CN113677374A - 肌疾病治疗用药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明开发在骨骼肌和/或心肌中显示优异的反义效果的核酸复合物、和以该核酸复合物作为有效成分的在骨骼肌、心肌等中发病的肌疾病的治疗或预防用的组合物。提供由第1核酸链和第2核酸链退火而成的双链核酸复合物，所述第1核酸链与目标基因的转录产物杂交，具有针对该转录产物的反义效果，所述第2核酸链包含与该第1核酸链互补的碱基序列，并且结合有胆固醇或其类似物。

Description

肌疾病治疗用药物组合物
技术领域
本发明涉及能够特异性地抑制在骨骼肌和心肌中表达的目标基因的表达的双链核酸复合物、和含有该双链核酸复合物作为有效成分的肌疾病的治疗或预防用药物组合物。
背景技术
作为肌疾病的一种的肌营养不良是由于骨骼肌的肌纤维变性或坏死而产生肌肉的萎缩、肌力降低的进行性的遗传性肌疾病。如果重症化，则不仅产生步行困难等运动功能障碍，而且由于呼吸衰竭、心力衰竭而导致死亡的状况也不少。肌营养不良根据遗传形式、临床症状而已知杜氏型、贝克型、肢带型、面肩肱型等各种病型(非专利文献1)。
到目前为止肌营养不良没有根治疗法，大多通过对症疗法应对。例如，对于杜氏肌营养不良，一直以来利用类固醇进行骨骼肌障碍的治疗。美国食药监局(FDA)在2017年2月作为5岁以上的幼儿以及成人中的杜氏肌营养不良(DMD)治疗药，认可了地夫可特(daflazacort：商品名Emflaza(注册商标))。该治疗药是降低免疫系统的活动、抑制炎症的皮质类固醇剂。另外，美国FDA在2016年9月作为杜氏肌营养不良治疗药新认可了エテプリルセン(eteolirsen：商品名EXONDYS 51)。该治疗药是以在抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因表达时的前体mRNA剪接中诱导外显子跳读，合成缺损了51号外显子的mRNA的方式设计的核酸药物。
肌营养不良的患病率据说在人口每10万人中为17～20人，但相关治疗药的市场规模逐年扩大，有在2022年会达到785亿美元的推测。
近年来，在被称为核酸药物的药品的开发中，寡核苷酸受到关注，另外特别是从目标基因的高选择性和低毒性的观点出发，利用反义法的核酸药物的开发积极地进行。反义法是指以从目标基因转录的mRNA或miRNA的部分序列作为目标正义链，通过将与其互补的寡核苷酸(反义寡核苷酸：本说明书中常常表述为“ASO(AntiSense Oligonucleotide)”)导入细胞，从而选择性地改变或阻碍由目标基因编码的蛋白质的表达的方法。
作为利用反义法的核酸，本发明者们到目前为止开发了使反义寡核苷酸和针对该反义寡核苷酸的互补链退火而得的双链核酸复合物。例如，专利文献1中公开了与结合了生育酚的互补链退火后的反义寡核苷酸被有效地传递到肝脏中，并具有高的反义效果。另外，专利文献2中，开发了将具有外显子跳读效果的双链反义寡核苷酸作为添加核苷酸，添加在gapmer(反义寡核苷酸)的5’末端、3’末端、或者5’末端和3’末端两端而得的短的gapmer反义寡核苷酸。进而，专利文献3中还发了用于传递治疗用寡核苷酸的双链剂。
如前所述，肌营养不良的死因多为由于突变基因的表达而发病的呼吸衰竭、心力衰竭。如果能够通过前述的核酸药物调节在膈等骨骼肌、心肌中表达的这些基因的表达，则可能可以降低肌营养不良的死亡率。另外，对于作为其他肌疾病的肌病、心肌病等也可能可以通过同样的方法治疗、预防。
然而，现在尚未开发出能有效地传递到骨骼肌、或心肌、并在该部位显示优异的反义效果的核酸复合物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2013/089283号
专利文献2:国际公开第2014/203518号
专利文献3:国际公开第2014/192310号
非专利文献
非专利文献1:杉田秀夫,小泽▲英▼二郎,埜中征哉编集,1995,新肌肉病学.南江堂,东京:pp469-550
发明内容
发明要解决的课题
本发明的课题是开发出能有效地传递到骨骼肌和/或心肌、并在该部位显示优异的反义效果的核酸复合物。另外，以这样的核酸复合物作为有效成分，开发在骨骼肌、心肌等中发病的肌疾病的治疗或预防用的组合物。
用于解决课题的手段
本发明者们为了解决上述课题反复进行了深入研究，结果发现，由一直以来被认为主要传递到肝脏的反义寡核苷酸、与结合了脂质特别是胆固醇的互补链组成的双链核酸复合物也被有效地传递到骨骼肌、心肌中，并在该部位显示非常优异的反义效果。
因此，通过将具有上述构成的双链核酸复合物(双链核酸剂)的目标基因设计成在骨骼肌和/或心肌中表达的肌疾病的致病基因，能够有效地将该反义寡核苷酸传递到骨骼肌和/或心肌，调节其目标基因的表达，从而能够制成治疗肌疾病的治疗或预防用的组合物。本发明是基于上述见解和开发结果的，提供以下(1)～(40)。
(1)一种双链核酸复合物，是用于在受检体的骨骼肌或心肌中抑制或增进目标基因的转录产物或翻译产物的表达量、或者阻碍目标基因的转录产物或翻译产物的功能的双链核酸复合物，所述双链核酸复合物包含第1核酸链和第2核酸链，
所述第1核酸链包含能够与所述目标基因的转录产物的全部或一部分杂交的碱基序列，并且对所述转录产物具有反义效果，
所述第2核酸链包含与所述第1核酸链互补的碱基序列，并且结合有胆固醇或其类似物，
所述第1核酸链退火至所述第2核酸链。
(2)根据(1)所述的双链核酸复合物，所述第1核酸链包含至少4个连续脱氧核糖核苷。
(3)根据(2)所述的双链核酸复合物，所述第1核酸链是gapmer。
(4)根据(1)或(2)所述的双链核酸复合物，所述第1核酸链是mixmer。
(5)根据(1)～(4)的任一项所述的双链核酸复合物，所述第2核酸链包含与所述第1核酸链中的至少4个连续脱氧核糖核苷互补的、至少4个连续核糖核苷。
(6)根据(1)～(5)的任一项所述的双链核酸复合物，所述第2核酸链不包含天然核糖核苷。
(7)根据(1)～(6)的任一项所述的双链核酸复合物，所述第2核酸链的核酸部分由被修饰或者非修饰的核苷间键连接起来的脱氧核糖核苷和/或糖修饰核苷组成。
(8)根据(1)～(7)的任一项所述的双链核酸复合物，所述第2核酸链结合有胆固醇或其类似物。
(9)根据(1)～(8)的任一项所述的双链核酸复合物，所述胆固醇或其类似物结合于所述第2核酸链的5’末端和/或3’末端。
(10)根据(1)～(9)的任一项所述的双链核酸复合物，所述第2核酸链上介由可切割(cleavable)或不可切割(uncleavable)的接头结合有配体。
(11)根据(1)～(10)的任一项所述的双链核酸复合物，所述第1核酸链与所述第2核酸链介由所述接头结合。
(12)根据(10)或(11)所述的双链核酸复合物，所述接头由核酸组成。
(13)一种药物组合物，包含(1)～(12)的任一项所述的双链核酸复合物作为有效成分。
(14)根据(13)所述的药物组合物，是受检体的骨骼肌功能障碍、或心功能障碍治疗用的药物组合物。
(15)根据(13)或(14)所述的药物组合物，所述骨骼肌功能障碍、或心功能障碍是选自肌营养不良、肌病、炎症性肌病、多发性肌炎、皮肤肌炎、Danon病、肌无力综合征、线粒体病、肌红蛋白尿症、糖原病、周期性四肢麻痹、遗传性心肌病、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、遗传性心律失常、神经变性疾病、肌少症、和恶病质中的疾病。
(16)根据(13)～(15)的任一项所述的药物组合物，被用于静脉内施与、肌肉内施与或皮下施与。
(17)根据(13)～(16)的任一项所述的药物组合物，所述双链核酸复合物的1次的施与量为0.1mg/kg以上。
(18)根据(13)～(17)的任一项所述的药物组合物，所述双链核酸复合物的1次的施与量为0.01mg/kg～200mg/kg。
(19)根据(13)～(18)的任一项所述的药物组合物，目标基因的转录产物是选自mRNA、微小RNA、前体mRNA、长链非编码RNA、和天然反义RNA中的任一RNA。
(20)根据(13)～(19)的任一项所述的药物组合物，第1核酸链是选自空间阻断、剪接开关、外显子跳读、和外显子列入中的任一RNA。
(21)根据(13)～(20)的任一项所述的药物组合物，所述双链核酸复合物中的第1核酸链的碱基序列用序列号24表示。
(22)一种双链核酸复合物，是用于在受检体的骨骼肌或心肌中诱导目标基因的RNA编集、外显子跳读、或者外显子列入的、或者用于空间阻断目标RNA的双链核酸复合物，所述双链核酸复合物包含第1核酸链和第2核酸链，
所述第1核酸链包含能够与所述目标基因的转录产物的全部或一部分杂交的碱基序列，并且对所述转录产物具有反义效果，
所述第2核酸链包含与所述第1核酸链互补的碱基序列，
所述第1核酸链退火至所述第2核酸链。
(23)根据(22)所述的双链核酸复合物，所述第1核酸链包含至少1个吗啉基核酸或核糖2’位修饰核酸。
(24)根据(22)或(23)所述的双链核酸复合物，所述第1核酸链中的碱基的50％以上为吗啉基核酸或核糖2’位修饰核酸。
(25)根据(22)～(24)的任一项所述的双链核酸复合物，所述第1核酸链是mixmer。
(26)根据(22)～(25)的任一项所述的双链核酸复合物，所述第1核酸链中的碱基的100％为吗啉基核酸或核糖2’位修饰核酸。
(27)根据(22)～(26)的任一项所述的双链核酸复合物，所述第2核酸链不包含天然核糖核苷。
(28)根据(22)～(27)的任一项所述的双链核酸复合物，所述第2核酸链的核酸部分由被修饰或者非修饰的核苷间键连接起来的脱氧核糖核苷和/或糖修饰核苷组成。
(29)根据(22)～(28)的任一项所述的双链核酸复合物，所述第2核酸链结合有功能性部分。
(30)根据(22)～(28)的任一项所述的双链核酸复合物，所述功能性部分选自胆固醇或其类似物、生育酚或其类似物、磷脂酰乙醇胺或其类似物、被取代或未被取代的C1～30的烷基、被取代或未被取代的C2～30的烯基、和被取代或未被取代的C1～30的烷氧基中。
(31)根据(30)所述的双链核酸复合物，所述功能性部分是胆固醇或其类似物。
(32)根据(22)～(31)的任一项所述的双链核酸复合物，所述胆固醇或其类似物结合于所述第2核酸链的5’末端和/或3’末端。
(33)根据(22)～(32)的任一项所述的双链核酸复合物，所述第2核酸链上介由可切割(cleavable)或不可切割(uncleavable)的接头而结合有配体。
(34)一种药物组合物，包含(22)～(33)的任一项所述的双链核酸复合物作为有效成分。
(35)根据(34)所述的药物组合物，是受检体的肌营养不良治疗用的药物组合物。
(36)根据(35)所述的药物组合物，所述肌营养不良是强直性肌营养不良或杜氏肌营养不良。
(37)根据(34)～(36)的任一项所述的药物组合物，被用于静脉内施与或皮下施与。
(38)根据(34)～(37)的任一项所述的药物组合物，所述双链核酸复合物的1次的施与量为0.1mg/kg以上。
(39)根据(34)～(38)的任一项所述的药物组合物，所述双链核酸复合物的1次的施与量为0.01mg/kg～200mg/kg。
(40)根据(34)～(39)的任一项所述的药物组合物，所述双链核酸复合物中的第1核酸链的碱基序列用序列号25～28的任一项表示。
本说明书包含成为本申请的优先权基础的日本专利申请号2019-073832号的公开内容。
发明的效果
根据本发明，提供将双链核酸复合物剂有效地传递到骨骼肌和心肌、在该部位发挥反义效果的双链核酸复合物。通过其反义效果，能够实现目标基因的表达抑制或增进、功能抑制、外显子跳读的诱导。
附图说明
图1显示本发明的双链核酸复合物的代表例的示意图。图1a显示在第2核酸链的5’末端结合有生育酚的双链核酸复合物。图1b显示第2核酸链的5’末端结合有胆固醇的双链核酸复合物。图1c显示使图1b的双链核酸复合物用RNA接头结合而成的单链核酸自身退火而得的物质。这里虽然未图示，但第2核酸链的3’末端可以结合有胆固醇或其类似物。另外，第2核酸链的两末端可以结合有胆固醇或其类似物。进而，第2核酸链的内部的核苷酸或单链核酸的RNA区域可以结合有胆固醇或其类似物。
图2是显示各种交联核酸的结构的图。
图3是显示第2核酸链结合有生育酚或胆固醇的本发明的双链核酸复合物(分别为Toc#1HDO(mSR-B1)、和Chol#1HDO(mSR-B1))对心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、背部肌肉(Back)中的目标SR-B1基因的表达抑制效果的图。图中，ASO是阳性对照，表示作为单链核酸分子的ASO(mSR-B1)，PBS表示作为阴性对照的溶剂所使用的PBS。
图4是显示第2核酸链结合有生育酚或胆固醇的本发明的双链核酸复合物(分别为Toc#1HDO(mMalat1)、和Chol#1HDO(mMalat1))对心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、背部肌肉(Back)中的目标Malat1基因的表达抑制效果的图。图中，ASO是阳性对照，表示作为单链核酸分子的ASO(mMalat1)，PBS表示作为阴性对照的溶剂所使用的PBS。
图5是显示将第2核酸链结合有生育酚或胆固醇的本发明的双链核酸复合物(分别为Toc#1HDO(mDMPK)、和Chol#1HDO(mDMPK))以12.5mg/kg施与时对腓肠肌(GC)、胫骨前肌(TA)、肱三头肌(TB)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、背部肌肉(Back)、和心肌(Heart)中的目标DMPK基因的表达抑制效果的图。图中，ASO是阳性对照，表示作为单链核酸分子的ASO(mDMPK)，PBS表示作为阴性对照的溶剂所使用的PBS。
图6是显示将第2核酸链结合有生育酚或胆固醇的本发明的双链核酸复合物(分别为Toc#1HDO(mDMPK)、和Chol#1HDO(mDMPK))以25mg/kg施与时对腓肠肌(GC)、胫骨前肌(TA)、肱三头肌(TB)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、背部肌肉(Back)、和心肌(Heart)中的目标DMPK基因的表达抑制效果的图。图中，ASO是阳性对照，表示作为单链核酸分子的ASO(mDMPK)，PBS表示作为阴性对照的溶剂所使用的PBS。
图7是显示将第2核酸链结合有生育酚或胆固醇的本发明的双链核酸复合物(分别为Toc#1HDO(mDMPK)、和Chol#1HDO(mDMPK))以50mg/kg施与时对腓肠肌(GC)、胫骨前肌(TA)、肱三头肌(TB)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、背部肌肉(Back)、和心肌(Heart)中的目标DMPK基因的表达抑制效果的图。图中，ASO是阳性对照，表示作为单链核酸分子的ASO(mDMPK)，PBS表示作为阴性对照的溶剂所使用的PBS。
图8是显示第2核酸链结合有生育酚或胆固醇的本发明的双链核酸复合物(分别为Toc#1DNA/DNA(mMalat1)、和Chol#1DNA/DNA(mMalat1)对心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)中的目标malat1基因的表达抑制效果的图。构成该双链核酸复合物的第2核酸链也仅由DNA构成。图中，ASO是阳性对照，表示作为单链核酸分子的ASO(mMalat1)，PBS表示作为阴性对照的溶剂所使用的PBS。
图9是显示作为第2核酸链包含结合有胆固醇、仅由DNA构成、且核苷之间全部由硫代磷酸酯键构成的Chol#1-cDNA(mMalat1)(PS)、或全部由磷酸二酯键构成的Chol#1-cDNA(mMalat1)(PO)的本发明的双链核酸复合物对心肌(Heart)、膈(Diaphragm)、背部肌肉(Back)中的目标malat1基因的表达抑制效果的图。图中，PBS表示作为阴性对照的溶剂所使用的PBS。
图10是显示由第2核酸链的5’侧结合有胆固醇的第2核酸链的核苷之间包含磷酸二酯键或硫代磷酸酯键的Chol#1HDO(mMalat1)(PO)、Chol#1HDO(5’PS)、以及Chol#1HDO(3’PS)构成的本发明的双链核酸复合物对心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、背部肌肉(Back)中的目标malat1基因的表达抑制效果的图。图中，PBS表示作为阴性对照的溶剂所使用的PBS。
图11是显示将第2核酸链结合有生育酚或胆固醇的本发明的双链核酸复合物(分别为Toc#1HDO(mMalat1)、和Chol#1HDO(mMalat1))多次施与时对心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、背部肌肉(Back)中的目标Malat1基因的表达抑制效果的图。图中，ASO是阳性对照，表示作为单链核酸分子的ASO(mMalat1)，PBS表示作为阴性对照的溶剂所使用的PBS。
图12是显示第2核酸链结合有胆固醇的本发明的双链核酸复合物(Chol#1HDO(mDMPK))对心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、背部肌肉(Back)中的目标DMPK基因的表达抑制效果的图。图中，PBS表示作为阴性对照的溶剂所使用的PBS。
图13是显示第2核酸链结合有胆固醇的本发明的双链核酸复合物Chol#1HDO(mMalat1)对(a)心肌(Heart)、(b)背部肌肉(Back)、(c)股四头肌(QF)、和(d)膈(Dia)中的目标基因(malat1)的表达抑制效果的图。纵轴表示malat1非编码RNA的相对表达量，横轴表示施与后的经过时间(天)。图中，PBS表示作为阴性对照的溶剂所使用的PBS。
图14显示施与后第8周(56天)的各组织中的malat1非编码RNA的相对表达量。图中，PBS表示作为阴性对照的溶剂所使用的PBS。
图15是显示本发明的双链核酸复合物Chol#1HDO(mMalat1)以各种用量单次施与时对(a)股四头肌(Quadriceps)、(b)心肌(Heart)、(c)背部肌肉(Back)、和(d)膈(Diaphragm)中的目标malat1基因的表达抑制效果的图。
图16是显示在结合于第2核酸链的胆固醇与核酸末端之间结合有由碳数6个的己基组成的接头的本发明的双链核酸复合物对心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、和背部肌肉(Back)中的目标malat1基因的表达抑制效果的图。图中，PBS表示作为阴性对照的溶剂所使用的PBS。
图17是显示包含目标基因的互补链的长度不同的第1核酸链的双链核酸复合物剂对心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、和背部肌肉(Back)中的目标基因(malat1)表达抑制效果的图。图中，PBS表示作为阴性对照的溶剂所使用的PBS。
图18是显示皮下施与本发明的双链核酸复合物剂时对(a)心肌(Heart)、(b)股四头肌(Quadriceps)、和(c)膈(Diaphragm)中的目标基因(malat1)表达抑制效果的图。
图19是显示末端结合有胆固醇的单链核酸复合物剂、本发明的双链核酸复合物剂Chol#1HDO(mMalat1)、和阴性对照用的PBS对心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、和背部肌肉(Back)中的malat1基因的表达抑制效果的图。
图20是显示末端结合有胆固醇的单链核酸复合物剂(5’Chol-ASO-DNA、3’Chol-ASO-DNA)、本发明的双链核酸复合物剂Chol#1HDO(mMalat1)、和阴性对照用的PBS施与72小时后的小鼠血中的血小板数的图。
图21显示用Bioanalyzer2100(Agilent社制)泳动后的PCR的结果中代表性的电泳图。(a)显示心脏(Heart)的PCR产物，另外(b)显示股四头肌(Quadriceps)的PCR产物。图中，箭头符号表示外显子23没有跳读的条带(Unskipped band)，另外箭形符号表示外显子23跳读了的条带(skipped band)。
