WO2014007305A1 - オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療剤 - Google Patents

オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療剤 Download PDF

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聡 小比賀
萌夏 中谷
秀典 安原
真理子 斯波
剛史 山本
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国立大学法人大阪大学
独立行政法人国立循環器病研究センター
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    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications

Definitions

  • the present invention relates to an oligonucleotide and a therapeutic agent for dyslipidemia containing the oligonucleotide as an active ingredient.
  • Familial hypercholesterolemia having a mutation in the gene of LDL receptor is a disease that develops at a rate of 1 in 500 (250,000 in Japan), and is the most common genetic metabolic disease.
  • the patient's serum total cholesterol level is 230 to 500 mg / dL (healthy person: 200 mg / dL or less), and symptoms such as skin and tendon xanthoma, coronary artery disease due to juvenile arteriosclerosis are observed.
  • the average life expectancy of patients is 54 years for men and 69 years for women, far below the average life expectancy of the entire population.
  • a typical treatment includes LDL apheresis treatment, but this treatment imposes a great burden on the patient.
  • Drug therapy includes administration of statins, but the effects of statins are not sufficient for familial hypercholesterolemia.
  • hyperlipidemia is a lifestyle-related disease that causes myocardial infarction and stroke, the cause of death after cancer.
  • Patent Document 1 describes antisense oligonucleotides for treating dyslipidemia containing various 4 ', 2'-bridged sugar-modified nucleosides targeting the PCSK9 gene. However, there is a need for oligonucleotides that have higher therapeutic effects at lower doses.
  • An object of the present invention is to provide an oligonucleotide having a higher therapeutic effect on dyslipidemia at a lower dose targeting the PCSK9 gene.
  • the present inventors have made antisense oligonucleotides containing 4 ′, 2′-bridged sugar-modified oligonucleosides lower by using a specific region of the PCSK9 gene as a target sequence.
  • the present inventors have found that a higher dyslipidemic effect can be achieved at a dose and completed the present invention.
  • the oligonucleotide of the present invention is an oligonucleotide containing a sugar-modified nucleoside at any position, and the sugar-modified nucleoside has a cross-linking structure between the 4 ′ position and the 2 ′ position, and the oligonucleotide
  • the PCSK9 gene can be combined with the PCSK9 gene, and the PCSK9 gene is a DNA or RNA comprising a base sequence including any of the following base sequences and a base sequence complementary thereto: (A) the base sequence shown by SEQ ID NO: 18; the base sequence shown by SEQ ID NO: 20; the base sequence shown by SEQ ID NO: 26; the base sequence shown by SEQ ID NO: 28; the base sequence shown by SEQ ID NO: 30; The base sequence shown by SEQ ID NO: 42; the base sequence shown by SEQ ID NO: 50; the base sequence shown by SEQ ID NO: 51; the base sequence shown by SEQ ID NO: 52; the base shown by SEQ ID NO:
  • the PCSK9 gene is DNA or RNA consisting of a base sequence comprising any of the following base sequences and a base sequence complementary thereto: (A ′) a base sequence represented by SEQ ID NO: 18; a base sequence represented by SEQ ID NO: 28; a base sequence represented by SEQ ID NO: 31; a base sequence represented by SEQ ID NO: 50; a base sequence represented by SEQ ID NO: 51; The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 89; the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 89; the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 124; the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 126; Nucleotide sequence; and nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 133; or nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 138; or (b ′) one or several bases deleted or substituted in the nucleotide sequence represented by (a ′) above
  • an added base sequence comprising any of
  • the PCSK9 gene is DNA or RNA consisting of a base sequence comprising any of the following base sequences and a base sequence complementary thereto: (A ′′) the base sequence shown by SEQ ID NO: 28; the base sequence shown by SEQ ID NO: 50; the base sequence shown by SEQ ID NO: 58; the base sequence shown by SEQ ID NO: 89; the base sequence shown by SEQ ID NO: 100; A base sequence represented by SEQ ID NO: 124; a base sequence represented by SEQ ID NO: 126; a base sequence represented by SEQ ID NO: 127; and a base sequence represented by SEQ ID NO: 133; or a base sequence represented by SEQ ID NO: 138; or (b '') A base sequence in which one or several bases have been deleted, substituted or added in the base sequence shown in (a '') above, or at least 75% of the base sequence shown in (a ') above A nucleotide sequence having the sequence homology of
  • the crosslinked structure has —CH 2 —O—, — (CH 2 ) 2 —O—, —CH 2 —NR 1 —O—, — (CH 2 ) 2 —NR 1 —O—.
  • R 1 is a hydrogen atom; an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring; and 2 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring.
  • An alkenyl group of ⁇ group hydroxyl group, straight-chain alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, straight-chain alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, mercapto group, straight-chain alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, amino group, 1 to 6 carbon atoms A linear alkylamino group, and a halogen atom; an aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may have one or more optional substituents selected from An aralkyl group having an aryl moiety having 3 to 12 carbon atoms which may have one or more optional substituents and may contain a hetero atom, and X represents an oxygen atom, a sulfur atom Represents an amino group or a methylene group.
  • the length of the base sequence of the oligonucleotide is 10 to 25 bases.
  • the PCSK9 gene is derived from a human PCSK9 gene.
  • the PCSK9 gene expression inhibitor of the present invention contains the above oligonucleotide as an active ingredient.
  • the therapeutic agent and prophylactic agent for dyslipidemia of the present invention contains the above oligonucleotide as an active ingredient.
  • oligonucleotide having a higher therapeutic effect on dyslipidemia at a lower dose targeting the PCSK9 gene.
  • linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms refers to any linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, specifically, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, An n-butyl group, an n-pentyl group, or an n-hexyl group.
  • linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkoxy group having an arbitrary linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. Examples thereof include a methyloxy group, an ethyloxy group, and an n-propyloxy group.
  • linear alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkylthio group having an arbitrary linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. Examples thereof include a methylthio group, an ethylthio group, and an n-propylthio group.
  • a linear alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkylamino group having one or two arbitrary linear alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms. Examples thereof include a methylamino group, a dimethylamino group, an ethylamino group, a methylethylamino group, and a diethylamino group.
  • an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring means any linear alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, any branch having 3 to 7 carbon atoms.
  • Chain alkyl groups, any cyclic alkyl group having 3 to 7 carbon atoms, and combinations thereof having 3 to 7 carbon atoms are included. It may be simply referred to as “lower alkyl group”.
  • arbitrary linear alkyl groups having 1 to 7 carbon atoms include methyl group, ethyl group, n-propyl group, n-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group, and n-heptyl group.
  • Examples of the arbitrary branched chain alkyl group having 3 to 7 carbon atoms include isopropyl group, isobutyl group, tert-butyl group, isopentyl group and the like, and examples of the arbitrary cyclic alkyl group having 3 to 7 carbon atoms include , A cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, and the like. Examples of these combinations having 3 to 7 carbon atoms include a methylcyclopentyl group and a methylcyclohexyl group.
  • an alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring means any straight chain alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms, any branch having 3 to 7 carbon atoms. It includes a chain alkenyl group, an arbitrary cyclic alkenyl group having 3 to 7 carbon atoms, and a combination thereof having 2 to 7 carbon atoms. It may be simply referred to as “lower alkenyl group”.
  • the arbitrary branched chain alkenyl group having 3 to 7 carbon atoms there are isopropenyl group, 1-methyl-1-propenyl group, 1-methyl -2-propenyl group, 2-methyl-1-propenyl group, 2-methyl-2-propenyl group, 1-methyl-2-butenyl group, etc.
  • any cyclic alkenyl group having 3 to 7 carbon atoms Includes a cyclobutenyl group, a cyclopentenyl group, a cyclohexenyl group, and the like.
  • aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may contain a hetero atom constitutes an arbitrary aromatic hydrocarbon having 6 to 12 carbon atoms or a ring structure composed only of hydrocarbons.
  • any heteroaromatic compound having 3 to 12 carbon atoms in which one or more carbon atoms are substituted with the same or different heteroatoms for example, a nitrogen atom, an oxygen atom, and a sulfur atom.
  • Examples of the aromatic hydrocarbon having 6 to 12 carbon atoms composed of only hydrocarbons include a phenyl group, a naphthyl group, an indenyl group, an azulenyl group, and the like, and a 3 to 12 carbon atom having a hetero atom in the ring structure.
  • Arbitrary heteroaromatic compounds include pyridyl group, pyrrolyl group, quinolyl group, indolyl group, imidazolyl group, furyl group, thienyl group and the like.
  • aralkyl group having an aryl moiety having 3 to 12 carbon atoms which may contain a hetero atom examples include a benzyl group, a phenethyl group, a naphthylmethyl group, a 3-phenylpropyl group, -Phenylpropyl, 4-phenylbutyl, 2-phenylbutyl, pyridylmethyl, indolylmethyl, furylmethyl, thienylmethyl, pyrrolylmethyl, 2-pyridylethyl, 1-pyridylethyl, 3 -Thienylpropyl group and the like.
  • halogen atom examples include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • nucleoside refers to a glycosylamine containing a nucleobase and a sugar.
  • examples of nucleosides include, but are not limited to, naturally occurring nucleosides, abasic nucleosides, modified nucleosides, and nucleosides having pseudobases and / or sugar groups.
  • nucleotide refers to a compound composed of a nucleoside and phosphoric acid, in which the sugar moiety of the nucleoside and phosphoric acid form an ester bond.
  • deoxyribonucleotide refers to a nucleotide having a hydrogen at the 2 ′ position of the sugar moiety of the nucleotide.
  • deoxyribonucleic acid refers to a nucleic acid containing deoxyribonucleotides.
  • ribonucleotide refers to a nucleotide having a hydroxy group at the 2 ′ position of the sugar moiety of the nucleotide.
  • RNA ribonucleic acid
  • modified nucleoside means an unnatural type of “nucleoside” in which a purine or pyrimidine base and a sugar are bonded, and aromatic heterocycles and aromatic hydrocarbons other than purine and pyrimidine. A ring that can be substituted with a purine or pyrimidine base and a sugar bonded to it.
  • a sugar-modified nucleoside having a modified sugar moiety can be mentioned.
  • oligonucleotide refers to an “oligonucleotide” in which 2 to 50 identical or different “nucleosides” are linked by phosphodiester bonds.
