ES2471978T3 - Compuestos y procedimientos para modular la expresión de ApoB - Google Patents

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Eric E. Swayze
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Abstract

Un compuesto antisentido corto de 10 a 14 monómeros de longitud, que comprende una región salto de 2'- desoxirribonucleótido flanqueada por cada lado por un ala, en el que cada ala comprende de forma independiente 1 a 3 monómeros modificados de alta afinidad que son nucleótidos modificados con azúcar que comprenden un puente entre la posición 4' y 2' del azúcar, y en el que el compuesto antisentido corto está dirigido a un ácido nucleico que codifica ApoB para uso en terapia.

Description

Compuestos y procedimientos para modular la expresión de ApoB
ANTECEDENTES
La elección como diana de secuencias de genes causantes de enfermedad se sugirió por primera vez hace casi 40 años (Belikova et al., Tet. Lett., 1967, 37, 3557-3562), y la actividad antisentido se demostr� en cultivo celular una década después (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1978, 75, 280-284). Una ventaja de la tecnología antisentido en el tratamiento de una enfermedad o afección que procede de un gen causante de enfermedad es que es un enfoque genético directo que tiene la capacidad para modular la expresión de genes causantes de enfermedad específicos.
En general, el principio detrás de la tecnología antisentido es que un compuesto antisentido se hibrida con un ácido nucleico diana y afecta la modulación de la actividad o función de la expresión g�nica, tal como transcripción, traducción o corte y empalme. La modulación de la expresión g�nica puede lograrse, por ejemplo, por degradación de diana o inhibición basada en la ocupación. Un ejemplo de la modulación de la función diana del ARN por degradación es la degradación basada en RNasa H del ARN diana tras la hibridación con un compuesto antisentido similar a ADN. Otro ejemplo de la modulación de la expresión g�nica por degradación diana es ARN interferente (ARNi). El ARNi es una forma de silenciamiento de genes mediado por antisentido que implica la introducción de ARNbc que conduce a la reducción específica de secuencia de niveles de ARNm end�geno elegido como diana. La especificidad de secuencia hace que los compuestos antisentido sean extremadamente atractivos como herramientas para elegir como diana la validación y la funcionalizaci�n g�nica, además de herramientas de investigación para identificar y caracterizar nucleasas y como agentes terapéuticos para modular selectivamente la expresión de genes que participan en la patog�nesis de una cualquiera de una variedad de enfermedades.
La tecnología antisentido es un medio eficaz para reducir la expresión de uno o más productos g�nicos específicos y, por tanto, se puede demostrar que son útiles únicamente en una serie de aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y de investigación. Los nucle�sidos químicamente modificados se usan rutinariamente para la incorporación en compuestos antisentido para potenciar una o más propiedades tales como resistencia a nucleasas, farmacocin�tica o afinidad por un ARN diana.
A pesar de la expansión del conocimiento desde el descubrimiento de la tecnología antisentido, queda sin satisfacer una necesidad de compuestos antisentido con mayor eficacia, toxicidad reducida y menor coste. Hasta la presente descripción no se han empleado modificaciones de alta afinidad en el diseño de compuestos antisentido cortos para reducir ARN diana in vivo. Esto es debido a asuntos referentes al grado de especificidad diana que tendría una secuencia de 15 nucleótidos o más corta cuando se empleara para reducir la diana en un sistema vivo. Estudios previos han descrito que se logra mayor especificidad y, por tanto, mayores posibilidades de potencia, por compuestos antisentido de entre 16 y 20 bases nucleot�dicas de longitud.
El documento WO 2004/044181 (ISIS PHARMACEUTICALS, INC.) describe compuestos antisentido, composiciones y métodos para modular la expresión de la apolipoprote�na B.
La presente descripción describe que la incorporación de nucleótidos de alta afinidad químicamente modificados en compuestos antisentido permite que compuestos antisentido cortos de aproximadamente 8-16 bases nucleot�dicas de longitud sean útiles en la reducción de ARN diana en animales con aumento de la potencia y mejora del índice terapéutico. Por tanto, se proporcionan aquí compuestos antisentido cortos que comprenden modificaciones de nucleótidos de alta afinidad útiles para reducir un ARN diana in vivo. Tales compuestos antisentido cortos son eficaces a dosis inferiores a las de los compuestos antisentido previamente descritos, permitiendo una reducción en la toxicidad y el coste del tratamiento.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona un compuesto antisentido corto de 10 a 14 mon�meros de longitud, que comprende una región de salto en 2’-desoxirribonucle�tido flanqueada por cada lado por un ala, en la que cada ala comprende independientemente de 1 a 3 mon�meros modificados de alta afinidad que son nucleótidos modificados con azúcar que comprenden un puente entre la posición 4’ y 2’ del azúcar, y en el que el compuesto antisentido est� dirigido a un ácido nucleico que codifica ApoB para uso en terapia.
La invención también proporciona un método ex vivo de modular la expresión de ApoB poniendo en contacto un ácido nucleico que codifica ApoB con un compuesto antisentido corto tal como se ha descrito anteriormente.
La invención también proporciona un compuesto antisentido corto tal como se ha descrito anteriormente para uso en la reducción de la expresión de ApoB ARN en un animal.
La invención también proporciona un compuesto antisentido corto tal como se ha descrito anteriormente para uso en el tratamiento de un trastorno cardiovascular en un animal.
La invención también proporciona el uso del compuesto antisentido corto tal como se ha descrito anteriormente para la preparación de un medicamento para la reducción de la expresión de ApoB ARN en un animal.
La invención también proporciona el uso del compuesto antisentido corto tal como se ha descrito anteriormente para 5 la preparación de un medicamento para tratar un trastorno cardiovascular en un animal.
Otros aspectos de la invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas.
SUMARIO DE LA DESCRIPCIÓN
Se describen aquí compuestos antisentido cortos y métodos de uso de dichos compuestos para reducir la expresión
10 del ARN diana en células o tejidos. En ciertas realizaciones, se describe aquí un método de reducir la expresión de una diana en un animal, que comprende administrar al animal un compuesto antisentido corto dirigido al ácido nucleico de dicha diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos son compuestos oligonucleot�dicos. En ciertas realizaciones, los oligonucle�tidos antisentido cortos tienen una longitud de alrededor de 8 a 16, preferiblemente de 9 a 15, más preferiblemente de 9 a 14, más preferiblemente de 10 a 14, y comprenden
15 una región de salto flanqueada por cada lado por un ala, en la que cada ala consiste independientemente de 1 a 3 nucleótidos. Entre los motivos preferidos se incluyen, pero no se limitan a, motivos ala-salto desoxi-ala seleccionados de 3-10-3, 2-10-3, 2-10-2, 1-10-1, 2-8-2, 1-8-1, 3-6-3 � 1-6-1. En una realización preferida, el oligonucle�tido antisentido corto comprende al menos una modificación de alta afinidad. En una realización adicional, la modificación de alta afinidad incluye nucleótidos de alta afinidad químicamente modificados. En una
20 realización preferida, cada ala consiste independientemente de 1 a 3 nucleótidos modificados de alta afinidad. En una realidad, los nucleótidos modificados de alta afinidad son nucleótidos modificados con azúcar.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos exhiben mayor captación en el intestino en comparación con los compuestos antisentido de mayor longitud. Por tanto, también se describen aquí métodos de reducir una diana en un animal, que comprenden administrar por vía oral los compuestos antisentido cortos de la presente
25 descripción.
Tambi�n se describen métodos de tratamiento de un trastorno metabólico en un animal, que comprenden administrar a un animal que necesite dicha terapia un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico implicado en la regulaci�n del metabolismo o aclaramiento de la glucosa, el metabolismo de los lípidos, el metabolismo del colesterol o la se�alizaci�n de la insulina.
30 También se describen métodos de incremento de la sensibilidad a la insulina, disminución de la glucosa en sangre o disminución de HbA1c en un animal, que comprenden administrar a dicho animal un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico que codifica una diana implicada en la regulaci�n del metabolismo o aclaramiento de la glucosa, el metabolismo de los lípidos, el metabolismo del colesterol o la se�alizaci�n de la insulina.
Se describen métodos adicionales de disminución del colesterol total en suero, LDL s�rica, VLDL s�rica, HDL s�rica,
35 triglic�ridos s�ricos, apolipoprote�na(a) s�rica o ácidos grasos libres en un animal, que comprenden administrar a dicho animal un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico que codifica una diana implicada en la regulaci�n del metabolismo o aclaramiento de la glucosa, el metabolismo de los lípidos, el metabolismo del colesterol o la se�alizaci�n de la insulina, en el que dicho compuesto antisentido corto tiene una longitud de 8 a 16 nucleótidos y comprende una región de salto flanqueada por cada lado por un ala, en la que cada ala consiste
40 independientemente de 1 a 3 nucleótidos modificados de alta afinidad.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden además un grupo conjugado. Entre los grupos conjugados se incluyen, C16 y colesterol.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden al menos una base nucleot�dica modificada, un enlace internucleos�dico o un resto de azúcar. En ciertas realizaciones, dicho enlace internucleos�dico modificado
45 es un enlace internucleos�dico fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleos�dico es un enlace internucleos�dico fosforotioato.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden al menos una modificación de alta afinidad. En ciertas de tales realizaciones, la modificación de alta afinidad es un nucleótido de alta afinidad químicamente modificado. En ciertas realizaciones, los nucleótidos de alta afinidad químicamente modificados son nucleótidos 50 modificados con azúcar. En ciertas realizaciones, al menos uno de los nucleótidos modificados con azúcar comprende un puente entre la posición 4’ y la posición 2’ del azúcar. Cada uno de los nucleótidos modificados con azúcar est�, independientemente, en la conformación del azúcar !-D o ∀-L. En ciertas realizaciones, cada uno de dichos nucleótidos modificados confiere una Tm de al menos 1 a 4 grados por nucleótido. En ciertas realizaciones, cada uno de dichos nucleótidos modificados con azúcar comprende un grupo sustituyente en 2’ que es distinto a H o
55 a OH. Dichos nucleótidos modificados con azúcar incluyen aquéllos que tienen un resto de azúcar bic�clico con puente en las posiciones 4’ a 2’. En ciertas realizaciones, cada uno de los grupos sustituyentes en 2’ es, independientemente, alcoxi, alcoxi sustituido o halógeno. En ciertas realizaciones, cada uno de los grupos sustituyentes en 2’ es OCH2CH2OCH3 (2’-MOE).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen uno o más nucleótidos modificados con azúcar, que comprenden un puente entre la posición 4’ y 2’ del azúcar, en los que cada uno de dichos puentes comprende independientemente de 2 a 4 grupos de unión seleccionados independientemente de -[C(R1)(R2)]n-, C(R1)=C(R2)-, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R1)2, -S(=O)x-y -N(R1)-;
5 en los que
x es 0, 1, � 2;
n es 1, 2, 3 � 4;
cada R1 y R2 es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20
10 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alic�clico C5-C7, radical alic�clico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, NJ, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1) o sulfoxilo (S(=O)-J1); y
cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo 15 sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido
o un grupo protector.
En un aspecto, cada uno de dichos puentes es, independientemente, -[C(R1)(R2)]n-, -[C(R1)(R2)]n-O-, -C(R1R2)-N(R1)O-o -C(R1R2)-O-N(R1)-. En otro aspecto, cada uno de dichos puentes es, independientemente, 4’-(CH2)3-2’, 4’(CH2)2-2’, 4’-CH2O-2’, 4’-(CH2)2-O-2’, 4’-CH2-O-N(R1)-2’ y 4’-CH2-N(R1)-O-2’-, en el que cada R1 es,
20 independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
En ciertas realizaciones, se describen aquí compuestos antisentido cortos útiles en la reducción de dianas y/o ARN dianas asociados con estados de enfermedad en animales. En ciertas realizaciones se describen métodos de uso de compuestos antisentido cortos para reducir la expresión de un ARN diana en un animal. En ciertas realizaciones, se describe aquí el uso de un compuesto antisentido corto en la descripción de un medicamento para el tratamiento de 25 un trastorno metabólico en un animal. En ciertas realizaciones se describe aquí el uso de un compuesto antisentido corto en la preparación de un medicamento para incrementar la sensibilidad a la insulina, disminuir la glucosa en sangre o disminuir el HbA1c en un animal. También se describe el uso de un compuesto antisentido corto en la preparación de un medicamento para disminuir el colesterol s�rico total, los niveles de LDL en suero, los niveles de VLDL en suero, los niveles de HDL en suero, triglic�ridos en suero, apoliprote�na(a) s�rica o ácidos grasos libres en
30 un animal.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos descritos aquí exhiben una potencia igual o mayor con respecto al silenciamiento del ARN diana en comparación con el oligonucle�tido antisentido parental más largo, de al menos 20 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos exhiben un inicio de la acción más rápido (reducción del ARN diana) en comparación con el oligonucle�tido antisentido parental. En ciertas
35 realizaciones, el incremento de la potencia se produce en el ri��n. En ciertas realizaciones, el ARN diana se expresa predominantemente en los riñones. En ciertas realizaciones, el incremento de la potencia se produce en el hígado. En ciertas realizaciones, el ARN diana se expresa predominantemente en el hígado.
DESCRIPCI�N DETALLADA
Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son ejemplos y
40 explicaciones únicamente y no son restrictivas de la invención reivindicada. Aquí, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa aquí, “o” significa “y/o”, a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término “que incluye”, as� como otras formas, tales como “incluye” e “incluido” no es limitante. Asimismo, términos tales como “elemento” o “componentes” abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se
45 indique específicamente lo contrario.
Los encabezados de sección usados aquí son únicamente con motivos organizativos y no deben interpretarse como limitantes de la materia objeto descrita.
A. Definiciones
A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura usada en relación con la química analítica,
50 la química orgánica sintética y la química medicinal y farmacéutica descritas aquí y los procedimientos y técnicas de las mismas descritos aquí son bien conocidos y usados habitualmente en la técnica. Se pueden usar técnicas estándar para síntesis química, análisis químico, preparación farmacéutica, formulación y liberación, y tratamiento de sujetos. Algunas de estas técnicas y procedimientos se pueden encontrar en, por ejemplo, “Carbohydrate Modifications in Antisense Research” Editado por Sangvi y Cook, American Chemical Society, Washington D.C.,
55 1994; y “Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, Pa., 18� edición, 1990.
A menos que se especifique lo contrario, los siguientes términos tienen los significados siguientes:
Como se usa aquí, el término “nucle�sido” quiere decir una glucosilamina que comprende una base nucleot�dica y un azúcar. Los nucle�sidos incluyen, pero no se limitan a, nucle�sidos naturales, nucle�sidos ab�sicos, nucle�sidos modificados y nucle�sidos que tienen bases miméticas y/o grupos de azúcar.
5 Como se usa aquí, el término “nucleótido” se refiere a una glucosilamina que comprende una base nucleot�dica y un azúcar que tiene un grupo fosfato unido covalentemente al azúcar. Los nucleótidos pueden estar modificados con cualquiera de diversos sustituyentes.
Como se usa aquí, el término “base nucleot�dica” se refiere a una porción de base de un nucle�sido o nucleótido. Una base nucleot�dica puede comprender cualquier átomo o grupo de átomos capaces de unir el hidrógeno con una
10 base de otro ácido nucleico.
Como se usa aquí, la expresión “resto de base heteroc�clica” se refiere a una base nucleot�dica que comprende un heterociclo.
Como se usa aquí, el término “desoxirribonucle�tido” quiere decir un nucleótido que tiene un hidrógeno en la posición 2’ de la porción de azúcar del nucleótido. Los desoxirribonucle�tidos pueden estar modificados con
15 cualquiera de diversos sustituyentes.
Como se usa aquí, el término “ribonucle�tido” quiere decir un nucleótido que tiene un hidroxi en la posición 2’ de la porción de azúcar del nucleótido. Los ribonucle�tidos pueden estar modificados con cualquiera de diversos sustituyentes.
Como se usa aquí, la expresión “compuesto oligom�rico” se refiere a una estructura polim�rica que comprende dos
20 o más subestructuras y que es capaz de hibridar con una región de una molécula de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, los compuestos oligom�ricos son oligonucle�sidos. En ciertas realizaciones, los compuestos oligom�ricos son oligonucle�tidos. En ciertas realizaciones, los compuestos oligom�ricos son compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos oligom�ricos son oligonucle�tidos antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos oligom�ricos son compuestos antisentido cortos. En ciertas realizaciones, los
25 compuestos oligom�ricos son oligonucle�tidos antisentido cortos. En ciertas realizaciones, los compuestos oligom�ricos son oligonucle�tidos quiméricos.
Como se usa aquí, el término “mon�mero” se refiere a una única unidad de un olig�mero. Los mon�meros incluyen, pero no se limitan a, nucle�sidos y nucleótidos, naturales o modificados.
Como se usa aquí, “oligonucle�sido” se refiere a un oligonucle�tido en el que los enlaces internucleos�dicos no 30 contienen un átomo de fósforo.
Como se usa aquí, el término “oligonucle�tido” se refiere a una compuesto oligom�rico que comprende una pluralidad de nucleótidos unidos. En cierta realización se modifica uno o más nucleótidos de un oligonucle�tido. En ciertas realizaciones, un oligonucle�tido comprende ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN). En ciertas realizaciones, los oligonucle�tidos est�n compuestos por bases nucleot�dicas naturales y/o no naturales,
35 azúcares y enlaces internucleot�dicos covalentes y pueden además incluir conjugados de ácidos no nucleicos.
Como se usa aquí, “enlace internucleot�dico” se refiere a un enlace covalente entre nucleótidos adyacentes.
Como se usa aquí, “enlace monom�rico” se refiere a un enlace covalente entre dos mon�meros. Los enlaces monom�ricos incluyen, pero no se limitan a, enlaces internucleot�dicos y enlaces internucleos�dicos.
Como se usa aquí, “enlace internucleot�dico natural” se refiere a un enlace fosfodi�ster 3’ a 5’.
40 Como se usa aquí, el término “compuesto antisentido” se refiere a un compuesto oligom�rico que es, al menos parcialmente, complementario a una molécula de ácido nucleico diana con la que hibrida. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido modula (incrementa o disminuye) la expresión de un ácido nucleico diana. Los compuestos antisentido incluyen, pero no se limitan a, compuestos que son oligonucle�tidos, oligonucle�sidos, análogos de oligonucle�tidos, miméticos de oligonucle�tidos y combinaciones quiméricas de estos. En
45 consecuencia, aunque todos los compuestos antisentido son compuestos oligom�ricos, no todos los compuestos oligom�ricos son compuestos antisentido.
Como se usa aquí, la expresión “oligonucle�tido antisentido” se refiere a un compuesto antisentido que es un oligonucle�tido.
Como se usa aquí, la expresión “oligonucle�tido antisentido parental” se refiere a un oligonucle�tido de 20
50 nucleótidos de longitud que tiene una región de salto desoxi que tiene diez 2’-desoxirribonucle�tidos, flanqueada por una primera y una segunda región ala, teniendo cada una de ellas cinco 2’-O-(2-metoxietil)ribonucle�tidos (un g�pmero 5-10-5 MOE) y que comprende la secuencia del compuesto antisentido corto correspondiente de que es padre.
Como se usa aquí, “compuesto antisentido corto” se refiere a un compuesto antisentido de alrededor de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 � 16 mon�meros de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene al menos una modificación de alta afinidad.
Como se usa aquí, la expresión “oligonucle�tido antisentido corto” se refiere a un oligonucle�tido antisentido de 5 alrededor de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 � 16 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, un oligonucle�tido antisentido corto tiene al menos una modificación de alta afinidad.
Como se usa aquí, la expresión “g�pmero corto” se refiere a un oligonucle�tido antisentido corto que tiene una primera y una segunda región ala, teniendo cada una de ellas independientemente de 1 a 3 nucleótidos de longitud y una región de salto de 2 a 14 bases nucleot�dicas de longitud.
10 Como se usa aquí, el término “motivo” se refiere a un patrón de nucleótidos no modificados y modificados en un compuesto antisentido corto.
Como se usa aquí, la expresión “olig�mero antisentido quimérico” se refiere a un compuesto oligom�rico antisentido que tiene al menos un azúcar, una base nucleot�dica o un enlace internucleos�dico que est� modificado diferencialmente en comparación con al menos otro azúcar, base nucleot�dica o enlace internucleos�dico dentro del
15 mismo compuesto oligom�rico antisentido. El resto de los azúcares, bases nucleot�dicas y enlaces internucleos�dicos pueden estar modificados o no modificados independientemente, ser iguales o diferentes.
Como se usa aquí, la expresión “oligonucle�tido antisentido quimérico” se refiere a un oligonucle�tido antisentido que tiene al menos un azúcar, una base nucleot�dica o un enlace internucleos�dico que est� modificado diferencialmente en comparación con al menos otro azúcar, base nucleot�dica o enlace internucleos�dico dentro del
20 mismo oligonucle�tido antisentido. El resto de los azúcares, bases nucleot�dicas y enlaces internucleos�dicos pueden estar modificados o no modificados independientemente, ser iguales o diferentes.
Como se usa aquí, la expresión “oligonucle�tido antisentido de estructura mixta” se refiere a un oligonucle�tido antisentido en el que al menos un enlace internucleos�dico del oligonucle�tido antisentido es diferente de al menos otro enlace internucleot�dico del oligonucle�tido antisentido.
25 Como se usa aquí, el término “diana” se refiere a una proteína cuya modulación se desea.
Como se usa aquí, la expresión “gen diana” se refiere a un gen que codifica una diana.
Como se usa aquí, las expresiones “ácido nucleico diana” y “molécula de ácido nucleico que codifica una diana” se refieren a cualquier molécula de ácido nucleico cuya expresión o actividad puede ser modulada por un compuesto antisentido. Los ácidos nucleicos diana incluyen, pero no se limitan a, ARN (incluidos, pero sin limitarse a, pre
30 ARNm y ARNm o porciones de los mismos) transcritos a partir de ADN que codifica una diana, y, también, ADNc derivado de dicho ARN, y ARNmi. Por ejemplo, el ácido nucleico diana puede ser un gen celular (o ARNm transcrito a partir del gen), cuya expresión se asocia con un trastorno o estado de enfermedad concreto, o una molécula de ácido nucleico de un agente infeccioso.
Como se usa aquí, el término “dirigido” o “dirigido a” se refiere a la asociación de un compuesto antisentido con una
35 molécula de ácido nucleico diana concreta o una región concreta de nucleótidos dentro de una molécula de ácido nucleico diana.
Como se usa aquí, la expresión “sitio diana en 5’” se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al nucleótido más en 5’ de un compuesto antisentido concreto.
Como se usa aquí, la expresión “sitio diana en 3’” se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es 40 complementario al nucleótido más en 3’ de un compuesto antisentido concreto.
Como se usa aquí, la expresión “región diana” se refiere a una porción de un ácido nucleico diana con la que uno o más compuestos antisentido son complementarios.
Como se usa aquí, la expresión “segmento diana” se refiere una parte más pequeña o subporciones de una región dentro de un ácido nucleico diana.
45 Como se usa aquí, la expresión “complementariedad con la base nucleot�dica” se refiere a una base nucleot�dica que puede aparearse con otra base nucleot�dica. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria de la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria del uracilo (U). En ciertas realizaciones, base nucleot�dica complementaria se refiere a una base nucleot�dica de un compuesto antisentido que puede aparearse con bases con una base nucleot�dica de su ácido nucleico diana. Por ejemplo, si una base nucleot�dica en una
50 posición determinada de un compuesto antisentido puede unirse por enlaces de hidrógeno a una base nucleot�dica en cierta posición de un ácido nucleico diana, la posición del enlace de hidrógeno entre el nucleótido y el ácido nucleico diana se considera complementaria en dicho par de bases nucleot�dicas.
Como se usa aquí, la expresión “base nucleot�dica no complementaria” se refiere a un par de bases nucleot�dicas que no forman enlaces de hidrógeno entre s� o, de otro modo, soportar hibridación.
Como se usa aquí, el término “complementariedad” se refiere a la capacidad de un compuesto oligom�rico para hibridar con otro compuesto oligom�rico o ácido nucleico a través de complementariedad de base nucleot�dica. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido y su diana son complementarios entre s� cuando un número suficiente de posiciones correspondientes en cada molécula est�n ocupadas por bases nucleot�dicas que se pueden unir entre s� para permitir una asociación estable entre el compuesto antisentido y la diana. Un experto en la técnica reconoce que la inclusión de faltas de coincidencia es posible sin eliminar la capacidad de los compuestos oligom�ricos para permanecer en asociación. Por tanto, se describen aquí compuestos antisentido que pueden comprender hasta alrededor de 20% de nucleótidos que est�n desapareados (es decir, no son bases nucleot�dicas complementarias a los correspondientes nucleótidos de la diana). Preferiblemente, los compuestos antisentido no contienen más de alrededor de 15%, más preferiblemente no más de alrededor de 10%, más preferiblemente no más de alrededor de 5% o ningún desapareamiento. Los nucleótidos restantes son bases nucleot�dicas complementarias o, por otro lado, no alteran la hibridación (por ejemplo, bases universales). Un experto normal en la técnica reconocería que los compuestos proporcionados aquí son al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% complementarios a un ácido nucleico diana.
Como se usa aquí, el término “desapareamiento” se refiere a una base nucleot�dica no complementaria en un compuesto oligom�rico complementario.
Como se usa aquí, “hibridación” quiere decir el apareamiento de compuestos oligom�ricos complementarios (por ejemplo, un compuesto antisentido y su ácido nucleico diana). Aunque no est� limitado a un mecanismo concreto, el mecanismo más habitual de apareamiento implica enlaces de hidrógeno que pueden ser enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, de Hoogsteen o de Hoogsteen inverso, entre nucle�sidos o bases nucleot�dicas complementarias (bases nucleot�dicas). Por ejemplo, la base natural adenina es una base nucleot�dica complementaria a las bases nucleot�dicas naturales timidina y uracilo, que se aparean a través de la formación de enlaces de hidrógeno. La base natural guanina es una base nucleot�dica complementaria de las bases naturales citosina y 5-metil-citosina. La hibridación se puede producir en varias circunstancias.
Como se usa aquí, la expresión “hibrida específicamente” se refiere a la capacidad de un compuesto oligom�rico para hibridar con un sitio en el ácido nucleico con mayor afinidad que con la que hibrida con otro sitio en el ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un oligonucle�tido antisentido hibrida específicamente con más de un sitio diana.
Como se usa aquí, “diseñar” o “diseñado” se refieren al procedimiento de diseñar un compuesto oligom�rico que hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico seleccionado.
Como se usa aquí, el término “modulación” se refiere a una perturbación de la función o actividad cuando se compara con el nivel de la función o actividad antes de la modulación. Por ejemplo, modulación incluye el cambio, un incremento (estimulaci�n o inducción) o una disminución (inhibición o reducción) de la expresión g�nica. Como ejemplo adicional, la modulación de la expresión puede incluir perturbar la selección de un sitio de corte y empalme del procesamiento de pre-ARNm.
Como se usa aquí, el término “expresión” se refiere a todas las funciones y etapas por las cuales la información codificada en un gen se convierte en estructuras presentes y funcionando en una célula. Dichas estructuras incluyen, pero no se limitan a, los productos de la transcripción y la traducción.
Como se usa aquí, “variante” se refiere a un transcrito de ARN alternativo que se puede producir a partir de la misma región gen�mica del ADN. Variantes incluyen, pero no se limitan a, “variantes pre-ARNm” que son transcritos producidos a partir del mismo ADN gen�mico que difieren de otros transcritos producidos a partir del mismo ADN gen�mico en su posición de iniciación o de terminación y contienen secuencias intr�nicas y ex�nicas. Variantes también incluyen, pero no se limitan a, aquellas con uniones de corte y empalme alternativas o codones de iniciación y terminación alternativos.
Como se usa aquí, “mon�mero modificado de alta afinidad” se refiere a un mon�mero que tiene al menos una base nucleot�dica modificada, un enlace internucleos�dico o un resto de azúcar, cuando se compara con mon�meros naturales, de modo que la modificación aumenta la afinidad de un compuesto antisentido que comprende el mon�mero de alta afinidad por su ácido nucleico diana. Las modificaciones de alta afinidad incluyen, pero no se limitan a, mon�meros (por ejemplo, nucle�sidos y nucleótidos), que comprenden azúcares modificados en 2’.
Como se usa aquí, la expresión “modificado en 2’” o “sustituido en 2’” quiere decir un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2’ distinto a H u OH. Los mon�meros modificados en 2’ incluyen, pero no se limitan a, BNA y mon�meros (por ejemplo, nucle�sidos y nucleótidos) con sustituyentes en 2’, tal como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2’-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), u O-CH2-C(=O)N(Rm)(Rn), en los que cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden un mon�mero modificado en 2’ que no tiene la fórmula 2’-O(CH2)nH, en la que n es de uno a seis. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden
un mon�mero modificado en 2’ que no tiene la fórmula 2’-OCH3. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden un mon�mero modificado en 2’ que no tiene la fórmula o, en la alternativa, 2’-O(CH2)2OCH3.
Como se usa aquí, la expresión “ácido nucleico bic�clico” o “BNA” o “nucle�sido bic�clico” o “nucleótido bic�clico” se refiere a un nucle�sido o nucleótido en el que la porción furanosa del nucle�sido incluye un puente que conecta dos átomos de carbono sobre el anillo de furanosa, formando de este modo un sistema de anillo bic�clico.
Como se usa aquí, a menos que se indique lo contrario, la expresión “metilenoxi BNA” solo se refiere a !-Dmetilenoxi BNA.
Como se usa aquí, el término “MOE” se refiere al sustituyente 2’-metoxietilo.
Como se usa aquí, el término “g�pmero” se refiere a un compuesto oligom�rico quimérico que comprende una región central (un “salto”) y una región en cualquiera de los lados de la región central (las “alas”), en la que el salto comprende al menos una modificación que es diferente de la de cada ala. Dichas modificaciones incluyen modificaciones en la base nucleot�dica, el enlace monom�rico y el azúcar, as� como la ausencia de modificación (sin modificar). Por tanto, en ciertas realizaciones, los enlaces nucleot�dicos en cada una de las alas son diferentes de los enlaces nucleot�dicos en el salto. En ciertas realizaciones, cada ala comprende nucleótidos con modificaciones de alta afinidad y el salto comprende nucleótidos que no comprenden dicha modificación. En ciertas realizaciones, los nucleótidos en el salto y los nucleótidos en las alas comprenden todos ellos modificaciones de alta afinidad, pero las modificaciones de alta afinidad en el salto son diferentes de las modificaciones de alta afinidad en las alas. En ciertas realizaciones, las modificaciones en las alas son las mismas entre s�. En ciertas realizaciones, las modificaciones en las alas son diferentes entre s�. En ciertas realizaciones, los nucleótidos en el salto no est�n modificados, y los nucleótidos en las alas est�n modificados. En ciertas realizaciones, la(s) modificación(es) en cada ala son las mismas. En ciertas realizaciones, la(s) modificación(es) en un ala son diferentes de la(s) modificación(es) en las otras alas. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos son g�pmeros que tienen 2’desoxinucle�tidos en el salto y nucleótidos con modificaciones de alta afinidad en el ala.
Como se usa aquí, el término “prof�rmaco” se refiere a un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una forma activa (es decir, el fármaco) dentro del cuerpo o las células del mismo por acción de enzimas end�genas u otros productos químicos y/o condiciones.
Como se usa aquí, el término “sales farmac�uticamente aceptables” se refiere a sales de compuestos activos que conservan la actividad biológica deseada del compuesto activo y que no producen efectos toxicológicos indeseados.