图22是显示mdx小鼠(杜氏肌营养不良模型小鼠)中的由单链核酸复合物剂(PMO)、本发明的末端结合有生育酚的双链核酸复合物剂Toc#1HDO(PMO)、和阴性对照用的PBS产生的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因的外显子跳读率的图。(a)显示心肌(Heart)、(b)显示膈(Diaphragm)、(c)显示背部肌肉(Back)、(d)显示股四头肌(Quadriceps)、(e)显示胫骨前肌(Tibialis anterior)、并且(f)显示肱三头肌(Triceps)。
图23是显示抗肌萎缩蛋白(dystrophin)蛋白质的表达的蛋白质印迹(WesternBlot)图。显示对mdx小鼠将单链核酸复合物剂(PMO)、本发明的末端结合有生育酚的双链核酸复合物剂Toc#1HDO(Toc-HDO)、和阴性对照用的PBS施与(a)心肌(Heart)、和(b)背部肌肉(Back)后的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)。B10(正常小鼠)表示阳性对照用的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)。
图24是显示mdx小鼠中的单链核酸复合物剂(PMO)、本发明的末端结合有生育酚的双链核酸复合物剂Toc#1HDO(Toc-HDO)施与后的心肌、背部肌肉中的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)蛋白质的表达的免疫染色的图。
图25是显示mdx小鼠中的由单链核酸复合物剂(PMO)、本发明的末端结合有生育酚的双链核酸复合物剂Toc#1HDO(Toc-HDO)、Chol#1HDO(Chol-HDO)和阴性对照用的PBS产生心肌、膈、股四头肌、胫骨前肌、和肱三头肌中的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因的外显子跳读的图。
图26是显示mdx小鼠中的由单链核酸复合物剂(mixmer)、本发明的末端结合有生育酚的双链核酸复合物剂Toc#1HDO(Toc-mixmer)和阴性对照用的PBS产生的心肌、股四头肌、胫骨前肌、肱三头肌、和背部肌肉中的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因的外显子跳读的图。
图27是显示本发明的双链核酸复合物(Chol#1HDO(mMalat1))、和如图1c那样使将Chol-HDO用RNA接头结合而成的单链核酸自身退火而得的核酸分子Chol-sHDO产生的心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、背部肌肉(Back)中的目标Malat1基因的表达抑制效果的图。PBS表示作为阴性对照的溶剂所使用的PBS。
图28是显示第2核酸链结合有胆固醇的本发明的双链核酸复合物(Chol#1HDO(mMalat1))、和具有作为第2核酸链具有与第1核酸链互补的序列且其3’末端结合有胆固醇的链并且使由四甘醇形成的接头(TEG)存在于胆固醇与第2核酸链的末端之间的构成的核酸(3’Chol(TEG)HDO(mMalat1))，对心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、背部肌肉(Back)中的目标Malat1基因的表达抑制效果的图。PBS表示作为阴性对照的溶剂所使用的PBS。
图29是显示正常小鼠(B10)、以及施与了仅PBS(mdx)、单链核酸复合物剂(PMO)、末端结合有生育酚的双链核酸复合物剂Toc#1HDO(Toc-HDO)、或末端结合有胆固醇的双链核酸复合物剂Chol#1HDO(Chol-HDO)的mdx小鼠在运动负荷试验中的连续行走时间的图。
图30是显示正常小鼠(B10)、以及施与了仅PBS(mdx)、单链核酸复合物剂(PMO)、末端结合有生育酚的双链核酸复合物剂Toc#1HDO(Toc-HDO)、或末端结合有胆固醇的双链核酸复合物剂Chol#1HDO(Chol-HDO)的mdx小鼠的(a)握力(grip power)和(b)保持冲量(holding impulse)的测定结果的图。
图31是显示正常小鼠(B10)、以及施与了仅PBS(mdx)、单链核酸复合物剂(PMO)、末端结合有生育酚的双链核酸复合物剂Toc#1HDO(Toc-HDO)、或末端结合有胆固醇的双链核酸复合物剂Chol#1HDO(Chol-HDO)的mdx小鼠的血清中的(a)肌酸激酶(CK)、(b)天冬氨酸转氨酶(AST)、和(c)丙氨酸转氨酶(ALT)的测定值的图。
图32是显示正常小鼠(B10)、以及施与了仅PBS(mdx)、单链核酸复合物剂(PMO)、末端结合有生育酚的双链核酸复合物剂Toc#1HDO(Toc-HDO)、或末端结合有胆固醇的双链核酸复合物剂Chol#1HDO(Chol-HDO)的mdx小鼠的心电图测定中的修正QT时间(QTc)的图。
图33是显示心肌中的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)蛋白质的表达的蛋白质印迹(Western Blot)的图。显示正常小鼠(B10)、以及施与了仅PBS(mdx)、单链核酸复合物剂(PMO)、末端结合有生育酚的双链核酸复合物剂Toc#1HDO(Toc-HDO)、或末端结合有胆固醇的双链核酸复合物剂Chol#1HDO(Chol-HDO)的mdx小鼠的心肌中的(a)抗肌萎缩蛋白(dystrophin)蛋白质、和(b)黏着斑蛋白(vinculin)蛋白质的表达。
图34是显示股四头肌中的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)蛋白质的表达的蛋白质印迹(Western Blot)的图。显示正常小鼠(B10)、以及施与了仅PBS(mdx)、单链核酸复合物剂(PMO)、末端结合有生育酚的双链核酸复合物剂Toc#1HDO(Toc-HDO)、或末端结合有胆固醇的双链核酸复合物剂Chol#1HDO(Chol-HDO)的mdx小鼠的股四头肌中的(a)抗肌萎缩蛋白(dystrophin)蛋白质、和(b)黏着斑蛋白(vinculin)蛋白质。
图35是显示心肌中的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)蛋白质的表达的免疫染色的图。显示正常小鼠(B10)、以及施与了仅PBS(mdx)、单链核酸复合物剂(PMO)、末端结合有生育酚的双链核酸复合物剂Toc#1HDO(Toc-HDO)、或末端结合有胆固醇的双链核酸复合物剂Chol#1HDO(Chol-HDO)的mdx小鼠的心肌中的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)蛋白质的表达。比例尺条表示200μm。
图36是显示股四头肌中的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)蛋白质的表达的免疫染色的图。显示正常小鼠(B10)、以及施与了仅PBS(mdx)、单链核酸复合物剂(PMO)、末端结合有生育酚的双链核酸复合物剂Toc#1HDO(Toc-HDO)、或末端结合有胆固醇的双链核酸复合物剂Chol#1HDO(Chol-HDO)的mdx小鼠的股四头肌中的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)蛋白质的表达。比例尺条表示200μm。
具体实施方式
1.双链核酸复合物
1-1.概要
本发明的第1方案涉及双链核酸复合物。本发明的双链核酸复合物通过反义效果而能够使受检体的骨骼肌或心肌中的目标基因的转录产物或翻译产物的表达量抑制或增进，诱导目标基因的转录产物或翻译产物的功能抑制、或空间阻断、剪接开关、RNA编集、外显子跳读或者外显子列入(exon-inclusion)。
本发明的双链核酸复合物包含彼此退火了的第1核酸链和第2核酸链。该第1核酸链包含能够与目标基因的转录产物的全部或一部分杂交的碱基序列，且对所述转录产物具有反义效果。另外，第2核酸链包含与所述第1核酸链互补的碱基序列，且其5’末端和/或3’末端结合有功能性部分。
1-2.术语的定义
本说明书中，所谓“目标基因”，是指通过本发明的双链核酸复合物的反义效果而其转录产物或翻译产物的表达量能够被抑制或增进、其转录产物或翻译产物的功能能够被阻碍、或空间阻断、剪接开关、RNA编集、外显子跳读或者外显子列入能够被诱导的基因。关于目标基因的种类，只要在生物体内表达就不特别限定，可列举例如，来源于导入本发明所涉及的双链核酸复合物的生物的基因，例如在各种疾病中其表达增加的基因。例如，清道夫受体B1(scavenger receptor B1：本说明书中经常表述为“SR-B1”)基因、肺腺癌转移相关转录产物1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1：本说明书中经常表述为“Malat1”)基因、DMPK(强直性肌营养不良蛋白激酶，dystrophia myotonica-protein kinase)基因、和抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因等。
其中，清道夫受体已知均为变性脂蛋白质的受体膜蛋白质，参与胆固醇、脂蛋白质代谢。SR-B1是属于进化上保守的CD36家族的2次跨膜蛋白质，具有长的细胞外区域、和分别包含氨基末端和羧基末端的2个短的细胞内区域。
Malat1已知是在以肺癌为代表的恶性肿瘤中高表达的长链非编码RNA(lncRNA)，滞留在肌细胞的核内。
DMPK基因编码强直性肌营养不良蛋白激酶，作为在肌营养不良中成人发病频率最高的肌紧张性营养不良的致病基因已知，存在于DMPK基因的3’非翻译区域的CTG重复序列的异常延伸被认为是该疾病的原因。
本说明书中所谓“目标转录产物”，是指成为本发明的核酸复合物的直接目标、且通过RNA聚合酶而合成的任意RNA。一般相当于“目标基因的转录产物”。具体可以包含从目标基因转录的mRNA(成熟mRNA、mRNA前体、未受到碱基修饰的mRNA等)、miRNA等非编码RNA(non-coding RNA、ncRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、天然反义RNA。作为目标基因的转录产物，可列举例如，作为SR-B1基因的转录产物的SR-B1 mRNA、作为Malat1基因的转录产物的Malat1非编码RNA、和作为DMPK基因的转录产物的DMPK mRNA。
作为具体例，序列号1显示小鼠SR-B1 mRNA的碱基序列，序列号2显示人SR-B1mRNA的碱基序列。另外，序列号3显示小鼠malat1非编码RNA的碱基序列，序列号4显示人Malat1非编码RNA的碱基序列。进而，序列号5显示小鼠DMPK mRNA的碱基序列，序列号6显示人DMPK mRNA的碱基序列。此外，序列号1～6均将mRNA的碱基序列置换成了DNA的碱基序列。这些基因和转录产物的碱基序列信息例如可以从NCBI(美国国家生物技术信息中心)数据库等公知的数据库获得。
另外，也可以利用公知的反义医药的碱基序列。例如，可以使用作为强直性肌营养不良的治疗药的构成针对作为其致病基因的DMPK基因的ISIS 598769(IONIS)的序列号24所示的碱基序列；作为杜氏肌营养不良的治疗药已知的构成诱导抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因的前体mRNA的外显子跳读的Eteplirsen(Sarepta；Exondys 51)的序列号25所示的碱基序列、构成Golodirsen(Sarepta)的序列号26所示的碱基序列、构成NS-065/NCNP-01(日本新药)的序列号27所示的碱基序列、和构成Casimersen(Sarepta)的序列号28所示的碱基序列等。
本说明书中，所谓“反义寡核苷酸(ASO)”是指包含能够与目标转录产物的全部或一部分、例如任意的目标区域杂交的互补碱基序列，能够通过反义效果而抑制控制其目标基因的转录产物的表达或目标转录产物的水平的单链寡核苷酸。本发明的双链核酸复合物中，第1核酸链作为ASO发挥功能，其目标区域可以包含3’UTR、5’UTR、外显子、内含子、编码区、翻译起始区、翻译终止区、或其他任意核酸区域。目标转录产物的目标区域可以为至少8碱基长，例如10～35碱基长、12～25碱基长、13～20碱基长、14～19碱基长、或15～18碱基长。
所谓“反义效果”，是指通过ASO与目标转录产物(例如RNA正义链)杂交从而带给其目标转录产物调节表达或编集的效果。所谓“调节目标转录产物的表达或编集”，是指目标基因的表达或目标转录产物的表达量(本说明书中，经常将“目标转录产物的表达量”表述为“目标转录产物的水平”)的抑制或降低、翻译的抑制、RNA编集、剪接功能改变效果(例如剪接开关、外显子列入、外显子跳读等)、或转录产物的分解。例如，在目标基因的转录后抑制中，如果作为ASO将RNA寡核苷酸导入细胞中，则ASO与作为目标基因的转录产物的mRNA通过退火而形成部分的双链。该部分的双链作为用于妨碍利用核糖体的翻译的覆盖物发挥作用，由此目标基因所编码的目标蛋白质的表达在翻译水平被抑制(空间阻断)。另一方面，如果将包含DNA作为ASO的寡核苷酸导入细胞，则形成部分的DNA-RNA杂合双链。该杂合双链结构被RNase H识别，结果目标基因的mRNA被分解，目标基因所编码的蛋白质的表达在表达水平上被抑制。进而，反义效果也可以以mRNA前体中的内含子作为目标而获得。进而，反义效果也可以以miRNA作为目标而获得。此时，通过其miRNA的功能抑制，能够增加该miRNA通常控制表达的基因的表达。一实施方式中，目标转录产物的表达调节也可以是目标转录产物量的降低。
本说明书中，所谓“目标基因的翻译产物”，是指成为本发明的核酸复合物的直接目标、且通过所述目标转录产物、或目标基因的转录产物的翻译而合成的任意的多肽或蛋白质。作为目标基因的翻译产物，可列举例如，作为SR-B1基因的翻译产物的SR-B1蛋白质、作为Malat1基因的翻译产物的Malat1蛋白质、和作为DMPK基因的翻译产物的DMPK蛋白质。
本说明书中使用的术语“核酸”或“核酸分子”，如果为单体则指核苷或核苷酸，如果为寡聚物则指寡核苷酸，另外如果为聚合物则指多核苷酸。
所谓“核苷”，一般是指由碱基和糖的组合形成的分子。核苷的糖部分不限定，通常由呋喃戊糖基(pentofuranosyl)糖构成，作为其具体例，可列举核糖、脱氧核糖。核苷的碱基部分(核酸碱基)通常为杂环式碱基部分。虽然不限定，但可列举腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、或尿嘧啶，以及除此以外的修饰核酸碱基(修饰碱基)。
所谓“核苷酸”，是指在所述核苷的糖部分共价键合有磷酸基的分子。在包含呋喃戊糖基(pentofuranosyl)糖的核苷酸的情况下，通常在2’位、3’位、或5’位的羟基上连接有磷酸基。
所谓“寡核苷酸”，是指相邻的核苷酸之间通过糖部分的羟基与磷酸基共价键合而数个～数十个连接从而形成的直链状的寡聚物。另外所谓“多核苷酸”，是指比寡核苷酸更多的核苷酸通过所述共价键合而数十个以上、优选为数百个以上连接从而形成的直链状的聚合物。在寡核苷酸或多核苷酸结构的内部磷酸基一般被视作形成核苷间键。
本说明书中所谓“核酸链”或仅“链”，是指寡核苷酸或多核苷酸。核酸链例如可以通过使用自动合成装置的化学合成法，或者通过聚合酶、连接酶、或利用限制性反应的酶的工序制作全长链或部分链。核酸链可以包含天然核苷酸和/或非天然核苷酸。
本说明书中所谓“天然核苷”，是指自然界中存在的核苷。可列举例如，由核糖与所述腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、或尿嘧啶等碱基形成的核糖核苷，由核糖脱氧核糖与所述腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、或胸腺嘧啶等碱基形成的脱氧核糖核苷。此外，RNA中出现的核糖核苷、和DNA中出现的脱氧核糖核苷在本说明书中经常分别表述为“DNA核苷”和“RNA核苷”。
本说明书中所谓“天然核苷酸”，是指自然界存在的核苷酸，且所述天然核苷的糖部分共价键合有磷酸基的分子。可列举例如，在核糖核苷上结合有磷酸基的作为RNA的构成单元已知的核糖核苷酸、和在脱氧核糖核苷上结合有磷酸基的作为DNA的构成单元已知的核糖脱氧核糖核苷酸。
本说明书中所谓“非天然核苷”，是指除了天然核苷以外的任意的核苷。包含例如，修饰核苷和核苷模拟物。本说明书中所谓“修饰核苷”，是指具有修饰糖部分和/或修饰核酸碱基的核苷。包含非天然寡核苷酸的核酸链在多数情况下，由于例如细胞摄入的强化、对核酸目标的亲和性的强化、核酸酶存在下的稳定性的增加、或抑制活性的增加等期望的特性，而比天然型更优选。
本说明书中所谓“模拟物”是指取代糖、核酸碱基、和/或核苷间键的官能团。一般地，模拟物代替糖或糖-核苷间键的组合而使用，为了对所选择的目标的杂交而核酸碱基维持不变。这里所谓“核苷模拟物”，包含为了在寡聚物化合物的一个以上位置取代糖、或取代糖和碱基、或取代构成寡聚物化合物的单体亚单元之间的键合等而使用的结构体。所谓“寡聚物化合物”，是指至少能与核酸分子的某区域杂交的连接了的单体亚单元的聚合物。作为核苷模拟物，可列举例如，具有吗啉基、环己烯基、环己基、四氢吡喃基、二环式或三环式糖模拟物例如非呋喃糖糖单元的核苷模拟物。
本说明书中所谓“二环式核苷”是指包含二环式糖部分的修饰核苷。包含二环式糖部分的核酸一般被称为交联核酸(bridged nucleic acid、BNA)。本说明书中，包含二环式糖部分的核苷也有时称为“交联核苷”。图2中部分例示交联核酸。
二环式糖可以是2’位的碳原子和4’位的碳原子通过2个以上原子交联而成的糖。二环式的例子是本领域技术人员公知的。包含二环式糖的核酸(BNA)的1个亚组可以说明为具有通过4’-(CH2)p-O-2’、4’-(CH2)p-CH2-2’、4’-(CH2)p-S-2’、4’-(CH2)p-O CH2O-2’、4’-(CH2)n-N(R3)-O-(CH2)m-2’[式中，p、m和n分别表示1～4的整数、0～2的整数、和1～3的整数；另外R3表示氢原子、烷基、烯基、环烷基、芳基、芳烷基、酰基、磺酰基、和单元取代基(荧光或者化学发光标记分子、具有核酸切割活性的功能性基团、细胞内或核内定位信号肽等)]交联了的2’位的碳原子和4’位的碳原子。进而，关于特定实施方式的BNA，3’位的碳原子上的OR2取代基和5’位的碳原子上的OR1取代基中，R1和R2典型地为氢原子，但彼此可以相同也可以不同，进而另外，可以是用于核酸合成的羟基的保护基、烷基、烯基、环烷基、芳基、芳烷基、酰基、磺酰基、甲硅烷基、磷酸基、被用于核酸合成的保护基保护的磷酸基、或P(R4)R5[其中，R4和R5彼此可以相同也可以不同，分别表示羟基、被用于核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、被用于核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、具有1～5个碳原子的烷氧基、具有1～5个碳原子的烷硫基、具有1～6个碳原子的氰基烷氧基、或被具有1～5个碳原子的烷基取代的氨基]。作为这样的BNA的非限定的例子，可列举亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA(LNA(锁核酸，Locked Nucleic Acid(注册商标)、也作为2’,4’-BNA已知)，例如，α-L-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA或者β-D-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA、亚乙基氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA(也作为ENA)、β-D-硫代(4’-CH2-S-2’)BNA、氨基氧基(4’-CH2-O-N(R3)-2’)BNA、氧基氨基(4’-CH2-N(R3)-O-2’)BNA(也作为2’,4’-BNANC已知)、2’,4’-BNAcoc、3’-氨基-2’,4’-BNA、5’-甲基BNA、(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA(也作为cEt BNA已知)、(4’-CH(CH2OCH3)-O-2’)BNA(也作为cMOE BNA已知)、酰胺基BNA(4’-C(O)-N(R)-2’)BNA(R＝H、Me)(也作为AmNA已知)、2’-O,4’-C-螺环亚丙基交联型核酸(也作为scpBNA已知)和本领域技术人员公知的其他BNA。本说明书中，有时将具有亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)交联的二环式核苷称为“LNA核苷”。