  • Non-naturally occurring derivatives of “oligonucleotides” are also included. Examples of such derivatives include sugar derivatives in which the sugar moiety is modified; thioate derivatives in which the phosphodiester moiety is thioated; phosphorothioates in which the oxygen atom of the phosphate group in the phosphodiester bond is substituted with a sulfur atom Derivatives; ester forms in which the terminal phosphoric acid moiety is esterified; amide forms in which the amino group on the purine base is amidated.
  • the oligonucleotide of the present invention contains at least one sugar-modified nucleoside at any position.
  • the position and number are not particularly limited, and can be appropriately designed according to the purpose.
  • Two or more sugar-modified nucleosides may be the same as or different from each other.
  • Sugar modification can alter the activity of the oligonucleotide. For example, it can increase affinity for the target nucleic acid, increase resistance to nucleases, and alter the pharmacokinetics or tissue distribution of the oligonucleotide. Increasing the affinity of the oligonucleotide for its target may allow the use of shorter oligonucleotides.
  • the oligonucleotide of the present invention can bind to the PCSK9 gene.
  • “can bind” means that a plurality of different single-stranded oligonucleotides or nucleic acids are nucleic acids having two or more strands due to complementation of nucleobases (also referred to as “hybrid” in this specification). Can be formed. Preferably, it means that a double-stranded nucleic acid can be formed.
  • the melting temperature (Tm) of the nucleic acid having two or more strands is not particularly limited. For example, two different single-stranded oligonucleotides or nucleic acids that form a double-stranded nucleic acid do not have to be completely complementary in the base sequence of the region that forms the double-stranded.
  • the origin of the PCSK9 gene to which the oligonucleotide of the present invention can bind is not particularly limited as long as it is an animal, but is preferably a mammal, more preferably a primate, and still more preferably a human.
  • the human PCSK9 gene contains the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (GenBank accession number: NM — 174936; full length 3731 bases, coding region, 2079 bases), and encodes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 1 GenBank accession number: NM — 174936; full length 3731 bases, coding region, 2079 bases
  • the PCSK9 gene is involved in the degradation of the LDL receptor.
  • Examples of the PCSK9 gene to which the oligonucleotide of the present invention can bind include, for example, DNA or RNA consisting of a base sequence including any of the following base sequences and base sequences complementary thereto: (A) the base sequence shown by SEQ ID NO: 18; the base sequence shown by SEQ ID NO: 20; the base sequence shown by SEQ ID NO: 26; the base sequence shown by SEQ ID NO: 28; the base sequence shown by SEQ ID NO: 30; The base sequence shown by SEQ ID NO: 42; the base sequence shown by SEQ ID NO: 50; the base sequence shown by SEQ ID NO: 51; the base sequence shown by SEQ ID NO: 52; the base shown by SEQ ID NO: 57 Sequence: Base sequence shown by SEQ ID NO: 58; Base sequence shown by SEQ ID NO: 59; Base sequence shown by SEQ ID NO: 89; Base sequence shown by SEQ ID NO: 94; Base sequence shown by SEQ ID NO: 100; A nucleotide sequence represented by SEQ ID NO
  • each of the above base sequences corresponds to the following target region in the PCSK9 gene: for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 is from position 457 to 470; the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 is at position 523 Position to position 536; the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 26 is positions 696 to 709; the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28 is positions 751 to 764; the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30 827 to 840; the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 31 is from 844 to 857; the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 42 is from 1173 to 1186; SEQ ID NO: 50 The nucleotide sequence shown is from positions 1418 to 1431; the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 51 is from positions 1451 to 1464; the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 52 is from positions 1481 to 1431 495; the nu
  • the position of the base sequence of the target region is the mouse PCSK9 gene (GenBank accession number: NM_153565; consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 139, having a total length of 3512 bases, and the coding region is 2085 bases; SEQ ID NO: 140 Although it is based on the amino acid sequence shown), it can also be a corresponding region in the case of genes from other animals (preferably mammals, more preferably primates, even more preferably humans).
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 138 corresponds to the region from positions 1357 to 1369 of the human PCSK9 gene (SEQ ID NO: 1).
  • the corresponding region derived from the other animal may be a sequence that is completely the same as the base sequence represented by the SEQ ID NO or a sequence having a predetermined sequence homology as described below.
  • Preferable examples include DNA or RNA having the following base sequence and a base sequence including any of the base sequences complementary thereto: (A ′) a base sequence represented by SEQ ID NO: 18; a base sequence represented by SEQ ID NO: 28; a base sequence represented by SEQ ID NO: 31; a base sequence represented by SEQ ID NO: 50; a base sequence represented by SEQ ID NO: 51; The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 89; the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 89; the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 124; the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 126; Nucleotide sequence; and nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 133; or nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 138; or (b ′) one or several bases deleted or substituted in the nucleotide sequence represented by (a ′) above Alternatively, an added base sequence or a base sequence having a
  • DNA or RNA consisting of the following base sequence and a base sequence including any of the base sequences complementary to these are included: (A ′′) the base sequence shown by SEQ ID NO: 28; the base sequence shown by SEQ ID NO: 50; the base sequence shown by SEQ ID NO: 58; the base sequence shown by SEQ ID NO: 89; the base sequence shown by SEQ ID NO: 100; A base sequence represented by SEQ ID NO: 124; a base sequence represented by SEQ ID NO: 126; a base sequence represented by SEQ ID NO: 127; and a base sequence represented by SEQ ID NO: 133; or a base sequence represented by SEQ ID NO: 138; or (b '') A base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in (a '') above, or a base sequence shown in (a '') above. A nucleotide sequence having sequence homology.
  • DNA or RNA consisting of the following base sequence and a base sequence including any of the base sequences complementary to these are included: (A ′ ′′) base sequence represented by SEQ ID NO: 50; base sequence represented by SEQ ID NO: 58; base sequence represented by SEQ ID NO: 124; base sequence represented by SEQ ID NO: 126; base sequence represented by SEQ ID NO: 127 And a base sequence represented by SEQ ID NO: 133; or a base sequence represented by SEQ ID NO: 138; or (b ′ ′′) one or several bases are deleted from the base sequence represented by (a ′ ′′) above.
  • the “base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence” means the base sequence of the target region substantially equivalent to the base sequence specified by the sequence number for the PCSK9 gene. Is a base sequence that has been changed by deletion, substitution, or addition, and the base sequence after the change also represents the PCSK9 gene.
  • predetermined sequence homology include at least 75%, at least 80%, at least 83%, at least 85%, at least 88%, and at least 90% sequence homology.
  • 75% sequence homology means that the ratio (%) of homologous (ie, identical) bases to the entire length of the target base sequence is 75%.
  • a sequence homology of at least 75% can substantially correspond to a sequence homology changed by deletion, substitution or addition within 3 bases when the total length of the base sequence is 14 bases, for example.
  • the sequence homology of 85% means that the ratio (%) of homologous (ie, identical) bases is 85% with respect to the entire length of the target base sequence. This 85% sequence homology can be roughly equivalent to, for example, a sequence homology altered by deletion, substitution or addition within 2 bases when the total length of the base sequence is 14 bases.
  • the PCSK9 gene is preferably derived from a human PCSK9 gene.
  • the oligonucleotide of the present invention has the nucleotide sequence specified by SEQ ID NO and the position of the sequence of the target region in the corresponding PCSK9 gene (for example, described in Table 1-1 to Table 1-3 and Table 2 below) The position may be designed as appropriate based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (base sequence of human PCSK9 gene).
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 138 corresponds to the region from positions 1357 to 1369 of the human PCSK9 gene (SEQ ID NO: 1).
  • the base sequence of the region targeted by the oligonucleotide designed with reference to the base sequence identified by the sequence number and the corresponding sequence of the target region in the PCSK9 gene is the above-mentioned “1 in the base sequence”.
  • it may be included in a “base sequence in which several bases are deleted, substituted or added” or “a base sequence having a predetermined sequence homology”.
  • the length of the base sequence of the oligonucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it can bind to the base sequence specified by the sequence number and the corresponding target region in the PCSK9 gene.
  • the length is preferably such that it binds to the target region and can suppress the expression level of PCSK9 mRNA.
  • the length of the base sequence of the oligonucleotide of the present invention is preferably 10 to 25 bases, more preferably 10 to 16 bases. If it is shorter than 10 bases, it is difficult to form a hybrid with the PCSK9 gene, and if it is longer than 25 bases, it tends to be degraded by a nuclease.
  • the oligonucleotide of the present invention may contain a sugar-modified nucleoside in the 5'-terminal region and 3'-terminal region of the oligonucleotide.
  • the number and arrangement of sugar-modified nucleosides contained in each of the 5'-terminal region and the 3'-terminus can be appropriately determined according to the nucleotide length and sequence of the oligonucleotide used. For example, when the length of the oligonucleotide is 13 to 14 bases, the sugar-modified nucleoside is independently in the 5′-terminal region and the 3′-terminal region, for example, 1 to 3 bases, preferably 2 to 3 bases. Can be included in the base.
  • the sugar-modified nucleoside contained in the oligonucleotide of the present invention has a cross-linking structure between the 4 'position and the 2' position in the same nucleoside.
  • crosslinked structures is represented by —CH 2 —O— or — (CH 2 ) 2 —O—.
  • BNA crosslinked structure
  • BNA examples include ⁇ -L-methyleneoxy (4′-CH 2 —O-2 ′), ⁇ -D-methyleneoxy (4′-CH 2 —O-2 ′), ethyleneoxy (4′- (CH 2 ) 2 —O-2 ′), but not limited to.
  • a BNA nucleoside (monomer) can be synthesized, for example, as an amidite form for oligo DNA synthesis by the methods described in Non-Patent Documents 1 to 5.
  • R 1 is a hydrogen atom
  • NC examples include oxyamino (4′-CH 2 —NH—O-2 ′) and N-methyloxyamino (4′—CH 2 —NCH 3 —O-2 ′). It is not limited.
  • the NC nucleoside (monomer) can be synthesized by the methods described in Non-Patent Documents 6 to 9, for example, as an amidite for oligo DNA synthesis.
