JP5875006B2 - オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療剤 - Google Patents
オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5875006B2 JP5875006B2 JP2012531921A JP2012531921A JP5875006B2 JP 5875006 B2 JP5875006 B2 JP 5875006B2 JP 2012531921 A JP2012531921 A JP 2012531921A JP 2012531921 A JP2012531921 A JP 2012531921A JP 5875006 B2 JP5875006 B2 JP 5875006B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- pcsk9
- oligonucleotide
- bna
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 0 CC(OC1C(N(C=C(C)C(N2)=O)C2=O)O[C@](C*)(COCc2ccccc2)C1OCc1ccccc1)=O Chemical compound CC(OC1C(N(C=C(C)C(N2)=O)C2=O)O[C@](C*)(COCc2ccccc2)C1OCc1ccccc1)=O 0.000 description 2
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
- A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
- C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
Description
ここで、R1は、水素原子;
分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基;
分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基;
水酸基、炭素数1から6の直鎖アルキル基、炭素数1から6の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数1から6の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数1から6の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基;
または該α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基を表す。
ここで、R1は、水素原子;
分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基;
分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基;
水酸基、炭素数1から6の直鎖アルキル基、炭素数1から6の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数1から6の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数1から6の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基;
または該α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基を表し;そして
Xは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表す。
配列番号3で示される塩基配列;配列番号4で示される塩基配列;配列番号5で示される塩基配列;配列番号6で示される塩基配列;配列番号7で示される塩基配列;配列番号8で示される塩基配列;配列番号9で示される塩基配列;配列番号10で示される塩基配列;配列番号11で示される塩基配列;配列番号12で示される塩基配列;配列番号13で示される塩基配列;配列番号14で示される塩基配列;配列番号15で示される塩基配列;配列番号16で示される塩基配列;配列番号17で示される塩基配列;配列番号18で示される塩基配列;またはこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなる領域である。さらに好適には、これらの塩基配列からなるDNAまたはRNAである。
ここで、R1は、水素原子;
分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基;
分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基;
水酸基、炭素数1から6の直鎖アルキル基、炭素数1から6の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数1から6の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数1から6の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基;
または該α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基を表す。このような架橋構造を、以下、NCという場合がある。
ここで、R1は、水素原子;
分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基;
分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基;
水酸基、炭素数1から6の直鎖アルキル基、炭素数1から6の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数1から6の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数1から6の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基;
または該α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基を表し;そして
Xは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表す。このような架橋構造を、以下、CONという場合がある。
ヌクレオシド類縁体:2’−アミノ−3’−O−[2−シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ]−5’−O−ジメトキシトリチル−2’−N,4’−C−オキソメチレンチミジン(化合物16)の合成