本说明书中所谓“非天然核苷酸”是指除了天然核苷酸以外的任意的核苷酸，包含修饰核苷酸和核苷酸模拟物。本说明书中所谓“修饰核苷酸”，是指具有修饰糖部分、修饰核苷间键、和修饰核酸碱基的任意1种以上的核苷酸。这里所谓“核苷酸模拟物”包含在寡聚物化合物的一个以上位置为了取代核苷和键合而使用的结构体。作为核苷酸模拟物，可列举例如，肽核酸或吗啉基核酸(-N(H)-C(＝O)-O-或其他通过非磷酸二酯键结合的吗啉基)。肽核酸(Peptide Nucleic Acid、PNA)是代替糖而具有N-(2-氨基乙基)甘氨酸通过酰胺键结合而成的主链的核苷酸模拟物。本说明书中包含非天然寡核苷酸的核酸链多数情况下具有例如，细胞摄入的强化、对核酸目标的亲和性的强化、核酸酶存在下的稳定性的增加、或抑制活性的增加等期望的特性。因此，比天然核苷酸更优选。
本说明书中所谓“修饰核苷间键”，是指相比天然存在的核苷间键(即，磷酸二酯键)具有取代或任意的变化的核苷间键。修饰核苷间键包括：含有磷原子的含磷核苷间键和不含有磷原子的非含磷核苷间键。代表性的含磷核苷间键可列举磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、磷酸三酯、膦酸烷基酯键、硫代膦酸烷基酯键、硼烷磷酸酯键、和氨基磷酸酯键等，但不限于这些。硫代磷酸酯键是将磷酸二酯键的非交联氧原子替换成了硫原子的核苷间键。含磷和非含磷键的制备方法是周知的。修饰核苷间键优选为核酸酶耐性高于天然存在的核苷间键的键。
本说明书中所谓“修饰核酸碱基”或“修饰碱基”，是指除了腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、或尿嘧啶以外的所有核酸碱基。作为修饰核酸碱基的例子，可列举5-甲基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、N4-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、N2-甲基鸟嘌呤、或8-溴鸟嘌呤，但不限于这些。优选的修饰核酸碱基为5-甲基胞嘧啶。
“非修饰核酸碱基”或“非修饰碱基”与天然核酸碱基同义，是指作为嘌呤碱基的腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及作为嘧啶碱基的胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、和尿嘧啶(U)。
本说明书中所谓“修饰糖”，是指相对于天然糖部分(即，DNA(2’-H)或RNA(2’-OH)中被认为的糖部分)具有取代和/或任意的变化的糖。本说明书中核酸链根据情况可以含有包括修饰糖在内的1种以上的修饰核苷。糖修饰核苷能够将核酸酶稳定性的强化、结合亲和性的增加、或其他某些有益的生物学的特性付与核酸链。核苷也可以包含化学修饰呋喃核糖环部分。作为化学修饰呋喃核糖环的例子，不限定，但可列举取代基(包含5’和2’取代基)的添加、通过非偕(geminal)环原子的交联形成而实现的二环式核酸(交联核酸、BNA)的形成、核糖基环的氧原子的用S、N(R)、或C(R1)(R2)(R、R1和R2分别独立地表示H、C1-C12烷基、或保护基)的取代、和它们的组合。本说明书中，作为具有修饰糖部分的核苷的例子不限定，但可列举包含5’-乙烯基、5’-甲基(R或S)、4’-S、2’-F(2’-氟基)、2’-OCH3(2’-OMe基或者2’-O-甲基)、和2’-O(CH2)2OCH3取代基的核苷。2’位的取代基还可以从烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、-O-烯丙基、-O-C1-C10烷基、-OCF3、-O(CH2)2SCH3、-O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、和O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)中选择，各Rm和Rn独立地为H、或取代或者非取代C1-C10烷基。本说明书中“2’-修饰糖”是指在2’位被修饰的呋喃基糖。
一般地，修饰可以以同一链中的核苷酸能够独立地受到不同的修饰的方式实施。另外，为了付与对酶的切割的抵抗性，同一核苷酸可以具有修饰核苷间键(例如，硫代磷酸酯键)，进而具有修饰糖(例如，2’-O-甲基修饰糖或二环式糖)。同一核苷酸还可以具有修饰核酸碱基(例如，5-甲基胞嘧啶)，进而具有修饰糖(例如，2’-O-甲基修饰糖或二环式糖)。
核酸链中的非天然核苷酸的数量、种类和位置能够影响由本发明的核酸复合物所提供的反义效果等。修饰的选择可以根据目标基因等的序列而不同，只要是本领域技术人员，就能够通过参照与反义法相关的文献(例如，WO 2007/143315、WO 2008/043753、和WO2008/049085)的说明而确定合适的实施方式。进而，在测定修饰后的核酸复合物所具有的反义效果时，在这样获得的测定值与修饰前的核酸复合物的测定值相比有意义地低的情况(例如，修饰后所得的测定值为修饰前的核酸复合物的测定值的70％以上、80％以上或90％以上的情况)下，可以评价相关修饰。
本说明书中使用的术语“互补的”，是指核酸碱基能够介由氢键而形成所谓沃森-克里克碱基对(天然型碱基对)或非沃森-克里克碱基对(Hoogsteen型碱基对等)的关系。本发明中，第1核酸链不必须与目标转录产物(例如，目标基因的转录产物)的全部或一部分完全互补，只要碱基序列具有至少70％、优选为至少80％、更优选为至少90％(例如，95％、96％、97％、98％、或99％以上)的互补性就可以。同样地，第2核酸链中的互补的区域也不必须与第1核酸链的全部或一部分完全互补，只要碱基序列具有至少70％、优选为至少80％、更优选为至少90％(例如，95％、96％、97％、98％、或99％以上)的互补性就可以。
本发明中所谓“肌疾病”，是指肌肉萎缩、产生肌力降低的疾病。包含例如，肌营养不良、肌病、炎症性肌病(包括多发性肌炎、皮肤肌炎)、Danon病、肌无力综合征、线粒体病、肌红蛋白尿症、糖原病、周期性四肢麻痹等。本发明中优选的肌疾病是肌营养不良。肌营养不良已知杜氏型、贝克型、埃默里-德赖弗斯(Emery-Dreifuss)型、肢带型、面肩肱型、眼咽型等各种病型，本说明书中的肌营养不良可以是任意病型。同样地，肌病已知先天性、远端型、甲状腺功能降低性、类固醇肌病等病型，但本说明书中的肌病可以是任意病型。
本说明书中所谓“功能性部分”，是通过与双链核酸复合物结合而能够实现双链核酸复合物向骨骼肌、心肌等的有效传递的部分。功能性部分不限定地是脂质配体、脂质衍生物配体、肽配体、抗体配体、适配体、低分子配体、被心肌/骨骼肌摄入的配体分子等。例如，功能性部分是胆固醇或其类似物、生育酚或其类似物、磷脂酰乙醇胺或其类似物、被取代或未被取代的C1～30的烷基、被取代或未被取代的C2～30的烯基、和被取代或未被取代的C1～30的烷氧基。
本说明书中所谓“生育酚”，是母育酚的甲基化衍生物，是具有被称为色原烷(俗称色满，chroman)的环状结构的脂溶性维生素(维生素E)。母育酚具有强的抗氧化作用，因此在生物体内作为抗氧化物质具有使代谢产生的自由基消失，保护细胞免受伤害的功能。
生育酚基于与色原烷结合的甲基的位置，已知包含α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、和δ-生育酚的多种不同的型。本说明书中的生育酚可以是任意的生育酚。另外，作为生育酚的类似物，可列举生育酚的各种不饱和类似物，例如，α-三烯生育酚、β-三烯生育酚、γ-三烯生育酚、δ-三烯生育酚等。优选生育酚为α-生育酚。
本说明书中所谓“胆固醇”，是也被称为类固醇的固醇的1种，特别是在动物中大量存在。胆固醇除了在生物体内的代谢过程中发挥重要功能之外，在动物细胞中也是与磷脂质一起构成细胞的膜系的主要构成成分。另外，胆固醇的类似物是指作为具有固醇骨架的醇的各种胆固醇代谢产物和类似物等，虽然不限定，但包含胆固烷醇、羊毛固醇、脑甾醇、脱氢胆固醇、和粪固醇等。
本说明书中所谓“类似物(analog)”，是指具有同一或类似的基本骨架具有类似的结构和性质的化合物。类似物包括例如，生物合成中间体、代谢产物、具有取代基的化合物等。某化合物是否是其他化合物的类似物，只要是本领域技术人员就能够基于技术常识判定。
本说明书中所谓“受检体”，是指应用本发明的双链核酸复合物或药物组合物的对象。受检体除了个体之外，包括器官、组织、和细胞。在受检体是个体的情况下，可以是包括人在内的所有动物。例如，除了人以外，可列举各种家畜、家禽、宠物、实验动物等。虽然不限定，但受检体可以是需要在骨骼肌或心肌中减少目标转录产物的表达量的个体、需要肌疾病的治疗或预防的个体。
1-3.构成
本发明的双链核酸复合物包含第1核酸链和第2核酸链。以下显示各核酸链的具体构成。
第1核酸链包含能够与目标基因的转录产物的全部或一部分杂交的碱基序列，是对目标转录产物带来反义效果的单链寡核苷酸链。
第2核酸链是包含与第1核酸链互补的碱基序列的单链寡核苷酸链。第2核酸链结合有胆固醇或其类似物。另外，双链核酸复合物中，第2核酸链介由互补的碱基对的氢键而退火于第1核酸链。
第1核酸链和第2核酸链的碱基长不特别限定，可以为至少8碱基长、至少9碱基长、至少10碱基长、至少11碱基长、至少12碱基长、至少13碱基长、至少14碱基长、或至少15碱基长。另外，第1核酸链和第2核酸链的碱基长可以为35碱基长以下、30碱基长以下、25碱基长以下、24碱基长以下、23碱基长以下、22碱基长以下、21碱基长以下、20碱基长以下、19碱基长以下、18碱基长以下、17碱基长以下、或16碱基长以下。第1核酸链和第2核酸链可以为相同的长度，也可以为不同的长度(例如，任意一方短或长1～3碱基的长度)。第1核酸链和第2核酸链所形成的双链结构也可以包含凸起。长度的选择可以根据例如费用、合成收率等其他因子中特别是反义效果的强度与对目标的核酸链的特异性的平衡来确定。
第1核酸链和第2核酸链中的核苷间键可以是天然存在的核苷间键和/或修饰核苷间键。虽然不限定，但优选从第1核酸链和/或第2核酸链的末端(5’末端、3’末端或者两端)起至少1个、至少2个、或至少3个核苷间键是修饰核苷间键。这里，例如从核酸链的末端起2个核苷间键，是指最接近核酸链的末端的核苷间键、和与其相邻且位于末端的相反侧的核苷间键。核酸链的末端区域中的修饰核苷间键能够抑制或阻碍核酸链的不期望的分解，因而优选。在一实施方式中，可以第1核酸链和/或第2核酸链的全部核苷间键是修饰核苷间键。修饰核苷间键可以是硫代磷酸酯键。
从第2核酸链的3’末端开始至少1个(例如3个)的核苷间键可以是RNase耐性高的如硫代磷酸酯键那样的修饰核苷间键。在第2核酸链的3’末端包含硫代磷酸酯修饰等修饰核苷间键的情况下，双链核酸复合物的基因抑制活性提高，因而优选的。
在第2核酸链的5’末端和3’末端，在未结合胆固醇或其类似物的末端，从其末端起2～6个碱基的核苷间键可以是修饰核苷间键(例如硫代磷酸酯键)。
从第2核酸链的3’末端起至少1个(例如3个)的核苷可以是例如RNase耐性高的2’F-RNA、2’-OMe等修饰核苷。在第2核酸链的3’末端包含2’F-RNA、2’-OMe等修饰核苷的情况下，双链核酸复合物的基因抑制活性提高，因而优选。
在第2核酸链的5’末端和3’末端，在未结合胆固醇或其类似物的末端，从其末端起1～5个核苷可以是例如RNase耐性高的2’F-RNA等修饰核苷。
第1核酸链和第2核酸链中的核苷可以是天然核苷(脱氧核糖核苷、核糖核苷、或者两者)和/或非天然核苷。
本说明书中，第1核酸链的碱基序列由于与目标转录产物的全部或一部分的碱基序列互补，因而能够与目标转录产物杂交(或退火)。碱基序列的互补性可以通过使用BLAST程序等来确定。只要是本领域技术人员，就能够考虑链间的互补度，容易地确定2条链能够杂交的条件(温度、盐浓度等)。进而，只要是本领域技术人员，就也能够基于例如目标基因的碱基序列的信息容易地设计与目标转录产物互补的反义核酸。
杂交条件可以是例如，低严格条件和高严格条件等各种严格条件。低严格条件可以是比较低温且高盐浓度的条件，例如，30℃、2×SSC、0.1％SDS。高严格条件可以是比较高温且低盐浓度的条件，例如，65℃、0.1×SSC、0.1％SDS。通过改变温度和盐浓度等条件，能够调整杂交的严格性。其中，1×SSC包含150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠。
第1核酸链在与目标转录产物杂交的情况下，可以包含能被RNase H识别的至少4个、至少5个、至少6个、或至少7个连续的核苷。通常，可以是包含4～20碱基、5～16碱基、或6～12碱基的连续核苷的区域。作为能被RNase H识别的核苷，可以使用例如天然型脱氧核糖核苷。被修饰的脱氧核糖核苷、和包含其他碱基的合适核苷是本领域周知的。另外，核糖核苷等在2’位具有羟基的核苷不适合作为所述核苷也是已知的。关于向包含“至少4个连续的核苷”的该区域的利用，可以容易地确定核苷的适合性。在一实施方式中，第1核酸链可以包含至少4个连续的脱氧核糖核苷。
在一实施方式中，第1核酸链的全长不仅由天然核糖核苷构成。第1核酸链的天然核糖核苷优选为全长的半数以下，或不包含。
在一实施方式中，第2核酸链可以包含与第1核酸链中的上述至少4个连续的核苷(例如脱氧核糖核苷)互补的、至少4个连续的核糖核苷。这是为了第2核酸链与第1核酸链形成部分的DNA-RNA杂合双链，从而被RNaseH识别而切割。第2核酸链中的至少4个连续的核糖核苷优选通过天然存在的核苷间键、即磷酸二酯键连接。
第2核酸链可以全部核苷由核糖核苷和/或修饰核苷构成。可以第2核酸链的全部核苷由脱氧核糖核苷和/或修饰核苷构成，也可以不包含核糖核苷。在一实施方式中，可以第2核酸链的全部核苷由脱氧核糖核苷和/或修饰核苷构成。
构成本发明的双链核酸复合物的第1核酸链和/或第2核酸链可以是gapmer。本说明书中“gapmer”原则上是指由中央区域(DNA缺口区域)、和直接配置于其5’末端和3’末端的翼区域(分别称为5’翼区域和3’翼区域)组成的单链核酸。gapmer中的所述中央区域包含至少4个连续的脱氧核糖核苷，所述翼区域包含至少1个非天然核苷。虽然不限定，但翼区域所包含的非天然核苷通常具有比天然核苷与RNA的结合力高、对核酸分解酶(核酸酶等)的耐性高的性质。在构成翼区域的非天然核苷包含交联核苷、或由交联核苷构成的情况下，将所述gapmer特别称为“BNA/DNAgapmer”。5’翼区域和3’翼区域所包含的交联核苷的数至少为1个，例如为2或3个。5’翼区域和3’翼区域所包含的交联核苷在5’翼区域和3’翼区域内连续或不连续地存在。交联核苷可以进一步包含修饰核酸碱基(例如，5-甲基胞嘧啶)。在交联核苷是LNA核苷的情况下，将所述gapmer称为“LNA/DNAgapmer”。在构成5’翼区域和3’翼区域的非天然核苷包含肽核酸或由肽核酸构成的情况下，将所述gapmer特别称为“肽核酸gapmer”。在构成5’翼区域和3’翼区域的非天然核苷包含吗啉基核酸、或由吗啉基核酸构成的情况下，将所述gapmer特别称为“吗啉基核酸gapmer”。5’翼区域和3’翼区域的碱基长分别独立地可以为至少2碱基长，例如，2～10碱基长、2～7碱基长、或3～5碱基长。5’翼区域和3’翼区域包含至少1种非天然核苷即可，也可以进一步包含天然核苷。
构成所述gapmer的第1核酸链和/或第2核酸链从5’末端起依次由2～7碱基长或者3～5碱基长的交联核苷、4～15碱基长或者8～12碱基长的核糖核苷或脱氧核糖核苷、和2～7碱基长或者3～5碱基长的交联核苷构成。
此外，仅在5’末端侧或3’末端侧的任一方具有翼区域的核酸链在本领域被称为“半gapmer”，本说明书中半gapmer也包含在gapmer中。
构成本发明的双链核酸复合物的第1核酸链和/或第2核酸链可以是mixmer。本说明书中“mixmer”是指包含周期的或随机的片段长的交替型的天然核苷和非天然核苷，且不包含4个以上的连续的脱氧核糖核苷和核糖核苷的核酸链。在mixmer中，将所述非天然核苷是交联核苷、且天然核苷是脱氧核糖核苷的mixmer特别称为“BNA/DNAmixmer”。在mixmer中，将所述非天然核苷是肽核酸、且天然核苷是脱氧核糖核苷的mixmer特别称为“肽核酸/DNAmixmer”。在mixmer中，将所述非天然核苷是吗啉基核酸、且天然核苷是脱氧核糖核苷的mixmer特别称为“吗啉基核酸/DNAmixmer”。mixmer不限于仅包含2种核苷。无论mixmer是否是天然或者修饰的核苷或核苷模拟物，都可以包含任意数的种类的核苷。例如，可以具有被交联核苷(例如，LNA核苷)分离的1或2个连续的脱氧核糖核苷。交联核苷可以进一步包含修饰核酸碱基(例如，5-甲基胞嘧啶)。
从第2核酸链的末端(5’末端、3’末端、或两末端)起至少1个、至少2个、至少3个、或至少4个核苷可以是修饰核苷。修饰核苷可以包含修饰糖和/或修饰核酸碱基。修饰糖可以是2’-修饰糖(例如，包含2’-O-甲基)。修饰核酸碱基也可以为5-甲基胞嘧啶。
第2核酸链可以从5’末端起依次由2～7碱基长或者3～5碱基长的修饰核苷(例如，包含2’-修饰糖的修饰核苷)、4～15碱基长或者8～12碱基长的(根据情况通过修饰核苷间键连接的)核糖核苷或脱氧核糖核苷、和2～7碱基长或者3～5碱基长的修饰核苷(例如，包含2’-修饰糖的修饰核苷)构成。这种情况下，第1核酸链可以是gapmer。
第1核酸链和第2核酸链可以在全部或一部分包含核苷模拟物或核苷酸模拟物。核苷酸模拟物可以是肽核酸和/或吗啉基核酸。第1核酸链可以包含至少1个修饰核苷。修饰核苷可以包含2’-修饰糖。该2’-修饰糖可以是包含2’-O-甲基的糖。因此，本发明的一实施方案涉及双链核酸复合物，第1核酸链包含能够与目标基因的转录产物的全部或一部分杂交的碱基序列、且对所述转录产物具有反义效果，第2核酸链包含与所述第1核酸链互补的碱基序列，所述第1核酸链退火至所述第2核酸链，所述第1核酸链在全部(100％)或一部分(例如全体的80％以上)包含吗啉基核酸。
第1核酸链和第2核酸链可以包含上述的修饰核苷间键和修饰核苷的任意的组合。
第1核酸链与第2核酸链可以介由接头而结合。这种情况下，第1核酸链与第2核酸链介由接头而连接，可以形成单链。但是，在其他情况下也由于功能区域与双链核酸复合物是相同的构成，因而在本说明书中，也包含这样的单链核酸作为本发明的双链核酸复合物的一实施方式。接头可以是任意的聚合物。可列举例如，多核苷酸、多肽、烯属烃等。具体地，例如，可以由DNA、RNA这样的天然核苷酸或肽核酸、吗啉基核酸这样的非天然核苷酸构成。在接头由核酸形成的情况下，接头的链长可以取至少1碱基、例如3～10碱基或4～6碱基的链长。优选为4碱基的链长。接头的位置可以在第1核酸链的5’侧也可以在3’侧的任意，例如，在第2核酸链的5’侧结合有胆固醇或其类似物的构成的情况下，第1核酸链的5’末端与第2核酸链的3’末端介由接头而连接。在一实施方案中，第1核酸链是仅在3’末端侧具有翼区域的半gapmer，第2核酸链是不包含糖修饰核苷的核酸链。
第2核酸链结合了胆固醇或其类似物。
与胆固醇或其类似物结合了的第2核酸链具有以下通式(I)所示的基团。
Figure BDA0003286202780000281
[式中，Rc表示可以具有取代基的碳数为4～18个、优选为碳数5～16个的亚烷基(其中，该取代基是可以被卤素原子、或羟基取代的碳数1～3个烷基、例如羟基甲基，该亚烷基中不相邻的碳原子可以被氧原子取代)。]
Rc虽不限定，但可以是-(CH2)3-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CH(CH2OH)-、或-(CH2)6-。
上述通式(I)或(II)所示的基团可以在第2核酸链的5’末端或3’末端介由磷酸酯键结合。
胆固醇或其类似物可以任意结合在第2核酸链的5’末端、或3’末端、或者两端。另外，胆固醇或其类似物可以结合于第2核酸链的内部的核苷酸。虽然不限定，但结合于第2核酸链的5’末端的固醇或其类似物特别合适。
在第2核酸链包含多个胆固醇或其类似物的情况下，它们可以相同也可以不同。例如，相当于在第2核酸链的5’末端结合有1个胆固醇、在3’末端结合有其他胆固醇类似物的情况。关于结合位置，胆固醇或其类似物可以结合于第2核酸链的多个位置，和/或一群结合于1个位置。也可以胆固醇或其类似物分别在第2核酸链的5’末端和3’末端各连接1个。