  • R 1 is a hydrogen atom
  • an aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may have one or more optional
  • AM examples include unsubstituted amide (4′-CO—NH-2 ′), N-methylamide (4′-CO—NCH 3 -2 ′), and acetamide (4′-CH 2 —CO—NH-2). '), N-methylacetamide (4'-CH 2 -CO-NCH 3 -2'), N-oxyacetamide (4'-CH 2 -CO-NH-O-2 '), N-methyl-N- Examples include, but are not limited to, oxyacetamide (4′-CH 2 —CO—NCH 3 —O-2 ′).
  • AM nucleoside can be synthesized, for example, by the method described in Patent Document 1 as an amidite for oligo DNA synthesis.
  • the oligonucleotide of the present invention comprises at least one sugar-modified nucleoside having any one of the above-mentioned bridging structures “BNA”, “NC” or “AM” between the 4 ′ position and the 2 ′ position in the same nucleoside. Includes types.
  • the oligonucleotide of the present invention may have a structure in which an oxygen atom of a phosphate group in a phosphodiester bond is substituted with a sulfur atom in a bond between nucleosides (a group corresponding to a phosphate group is referred to as a phosphorothioate group). Such a bond is called a PS skeleton.
  • an oligonucleotide in which all phosphate groups of the oligonucleotide are substituted with phosphorothioate groups is particularly referred to as S-oligonucleotide.
  • the oligonucleotide may be an oligonucleotide in which all of the phosphate groups of the oligonucleotide are substituted with phosphorothioate groups, or may be an oligonucleotide in which a part of the phosphate groups of the oligonucleotide is substituted with phosphorothioate groups.
  • the structure of the 5'-end or 3'-end of the oligonucleotide of the present invention is not particularly limited.
  • Cholesterol is preferably bound to the 5'-end or 3'-end.
  • the method for binding cholesterol to the 5'-end or 3'-end is not particularly limited.
  • a method of introducing cholesterol as an amidite a method of introducing as a solid phase carrier for oligonucleotide synthesis, and a method of conjugating after synthesizing an oligonucleotide.
  • the structure of the oligonucleotide of the present invention and the crosslinked structure of the BNA, NC or AM monomer that can constitute the oligonucleotide can be identified by, for example, a matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS) .
  • MALDI-TOF-MS matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometer
  • an oligonucleotide containing a sugar-modified nucleoside is fixed by a cross-linked structure between the 4′-position and the 2′-position within the same nucleoside, so that it is not easily degraded by various nucleases and is administered to a living body. Then, it can exist in the living body for a long time.
  • the oligonucleotide of the present invention can inhibit PCSK9 gene expression by binding to PCSK9 mRNA as, for example, an antisense nucleic acid. That is, it has an effect as a PCSK9 gene expression inhibitor.
  • the gene expression of PCSK9 is suppressed, the expression level of LDL receptor protein increases, and the LDL concentration in blood can be decreased by promoting LDL uptake into cells and metabolism.
  • the PCSK9 gene expression inhibitor can be used, for example, as a medicine for reducing the blood LDL concentration, or, for example, as a reagent for examining the influence of the blood LDL concentration on a disease state. Can do.
  • the oligonucleotide of the present invention has an effect as a PCSK9 gene expression inhibitor.
  • it has an effect as a blood LDL reducing agent, and has high effects such as familial hypercholesterolemia and hyperlipidemia. It is effective as a therapeutic agent and preventive agent for cholesterolemia (dyslipidemia). In particular, a higher dyslipidemic effect is achieved at a lower dose.
  • the therapeutic agent and prophylactic agent for dyslipidemia containing the oligonucleotide of the present invention as an active ingredient include, for example, pharmaceuticals such as excipients, binders, preservatives, oxidation stabilizers, disintegrants, lubricants, and flavoring agents.
  • An auxiliary agent usually used in the pharmaceutical technical field can be further contained, and for example, a parenteral preparation can be obtained.
  • it can further contain the pharmaceutical carrier normally used in the said technical field, for example, it can be set as topical preparations, such as a liquid agent, a cream agent, and an ointment.
  • Example 1 Synthesis of Oligonucleotide A BNA monomer (amidite) was synthesized by the method described in Non-Patent Documents 1 to 5. Using this as a monomer body for oligo DNA synthesis, a DNA synthesizer used the oligonucleotides described in Table 1-1 to Table 1-3 (BNA-oligonucleotides containing BNA-nucleosides consisting of the base sequence of mouse PCSK9 gene, In vivo grade, 1-100 mg as required) was synthesized.
  • the PS skeleton is a structure in which the oxygen atom of the phosphate group in the phosphodiester bond is replaced with a sulfur atom (a group corresponding to the phosphate group is referred to as a phosphorothioate group). ).
  • an oligonucleotide in which all of the phosphate groups of the oligonucleotide are replaced with phosphorothioate groups is particularly referred to as S-oligonucleotide. All of the oligonucleotides described in Table 1-1 to Table 1-3 are S-oligonucleotides.
  • As the cross-linked structure of BNA used in this example —CH 2 —O— was used.
  • the synthesized oligonucleotide was subjected to HPLC purification and lyophilization treatment.
  • the cross-linked structure of BNA used in this example and the purity and structure of each oligonucleotide obtained were confirmed by HPLC and MALDI-TOF-MS (manufactured by BRUKER DALTONICS).
  • Example 2 In Vitro PCSK9 Gene Expression Inhibition Effect 1 by Oligonucleotide Cells of the mouse liver cell line NMuli were seeded in a 12-well plate at 1.5 ⁇ 10 5 cells / well and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours. Each oligonucleotide synthesized in Example 1 was added to each well using Lipofectamine 2000 (manufactured by Invitrogen) to a final concentration of 5 nM or 50 nM (transfection). After 4 hours, the medium was changed, and after 20 hours, the cells were collected. Total RNA was extracted from the cells using RNeasy mini kit (manufactured by QIAGEN).
  • cDNA was obtained using a high capacity cDNA reverse reverse transcription kit (Applied Biosystems). Using the obtained cDNA and TaqMan (registered trademark) Gene Expression ID (Applied Biosystems), real-time PCR was performed by a StepOnePlus (TM) real-time PCR analysis system (Applied Biosystems), and the amount of PCSK9 mRNA was quantified. In real-time PCR, the amount of GAPDH mRNA of the housekeeping gene was also quantified at the same time, and the amount of PCSK9 mRNA relative to the amount of GAPDH mRNA was evaluated as the PCSK9 mRNA expression level. Cells that had not been transfected were used as controls. The results are shown in FIGS.
  • the primer used was TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems), and Assay ID was as follows: For mouse PCSK9 quantification: Mm01263610_m1 and Mm00463738_m1 For mouse GAPDH quantification: Mm99999999_m1
  • oligonucleotides for a specific target region ie, oligonucleotide 16 (target sequence: SEQ ID NO: 18), oligonucleotide 18 (target sequence: SEQ ID NO: 20), oligonucleotide 24 (target sequence: SEQ ID NO: 26), oligonucleotide 26 (target sequence: SEQ ID NO: 28), oligonucleotide 28 (target sequence: SEQ ID NO: 30), oligonucleotide 29 (target sequence: SEQ ID NO: 31), oligonucleotide 40 (target sequence: SEQ ID NO: 42), oligonucleotide 48 (target sequence: SEQ ID NO: 50), oligonucleotide 49 (target sequence: SEQ ID NO: 51), oligonucleotide 50 (target sequence: SEQ ID NO: 52), oligonucleotide 55 (target sequence: SEQ ID NO: 57) , Oligonucleotide 16 (target sequence: S
  • Example 3 In Vitro PCSK9 Gene Expression Inhibition Effect 2 by Oligonucleotide
  • a specific oligonucleotide was used, and the final concentration of each oligonucleotide added to each well was 0.4 nM, 2 nM or 10 nM instead of 5 nM or 50 nM
  • in vitro PCSK9 gene expression inhibitory effect was examined in the same manner as in Example 2. The results are shown in FIG.
  • oligonucleotide 16 target sequence: SEQ ID NO: 18
  • oligonucleotide 26 target sequence: SEQ ID NO: 28
  • oligonucleotide 29 target sequence: SEQ ID NO: 31
  • oligonucleotide 48 Target sequence: SEQ ID NO: 50
  • oligonucleotide 49 target sequence: SEQ ID NO: 51
  • oligonucleotide 56 target sequence: SEQ ID NO: 58
  • oligonucleotide 87 target sequence: SEQ ID NO: 89
  • oligonucleotide 98 target The sequence: SEQ ID NO: 100
  • Example 4 In vitro PCSK9 gene expression suppression effect 3 by oligonucleotide Among the oligonucleotides synthesized in Example 1, the oligonucleotide for the target sequence consisting of a base sequence common to the human PCSK9 gene and the mouse PCSK9 gene was used, and human liver cells were used instead of the cells of the mouse liver cell line NMuli. The in vitro PCSK9 gene expression inhibitory effect was examined in the same manner as in Example 2 except that cells of strain HuH7 were used. The results are shown in FIG.
  • the primer used was TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems), and Assay ID was as follows: For quantification of human PCSK9: Hs00545399_m1
  • oligonucleotide 48 target sequence: SEQ ID NO: 50
  • oligonucleotide 56 target sequence: SEQ ID NO: 58
  • mouse cells did not show much expression suppression effect, whereas human cells showed high expression suppression effect.
  • oligonucleotide 26 (target sequence: SEQ ID NO: 28), oligonucleotide 48 (target sequence: SEQ ID NO: 50), oligonucleotide 56 (target sequence) that showed the in vitro PCSK9 gene expression suppression effect : SEQ ID NO: 58), oligonucleotide 87 (target sequence: SEQ ID NO: 89), and oligonucleotide 98 (target sequence: SEQ ID NO: 100) were administered to the test animals, and the inhibitory effect on PCSK9 gene expression in vivo was examined.
  • mice 8-week-old mice C57BL6 / J (male: Japan SLC Co., Ltd.) were prepared so that there were 4 cases in each administration group.
  • each oligonucleotide was administered once at a dose of 10 mg / kg from the tail vein.
  • liver and whole blood were collected from each mouse.
  • the liver was washed with PBS, minced, snap-frozen with liquid nitrogen, and stored at ⁇ 80 ° C.