ヒトのPCSK9遺伝子の塩基配列(配列番号1:コーディング領域、2079塩基)を、GenBankより入手した(アクセッション番号:NM_174936)。以下の4つの観点でこの塩基配列をコンピュータソフトで解析し、オリゴヌクレオチドの標的として適している領域の塩基配列を選定した。
(1)ソフトmFold(M. Zuker、Nucleic Acids Res.、 2003年、第31巻、p. 3406-3415)を用いて、マウスのPCSK9遺伝子のmRNAの折れ畳み構造を計算した。オリゴヌクレオチドが結合しやすいように、mRNA上でステムループ構造を形成しにくい領域を選択した。
(2)ソフトJustBio(URL:http://www.justbio.com/)を用いて、ヒトとマウスのPCSK9遺伝子の塩基配列を比較した。マウスで評価した結果に基づいてヒトへの適用を可能にするように、ヒトとマウスとの間で塩基配列が同じ領域を選択した。
(3)オリゴヌクレオチドと2本鎖核酸を形成した際に熱安定性が高くなるように、GC含量が多い領域を選択した。
(4)ソフトBlast(S. F. Altschulら、J. Mol. Biol.、1990年、第215巻、p. 403-410)を用いて、標的領域の塩基配列と類似した塩基配列がゲノムの他の領域に存在するかどうかを探索した。他のmRNAにオリゴヌクレオチドが結合しないように、ゲノムの他の領域の塩基配列と類似性が低い塩基配列からなる領域を選択した。
非特許文献3〜7に記載の方法によりBNAモノマー(アミダイト体)を合成した。非特許文献8〜11に記載の方法によりNCモノマー(アミダイト体)を合成した。これらおよび実施例1で合成したCONモノマー(アミダイト体)をDNA合成用モノマー体として用いて、DNA合成機により必要に応じて1mgから100mg(in vivoグレード)のオリゴヌクレオチドを合成し、HPLC精製、凍結乾燥処理に供した。得られた各オリゴヌクレオチドの純度および構造をHPLCおよびMALDI−TOF−MSにより確認した。
コレステロールをアミダイト体として導入する手法により、オリゴヌクレオチドPCSK9−1−BNA−3Cの大量合成を行い、10mgのオリゴヌクレオチドを得た。
1nmolのオリゴヌクレオチドを10μLのFBS(牛胎児血清)と混合し、さらに滅菌水を加えて20μLに調製した。この溶液を37℃にて所定時間インキュベートした後、13μLのホルムアミドを加えて、ホルムアミドの最終濃度が40%となるようにして、FBS中のヌクレアーゼを失活させた。このサンプルは、HPLCによる解析まで−80℃にて保存した。HPLCによる解析のために、400μLのA バッファー(25mM Tris−HCl,0.5% CH3CN,pH7.0)をこのサンプルに加えて、ホルムアミドの最終濃度を3%にし、4mm Millex(登録商標)−HV Syringe Driven Filter Unit(ポアサイズ:0.45μm;ミリポア社製)で2回ろ過したものを、HPLCによる解析のためのサンプルとした。HPLCには、JASCO LC−2000Plusシリーズ(日本分光株式会社製)を用い、HPLCカラムには、TSK−GEL(登録商標)DNA−NPR(東ソー株式会社製)を用いた。A バッファー(25mM Tris−HCl,0.5% CH3CN,pH7.0)とB バッファー(25mM Tris−HCl,0.5% CH3CN,1M NH4Cl,pH7.0)を用い、最初の10分間は、A 100%,B 0%とし、次の45分間は、A 100%,B 0%からA 50%,B 50%になるように変化させ、次の10分間は、A 0%,B 100%とした。以上の一連のHPLCによる検出のための波長は260nmとした。オリゴヌクレオチドに相当するHPLCのピークの面積を、FBSと混合する前と、FBSと混合した後120分間後において測定し、これらの比より、FBSと混合した後120分間後のオリゴヌクレオチドの存在率[%(120分)]を求めた。結果を表2および3に示す。
緩衝液(8.1mM Na2HPO4,2.68mM KCl,1.47mM KH2PO4,pH7.2)中で、オリゴヌクレオチドと標的RNAとを等モル混合し、95℃にて5分間加熱後、室温まで徐冷してアニーリングさせ、2本鎖核酸を形成した。紫外可視分光光度計DU800(ベックマン社製)のペルチェ式UV melting装置を用いて、この2本鎖核酸の熱安定性を解析した。2本鎖核酸の温度を20℃から95℃まで0.5℃/分の速度で加温していき、260nmにおける吸光度(A)の温度(T)による変化を測定した。2本鎖核酸の濃度は1μMとし、セルの光路長は1cmとした。この測定結果よりdA/dT vs Tのグラフを描き、dA/dTの値が最も大きくなる温度、つまりAのTによる変化が最も大きくなる温度を、2本鎖核酸のTmとし、2本鎖核酸の熱安定性の指標とした。結果を表4および5に示す。
標的RNAの5’末端をγ−32Pで標識した。具体的には、10pmolのRNAと10pmol相当の[γ−32P]ATP(パーキンエルマー社製)を、T4 Polynucleotide Kinase(東洋紡績株式会社製)で反応させた。[γ−32P]標識RNAを含む反応後の産物は、スピンカラムで精製し、未反応の[γ−32P]ATPを除去した。この[γ−32P]標識RNAに、10μMの相補鎖オリゴヌクレオチド1μLを加え、95℃にて5分間加熱後、室温まで徐冷してアニーリングさせ、2本鎖核酸を形成した。
4.0×105個/mLに調製したマウス肝臓細胞株NMuliの細胞を、1ウェルあたり2mLずつ6ウェルプレートに播き、37℃にて5%CO2下で24時間培養した。最終濃度が1、3、10、30または50nMとなるように調製するために、1μMオリゴヌクレオチド含有溶液を最終濃度1nMの場合には2.2μL、3nMの場合には6.6μL、10nMの場合には22μL、30nMの場合には66μL、そして50nMの場合には110μL各々とLipofectamine2000(Invitrogen社製)を14.3μLとOpti−MEM(Invitrogen社製)を最終濃度1nMの場合には533.5μL、3nMの場合には529.1μL、10nMの場合には513.7μL、30nMの場合には469.7μL、そして50nMの場合には425.7μL各々とを混合し、混合液を室温にて20分間インキュベートして、このうち500μLとOpti−MEM1500μLを各ウェルに添加した。オリゴヌクレオチド添加4時間後に培地を交換した。さらに20時間後に細胞を回収し、ISOGEN(株式会社ニッポンジーン製)で細胞を破砕し、Total RNAを抽出した。抽出したTotal RNAを分光光度計で定量し、RNAの長さをアガロースゲル電気泳動で確認した。
PCSK9−0−BNA
PCSK9 Fwプライマー0:5’−TCAGTTCTGCACACCTCCAG−3’(配列番号19)
PCSK9 Rvプライマー0:5’−GGGTAAGGTGCGGTAAGTCC−3’(配列番号20)
PCSK9−1−BNA、PCSK9−2−BNA、PCSK9−1−NC、PCSK9−2−NC、PCSK9−1−BNA−3C