Como se usa aquí, la expresión “estructura caperuza” o “resto caperuza terminal” se refiere a modificaciones químicas que se han incorporado en cualquier extremo de un compuesto antisentido.
Como se usa aquí, el término “prevención” se refiere a retrasar o impedir el inicio o desarrollo de una afección o enfermedad durante un periodo de tiempo que va desde horas a días, preferiblemente de semanas a meses.
Como se usa aquí, el término “mejora” se refiere a una disminución de al menos un indicador de la gravedad de una afección o enfermedad. La gravedad de los indicadores se puede determinar mediante medidas subjetivas u objetivas que son conocidas para los expertos en la técnica.
Como se usa aquí, el término “tratamiento” se refiere a administrar una composición de la invención para efectuar una alteración o mejora de la afección o enfermedad. La prevención, mejora y/o tratamiento puede requerir la administración de múltiples dosis a intervalos regulares, o antes del inicio de la afección o enfermedad, para alterar el curso de la enfermedad o afección. Además, se puede usar un único agente en un único individuo para cada prevención, mejora y tratamiento de una afección o enfermedad de forma secuencial o concurrente.
Como se usa aquí, la expresión “agente farmacéutico” se refiere a una sustancia que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un sujeto.
Como se usa aquí, la expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un animal.
Como se usa aquí, “administrar” significa proporcionar un agente farmacéutico a un animal e incluye, pero no se limita a, la administración por un profesional m�dico y la autoadministraci�n.
Como se usa aquí, el término “co-administración” se refiere a la administración de dos o más agentes farmacéuticos a un animal. Los dos o más agentes farmacéuticos pueden estar en una única composición farmacéutica o pueden estar en composiciones farmacéuticas distintas. Cada uno de los dos o más agentes farmacéuticos se puede administrar por la misma vía de administración o por vías diferentes. La co-administración abarca la administración en paralelo o secuencial.
Como se usa aquí, la expresión “composición farmacéutica” se refiere a una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender un oligonucle�tido antisentido y una disolución acuosa estéril.
Como se usa aquí, el término “individuo” se refiere a un ser humano o a un animal no humano seleccionado para el tratamiento o terapia.
Como se usa aquí, el término “animal” se refiere a un ser humano o animal no humano, incluyendo, pero sin limitarse a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluyendo, pero sin limitarse a, 5 monos y chimpancés.
Como se usa aquí, el término “sujeto” se refiere a un animal, incluido, pero sin limitarse a, el ser humano, al que se administra una composición farmacéutica.
Como se usa aquí, el término “duración” se refiere al período de tiempo durante el cual se continúa una actividad o acontecimiento. En ciertas realizaciones, la duración del tratamiento es el período de tiempo durante el cual se
10 administran las dosis de un agente farmacéutico.
Como se usa aquí, la expresión “administración parenteral” se refiere a la administración mediante inyección o infusión. La administración parenteral incluye, pero no se limita a, administración subcutánea, administración intravenosa, o administración intramuscular.
Como se usa aquí, la expresión “administración subcutánea” se refiere a la administración justo debajo de la piel. 15 “Administración intravenosa” significa administración en una vena.
Como se usa aquí, el término “dosis” se refiere a una cantidad especificada de un agente farmacéutico proporcionada en una única administración. En ciertas realizaciones, una dosis se puede administrar en dos o más bolos, comprimidos o inyecciones. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, en las que se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se acomoda fácilmente mediante una única inyección. En
20 dichas realizaciones, se pueden usar dos o más inyecciones para alcanzar la dosis deseada. En ciertas realizaciones, una dosis se puede administrar en dos o más inyecciones para minimizar la reacción en el punto de inyección en un individuo.
Como se usa aquí, la expresión “unidad de dosificación” se refiere a una forma en la que se proporciona un agente farmacéutico. En ciertas realizaciones, una unidad de dosificación es un vial que comprende oligonucle�tido
25 antisentido liofilizado. En ciertas realizaciones, una unidad de dosificación es un vial que comprende oligonucle�tido antisentido reconstituido.
Como se usa aquí, la expresión “agente farmacéutico” se refiere a una sustancia que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones un oligonucle�tido antisentido es un agente farmacéutico.
30 Como se usa aquí, la expresión “ingrediente farmacéutico activo” se refiere a la sustancia en una composición farmacéutica que proporciona un efecto deseado.
Como se usa aquí, la expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo. En ciertas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido es la cantidad que necesita administrarse para tener como
35 resultado un beneficio observable.
Como se usa aquí, el término “hipercolesterolemia” se refiere a una afección caracterizada por niveles elevados de colesterol en suero.
Como se usa aquí, el término “hiperlipidemia” se refiere a una afección caracterizada por niveles elevados de lípidos en suero.
40 Como se usa aquí, el término “hipertrigliceridemia” se refiere a una afección caracterizada por niveles elevados de triglic�ridos en suero.
Como se usa aquí, el término “hipercolesterolemia no familiar” se refiere a una afección caracterizada por niveles elevados de colesterol que no es el resultado de una única mutación g�nica hereditaria.
Como se usa aquí, la expresión “hipercolesterolemia polig�nica” se refiere a una afección caracterizada por niveles
45 elevados de colesterol que es el resultado de la influencia de diversos factores genéticos. En ciertas realizaciones, la hipercolesterolemia polig�nica se puede exacerbar por la ingesta de lípidos en la dieta.
Como se usa aquí, la expresión “hipercolesterolemia familiar (HF)” se refiere a un trastorno metabólico dominante autos�mico caracterizado por una mutación en el gen del receptor de LDL (LDL-R), niveles marcadamente elevados de LDL-C e inicio prematuro de aterosclerosis. Un diagnóstico de hipercolesterolemia familiar se realiza cuando un 50 individuo cumple uno o más de los criterios siguientes: pruebas genéticas que confirman 2 genes mutados del receptor de LDL; pruebas genéticas que confirman un gen mutado del receptor de LDL; historial documentado de LDL-colesterol en suero sin tratar superior a 500 mg/dl; xantoma tendinoso y/o cut�neo antes de los 10 años de
edad: o ambos padres presentan niveles elevados de LDL-colesterol en suero documentados antes de la terapia hipolipemiante consistente con hipercolesterolemia familiar heterocig�tica.
Como se usa aquí, la expresión “hipercolesterolemia familiar homocig�tica” o “HFHo” se refiere a una afección caracterizada por una mutación en el gen de LDL-R tanto materno como paterno.
5 Como se usa aquí, la expresión “hipercolesterolemia familiar heterocig�tica” o “HFHe” se refiere a una afección caracterizada por una mutación en el gen de LDL-R materno o paternos.
Como se usa aquí, la expresión “dislipidemia mixta” se refiere a una afección caracterizada por niveles elevados de colesterol en suero y niveles elevados de triglic�ridos en suero.
Como se usa aquí, la expresión “dislipidemia diab�tica” o “diabetes de tipo II con dislipidemia” se refiere a una
10 afección caracterizada por diabetes de tipo II, niveles reducidos de HDL-C, niveles elevados de triglic�ridos en suero y niveles elevados de partículas de LDL pequeñas densas.
Como se usa aquí, la expresión “equivalentes de riesgo de “CPC” se refiere a indicadores de enfermedad ateroscler�tica clónica que confieren un riesgo elevado de cardiopat�a coronaria. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los equivalentes de riesgo de CPC incluyen, sin limitaciones, cardiopat�a coronaria clónica,
15 enfermedad de las arterias car�tidas sintom�tica, enfermedad arterial periférica y/o aneurisma a�rtico abdominal.
Como se usa aquí, la expresión “enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA”) se refiere a una afección caracterizada por la inflamación grasa del hígado que no se debe a un abuso del consumo de alcohol (por ejemplo, consumo de alcohol de más de 20 g/día). En ciertas realizaciones, la EHGNA est� relacionada con la resistencia a la insulina y el síndrome metabólico.
20 Como se usa aquí, la expresión “esteatohepatitis no alcohólica (EHNA)” se refiere a una afección caracterizada por la inflamación y la acumulación de grasa y tejido fibroso en el hígado que no se debe a un abuso del consumo de alcohol. EHNA es una forma extrema de la EHGNA.
Como se usa aquí, la expresión “factores de riesgo principales” se refiere a factores que contribuyen a un alto riesgo de una enfermedad o afección concreta. En ciertas realizaciones, los factores principales de riesgo de cardiopat�a
25 coronaria incluyen, sin limitación, tabaquismo, hipertensión, niveles bajos de HDL-C, antecedentes familiares de cardiopat�a coronaria y la edad.
Como se usa aquí, el término “factores de riesgo de CPC” se refiere a equivalentes de riesgo de CPC y factores de riesgo principales.
Como se usa aquí, la expresión “cardiopat�a coronaria (CPC)” se refiere a un estrechamiento de los vasos
30 sanguíneos pequeños que suministran sangre y oxígeno al corazón, que a menudo da como resultado aterosclerosis.
Como se usa aquí, la expresión “riesgo reducido de cardiopat�a coronaria” se refiere a una reducción de la probabilidad de que un individuo desarrolle cardiopat�a coronaria. En ciertas realizaciones, una reducción del riesgo de cardiopat�a coronaria se mide por una mejora en uno o más factores de riesgo de CPC, por ejemplo una
35 disminución de los niveles de LDL-C.
Como se usa aquí, el término “aterosclerosis” se refiere a un endurecimiento de las arterias que afecta a las arterias de tamaño grande y medio y que se caracteriza por la presencia de depósitos de grasa. Los depósitos de grasa se denominan “ateromas” o “placas”, que consisten principalmente en colesterol y otras grasas, calcio y tejido cicatricial, y daños en el revestimiento de las arterias.
40 Como se usa aquí, la expresión “historial de cardiopat�a coronaria” se refiere a la aparición de cardiopat�a coronaria cl�nicamente evidente en el historial m�dico de un individuo o un miembro de la familia del individuo.
Como se usa aquí, la expresión “cardiopat�a coronaria de inicio precoz” se refiere a un diagnóstico de cardiopat�a coronaria antes de los 50 años de edad.
Como se usa aquí, la expresión “individuo intolerante a estatinas” se refiere a un individuo que, como resultado de la
45 terapia con estatinas, experimenta uno o más incrementos de la creatinina cinasa, anomalías en las pruebas de función hepática, dolores musculares o efectos secundarios en el sistema nervioso central.
Como se usa aquí, el término “eficacia” se refiere a la capacidad para producir un efecto deseado. Por ejemplo, la eficacia de una terapia hipolipemiante puede ser la reducción en la concentración de uno o más de LDL-C, VLDL-C, IDL-C, no-HDL-C, ApoB, lipoprote�na(a), o triglic�ridos.
50 Como se usa aquí, la expresión “perfil de seguridad aceptable” se refiere a un patrón de efectos secundarios que est� dentro de los límites cl�nicamente aceptables.
Como se usa aquí, la expresión “efectos secundarios” se refiere a respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento aparte de los efectos deseados. En ciertas realizaciones, los efectos secundarios incluyen, sin limitaciones, reacciones en el sitio de la inyección, anomalías en las pruebas de función hepática, anomalías en la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías en el sistema nervioso central y miopat�as. Por ejemplo, incrementos en los niveles de aminotransferasas en suero pueden indicar toxicidad hepática o anomalías en la función hepática. Por ejemplo, incrementos en los niveles de bilirrubina pueden indicar toxicidad hepática o anomalías en la función hepática.
Como se usa aquí, la expresión “reacción en el sitio de la inyección” se refiere a inflamación o enrojecimiento anormal de la piel en el punto de inyección en un individuo.
Como se usa aquí, la expresión “cumplimiento del individuo” se refiere a la adhesión a una terapia recomendada o prescrita por un individuo.
Como se usa aquí, la expresión “terapia hipolipemiante” se refiere a un régimen terapéutico proporcionado a un individuo para reducir uno o más lípidos en un individuo. En ciertas realizaciones, se proporciona una terapia hipolipemiante para reducir uno o más de ApoB, colesterol total, LDL-C, VLDL-C, IDL-C, no-HDL-C, triglic�ridos, partículas de LDL pequeñas densas y Lp(a) en un individuo.
Como se usa aquí, la expresión “agente hipolipemiante” se refiere a un agente farmacéutico proporcionado a un individuo para alcanzar una disminución de los niveles de lípidos en el individuo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se proporciona a un individuo un agente hipolipemiante para reducir uno o más de ApoB, LDL-C, colesterol total y triglic�ridos.
Como se usa aquí, la expresión “LDL-C diana” se refiere a un nivel de LDL-C que se desea tras la terapia hipolipemiante.
Como se usa aquí, el término “cumplimiento” se refiere a la adhesión a una terapia recomendada por parte de un individuo.
Como se usa aquí, la expresión “terapia recomendada” se refiere a un régimen terapéutico recomendado por un profesional m�dico para el tratamiento, mejora o prevención de una enfermedad.
Como se usa aquí, la expresión “actividad baja del receptor de LDL” se refiere a la actividad del receptor de LDL que no es lo suficientemente alta como para mantener niveles cl�nicamente aceptables de LDL-C en la corriente sanguínea.
Como se usa aquí, la expresión “desenlace cardiovascular” se refiere a la aparición de acontecimientos cardiovasculares adversos principales.
Como se usa aquí, la expresión “desenlace cardiovascular mejorado” se refiere a una reducción de la aparición de acontecimientos cardiovasculares adversos principales o del riesgo de los mismos. Ejemplos de acontecimientos cardiovasculares adversos principales incluyen, sin limitaciones, muerte, reinfarto, ictus, shock cardiog�nico, edema pulmonar, parada cardíaca y arritmia ventricular.
Como se usa aquí, la expresión “marcadores sustitutos del desenlace cardiovascular” se refiere a los indicadores indirectos de acontecimientos cardiovasculares adversos o del riesgo de los mismos. Por ejemplo, marcadores sustitutos del desenlace cardiovascular incluyen el espesor de la media íntima de la carótida (CIMT). Otro ejemplo de un marcador sustituto del desenlace cardiovascular incluye el tamaño del ateroma. El tamaño del ateroma se puede determinar mediante ultrasonidos intravasculares (USIV).
Como se usa aquí, la expresión “incremento de los niveles de HDL-C” se refiere a un incremento de los niveles de HDL-C en suero en un individuo a lo largo del tiempo.
Como se usa aquí, el término “hipolipemiante” se refiere a una reducción de uno o más lípidos en suero en un individuo a lo largo del tiempo.
Como se usa aquí, la expresión “trastorno metabólico” se refiere a una afección caracterizada por una alteración o interrupción de la función metabólica. “Metabólica/o” y “metabolismo” son términos bien conocidos en la técnica, y generalmente incluyen toda la gama de procesos bioquímicos que se producen dentro de un organismo vivo. Trastornos metabólicos incluyen, pero no se limitan a, hiperglucemia, prediabetes, diabetes (de tipo I y de tipo II), obesidad, resistencia a la insulina y síndrome metabólico.
Como se usa aquí, la expresión “síndrome metabólico” se refiere a una combinación de factores de riesgo cardiovascular lip�dicos y no lip�dicos de origen metabólico. Se ha vinculado estrechamente con el trastorno metabólico generalizado conocido como resistencia a la insulina. El Panel de Tratamiento de adultos III (ATP III) del Programa Nacional educativo sobre colesterol de EE.UU. (NCEP) estableció criterios para el diagnóstico del síndrome metabólico cuando est�n presentes tres o más de cinco determinantes de riesgo. Los cinco determinantes de riesgo son obesidad abdominal, definida como una circunferencia de la cintura superior a 102 cm para varones o superior a 88 cm para mujeres, niveles de triglic�ridos superiores o iguales a 150 mg/dl, niveles de HDL-colesterol inferiores a 40 mg/dl para varones e inferiores a 50 mg/dl para mujeres, presión arterial superior o igual a 130/85 mmHg y niveles de glucosa en ayunas superiores o iguales a 110 mg/dl. Estos determinantes se pueden medir fácilmente en la práctica clónica (JAMA, 2001, 285: 2486-2497).
5 El término “alquilo” tal como se usa aquí, se refiere a un radical de hidrocarburo saturado lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono. Ejemplos de grupos alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, n-hexilo, octilo, decilo, dodecilo y similares. Típicamente, los grupos alquilo incluyen de 1 a alrededor de 24 átomos de carbono, más típicamente de 1 a alrededor de 12 átomos de carbono (alquilo C1-C12) siendo más preferidos con de 1 a alrededor de 6 átomos de carbono. La expresión “alquilo inferior”, como se
10 usa aquí, incluye de 1 a alrededor de 6 átomos de carbono. Los grupos alquilo, como se usan aquí pueden incluir, opcionalmente, uno o más grupos sustituyentes adicionales.
El término “alquenilo”, como se usa aquí, se refiere a un radical hidrocarburo de cadena lineal o ramificada que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono. Ejemplos de grupos alquenilo incluyen, pero no se limitan a, etenilo, propenilo, butenilo, 1-metil-2-buten-1-ilo, dienos tales como
15 1,3-butadieno y similares. Típicamente, los grupos alquenilo incluyen de 2 a alrededor de 24 átomos de carbono, más típicamente de 2 a alrededor de 12 átomos de carbono, siendo más preferidos de 2 a alrededor de 6 átomos de carbono. Los grupos alquenilo, como se usan aquí, pueden incluir, opcionalmente, uno o más grupos sustituyentes adicionales.
El término “alquinilo”, como se usa aquí, se refiere a un radical hidrocarburo de cadena lineal o ramificada que
20 contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono. Ejemplos de grupos alquinilo incluyen, pero no se limitan a, etinilo, 1-propinilo, 1-butinilo y similares. Típicamente, los grupos alquinilo incluyen de 2 a alrededor de 24 átomos de carbono, más típicamente de 2 a alrededor de 12 átomos de carbono, siendo más preferidos de 2 a alrededor de 6 átomos de carbono. Los grupos alquinilo, como se usan aquí, pueden incluir, opcionalmente, uno o más grupos sustituyentes adicionales.
25 El término “aminoalquilo”, como se usa aquí, se refiere a un radical alquilo sustituido con amino. Con este término se quiere incluir grupos alquilo C1-C12 que tienen un sustituyente amino en cualquier posición, y en el que el grupo alquilo une el grupo aminoalquilo a la molécula parental. Las porciones alquilo y/o amino del grupo aminoalquilo pueden estar adicionalmente sustituidas con grupos sustituyentes.
El término “alif�tico”, como se usa aquí, se refiere a un radical hidrocarburo de cadena lineal o ramificada que
30 contiene hasta veinticuatro átomos de carbono, en el que la saturación entre dos átomos de carbono cualesquiera es un enlace sencillo, doble o triple. Preferiblemente, un grupo alif�tico contiene de 1 a alrededor de 24 átomos de carbono, más típicamente de 1 a alrededor de 12 átomos de carbono, siendo más preferidos de 1 a alrededor de 6 átomos de carbono. La cadena lineal o ramificada de un grupo alif�tico puede interrumpirse con uno o más hetero�tomos que incluyen nitrógeno, oxígeno, azufre o fósforo. Dichos grupos alif�ticos interrumpidos por
35 hetero�tomos incluyen, sin limitaciones, polialcoxis, tales como polialquilenglicoles, poliaminas y poliiminas. Los grupos alif�ticos como se usan aquí pueden incluir, opcionalmente, grupos sustituyentes adicionales.
El término “alic�clico” o “aliciclilo” se refiere a un sistema de anillo cíclico en el que el anillo es alif�tico. El sistema de anillo puede comprender uno o más anillos de los que al menos un anillo es alif�tico. Alic�clicos preferidos incluyen anillos que tienen de alrededor de 5 a alrededor de 9 átomos de carbono en el anillo. Los grupos alic�clicos, como se
40 usan aquí, pueden incluir, opcionalmente, grupos sustituyentes adicionales.
El término “alcoxi”, como se usa aquí, se refiere a un radical formado entre un grupo alquilo y un átomo de oxígeno, en el que el átomo de oxígeno se usa para unir el grupo alcoxi a una molécula parental. Ejemplos de grupos alcoxi incluyen, pero no se limitan a, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, sec-butoxi, terc—butoxi, n-pentoxi, neopentoxi, n-hexoxi y similares. Los grupos alcoxi como se usan aquí pueden incluir, opcionalmente, grupos
45 sustituyentes adicionales.
Los términos “halo” y “halógeno”, como se usan aquí, se refieren a un átomo seleccionado de flúor, cloro, bromo y yodo.
Los términos “arilo” y “aromático” como se usa aquí se refieren a radicales de sistemas de anillo carboc�clicos mono
o polic�clicos que tienen uno o más anillos aromáticos. Ejemplos de grupos arilo incluyen, pero no se limitan a, fenilo,
50 naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, indenilo y similares. Sistemas de anillo de arilo preferidos tienen de alrededor de 5 a alrededor de 20 átomos de carbono en uno o más anillos. Grupos arilo, como se usa aquí, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Los términos “aralquilo” y “arilalquilo” como se usan aquí se refieren a un radical formado entre un grupo alquilo y un grupo arilo, en el que el grupo alquilo se usa para unir el grupo aralquilo a una molécula parental. Ejemplos incluyen,
55 pero no se limitan a, bencilo, fenetilo y similares. Grupos aralquilo, como se usa aquí, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales unidos al alquilo, al arilo o a ambos grupos que forman el grupo radical.
La expresión “radical heteroc�clico”, como se usa aquí, se refiere a un sistema de anillo mono-o poli-cíclico radical que incluye al menos un hetero�tomo y est� insaturado, parcialmente saturado o completamente saturado, incluyendo as� grupos heteroarilo. Heteroc�clico también implica que incluye sistemas de anillo condensados en los que uno o más de los anillos condensados contienen al menos un hetero�tomo y los otros anillos pueden contener uno o más hetero�tomos u opcionalmente no contienen hetero�tomos. Un grupo heteroc�clico incluye típicamente al menos un átomo seleccionado de azufre, nitrógeno u oxígeno. Ejemplos de grupos heteroc�clicos incluyen, [1,3]dioxolano, pirrolidinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo, quinoxalinilo, piridazinonilo, tetrahidrofurilo y similares. Grupos heteroc�clicos, como se usa aquí, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Los términos “heteroarilo” y “heteroarom�tico”, como se usan aquí, se refieren a un radical que comprende un anillo aromático mono-o poli-cíclico, sistema de anillo o sistema de anillo condensado en el que al menos uno de los anillos es aromático e incluye uno o más hetero�tomos. Heteroarilo también implica que incluye sistemas de anillo condensados que incluyen sistemas en los que uno o más de los anillos condensados no contienen hetero�tomos. Grupos heteroarilo típicamente incluyen un átomo de anillo seleccionado de azufre, nitrógeno u oxígeno. Ejemplos de grupos heteroarilo incluyen, pero no se limitan a, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isooxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, benzooxazolilo, quinoxalinilo y similares. Los radicales heteroarilo se pueden unir directamente a una molécula parental o un resto de enlace tal como un grupo alif�tico o hetero�tomo. Grupos heteroarilo, como se usa aquí, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
El término “heteroarilalquilo”, como se usa aquí, se refiere a un grupo heteroarilo como se ha definido previamente que tiene un radical alquilo que puede unir el grupo heteroarilalquilo a una molécula parental. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, piridinilmetilo, pirimidiniletilo, naftiridinilpropilo y similares. Grupos heteroarilalquilo, como se usa aquí, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales sobre una o ambas de las porciones de heteroarilo o alquilo.
La expresión “estructura mono-o polic�clica”, como se usa aquí, incluye todos los sistemas de anillo que son individuales o polic�clicos que tienen anillos que est�n condensados o ligados, e implica que incluye sistemas de anillo individuales y mixtos individualmente seleccionados de alif�tico, alic�clico, arilo, heteroarilo, aralquilo, arilalquilo, heteroc�clico, heteroarilo, heteroarom�tico, heteroarilalquilo. Tales estructuras mono-y polic�clicas pueden contener anillos que son uniformes o que tienen grados variables de saturación que incluyen completamente saturados, parcialmente saturados o completamente insaturados. Cada anillo puede comprender átomos de anillo seleccionados de C, N, O y S para dar lugar a anillos heteroc�clicos, además de anillos que sólo comprenden átomos de anillo de C que pueden estar presentes en un motivo mixto tal como, por ejemplo, bencimidazol en el que un anillo sólo tiene átomos de anillo de carbono, y el anillo condensado tiene dos átomos de nitrógeno. Las estructuras mono-o polic�clicas pueden estar adicionalmente sustituidas con grupos sustituyentes tales como, por ejemplo, ftalimida que tiene dos grupos =O unidos a uno de los anillos. En otro aspecto, estructuras mono-o polic�clicas pueden unirse a una molécula parental directamente mediante un átomo de anillo, mediante un grupo sustituyente o un resto de enlace bifuncional.
El término “acilo”, como se usa aquí, se refiere a un radical formado mediante eliminación de un grupo hidroxilo de un ácido orgánico y tiene la fórmula general -C(O)-X en la X es normalmente alif�tico, alic�clico o aromático. Ejemplos incluyen carbonilos alif�ticos, carbonilos aromáticos, sulfonilos alif�ticos, sulfinilos aromáticos, sulfinilos alif�ticos, fosfatos aromáticos, fosfatos alif�ticos y similares. Grupos acilo como se usa aquí pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
El término “hidrocarbilo” incluye grupos que comprenden C, O y H. Se incluyen grupos lineales, ramificados y cíclicos que tienen cualquier grado de saturación. Tales grupos hidrocarbilo pueden incluir uno o más hetero�tomos seleccionados de N, O y S, y pueden estar adicionalmente mono-o polisustituidos con uno o más grupos sustituyentes.
Los términos “sustituyente” y “grupo sustituyente”, como se usan aquí, incluyen grupos que típicamente se añaden a otros grupos o compuestos parentales para potenciar propiedades deseadas o dar efectos deseados. Los grupos sustituyentes pueden protegerse o no protegerse y pueden añadirse a un sitio disponible o a muchos sitios disponibles en un compuesto parental. Los grupos sustituyentes también pueden estar adicionalmente sustituidos con otros grupos sustituyentes y pueden unirse directamente o mediante un grupo de enlace tal como un grupo alquilo o hidrocarbilo a un compuesto parental. Tales grupos incluyen, sin limitación, halógeno, hidroxilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo (-C(O)Raa), carboxilo (-C(O)O-Raa), grupos alif�ticos, grupos alic�clicos, alcoxi, oxo sustituido (-O-Raa), arilo, aralquilo, heteroc�clico, heteroarilo, heteroarilalquilo, amino (-NRbbRcc), imino (=NRbb), amido (-C(O)NRbbRcc o -M(Rbb)C(O)Raa), azido (-N3), nitro (-NO2), ciano (-CN), carbamido (-OC(O)NRbbRcc o N(Rbb)C(O)ORaa), ureido (-N(Rbb)C(O)NRbbRcc), tioureido (-N(Rbb)C(S)NRbbRcc), guanidinilo (-N(Rbb)C(=NRbb)RbbRcc), amidinilo (-C(=NRbb)NRbbRcc o –N(Rbb)C(NRbb)Raa), tiol (-SRbb), sulfinilo (-S(O)Rbb), sulfonilo (-S(O)2Rbb), sulfonamidilo (-S(O)2NRbbRcc o -N(Rbb)S(O)2Rbb) y grupos conjugados. En las que cada Raa, Rbb y Rcc es, independientemente, H, un grupo funcional químico opcionalmente ligado u otro grupo sustituyente incluyendo una lista preferida, sin limitación H, alquilo, alquenilo, alquinilo, alif�tico, alcoxi, acilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, alic�clico, heteroc�clico y heteroarilalquilo.
B. Ciertos compuestos oligom�ricos
En ciertas realizaciones se desea modificar químicamente compuestos oligom�ricos, en comparación con olig�meros que se producen naturalmente, tales como ADN o ARN. Ciertas de tales modificaciones alteran la actividad del compuesto oligom�rico. Ciertas de tales modificaciones químicas pueden alterar la actividad, por
5 ejemplo: aumentando la afinidad de un compuesto antisentido por su ácido nucleico diana, aumentando su resistencia a una o más nucleasas y/o alterando la farmacocin�tica o distribución en tejido del compuesto oligom�rico. En ciertos casos, el uso de químicas que aumentan la afinidad de un compuesto oligom�rico por su diana puede permitir el uso de compuestos oligom�ricos más cortos.
1. Ciertos mon�meros
10 En ciertas realizaciones, los compuestos oligom�ricos comprenden uno o más mon�meros modificados. En ciertas de tales realizaciones, los compuestos oligom�ricos comprenden uno o más mon�meros de alta afinidad. En ciertas realizaciones, tal mon�mero de alta afinidad se selecciona de mon�meros (por ejemplo, nucle�sidos y nucleótidos) que comprenden azúcares modificados en 2’ que incluyen, pero no se limitan a: BNA y mon�meros (por ejemplo, nucle�sidos y nucleótidos) con sustituyentes en 2’ tales como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10,
15 OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2’-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) u O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), en los que cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o sin sustituir.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligom�ricos que incluyen, pero no se limitan a, compuestos antisentido cortos de la presente descripción, comprenden uno o más mon�meros de alta afinidad, siempre que el compuesto oligom�rico no comprenda un nucleótido que comprende 2’-O(CH2)nH, en la que n es uno a seis.
20 En ciertas realizaciones, los compuestos oligom�ricos que incluyen, pero no se limitan a, compuestos antisentido cortos de la presente descripción, comprenden uno o más mon�meros de alta afinidad, siempre que el compuesto oligom�rico no comprenda un nucleótido que comprende 2-OCH3 o 2’-O(CH2)2OCH3.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligom�ricos que incluyen, pero no se limitan a, compuestos antisentido cortos de la presente descripción, comprenden uno o más mon�meros de alta afinidad, siempre que el compuesto
25 oligom�rico no comprenda ∀-L-metilenoxi (4’-CH2-O-2’)-BNA.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligom�ricos que incluyen, pero no se limitan a, compuestos antisentido cortos de la presente descripción, comprenden uno o más mon�meros de alta afinidad, siempre que el compuesto oligom�rico no comprenda !-D-metilenoxi (4’-CH2-O-2’)-BNA.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligom�ricos que incluyen, pero no se limitan a, compuestos antisentido
30 cortos de la presente descripción, comprenden uno o más mon�meros de alta afinidad, siempre que el compuesto oligom�rico no comprenda ∀-L-metilenoxi (4’-CH2-O-2’)-BNA o !-D-metilenoxi (4’-CH2-O-2’)-BNA.
a. Ciertas bases nucleot�dicas
La porción de base natural de un nucle�sido es, típicamente una base heteroc�clica. Las dos clases más habituales de dichas bases heteroc�clicas son las purinas y las pirimidinas. Para los nucle�sidos que incluyen un azúcar de
35 pentofuranosilo, un grupo fosfato se puede unir al resto hidroxilo en 2’, 3’ o 5’ del azúcar. Al formar oligonucle�tidos, los grupos fosfato unen covalentemente a los nucle�sidos adyacentes entre s� para formar un compuesto polim�rico lineal. Dentro de los oligonucle�tidos, normalmente se hace referencia a los grupos fosfato como formadores de la estructura internucleot�dica del oligonucle�tido. El enlace natural o estructura de ARN y de ADN es un enlace fosfodi�ster 3’ a 5’.