  • the frozen liver sections were homogenized in 1 mL of TRIzol Regent (manufactured by Invitrogen), 200 ⁇ L of chloroform was added, and the mixture was centrifuged at 13,200 rpm at 4 ° C. for 15 minutes. 220 ⁇ L of the supernatant was added to 400 ⁇ L of isopropanol, mixed by inversion, centrifuged at 13,200 rpm, 4 ° C. for 15 minutes, and then isopropanol was removed.
  • TRIzol Regent manufactured by Invitrogen
  • cDNA was prepared using High Capacity cDNA Reverse Transfer Kit (Applied Biosystems).
  • Real-time PCR was performed using the obtained cDNA and Fast SYBR (registered trademark) Green Master Mix (Applied Biosystems) to quantify the amount of PCSK9 mRNA.
  • the amount of GAPDH mRNA of the housekeeping gene was also quantified, and the amount of PCSK9 mRNA relative to the amount of GAPDH mRNA was evaluated. The results are shown in FIG.
  • the primer used was TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems), and Assay ID was as follows: For mouse PCSK9 quantification: Mm00463738_m1 For mouse GAPDH quantification: Mm99999999_m1
  • oligonucleotide 26 target sequence: SEQ ID NO: 28
  • oligonucleotide 48 target sequence: SEQ ID NO: 50
  • oligonucleotide 56 target
  • oligonucleotide 87 target sequence: SEQ ID NO: 89
  • oligonucleotide 98 target sequence: SEQ ID NO: 100
  • oligonucleotide 26 (target sequence: SEQ ID NO: 28), oligonucleotide 48 (target sequence: SEQ ID NO: 50), oligonucleotide 56 (target sequence: SEQ ID NO: 58) and oligonucleotide 98 (target sequence: SEQ ID NO: 100) was found to show a significant PCSK9 gene expression inhibitory effect in vivo without showing hepatotoxicity.
  • Example 6 In vivo PCSK9 gene expression suppression effect 2 by oligonucleotide
  • Various oligonucleotides shown in Table 2 below were synthesized in the same manner as in Example 1.
  • various sugar-modified nucleoside monomers (BNA, NC and AM monomers) synthesized by the methods described in Non-Patent Documents 1 to 9 were used as oligonucleotide synthesis monomers.
  • —CH 2 —O—, —CH 2 —NCH 3 —O—, and —CO—NCH 3 — were used for the cross-linked structures of BNA, NC, and AM used in this example, respectively.
  • oligonucleotides shown in Table 2 were administered to test animals in the same manner as in Example 5 and examined for the PCSK9 gene expression inhibitory effect in vivo.
  • the dosage of the oligonucleotide to the mouse was 30 mg / kg instead of 10 mg / kg in Example 5 except for the oligonucleotide 29 (SEQ ID NO: 31).
  • the liver collected from the mouse was stored in the same manner as in Example 5 using formalin instead of using liquid nitrogen. The results are shown in FIG.
  • the oligonucleotide 136 targeting the base sequence represented by SEQ ID NO: 138, the oligonucleotide 122 targeting the base sequence represented by SEQ ID NO: 124, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 126 are targeted.
  • Oligonucleotide 124, oligonucleotide 125 targeting the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 127, and oligonucleotide 131 targeting the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 133 have a high PCSK9 gene expression inhibitory effect in vivo. Indicated.
  • PCSK9 gene expression suppression effect is higher than oligonucleotides linked in the PS backbone (the rest are natural phosphodiester bonds); rather than sugar-modified nucleoside monomers randomly present throughout the oligonucleotide PCSK9 gene expression suppression effect is higher when it is concentrated in both the 5′-end and 3′-end end regions; the proportion of natural DNA having a PS backbone is increased in the middle of the oligonucleotide As a result, the PCSK9 gene expression suppression effect is enhanced.
  • an oligonucleotide capable of binding to PCSK9 mRNA and suppressing PCSK9 gene expression can be provided.
  • the oligonucleotide of the present invention has an effect as a PCSK9 gene expression inhibitor.
  • lipid such as familial hypercholesterolemia and hyperlipidemia.
  • It is expected to have an effect as a therapeutic agent and preventive agent for (abnormality). In particular, it is expected that a higher dyslipidemic effect can be achieved at a lower dose.

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Abstract

　本発明のオリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシドを含み、該糖修飾ヌクレオシドは、４'位と２'位との間に架橋構造を有し、そして該オリゴヌクレオチドは、ＰＣＳＫ９遺伝子と結合し得る。本発明によれば、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的としたより低い用量でより高い脂質異常症治療効果を奏するオリゴヌクレオチドが提供される。

Description

オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療剤
　本発明は、オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療剤に関する。
　ＬＤＬ受容体の遺伝子に変異を有する家族性高コレステロール血症は、５００人に１人（国内で２５万人）の割合で発症する疾患であり、遺伝性代謝疾患の中で頻度が最も高い。患者の血清総コレステロール値は２３０～５００ｍｇ／ｄＬを示し（健常者：２００ｍｇ／ｄＬ以下）、皮膚および腱の黄色腫、若年性動脈硬化症による冠動脈疾患などの症状がみられる。患者の平均寿命は男性で５４歳、女性で６９歳と全人口の平均寿命を大きく下回る。代表的な治療法としては、ＬＤＬアフェレーシス治療が挙げられるが、この治療法は患者に多大な負担を強いる。薬物療法としては、スタチンの投与が挙げられるが、家族性高コレステロール血症に対しては、スタチンの効果は十分ではない。
　一方、高脂血症は、癌に次ぐ死因の心筋梗塞や脳卒中の原因となる生活習慣病である。
　これらの高コレステロール血症（脂質代謝異常症）に対する治療開発において、最近では、ＬＤＬ（ｌｏｗ　ｄｅｎｓｉｔｙリポタンパク質）受容体の代謝を調節しているＰＣＳＫ９遺伝子を標的とした戦略が注目されている。ＬＤＬ受容体を分解するＰＣＳＫ９の遺伝子発現を抑制することにより、ＬＤＬ受容体の発現量が上昇し、ＬＤＬの細胞内への取り込みや代謝を促進させることによって血中ＬＤＬ濃度を低下させる狙いがある。核酸医薬の一手法であるアンチセンス法を利用した治療実験も進められている。
　特許文献１には、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とした種々の４’，２’－架橋型糖修飾ヌクレオシドを含有する脂質異常症治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている。しかしながら、より低い用量でより高い治療効果を奏するオリゴヌクレオチドが求められている。
国際公開第２０１２／０２９８７０号
S. Obikaら、Tetrahedron Lett.、1997年、第38巻、p. 8735-8738 S. Obikaら、Tetrahedron Lett.、1998年、第39巻、p. 5401-5404 S. K. Singhら、Chem. Commun.、1998年、第4巻、p. 455-456 A. A. Koshkinら、Tetrahedron、1998年、第54巻、p. 3607-3630 S. Obikaら、Bioorg. Med. Chem.、2001年、第9巻、p. 1001-1011 S. M. A. Rahmanら、Angew. Chem. Int. Ed.、2007年、第46巻、p. 4306-4309 S. M. A. Rahmanら、Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids、2007年、第26巻、p. 1625-1628 K. Miyashitaら、Chem. Commun.、2007年、第36巻、p. 3765-3767 S. M. A. Rahmanら、J. Am. Chem. Soc.、2008年、第130巻、p. 4886-4896
　本発明は、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的としたより低い用量でより高い脂質異常症治療効果を奏するオリゴヌクレオチドを提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、ＰＣＳＫ９遺伝子の特定の領域を標的配列とすることによって、４’，２’－架橋型糖修飾オリゴヌクレオシドを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドがより低い用量でより高い脂質異常症治療効果を奏することを見出し、本発明を完成させた。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシドを任意の位置に含むオリゴヌクレオチドであって、該糖修飾ヌクレオシドが、４’位と２’位との間に架橋構造を有し、そして該オリゴヌクレオチドが、ＰＣＳＫ９遺伝子と結合し得、該ＰＣＳＫ９遺伝子が、以下の塩基配列およびこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡである：
　（ａ）配列番号１８で示される塩基配列；配列番号２０で示される塩基配列；配列番号２６で示される塩基配列；配列番号２８で示される塩基配列；配列番号３０で示される塩基配列；配列番号３１で示される塩基配列；配列番号４２で示される塩基配列；配列番号５０で示される塩基配列；配列番号５１で示される塩基配列；配列番号５２で示される塩基配列；配列番号５７で示される塩基配列；配列番号５８で示される塩基配列；配列番号５９で示される塩基配列；配列番号８９で示される塩基配列；配列番号９４で示される塩基配列；配列番号１００で示される塩基配列；配列番号１１７で示される塩基配列；配列番号１１８で示される塩基配列；配列番号１２４で示される塩基配列；配列番号１２６で示される塩基配列；配列番号１２７で示される塩基配列；および配列番号１３３で示される塩基配列；または配列番号１３８で示される塩基配列；あるいは