PCSK9 Fwプライマー1:5’−CACGCTTCCACAGACAGGCG−3’(配列番号21)
PCSK9 Rvプライマー1:5’−CGTTGAGGATGCGGCTATAC−3’(配列番号22)
PCSK9−3−BNA
PCSK9 Fwプライマー2:5’−GCCGGCACCTGGCGAGGACT−3’(配列番号23)
PCSK9 Rvプライマー2:5’−CCACTCTGTGACATGAAGCA−3’(配列番号24)
PCSK9−4−BNA、PCSK9−4−BNA(T,C)、PCSK9−5−BNA、PCSK9−6−BNA、PCSK9−4−NC(T,C)、PCSK9−5−NC(T,C)、PCSK9−6−NC(T,C)、PCSK9−4−i−BNA、PCSK9−4−ii−BNA、PCSK9−4−ii−BNA−A、PCSK9−4−iii−BNA、PCSK9−4−iii−BNA−A
PCSK9 Fwプライマー3:5’−GTGACTGCAGCACATGCTTC−3’(配列番号25)
PCSK9 Rvプライマー3:5’−CGTCCTACAGAGCAGCTGCC−3’(配列番号26)
PCSK9−7−BNA、PCSK9−8−BNA、PCSK9−7−NC(T,C)、PCSK9−8−NC(T,C)、
PCSK9 Fwプライマー4:5’−GCTCTGTAGGACGGTGTGGT−3’(配列番号27)
PCSK9 Rvプライマー4:5’−GGTGTTGTGGATGCTGCAGT−3’(配列番号28)
PCSK9−9−BNA
PCSK9 Fwプライマー5:5’−CCAGAAGGACCATGTTCTCA−3’(配列番号29)
PCSK9 Rvプライマー5:5’−GCACATTGCATCCAGTCAGG−3’(配列番号30)
PCSK9−10−BNA、PCSK9−10−NC(T,C)
PCSK9 Fwプライマー6:5’−GGATCTCAGGTCCTTCAGAG−3’(配列番号31)
PCSK9 Rvプライマー6:5’−GCCTGAGGCTGTCACTGAAC−3’(配列番号32)
GAPDH定量用
GAPDH Fwプライマー:5’−GTGTGAACGGATTTGGCCGT−3’(配列番号33)
GAPDH Rvプライマー:5’−GACAAGCTTCCCATTCTCGG−3’(配列番号34)
NMuliに代えてヒト肝癌由来細胞株Huh−7を用いたこと以外は、実施例8と同様にして、オリゴヌクレオチドによるPCSK9遺伝子のin vitroにおける発現抑制効果を調べた。
PCSK9−1−BNA、PCSK9−1−BNA−13、PCSK9−2−BNA−13
PCSK9 Fwプライマー1:5’−CACGCTTCCACAGACAGGCG−3’(配列番号21)
PCSK9 Rvプライマー1:5’−CGTTGAGGATGCGGCTATAC−3’(配列番号22)
PCSK9−3−BNA−13
PCSK9 Fwプライマー2:5’−GCCGGCACCTGGCGAGGACT−3’(配列番号23)
PCSK9 Rvプライマー2:5’−CCACTCTGTGACATGAAGCA−3’(配列番号24)
PCSK9−4−BNA−13
PCSK9 Fwプライマー3:5’−GTGACTGCAGCACATGCTTC−3’(配列番号25)
PCSK9 Rvプライマー3:5’−CGTCCTACAGAGCAGCTGCC−3’(配列番号26)
被験動物として6週齢のマウスC57BL6/J(オス:日本クレア)を各投与群で例数5匹となるように準備した。2週間の高脂肪食(F2HFD1,オリエンタル酵母工業株式会社製)負荷の後、0日目に採血して、BNA−オリゴヌクレオチドまたはNC−オリゴヌクレオチドを腹腔内投与した(10mg/kg/回)。1週間に2回、2週間〜6週間投与を行ない、その間、尾静脈より数回採血を行なった。3週間後または6週間後に尾静脈より絶食下採血を行なった。次いで、マウスをジエチルエーテルで麻酔後、PBSで上腸間膜静脈より灌流し、肝臓を採取、PBSで洗浄した後、細切し、液体窒素で瞬間凍結した後、−80℃にて保存した。
凍結した肝臓の切片を1mLのTRIzol Regent(Invitrogen社製)内でホモジナイズし、クロロホルム200μLを加えた後、13,200rpm、4℃にて15分間遠心した。上清220μLをイソプロパノール400μLに添加して転倒混和し、13,200rpm、4℃にて15分間遠心した後、イソプロパノールを除去した。次いで、75%エタノール800μLを加えた後、13,200rpm、4℃にて5分間遠心した。Total RNAを含む沈殿をRNAフリー水(Water,DEPC treated,RNase tested;ナカライテスク株式会社)80μLに溶解した。抽出したTotal RNAを分光光度計で定量し、RNAの長さをアガロースゲル電気泳動で確認した。
PCSK9−1−BNA、PCSK9−1−NC
PCSK9 Fwプライマー7:5’−GCTCAACTGTCAAGGGAAGG−3’(配列番号35)
PCSK9 Rvプライマー1:5’−CGTTGAGGATGCGGCTATAC−3’(配列番号22)
PCSK9−2−BNA、PCSK9−2−NC
PCSK9 Fwプライマー1:5’−CACGCTTCCACAGACAGGCG−3’(配列番号21)
PCSK9 Rvプライマー1:5’−CGTTGAGGATGCGGCTATAC−3’(配列番号22)
PCSK9−4−BNA、PCSK9−4−BNA(T,C)、PCSK9−4−NC(T,C)
PCSK9 Fwプライマー3:5’−GTGACTGCAGCACATGCTTC−3’(配列番号25)
PCSK9 Rvプライマー3:5’−CGTCCTACAGAGCAGCTGCC−3’(配列番号26)
GAPDH定量用
GAPDH Fwプライマー:5’−GTGTGAACGGATTTGGCCGT−3’(配列番号33)
GAPDH Rvプライマー:5’−GACAAGCTTCCCATTCTCGG−3’(配列番号34)
マウス尾静脈より血液を採取して、室温にて20分間静置した後、5000rpm、4℃にて20分間遠心して血清を分離した。それぞれの血清について、コレステロールE−テストワコー(和光純薬工業株式会社製)を用いて血清総コレステロール値を定量した。血清10μLに発色試液を1.5mL加えて37℃にて5分間加温し、分光光度計を用いて600nmの吸光度を測定した。標準試薬による検量線を用いて値を算出した。
凍結した肝臓の切片(50mg)を500μL RIPA バッファーに入れてホモジナイズし、10,000rpm、3分間冷却遠心し、上清をBIO RAD DC(BIO−RAD社製)を用いてタンパク定量を行なった。ポリアクリルアミドゲルReady Gel J(4%)(BIO−RAD社製)の各レーンにタンパク質量7μgずつアプライし、200Vにて40分間電気泳動した。Immun−Blot(登録商標)PVDF Membrane(Biorad社製)を用いて180mAにて90分間ブロッティングを行ない、次いでBlocking one(ナカライテスク株式会社)を用いて1時間ブロッキングを行なった。得られたメンブレンに対し、1次抗体として、抗LDL受容体ポリクローナルヤギ抗体(LDLR M−20,Santa Cruz Biotechnology社)を反応させ、二次抗体として、抗ヤギポリクローナル抗体(Donkey anti goat IgG HRP,Santa Cruz Biotechnology社)を反応させた。次いで、ECL plus(Western Blotting Detection System,GE healthcare社)を用いてメンブレンを発色させ、発色量を定量した。結果を図13に示す。