第2核酸链与胆固醇或其类似物的结合可以是直接结合，也可以是介由其他物质的间接结合。
在第2核酸链与胆固醇或其类似物直接结合的情况下，例如，可以介由共价键、离子键、氢键等而结合于第2核酸链。考虑能够获得更稳定的结合这样的方面，优选为共价键。
在第2核酸链与胆固醇或其类似物间接结合的情况下，可以介由连接基(本说明书中经常表述为“接头”)而结合。接头可以是可切割的(cleavable)接头或不可切割的(uncleavable)接头的任一者。
所谓“可切割的接头”，是指在生理学的条件下、例如细胞内或动物体内(例如，人体内)可以被切割的接头。可切割的接头被核酸酶等内源性酶选择性地切割。可切割的接头虽然不限定，但可列举酰胺、酯、磷酸二酯的一方或者两方的酯、磷酸酯、氨基甲酸酯、和二硫键、以及天然DNA接头。作为一例，胆固醇或其类似物可以介由二硫键连接。
所谓“不可切割的接头”，是指生理学的条件下、例如细胞内或动物体内(例如，人体内)不被切割的接头。不可切割的接头虽然不限定，但可列举由被硫代磷酸酯键、和硫代磷酸酯键连接的修饰或者非修饰的脱氧核糖核苷或修饰或者非修饰的核糖核苷形成的接头等。在接头是DNA等核酸或寡核苷酸的情况下，链长不特别限定，通常可以为2～20碱基长、3～10碱基长或4～6碱基长。
作为所述接头的一具体例，可列举以下通式II所示的接头。
Figure BDA0003286202780000301
[式中，n表示0或1。]
第2核酸链可以进一步包含结合于构成核酸链的多核苷酸的至少1个功能性部分。所谓“功能性部分”，是指对双链核酸复合物和/或该功能性部分所结合的核酸链付与所期望的功能的部分。所期望的功能可列举例如，标记功能、或纯化功能等。作为付与标记功能的部分的例子，可列举荧光蛋白质、荧光素酶等化合物。另外，作为付与纯化功能的部分的例子，可列举生物素、抗生物素蛋白、His标签肽、GST标签肽、FLAG标签肽等化合物。功能性部分的第2核酸链中的结合位置和结合的种类如关于胆固醇或其类似物与第2核酸链的结合在上面所记载那样。
在本发明的双链核酸复合物中，第1核酸链所具有的针对目标转录产物的在骨骼肌或心肌中的反义效果，可以用本领域公知的方法测定。例如，可以将双链核酸复合物导入细胞等之后，通过使用RNA印迹(Northern blotting)、定量PCR、或蛋白质印迹(Westernblotting)等公知技术来测定。通过测定骨骼肌细胞或心肌细胞内的目标基因的表达量或目标转录产物的水平(例如，mRNA量或者微小RNA等的RNA量、cDNA量、蛋白质量等)，可以在这些部位通过双链核酸复合物来判定目标基因表达是否被抑制。所述判定的基准虽然不限定，但在目标基因的表达量或目标转录产物的测定值与阴性对照(例如施与载体)的测定值相比减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、或至少40％的情况下，可以判定本发明的双链核酸复合物在骨骼肌或心肌带来反义效果。
如上所述，对于本发明的双链核酸复合物的例示的实施方式进行了说明，但本发明的双链核酸复合物不限于上述例示的实施方式。
1-4.双链核酸复合物的制造方法
本发明的双链核酸复合物只要是本领域技术人员就能够适当选择公知的方法而制造。虽然不限定，但通常，首先从分别设计、制造构成双链核酸复合物的第1核酸链和第2核酸链开始。例如，基于目标转录产物的碱基序列(例如，目标基因的碱基序列)信息设计第1核酸链，作为其互补链设计第2核酸链。接着，可以基于设计的碱基序列信息，将各个核酸链使用例如GE Healthcare社、Thermo Fisher Scientific社、Beckman Coulter社等市售自动核酸合成装置合成。然后，可以对所得的寡核苷酸使用反相柱等进行纯化。
另外，在结合了功能性部分的双链核酸复合物的情况下，第1核酸链可以依据上述方法制造。另一方面，结合了功能性部分的第2核酸链可以使用预先结合了功能性部分的核酸种，进行上述的合成、和纯化而制造。例如，可以使用预先结合了胆固醇或其类似物的核酸种，通过实施上述的合成和纯化来制造第2核酸链。或者，可以对通过实施上述的合成和纯化而制造的第2核酸链通过公知的方法结合胆固醇或其类似物。制造各核酸链之后，可以通过对第1核酸链与第2核酸链实施后述的退火来制造作为目的的结合有功能性部分的双链核酸复合物。
将功能性部分连接于核酸的方法在该技术领域是周知的。可以将通过该方法制造的核酸在适当的缓冲溶液中混合，在约90℃～98℃使其变性数分钟(例如5分钟)，然后使核酸在约30℃～70℃退火约1～8小时，制造本发明的双链核酸复合物之一。另外，核酸链可以指定碱基序列以及修饰部位和种类，向各种制造商(例如，株式会社ジーンデザイン)订购、获得。上述退火工序可以通过在室温(约10℃～约35℃)静置约5～60分钟来进行。可以将第1核酸链和第2核酸链分别在约70℃～98℃的缓冲液(例如磷酸缓冲生理盐水)或水中溶解，将所得的2种溶液混合，将混合液在约70℃～98℃保持数分钟(例如5分钟)，然后将混合液在约30℃～70℃(或30℃～50℃)保持约1～8小时，制备本发明的一部分实施方式的双链核酸复合物。第1核酸链和第2核酸链可以分别在室温(约10℃～约35℃)、在缓冲液(例如磷酸缓冲生理盐水)或水中溶解。制作双链核酸复合物时的退火的条件(时间和温度)不限于上述条件。另外，适合促进核酸链的退火的条件在该技术领域是周知的。
1-5.效果
本发明的双链核酸复合物能够被有效地传递到受检体的骨骼肌或心肌，在该部位对目标基因发挥反义效果，抑制其表达。因此，通过使用该双链核酸复合物作为有效成分，能够治疗或预防可能通过受检体的骨骼肌或心肌中的目标基因的表达而发病或重症化的、如肌疾病的这样的疾病。
2.药物组合物
2-1.概要
本发明的第2方案是药物组合物。本发明的药物组合物包含所述第1方案的双链核酸复合物作为有效成分，和/或作为向骨骼肌或心肌的药剂传递分子。所述第1方案的双链核酸复合物可以在骨骼肌或心肌通过反义效果调节目标转录产物的表达量。因此，通过将本发明的药物组合物施与受检体，能够使双链核酸复合物传递到受检体的骨骼肌或心肌，治疗可能在该部位发病的疾病、例如肌疾病。本发明的药物组合物可以本质上由所述第1方案的双链核酸复合物的组合物构成。即，本发明的药物组合物除了所述第1方案的双链核酸复合物之外，还可以进一步包含载体等辅助成分。另外，本发明的药物组合物也可以仅由所述第1方案的双链核酸复合物构成。
2-2.构成
以下，本发明的药物组合物可以包含有效成分和载体作为必须成分。对于各成分具体进行说明。
2-2-1.有效成分
有效成分是本发明的药物组合物中的必须成分的构成成分。本发明的药物组合物作为有效成分至少包含所述第1方案所述的双链核酸复合物。本发明的药物组合物可以包含二种以上的所述双链核酸复合物。
药物组合物所包含的所述双链核酸复合物的量(含量)根据双链核酸复合物的种类、要传递的部位(骨骼肌或心肌)、药物组合物的剂型、药物组合物的施与量、以及后述的载体的种类而不同。因此，可以考察各自的条件而适当设定。通常制备成单次施与量的药物组合物包含有效量的双链核酸复合物那样。所谓“有效量”，是指双链核酸复合物发挥作为有效成分的功能所需的量、且对应用其的生物体基本或完全不付与有害的副作用的量。该有效量可以根据受检体的信息、施与途径、和施与次数等各种条件而变化。最终通过医师、兽医或药剂师等的判断来确定。作为“受检体的信息”，是应用药物组合物的生物体的各种个体信息。例如，如果受检体是人，则包含年龄、体重、性别、食生活、健康状态、疾病的进行度/重症度、药剂敏感性、联用药物的有无等。
2-2-2.载体
本发明的药物组合物可以包含药学上可容许的载体。所谓“药学上可容许的载体”，是指在制剂技术领域通常使用的添加剂。可列举例如，溶剂、植物性油、基剂、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、pH调节剂、稳定剂、香味料、香料、赋形剂、载体、防腐剂、粘结剂、稀释剂、等渗剂、镇静剂、增量剂、崩解剂、缓冲剂、涂抹剂、润滑剂、着色剂、甜味剂、增稠剂、矫味剂、助溶剂、和其他添加剂。
溶剂例如可以是水或者除水以外的药学上可容许的水溶液、或药学上可容许的有机溶剂的任一者。作为水溶液，可列举例如，生理盐水、包含葡萄糖和/或其他辅助剂的等渗液、磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液。作为辅助剂，可列举例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠、以及低浓度的非离子表面活性剂、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯类等。
上述载体除了用于避免或抑制作为有效成分的双链核酸复合物在生物体内由于酶等的分解之外，还用于使制剂化、施与方法容易，维持剂型和药效，可以根据需要适当使用。
2-2-3.剂型
本发明的药物组合物的剂型只要是不会使得作为有效成分的第1方案所记载的双链核酸复合物通过分解等而失活、能够传递到作为目标部位的骨骼肌或心肌、在生物体内发挥其有效成分的药理效果(对目标基因的表达的反义效果)的方式，就不特别限定。
具体的剂型根据施与方法和/或处方条件而不同。施与方法可以大致区分为非经口施与和经口施与，所以可以制成适合各自的施与法的剂型。
如果施与方法为非经口施与，则优选的剂型是能够对对象部位直接施与或介由循环系统全身施与的液剂。作为液剂的例子，可列举注射剂。注射剂可以与所述赋形剂、酏剂、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、pH调节剂等适当组合，以一般认同的制药实施所要求的单位用量方式进行混和，从而制剂化。此外，可以是软膏、硬膏剂(plaster)、巴布剂(cataplasm)、经皮剂、洗剂、吸入剂、气雾剂、滴眼剂、和栓剂。
如果施与方法为经口施与，则优选的剂型可列举固体剂(包含片剂、胶囊剂、滴剂、口含剂)、颗粒剂、粉剂、散剂、液剂(包含内用水剂、乳剂、糖浆剂)。如果是固体剂，则可以根据需要制成该技术领域公知的施与了剂皮的剂型，例如，糖衣片、明胶包衣片、肠溶片、膜涂片、双层片、多层片。
此外，关于上述各剂型的具体形状、大小，均可以对于各自的剂型在本领域公知的剂型的范围内，不特别限定。关于本发明的药物组合物的制造方法，可以按照该技术领域的常规方法制剂化。
2-3.施与方式和施与量
本说明书中的药物组合物的优选的施与方式不特定限定。例如，可以是经口施与或非经口施与。作为非经口施与的具体例，可列举肌肉内施与、静脉内施与、动脉内施与、腹腔内施与、皮下施与(包括埋入型持续皮下施与)、气管/支气管施与、和直肠施与、以及利用输血的施与。如果鉴于本发明的应用对象部位是骨骼肌或心肌，则作为对象部位的肌肉内注射施与、静脉内点滴施与是合适的。
在药物组合物通过施与或摄取而应用的情况下，施与量或摄取量可以为例如，所包含的双链核酸复合物成为0.00001mg/kg/天～10000mg/kg/天、或0.001mg/kg/天～100mg/kg/天。药物组合物可以单次施与，也可以多次施与。在多次施与的情况下，可以每天或者以适当的时间间隔(例如以1天、2天、3天、1周、2周、1个月的间隔)施与例如2～20次等。上述的双链核酸复合物的1次的施与量可以为例如，0.001mg/kg以上、0.005mg/kg以上、0.01mg/kg以上、0.25mg/kg以上、0.5mg/kg以上、1mg/kg以上、2.5mg/kg以上、0.5mg/kg以上、1.0mg/kg以上、2.0mg/kg以上、3.0mg/kg以上、4.0mg/kg以上、5mg/kg以上、10mg/kg以上、20mg/kg以上、30mg/kg以上、40mg/kg以上、50mg/kg以上、75mg/kg以上、100mg/kg以上、150mg/kg以上、200mg/kg以上、300mg/kg以上、400mg/kg以上、或者500mg/kg以上，例如，可以适当选择0.001mg/kg～500mg/kg的范围所包含的任意的量(例如，0.001mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、或者200mg/kg)。
本发明的双链核酸复合物可以以0.01～10mg/kg(例如约6.25mg/kg)的用量、以每周2次的频率施与4次。另外，双链核酸复合物也可以以0.05～30mg/kg(例如约25mg/kg)的用量、每周1～2次的频率施与2～4次，例如以每周2次的频率施与2次。通过采用这样的施与管理办法(分开施与)，与更高用量的单次施与相比，能够降低毒性(例如避免血小板减少)，降低对受检体的负荷。
药物组合物即使重复施与在细胞内抑制效果也累加地发挥。另外，在重复施与的情况下，空出某种程度的施与间隔(例如，半天以上)更能够提高有效性。
2-4.应用对象疾病
成为药物组合物的应用对象的疾病是在骨骼肌或心肌中伴随目标基因的表达而可能发病的、或可能重症化的疾病。例如，虽然不限定，但可列举肌疾病。
本发明中所谓“肌疾病”，是以肌细胞(包含骨骼肌细胞、或心肌细胞)为病因、产生肌力降低的疾病的总称。包含例如，肌营养不良、肌病、炎症性肌病(包含多发性肌炎、皮肤肌炎)、Danon病、肌无力综合征、线粒体病、肌红蛋白尿症、糖原病、周期性四肢麻痹、遗传性心肌病、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、带有遗传性的心律失常等。另外，也包含其他脏器存在主要的原因、能够次要地对骨骼肌或心肌细胞带来功能失常的疾病。包含例如，神经变性疾病、肌少症、恶病质等。
2-5.药剂传递
本发明的药物组合物利用作为有效成分含有的第1方案的双链核酸复合物能够有效地被传递到骨骼肌或心肌，通过使特定的药剂与第1核酸链和/或第2核酸链结合，可以将该药剂传递到骨骼肌或心肌。被传递到骨骼肌或心肌的药剂虽然不限定，但可列举肽、蛋白质或核酸药剂、或者其他有机化合物等，例如抗肿瘤药、激素药、抗生素、抗病毒剂、抗炎症药等。优选的药剂是小分子药剂。小分子药剂在该技术领域对于本领域技术人员来说能够充分理解。典型地是指具有小于1,000道尔顿的分子量的药剂。药剂可以是亲油性药剂。作为核酸药剂不特别限定，但可列举ASO、antago-miR、剪接开关寡核苷酸、适配体、单链siRNA、微小RNA、前体微小RNA等。药剂的第2核酸链中的结合位置和结合的种类如上述对于胆固醇或其类似物与第2核酸链的结合所述。
2-6.效果
在骨骼肌或心肌中，能够治疗或预防可能由特定的基因的表达而发病的肌疾病等。
本发明的药物组合物如以下实施例所公开的那样，能够有效地被传递到骨骼肌或心肌，在该部位有效地抑制目标基因的表达或目标转录产物的水平。因此，提供在受检体的骨骼肌或心肌中使目标转录产物的表达量减少的方法，该方法包括将包含上述的双链核酸复合物的药物组合物施与受检体。该方法可以是治疗受检体的肌疾病的方法。另外，还提供药剂传递方法，是向受检体的骨骼肌或心肌传递药剂的方法，该方法包括将包含上述的双链核酸复合物的药物组合物施与受检体的步骤。
实施例
＜实施例1＞
(目的)
对于由以SR-B1基因作为目标的反义寡核苷酸与生育酚或胆固醇结合型互补链形成的双链核酸复合物剂对组织内mRNA表达的体内(in vivo)抑制效果进行验证。
(方法)
(1)核酸的制备
目标基因是清道夫受体B1(scavenger receptor B1、SR-B1)。本实施例中使用的构成双链核酸复合物剂的第1核酸链和第2核酸链的名称和碱基序列示于表1。
表1
寡核苷酸名 序列(5’-3’) 序列号
第1核酸链 ASO(mSR-B1) <u>T</u><sup>*</sup><u>C</u><sup>*</sup>a<sup>*</sup>g<sup>*</sup>t<sup>*</sup>c<sup>*</sup>a<sup>*</sup>t<sup>*</sup>g<sup>*</sup>a<sup>*</sup>c<sup>*</sup>t<sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>C</u> 7
第2核酸链 Toc#1-cRNA(mSR-B1) Toc-<u>g</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup>AGUCAUGACU<sup>*</sup>g<sup>*</sup><u>a</u> 8
第2核酸链 Chol#1-cRNA(mSR-B1) Chol-<u>g</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup>AGUCAUGACU<sup>*</sup><u>g</u><sup>*</sup><u>a</u> 8
带下划线的大写字母:LNA(C表示5-甲基胞嘧啶LNA)；小写字母:DNA；大写字母:RNA；带下划线的小写字母:2’-O-甲基RNA；*:硫代磷酸酯键(PS键)；Toc:生育酚；Chol:胆固醇
上述第1核酸链以小鼠的SR-B1基因为目标，由具有与作为其转录产物的SR-B1mRNA(GenBank登记号NM_016741、序列号1)的2479～2492位互补的碱基序列的14mer的单链LNA/DNAgapmer构成。更具体地，该LNA/DNAgapmer的5’末端和3’末端起各2个由LNA核苷构成，它们之间的10个由DNA核苷构成。
上述第2核酸链具有与第1核酸链互补的序列，且由在其5’末端结合有生育酚的生育酚结合型互补链RNA(Toc#1-cRNA(mSR-B1))、或结合有胆固醇的胆固醇结合型互补链RNA(Chol#1-cRNA(mSR-B1))构成。
通过使上述第1核酸链与2种第2核酸链的任一种退火，从而制备作为本发明的双链核酸复合物剂的生育酚结合型杂合双链寡核苷酸(Tocopherol-conjugatedheteroduplex oligonucleotide，以下表述为“Toc-HDO”)或胆固醇结合型杂合双链寡核苷酸(Cholesterol-conjugated heteroduplex oligonucleotide，以下表述为“Chol-HDO”)。将第1核酸链与第2核酸链等摩尔量混合，将溶液在95℃加热5分钟，然后冷却到37℃保持1小时，由此将核酸链退火而制备上述的双链核酸复合物剂。将退火后的核酸在4℃或冰上保存。将制备后的双链核酸复合物剂称为“Toc#1HDO(mR-B1)”或“Chol#1HDO(mSR-B1)”。
双链核酸复合物剂的比较对象使用现有的单链反义寡核苷酸(ASO)(对照ASO)。该对照ASO具有与所述双链核酸复合物剂的第1核酸链相同的构成。将制备后的单链ASO称为“ASO(mSR-B1)”。
(2)体内(in vivo)实验
施与双链核酸复合物剂等的小鼠使用体重20g的6～7周龄的雄的C57BL/6小鼠。本实施例中，以后，使用小鼠的实验全部以n＝4实施。
将双链核酸复合物剂和对照的ASO(mSR-B1)利用分别单次施与经由尾静脉以50mg/kg的量对小鼠进行静脉内注射。进而，作为阴性对照组也制作仅以单次施与注射PBS的小鼠。
(3)表达分析
在施与后72小时的时间点对小鼠灌注PBS，然后将小鼠解剖摘取心肌、股四头肌、膈、和背部肌肉。接着，使用高通量全自动核酸提取装置MagNA Pure 96(ロシュ·ライフサイエンス社)，按照操作指南从各组织提取mRNA。cDNA按照Transcriptor Universal cDNAMaster(ロシュ·ライフサイエンス社)的操作指南合成。定量RT-PCR通过TaqMan(ロシュ·ライフサイエンス社)实施。定量RT-PCR中使用的引物，使用基于各种基因数通过サーモ·フィッシャー·サイエンティフィック社(Thermo Fisher Scientific)设计和制造的制品。PCR条件(温度和时间)是将95℃15秒、60℃30秒、和72℃1秒作为1个循环，重复40个循环。将所得的扩增产物通过定量RT-PCR进行定量，基于其结果分别计算mRNA(SR-B1)的表达量/mRNA(ACTB：内标基因)的表达量，获得相对表达水平。计算出相对表达水平的平均值和标准误差。另外将各组的结果进行比较，进一步通过t-检验评价结果。
(结果)
图3显示结果。图3显示结合了生育酚或胆固醇的以SR-B1基因作为目标基因的本发明的双链核酸复合物(分别Toc#1HDO(mSR-B1)、和Chol#1HDO(mSR-B1))对心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、背部肌肉(Back)中的目标SR-B1基因的表达抑制效果。误差条表示各个标准误差。