　（ｂ）上記（ａ）に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、または上記（ａ）に示される塩基配列に対して少なくとも７５％の配列相同性を有する塩基配列。
　１つの実施態様では、上記ＰＣＳＫ９遺伝子は、以下の塩基配列およびこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡである：
　（ａ’）配列番号１８で示される塩基配列；配列番号２８で示される塩基配列；配列番号３１で示される塩基配列；配列番号５０で示される塩基配列；配列番号５１で示される塩基配列；配列番号５８で示される塩基配列；配列番号８９で示される塩基配列；配列番号１００で示される塩基配列；配列番号１２４で示される塩基配列；配列番号１２６で示される塩基配列；配列番号１２７で示される塩基配列；および配列番号１３３で示される塩基配列；または配列番号１３８で示される塩基配列；あるいは
　（ｂ’）上記（ａ’）に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、または上記（ａ’）に示される塩基配列に対して少なくとも７５％の配列相同性を有する塩基配列。
　１つの実施態様では、上記ＰＣＳＫ９遺伝子は、以下の塩基配列およびこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡである：
　（ａ’’）配列番号２８で示される塩基配列；配列番号５０で示される塩基配列；配列番号５８で示される塩基配列；配列番号８９で示される塩基配列；配列番号１００で示される塩基配列；配列番号１２４で示される塩基配列；配列番号１２６で示される塩基配列；配列番号１２７で示される塩基配列；および配列番号１３３で示される塩基配列；または配列番号１３８で示される塩基配列；あるいは
　（ｂ’’）上記（ａ’’）に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、または上記（ａ’）に示される塩基配列に対して少なくとも７５％の配列相同性を有する塩基配列。
　１つの実施態様では、上記架橋構造は、－ＣＨ２－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－、－ＣＨ２－ＮＲ１－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－ＮＲ１－Ｏ－、－ＣＯ－ＮＲ１－、－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＲ１－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＲ１－、－ＣＯ－ＮＲ１－Ｘ－、または－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＲ１－Ｘ－で表され、ここで、Ｒ１は、水素原子；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
　α群：水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子；から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基；または
　該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；を表し、そしてＸは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表す。
　１つの実施態様では、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列の長さは、１０～２５塩基である。
　１つの実施態様では、上記ＰＣＳＫ９遺伝子は、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子に由来する。
　本発明のＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制剤は、上記オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する。
　本発明の脂質異常症治療剤および予防剤は、上記オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する。
　本発明によれば、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的としたより低い用量でより高い脂質異常症治療効果を奏するオリゴヌクレオチドを提供することができる。
オリゴヌクレオチド（５ｎＭ）で処理したＮＭｕｌｉ細胞のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。 オリゴヌクレオチド（５ｎＭ）で処理したＮＭｕｌｉ細胞のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。 オリゴヌクレオチド（５ｎＭ）で処理したＮＭｕｌｉ細胞のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。 オリゴヌクレオチド（５ｎＭ）で処理したＮＭｕｌｉ細胞のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。 オリゴヌクレオチド（５０ｎＭ）で処理したＮＭｕｌｉ細胞のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。 オリゴヌクレオチド（５０ｎＭ）で処理したＮＭｕｌｉ細胞のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。 オリゴヌクレオチド（５０ｎＭ）で処理したＮＭｕｌｉ細胞のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。 オリゴヌクレオチド（５０ｎＭ）で処理したＮＭｕｌｉ細胞のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。 オリゴヌクレオチド（０．４ｎＭ、２ｎＭまたは１０ｎＭ）で処理したＮＭｕｌｉ細胞のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。 オリゴヌクレオチド（５ｎＭまたは５０ｎＭ）で処理したＨｕＨ７細胞のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。 オリゴヌクレオチドを投与したマウスの肝臓でのＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。 オリゴヌクレオチドを投与したマウスの血清ＡＬＴ（ＧＰＴ）値および血清ＡＳＴ（ＧＯＴ）値を示すグラフである。 オリゴヌクレオチドを投与したマウスの肝臓でのＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
　まず、本明細書中で用いられる用語を定義する。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキル基」は、炭素数１～６の任意の直鎖アルキル基をいい、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、またはｎ－ヘキシル基をいう。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」は、炭素数１～６の任意の直鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メチルオキシ基、エチルオキシ基、ｎ－プロピルオキシ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基」は、炭素数１～６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ－プロピルチオ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基」は、炭素数１～６の任意の直鎖アルキル基を１つまたは２つ有するアルキルアミノ基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基」は、炭素数１～７の任意の直鎖アルキル基、炭素数３～７の任意の分岐鎖アルキル基、炭素数３～７の任意の環状アルキル基および炭素数３～７のこれらの組み合わせを包含する。単に、「低級アルキル基」という場合もある。例えば、炭素数１～７の任意の直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、およびｎ－ヘプチル基などが挙げられ、炭素数３～７の任意の分岐鎖アルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、イソペンチル基などが挙げられ、そして炭素数３～７の任意の環状アルキル基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられ、炭素数３～７のこれらの組み合わせとしては、メチルシクロペンチル基、メチルシクロヘキシル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基」は、炭素数２～７の任意の直鎖アルケニル基、炭素数３～７の任意の分岐鎖アルケニル基、炭素数３～７の任意の環状アルケニル基および炭素数２～７のこれらの組み合わせを包含する。単に、「低級アルケニル基」という場合もある。例えば、炭素数２～７の任意の直鎖アルケニル基としては、エテニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、１－ペンテニル基、２－ペンテニル基、３－ペンテニル基、４－ペンテニル基、１－ヘキセニル基などが挙げられ、炭素数３～７の任意の分岐鎖アルケニル基としては、イソプロペニル基、１－メチル－１－プロペニル基、１－メチル－２－プロペニル基、２－メチル－１－プロペニル基、２－メチル－２－プロペニル基、１－メチル－２－ブテニル基などが挙げられ、そして炭素数３～７の任意の環状アルケニル基としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられ、炭素数２～７のこれらの組み合わせとしては、メチルシクロブテニル基、メチルシクロペンテニル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基」は、炭化水素のみで構成された炭素数６～１２の任意の芳香族炭化水素または環構造を構成する１以上の炭素原子が同種または異種のヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子、および硫黄原子）で置換された炭素数３～１２の任意の複素芳香族化合物を包含する。炭化水素のみで構成された炭素数６～１２の芳香族炭化水素としては、フェニル基、ナフチル基、インデニル基、アズレニル基などが挙げられ、そして環構造にヘテロ原子を含む炭素数３～１２の任意の複素芳香族化合物としては、ピリジル基、ピロリル基、キノリル基、インドリル基、イミダゾリル基、フリル基、チエニル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基」の例としては、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、３－フェニルプロピル基、２－フェニルプロピル基、４－フェニルブチル基、２－フェニルブチル基、ピリジルメチル基、インドリルメチル基、フリルメチル基、チエニルメチル基、ピロリルメチル基、２－ピリジルエチル基、１－ピリジルエチル基、３－チエニルプロピル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子が挙げられる。
　本明細書において、用語「ヌクレオシド」とは、核酸塩基および糖を含むグリコシルアミンをいう。ヌクレオシドの例としては、天然に存在するヌクレオシド、無塩基ヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、ならびに、擬似塩基および／または糖基を有するヌクレオシドが挙げられるがこれらに限定されない。
　本明細書において、用語「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドとリン酸とで構成される化合物であって、ヌクレオシドの糖部分とリン酸とがエステル結合を形成している化合物をいう。
　本明細書において、用語「デオキシリボヌクレオチド」は、ヌクレオチドの糖部分の２’位に水素を有するヌクレオチドをいう。
　本明細書において、用語「デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）」は、デオキシリボヌクレオチドを含む核酸をいう。
　本明細書において、用語「リボヌクレオチド」は、ヌクレオチドの糖部分の２’位にヒドロキシ基を有するヌクレオチドをいう。
　本明細書において、用語「リボ核酸（ＲＮＡ）」は、リボヌクレオチドを含む核酸をいう。
　本明細書において、用語「修飾ヌクレオシド」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖とが結合した「ヌクレオシド」のうち非天然型のもの、ならびに、プリンおよびピリミジン以外の芳香族複素環および芳香族炭化水素環でプリンまたはピリミジン塩基との代用が可能なものと糖が結合したものいう。例えば、糖部分が修飾された糖修飾ヌクレオシドが挙げられる。
　本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」とは、同一または異なる「ヌクレオシド」がリン酸ジエステル結合で２～５０個結合した「オリゴヌクレオチド」をいう。「オリゴヌクレオチド」の非天然型誘導体も含む。そのような誘導体としては、例えば、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル部分がチオエート化されたチオエート誘導体；リン酸ジエステル結合中のリン酸基の酸素原子が硫黄原子で置換されたホスホロチオエート誘導体；末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体；プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体が挙げられる。
　以下、本発明について詳述する。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシドを任意の位置に少なくとも１つ含む。その位置および数は、特に限定されず、目的に応じて適宜設計され得る。２つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、互いに同じものであってもよく、異なるものであってもよい。