オリゴヌクレオチドとして、PCSK9−2−BNA、PCSK9−2−NC、またはPCSK9−4−BNAを用い、これらを3週間に6回腹腔内投与した(20mg/kg/回)こと以外は、上記と同様にして、オリゴヌクレオチドのマウスへの投与実験を行った。上記と同様にして、肝臓組織を採取して、10%ホルマリン緩衝液に24時間浸して固定した後6時間流水水洗し、パラフィン包埋した。薄切切片(5μm)を作製して、ヘマトキシリン染色を行ない、顕微鏡にて観察し、写真撮影した。結果を図14に示す(40倍)。
オリゴヌクレオチド(PCSK9−2−BNA、PCSK9−2−NC、PCSK9−4−BNA、PCSK9−4−BNA(T,C)、またはPCSK9−4−NC(T,C))投与後のマウス血清を用いて、AST値、ALT値およびBUN値を定量した。AST値およびALT値は、トランスアミナーゼCII−テストワコー(和光純薬工業株式会社製)を用いて定量した。血清10μLにAST値測定用またはALT値測定用基質酵素液250μLを加えて37℃にて5分間加温し、発色試液250μLを加えて37℃にて20分間加温した。次いで、反応停止液1mLを加えた後、分光光度計を用いて555nmの吸光度を測定した。標準試薬による検量線を用いて各値を算出した。BUN値は、血清10μLに発色試液A 1mLを加えて37℃にて15分間加温し、発色試液B 1mLを加えて37℃にて10分間加温後、分光光度計を用いて570nmの吸光度を測定した。標準試薬による検量線を用いて値を算出した。結果を図15に示す(A:AST値、B:ALT値、C:BUN値)。
被験動物として6週齢のマウスC57BL6/J(オス:日本クレア)を各投与群で例数5匹となるように準備した。2週間の高脂肪食(F2HFD1:オリエンタル酵母工業)負荷の後、0日目に採血して、オリゴヌクレオチド(PCSK9−1−BNA)を腹腔内投与した。投与量は、0、1、5、10または20mg/kgとした。1週間に2回、6週間投与を行ない、6週間後に尾静脈より絶食下採血を行なった。実施例10と同様にして血清総コレステロール値およびリポタンパク質画分中コレステロール値を定量した。LDL画分中コレステロール値およびHDL画分中コレステロール値の結果を図16に示す(「LDL」は、LDL画分中コレステロール値を表し、「HDL」は、HDL画分中コレステロール値の結果を示す)。
被験動物として6週齢のマウスC57BL6/J(オス:日本クレア)を各投与群で例数5匹となるように準備した。2週間の高脂肪食(F2HFD1:オリエンタル酵母工業)負荷の後、0日目に採血して、PCSK9−1−BNAを腹腔内投与した。投与量は、0、1、5、10または20mg/kgとした。1週間に2回、6週間投与を行ない、6週間後に尾静脈より絶食下採血を行なった。次いで、マウスをジエチルエーテルで麻酔後、PBSで心臓より灌流し、肝臓を採取、PBSで洗浄した後、細切し、液体窒素で瞬間凍結した後、−80℃にて保存した。実施例10と同様にしてPCSK9のmRNA量を定量した。結果を図17に示す。
実施例12のPCSK9−1−BNA投与後のマウス血清を用いて、実施例10と同様にしてAST値、ALT値およびBUN値を定量した。結果を図18に示す(A:AST値、B:ALT値、C:BUN値)。
被験動物として6週齢のマウスC57BL6/J(オス:日本クレア)を各投与群で例数5匹となるように準備した。2週間の高脂肪食(F2HFD1:オリエンタル酵母工業)負荷の後、0日目に採血して、PCSK9−1−NCを腹腔内投与した。投与量は、0、1、5または10mg/kgとした。1週間に2回、6週間投与を行ない、4週間後または6週間後に尾静脈より絶食下採血を行なった。実施例10と同様にして血清総コレステロール値およびリポタンパク質画分中コレステロール値を定量した。LDL画分中コレステロール値およびHDL画分中コレステロール値の結果を図19に示す(「LDL」は、LDL画分中コレステロール値を表し、「HDL」は、HDL画分中コレステロール値の結果を示す)。
被験動物として6週齢のマウスC57BL6/J(オス:日本クレア)を各投与群で例数5匹となるように準備した。2週間の高脂肪食(F2HFD1:オリエンタル酵母工業)負荷の後、0日目に採血して、PCSK9−1−NCを腹腔内投与した。投与量は、0、1、5、10または20mg/kgとした。1週間に2回、6週間投与を行ない、4週間後または6週間後に尾静脈より絶食下採血を行なった。次いで、マウスをジエチルエーテルで麻酔後、PBSで心臓より灌流し、肝臓を採取、PBSで洗浄した後、細切し、液体窒素で瞬間凍結した後、−80℃で保存した。実施例10と同様にしてPCSK9のmRNA量を定量した。結果を図20に示す。
実施例15のPCSK9−1−NC投与後のマウス血清を用いて、実施例10と同様にしてAST値、ALT値およびBUN値を定量した。結果を図21に示す。
被験動物として6週齢のマウスC57BL6/J(オス:日本クレア)を各投与群で例数3匹となるように準備した。3週間の高脂肪食(F2HFD1:オリエンタル酵母工業)負荷の後、0日目に採血して、9日後および12日後に、オリゴヌクレオチド(PCSK9−4−ii−BNA−A、PCSK9−4−ii−BNA−A2、PCSK9−4−ii−NC−A、PCSK9−4−ii−NC−A2、PCSK9−4−ii−CON−A)を尾静脈より投与した(35mg/kg)。14日後に尾静脈より絶食下採血を行なった。実施例10と同様にして血清総コレステロール値を定量した。結果を図22に示す。
被験動物として3週齢のモルモットHartley(オス:日本SLC)を各投与群で例数1匹となるように準備した。2週間の高脂肪食(F2HFD1,オリエンタル酵母工業株式会社製)負荷の後、0日目に採血して、PCSK9−4−iii−BNA−gp(5’−CATgggcagccgCC−3’;すべてPS骨格、小文字:DNA、大文字:BNA、配列番号11で示される塩基配列からなるヒトの標的領域のモルモットにおける対応領域を標的とする)を腹腔内に3日間連続投与した。投与量は、1日あたり0、20または25mg/kgとした。投与後、3日後および7日後に各投与群1匹ずつ採血を行った。実施例10と同様にして血清総コレステロール値を定量した。結果を図23に示す。
