、
直径の最小サイズが0.6ミクロン〜0.8ミクロンであり、かつ、最大サイズが1.6ミクロン未満である小胞を捕捉するために、前記尿を、前記ガラス繊維の第二層に通過させること;
前記小胞を溶解させて、腎機能に関連するRNAを含む溶解物を得ること;ならびに
前記腎機能に関連するRNAを定量化すること;
を含み、超遠心することを含まない、核酸に基づき腎機能の変化を検出する方法であって;
尿中に通常みられる量と比較した、前記尿試料からの前記RNAの量の増加または減少が、前記患者における変化した腎機能と相関する、方法。 - 患者から採取した、RNAに関連する小胞を含む少なくとも2つの尿の試料を用意すること;
小胞捕捉材料は、ガラス繊維の、少なくとも第一層および第二層を含み、
直径が1.6ミクロン以上である前記尿からの小胞を捕捉するために、前記尿を、前記ガラス繊維の第一層に通過させること、および/または、
直径の最小サイズが0.6ミクロン〜0.8ミクロンであり、かつ、最大サイズが1.6ミクロン未満である小胞を捕捉するために、前記尿を、前記ガラス繊維の第二層に通過させること;
前記小胞を溶解させて、腎機能に関連するRNAおよび腎機能に応じて変化しないRNAを含む前記小胞に関連するRNAを放出させること;
前記腎機能に関連するRNAおよび前記腎機能に応じて変化しないRNAを定量化すること;ならびに
前記患者からの前記腎機能に関連するRNAの量と腎機能に応じて変化しないRNAの量との間の割合を決定すること;
を含み、超遠心することを含まない、腎機能の特徴を決定する方法であって、
前記2つ以上の尿試料の間の割合における差が、前記患者の腎機能の変化を示す、方法。 - 前記腎機能に応じて変化しないRNAが、ベータ−アクチンまたはベータ−2−ミクログロブリンのいずれか1つのタンパク質をコードする、請求項28に記載の方法。
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