Toc#1HDO(mSR-B1)和Chol#1HDO(mSR-B1)在各种骨骼肌和心肌中均与单链的对照ASO(mSR-B1)相比可见显著的目标基因的表达抑制效果。
＜实施例2＞
(目的)
以malat1基因作为目标，通过第2核酸链由生育酚或胆固醇结合型互补链组成的双链核酸复合物剂的单次施与，对于组织内mRNA表达的体内(in vivo)抑制效果进行验证。
(方法)
(1)核酸的制备
目标基因是转移相关肺腺癌转录产物(malat1)。本实施例中使用的构成双链核酸复合物剂的第1核酸链和第2核酸链的名称和碱基序列示于表2。
表2
寡核苷酸名 序列(5’-3’) 序列号
第1核酸链 ASO(mMalat1) <u>C</u><sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>A</u><sup>*</sup>g<sup>*</sup>t<sup>*</sup>t<sup>*</sup>c<sup>*</sup>a<sup>*</sup>c<sup>*</sup>t<sup>*</sup>g<sup>*</sup>a<sup>*</sup>a<sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>G</u><sup>*</sup><u>C</u> 9
第2核酸链 Toc#1-cRNA(mMalat1) Toc-<u>g</u><sup>*</sup><u>c</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup>UUCAGUGAAC<sup>*</sup><u>u</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup><u>g</u> 10
第2核酸链 Chol#1-cRNA(mMalat1) Chol-<u>g</u><sup>*</sup><u>c</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup>UUCAGUGAAC<sup>*</sup><u>u</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup><u>g</u> 10
带下划线的大写字母:LNA(C表示5-甲基胞嘧啶LNA)；小写字母:DNA；大写字母:RNA；带下划线的小写字母:2’-O-甲基RNA；*:硫代磷酸酯键(PS键)；Toc:生育酚；Chol:胆固醇
上述第1核酸链以小鼠的malat1基因为目标，由16mer的单链LNA/DNAgapmer构成，该单链LNA/DNAgapmer以作为该基因的转录产物的malat1非编码RNA(GenBank登记号NR_002847、序列号3)作为目标，具有与1316～1331位互补的碱基序列。更具体地，该LNA/DNAgapmer的5’末端和3’末端起各3个由LNA核苷构成，它们之间的10个由DNA核苷构成。
另一方面，第2核酸链具有与第1核酸链互补的序列，且由其5’末端结合有生育酚的生育酚结合型互补链RNA(Toc#1-cRNA(mMalat1))、或结合有胆固醇的胆固醇结合型互补链RNA(Chol#1-cRNA(mMalat1))构成。
将上述第1核酸链与2种第2核酸链的任一者以等摩尔量混合，将溶液在95℃加热5分钟，然后冷却到37℃保持1小时，由此将2条核酸链退火而制备上述的双链核酸复合物剂。退火后的核酸在4℃或冰上保存。将制备后的双链核酸复合物剂称为“Toc#1HDO(mMalat1)”或“Chol#1HDO(mMalat1)”。
双链核酸复合物剂的比较对象使用现有的单链反义寡核苷酸(ASO)(对照ASO)。该对照ASO具有与所述双链核酸复合物剂的第1核酸链相同的构成。将制备后的单链ASO作为“ASO(mMalat1)”。
(2)体内(in vivo)实验
施与双链核酸复合物剂等的小鼠使用体重20g的6～7周龄的雄的C57BL/6小鼠。
将双链核酸复合物剂和对照ASO利用单次施与而对小鼠分别经由尾静脉以50mg/kg的量进行静脉内注射。进而，作为阴性对照组也制作仅以单次施与注射PBS的小鼠。
(3)表达分析
在施与后72小时的时间点对小鼠灌注PBS，然后将小鼠解剖摘取心肌、股四头肌、膈、和背部肌肉。接着，使用高通量全自动核酸提取装置MagNA Pure 96(ロシュ·ライフサイエンス社)，按照操作指南从各组织提取mRNA。cDNA按照Transcriptor Universal cDNAMaster(ロシュ·ライフサイエンス社)的操作指南合成。定量RT-PCR通过TaqMan(ロシュ·ライフサイエンス社)实施。定量RT-PCR中使用的引物，使用基于各种基因数通过サーモ·フィッシャー·サイエンティフィック社(Thermo Fisher Scientific)设计和制造的制品。PCR条件(温度和时间)是将95℃15秒、60℃30秒、和72℃1秒作为1个循环，重复40个循环。将所得的扩增产物通过定量RT-PCR进行定量，基于其结果分别计算mRNA(malat1)的表达量/mRNA(ACTB：内标基因)的表达量，获得相对表达水平。计算出相对表达水平的平均值和标准误差。另外将各组的结果进行比较，进一步通过t-检验评价结果。
(结果)
图4显示结果。图4显示结合有生育酚或胆固醇的双链核酸复合物(分别为Toc#1HDO(mMalat1)、Chol#1HDO(mMalat1))对心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、背部肌肉(Back)中的目标Malat1基因的表达抑制效果。误差条表示各个标准误差。
Toc#1HDO(mMalat1)和Chol#1HDO(mMalat1)在各种骨骼肌和心肌中均与单链的对照ASO(mMalat1)相比可见显著的目标基因的表达抑制效果。
＜实施例3＞
(目的)
对于由以DMPK基因作为目标的反义寡核苷酸与生育酚或胆固醇结合型互补链形成的双链核酸复合物剂的单次施与对组织内mRNA表达的体内(in vivo)抑制效果，与实施例1和2同样进行验证。
(方法)
(1)核酸的制备
目标基因是DMPK(dystrophia myotonica-protein kinase)基因。编码强直性肌营养不良蛋白激酶的DMPK基因作为肌营养不良中成人发病频率最高的肌紧张性营养不良的致病基因已知，存在于DMPK基因的3’非翻译区域的CTG重复序列的异常延伸被认为是该疾病的原因。
本实施例中使用的构成双链核酸复合物剂的第1核酸链和第2核酸链的名称和碱基序列示于表3。
表3
寡核苷酸名 序列(5’-3’) 序列号
第1核酸链 ASO(mDMPK) <u>A</u><sup>*</sup><u>C</u><sup>*</sup><u>A</u><sup>*</sup>a<sup>*</sup>t<sup>*</sup>a<sup>*</sup>a<sup>*</sup>a<sup>*</sup>t<sup>*</sup>a<sup>*</sup>c<sup>*</sup>c<sup>*</sup>g<sup>*</sup><u>A</u><sup>*</sup><u>G</u><sup>*</sup><u>G</u> 11
第2核酸链 Toc#1-cRNA(mDMPK) Toc-<u>c</u><sup>*</sup><u>c</u><sup>*</sup><u>u</u><sup>*</sup>CGGUAUUUAU<sup>*</sup><u>u</u><sup>*</sup><u>g</u><sup>*</sup><u>u</u> 12
第2核酸链 Chol#1-cRNA(mDMPK) Chol-<u>c</u><sup>*</sup><u>c</u><sup>*</sup><u>u</u><sup>*</sup>CGGUAUUUAU<sup>*</sup><u>u</u><sup>*</sup><u>g</u><sup>*</sup><u>u</u> 12
带下划线的大写字母:LNA(C表示5-甲基胞嘧啶LNA)；小写字母:DNA；大写字母:RNA；带下划线的小写字母:2’-O-甲基RNA；*:硫代磷酸酯键(PS键)；Toc:生育酚；Chol:胆固醇
上述第1核酸链以小鼠的DMPK基因为目标，由16mer的单链LNA/DNAgapmer构成，该单链LNA/DNAgapmer以作为该基因的转录产物的DMPK mRNA(GenBank登记号NM_032418、序列号5)作为目标，具有与2682～2697位互补的碱基序列。更具体地，该LNA/DNAgapmer的5’末端和3’末端起各3个由LNA核苷构成，它们之间的10个由DNA核苷构成。
上述第2核酸链具有与第1核酸链互补的序列，且由在其5’末端结合有生育酚的生育酚结合型互补链RNA(Toc#1-cRNA(mDMPK))、或结合有胆固醇的胆固醇结合型互补链RNA(Chol#1-cRNA(mDMPK))构成。
通过使上述第1核酸链与第2核酸链的任一者退火，制备作为本发明的双链核酸复合物剂的Toc-HDO或胆固醇结合型杂合双链寡核苷酸Chol-HDO。具体地，将第1核酸链与第2核酸链等摩尔量混合，将溶液在95℃加热5分钟，然后冷却到37℃保持1小时，由此将核酸链退火而制备上述的双链核酸复合物剂。将退火后的核酸在室温、4℃或冰上保存。将制备后的双链核酸复合物剂称为“Toc#1HDO(mDMPK)”或“Chol#1HDO(mDMPK)”。
双链核酸复合物剂的比较对象使用现有的单链反义寡核苷酸(ASO)(对照ASO)。该对照ASO具有与所述双链核酸复合物剂的第1核酸链相同的构成。将制备后的单链ASO作为“ASO(mDMPK)”。
(2)体内(in vivo)实验
施与双链核酸复合物剂等的小鼠使用体重20g的6～7周龄的雄的C57BL/6小鼠。
将双链核酸复合物剂和对照ASO通过单次施与对小鼠分别经由尾静脉以12.5mg/kg、25mg/kg、或50mg/kg的量进行静脉内注射。进而，作为阴性对照组也制作仅以单次施与注射PBS的小鼠。
(3)表达分析
在施与后72小时的时间点对小鼠灌注PBS，然后将小鼠解剖摘取心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、背部肌肉(Back)、胫骨前肌(tibialis anterior：TA)、腓肠肌(gastrocnemius：GC)、和肱三头肌(triceps brachii：TB)。接着，使用高通量全自动核酸提取装置MagNA Pure96(ロシュ·ライフサイエンス社)，按照操作指南从各组织提取mRNA。cDNA按照Transcriptor Universal cDNA Master(ロシュ·ライフサイエンス社)的操作指南合成。定量RT-PCR通过TaqMan(ロシュ·ライフサイエンス社)实施。定量RT-PCR中使用的引物，使用基于各种基因数通过サーモ·フィッシャー·サイエンティフィック社(Thermo Fisher Scientific)设计和制造的制品。PCR条件(温度和时间)是将95℃15秒、60℃30秒、和72℃1秒作为1个循环，重复40个循环。将所得的扩增产物通过定量RT-PCR进行定量，基于其结果分别计算mRNA(DMPK)的表达量/mRNA(ACTB：内标基因)的表达量，获得相对表达水平。计算出相对表达水平的平均值和标准误差。另外将各组的结果进行比较，进一步通过t-检验评价结果。
(结果)
图5～7显示结果。图5、图6和图7分别显示将结合有生育酚或胆固醇的双链核酸复合物(分别Toc#1HDO(mDMPK)、和Chol#1HDO(mDMPK))以12.5mg/kg、25mg/kg、以及50mg/kg施与时对腓肠肌(GC)、胫骨前肌(TA)、肱三头肌(TB)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、背部肌肉(Back)、和心肌(Heart)中的目标DMPK基因的表达抑制效果。误差条表示各个标准误差。
Toc#1HDO(mDMPK)和Chol#1HDO(mDMPK)在各种骨骼肌和心肌中均与单链的对照ASO(mDMPK)相比可见对目标基因的有意义的表达抑制效果。特别是Chol#1HDO(mDMPK)中，其效果用量依赖性地显著。
＜实施例4：仅DNA＞
(目的)
对于第2核酸链由DNA构成的双链核酸复合物剂，验证结合有生育酚和胆固醇的双链核酸复合物的单次施与对心肌和骨骼肌中的目标基因表达的体内(in vivo)抑制效果。
(方法)
(1)核酸的制备
本实施例的双链核酸复合物剂的基本构成在第2核酸链结合有α-生育酚和胆固醇。在第2核酸链全部由DNA构成这一点，与实施例2不同。本实施例中使用的构成双链核酸复合物剂的第1核酸链和第2核酸链的名称和碱基序列示于表4。
表4
寡核苷酸名 序列(5’-3’) 序列号
第1核酸链 ASO(mMalat1) <u>C</u><sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>A</u><sup>*</sup>g<sup>*</sup>t<sup>*</sup>t<sup>*</sup>c<sup>*</sup>a<sup>*</sup>c<sup>*</sup>t<sup>*</sup>g<sup>*</sup>a<sup>*</sup>a<sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>G</u><sup>*</sup><u>C</u> 9
第2核酸链 Toc#1-cDNA(mMalat1) Toc-<u>g</u><sup>*</sup><u>c</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup>ttcagtgaac<sup>*</sup><u>t</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup><u>g</u> 13
第2核酸链 Chol#1-cDNA(mMalat1) Chol-<u>g</u><sup>*</sup><u>c</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup>ttcagtgaac<sup>*</sup><u>t</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup><u>g</u> 13
带下划线的大写字母:LNA(C表示5-甲基胞嘧啶LNA)；小写字母:DNA；大写字母:RNA；带下划线的小写字母:2’-O-甲基RNA；*:硫代磷酸酯键(PS键)；Toc:生育酚；Chol:胆固醇
上述第1核酸链使用实施例2中制备的第1核酸链。
第2核酸链与实施例2中制备的第2核酸链的胆固醇结合型互补链RNA(Chol#1-cRNA(mMalat1))同样地，具有与第1核酸链互补的序列，且在其5’末端结合有胆固醇，但与实施例2的第2核酸链不同，全部由DNA构成。
双链核酸复合物剂的制备依照实施例2所述的方法。作为第2核酸链，将使用Toc#1-cDNA(mMalat1)制备的双链核酸复合物剂称为“Toc#1DNA/DNA”，另外将使用Chol#1-cDNA(mMalat1)制备的双链核酸复合物剂称为“Chol#1DNA/DNA”。另外，双链核酸复合物剂的比较对象使用单链反义寡核苷酸(ASO)(ASO(mMalat1))。
(2)体内(in vivo)实验
基本的步骤依照实施例2所述的方法。对小鼠以50mg/kg单次施与双链核酸复合物剂。
(3)表达分析
最终施与的72小时后，对小鼠灌注PBS，然后将小鼠解剖分别摘取心肌、股四头肌、膈的各部位。从所得的各组织的RNA提取、cDNA合成、定量RT-PCR、和malat1 mRNA的表达水平的评价依照实施例2。
(结果)
图8显示结果。图8显示结合有胆固醇的双链核酸复合物Chol#1DNA/DNA对心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)中的目标malat1基因的表达抑制效果。误差条表示各个标准误差。
即使对仅由DNA构成的第2核酸链结合胆固醇，在各种骨骼肌和心肌中，与单链的对照ASO(mMalat1)、生育酚相比，均确认了显著的目标基因的表达抑制效果。
＜实施例5＞
(目的)
与实施例4同样地，验证了第2核酸链仅由DNA构成、且由具有各种核苷间键的修饰图谱的胆固醇结合型互补链构成的双链核酸复合物的单次施与对心肌和骨骼肌中的目标基因表达的体内(in vivo)抑制效果。
(方法)
(1)核酸的制备
目标基因是malat1。本实施例中使用的构成双链核酸复合物剂的第1核酸链和第2核酸链的名称和碱基序列示于表5。
表5
寡核苷酸名 序列(5’-3’) 序列号
第1核酸链 ASO(mMalat1) <u>C</u><sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>A</u><sup>*</sup>g<sup>*</sup>t<sup>*</sup>t<sup>*</sup>c<sup>*</sup>a<sup>*</sup>c<sup>*</sup>t<sup>*</sup>g<sup>*</sup>a<sup>*</sup>a<sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>G</u><sup>*</sup><u>C</u> 9
第2核酸链 Chol#1-cDNA(mMalat1) Chol-g<sup>*</sup>c<sup>*</sup>a<sup>*</sup>ttcagtgaac<sup>*</sup>t<sup>*</sup>a<sup>*</sup>g 29
第2核酸链 Chol#1-cDNA(mMalat1)(PS) Chol-<u>g</u><sup>*</sup><u>c</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup>t<sup>*</sup>t<sup>*</sup>c<sup>*</sup>a<sup>*</sup>g<sup>*</sup>t<sup>*</sup>g<sup>*</sup>a<sup>*</sup>a<sup>*</sup>c<sup>*</sup><u>t</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup><u>g</u> 13
第2核酸链 Chol#1-cDNA(mMalat1)(P0) Chol-<u>gca</u>ttcagtgaac<u>uag</u> 13
带下划线的大写字母:LNA(C表示5-甲基胞嘧啶LNA)；小写字母:DNA；大写字母:RNA；带下划线的小写字母:2’-O-甲基RNA；*:硫代磷酸酯键(PS键)；Chol:胆固醇
Chol#1-cDNA(mMalat1)(PS)的全核苷之间为硫代磷酸酯键，Chol#1-cDNA(mMalat1)(PO)的全核苷之间为磷酸二酯键。
双链核酸复合物剂的制备依照实施例2所述的方法。作为第2核酸链，将使用Chol#1-cDNA(mMalat1)制备的双链核酸复合物剂称为“Chol#1DNA/DNA”，将使用Chol#1-cDNA(mMalat1)(PS)制备的双链核酸复合物剂称为“Chol#1DNA/DNA-PS”，并且将使用Chol#1-cDNA(mMalat1)(PO)制备的双链核酸复合物剂称为“Chol#1DNA/DNA-PO”。
(2)体内(in vivo)实验
基本的步骤依照实施例2所述的方法。对小鼠以50mg/kg单次施与双链核酸复合物剂。
(3)表达分析
在施与后72小时的时间点，对小鼠灌注PBS，然后将小鼠解剖分别摘取心肌、膈、背部肌肉的各部位。从所得的各组织的RNA提取、cDNA合成、定量RT-PCR、和malat1 mRNA的表达水平的评价依照实施例2。
(结果)
图9显示结果。根据图9，在第2核酸链仅由DNA构成的情况下，即使全核苷之间全部为硫代磷酸酯键、或全部为磷酸二酯键，在各种骨骼肌和心肌中，也与实施例4同样地，均确认了显著的目标基因的表达抑制效果。
＜实施例6＞
(目的)
验证了将第2核酸链由具有各种核苷间键的修饰图谱的胆固醇结合型互补链构成的双链核酸复合物单次施与时的心肌和骨骼肌中的体内(in vivo)抑制效果。
(方法)
(1)核酸的制备