被験動物として3週齢のモルモットHartley(オス:日本SLC)を各投与群で例数1匹となるように準備した。2週間の高脂肪食(F2HFD1,オリエンタル酵母工業株式会社製)負荷の後、0日目に採血して、生理食塩水、PCSK9−4−iii−BNA−gp、ロバスタチン+生理食塩水、ロバスタチン+PCSK9−4−iii−BNA−gpを腹腔内に投与した。投与量は、ロバスタチン約30mg/kg/日を9日間連続投与、PCSK9−4−iii−BNA−gp 20mg/kgを9日間で3回投与とした。投与後、7日後に各投与群1匹ずつ採血を行った。実施例10と同様にして血清総コレステロール値を定量した。結果を図24に示す。
被験動物として5週齢のマウスC57BL6/J(オス:日本SLC)を各投与群で例数9匹となるように準備した。PBSに溶解したPCSK9−1−BNAを腹腔内投与した。投与量は、0、0.05、0.25、0.5、1、2.5または5mg/kgとした。投与後、3日後、7日後および14日後に各投与群3匹ずつ麻酔薬ベトルファール(明治製菓株式会社製)、ドミトール(日本全薬工業株式会社)およびドルミカム(アステラス製薬株式会社製)の混合溶液で麻酔後、採血を行った。PBSで肝灌流し、肝臓を採取、PBSで洗浄した後、QuickGeneKit(富士フィルム社製)に添付の組織溶解液4mLにて肝臓すべてを溶解し、−80℃で保存した。解凍した肝臓溶解液からQuickGeneKitを用いて、mRNAの抽出を行った。その後のcDNAの作製、リアルタイムPCRは、実施例10と同様に行い、PCSK9のmRNA量を定量した。結果を図25に示す。
被験動物として5週齢のマウスC57BL6/J(オス:日本SLC)を各投与群で例数9匹となるように準備した。PBSに溶解したPCSK9−1−BNAを腹腔内に毎日連続投与した。投与量は、1日あたり0、0.009、0.018、0.036、0.071または0.18mg/kgとした。これは2週間連続投与後の総投与量が0、0.125、0.25、0.5、1または2.5mg/kgになる値である。投与後、3日後および7日後に各投与群3匹ずつ麻酔薬ベトルファール、ドミトールおよびドルミカムの混合溶液で麻酔後、採血を行った。PBSで肝灌流し、肝臓を採取、PBSで洗浄した後、組織溶解液4mLにて肝臓すべてを溶解し、−80℃で保存した。解凍した肝臓溶解液からQuickGeneKitを用いて、mRNAの抽出を行った。その後のcDNAの作製、リアルタイムPCRは、実施例10と同様に行い、PCSK9のmRNA量を定量した。結果を図26に示す。
PCSK9−1−BNAの投与量および投与後採血までの経過日数を表7に記載の条件にしたこと以外は、実施例20と同様にして、PCSK9−1−BNAのマウスへの単回投与実験を行った。また、PCSK9−1−BNAの投与量および投与後採血までの経過日数を表7に記載の条件にしたこと以外は、実施例21と同様にして、PCSK9−1−BNAのマウスへの連続投与実験を行った。実施例10と同様にして血清総コレステロール値を定量した。PCSK9−1−BNAの投与後所定経過日数での単回投与実験で得られた血清総コレステロール値に対する連続投与実験で得られた血清総コレステロール値の比を図27に示す。
3質量%アテロコラーゲン(株式会社高研製コーケンアテロコラーゲンインプラント)0.1mLに0.1mgのPCSK9−1−BNAを練り込み、37℃にて24時間静置することによりPCSK9−1−BNA含有アテロコラーゲンゲルを作製した。
表8に示す2−ミクログロブリンを模倣したペプチド配列よりなるペプチド性インジェクタブルハイドロゲルをPCSK9−1−BNAの徐放用担体として用いた(表8中のペプチド1〜4のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号36〜39に対応する)。ペプチドは、Fmoc固相法によって合成し、1質量%の濃度でDMSO/H2Oに溶解させてオリゴヌクレオチドと複合させた。ペプチド3および4は10%DMSO/H2Oを溶媒としたときに均一なゲルを形成した。特にペプチド4ハイドロゲルは、5分以内の速やかなゲル化特性を示し、表9に示すように濃度依存的に高い弾性率を示した。
蛍光色素Alexa750(モレキュラープローブ社製)で標識したPCSK9−1−BNA(Alexa750−PCSK9−1−BNA)20mgをペプチド4水溶液(ペプチド濃度:1質量%;DMSO濃度:10(v/v)%)100mLに混合し、室温にて放置してPCSK9−1−BNA含有ペプチド性インジェクタブルハイドロゲルを作製した。
Claims (7)
- 糖修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドであって、
該糖修飾ヌクレオシドが、4’位と2’位との間に架橋構造を有し、
該オリゴヌクレオチドが、ヒトPCSK9遺伝子と結合し得、該ヒトPCSK9遺伝子の発現を抑制する活性を有し、そして該ヒトPCSK9遺伝子と相補的であり、
該架橋構造が、−CO−NR1−、−CH2−CO−NR1−、−(CH2)2−CO−NR1−、−CO−NR1−X−、または−CH2−CO−NR1−X−で表され、
ここで、R1は、水素原子;
分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基;
分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基;
水酸基、炭素数1から6の直鎖アルキル基、炭素数1から6の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数1から6の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数1から6の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基;
または該α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基を表し;そして
Xは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表し、そして
該オリゴヌクレオチドの塩基配列の長さが、13〜25塩基である、オリゴヌクレオチド。 - 前記ヒトPCSK9遺伝子が、以下の塩基配列:
配列番号3で示される塩基配列;配列番号4で示される塩基配列;配列番号5で示される塩基配列;配列番号6で示される塩基配列;配列番号7で示される塩基配列;配列番号8で示される塩基配列;配列番号9で示される塩基配列;配列番号10で示される塩基配列;配列番号11で示される塩基配列;配列番号12で示される塩基配列;配列番号13で示される塩基配列;配列番号14で示される塩基配列;配列番号15で示される塩基配列;配列番号16で示される塩基配列;配列番号17で示される塩基配列;配列番号18で示される塩基配列;またはこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるDNAまたはRNAである、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。 - 前記オリゴヌクレオチドの塩基配列の長さが、13〜20塩基である、請求項1または2に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドの5’−末端または3’−末端に、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナンスリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素からなる群より選択される少なくとも1つが結合している、請求項1から3のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項1から4のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、脂質異常症治療剤。