　糖修飾は、オリゴヌクレオチドの活性を変更し得る。例えば、標的核酸に対する親和性を高め、核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）に対する耐性を高め、オリゴヌクレオチドの薬物動態または組織分布を変更し得る。その標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高めることにより、より短いオリゴヌクレオチドの使用を可能にし得る。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＳＫ９遺伝子と結合し得る。
　ここで、「結合し得る」とは、異なる複数の１本鎖のオリゴヌクレオチドまたは核酸が、核酸塩基の相補性により２本鎖以上の鎖の核酸（本明細書中で「ハイブリッド」ともいう）を形成し得ることをいう。好適には、２本鎖の核酸を形成し得ることをいう。２本鎖以上の鎖の核酸の融解温度（Ｔｍ）は特に限定されない。例えば、２本鎖核酸を形成する異なる２つの１本鎖のオリゴヌクレオチドまたは核酸は、２本鎖を形成する領域の塩基配列が完全に相補性を有する必要はない。
　本発明のオリゴヌクレオチドが結合し得るＰＣＳＫ９遺伝子の起源としては、動物である限り特に限定されないが、好ましくは哺乳類、より好ましくは霊長類、さらに好ましくはヒトが挙げられる。ヒトＰＣＳＫ９遺伝子は、配列番号１で示される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ_１７４９３６；全長３７３１塩基、コーディング領域、２０７９塩基）を含み、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする。ＰＣＳＫ９遺伝子はＬＤＬ受容体の分解に関与する。
　本発明のオリゴヌクレオチドが結合し得るＰＣＳＫ９遺伝子としては、例えば、次の塩基配列およびこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる：
　（ａ）配列番号１８で示される塩基配列；配列番号２０で示される塩基配列；配列番号２６で示される塩基配列；配列番号２８で示される塩基配列；配列番号３０で示される塩基配列；配列番号３１で示される塩基配列；配列番号４２で示される塩基配列；配列番号５０で示される塩基配列；配列番号５１で示される塩基配列；配列番号５２で示される塩基配列；配列番号５７で示される塩基配列；配列番号５８で示される塩基配列；配列番号５９で示される塩基配列；配列番号８９で示される塩基配列；配列番号９４で示される塩基配列；配列番号１００で示される塩基配列；配列番号１１７で示される塩基配列；配列番号１１８で示される塩基配列；配列番号１２４で示される塩基配列；配列番号１２６で示される塩基配列；配列番号１２７で示される塩基配列；および配列番号１３３で示される塩基配列；または配列番号１３８で示される塩基配列；あるいは
　（ｂ）上記（ａ）に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、または上記（ａ）に示される塩基配列に対して所定の配列相同性を有する塩基配列。
　上記塩基配列は、各々、ＰＣＳＫ９遺伝子において以下の標的領域に対応する：例えば、配列番号１８で示される塩基配列は、第４５７位～第４７０位；配列番号２０で示される塩基配列は、第５２３位～第５３６位；配列番号２６で示される塩基配列は、第６９６位～第７０９位；配列番号２８で示される塩基配列は、第７５１位～第７６４位；配列番号３０で示される塩基配列は、第８２７位～第８４０位；配列番号３１で示される塩基配列は、第８４４位～第８５７位；配列番号４２で示される塩基配列は、第１１７３位～第１１８６位；配列番号５０で示される塩基配列は、第１４１８位～第１４３１位；配列番号５１で示される塩基配列は、第１４５１位～第１４６４位；配列番号５２で示される塩基配列は、第１４８１位～第１４９５位；配列番号５７で示される塩基配列は、第１６３１位～第１６４４位；配列番号５８で示される塩基配列は、第１６６７位～第１６８０位；配列番号５９で示される塩基配列は、第１６９０位～第１７０３位；配列番号８９で示される塩基配列は、第２５９０位～第２６０３位；配列番号９４で示される塩基配列は、第２７３１位～第２７４４位；配列番号１００で示される塩基配列は、第２９１９位～第２９３２位；配列番号１１７で示される塩基配列は、第２４３２位～第３４４５位；配列番号１１８で示される塩基配列は、第３４６４位～第３４７７位；配列番号１２４で示される塩基配列は、第１４１８位～第１４３０位；配列番号１２６で示される塩基配列は、第１４２２位～第１４３５位；配列番号１２７で示される塩基配列は、第１６５８位～第１６７０位；配列番号１３３で示される塩基配列は、第１６５８位～第１６７０位；および配列番号１３８で示される塩基配列は、第１４１９位～第１４３１位。上記標的領域の塩基配列の位置は、マウスＰＣＳＫ９遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ_１５３５６５；配列番号１３９で示される塩基配列からなり、全長３５１２塩基であり、コーディング領域は２０８５塩基である；配列番号１４０で示されるアミノ酸配列をコードする）に基づくが、他の動物（好ましくは哺乳類、より好ましくは霊長類、さらに好ましくはヒト）に由来する遺伝子の場合も、対応する領域であり得る。例えば、配列番号１３８で示される塩基配列は、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子（配列番号１）の第１３５７位～１３６９位の領域に対応する。上記他の動物由来の対応する領域は、上記配列番号で示される塩基配列と完全に同一の配列、または以下に説明するように所定の配列相同性を有する配列であり得る。
　好適には、次の塩基配列およびこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる：
　（ａ’）配列番号１８で示される塩基配列；配列番号２８で示される塩基配列；配列番号３１で示される塩基配列；配列番号５０で示される塩基配列；配列番号５１で示される塩基配列；配列番号５８で示される塩基配列；配列番号８９で示される塩基配列；配列番号１００で示される塩基配列；配列番号１２４で示される塩基配列；配列番号１２６で示される塩基配列；配列番号１２７で示される塩基配列；および配列番号１３３で示される塩基配列；または配列番号１３８で示される塩基配列；あるいは
　（ｂ’）上記（ａ’）に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、または上記（ａ’）に示される塩基配列に対して所定の配列相同性を有する塩基配列。
　より好適には、次の塩基配列およびこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる：
　（ａ’’）配列番号２８で示される塩基配列；配列番号５０で示される塩基配列；配列番号５８で示される塩基配列；配列番号８９で示される塩基配列；配列番号１００で示される塩基配列；配列番号１２４で示される塩基配列；配列番号１２６で示される塩基配列；配列番号１２７で示される塩基配列；および配列番号１３３で示される塩基配列；または配列番号１３８で示される塩基配列；あるいは
　（ｂ’’）上記（ａ’’）に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、または上記（ａ’’）に示される塩基配列に対して所定の配列相同性を有する塩基配列。
　さらに好適には、次の塩基配列およびこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる：
　（ａ’’’）配列番号５０で示される塩基配列；配列番号５８で示される塩基配列；配列番号１２４で示される塩基配列；配列番号１２６で示される塩基配列；配列番号１２７で示される塩基配列；および配列番号１３３で示される塩基配列；または配列番号１３８で示される塩基配列；あるいは
　（ｂ’’’）上記（ａ’’’）に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、または上記（ａ’’’）に示される塩基配列に対して所定の配列相同性を有する塩基配列。
　ここで、「塩基配列において１もしくは数個塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列」とは、ＰＣＳＫ９遺伝子について、配列番号にて特定した塩基配列と実質的に同等の標的領域の塩基配列を表す程度の塩基数（例えば１もしくは数個）にて、欠失、置換もしくは付加などにて変更された塩基配列を意味し、変更後の塩基配列もまたＰＣＳＫ９遺伝子を表す。ここで、所定の配列相同性の例としては、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、および少なくとも９０％の配列相同性が挙げられる。例えば、７５％の配列相同性とは、対象の塩基配列全長に対して、相同な（すなわち同一の）塩基が占める割合（％）が７５％であることをいう。少なくとも７５％の配列相同性は、例えば、塩基配列全長が１４塩基の場合、３塩基以内の欠失、置換もしくは付加により変更された配列相同性にほぼ相当し得る。８５％の配列相同性とは、対象の塩基配列全長に対して、相同な（すなわち同一の）塩基が占める割合（％）が８５％であることをいう。この８５％の配列相同性は、例えば、塩基配列全長が１４塩基の場合、２塩基以内の欠失、置換もしくは付加により変更された配列相同性にほぼ相当し得る。
　上記ＰＣＳＫ９遺伝子は、好適には、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子に由来する。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号にて特定した塩基配列およびその対応するＰＣＳＫ９遺伝子における標的領域の配列の位置（例えば、以下の表１－１から表１－３、および表２に記載の配列の位置）を参考にして、配列番号１に示す塩基配列（ヒトＰＣＳＫ９遺伝子の塩基配列）に基づいて、適宜、設計してもよい。例えば、配列番号１３８で示される塩基配列は、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子（配列番号１）の第１３５７位～１３６９位の領域に対応する。このように、配列番号にて特定した塩基配列およびその対応するＰＣＳＫ９遺伝子における標的領域の配列の位置を参考にして設計されるオリゴヌクレオチドが標的とする領域の塩基配列は、上記「塩基配列において１もしくは数個塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列」または「所定の配列相同性を有する塩基配列」に包含され得る。
　本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列の長さは、配列番号にて特定した塩基配列およびその対応するＰＣＳＫ９遺伝子内の標的領域に結合可能である限り、特に限定されない。標的領域に結合し、かつＰＣＳＫ９のｍＲＮＡの発現レベルを抑制することができる長さであることが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列の長さは、好適には１０～２５塩基であり、より好適には１０～１６塩基である。１０塩基よりも短いと、ＰＣＳＫ９遺伝子とハイブリッドを形成しにくくなり、２５塩基よりも長いと、核酸分解酵素により分解されやすくなる。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシドを当該オリゴヌクレオチドの５’－末端領域および３’－末端領域に含み得る。５’－末端領域および３’－末端のそれぞれに含まれる糖修飾ヌクレオシドの個数および配置は、用いるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド長および配列に応じて適宜決定し得る。例えば、オリゴヌクレオチドの長さが１３～１４塩基である場合、糖修飾ヌクレオシドは、５’－末端領域および３’－末端領域に、それぞれ独立して、例えば１～３塩基、好ましくは２～３塩基で含まれ得る。
　本発明のオリゴヌクレオチドが含む糖修飾ヌクレオシドは、同一のヌクレオシド内の４’位と２’位との間に架橋構造を有する。
　上記架橋構造の１つは、－ＣＨ２－Ｏ－、または－（ＣＨ２）２－Ｏ－で表される。このような架橋構造を、以下、「ＢＮＡ」という場合がある。
　ＢＮＡとしては、例えば、α－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）、β－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）、エチレンオキシ（４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＮＡヌクレオシド（モノマー）は、例えば、オリゴＤＮＡ合成用アミダイト体として、非特許文献１～５に記載の方法により合成することができる。
　上記架橋構造の他の１つは、－ＣＨ２－ＮＲ１－Ｏ－、または－（ＣＨ２）２－ＮＲ１－Ｏ－で表され、
　ここで、Ｒ１は、水素原子；
　分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；
　分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
　α群：水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子；から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基；または
　該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表す。このような架橋構造を、以下、「ＮＣ」という場合がある。
　ＮＣとしては、例えば、オキシアミノ（４’－ＣＨ２－ＮＨ－Ｏ－２’）、Ｎ－メチルオキシアミノ（４’－ＣＨ２－ＮＣＨ３－Ｏ－２’）が挙げられるが、これらに限定されない。ＮＣヌクレオシド（モノマー）は、例えば、オリゴＤＮＡ合成用アミダイト体として、非特許文献６～９に記載の方法により合成することができる。
　上記架橋構造の他の１つは、－ＣＯ－ＮＲ１－、－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＲ１－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＲ１－、－ＣＯ－ＮＲ１－Ｘ－、または－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＲ１－Ｘ－で表され、
　ここで、Ｒ１は、水素原子；
　分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；
　分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
　α群：水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子；から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基；または
　該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；を表し、そして
　Ｘは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表す。このような架橋構造を、以下、「ＡＭ」という場合がある。
　ＡＭとしては、例えば、無置換アミド（４’－ＣＯ－ＮＨ－２’）、Ｎ－メチルアミド（４’－ＣＯ－ＮＣＨ３－２’）、アセトアミド（４’－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－２’）、Ｎ－メチルアセトアミド（４’－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＣＨ３－２’）、Ｎ－オキシアセトアミド（４’－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－Ｏ－２’）、Ｎ－メチル－Ｎ－オキシアセトアミド（４’－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＣＨ３－Ｏ－２’）が挙げられるが、これらに限定されない。ＡＭヌクレオシド（モノマー）は、例えば、オリゴＤＮＡ合成用アミダイト体として、特許文献１に記載の方法により合成することができる。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、同一のヌクレオシド内の４’位と２’位との間に上記架橋構造「ＢＮＡ」、「ＮＣ」または「ＡＭ」のいずれか１つを有する糖修飾ヌクレオシドを少なくとも１種類含む。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間の結合において、リン酸ジエステル結合中のリン酸基の酸素原子が硫黄原子で置換された構造（リン酸基に対応する基をホスホロチオエート基という）であり得る。このような結合をＰＳ骨格という。また、本明細書において、オリゴヌクレオチドのリン酸基がすべてホスホロチオエート基で置換されたオリゴヌクレオチドを特にＳ－オリゴヌクレオチドという。オリゴヌクレオチドのリン酸基がすべてホスホロチオエート基で置換されたオリゴヌクレオチドであってもよく、またはオリゴヌクレオチドのリン酸基の一部がホスホロチオエート基で置換されたオリゴヌクレオチドであってもよい。
　本発明のオリゴヌクレオチドの５’－末端または３’－末端の構造は、特に限定されない。例えば、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナンスリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素からなる群より選択される１つが結合している。好適には５’－末端または３’－末端にコレステロールが結合している。コレステロールの結合により、オリゴヌクレオチドの生体内安定性の向上や標的臓器である肝臓への取り込み向上を期待することができる。５’－末端または３’－末端にコレステロールを結合させる方法は、特に限定されない。例えば、コレステロールをアミダイト体として導入する方法、オリゴヌクレオチド合成の固相担体として導入する方法、オリゴヌクレオチドを合成した後にコンジュゲート化する方法が挙げられる。
　本発明のオリゴヌクレオチドの構造および当該オリゴヌクレオチドを構成し得るＢＮＡ、ＮＣまたはＡＭモノマーの架橋構造は、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析計（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）により同定され得る。
　糖修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドは、上述のように、同一のヌクレオシド内の４’位と２’位との間の架橋構造により固定されているため、各種ヌクレアーゼにより分解されにくく、生体に投与されると、長時間生体内に存在することができる。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンス核酸として、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡと結合して、ＰＣＳＫ９の遺伝子発現を抑制し得る。すなわち、ＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制剤としての効果を奏する。ＰＣＳＫ９の遺伝子発現が抑制されると、ＬＤＬ受容体タンパク質の発現量が上昇し、ＬＤＬの細胞内への取り込みや代謝が促進されることによって血中ＬＤＬ濃度が低下し得る。すなわち、ＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制剤は、例えば、血中ＬＤＬ濃度を低減させるための医薬として利用することができ、あるいは、例えば、血中ＬＤＬ濃度が病態に及ぼす影響を調べるための試薬として利用することができる。このようにして、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制剤としての効果を奏し、この結果、血中ＬＤＬ低減剤としての効果、および家族性高コレステロール血症や高脂血症などの高コレステロール血症（脂質異常症）の治療剤および予防剤としての効果を奏する。特に、より低い用量でより高い脂質異常症治療効果を奏する。
　本発明のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療剤および予防剤は、例えば、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤をさらに含有し得、例えば、非経口投与製剤とすることができる。または、当該技術分野において通常用いられる医薬用担体をさらに含有し得、例えば、液剤、クリーム剤、軟膏剤などの局所用の製剤とすることができる。
　以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものでない。
　（実施例１）オリゴヌクレオチドの合成
　非特許文献１～５に記載の方法によりＢＮＡモノマー（アミダイト体）を合成した。これをオリゴＤＮＡ合成用モノマー体として用いて、ＤＮＡ合成機により、表１－１～表１－３に記載のオリゴヌクレオチド（マウスＰＣＳＫ９遺伝子の塩基配列からなるＢＮＡ－ヌクレオシドを含むＢＮＡ－オリゴヌクレオチド、ｉｎ　ｖｉｖｏグレード、必要に応じて１～１００ｍｇ）を合成した。なお、表１－１～表１－３において、ＰＳ骨格とは、リン酸ジエステル結合中のリン酸基の酸素原子が硫黄原子で置換された構造（リン酸基に対応する基をホスホロチオエート基という）をいう。また、本明細書において、オリゴヌクレオチドのリン酸基がすべてホスホロチオエート基に置き換わったオリゴヌクレオチドを特にＳ－オリゴヌクレオチドという。表１－１～表１－３に記載のオリゴヌクレオチドは、すべてＳ－オリゴヌクレオチドである。本実施例で使用したＢＮＡの架橋構造は、－ＣＨ２－Ｏ－を用いた。
　次いで、合成したオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ精製、凍結乾燥処理に供した。本実施例で使用したＢＮＡの架橋構造、ならびに得られた各オリゴヌクレオチドの純度および構造をＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ＢＲＵＫＥＲ　ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ社製）により確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（実施例２）オリゴヌクレオチドによるｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果１
　マウス肝臓細胞株ＮＭｕｌｉの細胞を１．５×１０５個／ウェルとなるように１２ウェルプレートに播き、５％ＣＯ２下３７℃にて２４時間培養した。実施例１で合成した各オリゴヌクレオチドを最終濃度５ｎＭまたは５０ｎＭとなるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて各ウェルに添加した（トランスフェクション）。４時間後に培地を交換し、さらに２０時間後に細胞を回収し、細胞からＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。
　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからＨｉｇｈ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ＩＤ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（ＴＭ）リアルタイムＰＣＲ解析システム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によりリアルタイムＰＣＲを行い、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ量を定量した。リアルタイムＰＣＲでは、ハウスキーピング遺伝子のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量も同時に定量し、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対するＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ量をＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ発現レベルとして評価した。トランスフェクション操作を行わなかった細胞をコントロールとして用いた。結果を図１および２に示す。
　なお、用いたプライマーは、ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）であり、Ａｓｓａｙ　ＩＤは、以下のとおりであった：
　マウスＰＣＳＫ９定量用：Ｍｍ０１２６３６１０＿ｍ１およびＭｍ００４６３７３８＿ｍ１
　マウスＧＡＰＤＨ定量用：Ｍｍ９９９９９９１５＿ｍ１
　図１および２から明らかなように、特定の標的領域に対するオリゴヌクレオチド、すなわちオリゴヌクレオチド１６（標的配列：配列番号１８）、オリゴヌクレオチド１８（標的配列：配列番号２０）、オリゴヌクレオチド２４（標的配列：配列番号２６）、オリゴヌクレオチド２６（標的配列：配列番号２８）、オリゴヌクレオチド２８（標的配列：配列番号３０）、オリゴヌクレオチド２９（標的配列：配列番号３１）、オリゴヌクレオチド４０（標的配列：配列番号４２）、オリゴヌクレオチド４８（標的配列：配列番号５０）、オリゴヌクレオチド４９（標的配列：配列番号５１）、オリゴヌクレオチド５０（標的配列：配列番号５２）、オリゴヌクレオチド５５（標的配列：配列番号５７）、オリゴヌクレオチド５６（標的配列：配列番号５８）、オリゴヌクレオチド５７（標的配列：配列番号５９）、オリゴヌクレオチド８７（標的配列：配列番号８９）、オリゴヌクレオチド９２（標的配列：配列番号９４）、オリゴヌクレオチド９８（標的配列：配列番号１００）、オリゴヌクレオチド１１５（標的配列：配列番号１１７）およびオリゴヌクレオチド１１６（標的配列：配列番号１１８）はＰＣＳＫ９のｍＲＮＡの発現レベルを著しく低下させた。
　（実施例３）オリゴヌクレオチドによるｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果２
　実施例１で合成したオリゴヌクレオチドのうち、特定のオリゴヌクレオチドを用いたこと、および各ウェルに添加した各オリゴヌクレオチドの最終濃度として、５ｎＭまたは５０ｎＭに代えて０．４ｎＭ、２ｎＭまたは１０ｎＭとしたこと以外は実施例２と同様にして、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果を調べた。結果を図３に示す。
　図３から明らかなように、特に、オリゴヌクレオチド１６（標的配列：配列番号１８）、オリゴヌクレオチド２６（標的配列：配列番号２８）、オリゴヌクレオチド２９（標的配列：配列番号３１）、オリゴヌクレオチド４８（標的配列：配列番号５０）、オリゴヌクレオチド４９（標的配列：配列番号５１）、オリゴヌクレオチド５６（標的配列：配列番号５８）、オリゴヌクレオチド８７（標的配列：配列番号８９）、およびオリゴヌクレオチド９８（標的配列：配列番号１００）は濃度依存的にＰＣＳＫ９のｍＲＮＡの発現レベルを著しく低下させた。
　（実施例４）オリゴヌクレオチドによるｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果３
　実施例１で合成したオリゴヌクレオチドのうち、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子とマウスＰＣＳＫ９遺伝子とで共通する塩基配列からなる標的配列に対するオリゴヌクレオチドを用いたこと、およびマウス肝臓細胞株ＮＭｕｌｉの細胞に代えてヒト肝臓細胞株ＨｕＨ７の細胞を用いたこと以外は実施例２と同様にして、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果を調べた。結果を図４に示す。
　なお、用いたプライマーは、ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）であり、Ａｓｓａｙ　ＩＤは、以下のとおりであった：
　ヒトＰＣＳＫ９定量用：Ｈｓ００５４５３９９＿ｍ１
　ヒトＧＡＰＤＨ定量用：Ｈｓ０２７５８９９７＿ｇ１
　図４から明らかなように、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果は、マウス細胞とヒト細胞とでほぼ同様の傾向を示した。特に、オリゴヌクレオチド４８（標的配列：配列番号５０）およびオリゴヌクレオチド５６（標的配列：配列番号５８）は、マウス細胞、ヒト細胞ともに高い発現抑制効果を示した。一方で、オリゴヌクレオチド７１（標的配列：配列番号７３）のように、マウス細胞ではあまり発現抑制効果を示さなかったのに対しヒト細胞では高い発現抑制効果を示した例もあった。
（実施例５）オリゴヌクレオチドによるｉｎ　ｖｉｖｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果１
　実施例３および４において、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果を示した、オリゴヌクレオチド２６（標的配列：配列番号２８）、オリゴヌクレオチド４８（標的配列：配列番号５０）、オリゴヌクレオチド５６（標的配列：配列番号５８）、オリゴヌクレオチド８７（標的配列：配列番号８９）、およびオリゴヌクレオチド９８（標的配列：配列番号１００）を被験動物に投与し、ｉｎ　ｖｉｖｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果を調べた。
　被験動物として８週齢のマウスＣ５７ＢＬ６／Ｊ（オス：日本エスエルシー株式会社）を各投与群で例数４匹となるように準備した。１週間後、尾静脈より各オリゴヌクレオチドを１０ｍｇ／ｋｇの投与量で単回投与した。
　４日後に各マウスを屠殺し、各マウスから肝臓と全血を採取した。肝臓は、ＰＢＳで洗浄した後、細切し、液体窒素で瞬間凍結した後、－８０℃にて保存した。凍結肝臓の切片を１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ　Ｒｅｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内でホモジナイズし、クロロホルム２００μＬを加えた後、１３，２００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心した。上清２２０μＬをイソプロパノール４００μＬに添加して転倒混和し、１３，２００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心した後、イソプロパノールを除去した。次いで、７５％エタノール８００μＬを加えた後、１３，２００ｒｐｍ、４℃にて５分間遠心した。Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを含む沈殿をＲＮａｓｅフリー水（Ｗａｔｅｒ，ＤＥＰＣ　ｔｒｅａｔｅｄ，ＲＮａｓｅ　ｔｅｓｔｅｄ；ナカライテスク株式会社）８０μＬに溶解した。抽出したＴｏｔａｌ　ＲＮＡを分光光度計で定量し、ＲＮＡの長さをアガロースゲル電気泳動で確認した。
　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ１０μｇからＨｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてｃＤＮＡを作製した。得られたｃＤＮＡおよびＦａｓｔ　ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ量を定量した。リアルタイムＰＣＲでは、ハウスキーピング遺伝子のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量も同時に定量し、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対するＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ量を評価した。結果を図５に示す。
　なお、用いたプライマーは、ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）であり、Ａｓｓａｙ　ＩＤは以下のとおりであった：
　マウスＰＣＳＫ９定量用：Ｍｍ００４６３７３８＿ｍ１
　マウスＧＡＰＤＨ定量用：Ｍｍ９９９９９９１５＿ｍ１
　次いで、採取した全血を室温にて２０分間静置した後、５０００ｒｐｍ、４℃にて２０分間遠心して血清を分離した。それぞれの血清について、トランスアミナーゼＣＩＩ－テストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用いてＡＳＴ値およびＡＬＴ値を定量し、肝毒性を調べた。結果を図６に示す。
　図５から明らかなように、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの高いＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果を示したオリゴヌクレオチド２６（標的配列：配列番号２８）、オリゴヌクレオチド４８（標的配列：配列番号５０）、オリゴヌクレオチド５６（標的配列：配列番号５８）、オリゴヌクレオチド８７（標的配列：配列番号８９）、およびオリゴヌクレオチド９８（標的配列：配列番号１００）はいずれもｉｎ　ｖｉｖｏでの高いＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果を示した。
　一方、図６から明らかなように、オリゴヌクレオチド８７（標的配列：配列番号８９）を投与したマウスには、著しい肝毒性が認められた。
　以上より、オリゴヌクレオチド２６（標的配列：配列番号２８）、オリゴヌクレオチド４８（標的配列：配列番号５０）、オリゴヌクレオチド５６（標的配列：配列番号５８）およびオリゴヌクレオチド９８（標的配列：配列番号１００）は、肝毒性を示すことなく、ｉｎ　ｖｉｖｏでの著しいＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果を示すことがわかった。
　（実施例６）オリゴヌクレオチドによるｉｎ　ｖｉｖｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果２
　以下の表２に示す各種オリゴヌクレオチドを実施例１と同様にして合成した。ただし、オリゴヌクレオチド合成用モノマーとして、非特許文献１～９に記載の方法により合成した各種糖修飾ヌクレオシドモノマー（ＢＮＡ、ＮＣおよびＡＭモノマー）を用いた。なお、本実施例で使用したＢＮＡ、ＮＣおよびＡＭの架橋構造は、それぞれ－ＣＨ２－Ｏ－、－ＣＨ２－ＮＣＨ３－Ｏ－、および－ＣＯ－ＮＣＨ３－を用いた。実施例１と同様にして、本実施例で使用した各種糖修飾ヌクレオシドモノマーの架橋構造、ならびに得られた各オリゴヌクレオチドの純度および構造をＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表２に示す各種オリゴヌクレオチドについて、実施例５と同様に、被験動物に投与し、ｉｎ　ｖｉｖｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果を調べた。オリゴヌクレオチドのマウスへの投与量は、オリゴヌクレオチド２９（配列番号３１）を除き、実施例５の１０ｍｇ／ｋｇに代えて、３０ｍｇ／ｋｇとした。マウスから採取した肝臓は、液体窒素を用いたことに代えて、ホルマリンを用いて、実施例５と同様にして保存した。結果を図７に示す。
　図７から明らかなように、配列番号１３８で示される塩基配列を標的とするオリゴヌクレオチド１３６、配列番号１２４で示される塩基配列を標的とするオリゴヌクレオチド１２２、配列番号１２６で示される塩基配列を標的とするオリゴヌクレオチド１２４、配列番号１２７で示される塩基配列を標的とするオリゴヌクレオチド１２５、および配列番号１３３で示される塩基配列を標的とするオリゴヌクレオチド１３１がｉｎ　ｖｉｖｏでの高いＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果を示した。標的領域が同一である場合、ｉｎ　ｖｉｖｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果について、以下の傾向が見られた：全てのヌクレオチド間においてＰＳ骨格にて結合しているオリゴヌクレオチドが、一部のヌクレオチド間においてＰＳ骨格にて結合している（残りが天然型リン酸ジエステル結合である）オリゴヌクレオチドよりも、ＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果が高い；糖修飾ヌクレオシドモノマーが、オリゴヌクレオチドの全体にわたってランダムに存在するよりも、５’－末端および３’－末端の両末端領域に集中して存在するほうが、ＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果が高い；オリゴヌクレオチドの中央部において、ＰＳ骨格を有する天然のＤＮＡの割合が増大させることにより、ＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果が高くなる。
　本発明によれば、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡと結合して、ＰＣＳＫ９の遺伝子発現を抑制し得るオリゴヌクレオチドを提供することができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制剤としての効果を奏し、この結果、血中ＬＤＬ低減剤としての効果、および家族性高コレステロール血症や高脂血症などの高コレステロール血症（脂質異常症）の治療剤および予防剤としての効果を奏することが期待される。特に、より低い用量でより高い脂質異常症治療効果を奏することが期待される。

Claims (8)

  1. 　糖修飾ヌクレオシドを任意の位置に含むオリゴヌクレオチドであって、
    　該糖修飾ヌクレオシドが、４’位と２’位との間に架橋構造を有し、そして
    　該オリゴヌクレオチドが、ＰＣＳＫ９遺伝子と結合し得、
    　該ＰＣＳＫ９遺伝子が、以下の塩基配列およびこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡである、オリゴヌクレオチド：
    　（ａ）配列番号１８で示される塩基配列；配列番号２０で示される塩基配列；配列番号２６で示される塩基配列；配列番号２８で示される塩基配列；配列番号３０で示される塩基配列；配列番号３１で示される塩基配列；配列番号４２で示される塩基配列；配列番号５０で示される塩基配列；配列番号５１で示される塩基配列；配列番号５２で示される塩基配列；配列番号５７で示される塩基配列；配列番号５８で示される塩基配列；配列番号５９で示される塩基配列；配列番号８９で示される塩基配列；配列番号９４で示される塩基配列；配列番号１００で示される塩基配列；配列番号１１７で示される塩基配列；配列番号１１８で示される塩基配列；配列番号１２４で示される塩基配列；配列番号１２６で示される塩基配列；配列番号１２７で示される塩基配列；および配列番号１３３で示される塩基配列；または配列番号１３８で示される塩基配列；あるいは
    　（ｂ）前記（ａ）に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、または前記（ａ）に示される塩基配列に対して少なくとも７５％の配列相同性を有する塩基配列。
  2. 　前記ＰＣＳＫ９遺伝子が、以下の塩基配列およびこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド：
    　（ａ’）配列番号１８で示される塩基配列；配列番号２８で示される塩基配列；配列番号３１で示される塩基配列；配列番号５０で示される塩基配列；配列番号５１で示される塩基配列；配列番号５８で示される塩基配列；配列番号８９で示される塩基配列；配列番号１００で示される塩基配列；配列番号１２４で示される塩基配列；配列番号１２６で示される塩基配列；配列番号１２７で示される塩基配列；および配列番号１３３で示される塩基配列；または配列番号１３８で示される塩基配列；あるいは
    　（ｂ’）前記（ａ’）に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、または前記（ａ’）に示される塩基配列に対して少なくとも７５％の配列相同性を有する塩基配列。
  3. 　前記ＰＣＳＫ９遺伝子が、以下の塩基配列およびこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド：
    　（ａ’’）配列番号２８で示される塩基配列；配列番号５０で示される塩基配列；配列番号５８で示される塩基配列；配列番号８９で示される塩基配列；配列番号１００で示される塩基配列；配列番号１２４で示される塩基配列；配列番号１２６で示される塩基配列；配列番号１２７で示される塩基配列；および配列番号１３３で示される塩基配列；または配列番号１３８で示される塩基配列；あるいは
    　（ｂ’’）前記（ａ’’）に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、または前記（ａ’’）に示される塩基配列に対して少なくとも７５％の配列相同性を有する塩基配列。
  4. 　前記架橋構造が、－ＣＨ２－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－、－ＣＨ２－ＮＲ１－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－ＮＲ１－Ｏ－、－ＣＯ－ＮＲ１－、－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＲ１－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＲ１－、－ＣＯ－ＮＲ１－Ｘ－、または－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＲ１－Ｘ－で表され、
    　ここで、Ｒ１は、水素原子；
    　分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；
    　分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
    　α群：水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子；から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基；または
    　該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；を表し、そして
    　Ｘは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表す、請求項１から３のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチド。
  5. 　前記オリゴヌクレオチドの塩基配列の長さが、１０～２５塩基である、請求項１から４のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチド。
  6. 　前記ＰＣＳＫ９遺伝子が、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子に由来する、請求項１から５のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチド。
  7. 　請求項１から６のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、ＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制剤。
  8. 　請求項１から６のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、脂質異常症治療剤または予防剤。
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