目标基因是malat1。本实施例中使用的构成双链核酸复合物剂的第1核酸链和第2核酸链的名称和碱基序列示于表6。
表6
寡核苷酸名 序列(5’-3’) 序列号
第1核酸链 ASO(mMalat1) <u>C</u><sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>A</u><sup>*</sup>g<sup>*</sup>t<sup>*</sup>t<sup>*</sup>c<sup>*</sup>a<sup>*</sup>c<sup>*</sup>t<sup>*</sup>g<sup>*</sup>a<sup>*</sup>a<sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>G</u><sup>*</sup><u>C</u> 9
第2核酸链 Chol#1-cRNA(mMalat1)(PO) Chol-<u>gca</u>UUCAGUGAAC<u>uag</u> 10
第2核酸链 Chol#1-cRNA(mMalat1)(5’PS) Chol-<u>g</u><sup>*</sup><u>c</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup>UUCAGUGAAC<u>uag</u> 10
第2核酸链 Chol#1-cRNA(mMalat1)(3’PS) Chol-<u>gca</u>UUCAGUGAAC<sup>*</sup><u>u</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup><u>g</u> 10
带下划线的大写字母:LNA(C表示5-甲基胞嘧啶LNA)；小写字母:DNA；大写字母:RNA；带下划线的小写字母:2’-O-甲基RNA；*:硫代磷酸酯键(PS键)；Chol:胆固醇
Chol#1-cRNA(mMalat1)(PO)仅由核苷间键无修饰的硫代磷酸酯键构成，Chol#1-cRNA(mMalat1)(5’PS)和Chol#1-cRNA(mMalat1)(3’PS)具有从分别结合有胆固醇的5’末端和3’末端起3核苷之间通过硫代磷酸酯键(PS)连接的构成。
双链核酸复合物剂的制备依照实施例2所述的方法。作为第1核酸链使用ASO(mMalat1)，另外作为第2核酸链，将使用Chol#1-cRNA(mMalat1)(PO)制备的双链核酸复合物剂称为“Chol#1HDO(PO)”，将使用Chol#1-cRNA(mMalat1)(5’PS)制备的双链核酸复合物剂称为“Chol#1HDO(5’PS)”，并且将使用Chol#1-cRNA(mMalat1)(3’PS)制备的双链核酸复合物剂称为“Chol#1HDO(3’PS)”。
(2)体内(in vivo)实验
基本的步骤依照实施例2所述的方法。对小鼠以50mg/kg单次施与双链核酸复合物剂。另外，作为阴性对照组，制作了仅施与PBS的小鼠。
(3)表达分析
在施与后72小时的时间点，对小鼠灌注PBS，然后将小鼠解剖分别摘取心肌、股四头肌、膈、背部肌肉的各部位。从所得的各组织的RNA提取、cDNA合成、定量RT-PCR、和malat1mRNA的表达水平的评价依照实施例2。
(结果)
图10显示结果。图10显示结合有胆固醇的双链核酸复合物Chol#1HDO(PO)、Chol#1HDO(5’PS)、以及Chol#1HDO(3’PS)对心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、背部肌肉(Back)中的目标Malat1基因的表达抑制效果。误差条表示各个标准误差。
任意双链核酸复合物均能够显著抑制malat1非编码RNA的表达。特别是在如Chol#1HDO(3’PS)那样从3’末端起具有修饰核苷间键的情况下，显示表达抑制活性增加的倾向。
＜实施例7＞
(目的)
对于由以malat1基因作为目标的反义寡核苷酸与生育酚或胆固醇结合型互补链形成的双链核酸复合物剂的多次施与对组织内mRNA表达的体内(in vivo)抑制效果进行验证。
(方法)
(1)核酸的制备
双链核酸复合物剂使用实施例2中制备的Toc#1HDO(mMalat1)和Chol#1HDO(mMalat1)，单链的对照ASO使用ASO(mMalat1)。
(2)体内(in vivo)实验
施与双链核酸复合物剂等的小鼠使用体重20g的6～7周龄的雄的C57BL/6小鼠。
将双链核酸复合物剂和对照ASO以每1次施与50mg/kg的量对小鼠经由尾静脉进行静脉内注射。施与每周进行1次，经4周进行共计4次。进而，作为阴性对照组也制作仅以单次施与注射PBS的小鼠。
(3)表达分析
在最终施与后72小时的时间点对小鼠灌注PBS，然后将小鼠解剖摘取心肌、股四头肌、膈、和背部肌肉。接着，使用高通量全自动核酸提取装置MagNA Pure 96(ロシュ·ライフサイエンス社)，按照操作指南从各组织提取mRNA。cDNA按照Transcriptor UniversalcDNA Master(ロシュ·ライフサイエンス社)的操作指南合成。定量RT-PCR通过TaqMan(ロシュ·ライフサイエンス社)实施。定量RT-PCR中使用的引物，使用基于各种基因数通过サーモ·フィッシャー·サイエンティフィック社(Thermo FisherScientific)设计和制造的制品。PCR条件(温度和时间)是将95℃15秒、60℃30秒、和72℃1秒作为1个循环，重复40个循环。将所得的扩增产物通过定量RT-PCR进行定量，基于其结果分别计算mRNA(malat1)的表达量/mRNA(ACTB：内标基因)的表达量，获得相对表达水平。计算出相对表达水平的平均值和标准误差。另外将各组的结果进行比较，进一步通过t-检验评价结果。
(结果)
图11显示结果。图11显示结合有生育酚或胆固醇的双链核酸复合物(分别Toc#1HDO(mMalat1)、Chol#1HDO(mMalat1))对心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、背部肌肉(Back)中的目标Malat1基因的表达抑制效果。误差条表示各个标准误差。
明确了Toc#1HDO(mMalat1)和Chol#1HDO(mMalat1)在各种骨骼肌和心肌中均通过多次的施与而进一步增强目标基因(malat1)表达抑制效果。
＜实施例8＞
(目的)
对于由以DMPK基因作为目标的反义寡核苷酸与胆固醇结合型互补链形成的双链核酸复合物剂的多次施与对组织内mRNA表达的体内(in vivo)抑制效果进行验证。
(方法)
(1)核酸的制备
双链核酸复合物剂使用实施例3中制备的Chol#1HDO(mDMPK)。
(2)体内(in vivo)实验
施与双链核酸复合物剂等的小鼠使用体重20g的6～7周龄的雄的C57BL/6小鼠。
将双链核酸复合物剂以每1次施与50mg/kg的量对小鼠经由尾静脉进行静脉内注射。施与每周2次共计进行4次。进而，作为阴性对照组也制作仅以单次施与注射PBS的小鼠。
(3)表达分析
在最终施与后72小时的时间点，对小鼠灌注PBS，然后将小鼠解剖分别摘取心肌、股四头肌、膈、背部肌肉的各部位。从所得的各组织的RNA提取、cDNA合成、定量RT-PCR、和DMPK mRNA的表达水平的评价依照实施例8。
(结果)
图12显示结果。图12显示结合有胆固醇的双链核酸复合物(Chol#1HDO(mDMPK))对心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、背部肌肉(Back)中的目标DMPK基因的表达抑制效果。误差条表示各个标准误差。
明确了Chol#1HDO(mDMPK)在各种骨骼肌和心肌中与阴性对照(仅PBS)相比，均通过多次的施与而进一步增强目标基因(DMPK)表达抑制效果。
＜实施例9＞
(目的)
验证了双链核酸复合物剂的单次施与对心肌和骨骼肌的组织内的mRNA表达的长期体内抑制效果的评价实验。
(方法)
(1)核酸的制备
双链核酸复合物剂使用实施例2中制备的Chol#1HDO(mMalat1)。
(2)体内(in vivo)实验
将双链核酸复合物剂通过与实施例2同样的方法对小鼠进行单次施与。
(3)表达分析
在施与后3天、7天、14天、28天、56天、和168天的时间点对小鼠灌注PBS，然后将小鼠解剖摘取心肌、股四头肌、膈、背部肌肉、肝脏、肾脏、大肠、和肺。从所得的各组织的RNA提取、cDNA合成、和定量RT-PCR、和malat1非编码RNA的表达水平的评价依照实施例2所述的方法。
(结果)
图13和14显示结果。
图13是显示结合有胆固醇的双链核酸复合物对心肌、和骨骼肌部位中的目标基因(malat1)的表达抑制效果的图。纵轴显示malat1非编码RNA的相对表达量、横轴显示施与后的经过时间(天)。误差条表示各个标准误差。图13a是心肌(Heart)、图13b是背部肌肉(Back)、图13c是股四头肌(Quadriceps)、图13d是膈(Diaphragm)。
图14显示与阴性对照(仅PBS)比较时的施与后第8周(56天)的各组织中的malat1非编码RNA的相对表达量。
由图13和14表明，Chol#1HDO(mMalat1)与阴性对照相比，在心肌、股四头肌、膈、背部肌肉的任一者中都长时间地显著抑制malat1非编码RNA的表达。另外判明了，其效果在骨骼肌中即使施与后经过8周也持续。
＜实施例10＞
(目的)
验证了将双链核酸复合物以各种用量单次施与时对心肌和骨骼肌的组织内的mRNA表达的体内(in vivo)抑制效果。
(方法)
(1)核酸的制备
使用实施例2中制备的双链核酸复合物剂Chol#1HDO(mMalat1)。
(2)体内(in vivo)实验
将双链核酸复合物剂Chol#1HDO(mMalat1)通过单次施与对小鼠经由尾静脉以12.5mg/kg、25.0mg/kg、50mg/kg或75mg/kg的量进行静脉内注射。
(3)表达分析
在施与72小时后，对小鼠灌注PBS，然后将小鼠解剖分别摘取心肌、股四头肌、膈、背部肌肉的各部位。从所得的各组织的RNA提取、cDNA合成、定量RT-PCR、和malat1 mRNA的表达水平的评价依照实施例2。
(结果)
结果示于图15。表明Chol#1HDO(mMalat1)在心肌和骨骼肌的任一者中，都能够用量依赖性地抑制malat1非编码RNA的表达。
＜实施例11＞
(目的)
验证了第2核酸链结合有胆固醇和饱和脂肪酸基的双链核酸复合物剂对心肌和骨骼肌的组织内的mRNA表达通过单次施与的体内(in vivo)抑制效果。
(方法)
(1)核酸的制备
目标基因与实施例2同样地为malat1。本实施例中使用的构成双链核酸复合物剂的第1核酸链使用实施例2所述的第1核酸链、即以作为小鼠的malat1基因的转录产物的malat1非编码RNA作为目标的16mer的单链LNA/DNAgapmerASO(mMalat1)。另一方面，第2核酸链具有与第1核酸链互补的序列，且是在其5’末端或3’末端结合有胆固醇的链，具有由碳数为6个饱和脂肪酸基(己基)构成的接头(C6)存在于胆固醇与第2核酸链的末端之间的构成。第2核酸链的各个名称如表7。
表7
寡核苷酸名 序列(5’-3’) 序列号
第1核酸链 ASO(mMalat1) <u>C</u><sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>A</u><sup>*</sup>g<sup>*</sup>t<sup>*</sup>t<sup>*</sup>c<sup>*</sup>a<sup>*</sup>c<sup>*</sup>t<sup>*</sup>g<sup>*</sup>a<sup>*</sup>a<sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>G</u><sup>*</sup><u>C</u> 9
第2核酸链 5’Chol(C6)-cRNA(mMalat1) Chol(C6)-<u>g</u><sup>*</sup><u>c</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup>UUCAGUGAAC<sup>*</sup><u>u</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup><u>g</u> 10
第2核酸链 3’Chol(C6)-cRNA(mMalat1) <u>g</u><sup>*</sup><u>c</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup>UUCAGUGAAC<sup>*</sup><u>u</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup><u>g</u>-Chol(C6) 10
带下划线的大写字母:LNA(C表示5-甲基胞嘧啶LNA)；小写字母:DNA；大写字母:RNA；带下划线的小写字母:2’-O-甲基RNA；*:硫代磷酸酯键(PS键)；Chol:胆固醇
通过使上述第1核酸链与第2核酸链5’Chol(C6)-cRNA(mMalat1)或3’Chol(C6)-cRNA(mMalat1)的任一者退火，从而制备本发明的双链核酸复合物剂。关于具体的制备方法，依照实施例2。将所制备的双链核酸复合物剂称为5’Chol(C6)HDO和3’Chol(C6)HDO。
(2)体内(in vivo)实验
基本的步骤依照实施例2所述的方法。对小鼠以50mg/kg单次施与双链核酸复合物剂。
(3)表达分析
在施与后72小时的时间点对小鼠灌注PBS，然后将小鼠解剖摘取心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、和背部肌肉(Back)。从所得的各组织的RNA提取、cDNA合成、和定量RT-PCR、和malat1的表达水平的评价依照实施例2所述的方法。
(结果)
图16显示结果。在C6接头存在于第2核酸链的末端与胆固醇之间的情况下，也确认了双链核酸复合物剂对心肌和骨骼肌的组织内的mRNA表达通过单次施与的体内(in vivo)抑制效果。该效果在结合于5’末端侧的情况下显示更强的效果。
＜实施例12＞
(目的)
验证了相对于目标基因的长度不同的双链核酸复合物剂的组织内mRNA表达的体内(in vivo)抑制效果。
(方法)
(1)核酸的制备
目标基因与实施例2同样地为malat1。本实施例中使用的构成双链核酸复合物剂的第1核酸链使用实施例2所述的第1核酸链、即以作为小鼠的malat1基因的转录产物的malat1非编码RNA作为目标的13mer和16mer的单链LNA/DNAgapmerASO(mMalat1)。第2核酸链是各第1核酸链的互补链，具有5’末端结合有胆固醇的构成。本实施例中使用的第1核酸链和第2核酸链的名称和序列示于表8。
表8
寡核苷酸名 序列(5’-3’) 序列号
第1核酸链 ASO(mMalat1)16mer <u>C</u><sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>A</u><sup>*</sup>g<sup>*</sup>t<sup>*</sup>t<sup>*</sup>c<sup>*</sup>a<sup>*</sup>c<sup>*</sup>t<sup>*</sup>g<sup>*</sup>a<sup>*</sup>a<sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>G</u><sup>*</sup><u>C</u> 9
第2核酸链 Chol#1-cRNA(mMalat1)16mer Chol-g<sup>*</sup>c<sup>*</sup>a<sup>*</sup>UUCAGUGAAC<sup>*</sup>u<sup>*</sup>a<sup>*</sup>g 30
第1核酸链 ASO(mMalat1)13mer <u>G</u><sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup>c<sup>*</sup>a<sup>*</sup>c<sup>*</sup>t<sup>*</sup>g<sup>*</sup>a<sup>*</sup>a<sup>*</sup>t<sup>*</sup><u>G</u><sup>*</sup><u>C</u> 14
第2核酸链 Chol#1-cRNA(mMalat1)13mer Chol-<u>g</u><sup>*</sup><u>c</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup>UUCAGUGA<sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup><u>c</u> 15
带下划线的大写字母:LNA(C表示5-甲基胞嘧啶LNA)；小写字母:DNA；大写字母:RNA；带下划线的小写字母:2’-O-甲基RNA；*:硫代磷酸酯键(PS键)；Chol:胆固醇
将所制备的16mer和13mer的双链核酸复合物剂分别称为“16mer Chol-HDO”和“13mer Chol-HDO”。
(2)体内(in vivo)实验
基本的步骤依照实施例2所述的方法。对小鼠以50mg/kg单次施与双链核酸复合物剂。
(3)表达分析
在施与后72小时的时间点对小鼠灌注PBS，然后将小鼠解剖摘取心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、和背部肌肉(Back)。从所得的各组织的RNA提取、cDNA合成、和定量RT-PCR、和malat1的表达水平的评价依照实施例2所述的方法。
(结果)
图17显示结果。图17是显示针对目标基因的长度不同的双链核酸复合物剂对全身的心肌/骨骼肌部位中的目标基因(malat1)表达抑制效果的图。显示心肌、股四头肌、膈、背部肌肉的结果。误差条显示标准误差。
确认了13mer Chol-HDO和16merChol-HDO均与阴性对照PBS相比可见明显的表达抑制效果。特别是13mer Chol-HDO中可见显著的效果。
＜实施例13＞
(目的)
验证了双链核酸复合物的单次皮下施与的长期体内(in vivo)表达抑制效果。
(方法)
(1)核酸的制备
使用实施例2中制备的双链核酸复合物剂Chol#1HDO(malat1)。
(2)体内(in vivo)实验
基本的步骤依照实施例7所述的方法，但本实施例中，以50mg/kg将双链核酸复合物剂对小鼠单次进行皮下施与。
(3)表达分析
在皮下施与后的7天、14天、和28天的时间点，对小鼠灌注PBS，然后将小鼠解剖摘取心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、和膈(Diaphragm)。从所得的各组织的RNA提取、cDNA合成、和定量RT-PCR、和malat1的表达水平的评价依照实施例2所述的方法。
(结果)
结果示于图18。图18是显示皮下施与双链核酸复合物剂时的心肌、股四头肌、和膈中的目标基因(malat1)的表达抑制效果的图。误差条表示标准误差。
证明了本发明的双链核酸复合物剂不仅通过静脉注射，通过皮下施与也能够长期维持目标基因的表达抑制效果。
＜实施例14＞
(目的)
对于本发明的胆固醇结合型双链核酸复合物、和胆固醇结合型ASO的施与对生物体的毒性进行验证。
(方法)
(1)核酸的制备
将本实施例中使用的构成单链核酸复合物的第1核酸链的名称和碱基序列示于表9。
表9
寡核苷酸名 序列(5’-3’) 序列号
第1核酸链 ASO(mMalat1) <u>C</u><sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>A</u><sup>*</sup>g<sup>*</sup>t<sup>*</sup>t<sup>*</sup>c<sup>*</sup>a<sup>*</sup>c<sup>*</sup>t<sup>*</sup>g<sup>*</sup>a<sup>*</sup>a<sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>G</u><sup>*</sup><u>C</u> 9
第1核酸链 5’-Chol-DNA-ASO(mMalat1) Chol-cttc<u>C</u><sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>A</u><sup>*</sup>g<sup>*</sup>t<sup>*</sup>t<sup>*</sup>c<sup>*</sup>a<sup>*</sup>c<sup>*</sup>t<sup>*</sup>g<sup>*</sup>a<sup>*</sup>a<sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>G</u><sup>*</sup><u>C</u> 16
第1核酸链 3’-Chol-ASO(mMalat1) <u>C</u><sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>A</u><sup>*</sup>g<sup>*</sup>t<sup>*</sup>t<sup>*</sup>c<sup>*</sup>a<sup>*</sup>c<sup>*</sup>t<sup>*</sup>g<sup>*</sup>a<sup>*</sup>a<sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>G</u><sup>*</sup><u>C</u>-Chol 9
第1核酸链 3’-Chol-DNA-ASO(mMalat1) <u>C</u><sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>A</u><sup>*</sup>g<sup>*</sup>t<sup>*</sup>t<sup>*</sup>c<sup>*</sup>a<sup>*</sup>c<sup>*</sup>t<sup>*</sup>g<sup>*</sup>a<sup>*</sup>a<sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup><u>G</u><sup>*</sup><u>C</u>cttc-Chol 17
第2核酸链 Chol#1-cRNA(mMalat1) Chol-<u>g</u><sup>*</sup><u>c</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup>UUCAGUGAAC<sup>*</sup><u>u</u><sup>*</sup><u>a</u><sup>*</sup><u>g</u> 10
带下划线的大写字母:LNA(C表示5-甲基胞嘧啶LNA)；小写字母:DNA；大写字母:RNA；带下划线的小写字母:2’-O-甲基RNA；*:硫代磷酸酯键(PS键)；Chol:胆固醇
上述第1核酸链具有在以小鼠的malat1基因作为目标的上述的实施例记载的ASO(mMalat1)中，在其5’末端或3’末端介由或不介由DNA接头(ccttc)而结合有胆固醇的构成。
(2)体内(in vivo)实验
基本的步骤依照实施例2所述的方法。对小鼠以50mg/kg对皮下和静脉单次施与双链核酸复合物剂。
(3)表达分析
在施与后72小时的时间点从各小鼠采血，外订委托LSIメディエンス社进行血细胞计数的测定。
(结果)
结果示于图19和20。图19是显示上述的单链核酸复合物剂、阳性对照用的双链核酸复合物剂Chol#1HDO(mMalat1)和阴性对照用的PBS对心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、和背部肌肉(Back)中的malat1基因的表达抑制效果的图。s.c.表示皮下施与。误差条表示标准误差。Chol-HDO和Chol-HDOs.c.均与阴性对照PBS相比，在心肌、股四头肌、膈、和背部肌肉的任一者中均确认了目标基因(malat1基因)的明显的表达抑制效果。另外，与单链核酸复合物(3’-Chol-DNA-ASO(mMalat1))相比，本发明的双链核酸复合物(Chol-HDO(mMalat1))也有意义地抑制目标基因的表达。特别是在皮下施与单链核酸复合物的情况(3’-Chol-DNA-ASO(mMalat1)s.c.)下，不能确认目标基因的表达抑制，但在皮下施与本发明的双链核酸复合物的情况(Chol-HDO(mMalat1)s.c.)下，确认了强的抑制效果。
图20是显示各核酸复合物施与后的血中的血小板数的图。s.c.表示皮下施与，另外i.v.表示静脉施与。与末端结合有胆固醇的单链核酸复合物(5’-Chol-DNA-ASO(mMalat1)、3’-Chol-DNA-ASO(mMalat1))相比，本发明的双链核酸复合物(5’-Chol-HDO(mMalat1)i.v.、5’-Chol-HDO(mMalat1)s.c.)未见血小板数的降低。该结果提示，本发明的双链核酸复合物与单链核酸复合物相比，对生物体的毒性低。
＜实施例15＞
(目的)
目的是评价由以mdx小鼠(杜氏肌营养不良模型小鼠)的外显子23/内含子23边界区域作为外显子跳读的目标的反义寡核苷酸(吗啉基寡聚物)与生育酚结合型互补链形成的双链核酸复合物的多次施与产生的、全身肌肉中的外显子跳读效果和抗肌萎缩蛋白(dystrophin)表达。
进行了评价由以小鼠抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因外显子23/内含子23作为目标的反义寡核苷酸与生育酚结合型互补链形成的双链核酸剂产生的组织内外显子跳读表达诱导的体内(in vivo)效果和抗肌萎缩蛋白(dystrophin)蛋白质的表达的实验。
(方法)
(1)核酸的制备
将双链核酸复合物剂与现有的单链反义寡核苷酸(ASO)对照进行比较。对照(ASO)为以小鼠抗肌萎缩蛋白(dystrophin)(dystrophin)基因的前体mRNA的外显子23/内含子23作为目标的25mer的单链吗啉基。该ASO的25mer全部由吗啉基构成。该吗啉基具有与小鼠的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)前体mRNA(GenBank登记号:NC_000086.7)的83803536～83803512位互补的碱基序列。通过使该吗啉基(第1链)与生育酚结合型Toc#1-cRNA(mDystrophin)退火，从而制备作为双链核酸剂的生育酚结合型杂合双链寡核苷酸(Tocopherol-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Toc-HDO)。将第1链与第2链以等摩尔量混合，将溶液在95℃加热5分钟，然后冷却到37℃保持1小时，由此将核酸链退火而制备上述的双链核酸剂。将退火后的核酸在4℃或冰上保存。将所制备的双链核酸剂称为Toc#1HDO。
将本实施例中使用的第1链和第2链的名称和碱基序列示于表10。
表10
寡核苷酸名 序列(5’-3’) 序列号
第1核酸链 PMO(mDystrophin) ggccaaacctcggcttacctgaaat 18
第2核酸链 Toc#1-cRNA(mDystrophin) Toc-<u>a</u><sup>*</sup><u>u</u><sup>*</sup><u>u</u><sup>*</sup>UCAGGUAAGCCGAGGUUUG<sup>*</sup><u>g</u><sup>*</sup><u>c</u><sup>*</sup><u>c</u> 19
斜体小写字母:吗啉基；大写字母:RNA；带下划线的小写字母:2’-O-甲基RNA；*:硫代磷酸酯键(PS键)；Toc:生育酚
(2)体内(in vivo)实验
小鼠是mdx体重20g的6～7周龄的雄的mdx小鼠。使用小鼠的实验全部以n＝4实施。将Toc#1HDO对小鼠经由静脉以100mg/kg的量进行静脉内注射。每周1次共计施与5次。进而，作为阴性对照组，也制作了代替Toc#1HDO而仅注射PBS、和PMO的小鼠。
(3)表达分析
在最终施与2周之后，对mdx小鼠灌注PBS，然后将小鼠解剖摘取心肌、股四头肌、膈、和背部肌肉。接着，用Isogen从各组织提取mRNA。对提取的总RNA 200ng使用Qiagen OneStep RT-PCR Kit(Qiagen社制)进行一步法RT-PCR。按照试剂盒所附带的操作指南制备反应液。热循环仪使用LifeECO(Bioer Technology社制)。所使用的RT-PCR的程序在42℃30分钟进行逆转录反应之后，在95℃15分钟进行热变性，接着，以[94℃30秒；60℃30秒；72℃60秒]作为1个循环进行35个循环PCR扩增反应，在72℃7分钟进行最后的延伸反应。
RT-PCR中使用的正向(Fw)引物和反向(Rv)引物的碱基序列如下。
·Fw引物：5’-ATCCAGCAGTCAGAAAGCAAA-3’(序列号20)
·Rv引物：5’-CAGCCATCCATTTCTGTAAGG-3’(序列号21)
将上述RT-PCR的反应产物1μL使用Bioanalyzer2100(Agilent社制)，使用AgilentDNA1000试剂盒进行分析。Bioanalyzer2100的电泳图示于图21。测定外显子23被跳读了的条带(箭形符号)的多核苷酸量“A”、和外显子23未被跳读的条带(箭头符号)的多核苷酸量“B”。
在Mdx小鼠中，外显子23存在异常的终止密码子。因此，在外显子23未被跳读的mRNA(B)中，其以后的外显子不被翻译，不表达正常的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)。另一方面，在外显子23被跳读了的mRNA(A)虽然不包含外显子23、成为短的mRNA，但正常的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)表达。基于这些“A”和“B”的测定值，按照以下式求出跳读效率。
·跳读效率(％)＝A/(A+B)×100
将肌肉标本在低温恒温器(Leica CM3050 S)中以25μM×40枚切片之后，用150μL的缓冲液(125mM Tris-HCl pH 6.4,10％glycerol,4％SDS,4M urea,10％巯基乙醇,0.005％BPB,H2O)溶解。
接着，进行超声波破碎，以100℃×3分钟加温，以10000g×5分钟离心之后，回收上清。
使用4-15％gradient 10well(Mini-PROTEAN(注册商标)TGX Precast Gels)将蛋白进行电泳。转移到膜之后，一抗使用兔抗抗肌萎缩蛋白抗体(anti-Dystrophinantibody；Abcam ab15277-rabbit)，二抗使用HRP结合-山羊抗兔IgG抗体(HRPconjugated-Goat anti-Rabbit IgG；Jackson lab)，进行蛋白质印迹(Westernblotting)。最终用SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate(Thermofisher)ChemiDoc成像系统(Biorad)评价发光。
接着，将肌肉标本在低温恒温器(Leica CM3050 S)制成10μM厚的薄层切片，放置于覆盖物滑片(MAS-02松浪工业)上。在冷却至-30℃的丙酮中将载玻片浸泡10分钟而冷却之后，加入TBS浸泡标本，使其融合。接着，用5％山羊血清封闭，用作为一抗溶液的兔抗抗肌萎缩蛋白抗体(anti-Dystrophin antibody；Abcam ab15277-rabbit)(1/400)/5％山羊血清/0.25％Tween 20/TBS处理，孵育一晚。将一抗溶液用0.25％Tween 20/TBS洗涤3次之后，用作为二抗溶液的山羊抗兔IgG抗体(Invitrogen；Alexa Fluor 568)(1/1000)/5％山羊血清/0.25％Tween 20/TBS孵育1小时。将二抗溶液用0.25％Tween 20/TBS洗涤3次，用VECTASHIELD封入之后，用基恩士(BZ-X700)观察，进行免疫染色图的照片拍摄。
(结果)
跳读率的结果示于图22，蛋白质印迹(Western Blot)图示于图23，并且免疫染色图示于图24。根据图22，在(a)心脏(Heart)中，基本没有发现由单链核酸复合物剂(PMO)产生的外显子跳读，但对于本发明的双链核酸复合物剂(Toc-HDO)观察到27％以上的外显子跳读。另外，在图22(b)～(f)所示的其他骨骼肌中，对于本发明的双链核酸复合物剂(Toc-HDO)也观察到单链核酸复合物剂(PMO)的2至4倍的外显子跳读。在图23的蛋白质印迹(Western Blot)中，也在(a)心脏和(b)股四头肌中观察到与单链核酸复合物剂(PMO)相比利用双链核酸复合物剂(Toc-HDO)时抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的表达更多。进而，在图24的免疫染色图中，也在心脏(a)、(b)和股四头肌(c)、(d)中，与图23同样地观察到与单链核酸复合物剂(PMO)(a)、(c)相比利用双链核酸复合物剂(Toc-HDO)(b)、(d)时抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的表达更多。
＜实施例16＞
(目的)
目的是评价由以mdx小鼠的外显子23/内含子23边界区域作为外显子跳读的目标的反义寡核苷酸(吗啉基寡聚物)与胆固醇结合型互补链形成的双链核酸复合物(Chol-HDO)的单次施与产生的、全身肌肉中的外显子跳读效果和抗肌萎缩蛋白(dystrophin)表达。基本的评价方法依照实施例15。
(方法)
(1)核酸的制备
使用的双链核酸复合物剂的第1链使用实施例15中制备的。通过使该第1链与胆固醇结合型Chol#1-cRNA(mDystrophin)退火，从而制备作为双链核酸剂的胆固醇结合型杂合双链寡核苷酸(cholesterol-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Chol-HDO)。将第1链与第2链以等摩尔量混合，将溶液在95℃加热5分钟，然后冷却到37℃保持1小时，由此将核酸链退火而制备上述的双链核酸剂。将退火后的核酸在4℃或冰上保存。将所制备的双链核酸剂称为Chol#1HDO。
本实施例中使用的第1核酸链和第2核酸链的名称和碱基序列示于表11。
表11
寡核苷酸名 序列(5’-3’) 序列号
第1核酸链 PMO(mDystrophin) ggccaaacctcggcttacctgaaat 18
第2核酸链 Chol#1-cRNA(mDystrophin) Chol-<u>a</u><sup>*</sup><u>u</u><sup>*</sup><u>u</u><sup>*</sup>UCAGGUAAGCCGAGGUUUG<sup>*</sup><u>g</u><sup>*</sup><u>c</u><sup>*</sup><u>c</u> 19
斜体小写字母:吗啉基；大写字母:RNA；带下划线的小写字母:2’-O-甲基RNA；*:硫代磷酸酯键(PS键)；Chol:胆固醇
(2)体内(in vivo)实验
小鼠使用体重20g的6～7周龄的雄的mdx小鼠。实验全部以n＝1实施。将Chol#1HDO对小鼠经由眼窝静脉以100mg/kg的量进行静脉内注射。施与次数为单次施与。进而，作为阴性对照组，也制作了代替Chol#1HDO注射了仅PBS、PMO、和注射了Toc-HDO的小鼠作为比较对照。
(3)表达分析
表达分析依照实施例15所述的方法。
(结果)
将结果示于图25。心脏(a)中Chol-HDO与Toc-HDO效果上无差异，但在骨骼肌(b)～(e)中，Chol-HDO比Toc-PMO外显子跳读效果高。
＜实施例17＞
(目的)
目的是评价由以mdx小鼠的外显子23/内含子23边界区域作为外显子跳读的目标的反义寡核苷酸(mixmer寡聚物)与生育酚结合型互补链形成的双链核酸复合物的单次皮下施与产生的全身肌肉中的外显子跳读效果和抗肌萎缩蛋白(dystrophin)表达。基本的评价方法依照实施例15。
(方法)
(1)核酸的制备
将双链核酸复合物剂与现有的单链反义寡核苷酸(ASO)对照进行比较。对照(ASO)是以小鼠抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因的前体mRNA的外显子23/内含子23作为目标的13mer的单链mixmer。该ASO由LNA与DNA构成，具有与小鼠的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)前体mRNA(GenBank登记号:NC_000086.7)互补的碱基序列。通过以所述mixmer作为第1链，与生育酚结合型Toc#1-cRNA(mDystrophin)退火，从而制备作为双链核酸剂的生育酚结合型杂合双链寡核苷酸(Tocopherol-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Toc-HDO)。将第1链与第2链以等摩尔量混合，将溶液在95℃加热5分钟，然后冷却到37℃保持1小时，由此将核酸链退火而制备上述的双链核酸剂。将退火后的核酸在4℃或冰上保存。将所制备的双链核酸剂称为Toc#2HDO。
本实施例中使用的第1核酸链和第2核酸链的名称和碱基序列示于表12。
表12
寡核苷酸名 序列(5’-3’) 序列号
第1核酸链 mixmer(mDystrophin) a<sup>*</sup><u>C</u><sup>*</sup>c<sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup>c<sup>*</sup><u>G</u><sup>*</sup>g<sup>*</sup><u>C</u><sup>*</sup>t<sup>*</sup><u>T</u><sup>*</sup>a<sup>*</sup><u>C</u><sup>*</sup>c 22
第2核酸链 Toc#1-cRNA(mDystrophin) Toc-<u>g</u><sup>*</sup><u>g</u><sup>*</sup><u>t</u><sup>*</sup>AAGCCGA<sup>*</sup><u>g</u><sup>*</sup><u>g</u><sup>*</sup><u>t</u> 23
带下划线的大写字母:LNA(C表示5-甲基胞嘧啶LNA)；小写字母:DNA；大写字母:RNA；带下划线的小写字母:2’-O-甲基RNA；*:硫代磷酸酯键(PS键)；Toc:生育酚
(2)体内(in vivo)实验
小鼠使用mdx体重20g的6～7周龄的雄的mdx小鼠。实验全部以n＝2实施。将Toc#2HDO对小鼠以100mg/kg的量进行皮下注射。施与次数为1次。进而，作为阴性对照组，也制作了代替Toc#2HDO注射了仅PBS、和单链mixmer的小鼠。
(3)表达分析
表达分析依照实施例17所述的方法。
(结果)
结果示于图26。表明以心脏(a)为代表，在骨骼肌(b)～(e)中，作为双链mixmer的Toc#2HDO(Toc-mixmer)也与单链mixmer(mixmer)相比具有更高的外显子跳读效果。
＜实施例18＞
(目的)
以malat1基因作为目标，通过由第2核酸链结合有胆固醇的双链核酸复合物形成的双链核酸复合物剂(Chol#1HDO(mMalat1))、和使第1核酸链与胆固醇结合型互补链用RNA接头结合而得的单链核酸自身退火而得的核酸分子的单次施与，对于组织内mRNA表达的体内(in vivo)抑制效果进行验证。
(方法)
(1)核酸的制备
目标基因是malat1。双链核酸复合物剂使用实施例2中制备的Chol#1HDO(mMalat1)。使第1核酸链(ASO)与互补链(胆固醇结合cRNA)Chol#1-cRNA(mMalat1)用RNA接头结合而得的单链核酸的名称和碱基序列示于表13。通过使该单链核酸如图1c所述那样自身退火，从而制备Chol#1sHDO(mMalat1)(或CholsHDO)。具体地，将Chol#1-sHDO(mMalat1)溶液在95℃加热5分钟，然后冷却到37℃保持1小时，由此使核酸链自身退火而制备。将退火后的核酸在室温、4℃或冰上保存。将制备而得的核酸称为“Chol#1sHDO(mMalat1)”。
表13
Figure BDA0003286202780000641
带下划线的大写字母:LNA(C表示5-甲基胞嘧啶LNA)；小写字母:DNA；大写字母:RNA；带下划线的小写字母:2’-O-甲基RNA；*:硫代磷酸酯键(PS键)；Chol:胆固醇
(2)体内(in vivo)实验
基本的步骤依照实施例2所述的方法。对小鼠以ASO换算为50mg/kg进行单次施与。
(3)表达分析
在施与后72小时的时间点，对小鼠灌注PBS，然后将小鼠解剖分别摘取心肌、股四头肌、膈、背部肌肉的各部位。从所得的各组织的RNA提取、cDNA合成、定量RT-PCR、和malat1mRNA的表达水平的评价依照实施例2。
(结果)
图27显示结果。根据图27，使第1核酸链与互补链(胆固醇结合)用RNA接头结合而得的单链核酸，也在各种骨骼肌和心肌中，与由胆固醇结合型互补链形成的双链核酸复合物剂同等地，均确认了显著的目标基因的表达抑制效果。
＜实施例19＞
(目的)
以malat1基因作为目标，通过单次施与第2核酸链结合有胆固醇的双链核酸复合物形成的双链核酸复合物剂(Chol#1HDO(mMalat1))，以及第2核酸链具有与第1核酸链互补的序列、且作为在其3’末端结合有胆固醇的链具有由四甘醇组成的接头(TEG)存在于胆固醇与第2核酸链的末端之间的构成的核酸(3’Chol(TEG)HDO(mMalat1))，对于组织内mRNA表达的体内(in vivo)抑制效果进行验证。
(1)核酸的制备
目标基因与实施例2同样地为malat1。实施例2中使用的双链核酸复合物剂(Chol#1HDO(mMalat1))和第1核酸链，使用实施例2所述的第1核酸链、即作为小鼠的malat1基因的转录产物的以malat1非编码RNA作为目标的16mer的单链LNA/DNAgapmerASO(mMalat1)。另一方面，通过使上述第1核酸链与第2核酸链3’Chol(TEG)-cRNA(mMalat1)退火，从而制备本发明的双链核酸复合物剂。关于具体的制备方法，依照实施例2。将所制备的双链核酸复合物剂称为“3’Chol(TEG)HDO”。第1和第2核酸链的各自的名称和碱基序列如表14。
表14
Figure BDA0003286202780000651
带下划线的大写字母:LNA(C表示5-甲基胞嘧啶LNA)；小写字母:DNA；大写字母:RNA；带下划线的小写字母:2’-O-甲基RNA；*:硫代磷酸酯键(PS键)；Chol:胆固醇
(2)体内(in vivo)实验
基本的步骤依照实施例2所述的方法。对小鼠以50mg/kg单次施与双链核酸复合物剂。
(3)表达分析
在施与后72小时的时间点对小鼠灌注PBS，然后将小鼠解剖摘取心肌(Heart)、股四头肌(Quadriceps)、膈(Diaphragm)、和背部肌肉(Back)。从所得的各组织的RNA提取、cDNA合成、和定量RT-PCR、和malat1的表达水平的评价依照实施例2所述的方法。
(结果)
图28显示结果。该效果在结合于3’末端侧的情况下效果减弱，因此结合于5’末端侧是重要的。
＜实施例20＞
(目的)
目的在于通过由以mdx小鼠的外显子23/内含子23边界区域作为外显子跳读的目标的反义寡核苷酸(吗啉基寡聚物)、与胆固醇结合型互补链或生育酚结合型互补链形成的双链核酸复合物(Chol-HDO或Toc-HDO)的多次施与，评价对运动能力的影响。
(方法)
(1)核酸的制备
所使用的双链核酸复合物剂的第1链，使用实施例15中制备的。通过使该第1链与胆固醇结合型Chol#1-cRNA(mDystrophin)或生育酚结合型Toc#1-cRNA(mDystrophin)退火，从而制备作为双链核酸剂的胆固醇结合型杂合双链寡核苷酸(Chol-HDO)和生育酚结合型杂合双链寡核苷酸(Toc-HDO)。将第1链与第2链以等摩尔量混合，将溶液在95℃加热5分钟，然后冷却到37℃保持1小时，由此将核酸链退火而制备上述的双链核酸剂。将退火后的核酸在4℃或冰上保存。将所制备的双链核酸剂称为Chol#1HDO和Toc#1HDO。
本实施例中使用的第1核酸链和第2核酸链的名称和碱基序列示于表15。
表15
寡核苷酸名 序列(5’-3’) 序列号
第1核酸链 PMO(mDystrophin) ggccaaacctcggcttacctgaaat 18
第2核酸链 Chol#1-cRNA(mDystrophin) Chol-<u>a</u><sup>*</sup><u>u</u><sup>*</sup><u>u</u><sup>*</sup>UCAGGUAAGCCGAGGUUUG<sup>*</sup><u>g</u><sup>*</sup><u>c</u><sup>*</sup><u>c</u> 19
第2核酸链 Toc#1-cRNA(mDystrophin) Toc-<u>a</u><sup>*</sup><u>u</u><sup>*</sup><u>u</u><sup>*</sup>UCAGGUAAGCCGAGGUUUG<sup>*</sup><u>g</u><sup>*</sup><u>c</u><sup>*</sup><u>c</u> 19
斜体小写字母:吗啉基；大写字母:RNA；带下划线的小写字母:2’-O-甲基RNA；*:硫代磷酸酯键(PS键)；Chol:胆固醇；Toc:生育酚
(2)体内(in vivo)实验
将Chol#1HDO或Toc#1HDO对小鼠经由静脉以100mg/kg的量进行静脉内注射。每周1次共计施与5次。进而，以代替Chol#1HDO或Toc#1HDO仅注射了PBS或PMO的小鼠作为阴性对照组，另外以B10(正常小鼠)作为阳性对照。
(3)运动负荷试验
在自第5次的最终施与起1周以上之后，实施运动负荷试验。运动负荷试验使用大鼠/小鼠兼用型跑步机(带式强制走行装置)(室町机械、MK-680S)，在有电刺激和无倾斜角度的条件下进行。测定试验开始至5分钟以5m/分钟的速度、然后每隔1分钟各增加1m/分钟速度时的连续行走时间。
(结果)
结果示于图29。相对于仅施与了PBS的阴性对照mdx小鼠(mdx、n＝6)，在施与了单链核酸复合物剂(PMO)的mdx小鼠(n＝3)中，连续行走时间稍微增加。与此相对，在施与了双链核酸复合物剂(Toc-HDO、n＝4)或双链核酸复合物剂(Chol-HDO、n＝6)的mdx小鼠中，连续行走时间大幅上升，特别是在双链核酸复合物剂(Chol-HDO)中，运动能力恢复到与阳性对照B10(n＝7)同等的水平。
＜实施例21＞
(目的)
目的是通过由以mdx小鼠的外显子23/内含子23边界区域作为外显子跳读的目标的反义寡核苷酸(吗啉基寡聚物)、与胆固醇结合型互补链或生育酚结合型互补链组成的双链核酸复合物(Chol-HDO或Toc-HDO)的多次施与，评价对握力和运动能力的影响。
(方法)
(1)核酸的制备
本实施例中使用的核酸复合物剂的制备方法依照实施例20所述的方法。本实施例中使用的第1核酸链和第2核酸链的名称和序列也如表15所示。
(2)体内(in vivo)实验
本实施例中使用的小鼠、和核酸复合物剂的施与方法依照实施例20。
(3)握力测定试验
在自第5次的最终施与起1周以上之后，实施握力测定试验。握力测定试验使用小鼠用握力测定装置(室町机械、MK-380CM)、不锈钢网(室町机械、MK-380CM-F/MM)、和数字测力计(IMADA、DS2-50N)。拉拽用前肢抓住了金属网的小鼠的尾部，测量直到小鼠放开金属网的拉力。3次测定而计算出平均。
(4)挂线试验
在自第5次的最终施与起1周以上之后，实施挂线试验。挂线试验通过使小鼠抓紧金属网之后翻转金属网，测定直到小鼠从金属网落下的时间(保持时间)来实施。计算出小鼠的体重(g)与保持时间(s)的积，作为保持冲量(Holding Impulse)(s*g)(HoldingImpulse(s*g)＝Body mass(g)×Hang Time(s))。计算出2次测定的平均。
(结果)
结果示于图30。相对于仅施与了PBS的阴性对照mdx小鼠(mdx、n＝7)，在施与了单链核酸复合物剂(PMO)的mdx小鼠(n＝9)中，握力(grip power)和保持冲量稍微增加。与此相对，在施与了双链核酸复合物剂(Toc-HDO、n＝9)或双链核酸复合物剂(Chol-HDO、n＝6)的mdx小鼠中显示，握力(grip power)和保持冲量(holding impulse)大幅上升。此外，在图30中，作为阳性对照，使用n＝6(握力)和n＝5(保持冲量)的B10。
＜实施例22＞
(目的)
在mdx小鼠的血液中，来源于肌肉的肌酸激酶(CK)、天冬氨酸转氨酶(AST)、和丙氨酸转氨酶(ALT)的浓度上升。因此，目的是在由以mdx小鼠的外显子23/内含子23边界区域作为外显子跳读的目标的反义寡核苷酸(吗啉基寡聚物)、与胆固醇结合型互补链或生育酚结合型互补链形成的双链核酸复合物(Chol-HDO或Toc-HDO)的多次施与之后，评价血清中的CK、AST、和ALT水平。
(方法)
(1)核酸的制备
本实施例中使用的核酸复合物剂的制备方法，依照实施例20所述的方法。本实施例中使用的第1核酸链和第2核酸链的名称和序列也如表15所示。
(2)体内(in vivo)实验
本实施例中使用的小鼠、和核酸复合物剂的施与方法依照实施例20。
(3)血清分析
在自第5次的最终施与起1周以上之后，从实施小鼠采血，分离血清。将所得的血清送株式会社エスアールエル，获得CK、AST、和ALT的测定结果。
(结果)
结果示于图31。相对于仅施与了PBS的阴性对照mdx小鼠(mdx、n＝11)，在施与了单链核酸复合物剂(PMO)的mdx小鼠(n＝7)中，CK、AST、和ALT的各值稍微减少。与此相对，在施与了双链核酸复合物剂(Toc-HDO、n＝7)或双链核酸复合物剂(Chol-HDO、n＝5或6)的mdx小鼠中，CK、AST、和ALT的各值大幅减少，特别是在Chol-HDO中，显示减少到与阳性对照B10(n＝8)同等的水平。
＜实施例23＞
(目的)
目的是通过由以mdx小鼠的外显子23/内含子23边界区域作为外显子跳读的目标的反义寡核苷酸(吗啉基寡聚物)、与胆固醇结合型互补链或生育酚结合型互补链形成的双链核酸复合物(Chol-HDO或Toc-HDO)的多次施与，评价对心肌功能的影响。
(方法)
(1)核酸的制备
本实施例中使用的核酸复合物剂的制备方法，依照实施例20所述的方法。本实施例中使用的第1核酸链和第2核酸链的名称和序列也如表15所示。
(2)体内(in vivo)实验
本实施例中使用的小鼠、和核酸复合物剂的施与方法依照实施例20。
(3)心电图测定
在自第5次的最终施与起1周以上之后，进行心电图测定。心电图测定使用模拟输入2通道PowerLab 2/26 PL2602、和High Performance Differential Bio AmplifierML132，在异氟烷麻醉下进行。以RR间隔修正QT时间，从而计算出修正QT时间(QTc)。
(结果)
结果示于图32。在仅施与了PBS的阴性对照mdx小鼠(mdx、n＝5)中，与正常小鼠(B10、n＝5)相比，QTc延长。在施与了单链核酸复合物剂(PMO、n＝5)的mdx小鼠中，QTc延长基本没有改善，与此相对，在施与了双链核酸复合物剂(Toc-HDO、n＝5)或双链核酸复合物剂(Chol-HDO、n＝5)的mdx小鼠中，显示QTc延长大幅改善。
＜实施例24＞
(目的)
目的是通过由以mdx小鼠的外显子23/内含子23边界区域作为外显子跳读的目标的反义寡核苷酸(吗啉基寡聚物)、与胆固醇结合型互补链或生育酚结合型互补链形成的双链核酸复合物(Chol-HDO或Toc-HDO)的多次施与，评价心肌和股四头肌中的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)蛋白质的表达。
(方法)
(1)核酸的制备
本实施例中使用的核酸复合物剂的制备方法，依照实施例20所述的方法。本实施例中使用的第1核酸链和第2核酸链的名称和序列也如表15所示。
(2)体内(in vivo)实验
本实施例中使用的小鼠、和核酸复合物剂的施与方法依照实施例20。
(3)表达分析
从第5次的最终施与开始1周以上之后，将小鼠解剖，进行利用蛋白质印迹(Western Blot)和免疫染色的表达分析。关于表达分析的方法，依照实施例15所述的方法。但是，在本实施例中，作为对照也同时进行对黏着斑蛋白(vinculin)的蛋白质印迹(Western Blot)。黏着斑蛋白抗体(anti-Vinculin(hVIN-1)antibody；NovusBiologicals,NB600-1293)以1/1000使用。
(结果)
结果示于图33～3637。与施与了单链核酸复合物剂(PMO)的mdx小鼠相比，在施与了双链核酸复合物剂(Toc-HDO)或双链核酸复合物剂(Chol-HDO)的mdx小鼠中，心肌(图33)和股四头肌(图34)中观察到更多的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的表达。进而，在图35和36的免疫染色图中，也与单链核酸复合物剂(PMO)相比，利用双链核酸复合物剂(Toc-HDO)或双链核酸复合物剂(Chol-HDO)时在心肌(图35)和股四头肌(图36)中观察到更多的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的表达。
Figure IDA0003286202820000011
Figure IDA0003286202820000021
Figure IDA0003286202820000031
Figure IDA0003286202820000041
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Figure IDA0003286202820000091
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Figure IDA0003286202820000161
Figure IDA0003286202820000171
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Figure IDA0003286202820000311
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Figure IDA0003286202820000331
Figure IDA0003286202820000341

Claims (40)

1.一种双链核酸复合物，是用于在受检体的骨骼肌或心肌中抑制或增进目标基因的转录产物或翻译产物的表达量、或者阻碍目标基因的转录产物或翻译产物的功能的双链核酸复合物，所述双链核酸复合物包含第1核酸链和第2核酸链，
所述第1核酸链包含能够与所述目标基因的转录产物的全部或一部分杂交的碱基序列，并且对所述转录产物具有反义效果，
所述第2核酸链包含与所述第1核酸链互补的碱基序列，并且结合有胆固醇或其类似物，
所述第1核酸链退火至所述第2核酸链。
2.根据权利要求1所述的双链核酸复合物，所述第1核酸链包含至少4个连续脱氧核糖核苷。
3.根据权利要求2所述的双链核酸复合物，所述第1核酸链是gapmer。
4.根据权利要求1或2所述的双链核酸复合物，所述第1核酸链是mixmer。
5.根据权利要求1～4的任一项所述的双链核酸复合物，所述第2核酸链包含与所述第1核酸链中的至少4个连续脱氧核糖核苷互补的、至少4个连续核糖核苷。
6.根据权利要求1～5的任一项所述的双链核酸复合物，所述第2核酸链不包含天然核糖核苷。
7.根据权利要求1～6的任一项所述的双链核酸复合物，所述第2核酸链的核酸部分由被修饰或者非修饰的核苷间键连接起来的脱氧核糖核苷和/或糖修饰核苷组成。
8.根据权利要求1～7的任一项所述的双链核酸复合物，所述第2核酸链结合有胆固醇或其类似物。
9.根据权利要求1～8的任一项所述的双链核酸复合物，所述胆固醇或其类似物结合于所述第2核酸链的5’末端和/或3’末端。
10.根据权利要求1～9的任一项所述的双链核酸复合物，所述第2核酸链上介由可切割或不可切割的接头结合有配体。
11.根据权利要求1～10的任一项所述的双链核酸复合物，所述第1核酸链与所述第2核酸链介由所述接头结合。
12.根据权利要求10或11所述的双链核酸复合物，所述接头由核酸组成。
13.一种药物组合物，包含权利要求1～12的任一项所述的双链核酸复合物作为有效成分。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，是受检体的骨骼肌功能障碍或心功能障碍治疗用的药物组合物。
15.根据权利要求13或14所述的药物组合物，所述骨骼肌功能障碍或心功能障碍是选自肌营养不良、肌病、炎症性肌病、多发性肌炎、皮肤肌炎、Danon病、肌无力综合征、线粒体病、肌红蛋白尿症、糖原病、周期性四肢麻痹、遗传性心肌病、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、遗传性心律失常、神经变性疾病、肌少症和恶病质中的疾病。
16.根据权利要求13～15的任一项所述的药物组合物，被用于静脉内施与、肌肉内施与或皮下施与。
17.根据权利要求13～16的任一项所述的药物组合物，所述双链核酸复合物的1次的施与量为0.1mg/kg以上。
18.根据权利要求13～17的任一项所述的药物组合物，所述双链核酸复合物的1次的施与量为0.01mg/kg～200mg/kg。
19.根据权利要求13～18的任一项所述的药物组合物，目标基因的转录产物是选自mRNA、微小RNA、前体mRNA、长链非编码RNA和天然反义RNA中的任一RNA。
20.根据权利要求13～19的任一项所述的药物组合物，第1核酸链是选自空间阻断、剪接开关、外显子跳读和外显子列入中的任一RNA。
21.根据权利要求13～20的任一项所述的药物组合物，所述双链核酸复合物中的第1核酸链的碱基序列用序列号24表示。
22.一种双链核酸复合物，是用于在受检体的骨骼肌或心肌中诱导目标基因的RNA编集、外显子跳读或者外显子列入，或者空间阻断目标RNA的双链核酸复合物，所述双链核酸复合物包含第1核酸链和第2核酸链，
所述第1核酸链包含能够与所述目标基因的转录产物的全部或一部分杂交的碱基序列，并且对所述转录产物具有反义效果，
所述第2核酸链包含与所述第1核酸链互补的碱基序列，
所述第1核酸链退火至所述第2核酸链。
23.根据权利要求22所述的双链核酸复合物，所述第1核酸链包含至少1个吗啉基核酸或核糖2’位修饰核酸。
24.根据权利要求22或23所述的双链核酸复合物，所述第1核酸链中的碱基的50％以上为吗啉基核酸或核糖2’位修饰核酸。
25.根据权利要求22～24的任一项所述的双链核酸复合物，所述第1核酸链是mixmer。
26.根据权利要求22～25的任一项所述的双链核酸复合物，所述第1核酸链中的碱基的100％为吗啉基核酸或核糖2’位修饰核酸。
27.根据权利要求22～26的任一项所述的双链核酸复合物，所述第2核酸链不包含天然核糖核苷。
28.根据权利要求22～27的任一项所述的双链核酸复合物，所述第2核酸链的核酸部分由被修饰或者非修饰的核苷间键连接起来的脱氧核糖核苷和/或糖修饰核苷组成。
29.根据权利要求22～28的任一项所述的双链核酸复合物，所述第2核酸链结合有功能性部分。
30.根据权利要求22～28的任一项所述的双链核酸复合物，所述功能性部分选自胆固醇或其类似物、生育酚或其类似物、磷脂酰乙醇胺或其类似物、被取代或未被取代的C1～30的烷基、被取代或未被取代的C2～30的烯基、和被取代或未被取代的C1～30的烷氧基中。
31.根据权利要求30所述的双链核酸复合物，所述功能性部分是胆固醇或其类似物。
32.根据权利要求22～31的任一项所述的双链核酸复合物，所述胆固醇或其类似物结合于所述第2核酸链的5’末端和/或3’末端。
33.根据权利要求22～32的任一项所述的双链核酸复合物，所述第2核酸链上介由可切割或不可切割的接头而结合有配体。
34.一种药物组合物，包含权利要求22～33的任一项所述的双链核酸复合物作为有效成分。
35.根据权利要求34所述的药物组合物，是受检体的肌营养不良治疗用的药物组合物。
36.根据权利要求35所述的药物组合物，所述肌营养不良是强直性肌营养不良或杜氏肌营养不良。
37.根据权利要求34～36的任一项所述的药物组合物，被用于静脉内施与或皮下施与。
38.根据权利要求34～37的任一项所述的药物组合物，所述双链核酸复合物的1次的施与量为0.1mg/kg以上。
39.根据权利要求34～38的任一项所述的药物组合物，所述双链核酸复合物的1次的施与量为0.01mg/kg～200mg/kg。
40.根据权利要求34～39的任一项所述的药物组合物，所述双链核酸复合物中的第1核酸链的碱基序列用序列号25～28的任一项表示。
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