- 生体吸収性材料を担体として含有する徐放製剤である、請求項5に記載の治療剤。
- 前記生体吸収性材料が、アテロコラーゲンまたはペプチドゲルである、請求項6に記載の治療剤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012531921A JP5875006B2 (ja) | 2010-08-31 | 2011-08-31 | オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療剤 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010195187 | 2010-08-31 | ||
JP2010195187 | 2010-08-31 | ||
JP2012531921A JP5875006B2 (ja) | 2010-08-31 | 2011-08-31 | オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療剤 |
PCT/JP2011/069818 WO2012029870A1 (ja) | 2010-08-31 | 2011-08-31 | オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2012029870A1 JPWO2012029870A1 (ja) | 2013-10-31 |
JP5875006B2 true JP5875006B2 (ja) | 2016-03-02 |
Family
ID=45772947
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012531921A Expired - Fee Related JP5875006B2 (ja) | 2010-08-31 | 2011-08-31 | オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療剤 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9127280B2 (ja) |
EP (1) | EP2612914B1 (ja) |
JP (1) | JP5875006B2 (ja) |
WO (1) | WO2012029870A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2778171C (en) * | 2009-10-29 | 2017-07-25 | Osaka University | Bridged artificial nucleoside and nucleotide |
US9255154B2 (en) | 2012-05-08 | 2016-02-09 | Alderbio Holdings, Llc | Anti-PCSK9 antibodies and use thereof |
JP2015165772A (ja) * | 2012-07-04 | 2015-09-24 | 国立大学法人大阪大学 | オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療剤 |
US10077443B2 (en) | 2012-11-15 | 2018-09-18 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | Oligonucleotide conjugates |
JP6270742B2 (ja) * | 2013-01-10 | 2018-01-31 | 塩野義製薬株式会社 | 架橋型核酸誘導体の製造方法 |
DK2970968T3 (en) * | 2013-03-15 | 2018-03-05 | Miragen Therapeutics Inc | CONNECTED BICYCLIC Nucleosides |
JP6569920B2 (ja) | 2016-01-07 | 2019-09-04 | 国立大学法人大阪大学 | α−シヌクレイン発現抑制剤 |
CA3058567A1 (en) | 2017-04-13 | 2018-10-18 | Cadila Healthcare Limited | Novel peptide based pcsk9 vaccine |
US11273222B2 (en) | 2017-05-26 | 2022-03-15 | National Cerebral And Cardiovascular Center | Antisense nucleic acid targeting PCSK9 |
EP4130266A1 (en) | 2020-03-26 | 2023-02-08 | National Cerebral and Cardiovascular Center | Antisense nucleic acid targeting apoc3 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005021570A1 (ja) * | 2003-08-28 | 2005-03-10 | Gene Design, Inc. | N−0結合性架橋構造型新規人工核酸 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK2015758T3 (da) * | 2006-05-05 | 2014-06-23 | Isis Pharmaceuticals Inc | Forbindelser og fremgangsmåder til modulering af ekspression af apob |
EP2444494B1 (en) | 2006-10-09 | 2016-09-28 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | Rna antagonist compounds for the modulation of pcsk9 |