40 Además de las bases nucleot�dicas “no modificadas” o “naturales”, tal como las bases nucleot�dicas de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases nucleot�dicas de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U), muchas bases nucleot�dicas modificadas o miméticos de bases nucleot�dicas conocidas para los expertos en la técnica son susceptibles con los compuestos descritos aquí. En ciertas realizaciones, una base nucleot�dica modificada es una base nucleot�dica que es bastante similar en estructura a la base nucleot�dica parental, tal como, por ejemplo, 7
45 desaza purina, una 5-metilcitosina o una pinza G. En ciertas realizaciones, los miméticos de las bases nucleot�dicas incluyen estructuras más complicadas, tales como, por ejemplo, un mimético de una base nucleot�dica de fenoxacina tric�clica. Los métodos para la preparación de las bases nucleot�dicas modificadas indicadas anteriormente son bien conocidos por los expertos en la técnica.
b. Ciertos azúcares
50 Los compuestos oligom�ricos descritos aquí pueden comprender uno o más mon�meros, incluyendo un nucle�sido
o nucleótido, que tiene un resto de azúcar modificado. Por ejemplo, el anillo de azúcar de furanosilo de un nucle�sido se puede modificar de diversas maneras, incluyendo, pero sin limitarse a, la adición de un grupo sustituyente, en puente de dos átomos de anillo no germinales, para formar un ácido bic�clico-nucleico (BNA).
En ciertas realizaciones, los compuestos oligom�ricos comprenden uno o más mon�meros que es un BNA. En ciertas realizaciones, los BNA incluyen, pero no se limitan a, (A) ∀-L-metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA, (B) !-Dmetilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA, (C) etilenoxi (4’-(CH2)2-O-2’) BNA, (D) aminooxi (4’-CH2-O-N(R)-2’) BNA y (E) oxiamino (4’-CH2-N(R)-O-2’) BNA, como se representa en la Figura 1.
Figura 1. Ciertas estructuras BNA
En ciertas realizaciones, los compuestos de BNA incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen al menos un puente entre la posición 4’ y la posición 2’ del azúcar, en los que cada uno de los puentes comprende de forma independiente de 1 o de 2 a 4 grupos de unión seleccionados de forma independiente de -[C(R1)(R2)]n-, C(R1)=C(R2)-, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R1)2, -S(=O)x-y -N(R1)-;
en los que:
x es 0, 1, � 2;
n es 1, 2, 3 � 4;
cada R1 y R2 es, de forma independiente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alic�clico C5-C7, radical alic�clico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1) o sulfoxilo (S(=O)-J1); y
cada J1 y J2 es, de forma independiente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.
En una realización, cada uno de los puentes o los compuestos de BNA es, de forma independiente, -[C(R1)(R2)]n-, [C(R1)(R2)]n-O-, -C(R1R2)-N(R1)-O-o -C(R1R2)-O-N(R1)-. En otra realización, cada uno de dichos puentes es, de forma independiente, 4’-(CH2)-2’, 4’-(CH2)2-2’, 4’-(CH2)3-2’, 4’-CH2-O-2’, 4’-(CH2)2-O-2’, 4’-CH2-O-N(R1)-2’ y 4’-CH2N(R1)-O-2’-, en el que cada R1 es, de forma independiente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
Ciertos BNA se han preparado y descrito en la bibliografía de patentes, as� como en la bibliografía científica (Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; documento WO 94/14226; documento WO 2005/021570; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Ejemplos de patentes de EE.UU. presentadas y solicitudes publicadas que describen BNAs incluyen, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nos 7.053.207; 6.268.490; 6.770.748; 6.794.499; 7.034.133; y 6.525.191; y las publicaciones pre-concesión de EE.UU. nos 2004-0171570; 2004-0219565; 2004-0014959; 2003-0207841; 2004-0143114; y 20030082807.
Aqu� también se describen BNAs en los que el grupo 2’-hidroxilo del anillo de azúcar ribosilo est� unido al átomo de carbono en 4’ del anillo de azúcar, formando de este modo un enlace metilenoxi (4’-CH2-O-2’) para formar el resto de azúcar bic�lico (Revisado en Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 81-7; y Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; véase también las patentes de EE.UU.:
6.268.490 y 6.670.461). El enlace puede ser un grupo metileno (-CH2-) que forma un puente entre el átomo de oxígeno en 2’ y el átomo de carbono en 4’, para los que el término metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA se usa para el resto bic�clico; en el caso de que haya un grupo etileno en esta posición se usa el término etilenoxi (4’-CH2CH2-O-2’) BNA (Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456: Morita et al., Bioorganic Medicinal Chemistry, 2003, 11, 22112226). El metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA y otros análogos del azúcar bic�clico muestran estabilidades térmicas del dúplex muy altas con complementariedad de ADN y ARN (Tm = +3 a +10�C), estabilidad frente a la degradación 3’exonucleol�tica y buenas propiedades de solubilidad. Se han descrito potentes oligonucle�tidos antisentido no tóxicos que comprenden BNAs (Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638).
Un isómero de metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA que también se ha tratado es alfa-L-metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA, que se ha demostrado que tiene una estabilidad superior contra una 3’-exonucleasa. Los alfa-L-metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA se incorporaron en g�pmeros y quimeras antisentido, que mostraron una potente actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
Se han descrito la síntesis y preparación de los mon�meros de metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracilo, junto con su oligomerizaci�n y las propiedades de reconocimiento de ácidos nucleicos (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). También se han descrito BNAs y su preparación en los documentos WO 98/39352 y WO 99/14226.
Tambi�n se han preparado análogos de metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA, fosforotioato-metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA y 2’-tio-BNAs (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). También se ha descrito la preparación de análogos nucleos�dicos bloqueados que comprenden dúplex de oligodesoxirribonucle�tidos como sustratos para las ácido nucleico polimerasas (Wengel et al., documento WO 99/14226). Además, en la técnica se ha descrito la síntesis de 2’-amino-BNA, un nuevo análogo oligonucleot�dico de alta afinidad restringido por conformación (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado 2’-amino-y 2’-metilamino-BNA, y se ha informado previamente la estabilidad térmica de sus dúplex con cadenas de ARN y ADN complementarias.
Los restos de azúcares modificados son muy conocidos y pueden usarse para alterar, típicamente incrementar, la afinidad del compuesto antisentido por su diana y/o incrementar la resistencia a nucleasas. Una lista representativa de azúcares modificados preferidos incluye, pero no se limita a, azúcares modificados bic�clicos (BNA), incluyendo metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA y etilenoxi (puente de 4’-(CH2)2-O-2’) BNA; azúcares sustituidos, especialmente azúcares sustituidos en 2’ que tienen un grupo sustituyente 2’-F, 2’-OCH3 o 2’-O (CH2)2-OCH3; y azúcares modificados en 4’-tio. Los azúcares también pueden reemplazarse con grupos miméticos de azúcar, entre otros. Los métodos para las preparaciones de azúcares modificados son muy conocidos para aquellos expertos en la técnica. Algunas patentes y publicaciones representativas que enseñan la preparación de dichos azúcares modificados incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE.UU. nos: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; 5.792.747; 5.700.920; 6.531.584; y 6.600.032; y el documento WO 2005/121371.
En ciertas realizaciones, BNA incluyen nucle�sidos bic�clicos que tienen la fórmula:
en la que:
Bx es un resto de base heteroc�clica;
T1 es H o un grupo protector de hidroxilo;
T2 es H, un grupo protector de hidroxilo o un grupo de fósforo reactivo;
Z es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, o amida sustituida.
En una realización, cada uno de los grupos sustituidos est�, de forma independiente, mono o polisustituido con grupos sustituyentes opcionalmente protegidos seleccionados de forma independiente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 y CN, en los que cada uno de J1, J2 y J3 es, de forma independiente, H o alquilo C1-C6 y X es O, S o NJ1.
En ciertas de estas realizaciones, cada uno de los grupos sustituidos est�, de forma independiente, mono o polisustituido con grupos sustituyentes seleccionados de forma independiente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1 y NJ3C(=X)NJ1J2, en los que cada uno de J1, J2 y J3 es, de forma independiente, H, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido y X es O o NJ1.
En ciertas realizaciones, el grupo Z es alquilo C1-C6 sustituido con uno o más Xx, en el que cada Xx es, de forma independiente, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 o CN; en los que cada uno de J1, J2 y J3 es, de forma independiente, H o alquilo C1-C6 y X es O, S o NJ1. En otra realización, el grupo Z es alquilo C1-C6 sustituido con uno o más Xx, en la que cada Xx es, de forma independiente halo (por ejemplo, flúor), hidroxilo, alcoxi (por ejemplo, CH3O-), alcoxi o azido sustituido.
En ciertas realizaciones, el grupo Z es -CH2Xx, en el que Xx es OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 o CN; en los que cada uno de J1, J2 y J3 es, de forma independiente, H o alquilo C1-C6 y X es O, S o NJ1. En otra realización, el grupo Z es CH2Xx, en el que Xx es halo (por ejemplo, flúor), hidroxilo, alcoxi (por ejemplo, CH3O-) o azido.
En ciertas de estas realizaciones, el grupo Z est� en la configuración (R).
En ciertas de estas realizaciones, el grupo Z est� en la configuración (S).
En ciertas realizaciones, cada T1 y T2 es un grupo protector de hidroxilo. Una lista preferida de grupos protectores de
5 hidroxilo incluye bencilo, benzo�lo, 2,6-diclorobencilo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo, mesilato, tosilato, dimetoxitritilo (DMT), 9-fenilxantina-9-ilo (Pixilo) y 9-(p-metoxifenilo)xantina-9-ilo (MOX). En ciertas realizaciones, T1 es un grupo protector de hidroxilo seleccionado de acetilo, bencilo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo y dimetoxitritilo, en los que un grupo protector de hidroxilo más preferido es T1 es 4,4’-dimetoxitritilo.
En ciertas realizaciones, T2 es un grupo de fósforo reactivo en el que los grupos de fósforo reactivos preferidos
10 incluyen diisopropilcianoetoxi fosforoamidito y H-fosfonato. En ciertas realizaciones, T1 es 4,4’-dimetoxitritilo y T2 es diisopropilcianoetoxi fosforoamidito.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligom�ricos tienen al menos un mon�mero de la fórmula:
o de la fórmula:
o de la fórmula:
en las que
Bx es un resto de base heteroc�clica;
20 T3 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado unido o un grupo de unión internucleos�dica unido a un nucle�sido, un nucleótido, un oligonucle�sido, un oligonucle�tido, una subunidad monom�rica o un compuesto oligom�rico;
T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado unido o un grupo de unión internucleos�dica unido a un nucle�sido, un nucleótido, un oligonucle�sido, un oligonucle�tido, una subunidad monom�rica o un
25 compuesto oligom�rico;
en las que al menos uno de T3 y T4 es un grupo de unión internucleos�dica unido a un nucle�sido, un nucleótido, un oligonucle�sido, un oligonucle�tido, una subunidad monom�rica o un compuesto oligom�rico; y
Z es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido o amida sustituida.
En una realización, cada uno de los grupos sustituidos est�, de forma independiente, mono o polisustituido con grupos sustituyentes opcionalmente protegidos seleccionados de forma independiente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 y CN, en los que cada uno de J1, J2 y J3 es, de forma independiente, H o alquilo C1-C6 y X es O, S o NJ1.
En una realización, cada uno de los grupos sustituidos est�, de forma independiente, mono o polisustituido con grupos sustituyentes seleccionados de forma independiente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1 y NJ3C(=X)NJ1J2, en los que cada uno de J1, J2 y J3 es, de forma independiente, H o alquilo C1-C6 y X es O o NJ1.
En ciertas de estas realizaciones, al menos un Z es alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido. En ciertas realizaciones, cada Z es, de forma independiente, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido. En ciertas realizaciones, al menos un Z es alquilo C1-C6. En ciertas realizaciones, cada Z es, de forma independiente, alquilo C1-C6. En ciertas realizaciones, al menos un Z es metilo. En ciertas realizaciones, cada Z es metilo. En ciertas realizaciones, al menos un Z es etilo. En ciertas realizaciones, cada Z es etilo. En ciertas realizaciones, al menos un Z es alquilo C1-C6 sustituido. En ciertas realizaciones, cada Z es, de forma independiente, alquilo C1-C6 sustituido. En ciertas realizaciones, al menos un Z es metilo sustituido. En ciertas realizaciones, cada Z es metilo sustituido. En ciertas realizaciones, al menos un Z es etilo sustituido. En ciertas realizaciones, cada Z es etilo sustituido.
En ciertas realizaciones, al menos un grupo sustituyente es alcoxi C1-C6 (por ejemplo, al menos un Z es alquilo C1-C6 sustituido con uno o más alcoxi C1-C6). En otra realización, cada grupo sustituyente es, de forma independiente, alcoxi C1-C6 (por ejemplo, cada Z es, de forma independiente, alquilo C1-C6 sustituido con uno o más alcoxi C1-C6).
En ciertas realizaciones, al menos un grupo sustituyente alcoxi C1-C6 es CH3O-(por ejemplo, al menos un Z es CH3OCH2-). En otra realización, cada grupo sustituyente alcoxi C1-C6 es CH3O-(por ejemplo, cada Z es CH3OCH2-).
En ciertas realizaciones, al menos un grupo sustituyente es halógeno (por ejemplo, al menos un Z es alquilo C1-C6 sustituido con uno o más halógenos). En ciertas realizaciones, cada grupo sustituyente es, de forma independiente, halógeno (por ejemplo, cada Z es, de forma independiente, alquilo C1-C6 sustituido con uno o más halógenos). En ciertas realizaciones, al menos un grupo sustituyente halógeno es flúor (por ejemplo, al menos un Z es CH2FCH2-, CHF2CH2-o CF3CH2-). En ciertas realizaciones, cada grupo sustituyente halógeno es flúor (por ejemplo, cada Z es, de forma independiente, CH2FCH2-, CHF2CH2-o CF3CH2-).
En ciertas realizaciones, al menos un grupo sustituyente es hidroxilo (por ejemplo, al menos un Z es alquilo C1-C6 sustituido con uno o más hidroxilos). En ciertas realizaciones, cada grupo sustituyente es, de forma independiente, hidroxilo (por ejemplo, cada Z es, de forma independiente, alquilo C1-C6 sustituido con uno o más hidroxilos). En ciertas realizaciones, al menos un Z es HOCH2-. En otra realización, cada Z es HOCH2-.
En ciertas realizaciones, al menos un Z es CH3-, CH3CH2-, CH2OCH3-, CH2F-o HOCH2-. En ciertas realizaciones, cada Z es, de forma independiente, CH3-, CH3CH2-, CH2OCH3-, CH2F-o HOCH2-.
En ciertas realizaciones, al menos un grupo Z es alquilo C1-C6 sustituido con uno o más Xx, en el que cada Xx es, de forma independiente, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 o CN; en los que cada uno de J1, J2 y J3 es, de forma independiente, H o alquilo C1-C6 y X es O, S o NJ1. En otra realización, al menos un grupo Z es alquilo C1-C6 sustituido con uno o más Xx, en el que cada Xx es, de forma independiente, halo (por ejemplo, flúor, alcoxi (por ejemplo, CH3O-) o azido.
En ciertas realizaciones, cada grupo Z es, de forma independiente, alquilo C1-C6 sustituido con uno o más Xx, en el que cada Xx es, de forma independiente, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 o CN; en los que cada uno de J1, J2 y J3 es, de forma independiente, H o alquilo C1-C6 y X es O, S o NJ1. En otra realización, cada grupo Z es, de forma independiente, alquilo C1-C6 sustituido con uno o más Xx, en el que cada Xx es, de forma independiente halo (por ejemplo, flúor), hidroxilo, alcoxi (por ejemplo, CH3O-) o azido.
En ciertas realizaciones, al menos un grupo Z es -CH2Xx, en el que Xx es OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 o CN; en los que cada uno de J1, J2 y J3 es, de forma independiente, H o alquilo C1-C6 y X es O, S o NJ1. En ciertas realizaciones, al menos un grupo Z es CH2Xx, en el que Xx es halo (por ejemplo, flúor), hidroxilo, alcoxi (por ejemplo, CH3O-) o azido.
En ciertas realizaciones, cada grupo Z es, de forma independiente, -CH2Xx, en el que Xx es, de forma independiente, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 o CN; en los que cada uno de J1, J2 y J3 es, de forma independiente, H o alquilo C1-C6 y X es O, S o NJ1. En otra realización, cada grupo Z es, de forma independiente, CH2Xx, en el que Xx es, de forma independiente, halo (por ejemplo, flúor), hidroxilo, alcoxi (por ejemplo, CH3O-) o azido.
En ciertas realizaciones, al menos un Z es CH3-. En otra realización, cada Z es CH3-.
En ciertas realizaciones, el grupo Z de al menos un mon�mero est� en la configuración (R) representada por la fórmula:
o la fórmula:
o la fórmula:
En ciertas realizaciones, el grupo Z de cada mon�mero de la fórmula est� en la configuración (R).
En ciertas realizaciones, el grupo Z de al menos un mon�mero est� en la configuración (S) representada por la 10 fórmula:
o la fórmula:
o la fórmula:
En ciertas realizaciones, el grupo Z de cada mon�mero de la fórmula est� en la configuración (S).
En ciertas realizaciones, cada T3 es H o un grupo protector de hidroxilo. En ciertas realizaciones, cada T4 es H o un grupo protector de hidroxilo. En una realización adicional, T3 es un grupo de unión internucleos�dica unido a un nucle�sido, nucleótido o una subunidad monom�rica. En ciertas realizaciones, T4 es un grupo de unión internucleos�dica unido a un nucle�sido, nucleótido o una subunidad monom�rica. En ciertas realizaciones, T3 es un grupo de unión internucleos�dica unido a un oligonucle�sido o a un oligonucle�tido. En ciertas realizaciones, T4 es un grupo de unión internucleos�dica unido a un oligonucle�sido o a un oligonucle�tido. En ciertas realizaciones, T3 es un grupo de unión internucleos�dica unido a un compuesto oligom�rico. En ciertas realizaciones, T4 es un grupo de unión internucleos�dica unido a un compuesto oligom�rico. En ciertas realizaciones, al menos uno de T3 y T4 comprende un grupo de unión internucleos�dica seleccionado de fosfodi�ster o fosforotioato.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligom�ricos tienen al menos una región de al menos dos mon�meros contiguos de la fórmula:
10 o de la fórmula:
o de la fórmula:
En ciertas realizaciones, el compuesto oligom�rico comprende al menos dos regiones de al menos dos mon�meros
15 contiguos de la fórmula anterior. En ciertas realizaciones, el compuesto oligom�rico comprende un compuesto oligom�rico con salto. En ciertas realizaciones, el compuesto oligom�rico comprende al menos una región de alrededor de 8 a alrededor de 14 nucle�sidos !-D-2’-desoxirribofuranosilo contiguos. En ciertas realizaciones, el compuesto oligom�rico comprende al menos una región de alrededor de 9 a alrededor de 12 nucle�sidos !-D-2’desoxirribofuranosilo contiguos.
20 En ciertas realizaciones, los mon�meros incluyen miméticos de azúcar. En ciertas de estas realizaciones, se usa un mimético en lugar del azúcar o de la combinación azúcar-unión internucleos�dica, y la base nucleot�dica se mantiene por hibridación a una diana seleccionada. Ejemplos representativos de miméticos de azúcar incluyen, pero no se limitan a, ciclohexenilo o morfolino. Ejemplos representativos de un mimético para una combinación de azúcar-unión internucleos�dica incluyen, pero no se limitan a, ácidos nucleicos pept�dicos (PNA) o grupos morfolino unidos por
25 enlaces aquirales sin carga. En algunos casos se usa un mimético en lugar de la base nucleot�dica. Miméticos de bases nucleot�dicas representativos son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, análogos de fenoxacina tric�clica y bases universales (Berger et al., Nuc Acid Res. 2000, 28:2911-14). Los métodos para la síntesis de azúcar, nucle�sidos y miméticos de bases nucleot�dicas son bien conocidos para los expertos en la técnica.
30 3. Enlaces monom�ricos
Aqu� se describen grupos ligadores que unen mon�meros (incluidos, pero sin limitarse a, nucle�sidos y nucleótidos modificados y no modificados), formando de este modo un compuesto oligom�rico. Las dos clases principales de grupos de unión se definen por la presencia o ausencia de un átomo de fósforo. Enlaces representativos que contienen fósforo incluyen, pero no se limitan a, fosforodi�steres (P=O), fosforotri�steres, metilfosfonatos, 35 fosforoamidato y fosforotioatos (P=S). Grupos de unión que no contienen fósforo representativos incluyen, pero no se limitan a, metilenmetilimino (-CH2-N(CH3)O-CH2-), tiodi�ster (-O-C(O)-S-), tionocarbamato (-O-C(O)(NH)-S-); siloxano (-O-Si(H)2-O-); y N,N’-dimetilhidrazina (-CH2-N(CH3)-N(CH3)-). Los compuestos oligom�ricos que tienen grupos de unión sin fósforo se denominan oligonucle�sidos. Se pueden usar enlaces modificados, en comparación con los enlaces fosfodi�ster naturales, para alterar, típicamente aumentar, la resistencia a la nucleasa del
40 compuesto oligom�rico. En ciertas realizaciones, se pueden preparar enlaces que tienen un átomo quiral, como mezclas rac�micas en forma de enanti�meros separados. Enlaces quirales representativos incluyen, pero no se limitan a, alquilfosfonatos y fosforotioatos. Los métodos para la preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Los compuestos oligom�ricos descritos aquí contienen uno o más centros asimétricos y pueden, por tanto, dar lugar a enanti�meros, diastere�meros y otras configuraciones estereoisom�ricas que pueden definirse en términos de estereoqu�mica absoluta como (R) o (S), ∀ o !, tal como para an�meros de azúcar, o como (D) o (L), tal como para amino�cidos. Incluidos en los compuestos antisentido proporcionados aquí est�n todos estos posibles isómeros, as�
5 como sus formas rac�micas y �pticamente puras.
4. Compuestos oligom�ricos
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquí compuestos oligom�ricos que tienen grupos de fósforo reactivos útiles para formar enlaces, incluyendo, por ejemplo, enlaces internucleos�dicos fosfodi�ster y fosforotioato. Los métodos de preparación y/o purificación de precursores o compuestos oligom�ricos no son una limitación de las
10 composiciones o métodos descritos aquí. Los métodos para la síntesis y purificación de compuestos oligom�ricos, incluyendo ADN, ARN, oligonucle�tidos, oligonucle�sidos y compuestos antisentido son bien conocidos por los expertos en la técnica.
En general, los compuestos oligom�ricos comprenden una pluralidad de subunidades monom�ricas unidas mediante grupos de unión. Ejemplos no limitantes de compuestos oligom�ricos incluyen cebadores, sondas, compuestos 15 antisentido, oligonucle�tidos antisentido, oligonucle�tidos de secuencias de guía externas (SGE), empalmadotes alternativos y ARNsi. Como tales, estos compuestos se pueden introducir en forma monocatenaria, bicatenaria, circular, ramificada o en horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias o bucles. Compuestos oligom�ricos bicatenarios pueden ser dos hebras hibridadas para formar compuestos bicatenarios o una sola hebra con suficiente autocomplementariedad para permitir la hibridación y la formación de un compuesto
20 completamente o parcialmente bicatenario.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona compuestos oligom�ricos quiméricos. En ciertas de estas realizaciones, los compuestos oligom�ricos quiméricos son oligonucle�tidos quiméricos. En ciertas de estas realizaciones, los oligonucle�tidos quiméricos comprenden nucleótidos modificados de forma diferente. En ciertas realizaciones, los oligonucle�tidos quiméricos son oligonucle�tidos antisentido de estructura mixta.
25 En general, un compuesto oligom�rico quimérico tendr� nucle�sidos modificados que pueden estar en posiciones aisladas o agrupados en regiones que definirán un motivo concreto. Cualquier combinación de modificaciones y/o grupos miméticos puede comprender un compuesto oligom�rico quimérico, tal como se describe aquí.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligom�ricos quiméricos típicamente comprenden al menos una región modificada de modo que confieren un incremento de la resistencia a la degradación por nucleasas, incremento de la 30 captación celular y/o incremento de la afinidad de unión por el ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una región adicional del compuesto oligom�rico puede servir como sustrato para las enzimas capaces de escindir ARN:ADN o híbridos ARN:ARN. A modo de ejemplo, la RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la hebra de ARN de un dúplex ARN:ADN. Por tanto, la activación de la RNasa H da lugar a la escisión del ARN diana, de modo que se potencia considerablemente la eficiencia de la inhibición de la expresión g�nica. En consecuencia, a
35 menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos oligom�ricos más cortos cuando se usan quimeras, en comparación con, por ejemplo, fosforotioato desoxioligonucle�tidos que hibridan con la misma región diana. La escisión del ARN diana se puede detectar de forma rutinaria mediante electroforesis en gel y, en caso necesario, técnicas asociadas de hibridación de ácidos nucleicos conocidas en la técnica.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligom�ricos quiméricos son g�pmeros. En ciertas realizaciones, los
40 compuestos quiméricos son compuestos antisentido cortos. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos son g�pmeros. En ciertas de estas realizaciones, un olig�mero antisentido de estructura mixta tiene un tipo de enlace internucleot�dico en una o ambas alas y un tipo diferente de enlaces internucleot�dicos en el salto. En ciertas de estas realizaciones, el olig�mero antisentido de estructura mixta tiene enlaces fosfodi�ster en las alas y enlaces fosforotioato en el salto. En ciertas realizaciones en las que el enlace internucleot�dico en un ala es diferente del
45 enlace internucleot�dico en el salto, el enlace internucleot�dico que une dicha ala y el salto es el mismo que el enlace internucleot�dico del ala. En ciertas realizaciones en las que el enlace internucleot�dico en un ala es diferente del enlace internucleot�dico en el salto, el enlace internucleot�dico que une dicha ala y el salto es el mismo que el enlace internucleot�dico del salto.
C. Ciertos compuestos antisentido cortos
50 Se describen aquí compuestos antisentido de 8 a 16, preferiblemente de 9 a 15, más preferiblemente de 9 a 14, más preferiblemente de 10 a 14 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 9 a 14 nucleótidos. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 10 a 14 nucleótidos. En ciertas realizaciones, dichos compuestos antisentido cortos son oligonucleot�dicos antisentido cortos.
55 En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden una o más modificaciones químicas. En ciertas de estas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden al menos un nucleótido modificado. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden al menos dos o más nucleótidos modificados. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden al menos un enlace
internucleot�dico modificado. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos son oligonucle�tidos de estructura mixta. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos son oligonucle�tidos quiméricos. En ciertas realizaciones, los oligonucle�tidos antisentido cortos se modifican de forma uniforme. En ciertas realizaciones, los oligonucle�tidos antisentido cortos comprenden modificaciones seleccionadas de forma independiente en cada base nucleot�dica y en cada enlace.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos son g�pmeros cortos. En ciertas de estas realizaciones, los g�pmeros cortos comprenden al menos una modificación de alta afinidad en una o más alas del compuesto. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden de 1 a 3 modificaciones de alta afinidad en cada ala. En ciertas realizaciones, las modificaciones de alta afinidad de los compuestos antisentido cortos permiten una afinidad por la diana similar, o incluso mayor, a la afinidad por la diana de compuestos antisentido más largos. En ciertas realizaciones, los nucleótidos modificados de alta afinidad son nucleótidos modificados con azúcar. Dichos nucleótidos modificados con azúcar incluyen aquellos que comprenden un puente entre las posiciones 4’ y 2’ del azúcar. Las modificaciones de alta afinidad ejemplares incluyen, pero no se limitan a, BNA y otras modificaciones en 2’, tal como 2’-MOE. En una realización alternativa de la invención, la modificación de alta afinidad no es un nucleótido modificado con azúcar 2’-O-(CH2)nH (n = 1-6). En una realización alternativa adicional, el nucleótido modificado de alta afinidad no es un nucleótido 2’-OCH3 o un 2’-OCH2CH2OCH3. En ciertas realizaciones, los nucleótidos modificados de alta afinidad confieren un Tm de al menos 1, al menos 1,5, al menos 2, al menos 2,5, al menos 3,0, al menos 3,5 o al menos 4,0 grados por nucleótido. En la técnica se sabe que algunas modificaciones nucleot�dicas de alta afinidad aumentan la toxicidad. Como se muestra aquí, los compuestos antisentido cortos que tienen un número limitado (en general de 2 a 6) de modificaciones de alta afinidad muestran poco o ningún aumento de toxicidad, pero conservan o aumentan la afinidad por el ARN diana, al tiempo que también reducen significativamente la expresión del ARN diana. Los compuestos antisentido cortos de la invención pueden comprender, opcionalmente, un grupo conjugado, tal como, por ejemplo, colesterol o C16.
1. Ciertas alas
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden un ala en 5’ y/o un ala en 3’. En dichas realizaciones, las características del ala en 3’ y las características del ala en 5’ se seleccionan de forma independiente. Por tanto, en dichas realizaciones, el número de mon�meros en el ala 5’ y el número de mon�meros (longitud) en el ala 3’ pueden ser iguales o pueden ser diferentes; las modificaciones, si las hay, en el ala 5’ pueden ser las mismas que las modificaciones, si las hay, en el ala 3’, o dichas modificaciones, si las hay, pueden ser diferentes; y los enlaces monom�ricos en el ala 5’ y los enlaces monom�ricos en el ala 3’ pueden ser iguales o pueden ser diferentes.
En ciertas realizaciones, un ala comprende uno, dos o tres mon�meros (es decir, tiene una longitud de 1, 2 � 3). En ciertas realizaciones, los mon�meros de un ala est�n modificados. En ciertas de tales realizaciones, los mon�meros del ala est�n modificados para incrementar la afinidad del compuesto antisentido por su ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, los mon�meros de un ala son nucle�sidos o nucleótidos. En ciertas de tales realizaciones, los nucle�sidos o nucleótidos del ala comprenden una modificación en 2’. En ciertas de tales realizaciones, los mon�meros (nucle�sidos o nucleótidos) del ala son BNA. En ciertas de tales realizaciones, los mon�meros del ala se seleccionan de ∀-L-metilenoxi (4’-CH2O-2’) BNA, !-D-metilenoxi (4’-CH2O-2’) BNA, etilenoxi 4’-(CH2)2-O-2’) BNA, aminooxi (4’-CH2-O-N(R)-2’) BNA y oxiamino (4’-CH2-N(R)-O-2’) BNA. En ciertas realizaciones, los mon�meros de un ala comprenden un sustituyente en la posición 2’ seleccionado de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2’-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) y O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), en los que cada Rm y Rn es, de forma independiente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, los mon�meros de un ala son nucleótidos 2’MOE.
En ciertas realizaciones, los enlaces monom�ricos en un ala son enlaces internucleot�dicos naturales. En ciertas realizaciones, los enlaces monom�ricos en un ala son enlaces internucleot�dicos no naturales o enlaces internucleos�dicos. En ciertas de tales realizaciones, los enlaces monom�ricos en el ala son más resistentes a una o más nucleasas que los enlaces internucleot�dicos naturales. En ciertas de tales realizaciones, los enlaces monom�ricos en el ala son enlaces fosforotioato (P=S). En ciertas realizaciones en las que un ala tiene más de un enlace monom�rico, los enlaces monom�ricos son iguales entre s�. En ciertas realizaciones en las que un ala tiene más de un enlace monom�rico, los enlaces monom�ricos son diferentes entre s�.
Un experto en la técnica reconocer� que las características y modificaciones tratadas anteriormente pueden usarse en cualquier combinación para preparar un ala. La tabla a continuación proporciona ejemplos no limitantes que muestran cómo se podría preparar un ala seleccionando un cierto número de mon�meros, modificaciones monom�ricas (si las hay) y enlaces monom�ricos dentro del ala.
Longitud
Tipo de mon�mero/modificaciones Enlaces monom�ricos dentro del ala
1
2’MOE Ninguno
1
BNA Ninguno
1
Metilenoxi BNA Ninguno
1
ENA Ninguno
2
2’MOE P=S
2
BNA P=S
2
Metilenoxi BNA P=S
2
ENA P=S
2
2’ MOE P=O
2
BNA P=O
2
Metilenoxi BNA P=O
2
ENA P=O
3
2’ MOE P=S
3
BNA P=S
3
Metilenoxi BNA P=S
3
ENA P=S
3
2’ MOE P=O
3
BNA P=O
3
Metilenoxi BNA P=O
3
ENA P=O
En ciertas realizaciones en las que un ala comprende dos, tres o cuatro mon�meros, dichos dos, tres o cuatro mon�meros comprenden todos ellos las mismas modificaciones, si las hay. En ciertas realizaciones en las que un ala comprende dos, tres o cuatro mon�meros, una o más de dichas dos, tres o cuatro bases nucleot�dicas
5 comprenden una o más modificaciones que son diferentes de una o más de las modificaciones de uno o más del resto de los mon�meros.
2. Ciertos saltos
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden un salto entre el ala en 5’ y el ala en 3’. En ciertas realizaciones, el salto comprende cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce
10 mon�meros. En ciertas realizaciones, los mon�meros del salto son desoxirribonucle�tidos no modificados. En ciertas realizaciones, los mon�meros del salto son ribonucle�tidos no modificados. En ciertas realizaciones, las modificaciones del salto (si las hay) dan como resultado un compuesto antisentido que, cuando se une a su ácido nucleico diana, soporta la escisión por una RNasa, incluyendo, pero sin limitarse a, RNasa H.
En ciertas realizaciones, los enlaces monom�ricos en el salto son enlaces internucleot�dicos naturales. En ciertas
15 realizaciones, los enlaces monom�ricos en el salto son enlaces internucleot�dicos no naturales. En ciertas de tales realizaciones, los enlaces monom�ricos en el salto son más resistentes a una o más nucleasas que los enlaces internucleot�dicos naturales. En ciertas de tales realizaciones, los enlaces monom�ricos en el salto son enlaces fosforotioato (P=S). En ciertas realizaciones, los enlaces monom�ricos en el salto son iguales entre s�. En ciertas realizaciones, los enlaces monom�ricos en el salto no son todos iguales.
20 Un experto en la técnica reconocer� que las características y modificaciones tratadas anteriormente pueden usarse en cualquier combinación para preparar un salto. La tabla a continuación proporciona ejemplos no limitantes que muestran cómo se podría preparar un salto seleccionando un cierto número de mon�meros, modificaciones monom�ricas (si las hay) y enlaces monom�ricos dentro de la región del salto.
Longitud
Tipo de mon�mero/modificaciones Enlaces monom�ricos dentro del salto
5
ADN P=S
6
ADN P=S
7
ADN P=S
8
ADN P=S
9
ADN P=S
10
ADN P=S
11
ADN P=S
12
ADN P=S
13
ADN P=S
14
ADN P=S
6
ADN P=O
7
ADN P=O
8
ADN P=O
9
ADN P=O
10
ADN P=O
11
ADN P=O
12
ADN P=O
8
ARN P=S
9
ARN P=S
10
ARN P=S
11
ARN P=S
12
ARN P=S
3. Ciertos compuestos oligom�ricos antisentido con saltos
Un experto normal en la técnica reconocer� que se pueden seleccionar las alas y los saltos tratados anteriormente y
5 después combinar en diversas combinaciones para generar compuestos oligom�ricos con saltos, incluyendo, pero sin limitarse a, compuestos oligom�ricos antisentido con saltos y oligonucle�tidos antisentido con saltos. Las características (longitud, modificaciones, enlaces) del ala en 5’ y del ala en 3’ pueden seleccionarse de forma independiente entre s�. Las características del salto incluyen al menos una diferencia en la modificación en comparación con las características del ala en 5’ y al menos una diferencia en comparación con las características
10 del ala en 3’ (es decir, debe haber al menos una diferencia en la modificación entre regiones adyacentes para distinguir dichas regiones adyacentes entre s�). Las características del salto pueden, por otro lado, seleccionarse de forma independiente.
En ciertas realizaciones, los enlaces monom�ricos en un ala y los enlaces monom�ricos dentro del salto son iguales. En ciertas realizaciones, los enlaces monom�ricos en un ala y los enlaces monom�ricos dentro del salto son 15 diferentes. En ciertas de tales realizaciones, el enlace monom�rico que une el ala y el salto es igual que los enlaces monom�ricos dentro del ala. En ciertas realizaciones, el enlace monom�rico que une el ala y el salto es igual que los enlaces monom�ricos dentro del salto. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen enlaces
uniformes a lo largo del compuesto. En ciertas de tales realizaciones, todos los enlaces son enlaces fosforotioato (P=S).
Un experto normal en la técnica reconocer� que las alas en 3’, las alas en 5’, los saltos y los enlaces tratados anteriormente pueden usarse en cualquier combinación para preparar un g�pmero. La tabla a continuación proporciona ejemplos no limitantes que muestran cómo se podría preparar un g�pmero seleccionando un cierto número de ala en 5’, un salto, un ala en 3’ y ciertos enlaces que unen el salto y cada ala.
Ala en 5’
Puente en 5’ salto Puente en 3’ Ala en 3’
Longitud
Mon�mero Enlace Enlace Longitud Mon�mero Enlace Enlace Longitud Mon�mero Enlace
2
MOE P=S P=S 6 ADN P=S P=S 2 MOE P=S
2
BNA P=S P=O 8 ADN P=O P=S 3 BNA P=S
1
MOE Ninguno P=S 10 ADN P=S P=S 1 MOE P=S
2
MOE P=S P=S 8 ARN P=S P=S 2 MOE P=S
3
Metilenoxi BNA P=S P=S 8 ARN P=S P=S 3 MOE P=S
3
ADN P=O P=O 10 ARN P=S P=O 3 2’OH P=O
2
2-F P=S P=S 5 ARN P=S P=S 2 2’-F P=S
1
MOE P=O P=S 5 ADN P=O P=S 4 MOE P=S
En ciertas realizaciones, los compuestos oligom�ricos descritos aquí pueden comprender de alrededor de 8 a alrededor de 16, preferiblemente de 9 a 15, más preferiblemente de 9 a 14, más preferiblemente de 10 a 14
10 mon�meros (es decir, de alrededor de 8 a alrededor de 16 mon�meros unidos). Un experto normal en la técnica apreciar� que esto comprende compuestos antisentido de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 � 16 bases nucleot�dicas. En ciertas realizaciones, los compuestos oligom�ricos son compuestos antisentido.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen 8 bases nucleot�dicas de longitud.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen 9 bases nucleot�dicas de longitud.
15 En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen 10 bases nucleot�dicas de longitud.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen 11 bases nucleot�dicas de longitud.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen 12 bases nucleot�dicas de longitud.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen 13 bases nucleot�dicas de longitud.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen 14 bases nucleot�dicas de longitud.
20 En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen 15 bases nucleot�dicas de longitud.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen 16 bases nucleot�dicas de longitud.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen 8 mon�meros de longitud. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen 9 mon�meros de longitud. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen 10 mon�meros de longitud. En ciertas realizaciones, los compuestos 25 antisentido cortos tienen 11 mon�meros de longitud. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen mon�meros de longitud. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen 13 mon�meros de longitud. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen 14 mon�meros de longitud. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen 15 mon�meros de longitud. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen 16 mon�meros de longitud. En ciertas realizaciones, los compuestos
30 antisentido cortos comprenden 9 a 15 mon�meros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden 10 a 15 mon�meros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden 12 a 14 mon�meros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden 12 a 14 nucleótidos o nucle�sidos.
Un experto en la técnica e informado de los compuestos antisentido cortos ilustrados aquí podr� identificar sin 35 experimentación adicional otros compuestos antisentido cortos.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden un salto flanqueado por más de un ala tanto en uno como en ambos lados. Por tanto, en ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto comprende dos o más alas en 5’ y dos o más alas en 3’. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto comprende un ala en 5’ y dos o más alas en 3’. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto comprende un ala en 3’ y dos o
5 más alas en 5’. Ciertas de tales realizaciones comprenden, por ejemplo, las regiones siguientes: un primer ala en 5’un puente -un segundo ala en 5’-un puente -un salto -un puente -un segundo ala en 3’ -un puente -un primer ala en 3’. En dichas realizaciones, cada región tiene al menos una diferencia en la modificación cuando se compara con su región adyacente. Por tanto, en dichas realizaciones, el segundo ala en 5’ y el segundo ala en 3’ comprenden, cada uno de forma independiente, una o más diferencias en la modificación cuando se compara con el salto y cuando se compara con el primer ala en 5’ y con el primer ala en 3’. En dichas realizaciones, las modificaciones del primer ala en 3’ y del primer ala en 5’ pueden ser, cada una o ambas, iguales o diferentes de las modificaciones del salto, si las hay.
4. Ciertos grupos conjugados
En un aspecto, los compuestos oligom�ricos est�n modificados mediante unión covalente de uno o más grupos
15 conjugados. En general, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del compuesto oligom�rico unido incluyendo, pero sin limitarse a, farmacodin�mica, farmacocin�tica, unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y aclaramiento. Los grupos conjugados se usan rutinariamente en las técnicas químicas y est�n unidos directamente o mediante un resto de unión o grupo de unión opcional a un compuesto parental, tal como un compuesto oligom�rico. Una lista preferida de grupos conjugados incluye, sin limitaciones, intercalantes, moléculas indicadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, tio�teres, poli�steres, colesteroles, tiocolesteroles, restos de ácido cólico, folato, lípidos, fosfol�pidos, biotina, fenazina, fenantridina, antraquinona, adamantano, acridina, fluoresce�nas, rodaminas, cumarinas y pigmentos.
Grupos conjugados preferidos en la presente invención incluyen restos lip�dicos, tales como un resto colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553); ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem.
25 Lett., 1994, 4, 1053); un tio�ter, por ejemplo hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765); un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533); una cadena alif�tica, por ejemplo residuos de dodecanodiol o undecilo (Saison-Hehmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49); un fosfol�pido, por ejemplo, dihexadecil-rac-glicerol o trietilamonio-1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777); una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969); ácido adamantano acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651); un resto palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229); o u resto octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923).
35 Grupos de unión o restos de unión bifuncionales, tales como los conocidos en la técnica, son adecuados para los compuestos proporcionados aquí. Los grupos de unión son útiles para la unión de grupos químicos funcionales, grupos conjugados, grupos indicadores y otros grupos para sitios selectivos en un compuesto parental, tal como, por ejemplo, un compuesto oligom�rico. En general, un resto de unión bifuncional comprende un resto hidrocarbilo que tiene dos grupos funcionales. Uno de los grupos funcionales se selecciona de modo que se una a una molécula parental o compuesto de interés y el otro se selecciona de modo que se una esencialmente a cualquier grupo seleccionado, tal como un grupo químico funcional o un grupo conjugado. En algunas realizaciones, el ligador comprende una estructura de cadena o un olig�mero de unidades repetidas, tales como unidades de etilenglicol o amino�cido. Ejemplos de grupos funcionales que se usan de forma rutinaria en un resto de unión bifuncional incluyen, pero no se limitan a, electr�filos para reaccionar con grupos nucle�filos y nucle�filos para reaccionar con
45 grupos electr�filos. En algunas realizaciones, restos de unión bifuncionales incluyen amino, hidroxilo, ácido carbox�lico, tiol, insaturaciones (por ejemplo, dobles o triples enlaces) y similares. Algunos ejemplos no limitantes de restos de unión bifuncionales incluyen ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (ADO), 4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1carboxilato de succinimidilo (SMCC) y ácido 6-aminohexanoico (AHEX o AHA). Otros grupos de unión incluyen, pero no se limitan a, alquilo C1-C10 sustituido, alquenilo C2-C10 sustituido o no sustituido o alquinilo C2-C10 sustituido o no sustituido, en los que una lista no limitante de grupos sustituyentes preferidos incluyen hidroxilo, amino, alcoxi, carboxi, bencilo, fenilo, nitro, tiol, tioalcoxi, halógeno, alquilo, arilo, alquenilo y alquinilo.
5. Síntesis, purificación y análisis
La oligomerizaci�n de nucle�sidos y nucleótidos modificados y no modificados se puede realizar de forma rutinaria de acuerdo con los procedimientos de la bibliografía ADN (Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal
55 (1993), Humana Press) y/o ARN (Scaringe, Methods (2001), 23, 206-217. Gait et al., Applications of Chemically synthesized RNA in RNA: Protein Interactions, Ed. Smith (1998), 1-36. Gallo et al., Tetrahedron (2001), 57, 57075713).
Los compuestos oligom�ricos proporcionados aquí pueden obtenerse de forma conveniente y rutinaria a través de la técnica bien conocida de la síntesis en fase sólida. El equipo para dicha síntesis se comercializa mediante diferentes proveedores incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). También se puede emplear adicionalmente o como alternativa cualquier otro medio para dicha síntesis. Es bien conocido el uso de técnicas similares para preparar oligonucle�tidos tales como fosforotioatos y derivados alquilados. La invención no est� limitada por el método de la síntesis de compuestos antisentido.
Los expertos en la técnica conocen métodos de purificación y análisis de compuestos oligom�ricos. Los métodos de
5 análisis incluyen electroforesis capilar (EC) y espectroscop�a de masas por electropulverizaci�n. Dichos métodos de síntesis y análisis pueden realizarse en placas de múltiples pocillos. El método de la invención no est� limitado por el método de la purificación de olig�meros.
D. Antisentido
Los mecanismos antisentido son todos aquellos que implican la hibridación de un compuesto con un ácido nucleico
10 diana, en los que el resultado o efecto de la hibridación es la degradación de la diana o la ocupación de la diana con la detención de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, transcripción o corte y empalme.
Un tipo de mecanismo antisentido que implica la degradación de la diana incluye una RNasa H. La RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la hebra de ARN de un dúplex ARN:ADN. En la técnica se sabe que los compuestos antisentido monocatenarios que son “similares a ADN” provocan actividad de RNasa H en células de
15 mamífero. Por tanto, la activación de la RNasa H da como resultado la escisión del ARN diana, de modo que se potencia considerablemente la eficiencia de la inhibición de la expresión g�nica mediada por oligonucle�tidos similares a ADN.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido modificados químicamente tienen una afinidad mayor por los ARN diana que los ADN no modificados. En ciertas de tales realizaciones, dicha afinidad mayor proporciona a su
20 vez mayor potencia, lo que permite la administración de dosis menores de dichos compuestos, menor potencial de toxicidad y mejora del índice terapéutico y menores costes globales de la terapia.
La presente descripción demuestra que la incorporación de nucleótidos y nucle�sidos de alta afinidad químicamente modificados en compuestos antisentido permite el diseño de compuestos antisentido cortos de una longitud de 8-16 bases nucleot�dicas útiles para la reducción de los ARN diana y/o las proteínas diana en células, tejidos y animales, 25 incluyendo, pero sin limitarse a, seres humanos con mayor potencia y mejor índice terapéutico. Por tanto, en ciertas realizaciones, se describen aquí compuestos antisentido cortos que comprenden modificaciones en nucleótidos de alta afinidad útiles para reducir un ARN diana in vivo. Ciertos de tales compuestos antisentido cortos son eficaces a dosis menores que los compuestos antisentido descritos anteriormente, lo que permite una reducción de la toxicidad y los costes de tratamiento. Además, ciertos compuestos antisentido cortos tienen mayor potencial para dosificación
30 oral.
Para abordar la necesidad de compuestos antisentido más potentes, aquí se describen compuestos antisentido cortos (de 8 a 16, preferiblemente de 9 a 15, más preferiblemente de 9 a 14, más preferiblemente de 10 a 14 nucleótidos de longitud) con mayor actividad in vivo respecto a los compuestos más largos. Ciertos compuestos antisentido cortos son compuestos g�pmeros que comprenden nucle�sidos químicamente modificados de alta 35 afinidad en los extremos 3’ y 5’ (alas) del compuesto. En ciertas realizaciones, la adición de nucleótidos modificados de alta afinidad permite que los compuestos antisentido sean activos, o específicos para, su ARN diana objetivo in vivo a pesar de tener una longitud más corta. Aquí se contemplan compuestos antisentido en los que cada una de las alas comprende de forma independiente de 1 a 3 nucleótidos modificados de alta afinidad. En ciertas realizaciones, las modificaciones de alta afinidad son modificaciones de azúcar. Los nucleótidos modificados de alta 40 afinidad incluyen, pero no se limitan a, BNA u otros nucleótidos modificados en 2’, tales como nucleótidos 2’-MOE. También se contemplan compuestos antisentido cortos que tienen al menos un enlace internucleot�dico modificado, tal como un enlace internucleot�dico fosforotioato. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos de la presente invención pueden tener todos los enlaces internucleos�dicos de fosforotioato. Los compuestos antisentido cortos comprenden, opcionalmente, un grupo conjugado. Como se muestra aquí, los compuestos antisentido cortos
45 tienen mayor afinidad por ARN diana que por ADN, y son significativamente más potentes in vivo, como se demuestra mediante la reducción del ARNm diana as� como la mejora de una diversidad de indicaciones de enfermedad.
Como se usa aquí, un ARN que est� implicado en la regulaci�n del metabolismo o aclaramiento de la glucosa, el metabolismo de los lípidos, el metabolismo del colesterol o el metabolismo de la insulina es cualquier ARN implicado
50 en las vías bioquímicas que regulan estos procesos. Dichos ARN son bien conocidos en la técnica.
1. Modulación de la expresión diana
En ciertas realizaciones, se identifica una diana y se diseñan oligonucle�tidos antisentido para modular dicha diana o su expresión. En ciertas realizaciones, el diseño de un compuesto oligom�rico para una molécula de ácido nucleico diana puede ser un procedimiento de múltiples etapas. Típicamente, el procedimiento comienza con la identificación 55 de una proteína diana cuya actividad se tiene que modular y, después identificando el ácido nucleico cuya expresión produce la proteína diana. En ciertas realizaciones, el diseño de un compuesto antisentido da como resultado un compuesto antisentido que se puede hibridar con la molécula de ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucle�tido antisentido o un oligonucle�sido antisentido. En ciertas realizaciones,
un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre s�. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido es perfectamente complementario de un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido incluye un apareamiento erróneo. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido incluye dos apareamientos erróneos. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido incluye tres o más apareamientos
5 erróneos.
La modulación de la expresión de un ácido nucleico diana se puede conseguir mediante la alteración de cualquier número de funciones del ácido nucleico. En ciertas realizaciones, las funciones del ARN que se van a modular incluyen, pero no se limitan a, funciones de translocaci�n, que incluyen, pero no se limitan a, translocaci�n del ARN a un sitio de traducción de proteínas, translocaci�n del ARN a sitios dentro de la célula que est�n lejos del sitio de la 10 síntesis de ARN, y traducción de proteínas a partir del ARN. Las funciones de procesamiento de ARN que se pueden modular incluyen, pero no se limitan a, corte y empalme del ARN para dar una o más especies de ARN, tapar los extremos del ARN, maduración en 3’ del ARN y actividad catalítica o formación de complejos que implican al ARN que se pueden unir o ser facilitados por el ARN. La modulación de la expresión puede dar como resultado el incremento de los niveles de una o más especies de ácido nucleico o la disminución de los niveles de una o más
15 especies de ácido nucleico, bien temporalmente o a un nivel neto en equilibrio. Por tanto, en una realización, modulación de la expresión puede significar aumentar o disminuir los niveles de ARN o de proteínas dianas. En otra realización, modulación de la expresión puede significar aumentar o disminuir uno o más productos de corte y empalme del ARN o un cambio en la proporción de dos o más productos de corte y empalme.
En ciertas realizaciones, la expresión de un gen diana se modula usando un compuesto oligom�rico que comprende
20 de alrededor de 8 a alrededor de 16, preferiblemente de 9 a 15, más preferiblemente de 9 a 14, más preferiblemente de 10 a 14 mon�meros (es decir, de alrededor de 8 a alrededor de 16 mon�meros unidos). Un experto normal en la técnica apreciar� que esto comprende métodos de modulación de la expresión de un gen diana usando uno o más compuestos antisentido de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 � 16 bases nucleot�dicas.
En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de un gen diana comprenden usar un compuesto antisentido
25 corto que tiene 8 bases nucleot�dicas de longitud. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de un gen diana comprenden usar un compuesto antisentido corto que tiene 9 bases nucleot�dicas de longitud. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de un gen diana comprenden usar un compuesto antisentido corto que tiene 8 bases nucleot�dicas de longitud. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de un gen diana comprenden usar un compuesto antisentido corto que tiene 10 bases nucleot�dicas de longitud. En ciertas
30 realizaciones, los métodos de modulación de un gen diana comprenden usar un compuesto antisentido corto que tiene 10 bases nucleot�dicas de longitud. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de un gen diana comprenden usar un compuesto antisentido corto que tiene 11 bases nucleot�dicas de longitud. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de un gen diana comprenden usar un compuesto antisentido corto que tiene 12 bases nucleot�dicas de longitud. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de un gen diana
35 comprenden usar un compuesto antisentido corto que tiene 13 bases nucleot�dicas de longitud. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de un gen diana comprenden usar un compuesto antisentido corto que tiene 14 bases nucleot�dicas de longitud. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de un gen diana comprenden usar un compuesto antisentido corto que tiene 15 bases nucleot�dicas de longitud. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de un gen diana comprenden usar un compuesto antisentido corto que
40 tiene 16 bases nucleot�dicas de longitud.
En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de la expresión de un gen diana comprenden el uso de un compuesto antisentido corto que comprende de 9 a 15 mon�meros. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de la expresión de un gen diana comprenden el uso de un compuesto antisentido corto que comprende de 10 a 15 mon�meros. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de la expresión de un gen diana
45 comprenden el uso de un compuesto antisentido corto que comprende de 12 a 14 mon�meros. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de la expresión de un gen diana comprenden el uso de un compuesto antisentido corto que comprende 12 � 14 nucleótidos o nucle�sidos.
2. Hibridación
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido hibridan específicamente cuando hay un grado suficiente de
50 complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto antisentido con secuencias de un ácido nucleico no diana en condiciones en las que se desea unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de los ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en las condiciones en las que se realizan los ensayos en el caso de ensayos in vitro.
Como se usa aquí, “condiciones rigurosas de hibridación” o “condiciones rigurosas” se refiere a condiciones en las
55 cuales un compuesto antisentido hibrida con su secuencia diana pero con un número mínimo de otras secuencias. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y ser�n diferentes en circunstancias diferentes y las “condiciones rigurosas” en las que los compuestos antisentido hibridan con una secuencia diana vienen determinadas por la naturaleza y la composición de los compuestos antisentido y de los ensayos en los que se est�n investigando.
3.
Complementariedad
En la técnica se entiende que la incorporación de modificaciones de afinidad en el nucleótido puede hacer que se produzca un mayor número de apareamientos erróneos en comparación con un compuesto no modificado. De forma similar, ciertas secuencias oligonucleot�dicas pueden ser más tolerantes a los apareamientos erróneos que otras secuencias oligonucleot�dicas. Un experto normal en la técnica es capaz de determinar un número adecuado de apareamientos erróneos entre oligonucle�tidos o entre un oligonucle�tido y un ácido nucleico diana, tal como mediante la determinación de la temperatura de fusión (Tm). Tm o Tm se pueden calcular mediante técnicas familiares para un experto normal en la técnica. Por ejemplo, las técnicas descritas en Freier et al. (Nucleic Acids Research, 1997, 25, 22: 4429-4443) permiten a un experto normal en la técnica evaluar en las modificaciones nucleot�dicas su capacidad para incrementar la temperatura de fusión de un dúplex ARN:ADN.
4.
Identidad
Los compuestos antisentido, o una porción de los mismos, pueden tener un porcentaje definido de identidad con una SEC ID NO o un compuesto que tenga un número Isis específico. Como se usa aquí, una secuencia es idéntica a la secuencia descrita aquí si tiene la misma capacidad de apareamiento de bases nucleot�dicas. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en las secuencias descritas de los compuestos descritos aquí se consideraría idéntico, ya que ambos se aparear�an con adenina. Esta identidad puede estar a lo largo de toda la longitud del compuesto oligom�rico, o en una porción del compuesto antisentido (por ejemplo, las bases nucleot�dicas 1-20 de un 27-mero pueden compararse con un 20-mero para determinar el porcentaje de identidad del compuesto oligom�rico con la SEC ID NO. Los expertos en la técnica entienden que un compuesto antisentido no tiene que tener una secuencia idéntica a la de los descritos aquí para funcionar de un modo similar al compuesto antisentido descrito aquí. Aquí también se proporcionan versiones más cortas de los compuestos antisentido enseñados aquí o versiones no idénticas de los compuestos antisentido enseñados aquí. Las versiones no idénticas son aquellas en las que cada base no tiene la misma actividad de apareamiento que los compuestos antisentido descritos aquí. Las bases no tienen la misma actividad de apareamiento por ser más cortas o por tener al menos un sitio ab�sico. Como alternativa, una versión no idéntica puede incluir al menos una base sustituida con una base diferente con distinta actividad de apareamiento (por ejemplo, G se puede sustituir por C, A o T). El porcentaje de identidad se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen idéntico apareamiento de bases correspondiente a la SEC ID NO o al compuesto antisentido con el que se est� comparando. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes entre s�, dispersas por el oligonucle�tido o ambas cosas.
Por ejemplo, un 16-mero que tiene la misma secuencia que las bases nucleot�dicas 2-17 de un 20-mero es un 80% idéntico al 20-mero. Como alternativa, un 20-mero que contiene cuatro bases nucleot�dicas no idénticas al 20-mero es también un 80% idéntico al 20-mero. Un 14-mero que tiene la misma secuencia que las bases nucleot�dicas 1-14 de un 18-mero es un 78% idéntico al 18-mero. Dichos cálculos entran dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.
El porcentaje de identidad se basa en el porcentaje de bases nucleot�dicas en la secuencia original presentes en una porción de la secuencia modificada. Por tanto, un compuesto antisentido de 30 bases nucleot�dicas que comprende la secuencia completa de la complementaria de un segmento diana activo de 20 bases nucleot�dicas tendría una porción de identidad del 100% con el complementario del segmento diana activo de 20 bases nucleot�dicas, al tiempo que además comprende una porción adicional de 10 bases nucleot�dicas. En el contexto de la presente descripción, el complementario de un segmento diana activo puede constituir una única porción. En realizaciones preferidas, los oligonucle�tidos proporcionados aquí son al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idénticos a al menos una porción del complementario de los segmentos diana activos presentados aquí.
E. ácidos nucleicos, regiones y segmentos diana
El ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico que codifica ApoB. Las moléculas de ácido nucleico que codifican ApoB incluyen, sin limitaciones, SEC ID NO 1 y SEC ID NO: 2 que codifican ApoB humano y de ratón (NM_000384.1) y XM_137955.5).
El procedimiento de apuntar a una diana incluye la determinación de al menos una región, segmento o sito diana dentro del ácido nucleico diana para que se produzca la interacción antisentido de modo que dé como resultado el efecto deseado.
En ciertas realizaciones, el nucleótido más en 5’ de una región diana es el sitio diana en 5’ de un compuesto antisentido corto, y el nucleótido más en 3’ de una región diana es el sitio diana en 3’ del mismo compuesto antisentido corto. En ciertas realizaciones, el nucleótido más en 5’ de una región diana es el sitio diana en 5’ de un compuesto antisentido corto, y el nucleótido más en 3’ de una región diana es el sitio diana en 3’ de un compuesto antisentido corto diferente. En ciertas realizaciones, una región diana comprende una secuencia nucleot�dica dentro de 10, 15 � 20 nucleótidos de un sitio diana en 5’ o un sitio diana en 3’.
En ciertas realizaciones, una región diana es una región estructuralmente definida del ácido nucleico. Por ejemplo, en ciertas de tales realizaciones, una región diana puede abarcar una 3’ UTR, una 5’ UTR, un ex�n, un intr�n, una
regi�n codificadora, una región de inicio de la traducción, una región de terminación de la traducción u otra región de ácido nucleico definida.
Las localizaciones sobre el ácido nucleico diana definido por tener uno o más compuestos antisentido cortos activos diana se denominan “segmentos diana activos”. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana que tiene uno o más compuestos antisentido cortos activos diana es ARN diana. Cuando un segmento diana activo se define por múltiples compuestos antisentido cortos, los compuestos est�n separados preferiblemente por no más de alrededor de 10 nucleótidos sobre la secuencia diana, más preferiblemente no más de alrededor de 5 nucleótidos sobre la secuencia diana, incluso más preferiblemente los compuestos antisentido cortos son contiguos, más preferiblemente los compuestos antisentido cortos se solapan. Puede haber una considerable variación de la actividad (por ejemplo, definida por el porcentaje de inhibición) de los compuestos antisentido cortos dentro de un segmento diana activo. Los compuestos antisentido cortos activos son aquellos que modulan la expresión de su ácido nucleico diana, incluyendo, pero sin limitarse a, un ARN diana. Los compuestos antisentido cortos activos inhiben la expresión de su ARN diana al menos un 10%, preferiblemente un 20%. En una realización preferida, al menos alrededor del 50%, preferiblemente alrededor del 70% de los compuestos antisentido cortos dirigidos al segmento diana activo modulan la expresión de su ARN diana al menos un 40%. En una realización más preferida, el nivel de inhibición requerido para definir un compuesto antisentido corto activo se define en base a los resultados del cribado usado para definir los segmentos diana activos.
Un segmento diana adecuado es una porción de al menos alrededor de 8 bases nucleot�dicas de una región diana a la que est� dirigido un compuesto antisentido corto activo. Los segmentos diana pueden incluir secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos las 8 bases nucleot�dicas consecutivas desde el extremo 5’ de uno de los segmentos diana ilustrativos (siendo las bases nucleot�dicas restantes una tira consecutiva del mismo ADN o ARN comenzando inmediatamente antes del extremo 5’ del segmento diana y continuando hasta que el ADN o ARN comprende de alrededor de 8 a alrededor de 16 bases nucleot�dicas). Los segmentos diana también est�n representados por secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos las 8 bases nucleot�dicas consecutivas desde el extremo 3’ de uno de los segmentos diana ilustrativos (siendo las bases nucleot�dicas restantes una tira consecutiva del mismo ADN o ARN comenzando inmediatamente después del extremo 3’ del segmento diana y continuando hasta que el ADN o ARN comprende de alrededor de 8 a alrededor de 16 bases nucleot�dicas). Se entiende también que los segmentos diana antisentido se pueden representar por secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos 8 bases nucleot�dicas consecutivas de una porción interna de la secuencia de un segmento diana ilustrativo y pueden extenderse en una o ambas direcciones hasta que el compuesto antisentido corto comprende de alrededor de 8 a alrededor de 16 bases nucleot�dicas. Un experto en la técnica armado con los segmentos diana ilustrados aquí podr�, sin experimentación indebida, identificar otros segmentos diana.
Una vez que se han identificado una o más regiones, segmentos o sitios diana, se escogen los compuestos antisentido cortos que son suficientemente complementarios a la diana, es decir hibridan suficientemente bien y con suficiente especificidad, para dar el efecto deseado.
Los compuestos antisentido cortos también pueden estar dirigidos a regiones de la secuencia de bases nucleot�dicas diana que comprende cualquier base nucleot�dica consecutiva de 8 a 16 bases nucleot�dicas de longitud a lo largo de la molécula de ácido nucleico diana.
Los segmentos diana de 8 a 16 bases nucleot�dicas de longitud que comprenden una tira de al menos ocho (8) bases nucleot�dicas consecutivas seleccionadas del interior de los segmentos diana ilustrativos también se consideran adecuados como diana. Por tanto, los compuestos antisentido cortos también pueden abarcar 8-16 bases nucleot�dicas con los segmentos identificados aquí comenzando en un sitio diana en 5’ concreto. Cualquier segmento de 8, 9, 10, 11, o, más preferiblemente, de 12, 13, 14, 15 o 16 bases nucleot�dicas contiguas en un perímetro de 50, preferiblemente 25, más preferiblemente 16 bases nucleot�dicas alrededor de estas regiones también se consideran adecuados como diana.
En una realización adicional, los “segmentos diana adecuados” identificados aquí se pueden emplear en una criba para compuestos antisentido cortos adicionales que modulan la expresión de un ácido nucleico diana. “Moduladores” son los compuestos que disminuyen o incrementan la expresión de un ácido nucleico diana y que comprenden al menos una porción de 8 bases nucleot�dicas que es complementaria a un segmento diana. El método de criba comprende las etapas de poner en contacto un segmento diana de un ácido nucleico con uno o más moduladores candidatos y seleccionar uno o más moduladores candidatos que disminuyan o incrementen la expresión de un ácido nucleico diana. Una vez que se ha demostrado que el modulador o moduladores candidatos diana son capaces de modular (por ejemplo, disminuir o aumentar) la expresión de un ácido nucleico diana, el modulador puede emplearse en estudios de investigación adicionales de la función de la diana, o para usar como agente de investigación, diagnóstico o terapéutico de acuerdo con la presente descripción.
Para todos los compuestos antisentido cortos tratados aquí, secuencia, mon�mero, modificación monom�rica y enlace monom�rico pueden, cada uno, seleccionarse de forma independiente. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos est�n descritos con un motivo. En dichas realizaciones, cualquier motivo puede usarse con cualquier secuencia, se describan específicamente aquí o no, la secuencia y/o el motivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden modificaciones que no son adecuados para describir con un motivo (por ejemplo, los compuestos antisentido cortos que comprenden varias modificaciones y/o enlaces diferentes en varias posiciones a lo largo del compuesto). Dichas combinaciones se pueden incorporar para cualquier secuencia, se describa o no aquí. El listado de secuencias que acompaña a esta presentación proporciona ciertas secuencias de ácido nucleico independientes de la modificación química. Aunque dicho listado identifica cada
5 secuencia como “ARN” o “ADN”, según se requiera, en realidad dichas secuencias pueden modificarse con cualquier combinación de modificaciones químicas y/o motivos.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden al menos un mon�mero modificado de alta afinidad. En ciertas realizaciones se proporcionan compuestos antisentido cortos dirigidos a moléculas de ácido nucleico que codifican ApoB-100 (también conocida como APOB; ant�geno Ag(x); apoB-48; apolipoprote�na B;
10 apolipoprote�na B-100; apolipoprote�na B-48).
F. Ciertas dianas
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos pueden diseñarse de modo que modulen cualquier diana. En ciertas realizaciones, la diana es cl�nicamente relevante. En dichas realizaciones, la modulación de la diana da como resultado un beneficio cl�nico. Ciertas dianas se expresan, preferentemente, en el ri��n. Ciertas
15 dianas se expresan, preferiblemente, en el hígado. Ciertas dianas se asocian con un trastorno metabólico. Ciertas dianas se asocian con un trastorno cardiovascular. En ciertas realizaciones, la diana es ApoB.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos exhiben in vivo una reducción del ARN diana específico del ri��n y del hígado. Dicha propiedad convierte a dichos compuestos antisentido cortos en particularmente útiles para la inhibición de muchos ARN diana implicados en enfermedades metabólicas y cardiovasculares. Por tanto, se
20 describen aquí métodos para tratar trastornos metabólicos y cardiovasculares poniendo en contacto dichos tejidos renales o hepáticos con compuestos antisentido cortos dirigidos a ARN asociados con dichos trastornos. Por tanto, aquí también se describen métodos para mejorar cualquiera de diversas indicaciones de enfermedad metabólica o cardiovascular con los compuestos antisentido cortos de la presente descripción.
1. ApoB
25 La ApoB (también conocida como apolipoprote�na B-100; ApoB-100, apolipoprote�na B-48; ApoB-48 y ant�geno Ag(x)) es una glucoprote�na grande que desempeña un papel indispensable en el ensamblaje y secreción de lípidos y en el transporte y captación mediada por receptor y liberación de distintas clases de lipoprote�nas. La ApoB realiza diversas actividades, desde la absorción y procesamiento de lípidos de la dieta hasta la regulaci�n de los niveles circulantes de lipoprote�na (Davidson y Shelness, Annu. Rev Nutr., 2000, 20, 169-193). Esta última propiedad
30 destaca su relevancia en términos de susceptibilidad a la aterosclerosis, que se correlaciona considerablemente con la concentración ambiental de lipoprote�nas que contienen ApoB (Davidson y Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193). La ApoB-100 es el principal componente proteico de LDL-C y contiene el dominio requerido para la interacción de esta especie de lipoprote�na con el receptor de LDL. Los niveles elevados de LDL-C son un factor de riesgo de enfermedad cardiovascular, incluida la aterosclerosis.
35 Definiciones
La “ApoB” es el producto g�nico o proteína cuya expresión se va a modular mediante la administración de un compuesto antisentido corto.
“ácido nucleico de ApoB” significa cualquier ácido nucleico que codifica la ApoB. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un ácido nucleico de ApoB incluye, sin limitaciones, una secuencia de ADN que codifica ApoB, una
40 secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica ApoB, y una secuencia de ARNm que codifica la ApoB.
“ARNm de ApoB” significa un ARNm que codifica la ApoB.
Indicaciones terapéuticas de ApoB
En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para modular la expresión de ApoB en un individuo, que comprende administrar un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB. En ciertas 45 realizaciones, se describen aquí métodos para tratar a un individuo, que comprenden administrar una o más composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB. En ciertas realizaciones, el individuo tiene hipercolesterolemia, hipercolesterolemia no familiar, hipercolesterolemia familiar, hipercolesterolemia familiar heterocig�tica, hipercolesterolemia familiar homocig�tica, dislipidemia mixta, aterosclerosis, un riesgo de desarrollar aterosclerosis, cardiopat�a coronaria, antecedentes de cardiopat�a coronaria,
50 cardiopat�a coronaria de inicio precoz, uno o más factores de riesgo de cardiopat�a coronaria, diabetes de tipo II, diabetes de tipo II con dislipidemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, hiperacidemia grasa, esteatosis hepática, esteatohepatitis no alcohólica o enfermedad de hígado graso no alcohólica.
Las guías para terapias hipolipemiantes se establecieron en el 2001, en el Panel de Tratamiento de adultos III (ATP III) del Programa Nacional educativo sobre colesterol de EE.UU. (NCEP) y se actualizaron en 2004 (Grundy et al., 55 Circulation, 2004, 110, 227-239). Las guías incluyen obtener un perfil lipoproteico completo, normalmente después
de ayunar durante 9 a 12 horas, para la determinación de los niveles de LDL-C, colesterol total y HDL-C. De acuerdo con las guías más recientemente establecidas, los niveles de LDL-C de 130-159 mg/dl, 160-189 mg/dl y mayores o iguales a 190 mg/dl se consideran en el límite alto, alto y muy alto, respectivamente. Niveles de colesterol de 200239 y mayores o iguales a 240 mg/dl se consideran en el límite alto y altos, respectivamente. Niveles de HDL-C inferiores a 40 mg/dl se consideran bajos.
En ciertas realizaciones, se ha identificado que el individuo necesita terapia hipolipemiante. En ciertas de tales realizaciones, se ha identificado que el individuo necesita terapia hipolipemiante de acuerdo con las guías establecidas en 2001 por Panel de Tratamiento de adultos III (ATP III) del Programa Nacional educativo sobre colesterol de EE.UU. (NCEP) y actualizadas en 2004 (Grundy et al., Circulation, 2004, 110, 227-239). En ciertas de tales realizaciones, el individuo que necesita terapia hipolipemiante tiene un nivel de LDL-C superior a 190 mg/dl. En ciertas de tales realizaciones, el individuo que necesita terapia hipolipemiante tiene un nivel de LDL-C superior a 160 mg/dl. En ciertas de tales realizaciones, el individuo que necesita terapia hipolipemiante tiene un nivel de LDL-C superior a 130 mg/dl. En ciertas de tales realizaciones, el individuo que necesita terapia hipolipemiante tiene un nivel de LDL-C superior a 100 mg/dl. En ciertas de tales realizaciones, el individuo que necesita terapia hipolipemiante debe mantener el nivel de LDL-C por debajo de 160 mg/dl. En ciertas de tales realizaciones, el individuo que necesita terapia hipolipemiante debe mantener el nivel de LDL-C por debajo de 130 mg/dl. En ciertas de tales realizaciones, el individuo que necesita terapia hipolipemiante debe mantener el nivel de LDL-C por debajo de 100 mg/dl. En ciertas de tales realizaciones, el individuo debe mantener el nivel de LDL-C por debajo de 70 mg/dl.
En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para reducir la ApoB en un individuo. En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para reducir en un individuo los niveles de lipoprote�nas que contienen ApoB. En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para reducir el nivel de LDL-C en un individuo. En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para reducir el nivel de VLDL-C en un individuo. En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para reducir el nivel de IDL-C en un individuo. En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para reducir el nivel de no HDL-C en un individuo. En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para reducir Lp(a) en un individuo. En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para reducir los triglic�ridos en suero en un individuo. En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para reducir los triglic�ridos hepáticos en un individuo. En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para reducir el nivel de Ox-LDL-C en un individuo. En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para reducir las partículas pequeñas de LDL en un individuo. En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para reducir las partículas pequeñas de VLDL en un individuo. En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para reducir los fosfol�pidos en un individuo. En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para reducir los fosfol�pidos oxidados en un individuo.
En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para reducir la concentración de Ox-LDL-C en un sujeto. En ciertas de tales realizaciones, la reducción de ApoB, LDL-C, VLDL-C, IDL-C, colesterol total, no-HDL-C, Lp(a), triglic�ridos u Ox-LDL-C se selecciona, de forma independiente, de al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% y al menos 100%. En ciertas de tales realizaciones, la reducción de ApoB, LDL-C, VLDL-C, IDL-C, colesterol total, no-HDL-C, Lp(a), triglic�ridos u Ox-LDL-C se selecciona, de forma independiente, de al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60% y al menos 70%. En ciertas de tales realizaciones, la reducción de ApoB, LDL-C, VLDL-C, IDL-C, colesterol total, no-HDL-C, Lp(a), triglic�ridos u Ox-LDL-C se selecciona, de forma independiente, de al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, y al menos 70%.
En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para elevar la concentración de HDL-C en un sujeto.
En ciertas realizaciones, los métodos descritos aquí no reducen los niveles de HDL-C. En ciertas realizaciones, los métodos descritos aquí no dan como resultado la acumulación de lípidos en el hígado. En ciertas realizaciones, los métodos descritos aquí no producen esteatosis hepática.
En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para reducir la concentración de ApoB en un sujeto al tiempo que se reducen los efectos secundarios asociados con el tratamiento. En ciertas de tales realizaciones, un efecto secundario es toxicidad hepática. En ciertas de tales realizaciones, un efecto secundario es una función hepática anómala. En ciertas de tales realizaciones, un efecto secundario es elevación de los niveles de alanina aminotransferasa (ALT). En ciertas de tales realizaciones, un efecto secundario es elevación de los niveles de aspartato aminotransferasa (AST).
En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para reducir la concentración de ApoB en un sujeto que no alcanza los niveles diana de LDL-C como resultado de la terapia hipolipemiante. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB es el único agente hipolipemiante administrado al sujeto. En ciertas de tales realizaciones, el sujeto no ha cumplido la terapia hipolipemiante recomendada. En ciertas de tales realizaciones, una composición farmacéutica de la descripción se administra junto con una terapia hipolipemiante adicional diferente. En ciertas de tales realizaciones, una terapia hipolipemiante adicional es af�resis de LDL. En ciertas de tales realizaciones, una terapia hipolipemiante adicional es una estatina. En ciertas de tales realizaciones, una terapia hipolipemiante adicional es ezetimiba.
En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para disminuir la concentración de ApoB en un sujeto intolerante a estatinas. En ciertas de tales realizaciones, el sujeto presenta incrementos de la concentración de creatina cinasa como resultado de la administración de estatinas. En ciertas de tales realizaciones, el sujeto presenta anomalías en la función hepática como resultado de la administración de estatinas. En ciertas de tales
5 realizaciones, el sujeto presenta dolores musculares como resultado de la administración de estatinas. En ciertas de tales realizaciones, el sujeto tiene efectos secundarios sobre el sistema nervioso central como resultado de la administración de estatinas. En ciertas realizaciones, el sujeto no ha cumplido la terapia de estatinas recomendada.
En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para disminuir los niveles de triglic�ridos en hígado en un sujeto. En ciertas de tales realizaciones, el sujeto tiene niveles elevados de triglic�ridos en el hígado. En ciertas de
10 tales realizaciones, el sujeto tiene esteatohepatitis. En ciertas de tales realizaciones, el sujeto tiene esteatosis. En ciertas de tales realizaciones, los niveles de triglic�ridos en hígado se miden mediante pruebas de imagen de resonancia magnética.
En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para reducir el riesgo de cardiopat�a coronaria en un sujeto. En ciertas realizaciones, los métodos son para ralentizar la progresión de la aterosclerosis en un sujeto. En ciertas de
15 tales realizaciones, los métodos son para detener la progresión de la aterosclerosis en un sujeto. En ciertas de tales realizaciones, los métodos son para reducir el tamaño y/o la prevalencia de las placas ateroscler�ticas en un sujeto. En ciertas realizaciones, los métodos reducen el riesgo de un sujeto de desarrollar aterosclerosis.
En ciertas realizaciones, los métodos descritos mejoran el resultado cardiovascular en un sujeto. En ciertas de tales realizaciones, el resultado cardiovascular mejorado es la reducción del riesgo de desarrollar cardiopat�a coronaria. 20 En ciertas de tales realizaciones, el resultado cardiovascular mejorado es una reducción en la aparición de uno o más acontecimientos cardiovasculares importantes, que incluyen, pero no se limitan a, muerte, infarto de miocardio, reinfarto, ictus, shock cardiog�nico, edema pulmonar, parada cardíaca y arritmia ventricular. En ciertas de tales realizaciones, el resultado cardiovascular mejorado se pone de manifiesto por la mejora del espesor de la media íntima de la carótida. En ciertas de tales realizaciones, la mejora del espesor de la media íntima de la carótida es
25 una disminución del espesor. En ciertas de tales realizaciones, la mejora del espesor de la media íntima de la carótida es una prevención de un incremento del espesor de la media íntima.
En ciertas de tales realizaciones, una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB es para usar en terapia. En ciertas realizaciones, la terapia es la reducción de LDL-C, ApoB, VLDL-C, IDL-C, no-HDL-C, Lp(a), triglic�ridos en suero, triglic�ridos en hígado, Ox-LDL-C, partículas 30 pequeñas de LDL, VLDL pequeñas, fosfol�pidos o fosfol�pidos oxidados en un individuo. En ciertas realizaciones, la terapia es el tratamiento de hipercolesterolemia, hipercolesterolemia no familiar, hipercolesterolemia familiar, hipercolesterolemia familiar heterocig�tica, hipercolesterolemia familiar homocig�tica, dislipidemia mixta, aterosclerosis, un riesgo de desarrollar aterosclerosis, cardiopat�a coronaria, antecedentes de cardiopat�a coronaria, cardiopat�a coronaria de inicio precoz, uno o más factores de riesgo de cardiopat�a coronaria, diabetes de tipo II,
35 diabetes de tipo II con dislipidemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, hiperacidemia grasa, esteatosis hepática, esteatohepatitis no alcohólica o enfermedad de hígado graso no alcohólica. En realizaciones adicionales, la terapia es la reducción del riesgo de CPC. En ciertas realizaciones, la terapia es la prevención de la aterosclerosis. En ciertas realizaciones, la terapia es la prevención de cardiopat�a coronaria.
En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido corto dirigido a un
40 ácido nucleico de ApoB se usa para la preparación de un medicamento para reducir los niveles de LDL-C, ApoB, VLDL-C, IDL-C, no-HDL-C, Lp(a), triglic�ridos en suero, triglic�ridos en hígado, Ox-LDL-C, partículas pequeñas de LDL, VLDL pequeñas, fosfol�pidos o fosfol�pidos oxidados en un individuo. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB se usa para la preparación de un medicamento para reducir el riesgo de cardiopat�a coronaria. En ciertas realizaciones, un
45 compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB se usa para la preparación de un medicamento para el tratamiento de hipercolesterolemia, hipercolesterolemia no familiar, hipercolesterolemia familiar, hipercolesterolemia familiar heterocig�tica, hipercolesterolemia familiar homocig�tica, dislipidemia mixta, aterosclerosis, un riesgo de desarrollar aterosclerosis, cardiopat�a coronaria, antecedentes de cardiopat�a coronaria, cardiopat�a coronaria de inicio precoz, uno o más factores de riesgo de cardiopat�a coronaria, diabetes de tipo II,
50 diabetes de tipo II con dislipidemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, hiperacidemia grasa, esteatosis hepática, esteatohepatitis no alcohólica, o enfermedad de hígado graso no alcohólica.
Terapias de combinación con ApoB
En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB se administran conjuntamente con uno o más agentes farmacéuticos distintos. 55 En ciertas realizaciones, dichos uno o más agentes farmacéuticos distintos est�n diseñados para tratar la misma enfermedad o afección que las una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención. En ciertas de tales realizaciones, los uno o más agentes farmacéuticos son agentes hipolipemiantes. En ciertas realizaciones, dichos uno o más agentes farmacéuticos distintos est�n diseñados para tratar otra enfermedad o afección distinta a la de las una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención. En ciertas realizaciones, dichos uno o más 60 agentes farmacéuticos distintos est�n diseñados para tratar un efecto indeseado de las una o más composiciones
farmac�uticas de la presente invención. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran conjuntamente con otro agente farmacéutico para tratar un efecto indeseado de dicho otro agente farmacéutico. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno o más agentes farmacéuticos distintos se administran al mismo tiempo. En ciertas realizaciones, una
o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno o más agentes farmacéuticos distintos se administran en momentos diferentes. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno o más agentes farmacéuticos distintos se preparan juntos en una única formulación. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno o más agentes farmacéuticos distintos se preparan por separado.
En ciertas realizaciones, los agentes farmacéuticos que se pueden administrar de forma conjunta con una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB incluyen agentes hipolipemiantes. En ciertas de tales realizaciones, los agentes farmacéuticos que se pueden administrar de forma conjunta con una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, atorvastatina, simvastatina, rosuvastatina y ezetimiba. En ciertas de tales realizaciones, el agente hipolipemiante se administra antes de la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. En ciertas de tales realizaciones, el agente hipolipemiante se administra después de la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. En ciertas de tales realizaciones, el agente hipolipemiante se administra al mismo tiempo que la composición farmacéutica de la presente invención. En ciertas de tales realizaciones, la dosis de un agente hipolipemiante coadministrado es la misma que la dosis que se administraría si el agente hipolipemiante se administrara solo. En ciertas de tales realizaciones, la dosis de un agente hipolipemiante coadministrado es menor que la dosis que se administraría si el agente hipolipemiante se administrara solo. En ciertas de tales realizaciones, la dosis de un agente hipolipemiante coadministrado es mayor que la dosis que se administraría si el agente hipolipemiante se administrara solo.
En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un inhibidor de la HMG-CoA reductasa. En ciertas de tales realizaciones, el inhibidor de la HMG-CoA reductasa es una estatina. En ciertas de tales realizaciones, la estatina se selecciona de atorvastatina, simvastatina, pravastatina, fluvastatina y rosuvastatina.
En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un inhibidor de la absorción de colesterol. En ciertas de tales realizaciones, el inhibidor de la absorción de colesterol es ezetimiba.
En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un inhibidor de la HMG-CoA reductasa formulado conjuntamente con un inhibidor de la absorción de colesterol. En ciertas de tales realizaciones, el agente hipolipemiante formulado conjuntamente es ezetimiba/simvastatina.
En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un inhibidor de la proteína de transferencia de triglic�ridos microsomal (inhibidor de MTP).
En ciertas realizaciones, un agente farmacéutico coadministrado es un secuestrante de ácidos biliares. En ciertas de tales realizaciones, el secuestrante de ácidos biliares se selecciona de colestiramina, colestipol y colesevelam.
En ciertas realizaciones, un agente farmacéutico coadministrado es un ácido nicot�nico. En ciertas de tales realizaciones, el ácido nicot�nico se selecciona de ácido nicot�nico de liberación inmediata, ácido nicot�nico de liberación extendida y ácido nicot�nico de liberación sostenida.
En ciertas realizaciones, un agente farmacéutico coadministrado es un ácido f�brico. En ciertas de tales realizaciones, el ácido f�brico se selecciona de gemfibrozilo, fenofibrato, clofibrato, bezafibrato y ciprofibrato.
Otros ejemplos de agentes farmacéuticos que se pueden administrar de forma conjunta con una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB incluyen, pero no se limitan a, corticosteroides, incluyendo, pero sin limitarse a, prednisona; inmunoglobulinas, incluyendo, pero sin limitarse a, inmunoglobulina intravenosa (IgIV); analgésicos (por ejemplo, acetaminofeno); agentes antiinflamatorios, incluyendo, pero sin limitarse a, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (por ejemplo, ibuprofeno, inhibidores de la COX-1 e inhibidores de la COX-2); salicilatos; antibióticos; antivirales; agentes antif�ngicos; agentes antidiab�ticos (por ejemplo, biguanidas, inhibidores de la glucosidasa, insulinas, sulfonilureas y tiazolidendionas); modificadores adren�rgicos; diuréticos; hormonas (por ejemplo, esteroides anab�licos, andr�genos, estr�genos, calcitonina, progestina, somatostatina y hormonas tiroideas); inmunomoduladores; relajantes musculares; antihistam�nicos, agentes antiosteoporosis (por ejemplo, bisfosfonatos, calcitonina y estr�genos); prostaglandinas, agentes antineopl�sicos; agentes psicoterap�uticos; sedantes; roble venenoso atlántico o zumaque veneoso; anticuerpos; y vacunas.
En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB se puede administrar junto con una terapia hipolipemiante. En ciertas de tales realizaciones, una terapia hipolipemiante es un cambio terapéutico del estilo de vida. En ciertas de tales realizaciones, una terapia hipolipemiante es af�resis de LDL.
En una realización, los compuestos antisentido proporcionados aquí se pueden usar para disminuir el nivel de lipoprote�nas que contienen apolipoprote�na B en un sujeto humano. Como se usa aquí, “lipoprote�na que contiene apolipoprote�na B” se refiere a cualquier lipoprote�na que tiene apolipoprote�na B como su componente proteico y se entiende que incluye LDL, VLDL, IDL, y lipoprote�na(a). Cada uno de LDL, VLDL, IDL, y lipoprote�na(a) contienen
5 una molécula de apolipoprote�na B, por tanto la medida de la apolipoprote�na B en suero refleja el número total de estas lipoprote�nas. Como se conoce en la técnica, cada una de las lipoprote�nas mencionadas en lo que antecede es aterog�nica. Por tanto, la reducción de una o más lipoprote�nas que contienen apolipoprote�na B en suero puede proporcionar un beneficio terapéutico a un sujeto humano. Las partículas pequeñas de LDL se consideran particularmente aterog�nicas con respecto a las partículas grandes de LDL. Por lo que la reducción de las partículas pequeñas de LDL puede proporcionar un beneficio terapéutico a un sujeto humano. También se pueden determinar parámetros lip�dicos adicionales en un sujeto. La reducción de la proporción colesterol total:HDL o de la proporción LDL:HDL es una mejora cl�nicamente deseable en la proporción del colesterol. De forma similar, es cl�nicamente deseable reducir los triglic�ridos en suero en seres humanos que exhiben niveles elevados de lípidos.
Otras indicaciones de enfermedad cardiovascular que se pueden medir en un sujeto incluyen el tamaño de la
15 partícula de LDL; la concentración en suero de LDL éster de colesterilo; la composición en suero de LDL éster de colesterilo; la extensión de la poliinsaturaci�n de LDL ésteres de colesterilo en suero; y los niveles en suero de HDL colesterol. Como se usa aquí, “el tamaño de partícula de LDL en suero” se refiere a la clasificación del tamaño de partícula de LDL en suero, que puede ser muy pequeña, pequeña, medio o grande, y típicamente se expresa en g/#mol. En el contexto de la presente invención, “concentración en suero de LDL éster de colesterilo” quiere decir la cantidad de éster de colesterilo presente en las partículas de LDL y típicamente se mide en mg/dl. En el contexto de la presente invención, “composición en suero de LDL éster de colesterilo” es una medida del porcentaje de ésteres de colesterilo de ácidos grasos saturados, monoinsaturados y poliinsaturados presentes en las partículas de LDL en suero. “Poliinsaturaci�n de ésteres de colesterilo en LDL en suero” quiere decir el porcentaje de ésteres de colesterilo de ácidos grasos poliinsaturados en las partículas de LDL en suero.
25 Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para obtener muestras de suero o plasma para análisis y métodos de preparación de las muestras de suero para análisis. Con respecto a las determinaciones de lipoprote�nas, colesterol, triglic�ridos y ésteres de colesterilo, los términos “suero” y “plasma” se usan aquí de forma intercambiable.
En otra realización, los compuestos antisentido proporcionados aquí se pueden usar para tratar trastornos metabólicos. Se puede emplear una diversidad de biomarcadores para evaluar la enfermedad metabólica. Por ejemplo, un m�dico, o incluso el paciente, puede determinar los niveles de glucosa en sangre usando un kit de análisis disponible habitualmente o un glucos�metro (por ejemplo, el kit Ascensia ELITE™, Ascensia (Bayer), Tarrytown NY, o Accucheck, Roche Diagnostics). También se pueden medir los niveles de hemoglobina glucada (HbAIc). La HbAIc es una variante de hemoglobina minoritaria estable formada in vivo mediante la modificación
35 postraduccional de la glucosa y contiene, principalmente, cadena ! glucada en NH2-terminal. Existe una fuerte correlación entre los niveles de HbAIc y los niveles medios de glucosa en sangre durante los 3 meses previos. Por tanto, la HbAIc a menudo se ve como “el patrón” para medir el control sostenido de la glucosa en sangre (Bunn, H.F. et al., 1978, Science. 200, 21-7). La HbAIc se puede medir mediante HPLC de intercambio iónico o mediante inmunoensayo; actualmente se dispone de gran cantidad de kit para recolección domiciliara de sangre y su envío para la determinación de HbAIc. La fructosamina en suero es otra medida del control estable de la glucosa y se puede medir mediante un método colorim�trico (Cobas Integra, Roche Diagnostics).
Ciertos compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos est�n dirigidos a un ácido nucleico de ApoB que tiene la secuencia de número de acceso en GENBANK� NM_000384.1, incorporada aquí como SEC ID NO: 1. En ciertas de
45 tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a la SEC ID NO: 1 es al menos un 90% complementario a la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a la SEC ID NO: 1 es al menos un 95% complementario a la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a la SEC ID NO: 1 es 100% complementario a la SEC ID NO: 1. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de las secuencias nucleot�dicas indicadas en la Tabla 1 y en la Tabla 2.
La secuencia nucleot�dica indicada en cada SEC ID NO en las Tablas 1 y 2 es independiente de cualquier modificación de un resto de azúcar, un enlace monom�rico o una base nucleot�dica. Como tales, los compuestos antisentido cortos definidos por una SEC ID NO pueden comprender, de forma independiente, una o más modificaciones en un resto de azúcar, un enlace internucleos�dico o una base nucleot�dica. Los compuestos 55 antisentido descritos por el Número Isis (n� Isis) indican una combinación de secuencia de bases nucleot�dicas y una
o más modificaciones en un resto de azúcar, un enlace internucleos�dico o una base nucleot�dica.
Las Tablas 1 y 2 ilustran ejemplos de compuestos antisentido cortos dirigidos a la SEC ID NO: 1. La Tabla 1 ilustra compuestos antisentido cortos que son 100% complementarios a la SEC ID NO: 1. La Tabla 2 ilustra compuestos antisentido cortos que tienen uno o dos apareamientos erróneos con respecto a la SEC ID NO: 1. La columna denominada “motivo g�pmero” indica el motivo ala-salto-ala de cada compuesto antisentido corto. El segmento salto
comprende 2’-desoxinucle�tidos y cada nucleótido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado en 2’. El azúcar modificado en 2’ concreto también est� indicado en la columna “motivo g�pmero”. Por ejemplo, “2-10-2 MOE” significa un motivo g�pmero 2-10-2, en el que un segmento de salto de diez 2’-desoxinucle�tidos est� flanqueado por segmentos ala de dos nucleótidos, en los que los nucleótidos de los segmentos ala son nucleótidos 5 2’-MOE. Los enlaces internucleos�dicos son fosforotioato. Los compuestos antisentido cortos comprenden 5-metilcitidina en lugar de citosina no modificada, a menos que “citosina no modificada” est� en la lista en la columna del motivo g�pmero, en cuyo caso las citosinas indicadas son citosinas no modificadas. Por ejemplo, “5-mC sólo en salto” indica que el segmento de salto tiene 5-metilcitosinas, mientras que los segmentos ala tienen citosinas no modificadas.
10 Tabla 1: Compuestos antisentido cortos dirigidos a la SEC ID NO: 1
N� ISIS
Sitio diana en 5’ Sitio diana en 3’ Secuencia (5’-3’) Motivo g�pmero SEC ID NO
372816
263 278 CCGGAGGTGCTTGAAT 3-10-3 MOE 16
372894
264 277 CGGAGGTGCTTGAA 2-10-2 MOE 17
372817
428 443 GAAGCCATACACCTCT 3-10-3 MOE 18
372895
429 442 AAGCCATACACCTC 2-10-2 MOE 19
372818
431 446 GTTGAAGCCATACACC 3-10-3 MOE 20
372896
432 445 TTGAAGCCATACAC 2-10-2 MOE 21
372819
438 453 CCTCAGGGTTGAAGCC 3-10-3 MOE 22
372897
439 452 CTCAGGGTTGAAGC 2-10-2 MOE 23
372820
443 458 TTTGCCCTCAGGGTTG 3-10-3 MOE 24
372898
444 457 TTGCCCTCAGGGTT 2-10-2 MOE 25
372821
468 483 AGTTCTTGGTTTTCTT 3-10-3 MOE 26
372899
469 482 GTTCTTGGTTTTCT 2-10-2 MOE 27
372822
587 602 CCTCTTGATGTTCAGG 3-10-3 MOE 28
372900
588 601 CTCTTGATGTTCAG 2-10-2 MOE 29
372823
592 607 ATGCCCCTCTTGATGT 3-10-3 MOE 30
372901
593 606 TGCCCCTCTTGATG 2-10-2 MOE 31
346583
715 728 TGCCACATTGCCCT 3-8-3 MOE 32
346584
716 729 TTGCCACATTGCCC 3-8-3 MOE 33
346585
717 730 GTTGCCACATTGCC 3-8-3 MOE 34
346586
718 731 TGTTGCCACATTGC 3-8-3 MOE 35
346587
719 732 CTGTTGCCACATTG 3-8-3 MOE 36
346588
720 733 TCTGTTGCCACATT 3-8-3 MOE 37
346589
721 734 TTCTGTTGCCACAT 3-8-3 MOE 38
346590
722 735 TTTCTGTTGCCACA 3-8-3 MOE 39
346591
723 736 ATTTCTGTTGCCAC 3-8-3 MOE 40
372824
929 944 GTAGGAGAAAGGCAGG 3-10-3 MOE 41
372902
930 943 TAGGAGAAAGGCAG 2-10-2 MOE 42
372825
1256 1271 GGCTTGTAAAGTGATG 3-10-3 MOE 43
372903
1257 1270 GCTTGTAAAGTGAT 2-10-2 MOE 44
372826
1304 1319 CCACTGGAGGATGTGA 3-10-3 MOE 45
372904
1305 1318 CACTGGAGGATGTG 2-10-2 MOE 46
372829
2135 2150 TTTCAGCATGCTTTCT 3-10-3 MOE 47
372907
2136 2149 TTCAGCATGCTTTC 2-10-2 MOE 48
372832
2774 2789 CATATTTGTCACAAAC 3-10-3 MOE 49
372910
2775 2788 ATATTTGTCACAAA 2-10-2 MOE 50
372833
2779 2794 ATGCCCATATTTGTCA 3-10-3 MOE 51
372911
2780 2793 TGCCCATATTTGTC 2-10-2 MOE 52
372835
2961 2976 TTTTGGTGGTAGAGAC 3-10-3 MOE 53
372913
2962 2975 TTTGGTGGTAGAGA 2-10-2 MOE 54
346592
3248 3261 TCTGCTTCGCACCT 3-8-3 MOE 55
346593
3249 3262 GTCTGCTTCGCACC 3-8-3 MOE 56
346594
3250 3263 AGTCTGCTTCGCAC 3-8-3 MOE 57
346595
3251 3264 CAGTCTGCTTCGCA 3-8-3 MOE 58
346596
3252 3265 TCAGTCTGCTTCGC 3-8-3 MOE 59
346597
3253 3266 CTCAGTCRGCTTCG 3-8-3 MOE 60
346598
3254 3267 CCTCAGTCTGCTTC 3-8-3 MOE 61
346599
3255 3268 GCCTCAGTCTGCTT 3-8-3 MOE 62
346600
3256 3269 AGCCTCAGTCTGCT 3-8-3 MOE 63
372836
3350 3365 AACTCTGAGGATTGTT 3-10-3 MOE 64
372914
3351 3364 ACTCTGAGGATTGT 2-10-2 MOE 65
372837
3355 3370 TCATTAACTCTGAGGA 3-10-3 MOE 66
372915
3356 3369 CATTAACTCTGAGG 2-10-2 MOE 67
372838
3360 3375 ATTCATCATTAACTCT 3-10-3 MOE 68
372916
3361 3374 TTCATCATTAACTC 2-10-2 MOE 69
372839
3409 3424 TTGTTCTGAATGTCCA 3-10-3 MOE 70
387461
3409 3424 TTGTTCTGAATGTCCA 3-10-3 Metilenoxi BNA citosinas no modificadas en el salto 70
380147
3409 3424 TTGTTCTGAATGTCCA 3-10-3 Metilenoxi BNA 70
372917
3410 3423 TGTTCTGAATGTCC 2-10-2 MOE 73
372840
3573 3588 CAGATGAGTCCATTTG 3-10-3 MOE 74
372918
3574 3587 AGATGAGTCCATTT 2-10-2 MOE 75
372841
3701 3716 ATCCACAGGGAAATTG 3-10-3 MOE 76
372919
3702 3715 TCCACAGGGAAATT 2-10-2 MOE 77
372843
4219 4234 CAGTTGTACAAGTTGC 3-10-3 MOE 78
372921
4220 4233 AGTTGTACAAGTTG 2-10-2 MOE 79
372844
4301 4316 CACAGAGTCAGCCTTC 3-10-3 MOE 80
372922
4302 4315 ACAGAGTCAGCCTT 2-10-2 MOE 81
372845
4308 4323 GGTCAACCACAGAGTC 3-10-3 MOE 82
372923
4309 4322 GTCAACCACAGAGT 2-10-2 MOE 83
346601
5588 5601 CAGCCACATGCAGC 3-8-3 MOE 84
346602
5589 5602 CCAGCCACATGCAG 3-8-3 MOE 85
346603
5590 5603 ACCAGCCACATGCA 3-8-3 MOE 86
346604
5591 5604 TACCAGCCACATGC 3-8-3 MOE 87
346605
5592 5605 TTACCAGCCACATG 3-8-3 MOE 88
346606
5593 5606 GTTACCAGCCACAT 3-8-3 MOE 89
346607
5594 5607 GGTTACCAGCCACA 3-8-3 MOE 90
346608
5595 5608 AGGTTACCAGCCAC 3-8-3 MOE 91
346609
5596 5609 TAGGTTACCAGCCA 3-8-3 MOE 92
372851
5924 5939 AGGTTCTGCTTTCAAC 3-10-3 MOE 93
372929
5925 5938 GGTTCTGCTTTCAA 2-10-2 MOE 94
372854
6664 6679 TACTGATCAAATTGTA 3-10-3 MOE 95
372932
6665 6678 ACTGATCAAATTGT 2-10-2 MOE 96
372855
6908 6923 TTTTTCTTGTATCTGG 3-10-3 MOE 97
372933
6909 6922 TTTTCTTGTATCTG 2-10-2 MOE 98
372856
7190 7205 ATCCATTAAAACCTGG 3-10-3 MOE 99
372934
7191 7204 TCCATTAAAACCTG 2-10-2 MOE 100
372858
7817 7832 ATATTGCTCTGCAAAG 3-10-3 MOE 101
372936
7818 7831 TATTGCTCTGCAAA 2-10-2 MOE 102
346610
7818 7831 TATTGCTCTGCAAA 3-8-3 MOE 102
346611
7819 7832 ATATTGCTCTGCAA 3-8-3 MOE 104
346612
7820 7833 AATATTGCTCTGCA 3-8-3 MOE 105
346613
7821 7834 GAATATTGCTCTGC 3-8-3 MOE 106
346614
7822 7835 AGAATATTGCTCTG 3-8-3 MOE 107
346615
7823 7836 TAGAATATTGCTCT 3-8-3 MOE 108
346616
7824 7837 ATAGAATATTGCTC 3-8-3 MOE 109
346617
7825 7838 GATAGAATATTGCT 3-8-3 MOE 110
346618
7826 7839 GGATAGAATATTGC 3-8-3 MOE 111
372859
7995 8010 ATGGAATCCTCAAATC 3-10-3 MOE 112
372937
7996 8009 TGGAATCCTCAAAT 2-10-2 MOE 113
372861
8336 8351 GAATTCTGGTATGTGA 3-10-3 MOE 114
372939
8337 8350 AATTCTGGTATGTG 2-10-2 MOE 115
372862
8341 8356 AGCTGGAATTCTGGTA 3-10-3 MOE 116
372940
8342 8355 GCTGGAATTCTGGT 2-10-2 MOE 117
372863
8539 8554 TGAAAATCAAAATTGA 3-10-3 MOE 118
372941
8540 8553 GAAAATCAAAATTG 2-10-2 MOE 119
372871
9344 9359 AAACAGTGCATAGTTA 3-10-3 MOE 120
372949
9345 9358 AACAGTGCATAGTT 2-10-2 MOE 121
372872
9515 9530 TTCAGGAATTGTTAAA 3-10-3 MOE 122
372950
9516 9529 TCAGGAATTGTTAA 2-10-2 MOE 123
372875
9794 9809 TTTTGTTTCATTATAG 3-10-3 MOE 124
372953
9795 9808 TTTGTTTCATTATA 2-10-2 MOE 125
372877
10157 10172 GATGACACTTGATTTA 3-10-3 MOE 126
372955
10158 10171 ATGACACTTGATTT 2-10-2 MOE 127
372878
10161 10176 GTGTGATGACACTTGA 3-10-3-MOE 128
372956
10162 10175 TGTGATGACACTTG 2-10-2 MOE 129
372879
10167 10182 TATTCAGTGTGATGAC 3-10-3 MOE 130
372957
10168 10181 ATTCAGTGTGATGA 2-10-2 MOE 131
372880
10172 10187 ATTGGTATTCAGTGTG 3-10-3 MOE 132
372958
10173 10186 TTGGTATTCAGTGT 2-10-2 MOE 133
346619
10838 10851 CCTCTAGCTGTAAG 3-8-3 MOE 134
346620
10839 10852 CCCTCTAGCTGTAA 3-8-3 MOE 135
346621
10840 10853 GCCCTCTAGCTGTA 3-8-3 MOE 136
346622
10841 10854 GGCCCTCTAGCTGT 3-8-3 MOE 137
346623
10842 10855 AGGCCCTCTAGCTG 3-8-3 MOE 138
346624
10843 10856 GAGGCCCTCTAGCT 3-8-3 MOE 139
346625
10844 10857 AGAGGCCCTCTAGC 3-8-3 MOE 140
346626
10845 10858 AAGAGGCCCTCTAG 3-8-3 MOE 141
346627
10846 10859 AAAGAGGCCCTCTA 3-8-3 MOE 142
372890
13689 13704 GAATGGACAGGTCAAT 3-10-3 MOE 143
372968
13690 13703 AATGGACAGGTCAA 2-10-2 MOE 144
372891
13694 13709 GTTTTGAATGGACAGG 3-10-3 MOE 145
372969
13695 13708 TTTTGAATGGACAG 2-10-2 MOE 146
372892
13699 13714 TGGTAGTTTTGAATGG 3-10-3 MOE 147
372970
13700 13713 GGTAGTTTTGAATG 2-10-2 MOE 148
346628
13907 13920 TCACTGTATGGTTT 3-8-3 MOE 149
346629
13908 13921 CTCACTGTATGGTT 3-8-3 MOE 150
346630
13909 13922 GCTCACTGTATGGT 3-8-3 MOE 151
346631
13910 13923 GGCTCACTGTATGG 3-8-3 MOE 152
346632
13911 13924 TGGCTCACTGTATG 3-8-3 MOE 153
346633
13912 13925 CTGGCTCACTGTAT 3-8-3 MOE 154
346634
13913 13926 GCTGGCTCACTGTA 3-8-3 MOE 155
346635
13914 13927 GGCTGGCTCACTGT 3-8-3 MOE 156
346636
13915 13928 AGGCTGGCTCACTG 3-8-3 MOE 157
346637
13963 13976 CAGGTCCAGTTCAT 3-8-3 MOE 158
346638
13964 13977 GCAGGTCCAGTTCA 3-8-3 MOE 159
346639
13965 13978 TGCAGGTCCAGTTC 3-8-3 MOE 160
346640
13966 13979 GTGCAGGTCCAGTT 3-8-3 MOE 161
346641
13967 13980 GGTGCAGGTCCAGT 3-8-3 MOE 162
346642
13968 13981 TGGTGCAGGTCCAG 3-8-3 MOE 163
346643
13969 13982 TTGGTGCAGGTCCA 3-8-3 MOE 164
346644
13970 13983 TTTGGTGCAGGTCC 3-8-3 MOE 165
346645
13971 13984 CTTTGGTGCAGGTC 3-8-3 MOE 166
346646
14051 14064 TAACTCAGATCCTG 3-8-3 MOE 167
346647
14052 14065 ATAACTCAGATCCT 3-8-3 MOE 168
346648
14053 14066 AATAACTCAGATCC 3-8-3 MOE 169
346649
14054 14067 AAATAACTCAGATC 3-8-3 MOE 170
346650
14055 14068 AAAATAACTCAGAT 3-8-3 MOE 171
346651
14056 14069 CAAAATAACTCAGA 3-8-3 MOE 172
346652
14057 14070 GCAAAATAACTCAG 3-8-3 MOE 173
346653
14058 14071 AGCAAAATAACTCA 3-8-3 MOE 174
346654
14059 14072 TAGCAAAATAACTC 3-8-3 MOE 175
Tabla 2: Compuestos antisentido cortos dirigidos a la SEC ID NO: 1 y que tienen 1 � 2 apareamientos erróneos
N� ISIS
Sitio diana en 5’ Sitio diana en 3’ Secuencia (5’-3’) Motivo g�pmero SEC ID NO
372894
771 784 CGGAGGTGCTTGAA 2-10-2 MOE 17
372905
1111 1124 CAGGGCCTGGAGAG 2-10-2 MOE 176
346628
1493 1506 TCACTGTATGGTTT 3-8-3 MOE 149
372828
2006 2021 TCTGAAGTCCATGATC 3-10-3 MOE 177
372906
2007 2020 CTGAAGTCCATGAT 2-10-2 MOE 178
372830
2382 2397 TGGGCATGATTCCATT 3-10-3 MOE 179
372908
2383 2396 GGGCATGATTCCAT 2-10-2 MOE 180
346616
3162 3175 ATAGAATATTGCTC 3-8-3 MOE 109
346617
3163 3176 GATAGAATATTGCT 3-8-3 MOE 110
372929
3513 3526 GGTTCTGCTTTCAA 2-10-2 MOE 94
372946
3800 3813 TGGAGCCCACGTGC 2-10-2 MOE 181
372904
4040 4053 CACTGGAGGATGTG 2-10-2 MOE 46
372842
4084 4099 TTGAAGTTGAGGGCTG 3-10-3 MOE 182
372920
4085 4098 TGAAGTIGAGGGCT 2-10-2 MOE 183
346586
4778 4791 TGTTGCCACATTGC 3-8-3 MOE 35
372847
5030 5045 ACCAGTATTAATTTTG 3-10-3 MOE 184
372925
5031 5044 CCAGTATTAATTTT 2-10-2 MOE 185
372848
5192 5207 GTGTTCTTTGAAGCGG 3-10-3 MOE 186
372926
5193 5206 TGTTCTTTGAAGCG 2-10-2 MOE 187
372953
5625 5638 TTTGTTTCATTATA 2-10-2 MOE 125
372935
7585 7598 AGTTACTTTGGTGT 2-10-2 MOE 188
372860
8255 8270 TGGTACATGGAAGTCT 3-10-3 MOE 189
372938
8256 8269 GGTACATGGAAGTC 2-10-2 MOE 190
391260
8256 8269 GGTACATGGAAGTC 2-10-2 MOE 190
392068
8256 8269 GGTACATGGAAGTC 2-10-2 MOE 190
387462
8256 8269 GGTACATGGAAGTC 2-10-2 metilenoxi BNA 190
391872
8256 8269 GGTACATGGAAGTC 1-1-10-22’-(butilacetomido)-palmitamida metilenoxi BNA/metilenoxi BNA Citosinas no modificadas en el salto 190
380148
8256 8269 GGTACATGGAAGTC 2-10-2 Metilenoxi BNA 190
391871
8256 8269 GGTACATGGAAGTC 1-1-10-2 2'-(butilacetomido)palmitamida/MOE/MOE Citosinas no modificadas en el salto 190
391755
8256 8269 GGTACATGGAAGTC 2-10-2 ENA mC sólo en el ala 190
398296
8256 8269 GGTACATGGAAGTC 2-10-2 (6'S)-6'-metil-Metilenoxi BNA Citosinas no modificadas 190
372942
8455 8468 TCCATGCCATATGT 2-10-2 MOE 200
372865
8888 8903 CCCTGAAGAAGTCCAT 3-10-3 MOE 201
372943
8889 8902 CCTGAAGAAGTCCA 2-10-2 MOE 202
372866
8908 8923 GCCCAGTTCCATGACC 3-10-3 MOE 203
372944
8909 8922 CCCAGTTCCATGAC 2-10-2 MOE 204
372867
9058 9073 TTGAGGAAGCCAGATT 3-10-3 MOE 205
372945
9059 9072 TGAGGAAGCCAGAT 2-10-2 MOE 206
372870
9261 9276 TGGATGCAGTAATCTC 3-10-3 MOE 207
372948
9262 9275 GGATGCAGTAATCT 2-10-2 MOE 208
372881
10185 10200 TATAAAGTCCAGCATT 3-10-3 MOE 209
372959
10186 10199 ATAAAGTCCAGCAT 2-10-2 MOE 210
372882
10445 10460 AAGTTCCTGCTTGAAG 3-10-3 MOE 211
372960
10446 10459 AGTTCCTGCTTGAA 2-10-2 MOE 212
372964
11451 11464 AATGGTGAAGTACT 2-10-2 MOE 213
346612
13459 13472 AATATTGCTCTGCA 3-8-3 MOE 105
346613
13460 13473 GAATATTGCTCTGC 3-8-3 MOE 106
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 263-278 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a los nucleótidos 263-278 de la SEC ID NO: 1 comprenden una secuencia nucleot�dica seleccionada de la SEC ID NO: 16 � 17. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 263-278 de la SEC ID NO: 1 se selecciona del no Isis 372816 � 372894.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 428-483 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 428-483 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, � 27. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 428-483 de la SEC ID N� 1 se selecciona de
5 los nos Isis 372817, 372895, 372818, 372896, 372819, 372897, 372820, 372898, 372821, � 372899.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 428-458 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 428-458 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 � 25. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 428-458 de la SEC ID NO: 1 se selecciona de los nos Isis
10 372817, 372895, 372818, 372896, 372819, 372897, 372820 � 372898.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 468-483 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 468-483 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 26 � 27. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 468-483 de la SEC ID NO: 1 se selecciona del n� Isis 372821 � 372899.
15 En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 587-607 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 587-607 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 28 29, 30, � 31. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 587-607 de la SEC ID NO: 1 se selecciona de los nos Isis 372822, 372900, 372823 � 372901.
20 En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 715-736 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 715-736 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 � 40. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 715-736 de la SEC ID NO: 1 se selecciona de los nos Isis 346583, 346584, 346585, 346586, 346587, 346588, 346589, 346590 � 346591.
25 En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 929-944 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 929-944 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 41 � 42. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 929-944 de la SEC ID NO: 1 se selecciona del n� Isis 372824 � 372902.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 1256-1319 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales
30 realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1256-1319 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 43 44, 45, � 46. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1256-1319 de la SEC ID NO: 1 se selecciona de los nos Isis 372825, 372903, 372826 � 372904.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 1256-1271 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales
35 realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1256-1271 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 43 � 44. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1256-1271 de la SEC ID N� 1 se selecciona del n� Isis 372825 � 372903.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 1304-1319 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1304-1319 de la SEC ID NO: 1 comprende 40 una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 45 � 46. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1304-1319 de la SEC ID NO: 1 se selecciona del n� Isis 372826 � 372904.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 2135-2150 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 2135-2150 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 47 � 48. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto 45 antisentido corto dirigido a los nucleótidos 2135-2150 de la SEC ID NO: 1 se selecciona del n� Isis 372829 � 372907.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 2774-2794 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 2774-2794 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 49 50, 51, � 52. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 2774-2794 de la SEC ID NO: 1 se selecciona de los nos Isis
50 372832, 372910, 372833 � 372911.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 2961-2976 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 2961-2976 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 53 � 54. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 2961-2976 de la SEC ID NO: 1 se selecciona del n� Isis 372835 � 372913.
55 En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 3248-3269 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 3248-3269 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 � 63. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 3248-3269 de la SEC ID NO: 1 se selecciona de los nos Isis 346592, 346593, 346594, 346595, 346596, 346597, 346598, 346599 � 346600.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 3350-3375 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales
5 realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 3350-3375 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 64 65, 66, 67, 68 � 69. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 3350-3375 de la SEC ID NO: 1 se selecciona de los nos Isis 372836, 372914, 372837, 372915, 372838, � 372916.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 3409-3424 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales
10 realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 3409-3424 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 70 � 73. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 3409-3424 de la SEC ID NO: 1 se selecciona de los nos Isis 372839, 387461, 380147 � 372917.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 3573-3588 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales
15 realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 3573-3588 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 74 � 75. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 3573-3588 de la SEC ID NO: 1 se selecciona del n� Isis 372840 � 372918. En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 3701-3716 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 3701-3716 de la SEC ID NO: 1 comprende
20 una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 76 � 77. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 3701-3716 de la SEC ID NO: 1 se selecciona del n� Isis 372841 � 372919.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 4219-4234 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 4219-4234 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 78 � 79. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto 25 antisentido corto dirigido a los nucleótidos 4219-4234 de la SEC ID NO: 1 se selecciona del n� Isis 372843 � 372921.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 4301-4323 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 4301-4323 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 80, 81, 82, u 83. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 4301-4323 de la SEC ID NO: 1 se selecciona de los nos Isis 372844,
30 372922, 372845 � 372923.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 5588-5609 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 5588-5609 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 � 92. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 5588-5609 de la SEC ID NO: 1 se selecciona
35 de los nos Isis 346601, 346602, 346603, 346604, 346605, 346606, 346607, 346608 � 346609.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 5924-5939 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 5924-5939 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 93 � 94. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 5924-5939 de la SEC ID NO: 1 se selecciona del n� Isis 372851 � 372929.
40 En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 6664-6679 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 6664-6679 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 95 � 96. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 6664-6679 de la SEC ID NO: 1 se selecciona del n� Isis 372854 � 372932.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 6908-6923 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales
45 realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 6908-6923 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID N0 97 � 98. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 6908-6923 de la SEC ID NO: 1 se selecciona del n� Isis 372855 � 372933.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 7190-7205 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 7190-7205 de la SEC ID NO: 1 comprende 50 una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 99 � 100. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 7190-7205 de la SEC ID NO: 1 se selecciona del n� Isis 372856 � 372934.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 7817-7839 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 7817-7839 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 101, 102, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, � 111. En
55 ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 7817-7839 de la SEC ID NO: 1 se selecciona de los nos Isis 372858, 372936, 346610, 346611, 346612, 346613, 346614, 346615, 346616, 346617 � 346618.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 7995-8010 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 7995-8010 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 112 � 113. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 7995-8010 de la SEC ID NO: 1 se selecciona del n� Isis 372859 � 372937.
5 En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 8336-8356 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 8336-8356 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 114 115, 116, � 117. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 8336-8356 de la SEC ID NO: 1 se selecciona de los nos Isis 372861, 372939, 372862 � 372940.
10 En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 8539-8554 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 8539-8554 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 118 � 119. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 8539-8554 de la SEC ID NO: 1 se selecciona del n� Isis 372863 � 372941.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 9344-9359 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales
15 realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 9344-9359 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 120 � 121. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 9344-9359 de la SEC ID NO: 1 se selecciona del n� Isis 372871 � 372949.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 9515-9530 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 9515-9530 de la SEC ID NO: 1 comprende 20 una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 122 � 123. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 9515-9530 de la SEC ID NO: 1 se selecciona del n� Isis 372872 � 372950.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 9794-9809 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 9794-9809 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 124 � 125. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto 25 antisentido corto dirigido a los nucleótidos 9794-9809 de la SEC ID NO: 1 se selecciona del n� Isis 372875 � 372953.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 10157-10187 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 10157-10187 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 � 133. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 10157-10187 de la SEC ID NO: 1 se
30 selecciona de los nos Isis 372877, 372955, 372878, 372956, 372879, 372957, 372880 � 372958.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 10838-10859 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 10838-10859 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141 � 142. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 10838-10859 de la SEC ID NO: 1 se
35 selecciona de los nos Isis 346619, 346620, 346621, 346622, 346623, 346624, 346625, 346626 � 346627.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 13689-13714 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 13689-13714 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 143, 144, 145, 146, 147 � 148. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 13689-13714 de la SEC ID NO: 1 se
40 selecciona de los nos Isis 372890, 372968, 372891, 372969, 372892, � 372970.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 13907-13928 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 13907-13928 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156 � 157. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 13907-13928 de la SEC ID NO: 1 se
45 selecciona de los nos Isis 346628, 346629, 346630, 346631, 346632, 346633, 346634, 346635 � 346636.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 13963-13984 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 13963-13984 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165 � 166. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 13963-13984 de la SEC ID NO: 1 se
50 selecciona de los nos Isis 346637, 346638, 346639, 346640, 346641, 346642, 346643, 346644 � 346645.
En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 14051-14072 de la SEC ID NO: 1. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 14051-14072 de la SEC ID NO: 1 comprende una secuencia nucleot�dica seleccionada de SEC ID NO 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174 � 175. En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 14051-14072 de la SEC ID NO: 1 se
55 selecciona de los nos Isis 346646, 346647, 346648, 346649, 346650, 346651, 346652, 346653 � 346654.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB tienen una longitud de 8 a 16, preferiblemente de 9 a 15, más preferiblemente de 9 a 14, más preferiblemente de 10 a 14 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB tienen una longitud de 9 a 14 nucleótidos. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido
5 nucleico de ApoB tienen una longitud de 10 a 14 nucleótidos. En ciertas realizaciones, dichos compuestos antisentido cortos son oligonucleot�dicos antisentido cortos.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB son g�pmeros cortos. En ciertas de tales realizaciones, los g�pmeros cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB comprenden al menos una modificación de alta afinidad en una o más alas del compuesto. En ciertas realizaciones, los compuestos 10 antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB comprenden de 1 a 3 modificaciones de alta afinidad en cada ala. En ciertas de tales realizaciones, los nucle�sidos o nucleótidos del ala comprenden una modificación en 2’. En ciertas realizaciones, los mon�meros del ala son BNA. En ciertas de tales realizaciones, los mon�meros del ala se seleccionan de ∀-L-metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA, !-D-metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA, etilenoxi (4’-(CH2)2-O-2’)BNA, aminooxi (4’-CH2-O-N(R)-2’) BNA y oxiamino (4’-CH2-N(R)-O-2’) BNA. En ciertas realizaciones, los
15 mon�meros de un ala comprenden un sustituyente en la posición 2’ seleccionado de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2’-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), y O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), en los que cada Rm y Rn es, de forma independiente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, los mon�meros de un ala son nucleótidos 2’MOE.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB comprenden un
20 salto entre el ala en 5’ y el ala en 3’. En ciertas realizaciones, el salto comprende cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce mon�meros. En ciertas realizaciones, los mon�meros del salto son desoxirribonucle�tidos no modificados. En ciertas realizaciones, los mon�meros del salto son ribonucle�tidos no modificados. En ciertas realizaciones, las modificaciones del salto (si las hay) dan como resultado un compuesto antisentido que, cuando se une a su ácido nucleico diana, soporta la escisión por una RNasa, incluyendo, pero sin
25 limitarse a, RNasa H.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB tienen enlaces monom�ricos uniformes. En ciertas de tales realizaciones, dichos enlaces son todos enlaces fosforotioato. En ciertas realizaciones, los enlaces son todos enlaces fosfodi�ster. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB tienen esqueletos mixtos.
30 En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB tienen una longitud de 8 mon�meros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB tienen una longitud de 9 mon�meros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB tienen una longitud de 10 mon�meros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB tienen una longitud de 11 mon�meros. En ciertas realizaciones, los
35 compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB tienen una longitud de mon�meros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB tienen una longitud de 13 mon�meros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB tienen una longitud de 14 mon�meros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB tienen una longitud de 15 mon�meros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido
40 cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB tienen una longitud de 16 mon�meros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB comprenden de 9 a 15 mon�meros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB comprenden de 10 a 15 mon�meros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB comprenden de 12 a 14 mon�meros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido
45 nucleico de ApoB comprenden de 12 a 14 nucleótidos o nucle�sidos.
En ciertas realizaciones, se describen aquí métodos para modulación de la expresión de ApoB. En ciertas realizaciones, dichos métodos comprenden el uso de uno o más compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB, en el que el compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB tiene una longitud de alrededor de 8 a alrededor de 16, preferiblemente de 9 a 15, más preferiblemente de 9 a 14, más preferiblemente
50 de 10 a 14 mon�meros (es decir, de alrededor de 8 a alrededor de 16 mon�meros unidos). Un experto normal en la técnica apreciar� que esto comprende métodos de modulación de la expresión de ApoB usando uno o más compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB de de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 � 16 mon�meros.
En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de ApoB comprenden el uso de un compuesto antisentido corto
55 dirigido a un ácido nucleico de ApoB que tiene una longitud de 8 mon�meros. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de ApoB comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB que tiene una longitud de 9 mon�meros. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de ApoB comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB que tiene una longitud de 10 mon�meros. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de ApoB comprenden el uso de un compuesto
60 antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB que tiene una longitud de 11 mon�meros. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de ApoB comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB que tiene una longitud de 12 mon�meros. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de ApoB comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB que tiene una longitud de 13 mon�meros. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de ApoB comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB que tiene una longitud
5 de 14 mon�meros. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de ApoB comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB que tiene una longitud de 15 mon�meros. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de ApoB comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB que tiene una longitud de 16 mon�meros.
En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de la expresión de ApoB comprenden el uso de un compuesto
10 antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB que comprende de 9 a 15 mon�meros. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de la expresión de ApoB comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB que comprende de 10 a 15 mon�meros. En ciertas realizaciones, los métodos de modulación de la expresión de ApoB comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB que comprende de 12 a 14 mon�meros. En ciertas realizaciones, los métodos de
15 modulación de la expresión de ApoB comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de ApoB que comprende de 12 � 14 nucleótidos o nucle�sidos.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB pueden tener una cualquiera o más propiedades o características de los compuestos antisentido cortos generalmente descritos aquí. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB tienen un motivo
20 (ala-salto desoxi-ala) seleccionado de 1-12-1, 1-1-10-2, 2-10-1-1, 3-10-3, 2-10-3, 2-10-2, 1-10-1, 1-10-2, 3-8-3, 2-8-2, 1-8-1, 3-6-3 � 1-6-1, más preferiblemente 1-10-1, 2-10-2, 3-10-3 y 1-9-2.
Sales, prof�rmacos y bioequivalentes
Los compuestos antisentido proporcionados aquí comprenden cualquier sal, ésteres o sales de dichos ésteres farmac�uticamente aceptables, o cualquier otro equivalente funcional que, tras la administración a un animal,
25 incluyendo un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biol�gicamente activo o un residuo del mismo. De acuerdo con esto, por ejemplo, la descripción también se extiende a prof�rmacos y sales farmac�uticamente aceptables de los compuestos antisentido, sales farmac�uticamente aceptables de dichos prof�rmacos, y otros bioequivalentes.
El término “prof�rmaco” indica un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva o menos activa que se
30 convierte en una forma activa (es decir, el fármaco) dentro del cuerpo o las células del mismo por acción de enzimas end�genas, productos químicos y/o condiciones. En particular, las versiones prof�rmaco de los oligonucle�tidos se preparan como derivados SATE ((S-acetil-2-tioetil)fosfato de acuerdo con los métodos descritos en el documento WO 93/24510 o el documento WO 94/26764. Los prof�rmacos también pueden incluir compuestos antisentido en los que uno o ambos extremos comprenden bases nucleot�dicas que se escinden (por ejemplo, incorporando enlaces
35 fosfodi�ster en el esqueleto en los extremos) para producir el compuesto activo. En ciertas realizaciones, uno o más restos que no son fármacos se escinden de un prof�rmaco, dando la forma activa. En ciertas de tales realizaciones, dichos restos que no son fármacos no son un nucleótido o un oligonucle�tido.
La expresión “sales farmac�uticamente aceptables” se refiere a sales fisiológica y farmac�uticamente aceptables de los compuestos descritos aquí, es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada del compuesto parental
40 y que no producen efectos toxicológicos indeseados en el mismo. Las sales de sodio de los oligonucle�tidos antisentido son útiles y bien aceptadas para administración terapéutica a seres humanos.
En ciertas realizaciones, se proporcionan sales, incluyendo, pero sin limitarse a, las sales de ácidos nucleicos bicatenarios (incluyendo, pero sin limitarse a, compuestos de ARNbc).
G. Ciertas composiciones farmacéuticas
45 En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden uno o más compuestos antisentido cortos y uno o más excipientes. En ciertas de tales realizaciones, los excipientes se seleccionan de agua, disoluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilasa, estearato de magnesio, talco, ácido sil�cico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa y polivinilpirrolidona.
En ciertas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica de la presente invención usando técnicas
50 conocidas, incluyendo, pero sin limitarse a, métodos de mezclamiento, disolución, granulación, formación de pastillas, trituración, emulsión, encapsulaci�n, atrapamiento o de formación de comprimidos.
En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica de la presente invención es un líquido (por ejemplo, una suspensión, elixir y/o disolución). En ciertas de tales realizaciones, se prepara una composición farmacéutica líquida usando ingredientes conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, agua, glicoles, aceites, alcoholes,
55 agentes aromatizantes, conservantes y agentes colorantes.
En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica de la presente invención es un sólido (por ejemplo, un polvo, comprimido y/o cápsula). En ciertas de tales realizaciones, se prepara una composición farmacéutica sólida que comprende uno o más oligonucle�tidos usando ingredientes conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, almidones, azúcares, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes y agentes disgregantes.
5 En ciertas realizaciones, se formula una composición farmacéutica de la presente invención como una preparación depot. Ciertas preparaciones depot son, típicamente, de acción más prolongada que las preparaciones que no son depot. En ciertas realizaciones, dichas preparaciones se administran mediante implantación (por ejemplo subcutánea o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. En ciertas realizaciones, las preparaciones depot se preparan usando materiales polim�ricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo una emulsión en un aceite
10 aceptable) o resinas de intercambio iónico, o en forma de derivados escasamente solubles, por ejemplo en forma de una sal escasamente soluble.
En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica de la presente invención comprende un sistema de liberación. Ejemplos de sistemas de liberación incluyen, pero no se limitan a, liposomas y emulsiones. Ciertos sistemas de liberación son útiles para preparar ciertas composiciones farmacéuticas, incluyendo las que
15 comprenden compuestos hidrófobos. En ciertas realizaciones, se usan ciertos disolventes orgánicos, tales como dimetilsulf�xido.
En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica de la presente invención comprende una o más moléculas de liberación específicas de tejido diseñadas para liberar el uno o más agentes farmacéuticos de la presente invención en tejidos o tipos de células específicos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las composiciones
20 farmacéuticas incluyen liposomas recubiertos con un anticuerpo específico de tejido.
En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica de la presente invención comprende un sistema de codisolvente. Ciertos de dichos sistemas de co-disolvente comprenden, por ejemplo, alcohol benc�lico, un tensioactivo apolar, un pol�mero orgánico miscible en agua y una fase acuosa. En ciertas realizaciones, dichos sistemas de codisolvente se usan para compuestos hidrófobos. Un ejemplo no limitante de dicho sistema de co-disolvente es el 25 sistema de co-disolvente de VPD, que es una disolución de etanol absoluto que comprende 3% p/v de alcohol benc�lico, 8% p/v del tensioactivo apolar, Polisorbato 80.TM y 65% p/v de polietilenglicol 300. Las proporciones de dichos sistemas de co-disolvente se pueden variar considerablemente sin alterar de forma significativa sus características de solubilidad y de toxicidad. Además, la identidad de los componentes del co-disolvente se puede variar: por ejemplo, se pueden usar otros tensioactivos en lugar de Polisorbato 80.TM; el tamaño de la fracción de
30 polietilenglicol puede variarse; otros pol�meros biocompatibles pueden sustituir al polietilenglicol, por ejemplo polivinilpirrolidona; y otros azúcares o polisac�ridos pueden sustituir a la dextrosa.
En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica de la presente invención comprende un sistema de liberación sostenida. Un ejemplo no limitante de dicho sistema de liberación sostenida es una matriz semipermeable de pol�meros hidrófobos sólidos. En ciertas realizaciones, los sistemas de liberación sostenida pueden, dependiendo
35 de su naturaleza química, liberar agentes farmacéuticos durante un período de horas, días, semanas o meses.
En ciertas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica de la presente invención para administración oral. En ciertas de tales realizaciones, se formula una composición farmacéutica combinando uno o más oligonucle�tidos con uno o más vehículos farmac�uticamente aceptables. Ciertos de dichos vehículos permiten formular las composiciones farmacéuticas en forma de comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, 40 jarabes, suspensiones espesas, suspensiones y similares, para ingestión oral por un sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas para uso oral se obtienen mezclando oligonucle�tidos y uno o más excipientes sólidos. Excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, cargas, tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa, tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa,
45 carboximetilcelulosa sádica y/o polivinilpirrolidona (PVP). En ciertas realizaciones, dicha mezcla opcionalmente se tritura, y opcionalmente se añaden adyuvantes. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se forman para obtener comprimidos o núcleos de pastillas. En ciertas realizaciones se añaden agentes disgregantes (por ejemplo, polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido alg�nico o una sal de los mismos, tal como alginato de sodio).
En ciertas realizaciones, los núcleos de pastillas se proporcionan con recubrimientos. En ciertas de tales
50 realizaciones se pueden usar disoluciones de azúcar concentradas, que opcionalmente pueden comprender goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o di�xido de titanio, disoluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. A los recubrimientos de pastillas o comprimidos se pueden añadir colorantes o pigmentos.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas para administración oral son cápsulas duras hechas de
55 gelatina. Ciertas de dichas cápsulas duras comprenden uno o más agentes farmacéuticos de la presente invención mezclados con una o más cargas, tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones, y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio, y, opcionalmente, estabilizantes. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas para administración oral son cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. En ciertas cápsulas blandas, uno o más agentes farmacéuticos de la presente invención se disuelven o suspenden en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se preparan para administración bucal. Ciertas de dichas composiciones farmacéuticas son comprimidos o píldoras formuladas de un modo convencional.
5 En ciertas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica para administración mediante inyección (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, etc.). En ciertas de tales realizaciones, una composición farmacéutica comprende un vehículo y se formula en disolución acuosa, tal como agua o tampones fisiológicamente compatibles, tales como disolución de Hank, disolución de Ringer o disolución salina tamponada fisiológicamente. En ciertas realizaciones se incluyen otros ingredientes (por ejemplo, ingredientes que ayudan a la solubilidad o
10 sirven como conservantes). En ciertas realizaciones se preparan suspensiones inyectables usando vehículos líquidos adecuados, agentes de suspensión y similares. Ciertas composiciones farmacéuticas para inyección se presentan en forma de monodosis, por ejemplo en ampollas, o en envases con múltiples dosis. Ciertas composiciones farmacéuticas para inyección son suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o
15 dispersantes. Ciertos disolventes adecuados para uso en composiciones farmacéuticas para inyección incluyen, pero no se limitan a, disolventes lip�filos y aceites grasos tales como aceite de sésamo, ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglic�ridos, y liposomas. Las suspensiones inyectables acuosas pueden comprender sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sádica, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, dichas suspensiones también pueden comprender estabilizantes o agentes
20 adecuados que aumentan la solubilidad de los agentes farmacéuticos para permitir la preparación de disoluciones muy concentradas.
En ciertas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica para administración transmucosal. En ciertas de tales realizaciones se usan en la formulación penetrantes adecuados para atravesar la barrera. Tales penetrantes se conocen generalmente en la técnica.
25 En ciertas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica para administración por inhalaci�n. Ciertas de dichas composiciones farmacéuticas se preparan en forma de un nebulizador de aerosol en un envase presurizado o nebulizador. Ciertas de dichas composiciones farmacéuticas comprenden un propelente, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, di�xido de carbono u otro gas adecuado. En ciertas realizaciones que usan un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando
30 una válvula que libera una cantidad medida. En ciertas realizaciones se pueden formular cápsulas y cartuchos para usar en un inhalador o insuflador. Ciertas de dichas formulaciones comprenden una mezcla en polvo de un agente farmacéutico de la invención y una base en polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.
En ciertas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica para administración rectal, tal como supositorios
o enema de retención. Ciertas de dichas composiciones farmacéuticas comprenden ingredientes conocidos, tales 35 como manteca de cacao y/u otros glic�ridos.
En ciertas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica para administración típica. Ciertas de dichas composiciones farmacéuticas comprenden bases blandas de hidratación, tales como ungüentos o cremas. Ejemplos de bases adecuadas para ungüentos incluyen, pero no se limitan a, vaselina, vaselina más siliconas volátiles, lanolina y agua en emulsiones de aceite, tal como Eucerin.TM., disponible de Beiersdorf (Cincinnati, Ohio). Ejemplos
40 de bases de crema adecuados incluyen, pero no se limitan a, Crema Nivea.TM., disponible de Beiersdorf (Cincinnati, Ohio), crema fría (USP), Purpose Cream.TM, disponible en Johnson & Johnson (New Brunswick, N.J.), pomada hidrófila (USP) y Lubriderm.TM., disponible de Pfizer (Morris Plains, NJ.).
En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica de la presente invención comprende un oligonucle�tido en una cantidad terapéuticamente eficaz. En ciertas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente
45 para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de una enfermedad o para prolongar la supervivencia del sujeto que se est� tratando. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz entra dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.
En ciertas realizaciones, se formulan uno o más compuestos antisentido cortos de la presente invención como un prof�rmaco. En ciertas realizaciones, tras la administración in vivo, un prof�rmaco se convierte químicamente en la 50 forma biológica, farmacéutica o terapéuticamente más activa del compuesto antisentido corto. En ciertas realizaciones, los prof�rmacos son útiles debido a que son más fáciles de administrar que la forma activa correspondiente. Por ejemplo, en ciertos casos, un prof�rmaco puede estar más biodisponible (por ejemplo, mediante administración oral) que su forma activa correspondiente. En ciertos casos, un prof�rmaco puede temer mejor solubilidad en comparación con la forma activa correspondiente. En ciertas realizaciones, los prof�rmacos son 55 menos hidrosolubles que la forma activa correspondiente. En ciertos casos, dichos prof�rmacos poseen superior transmisión a través de las membranas celulares, en los que la solubilidad en agua es perjudicial para la movilidad. En ciertas realizaciones, un prof�rmaco es un éster. En ciertas de tales realizaciones, el éster se hidroliza metab�licamente en ácido carbox�lico tras la administración. En ciertos casos, el compuesto que contiene ácido carbox�lico es la forma activa correspondiente. En ciertas realizaciones, un prof�rmaco comprende un p�ptido corto
(poliamino�cido) unido a un grupo ácido. En ciertas de tales realizaciones, el p�ptido se escinde tras la administración para formar la forma activa correspondiente.
En ciertas realizaciones, se produce un prof�rmaco modificando un compuesto farmac�uticamente activo de modo que el compuesto activo se regenerar� tras la administración in vivo. El prof�rmaco se puede diseñar para alterar la 5 estabilidad metabólica o las características de transporte de un fármaco, para enmascarar los efectos secundarios o la toxicidad, para mejorar el sabor de un fármaco o para alterar otras características o propiedades de un fármaco. En virtud de los conocimientos sobre los procesos farmacodin�micos y el metabolismo de los fármacos in vivo, los expertos en la técnica, una vez que se conoce el compuesto farmac�uticamente activo, pueden diseñar prof�rmacos del compuesto (véase, por ejemplo, Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University
10 Press, Nueva York, páginas 388-392).
En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica que comprende uno o más agentes farmacéuticos de la presente invención es útil para tratar afecciones o trastornos en un mamífero, y, particularmente, en un sujeto humano. Las vías de administración adecuadas incluyen, pero no se limitan a, las vías oral, rectal, transmucosal, intestinal, enteral, típica, supositorios, mediante inhalaci�n, intratecal, intraventricular, intraperitoneal, intranasal,
15 intraocular y parenteral (por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intramedular y subcutánea). En ciertas realizaciones se administran agentes farmacéuticos intratecales para alcanzar exposiciones locales en lugar de sist�micas. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden inyectar directamente en el área del efecto deseado (por ejemplo, en el área renal o cardíaca).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos, en comparación con sus oligonucle�tidos parentales,
20 son particularmente adecuados para administración oral. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos est�n mejor adaptados para administración oral que sus oligonucle�tidos parentales, debido a que tienen mayor potencia en comparación con dichos oligonucle�tidos parentales. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos est�n mejor adaptados para administración oral que sus oligonucle�tidos parentales, debido a que tienen mejores propiedades de estabilidad, disponibilidad o solubilidad en comparación con los oligonucle�tidos
25 parentales.
En un aspecto adicional, un agente farmacéutico es un oligonucle�tido liofilizado estéril que se reconstituye con un diluyente adecuado, por ejemplo agua estéril para inyectables. El producto reconstituido se administra como una inyección subcutánea o como una infusión intravenosa tras la dilución en disolución salina. El producto farmacol�gico liofilizado consiste en un oligonucle�tido que se ha preparado en agua para inyectables, ajustado a un 30 pH 7,0-9,0 con un ácido o base durante la preparación y, después, se liofiliza. El oligonucle�tido liofilizado puede ser 25-800 mg del oligonucle�tido. Se entiende que esto abarca 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775 y 800 mg de oligonucle�tido liofilizado. El producto farmacol�gico liofilizado puede envasarse en un vial de cristal transparente de tipo I de 2 ml (tratado con sulfato am�nico), tapado con un cierre de caucho de bromobutilo y sellado con una
35 cápsula de aluminio FLIP-OFF�.
Las composiciones de la presente invención pueden comprender, adicionalmente, otros componentes adyuvantes encontrados convencionalmente en composiciones farmacéuticas a sus niveles de uso establecidos en la técnica. Por tanto, por ejemplo, las composiciones pueden comprender materiales adicionales compatibles, farmac�uticamente activos tales como, por ejemplo, antiprur�ticos, astringentes, anestésicos locales o agentes 40 antiinflamatorios, o pueden comprender materiales adicionales útiles en la formulación física de varias formas de dosificación de las composiciones de la presente invención, tales como colorantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes y estabilizantes. Sin embargo, dichos materiales, cuando se añaden, no deberían interferir indebidamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente invención. Las formulaciones se pueden esterilizar y, si se desea, mezclar con
45 agentes adyuvantes, por ejemplo lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales de influencia sobre la presión osm�tica, tampones, colorantes, aromatizantes y/o sustancias aromáticas y similares, que no interaccionan de forma perjudicial con el (los) oligonucle�tido(s) de la formulación.
Los compuestos antisentido proporcionados aquí se pueden mezclar, encapsular, conjugar o, de otro modo, asociar con otras moléculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos.
50 Aquí también se describen composiciones farmacéuticas y formulaciones que incluyen los compuestos antisentido proporcionados aquí. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de diversos modos dependiendo de si se desea tratamiento local o sist�mico y del área que se va a tratar. En una realización preferida, la administración es típica en la superficie del tracto respiratorio, particularmente pulmonar, por ejemplo mediante nebulizaci�n, inhalaci�n o insuflaci�n de polvos o aerosoles, por boca y/o nariz.
55 Las formulaciones farmacéuticas descritas aquí, que se pueden presentar de forma conveniente en forma de monodosis, se pueden preparar de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Dichas técnicas incluyen la etapa de poner en contacto los ingredientes activos con el (los) vehículo(s) farmacéutico(s) o excipiente(s). En general, las formulaciones se preparan poniendo en contacto de forma uniforme y estrecha los ingredientes activos con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o con ambos y,
despu�s, en caso necesario, dando forma al producto (por ejemplo, en un tamaño de partícula específico para liberación). En una realización preferida, las formulaciones farmacéuticas se preparan para administración pulmonar en un disolvente adecuado, por ejemplo agua o disolución salina normal, posiblemente en una formulación estéril, con vehículos u otros agentes para permitir la formación de gotas del diámetro deseado para liberación usando inhaladores, dispositivos de liberación nasal, nebulizadores y otros dispositivos para liberación pulmonar. Como alternativa, las formulaciones farmacéuticas se pueden formular como polvos secos para usar en inhaladores de polvo seco.
Un “vehículo farmacéutico” o “excipiente” puede ser un disolvente farmac�uticamente aceptable, agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacol�gicamente inerte para liberar uno o más ácidos nucleicos a un individuo y se conocen en la técnica. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, con el modo de administración previsto en mente, de modo que proporcione el volumen y la consistencia, etc., deseados, cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada.
H. Ciertos usos terapéuticos
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido se usan para modular la expresión de un gen diana en un animal, tal como un ser humano. En ciertas realizaciones, dichos compuestos se pueden usar para tratar trastornos metabólicos, o modular una o más indicaciones de enfermedad. Por ejemplo, los métodos comprenden la etapa de administrar a dicho animal que necesite terapia por una enfermedad o afección asociada con un gen diana una cantidad eficaz de un compuesto antisentido que module la expresión del gen diana. Los compuestos antisentido proporcionados aquí que modulan de forma eficaz la expresión de un ARN diana o productos proteicos de la expresión se consideran compuestos antisentido activos. Los compuestos antisentido activos también pueden incluir compuestos que modulan de forma eficaz una o más de una serie de indicaciones de enfermedad, incluyendo indicaciones de enfermedad metabólica y cardiovascular, ejemplos de los cuales se describen más abajo.
La modulación de la expresión de un gen diana se puede medir en un fluido corporal, que puede o no contener células; tejido; u órgano del animal. Los métodos para obtener muestras para análisis, tales como fluidos corporales (por ejemplo, esputo, suero, orina), tejidos (por ejemplo, biopsia) u órganos, y los métodos de preparación de las muestras para permitir el análisis son bien conocidos para los expertos en la técnica. Los métodos para el análisis de ARN y los niveles de proteínas se tratan anteriormente, y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los efectos del tratamiento se pueden evaluar midiendo biomarcadores, o indicaciones de enfermedad, asociados con la expresión del gen diana en los fluidos, tejidos u órganos mencionados anteriormente, recogidos de un animal en contacto con uno o más compuestos descritos aquí, mediante métodos cl�nicos rutinarios conocidos en la técnica. Estos biomarcadores incluyen, pero no se limitan a: transaminasas hepáticas, bilirrubina, albúmina, nitrógeno ureico en sangre, creatinina y otros marcadores de la función renal y hepática; interleucinas, factores de necrosis tumoral, moléculas de adhesión intracelular, proteína C reactiva, quimiocinas, citocinas y otros marcadores de inflamación.
Los compuestos antisentido proporcionados aquí se pueden usar en composiciones farmacéuticas añadiendo una cantidad eficaz de un compuesto a un diluyente o vehículo adecuado farmac�uticamente aceptable. Los vehículos y diluyentes aceptables son bien conocidos por los expertos en la técnica. La selección de un diluyente o vehículo se basa en una serie de factores, incluyendo, pero sin limitarse a, la solubilidad del compuesto y la vía de administración. Dichas consideraciones son bien conocidas por los expertos en la técnica. En un aspecto, los compuestos antisentido descritos aquí inhiben la expresión de un gen diana. Los compuestos también se pueden usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con un gen diana.
Tambi�n se contemplan métodos mediante los que los fluidos corporales, órganos o tejidos se ponen en contacto con una cantidad eficaz de uno o más de los compuestos antisentido o las composiciones proporcionados aquí. Los fluidos corporales, órganos o tejidos se pueden poner en contacto con uno o más de los compuestos, dando como resultado la modulación de la expresión de un gen diana en las células de los fluidos corporales, órganos o tejidos. Una cantidad eficaz se puede determinar monitorizando el efecto modulador del compuesto antisentido o compuestos o composiciones sobre los ácidos nucleicos diana o sus productos mediante métodos rutinarios para el experto en la técnica.
Co-administración
En ciertas realizaciones, dos o más compuestos antisentido se administran de forma conjunta. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas incluyen uno o más compuestos antisentido, particularmente oligonucle�tidos, dirigidos a un primer ácido nucleico y uno o más compuestos antisentido dirigidos a un segundo ácido nucleico diana. Uno o más de dichos compuestos antisentido pueden ser un compuesto antisentido corto. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas incluyen dos o más compuestos antisentido dirigidos a diferentes regiones del mismo ácido nucleico diana. Uno o más de dichos compuestos antisentido pueden ser un compuesto antisentido corto. Dos o más compuestos combinados se pueden usar juntos o de forma secuencial.
Administraci�n conjunta
En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas se administran conjuntamente con uno o más agentes farmacéuticos distintos. En ciertas realizaciones, dichos uno o más agentes farmacéuticos distintos est�n diseñados para tratar la misma enfermedad o afección a la de las una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención. En ciertas realizaciones, dichos uno o más agentes farmacéuticos distintos est�n diseñados 5 para tratar una enfermedad o afección distinta a la de las una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención. En ciertas realizaciones, dichos uno o más agentes farmacéuticos distintos est�n diseñados para tratar un efecto indeseado de las una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran conjuntamente con otro agente farmacéutico para tratar un efecto indeseado de dicho otro agente farmacéutico. En ciertas realizaciones, una o más 10 composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno o más agentes farmacéuticos distintos se administran al mismo tiempo. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno o más agentes farmacéuticos distintos se administran en momentos diferentes. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno o más agentes farmacéuticos distintos se preparan juntos en una única formulación. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas de la presente
15 invención y uno o más agentes farmacéuticos distintos se preparan por separado.
En ciertas realizaciones, los agentes farmacéuticos que se pueden administrar de forma conjunta con una composición farmacéutica de la presente invención incluyen agentes hipolipemiantes. En ciertas de tales realizaciones, los agentes farmacéuticos que se pueden administrar de forma conjunta con una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, atorvastatina, simvastatina, rosuvastatina y 20 ezetimiba. En ciertas de tales realizaciones, el agente hipolipemiante se administra antes de la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. En ciertas de tales realizaciones, el agente hipolipemiante se administra después de la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. En ciertas de tales realizaciones, el agente hipolipemiante se administra al mismo tiempo que la composición farmacéutica de la presente invención. En ciertas de tales realizaciones, la dosis de un agente hipolipemiante coadministrado es la
25 misma que la dosis que se administraría si el agente hipolipemiante se administrara solo. En ciertas de tales realizaciones, la dosis de un agente hipolipemiante coadministrado es menor que la dosis que se administraría si el agente hipolipemiante se administrara solo. En ciertas de tales realizaciones, la dosis de un agente hipolipemiante coadministrado es mayor que la dosis que se administraría si el agente hipolipemiante se administrara solo.
En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un inhibidor de la HMG-CoA reductasa. En
30 ciertas de tales realizaciones, el inhibidor de la HMG-CoA reductasa es una estatina. En ciertas de tales realizaciones, la estatina se selecciona de atorvastatina, simvastatina, pravastatina, fluvastatina y rosuvastatina. En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un inhibidor de la absorción de colesterol. En ciertas de tales realizaciones, el inhibidor de la absorción de colesterol es ezetimiba. En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un inhibidor de la HMG-CoA reductasa formulado conjuntamente con un
35 inhibidor de la absorción de colesterol. En ciertas de tales realizaciones, el agente hipolipemiante formulado conjuntamente es ezetimiba/simvastatina. En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un inhibidor de la proteína de transferencia de triglic�ridos microsomal.
En ciertas realizaciones, un agente farmacéutico coadministrado es un secuestrante de ácidos biliares. En ciertas de tales realizaciones, el secuestrante de ácidos biliares se selecciona de colestiramina, colestipol y colesevelam.
40 En ciertas realizaciones, un agente farmacéutico coadministrado es un ácido nicot�nico. En ciertas de tales realizaciones, el ácido nicot�nico se selecciona de ácido nicot�nico de liberación inmediata, ácido nicot�nico de liberación extendida y ácido nicot�nico de liberación sostenida.
En ciertas realizaciones, un agente farmacéutico coadministrado es un ácido f�brico. En ciertas de tales realizaciones, el ácido f�brico se selecciona de gemfibrozilo, fenofibrato, clofibrato, bezafibrato y ciprofibrato.
45 Otros ejemplos de agentes farmacéuticos que se pueden administrar de forma conjunta con una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, corticosteroides, incluyendo, pero sin limitarse a, prednisona; inmunoglobulinas, incluyendo, pero sin limitarse a, inmunoglobulina intravenosa (IgIV); analgésicos (por ejemplo, acetaminofeno); agentes antiinflamatorios, incluyendo, pero sin limitarse a, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (por ejemplo, ibuprofeno, inhibidores de la COX-1 e inhibidores de la COX-2); salicilatos; antibióticos;
50 antivirales; agentes antif�ngicos; agentes antidiab�ticos (por ejemplo, biguanidas, inhibidores de la glucosidasa, insulinas, sulfonilureas y tiazolidendionas); modificadores adren�rgicos; diuréticos; hormonas (por ejemplo, esteroides anab�licos, andr�genos, estr�genos, calcitonina, progestina, somatostatina y hormonas tiroideas); inmunomoduladores; relajantes musculares; antihistam�nicos, agentes antiosteoporosis (por ejemplo, bisfosfonatos, calcitonina y estr�genos); prostaglandinas, agentes antineopl�sicos; agentes psicoterap�uticos; sedantes; productos
55 del roble venenoso del atlántico o de zumaque venenoso; anticuerpos; y vacunas.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de forma conjunta con una terapia hipolipemiante. En ciertas de tales realizaciones, una terapia hipolipemiante es un cambio terapéutico del estilo de vida. En ciertas de tales realizaciones, una terapia hipolipemiante es af�resis de LDL.
I. Kits, reactivos de investigación y diagnósticos
Los compuestos antisentido proporcionados aquí se pueden utilizar para diagnóstico y como reactivos y kits de investigación. Además, los compuestos antisentido que pueden inhibir la expresión g�nica o modular la expresión g�nica con especificidad, a menudo son usados por los expertos en la técnica para aclarar la función de genes concretos o distinguir entre funciones de varios miembros de una vía biológica.
5 Para usar en kits y diagnósticos, los compuestos antisentido descritos aquí, bien solos o en combinación con otros compuestos o terapéuticas, se pueden usar como herramientas en análisis diferencial y/o de combinación para aclarar los patrones de expresión de una porción o todo el complemento de genes expresados dentro de las células
o tejidos. Los métodos de análisis de la expresión g�nica son bien conocidos por los expertos en la técnica.
J.
Ciertas ventajas de los compuestos antisentido cortos
10 En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen ventajas cuando se comparan con sus oligonucle�tidos parentales. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen mayor afinidad por un ácido nucleico diana que su oligonucle�tido parental. En ciertas realizaciones, compuestos antisentido cortos tienen mayor potencia in vitro que su oligonucle�tido parental. En ciertas de tales realizaciones, la mayor potencia in vitro no est� completamente explicada por su mayor afinidad. En ciertas de tales realizaciones,
15 dicha mayor potencia in vitro se puede atribuir a un incremento de la capacidad de los compuestos antisentido cortos para penetrar en las células y/o a la mayor capacidad par acceder a los ácidos nucleicos diana en una célula. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen mayor potencia in vivo que sus oligonucle�tidos parentales. En ciertas realizaciones, dicha mayor potencia in vivo no se puede atribuir al incremento de la potencia in vitro o al incremento de la afinidad. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen incluso mayor
20 potencia in vivo en comparación con sus oligonucle�tidos parentales de lo que se predeciría en base a sus potencias in vitro o en las afinidades. En ciertas realizaciones, dicho incremento de la potencia in vivo puede atribuirse al incremento de la biodisponibilidad, mejor penetraci�n en la célula, mejor acceso al ácido nucleico diana une vez que est� en la célula, o a otros factores.
En ciertas realizaciones, cabría esperar que los compuestos antisentido cortos fueran menos específicos de su ácido
25 nucleico diana en comparación con sus oligonucle�tidos parentales. En ciertas de tales realizaciones, cabría esperar un incremento de los efectos secundarios, incluido el potencial de efectos tóxicos, de los compuestos antisentido cortos. En ciertas realizaciones, dichos efectos secundarios adicionales no se observan. En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos no diana a los que se puede unir un compuesto antisentido corto no est�n disponibles para el compuesto antisentido corto. En dichas realizaciones, los efectos secundarios, incluida la toxicidad, son menos
30 problem�ticos de lo que cabría esperar.
En ciertas realizaciones, debido a que son más pequeños, es menos probable que los compuestos antisentido cortos se unan a proteínas. En ciertas de tales realizaciones, dicha menor unión de proteínas tiene como resultado menor toxicidad, ya que la unión a proteínas puede tener consecuencias no deseadas. En ciertas realizaciones, dicha menor unión de proteínas da como resultado mayor potencia, ya que deja más compuesto antisentido
35 disponible para el efecto terapéutico. En ciertas realizaciones, la menor unión de proteínas da como resultado una menor toxicidad por interacción farmacol�gica.
Ejemplo 1
Cultivo celular y tratamiento con compuestos antisentido cortos
El efecto de los compuestos antisentido cortos sobre la expresión del ácido nucleido diana se puede analizar en una
40 cualquiera de una serie de estirpes celulares cultivadas o primarias. Las estirpes celulares se pueden obtener de fuentes disponibles para el público, tal como la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las células se cultivan de acuerdo con métodos bien conocidos por los expertos normales en la técnica.
Cuando las células alcanzaron la confluencia adecuada, se trataron con oligonucle�tido usando LIPOFECTIN�, según se describe. Cuando las células alcanzaron una confluencia del 65-75% se trataron con oligonucle�tido. El 45 oligonucle�tido se mezcl� con LIPOFECTIN� Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) en medio Opti-MEM�-1 con reducción de suero (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) para alcanzar la concentración deseada del oligonucle�tido y una concentración de LIPOFECTIN� de 2,5 � 3 #g/ml por oligonucle�tido 100 nM. Esta mezcla de transfecci�n se incub� a temperatura ambiente durante aproximadamente 0,5 horas. Para las células cultivadas en placas de 96 pocillos, las células se lavaron una vez con 100 #l de OPTI-MEM�-1 y después se trataron con 130 #l
50 de la mezcla de transfecci�n. Las células cultivadas en placas de 24 pocillos u otras placas de cultivo tisular estándar se trataron de forma similar, usando volúmenes adecuados de medio y de oligonucle�tido. Las células se trataron, y los datos se obtuvieron por duplicado o por triplicado. Tras aproximadamente 4-7 horas de tratamiento a 37�C, el medio que contenía la mezcla de transfecci�n se reemplazó con medio de cultivo fresco. Las células se recogieron 16-24 horas después del tratamiento con oligonucle�tido.
55 Se usan oligonucle�tidos control para determinar la concentración óptima del compuesto oligom�rico para una estirpe celular concreta. Además, cuando los compuestos oligom�ricos se analizan en experimentos de detección selectiva de compuestos oligom�ricos o ensayos fenot�picos, los oligonucle�tidos control se analizan en paralelo.
La concentración del oligonucle�tido usado varía de una estirpe celular a otra estirpe celular. Para determinar la concentración óptima del oligonucle�tido para una estirpe celular concreta, se trata a las células con un oligonucle�tido control positivo a un intervalo de concentraciones. La concentración del oligonucle�tido control positivo que da como resultado un 80% de inhibición del ARNm diana se usa después como concentración de 5 detección selectiva para nuevos oligonucle�tidos en experimentos posteriores para dicha estirpe celular. Si no se alcanza un 80% de inhibición, la concentración menor del oligonucle�tido control positivo que da como resultado un 60% de inhibición del ARNm diana se usa después como concentración de detección selectiva del oligonucle�tido en experimentos posteriores para dicha estirpe celular. Si no se alcanza 60% de inhibición, se estima que dicha estirpe celular concreta es inadecuada para los experimentos de transfecci�n de oligonucle�tidos. Las
10 concentraciones de los oligonucle�tidos antisentido usadas aquí son de 50 nM a 300 nM cuando el oligonucle�tido antisentido se transfecta usando un reactivo de liposoma y 1 nM a 40 nM cuando el oligonucle�tido antisentido se transfecta mediante electroporaci�n.
Ejemplo 2: Análisis con PCR cuantitativa en tiempo real de los niveles de ARNm diana
La cuantificación de los niveles de ARNm diana se realizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el
15 sistema de detección de secuencias ABI PRISM� 7600, 7700, � 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Antes del análisis de PCR cuantitativa, los equipos cebador-sonda específicos del gen diana que se est� midiendo se evaluaron según su capacidad de “multiplexar” con una reacción de amplificación por GAPDH. Tras el aislamiento, el ARN se somete a reacción secuencia de transcriptasa inversa (RT) y PCR en tiempo real, ambas 20 realizadas en el mismo pocillo. Los reactivos para RT y PCR se obtuvieron de Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). La PCR con RT en tiempo real se llev� a cabo en el mismo, añadiendo 20 #l de cóctel de PCR (2,5 x tampón de PCR menos MgCl2, MgCl2 6,6 mM, 375 #M cada uno de dATP, dCTP, dCTP y dGTP, 375 nM de cada cebador directo y cebador inverso, 125 nM de sonda, 4 unidades de inhibidor de RNasa, 1,25 unidades de PLATINUM� Taq, 5 unidades de transcriptasa inversa MuLV y 2,5 x pigmento de Rox) a placas de 96 pocillos que
25 contienen 30 #l de disolución de ARN total (20-200 ng). La reacción de RT se llev� a cabo mediante incubaci�n durante 30 minutos a 48�C. Tras una incubaci�n de 10 minutos a 95�C para activar la PLATINUM� Taq, se llevaron a cabo 40 ciclos de un protocolo de PCR de dos etapas: 95�C durante 15 segundos (desnaturalización), seguido de 60�C durante 1,5 minutos (hibridación/extensión).
Las cantidades del gen diana obtenidos mediante PCR en tiempo real con RT se normalizaron usando el nivel de
30 expresión de GAPDH, un gen cuya expresión es constante, o cuantificando el ARN total usando RiboGreen� (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). La expresión de GAPDH se cuantific� mediante PCR en tiempo real con RT realizada simultáneamente con la diana, multiplexando, o por separado. El ARN total se cuantific� usando reactivo de cuantificación de ARN RiboGreen� (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR).
En una placa de 96 pocillos que contenía 30 #l de ARN celular purificado se pipetearon 170 #l de reactivo de trabajo
35 RiboGreen� (reactivo RiboGreen� diluido a 1:350 en Tris-Hcl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5). La placa se leyó en un lector CytoFluor� 4000 (PE Applied Biosystems) con excitación de 485 nm y emisión a 530 nm.
Las sondas para PCR de GAPDH tiene JOE unido covalentemente en el extremo 5’ y TAMRA o MGB unidos covalentemente al extremo 3’, en el que JOE es el colorante indicador fluorescente y TAMRA o MGB es el colorante inactivador. En algunos tipos de células se usan cebadores y sondas diseñados para una secuencia de GAPDH de
40 una especie diferente, para medir la expresión de GAPDH. Por ejemplo, un equipo de sonda y cebador para GAPDH humano se usa para medir la expresión de GAPDH en células y estirpes celulares derivadas de mono.
Las sondas y cebadores para uso en PCR en tiempo real se diseñaron para hibridar con los ácidos nucleicos diana a través de métodos de rutina. Por ejemplo, el software PrimerExpress� (Applied Biosystems, Foster City, CA) se usa de forma rutinaria para diseñar sondas y cebadores para uso en PCR en tiempo real. Los ejemplos de secuencias
45 de cebadores y sondas y de los ácidos nucleicos diana con los que hibridan se presentan en la Tabla 3. Las sondas para PCR específicas de la diana tienen FAM unido covalentemente al extremo 5’ y TAMRA o MGB unidos covalentemente al extremo 3’, donde FAM es el colorante fluorescente y TAMRA o MGB es el colorante inactivador.
Tabla 3
Cebadores y sondas específicos de diana para uso en PCR en tiempo real
Nombre de la diana
Especie Descripción de la secuencia Secuencia (5’ a 3’) SEC ID NO
ApoB
Ratón Cebador directo CGTGGGCTCCAGCATTCTA 1524
ApoB
Ratón Cebador inverso AGTCATTTCTGCCTTTGCGTC 1525
ApoB
Ratón Sonda CCAATGGTCGGGCACTGCTCAA 1526
ApoB
Ratón Cebador directo GAAAATAGACTTCCTGAATAACTATGCATT 1527
ApoB
Ratón Cebador inverso ACTCGCTTGCCAGCTTGC 1528
ApoB
Ratón Sonda TTTCTGAGTCCCCGTGCCCAACA 1529
GCGR
Ratón Cebador directo TGAGCCTTGCCACCTTCTCT 1530
GCGR
Ratón Cebador inverso GCGCACCCCAGCCAA 1531
GCGR
Ratón Sonda AGAGGAGCTTCTTTTCCCTCTACCTGGGC 1532
GCGR
Ratón Cebador directo ATTTCCTGCCCCTGGTACCT 1533
GCGR
Ratón Cebador inverso CGGGCCCACACCTCTTG 1534
GCGR
Ratón Sonda CCACAAAGTGCAGCACCGCCTAGTGT 1535
PTEN
Ratón Cebador directo GCCACAGGCTCCCAGACAT 1536
PTEN
Ratón Cebador inverso TCCATCCTCTTGATATCTCCTTTTG 1537
PTEN
Ratón Sonda ACAGCCATCATCAAAGAGATCGTTAGCAGAA 1538
PTEN
Ratón Cebador directo ATGACAATCATGTTGCAGCAATTC 1539
PTEN
Ratón Cebador inverso CGATGCAATAAATATGCACAAATCA 1540
PTEN
Ratón Sonda CTGTAAAGCTGGAAAGGGACGGACTGGT 1541
Ejemplo 3: Compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de ApoB y que tiene modificaciones2’-MOE o metilenoxi (4’-CH2O-2’) BNA
En ratones Balb/c machos de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) se inyect� por vía
5 intraperitoneal (i.p.) compuestos antisentido dirigidos a ApoB, a una frecuencia de dos veces a la semana durante tres semanas. Las dosis de compuestos antisentido incluyeron 2,4, 1,2, 0,6, 0,3 y 0,15 #mol/kg. Para los compuestos antisentido de 14 nucleótidos de longitud, estas dosis corresponden a aproximadamente 12, 6, 3, 1,5 � 0,75 mg/kg, respectivamente. En la Tabla 4 se muestran las secuencias y motivos de los compuestos antisentido usados en este estudio. Los compuestos antisentido tienen una longitud de 20 � 14 nucleótidos, y tienen una región
10 de “salto” central que consiste en diez 2’-desoxinucle�tidos flanqueados por alas que tienen “alas” modificadas con 2’-O-metoxietilo (2’-MOE) o BNA. Por ejemplo, el motivo del g�pmero 2-10-2 MOE indica un compuesto antisentido con un salto de diez nucleótidos flanqueado por alas de 2 nucleótidos con modificaciones 2’-MOE. Los residuos en negrita indican restos 2’-O-metoxietilo, y los residuos en cursiva indican metilenoxi (4’-CH2O-2’) BNAs. Los enlaces internucleos�dicos de cada compuesto son, en todos, fosforotioato. Todos los residuos de citosina de ISIS 147764 e
15 ISIS 372938 se reemplazan con 5-metilcitosinas. Para ISIS 387462, sólo el residuo de citosina en el ala del compuesto est� sustituido por 5-metilcitosina. Los compuestos antisentido para ApoB est�n dirigidos a las secuencias de ApoB-100 disponibles públicamente, incluido el número de acceso en Genbank XM_137955.5 (SEC ID NO: 2).
Tabla 4: Compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de ApoB
N� ISIS
SEC ID NO de la diana Sitio diana en 5’ Secuencia (5’-3’) Motivo g�pmero SEC ID NO
147764
2 8865 GTCCCTGAAGATGTCAATGC 5-10-5 MOE 1561
372938
2 8235 GGTACATGGAAGTC 2-10-2 MOE 190
387462
2 8235 GGTACATGGAAGTC 2-10-2 metilenoxi (4’-CH2-O2’) BNA 190
Cuarenta y ocho horas después de la inyección final, se sacrificó a los ratones para evaluar las transaminasas (Tabla 5); el peso del hígado y los riñones (Tabla 6); los niveles de triglic�ridos, LDL, HDL y ácidos grasos libres (Tabla 7); niveles de ARNm diana en el hígado (Tabla 8); niveles de proteína diana en plasma; y concentración de oligonucle�tidos en tejido (Tabla 9). Estos criterios de valoración se determinaron usando métodos descritos aquí y son muy conocidos por los expertos en la técnica.
Tabla 5: Niveles de ALT y AST (UI/l)
N� ISIS
Dosis #mol/kg ALT AST
Disoluci�n salina
N/A 27,8 46,3
147764
2,4 29,5 64,0
372938
2,4 26,0 49,0
372938
1,2 24,8 49,5
372938
0,6 28,0 79,3
372938
0,3 28,3 60,0
372938
0,15 28,3 50,3
387462
2,4 41,3 84,0
387462
1,2 35,3 63,5
387462
0,6 32,0 77,3
387462
0,3 27,8 55,0
387462
0,15 29,3 68,3
Tabla 6: Peso del hígado y los riñones (% de disolución salina control)
N� ISIS
Dosis #mol/kg Hígado Ri��n
Disoluci�n salina
N/A 100 100
147764
2,4 102 105
372938
2,4 100 100
372938
1,2 90 101
372938
0,6 96 112
372938
0,3 91 107
372938
0,15 96 98
387462
2,4 116 90
387462
1,2 113 90
387462
0,6 106 97
387462
0,3 101 126
387462
0,15 95 100
El peso corporal total y el consumo de alimentos no difirieron significativamente entre los animales tratados con disolución salina o con oligonucle�tidos. Los niveles de glucosa también fueron similares en todos los grupos de tratamiento.
Tabla 7: Niveles de triglic�ridos (TRIG), colesterol total (COL), HDL, LDL y ácidos grasos libres (AGL)
N� ISIS
Dosis #mol/kg TRIG (mg/dl) COL (mg/dl) HDL (mg/dl) LDL (mg/dl) AGL (mg/dl)
Disoluci�n salina
N/A 167 107 81,8 11,0 1,76
147764
2,4 167 107 81,3 10,3 1,29
372938
2,4 153 104 79,0 10,3 1,28
372938
1,2 136 101 77,8 9,5 1,70
372938
0,6 184 110 83,3 10,8 1,66
372938
0,3 138 109 84,3 11,0 1,53
372938
0,15 151 106 82,8 10,8 1,57
387462
2,4 49 14 9,0 1,5 0,74
387462
1,2 71 23 16,5 2,0 0,76
387462
0,6 150 55 39,3 3,7 1,43
387462
0,3 136 92 72,8 7,5 1,14
387462
0,15 163 104 81,5 9,3 1,47
Tabla 8: % de niveles de ARNm de ApoB (respecto a la disolución salina control)
N� ISIS
2,4 #mol/kg 1,2 #mol/kg 0,6 #mol/kg 0,3 #mol/kg 0,15 #mol/kg
147764
57,7 ND ND ND ND
372938
77,0 90,0 87,3 92,6 93,1
387462
1,5 8,5 27,4 58,9 75,8
El tratamiento con ISIS 387462 dio como resultado una significativa reducción dependiente de la dosis de los niveles de triglic�ridos, colesterol total, HDL, LDL y ácidos grasos libres. De acuerdo con estos hallazgos fenot�picos, el
10 tratamiento con ISIS 387462 también condujo a una reducción dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de ApoB (Tabla 8) y de proteínas (no mostrado) en plasma de ratón. Para determinar si el incremento observado en la eficiencia con el g�pmero metilenoxi (4’-CH2O-2’) BNA se debe a un incremento de la acumulación de oligonucle�tidos, se determin� la concentración de los oligonucle�tidos de longitud completa y totales en hígado y ri��n.
15 Tabla 9: Concentración tisular de compuestos antisentido de longitud completa y total (#M) respecto al nivel de ARNm de ApoB (% de disolución salina control)
N� ISIS
Dosis #mol/kg Longitud completa en ri��n Longitud completa en hígado Total en ri��n Total en hígado ARNm de ApoB
147764
2,4 28,6 22,9 33,5 31,3 58
372938
2,4 32,0 5,49 34,0 7,76 77
387462
2,4 37,2 5,69 38,9 7,31 1,5
387462
1,2 29,8 3,71 31,3 4,91 8,5
387462
0,6 18,9 1,97 20,0 2,57 27
387462
0,3 9,11 0,73 9,49 0,78 59
387462
0,15 6,97 0,19 7,43 0,24 76
Los niveles del g�pmero 2-10-2 metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA fueron similares a los de los g�pmeros 5-10-5 y 2-10-2 MOE en el ri��n, pero se redujeron significativamente en el hígado. La EC50 para ISIS 387462 en el hígado se determin� comparando la concentración del oligonucle�tido en el hígado con la inhibición de ARNm de ApoB. La
5 EC50 aproximada para ISIS 387462 es 1 #M. Por el contrario, un compuesto g�pmero eficaz 5-10-5 MOE tiene típicamente una EC50 de aproximadamente 15 #M en el hígado.
Tomados juntos, estos resultados demuestran que el g�pmero corto de ApoB que tiene metilenoxi (4’-CH2-O-2’) en las alas es un potente inhibidor de la expresión de ARNm diana y puede reducir de forma eficaz los niveles de triglic�ridos, colesterol y ácidos grasos libres. La potencia del compuesto antisentido corto no parece ser el resultado
10 del incremento de la acumulación en tejido, ya que se han observado niveles similares del compuesto en el ri��n y en el hígado se encontraron niveles reducidos en relación con el g�pmero 5-10-5 MOE. Además, el g�pmero metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA exhibió pocos o ningún efecto secundario adverso.
Ejemplo 4. Estudio de respuesta a la dosis de administración de una sola dosis con compuestos antisentidocortos dirigidos a ácidos nucleicos de ApoB y de PTEN
15 En ratones Balb/c machos de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) se administr� una única inyección intraperitoneal (i.p.) del compuesto antisentido a una dosis de 8, 4, 2 � 1 #mol/kg. Cada grupo de dosis estaba constituido por cuatro animales. En la Tabla 10 se muestran la secuencia, la química del ala, y los motivos de cada compuesto antisentido usados en este estudio. Los residuos en cursiva indican las modificaciones metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA, los residuos subrayados indican las modificaciones N-metil-oxiamino (4’-CH2-N(CH3)-O-2’) BNA,
20 y los residuos en recuadros indican las modificaciones ∀-L-metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA. Todos los compuestos antisentido comprenden enlaces fosforotioato en cada posición. Cada citosina de ISIS 116847 y los residuos de citosina en las alas con metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA de ISIS 392063 est�n sustituidas con 5-metilcitosinas, mientras que los residuos de timidina en las alas con metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA de ISIS 392745 est�n sustituidas con 5metiltimidinas. Los compuestos antisentido de PTEN est�n dirigidos a los ácidos nucleicos de PTEN publicados,
25 incluido el número de acceso en Genbank U92437.1 (SEC ID NO: 13). Los compuestos antisentido de ApoB est�n dirigidos a los ácidos nucleicos de ApoB publicados, incluido el número de acceso en Genbank XM_137955.5 (SEC ID N�: 2).

Tabla 10: Compuestos antisentido cortos dirigidos a ácidos nucleicos de ApoB y de PTEN
N� ISIS
Diana SEC ID de la diana Sitio diana en 5’ SECUENCIA G�pmero SEC ID NO
387462
ApoB 19 8235 GGTACATGGAAGTC 2-10-2 Metilenoxi BNA 193
392063
PTEN 29 3099 CTAAGCACTGGCCT 2-10-2 Metilenoxi BNA 1226
396565
PTEN 29 3099 CUTAGCACTGGCC U 2-10-2 N-Me-oxiamino BNA 1126
396006
PTEN 29 3099 2-10-2 ∀-L-metilenoxi BNA 1226
Tabla 11: % de reducción de ARNm de ApoB y PTEN (respecto a la disolución salina control)
N� ISIS
Dosis (#mol/kg) % de reducción de ARNm de ApoB (respecto a la disolución salina) % de reducción de ARNm de PTEN (respecto a la disolución salina)
387462
8 0,62 92,8
4
6,55 103
2
18,6 105
1
42,0 98,0
392063
8 126 6,79
4
111 18,1
2
112 42,4
1
114 62,3
396565
8 116 23,8
4
1,04 46,6
2
94,4 76,1
1
115 89,5
396006
8 94,3 62,9
4
101 18,2
2
79,7 52,4
1
111 82,4
Como se muestra en la Tabla 11, cada compuesto antisentido corto que tiene modificaciones metilenoxi BNA demostr� una reducción dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de la diana. Cabe destacar que el compuesto antisentido corto con las alas N-metil-oxiamino BNA (ISIS 396565) también demostr� una reducción dependiente de la dosis de la expresión de PTEN similar a la de los compuestos antisentido cortos con !-Dmetilenoxi BNA y ∀-L-metilenoxi BNA. Después se calcularon las concentraciones ED50 estimadas para cada antisentido usando Graphpad Prism. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 12.

Tabla 12: Concentraciones ED50 estimadas
Qu�mica del ala
N� ISIS ED50 (#mol/kg) ED50 (mg/kg)
Metilenoxi BNA
387462 0,8 3,9
Metilenoxi BNA
392063 1,5 7
N-Me-oxiamino BNA
396565 3,8 17,4
∀-L-metilenoxi BNA
396006 2,1 9,3
10 Ejemplo 5: Inhibición antisentido de ApoB por compuestos antisentido cortos
Los compuestos antisentido cortos mostrados en la Tabla 13 se analizaron en busca de sus efectos in vivo. En ratones Balb/c machos de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) se administraron dosis intraperitoneales de 3,2, 1, 0,32, � 0,1 umol/kg dos veces a la semana durante tres semanas. Se us� un g�pmero 510-5 MOE como tratamiento control. Se sacrificó a los ratones aproximadamente 48 horas después de la última
15 dosis. Se recogió tejido hepático para aislar el ARN, y se recogió sangre para análisis químico en suero. Los niveles de ARNm de ApoB se midieron usando PCR cuantitativa en tiempo real, tal como se ha descrito aquí. Los niveles de ARNm de ApoB se normalizaron con los niveles de ARN determinado mediante RIBOGREEN y se presentan en la Tabla 14 como el porcentaje de inhibición respecto a los niveles de ARNm de ApoB en animales control tratados con disolución salina.

Tabla 13: Compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de ApoB
N� ISIS
Secuencia (5’-3’) Motivo g�pmero SEC ID N�
387462
GGTACATGGAAGTC 2-10-2 metilenoxi BNA 190
398296
GGTACATGGAAGTC 2-10-2 6’-(S)-metil metilenoxi BNA 190
Tabla 14: Inhibición antisentido de ApoB por compuestos antisentido cortos que comprenden BNA
N� ISIS
Dosis (umol/kg) % Inhib
379818
1 56
387462
0,1 33
0,32
57
1
93
3,2
99
398296
0,1 17
0,32
35
1
80
3,2
98
5 La Tabla 14 muestra que los niveles de ARNm de ApoB se reducían de un modo dependiente de la dosis tras tratamiento con compuestos antisentido cortos que tienen un motivo de g�pmero 2-10-2 y modificaciones de BNA en las alas. A la dosis de 1 umol/kg, la inhibición de ApoB por los compuestos antisentido cortos fue mayor de lo observado con un g�pmero 5-10-5 MOE a una dosis equivalente. El colesterol se redujo a las dosis de 1 y 3,2 umol/kg de compuesto antisentido corto.
10 Los compuestos antisentido cortos exhibían pocos o ningún efecto secundario adverso, como se juzgó por los pesos de los órganos y del cuerpo, los niveles de transaminasas en suero, de bilirrubina, nitrógeno ureico en sangre y creatinina.
Ejemplo 6: Administración de una sola dosis de compuestos antisentido cortos que comprendenmodificaciones BNA
15 En ratones Balb/c machos de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) se administr� una única inyección intraperitoneal del compuesto antisentido a una dosis de 8, 4, 2 � 1 #mol/kg. Los compuestos antisentido cortos analizados fueron ISIS 387462 e ISIS 398296. Cada grupo de dosis estaba constituido por cuatro animales. Se us� un g�pmero 5-10-5 MOE como tratamiento control. Se sacrificó a los ratones aproximadamente 48 horas después de la última dosis. Se recogió tejido hepático para aislar el ARN y se recogió sangre para análisis químico
20 en suero. Los niveles de ARNm de ApoB se midieron usando PCR cuantitativa en tiempo real, tal como se ha descrito aquí. Los niveles de ARNm de ApoB se normalizaron con los niveles de ARN determinado mediante RIBOGREEN, y se presentan en la Tabla 15 como el porcentaje de inhibición respecto a los niveles de ARNm de ApoB en animales control tratados con disolución salina.
Tabla 15: Inhibición antisentido de ApoB por compuestos antisentido cortos que comprenden BNA La Tabla 15 muestra que los niveles de ARNm de ApoB se reducían de un modo dependiente de la dosis tras una única administración de compuestos antisentido cortos que tienen un motivo de g�pmero 2-10-2 y modificaciones de BNA en las alas. A la dosis de 8 umol/kg, la inhibición de ApoB por los compuestos antisentido cortos fue mayor de
N� ISIS
Dosis (umol/kg) % Inhib
379818
8 77
387462
8 99
4
93
2
81
1
58
398296
8 97
4
81
2
54
1
19
5 lo observado con un g�pmero 5-10-5 MOE a una dosis equivalente. La ED50 de ISIS 387462 fue 3,9 mg/kg y la ED50 de ISIS 398296 fue 8,7 mg/kg. El colesterol también se redujo de un modo dependiente de la dosis. Los triglic�ridos se redujeron a la dosis más elevada.
Los compuestos antisentido cortos exhibían pocos o ningún efecto secundario adverso, como se juzga por los pesos de los órganos y del cuerpo, los niveles de transaminasas en suero, de bilirrubina, nitrógeno ureico en sangre y
10 creatinina.
Ejemplo 7: Inhibición antisentido de ApoB por compuestos antisentido cortos que comprenden conjugados de ácido palm�tico
Se administr� una única inyección intraperitoneal del compuesto antisentido a una dosis de 2,5, 1,0, 0,4 y 0,16 umol/kg a ratones Balb/c machos de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Cada grupo de 15 dosis estaba constituido por cuatro animales. Los compuestos analizados se muestran en la Tabla 16. Se us� un g�pmero 5-10-5 MOE como tratamiento control. Se sacrificó a los ratones aproximadamente 48 horas después de la última dosis. Se recogió tejido hepático para aislar el ARN y se recogió sangre para análisis químico en suero. Los niveles de ARNm de ApoB se midieron usando PCR en tiempo real, tal como se ha descrito aquí. Los niveles de ARNm de ApoB se normalizaron con los niveles de ARN determinado mediante RIBOGREEN, y se presentan en la
20 Tabla 17 como el porcentaje de inhibición respecto a los niveles de ARNm de ApoB en animales control tratados con disolución salina.

Tabla 16: Compuestos antisentido cortos que comprenden conjugados de palm�tico
N� ISIS
Secuencia (5’-3’) Motivo g�pmero SEC ID NO
387462
GGTACATGGAAGTC 2-10-2 metilenoxi BNA 190
391871
GGTACATGGAAGTC 1-1-10-2 2’-(butilacetomido)-palmitamida/MOE/MOE citosinas no modificadas en el salto (es decir, 2-10-2 MOE con 2’(butilacetomido)-palmitamida substituida en el nucleótido en 5’ 190
391872
GGTACATGGAAGTC 1-1-10-2 2’-(butilacetomido)-palmitamida metilenoxi BNA/metilenoxi BNA citosinas no modificadas en el salto (es decir, 2-10-2 metilenoxi BNA con 2’-(butilacetomido)-palmitamida substituida en el nucleótido en 5’) 190
Tabla 17: Inhibición antisentido por los compuestos antisentido cortos que comprenden conjugados de ácido 25 palm�tico
N� ISIS
Dosis (umol/kg) % Inhib
5-10-5
2,5 54
387462
2,5 99
1,0
91
0,4
65
0,16
16
391871
2,5 49
1,0
18
0,4
5
0,16
0
391872
2,5 99
1,0
92
0,4
50
0,16
18
La Tabla 17 muestra que los niveles de ARNm de ApoB se reducían de un modo dependiente de la dosis tras tratamiento con compuestos antisentido cortos que tienen un conjugado de ácido palm�tico (C16). A la dosis de 2,5 umol/kg, la inhibición de ApoB por los compuestos antisentido cortos fue mayor de lo observado con un g�pmero 55 10-5 MOE a una dosis equivalente. En este estudio, las ED50 estimadas fueron 1,5 mg/kg para ISIS 387462, 13,1 mg/kg para ISIS 391871 y 1,9 mg/kg para ISIS 391872. Las ED50 estimada para el g�pmero 5-10-5 MOE fue 17,4 mg/kg. Los triglic�ridos se redujeron a las dosis de 2,5 y 1,0 mg/kg de ISIS 387462 e ISIS 391872. ISIS 387462 e ISIS 391872 redujeron marcadamente el colesterol total, HDL-C y LDL-C de un modo dependiente de la dosis, la reducción de LDL-C era tan marcada que estaba por debajo del límite de detección. En general, los compuestos
10 antisentido cortos exhibieron pocos o ningún efecto secundario adverso.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Isis Pharmaceuticals, Inc. Sanjay Bhanot Richard S. Geary Robert McKay Brett P. Monia Punit P. Seth Andrew M. Siwkowski Eric E. Swayze Edward Wancewitz
<120> COMPUESTOS Y PROCEDIMIENTOS PARA MODULAR LA EXPRESIÓN DE APOB 15 <130> CORE0061WO8
<150> PCT/US2007/061183
<151> 2007-01-27
<150> 60/746,631
<151> 2006-05-05 20 <150> 60/747,059
<151> 2006-05-11
<150> 60/805,660
<151> 2006-06-23
<150> 60/864,554 25 <151> 2006-11-06
<160> 2
<170> Fast SEQ para Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 14121 30 <212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 13928
<212> ADN
<213> Mus musculus
<400> 2

Claims (19)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un compuesto antisentido corto de 10 a 14 mon�meros de longitud, que comprende una región salto de 2’desoxirribonucle�tido flanqueada por cada lado por un ala, en el que cada ala comprende de forma independiente 1 a 3 mon�meros modificados de alta afinidad que son nucleótidos modificados con azúcar que comprenden un puente entre la posición 4’ y 2’ del azúcar, y en el que el compuesto antisentido corto est� dirigido a un ácido nucleico que codifica ApoB para uso en terapia.
  2. 2.
    El compuesto antisentido corto de la reivindicación 1, para uso en:
    (i)
    tratar un trastorno o enfermedad metabólica o cardiovascular;
    (ii)
    reducir el riesgo de cardiopat�a coronaria (CPC) o prevenir CPC en un sujeto;
    (iii) ralentizar o detener la progresión de aterosclerosis en un sujeto, o prevenir la aterosclerosis; o
    (iv) tratar hipercolesterolemia, hipercolesterolemia no familiar, hipercolesterolemia familiar, hipercolesterolemia familiar heterocig�tica, hipercolesterolemia familiar homocig�tica, dislipidemia mixta, aterosclerosis, un riesgo de desarrollar aterosclerosis, cardiopat�a coronaria, antecedentes de cardiopat�a coronaria, cardiopat�a coronaria de inicio precoz, uno o más factores de riesgo de cardiopat�a coronaria, diabetes de tipo II, diabetes de tipo II con dislipidemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, hiperacidemia grasa, esteatosis hepática, esteatohepatitis no alcohólica, o enfermedad de hígado graso no alcohólica.
  3. 3.
    Uso de un compuesto antisentido corto de 10 a 14 mon�meros de longitud, que comprende una región salto de 2’desoxirribonucle�tido flanqueada por cada lado por un ala, en el que cada ala comprende de forma independiente 1 a 3 mon�meros modificados de alta afinidad que son nucleótidos modificados con azúcar que comprenden un puente entre la posición 4’ y 2’ del azúcar, y en el que el compuesto antisentido corto est� dirigido a un ácido nucleico que codifica ApoB, en la fabricación de un medicamento para:
    (i)
    tratar un trastorno o enfermedad metabólica o cardiovascular;
    (ii)
    reducir el riesgo de cardiopat�a coronaria (CPC) o prevenir CPC en un sujeto;
    (iii) ralentizar o detener la progresión de aterosclerosis en un sujeto, o prevenir la aterosclerosis; o
    (iv) tratar hipercolesterolemia, hipercolesterolemia no familiar, hipercolesterolemia familiar, hipercolesterolemia familiar heterocig�tica, hipercolesterolemia familiar homocig�tica, dislipidemia mixta, aterosclerosis, un riesgo de desarrollar aterosclerosis, cardiopat�a coronaria, antecedentes de cardiopat�a coronaria, cardiopat�a coronaria de inicio precoz, uno o más factores de riesgo de cardiopat�a coronaria, diabetes de tipo II, diabetes de tipo II con dislipidemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, hiperacidemia grasa, esteatosis hepática, esteatohepatitis no alcohólica, o enfermedad de hígado graso no alcohólica.
  4. 4.
    El compuesto antisentido corto o uso de cualquier reivindicación precedente, en el que el sujeto a tratar es un ser humano.
  5. 5.
    El compuesto antisentido corto o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la conformación de cada uno de dichos nucleótidos modificados con azúcar es, de forma independiente, !-D o ∀-L.
  6. 6.
    El compuesto antisentido corto o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que cada uno de dichos puentes comprende de forma independiente 1 o de 2 a 4 grupos unidos seleccionados de forma independiente de [C(R1)(R2)]n-, -C(R1)=C(R2)-, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R1)2-, -S(=O)X-y -N(R1)-;
    en los que
    x es 0, 1 � 2;
    n es 1, 2, 3 � 4;
    cada uno de R1 y R2 es, de forma independiente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alic�clico C5-C7, radical alic�clico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1) o sulfoxilo (S(=O)-J1); y
    cada uno de J1 y J2 es, de forma independiente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.
  7. 7.
    El compuesto antisentido corto o uso de la reivindicación 6, en el que cada uno de dichos puentes es, de forma independiente, 4’-CH2-2’, 4’-(CH2)2-2’, 4’-CH2-O-2’, 4’-(CH2)2-O-2’ 4’-CH2-O-N(R1)-2’ � 4’-CH2-N(R1)-O-2’-en los que cada R1 es, de forma independiente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
  8. 8.
    El compuesto antisentido corto o uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos un enlace monom�rico es un enlace monom�rico modificado.
  9. 9.
    El compuesto antisentido o uso de la reivindicación 8, en el que el enlace monom�rico modificado es un enlace fosforotioato.
  10. 10.
    El compuesto antisentido corto o uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que cada enlace monom�rico es un enlace internucleos�dico fosforotioato.
  11. 11.
    El compuesto antisentido corto o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que tiene 10-13 mon�meros de longitud.
  12. 12.
    El compuesto antisentido corto o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que tiene 10-12 mon�meros de longitud.
  13. 13.
    El compuesto antisentido corto o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que tiene 10-11 mon�meros de longitud.
  14. 14.
    El compuesto antisentido corto o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que tiene 10 mon�meros de longitud.
  15. 15.
    El compuesto antisentido corto o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que tiene 11 mon�meros de longitud.
  16. 16.
    El compuesto antisentido corto o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que tiene 12 mon�meros de longitud.
  17. 17.
    El compuesto antisentido corto o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que tiene 13 mon�meros de longitud.
  18. 18.
    El compuesto antisentido corto o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que tiene 14 mon�meros de longitud.
  19. 19.
    El compuesto antisentido corto o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que tiene un motivo seleccionado de 1-12-1; 2-10-2; 1-10-1; 1-10-2; 3-8-3; 2-8-2; 1-8-1; y 3-6-3, en el que el primer número representa el número de mon�meros en el ala 5’, el segundo número representa el número de mon�meros en el salto, y el tercer número representa el número de mon�meros en el ala 3’.
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