US8093222B2 (en) * | 2006-11-27 | 2012-01-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating hypercholesterolemia |
WO2009127680A1 (en) | 2008-04-16 | 2009-10-22 | Santaris Pharma A/S | Pharmaceutical composition comprising anti pcsk9 oligomers |
WO2009148605A2 (en) * | 2008-06-04 | 2009-12-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating hypercholesterolemia |
WO2010000665A1 (en) | 2008-06-30 | 2010-01-07 | Santaris Pharma A/S | Antidote oligomers |
CA2778171C (en) | 2009-10-29 | 2017-07-25 | Osaka University | Bridged artificial nucleoside and nucleotide |
-
2011
- 2011-08-31 JP JP2012531921A patent/JP5875006B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-08-31 WO PCT/JP2011/069818 patent/WO2012029870A1/ja active Application Filing
- 2011-08-31 EP EP11821885.8A patent/EP2612914B1/en not_active Not-in-force
- 2011-08-31 US US13/819,722 patent/US9127280B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005021570A1 (ja) * | 2003-08-28 | 2005-03-10 | Gene Design, Inc. | N−0結合性架橋構造型新規人工核酸 |
Non-Patent Citations (13)
Title |
---|
JPN6010070544; YAHARA, A. et al: 'Synthesis and properties of a novel 2',4'-BNA bearing a urea bridged structure' Nucleic Acids Symposium Series Vol.53, 2009, p.11-12 * |
JPN6010070545; NISHIDA, M. et al: 'Synthesis and chemical properties of a novel 2',4'-bridged nucleic acid analog with a seven-membered' Nucleic Acids Symposium Series No.51, 2007, p.157-158 * |
JPN6011051757; GUPTA, N. et al.: 'A locked nucleic acid antisense oligonucleotide (LNA) silences PCSK9 and enhances LDLR expression in' PLoS ONE Vol.5 No.5, 201005, e10682 * |
JPN6011051759; KOIZUMI, M.: '2'-O,4'-C-Ethylene-Bridged Nucleic Acids (ENATM) as next-generation antisense and antigene agents.' Biological & Pharmaceutical Bulletin Vol.27 No.4, 2004, p.453-456 * |
JPN6011051761; PRAKASH, T.P. et al.: 'Antisense oligonucleotides containing conformationally constrained 2',4'-(N-methoxy)aminomethylene a' J. Med. Chem. Vol.53 No.4, 201002, p.1636-1650 * |
JPN6011051762; RAHMAN, S.M.A. et al.: 'Design, synthesis, and properties of 2',4'-BNA(NC): a bridged nucleic acid analogue.' J. Am. Chem. Soc. Vol.130 No.14, 2008, p.4886-4896 * |
JPN6011051764; GRAHAM, M.J. et al.: 'Antisense inhibition of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 reduces serum LDL in hyperlipi' J. Lipid Res. Vol.48 No.4, 2007, p.763-767 * |
JPN6011051766; CHAN, J.H.P. et al.: 'Antisense oligonucleotides: from design to therapeutic application.' Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. Vol.33 No.5-6, 2006, p.533-540 * |
JPN6011051768; AARTSMA-RUS, A. et al.: 'Guidelines for antisense oligonucleotide design and insight into splice-modulating mechanisms.' Mol. Therapy Vol.17 No.3, 2009, p.548-553 * |
JPN6011051771; GRAY, D.M. et al.: 'Antisense DNA parameters derived from next-nearest-neighbor analysis of experimental data.' BMC Bioinformatics Vol.11 No.252, 201005, p.1-14 * |
JPN6011051774; NISHIDA, M. et al.: 'Synthesis, RNA selective hybridization and high nuclease resistance of an oligonucleotide containing' Chemical Communications Vol.46 No.29, 201006, p.5283-5285 * |
JPN6011051776; FRANK-KAMENETSKY, M. et al.: 'Therapeutic RNAi targeting PCSK9 acutely lowers plasma cholesterol in rodents and LDL cholesterol in' Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.105 No.33, 2008, p.11915-11920 * |
JPN6011051779; RAHMAN, S.M.A., et al: 'RNA interference with 2',4'-bridged nucleic acid analogues.' Bioorganic & Medicinal Chemistry Vol.18 No.10, 20100403, p.3474-3480 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2612914A4 (en) | 2014-12-31 |
JPWO2012029870A1 (ja) | 2013-10-31 |
US9127280B2 (en) | 2015-09-08 |
WO2012029870A1 (ja) | 2012-03-08 |
EP2612914A1 (en) | 2013-07-10 |
EP2612914B1 (en) | 2017-06-21 |
US20130172402A1 (en) | 2013-07-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5875006B2 (ja) | オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療剤 | |
WO2013089157A1 (ja) | オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する高脂血症治療剤 | |
KR101857707B1 (ko) | 아포지질단백질 c-iii 발현을 조절하는 조성물 및 방법 | |
JP6440170B2 (ja) | キメラ一本鎖アンチセンスポリヌクレオチドおよび二本鎖アンチセンス剤 | |
JP2021502120A (ja) | 細胞におけるlpaの発現を抑制するための核酸 | |
JP2015518714A (ja) | 遺伝子発現を調節するための組成物及び方法 | |
JP5812478B2 (ja) | 抗癌剤結合性核酸アプタマー及びその利用 | |
Taskova et al. | Antisense oligonucleotides internally labeled with peptides show improved target recognition and stability to enzymatic degradation | |
US20220160880A1 (en) | Antisense nucleic acid targeting pcsk9 | |
JPWO2020027227A1 (ja) | オリゴヌクレオチドを含有する小細胞肺癌治療薬 | |
RU2753517C2 (ru) | Антисмысловые олигонуклеотиды к hif-1-альфа | |
JP6826984B2 (ja) | アシル−アミノ−lnaオリゴヌクレオチドおよび/またはヒドロカルビル−アミノ−lnaオリゴヌクレオチド | |
WO2014007305A1 (ja) | オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療剤 | |
US20200318113A1 (en) | Polynucleotide conjugates and uses thereof | |
EP3500673B1 (en) | Carboxylated 2'-amino-lna nucleotides and oligonucleotides comprising the same | |
TW202022115A (zh) | 乙醯輔酶a羧化酶的反義寡核苷酸 | |
RU2807629C2 (ru) | Антисмысловые олигонуклеотиды ацетил-соа-карбоксилазы-2 | |
JP6736462B2 (ja) | 生体内のアシル化機能と置き換えられる人工触媒システム | |
Wang | Poly (ethylene) Glycol-Based Bottlebrush Polymers as Nanocarriers for Oligonucleotide Therapeutics: Design, Synthesis, and Applications | |
AU2022337260A1 (en) | Compositions and methods for skipping exon 45 in duchenne muscular dystrophy | |
EA045986B1 (ru) | Нуклеиновые кислоты для ингибирования экспрессии lpa в клетке |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20131213 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140805 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140930 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150310 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150508 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20150707 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20151005 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20151013 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20151222 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160108 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5875006 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D04 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |