CN108699555A - 用于治疗杜兴肌营养不良和相关病症的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及用于治疗杜兴肌营养不良和相关病症的组合物和方法。公开了修饰的反义寡聚体，用于治疗杜兴肌营养不良和相关病症。

Description

用于治疗杜兴肌营养不良和相关病症的组合物和方法
技术领域
本发明涉及用于治疗杜兴肌营养不良和相关病症的组合物和方法。
背景技术
杜兴肌营养不良(DMD)由蛋白质肌养蛋白的表达缺陷引起。编码该蛋白的基因包含在超过2百万个核苷酸的DNA上展开的79个外显子。改变外显子的阅读框或引入终止密码子，或特征为一个或多个完整框外外显子的除去，或一个或多个外显子的复制的任何外显子突变，具有破坏功能性肌养蛋白的产生，导致DMD的潜力。
疾病发生可在出生时以提高的肌酸激酶水平记录，和在生命的第一年中可存在明显的运动缺陷。到7岁或8岁时，大多数DMD患者具有递增的吃力步态，并逐渐失去从地板起身和爬楼梯的能力；到10-14岁，大多数是轮椅依赖性的。DMD一律是致命的；受影响的个体通常在其青少年晚期或20多岁早期死于呼吸和/或心力衰竭。DMD的持续进展在疾病的所有阶段考虑治疗干预；然而，治疗目前局限于糖皮质激素，其与许多副作用有关，包括体重增加、行为变化、青春期变化、骨质疏松症、库欣综合征样面容、生长抑制和白内障。
较不严重形式的肌营养不良，贝克肌营养不良(BMD)，本文所述的一种相关病症，已发现在突变(通常是一个或多个外显子缺失)导致沿整个肌养蛋白转录物的正确阅读框，使得mRNA翻译成蛋白不过早终止时发生。如果在突变的肌养蛋白前-mRNA的加工期间上游和下游外显子的连接维持正确的基因阅读框，结果是编码具有保留一些活性的短内部缺失的蛋白的mRNA，导致贝克表型。
许多年来已经知道，不改变肌养蛋白的阅读框的一个或多个外显子的缺失将产生BMD表型，而引起移码的外显子缺失将产生DMD(Monaco，Bertelson等1988)。总体上，肌养蛋白突变，包括点突变和外显子缺失(其改变阅读框，因此中断正确的蛋白翻译)，导致DMD。还应注意，一些BMD和DMD患者具有覆盖多个外显子的外显子缺失。
测试剪接转换寡核苷酸(splice switching oligonucleotide，SSO)用于治疗DMD的安全性和功效的最近的临床试验基于通过剪接体的空间阻断来诱导前-mRNA的选择剪接的SSO技术(Cirak等，2011；Goemans等，2011；Kinali等，2009；van Deutekom等，2007)。然而，尽管这些成功，但可用于治疗DMD的药理学选项仍有限。
因此，对用于治疗DMD的改进的治疗方法仍有强烈需求。
发明内容
本公开内容至少部分地基于令人惊讶的发现，即用肌养蛋白治疗剂结合肌生成抑制蛋白治疗剂全身性治疗mdx小鼠(杜兴肌营养不良的鼠模型)尤其增加小鼠的肌肉抓握力量。除了增加肌肉抓握力量之外，与仅单一疗法相比，这种组合的治疗方法还增加外显子跳跃效率和蛋白表达以及其它体内和体外终点。这些尤其包括体重、肌肉质量、某些肌肉纤维肥大和肌肉再生的改进。
其它令人惊讶的发现涉及尤其根据本文所述的方法和组合治疗的接受群体的年龄。通常已知幼小的mdx小鼠经历更大确定的肌肉生长和再生期，和因此趋于具有更轻的病理。参见例如，McGreevy等Disease Models&Mechanisms 8:195-213(2015)。相比之下，老年mdx小鼠显示肌肉完整性和功能的更多一致损失，和特征为难以治疗的更严重病理。然而，令人惊讶的是，发现上述体内和体外结果不仅出现在幼小mdx小鼠中，而且也出现在老年小鼠中。这表明本文所述的组合物和方法可用于治疗具有较严重病理和较差预后的年长患者(例如，7岁和更大的儿科患者)。
其它令人惊讶的发现涉及测试的治疗群体的更大寿命和/或存活率。已知尽管是肌养蛋白缺陷的，但幼小mdx小鼠具有最少的临床症状(McGreevy等2015)。更好代表临床表型的严重的营养不良表型，例如肌肉消瘦、脊柱侧弯和心力衰竭，直到小鼠15个月或更大时才出现。然而，在此时频繁发生生命的过早损失，因为mdx小鼠的寿命比野生型小鼠短大约25％。然而，在此本发明人已令人惊讶地发现，根据本文的方法和组合的治疗提供了mdx小鼠的存活从至少约18个月延长至24个月，完全超过了此模型的典型寿命/存活率。根据本文的各个方面和实施方案，在老年mdx小鼠中观察到的这些增加的治疗益处和寿命是令人惊讶的。
因此，本文提供的各个方面包括通过给予肌养蛋白治疗剂和肌生成抑制蛋白治疗剂的组合，治疗受试者的杜兴肌营养不良的方法。
各个方面包括治疗杜兴肌营养不良的受试者的方法，所述受试者具有肌养蛋白基因中的突变，其对通过能够在肌养蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感。所述方法包括给予受试者有效量的反义寡聚体，所述反义寡聚体包含17-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌养蛋白前-mRNA的外显子的靶标区的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列，其中反义寡聚体诱导外显子的跳跃；其中所述寡聚体包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i)修饰的核苷间连键，(ii)修饰的糖部分，或(iii)前述的组合；和其中已给予所述受试者肌生成抑制蛋白治疗剂，其在受试者中抑制肌生成抑制蛋白活性和肌生成抑制蛋白表达的一者或二者，从而治疗杜兴肌营养不良。
在各种实施方案中，所述外显子选自外显子7、外显子8、外显子9、外显子19、外显子23、外显子44、外显子45、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子55。在一些实施方案中，所述外显子包含外显子23。在一些实施方案中，所述外显子包含外显子45。在一些实施方案中，所述外显子包含外显子51。在一些实施方案中，所述外显子包含外显子53。在进一步的实施方案中，所述外显子包含外显子8、外显子44、外显子50、外显子52或外显子55。
在各种实施方案中，反义寡聚体包含20-30个亚单位。在一些实施方案中，所述反义寡聚体选自SEQ ID NOS:76-SEQ ID NO:3485。在进一步的实施方案中，所述反义寡聚体是SEQ ID NO:76。
在各种实施方案中，所述靶向序列与靶标区的至少15个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，所述靶向序列与靶标区的至少17个连续核苷酸互补。在进一步的实施方案中，其中靶向序列与靶标区100％互补。
在各种实施方案中，所述肌生成抑制蛋白治疗剂是蛋白或核酸。在一些实施方案中，所述蛋白是抗-肌生成抑制蛋白抗体。在一些实施方案中，所述蛋白是可溶性受体。在进一步的实施方案中，所述可溶性受体是ACVR2。在一些实施方案中，所述核酸是反义寡聚体或siRNA的至少一种。
在各种实施方案中，所述反义寡聚体包含12-40个亚单位，和进一步包含与肌生成抑制蛋白前-mRNA的靶标区的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；和其中所述寡聚体包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i)修饰的核苷间连键，(ii)修饰的糖部分，或(iii)前述的组合。在实施方案中，反义寡聚体包含20-30个亚单位。在一些实施方案中，所述靶向序列与靶标区的至少15个连续核苷酸互补。在进一步的实施方案中，所述靶向序列与靶标区的至少17个连续核苷酸互补。在实施方案中，所述靶向序列与靶标区100％互补。在实施方案中，靶标区包含SEQ ID NO:1。在实施方案中，所述外显子包含外显子2。
在各种实施方案中，所述靶标区选自(i)核苷酸序列，其中至少一个核苷酸跨越与内含子1/外显子2和外显子2/内含子2缔合的剪接点；或(ii)核苷酸序列，其中没有核苷酸跨越与内含子1/外显子2和外显子2/内含子2缔合的剪接点。在实施方案中，剪接点选自包含剪接受体位点或剪接供体位点的序列。在实施方案中，剪接点选自包含剪接受体位点或剪接供体位点的序列。在一些实施方案中，剪接受体位点在SEQ ID NO:2中提供和剪接供体位点在SEQ ID NO:3中提供。
在各种实施方案中，(i)的所述核苷酸选自SEQ ID NOS:16-43。在实施方案中，(ii)的所述核苷酸选自SEQ ID NOS:44-70。
在各种实施方案中，受试者是7岁或更大的儿科患者。
各个方面包括治疗杜兴肌营养不良的方法，所述方法包括：给予受试者有效量的反义寡聚体，其包含12-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；和其中所述寡聚体包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i)修饰的核苷间连键，(ii)修饰的糖部分，或(iii)前述的组合；和其中已给予所述受试者肌养蛋白治疗剂，其在受试者中增加肌养蛋白表达，从而治疗杜兴肌营养不良。
在各种实施方案中，其中受试者具有在肌养蛋白基因中的突变，其对通过能够在人肌生成抑制蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感。
在各种实施方案中，反义寡聚体包含20-30个亚单位。在实施方案中，所述靶向序列与靶标区的至少15个连续核苷酸互补。在实施方案中，所述靶向序列与靶标区的至少17个连续核苷酸互补。在实施方案中，反义寡聚体与靶标区100％互补。在实施方案中，靶标区包含SEQ ID NO:1。在实施方案中，所述外显子包含外显子2。
在各种实施方案中，所述靶标区选自(i)核苷酸序列，其中至少一个核苷酸跨越与内含子1/外显子2和外显子2/内含子2缔合的剪接点；或(ii)核苷酸序列，其中没有核苷酸跨越与内含子1/外显子2和外显子2/内含子2缔合的剪接点。在实施方案中，剪接点选自包含剪接受体位点或剪接供体位点的序列。在实施方案中，剪接受体位点在SEQ ID NO:2中提供和剪接供体位点在SEQ ID NO:3中提供。
在各种实施方案中，所述肌养蛋白治疗剂选自一种或多种蛋白或核酸。在实施方案中，所述核酸是反义寡聚体。在一些实施方案中，所述反义寡聚体包含20-50个亚单位，和进一步包含与包含人肌养蛋白前-mRNA的外显子的靶标区的10或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；和其中所述寡聚体包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i)修饰的核苷间连键，(ii)修饰的糖部分，或(iii)前述的组合。
各个方面和实施方案包括治疗具有在肌养蛋白基因中的突变的受试者的杜兴肌营养不良和相关病症的方法，所述受试者对通过能够在肌养蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感。在各种实施方案中，所述方法包括给予受试者包含式(I)的靶向序列
或其药学上可接受的盐，其中：
每个Nu是核碱基，其一起形成靶向序列；
Z是8-48的整数；
每个Y独立地选自O和–NR4，其中每个R4独立地选自H、C1-C6烷基、芳烷基、C(＝NH)NH2、C(O)(CH2)nNR5C(＝NH)NH2、C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR5C(＝NH)NH2和G，其中R5选自H和C1C6烷基和n是1-5的整数；
T选自OH和下式的部分：
其中：
A选自–OH、-N(R7)2R8，其中：
每个R7独立地选自H和C1-C6烷基，和
R8选自电子对和H，和
R6选自OH、–N(R9)CH2C(O)NH2和下式的部分：
其中：
R9选自H和C1-C6烷基；和
R10选自G、C(O)-R11OH、酰基、三苯甲基、4甲氧基三苯甲基、C(＝NH)NH2、C(O)(CH2)mNR12C(＝NH)NH2和C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR12C(＝NH)NH2，其中：
M是1-5的整数，
R11具有式-(O-烷基)y-，其中y是3-10的整数，和
y个烷基中的每个独立地选自C2-C6烷基；和
R12选自H和C1-C6烷基；
R1的每个实例独立地选自：
–N(R13)2R14，其中每个R13独立地选自H和C1-C6烷基，和R14选自电子对和H；
式(II)的部分：
其中：
R15选自H、G、C1-C6烷基、C(＝NH)NH2、C(O)(CH2)qNR18C(＝NH)NH2和-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR18C(＝NH)NH2，其中：
R18选自H和C1-C6烷基；和
q是1-5的整数，
R16选自电子对和H；和
每个R17独立地选自H和甲基；和
式(III)的部分：
其中：
R19选自H、C1-C6烷基、C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)rNR22C(＝NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR22C(＝NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)4NH2和G，其中：
R22选自H和C1-C6烷基；和
r是1-5的整数，
R20选自H和C1-C6烷基；和
R21选自电子对和H；
R2选自H、G、酰基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、C1-C6烷基、-C(＝NH)NH2、-C(O)-R23、-C(O)(CH2)sNR24C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR24C(＝NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)3NHC(＝NH)NH2和下式的部分：
其中
R23具有式-(O-烷基)v-OH，其中v是3-10的整数和v个烷基中的每个独立地选自C2-C6烷基；和
R24选自H和C1-C6烷基；
s是1-5的整数；
L选自–C(O)(CH2)6C(O)–和-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)–；和
每个R25具有式–(CH2)2OC(O)N(R26)2，其中每个R26具有式–(CH2)6NHC(＝NH)NH2；和
R3选自电子对、H和C1-C6烷基，
其中G是细胞穿透肽(“CPP”)和接头部分，选自-C(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)(CH2)2NH-CPP、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NH-CPP和-C(O)CH2NH-CPP，或G具有下式：
其中CPP通过CPP羧基端的酰胺键连接至接头部分、条件是G的至多一个实例存在，和
其中靶向序列与包含人肌养蛋白前-mRNA的外显子的靶标区的10或更多个连续核苷酸互补；和
其中已给予所述受试者肌生成抑制蛋白治疗剂，从而在受试者中抑制肌生成抑制蛋白活性或表达的一者或二者。
在各种实施方案中，每个Nu独立地是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、肌苷、次黄嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C5-丙炔基-修饰的嘧啶或10-(9-(氨基乙氧基)吩噁嗪基)。
在各种实施方案中，靶标区选自(i)核苷酸序列，其中至少一个核苷酸跨越与所述外显子缔合的剪接点；或(ii)核苷酸序列，其中没有核苷酸跨越与所述外显子缔合的剪接点。在实施方案中，靶向序列包含选自SEQ ID NOS:76-3485的序列，是选自SEQ ID NOS:76-3485的靶向序列的至少10个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:76-3485的靶向序列具有至少90％序列同一性的变体。
在各种实施方案中，
i)Y是O，R2选自H或G，R3选自电子对或H；
ii)R2是G，其中CPP具有选自SEQ ID NOS:3486-3501的序列；
iii)每个R1是-N(CH3)2；
iv)至少一个R1选自：
或
v)50-90％的R1基团是-N(CH3)2。
在各种实施方案中，T具有下式：
其中A是–N(CH3)2，和R6具有下式：
其中R10是-C(O)R11OH。
在各种实施方案中，每个Y是O，和T选自：
在各种实施方案中，T具有下式：
各个方面包括治疗具有在肌养蛋白基因中的突变的受试者的杜兴肌营养不良和相关病症的方法，所述受试者对通过能够在肌养蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感。在各种实施方案中，所述方法包括给予受试者包含式(VI)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
每个Nu是核碱基，其一起形成靶向序列；
Z是8-48的整数；
每个Y独立地选自O和–NR4，其中每个R4独立地选自H、C1-C6烷基、芳烷基、-C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)nNR5C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR5C(＝NH)NH2和G，其中R5选自H和C1-C6烷基和n是1-5的整数；
T选自OH和下式的部分：
其中：
A选自–OH和-N(R7)2R8，其中：
每个R7独立地选自H和C1-C6烷基，和
R8选自电子对和H，和
R6选自OH、–N(R9)CH2C(O)NH2和下式的部分：
其中：
R9选自H和C1-C6烷基；和
R10选自G、-C(O)-R11OH、酰基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、-C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)mNR12C(＝NH)NH2和-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR12C(＝NH)NH2，其中：
m是1-5的整数，
R11具有式-(O-烷基)y-，其中y是3-10的整数，和
y个烷基中的每个独立地选自C2-C6烷基；和
R12选自H和C1-C6烷基；
R2选自H、G、酰基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、C1-C6烷基、-C(＝NH)NH2和-C(O)-R23；和
R3选自电子对、H和C1-C6烷基，和其中靶向序列包含选自SEQ ID NOS:76-3485的序列，选自SEQ ID NOS:76-3485，是选自SEQ ID NOS:76-3485的序列的至少10个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:76-3485的序列具有至少90％序列同一性的变体。
各个方面包括治疗具有在肌养蛋白基因中的突变的受试者的杜兴肌营养不良和相关病症的方法，所述受试者对通过能够在人肌生成抑制蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感。在实施方案中，所述方法包括给予受试者包含式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
每个Nu是核碱基，其一起形成靶向序列；
Z是8-48的整数；
每个Y独立地选自O和–NR4，其中每个R4独立地选自H、C1-C6烷基、芳烷基、C(＝NH)NH2、C(O)(CH2)nNR5C(＝NH)NH2、C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR5C(＝NH)NH2和G，其中R5选自H和C1C6烷基和n是1-5的整数；
T选自OH和下式的部分：
其中：
A选自–OH、-N(R7)2R8，其中：
每个R7独立地选自H和C1-C6烷基，和
R8选自电子对和H，和
R6选自OH、–N(R9)CH2C(O)NH2和下式的部分：
其中：
R9选自H和C1-C6烷基；和
R10选自G、C(O)-R11OH、酰基、三苯甲基、4甲氧基三苯甲基、C(＝NH)NH2、C(O)(CH2)mNR12C(＝NH)NH2和C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR12C(＝NH)NH2，其中：
m是1-5的整数，
R11具有式-(O-烷基)y-，其中y是3-10的整数，和
y个烷基中的每个独立地选自C2-C6烷基；和
R12选自H和C1-C6烷基；
R1的每个实例独立地选自：
–N(R13)2R14，其中每个R13独立地选自H和C1-C6烷基，和R14选自电子对和H；
式(II)的部分:
其中：
R15选自H、G、C1-C6烷基、C(＝NH)NH2、C(O)(CH2)qNR18C(＝NH)NH2和-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR18C(＝NH)NH2，其中：
R18选自H和C1-C6烷基；和
q是1-5的整数，
R16选自电子对和H；和
每个R17独立地选自H和甲基；和
式(III)的部分:
其中：
R19选自H、C1-C6烷基、C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)rNR22C(＝NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR22C(＝NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)4NH2和G，其中：
R22选自H和C1-C6烷基；和
r是1-5的整数，
R20选自H和C1-C6烷基；和
R21选自电子对和H；
R2选自H、G、酰基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、C1-C6烷基、-C(＝NH)NH2、-C(O)-R23、-C(O)(CH2)sNR24C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR24C(＝NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)3NHC(＝NH)NH2和下式的部分：
其中
R23具有式-(O-烷基)v-OH，其中v是3-10的整数和v个烷基中的每个独立地选自C2-C6烷基；和
R24选自H和C1-C6烷基；
s是1-5的整数；
L选自–C(O)(CH2)6C(O)–和-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)–；和
每个R25具有式–(CH2)2OC(O)N(R26)2，其中每个R26具有式–(CH2)6NHC(＝NH)NH2；和
R3选自电子对、H和C1-C6烷基，
其中G是细胞穿透肽(“CPP”)和接头部分，其选自-C(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)(CH2)2NH-CPP、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NH-CPP和-C(O)CH2NH-CPP，或G具有下式：
其中CPP通过CPP羧基端的酰胺键连接至接头部分，条件是G的至多一个实例存在，和
其中靶向序列与包含人肌养蛋白前-mRNA的外显子的靶标区的10或更多个连续核苷酸互补；和
其中已给予所述受试者肌生成抑制蛋白治疗剂，从而在受试者中抑制肌生成抑制蛋白活性或表达的一者或二者。
在各种实施方案中，每个Nu独立地是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、肌苷、次黄嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C5-丙炔基-修饰的嘧啶或10-(9-(氨基乙氧基)吩噁嗪基)。
在各种实施方案中，靶向序列包含选自SEQ ID NOS:16-75的序列，是选自SEQ IDNOS:16-75的靶向序列的至少10个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:16-75的靶向序列具有至少90％序列同一性的变体。
在各种实施方案中，
i)Y是O，R2选自H或G，R3选自电子对或H；
ii)R2是G，其中CPP具有选自SEQ ID NOS:3486-3501的序列；
iii)每个R1是-N(CH3)2；
iv)至少一个R1选自：
或v)50-90％的R1基团是-N(CH3)2。
在各种实施方案中，T具有下式：
其中A是–N(CH3)2和R6具有下式：
其中R10是-C(O)R11OH。
在各种实施方案中，每个Y是O和T选自:
在各种实施方案中，T具有下式：
各个方面包括治疗具有在肌养蛋白基因中的突变的受试者的杜兴肌营养不良和相关病症的方法，所述受试者对通过能够在肌生成抑制蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感。在各种实施方案中，所述方法包括给予受试者包含式(VI)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
每个Nu是核碱基，其一起形成靶向序列；
Z是8-48的整数；
每个Y独立地选自O和–NR4，其中每个R4独立地选自H、C1-C6烷基、芳烷基、-C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)nNR5C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR5C(＝NH)NH2和G，其中R5选自H和C1-C6烷基和n是1-5的整数；
T选自OH和下式的部分：
其中：
A选自–OH和-N(R7)2R8，其中：
每个R7独立地选自H和C1-C6烷基，和
R8选自电子对和H，和
R6选自OH、–N(R9)CH2C(O)NH2和下式的部分：
其中：
R9选自H和C1-C6烷基；和
R10选自G、-C(O)-R11OH、酰基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、-C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)mNR12C(＝NH)NH2和-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR12C(＝NH)NH2，其中：
m是1-5的整数，
R11具有式-(O-烷基)y-，其中y是3-10的整数，和
y个烷基中的每个独立地选自C2-C6烷基；和
R12选自H和C1-C6烷基；
R2选自H、G、酰基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、C1-C6烷基、-C(＝NH)NH2,和-C(O)-R23；和
R3选自电子对、H和C1-C6烷基，和其中靶向序列包含选自SEQ ID NOS:16-75的序列，选自SEQ ID NOS:16-75，是选自SEQ ID NOS:16-75的序列的至少10个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:16-75的序列具有至少90％序列同一性的变体。
各个方面包括肌养蛋白相关的药物组合物，其包含20-50个亚单位的反义寡聚体化合物和药学上可接受的载体，所述化合物包含：至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i)修饰的核苷间连键，(ii)修饰的糖部分，或(iii)前述的组合；和与包含人肌养蛋白前-mRNA的外显子的靶标区的10或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；
以及肌生成抑制蛋白相关的药物组合物，其包含12-40个亚单位的反义寡聚体化合物和药学上可接受的载体，所述化合物包含：至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i)修饰的核苷间连键，(ii)修饰的糖部分，或(iii)前述的组合；和
与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的靶标区的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列。在各种实施方案中，肌养蛋白相关的组合物和肌生成抑制蛋白相关的组合物在相同的药物组合物中提供。
各个方面包括用于在具有遗传突变的受试者中调节肌生成抑制蛋白表达的方法，所述受试者对通过能够在人肌生成抑制蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感，所述方法包括：给予受试者有效量的反义寡聚体，其包含12-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；和其中所述寡聚体包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i)修饰的核苷间连键，(ii)修饰的糖部分，或(iii)前述的组合；结合反义寡聚体至肌生成抑制蛋白前-mRNA转录物的靶标区；和抑制靶标区转录为人肌生成抑制蛋白mRNA转录物，其中已给予所述受试者肌养蛋白治疗剂，其在受试者中增加肌养蛋白表达。
各个方面包括用于在具有遗传突变的受试者中减少外显子2表达的方法，所述受试者对通过能够在人肌生成抑制蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感，所述方法包括：给予受试者有效量的反义寡聚体，其包含12-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列，和抑制肌生成抑制蛋白mRNA转录物中外显子2的转录，其中已给予所述受试者肌养蛋白治疗剂，其在受试者中增加肌养蛋白表达。在各种实施方案中，在肌生成抑制蛋白mRNA转录物中外显子2表达减少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
各个方面包括用于在受试者的肌肉细胞或组织中减少功能性肌生成抑制蛋白的蛋白积聚的方法，所述受试者具有在肌养蛋白基因中的突变，其对通过能够在人肌生成抑制蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感，所述方法包括：给予受试者有效量的反义寡聚体，其包含12-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列，和抑制肌生成抑制蛋白mRNA转录物中外显子2的转录，其中已给予所述受试者肌养蛋白治疗剂，其在受试者中增加肌养蛋白表达。
各个方面包括用于治疗杜兴肌营养不良和相关病症的药物，其包含：包含12-40个亚单位的反义寡聚体化合物，其包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i)修饰的核苷间连键，(ii)修饰的糖部分，或(iii)前述的组合；和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；和增加肌养蛋白表达的肌养蛋白治疗剂。
各个方面包括用于在具有在肌养蛋白基因中的突变的受试者中抑制杜兴肌营养不良和相关病症的进展的方法，所述受试者对通过能够在人肌生成抑制蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感，所述方法包括：给予受试者有效量的反义寡聚体，其包含12-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；和抑制肌生成抑制蛋白mRNA转录物中外显子2的转录，其中已给予所述受试者肌养蛋白治疗剂，其在受试者中增加肌养蛋白表达，从而抑制杜兴肌营养不良的进展。
各个方面包括在具有杜兴肌营养不良和相关病症的受试者中减少功能性肌生成抑制蛋白的蛋白积聚的方法，所述方法包括：给予受试者有效量的反义寡聚体，其包含12-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；抑制肌生成抑制蛋白mRNA转录物中外显子2的转录，其中在受试者中功能性肌生成抑制蛋白的蛋白积聚减少，和其中已给予所述受试者肌养蛋白治疗剂，其在受试者中增加肌养蛋白表达。
各个方面包括用于在需要治疗的受试者中治疗杜兴肌营养不良和相关病症的方法，包括：给予有效在受试者中产生峰值血液浓度为至少约200-400nM的反义寡聚体的量的反义寡聚体。
各个方面包括在具有在肌养蛋白基因中的突变的受试者中治疗骨骼肌肉质量缺乏的方法，所述受试者对通过能够在人肌生成抑制蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感，所述方法包括：(a)在受试者中测量肌生成抑制蛋白蛋白的血液或组织水平；(b)给予受试者有效量的反义寡聚体，其包含12-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；(c)抑制肌生成抑制蛋白mRNA转录物中外显子2的转录；(d)在选择的时间后在受试者中测量肌生成抑制蛋白的蛋白水平；和(e)使用(d)中测量的水平重复所述给予，以调节给予的反义寡聚体的量的剂量或剂量方案，其中在给予反义寡聚体后在受试者中肌生成抑制蛋白的蛋白水平减少，和其中已给予所述受试者肌养蛋白治疗剂，其在受试者中增加肌养蛋白表达。
各个方面包括在具有在肌养蛋白基因中的突变的受试者中抑制杜兴肌营养不良和相关病症的进展的方法，所述受试者对通过能够在肌养蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感，所述方法包括：给予受试者有效量的反义寡聚体，其包含17-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌养蛋白前-mRNA的外显子的靶标区的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列，其中反义寡聚体诱导外显子的跳跃；其中所述寡聚体包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i)修饰的核苷间连键，(ii)修饰的糖部分，或(iii)前述的组合；和其中已给予所述受试者肌生成抑制蛋白治疗剂，其在受试者中抑制肌生成抑制蛋白活性和表达的一者或二者，从而抑制杜兴肌营养不良的进展。
各个方面包括抑制杜兴肌营养不良的进展的方法，所述方法包括：给予受试者有效量的反义寡聚体，其包含12-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；和其中所述寡聚体包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i)修饰的核苷间连键，(ii)修饰的糖部分，或(iii)前述的组合；和其中已给予所述受试者肌养蛋白治疗剂，其在受试者中增加肌养蛋白表达，从而抑制杜兴肌营养不良的进展。
各个方面和实施方案包括反义寡聚体，其进一步包含缀合至反义寡聚体的3’末端或5’末端的富含精氨酸的肽序列，其中富含精氨酸的肽序列包含选自SEQ ID NOS:3486-3501的序列。
各个方面包括组合物，包含：反义寡聚体，其包含17-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌养蛋白前-mRNA的外显子的靶标区的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；其中所述肌养蛋白靶向的寡聚体包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i)修饰的核苷间连键，(ii)修饰的糖部分，或(iii)前述的组合；和反义寡聚体包含12-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；其中所述肌生成抑制蛋白靶向的寡聚体包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i)修饰的核苷间连键，(ii)修饰的糖部分，或(iii)前述的组合。
各个方面和实施方案包括给予肌养蛋白治疗剂和肌生成抑制蛋白治疗剂至受试者，其中所述受试者是7岁或更大的儿科患者。
各个方面包括用于在具有遗传突变的受试者中调节肌养蛋白表达的方法，所述受试者对通过能够在人肌生成抑制蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感，所述方法包括：给予受试者有效量的反义寡聚体，其包含17-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌养蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；和其中所述寡聚体包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i)修饰的核苷间连键，(ii)修饰的糖部分，或(iii)前述的组合；其中已给予所述受试者肌生成抑制蛋白治疗剂，其在受试者中抑制肌生成抑制蛋白活性和肌生成抑制蛋白表达的一者或二者。
各个方面和实施方案进一步包括提供在具有DMD和相关病症的受试者中调节肌肉质量的方法。
在另一个方面，本公开内容提供了用于治疗DMD患者的方法，所述方法包括给予受试者本文所述的任何肌养蛋白治疗剂和本文所述的任何肌生成抑制蛋白治疗剂的一者或二者，从而治疗DMD。患者可以是在DMD基因中具有突变的患者，其对外显子跳跃易感，例如，使用能够诱导外显子跳跃的寡核苷酸。在一些实施方案中，患者在DMD基因中具有突变，其对外显子51跳跃易感。在一些实施方案中，患者在DMD基因中具有突变，其对外显子53跳跃易感。在一些实施方案中，患者在DMD基因中具有突变，其对外显子45跳跃易感。在一些实施方案中，患者在DMD基因中具有突变，其对外显子44跳跃易感。在一些实施方案中，患者在DMD基因中具有突变，其对外显子52跳跃易感。在一些实施方案中，患者在DMD基因中具有突变，其对外显子50跳跃易感。在一些实施方案中，患者在DMD基因中具有突变，其对外显子8跳跃易感。在一些实施方案中，患者在DMD基因中具有突变，其对外显子55跳跃易感。
在另一个方面，本公开内容提供了组合物(例如，药物组合物)，其包含任何一种或多种本文所述的肌养蛋白治疗剂和一种或多种本文所述的肌生成抑制蛋白治疗剂。
在本文所述的方法或组合物的一些实施方案中，肌养蛋白治疗剂是eteplirsen。
在本文所述的方法或组合物的一些实施方案中，肌养蛋白治疗剂不包含SEQ IDNO:927所示的序列和不由SEQ ID NO:927所示的序列组成。
在本文所述的方法或组合物的一些实施方案中，肌养蛋白是人肌养蛋白。在本文所述的方法或组合物的一些实施方案中，肌生成抑制蛋白是人肌生成抑制蛋白。在本文所述的方法或组合物的一些实施方案中，受试者是人。
在本文所述的任何方法或组合物的一些实施方案中，受试者是人(例如，人患者)。在本文所述的任何方法或组合物的一些实施方案中，受试者是男性受试者。在本文所述的任何方法或组合物的一些实施方案中，受试者是儿科患者。在本文所述的任何方法或组合物的一些实施方案中，患者是7岁或更大。在本文所述的任何方法或组合物的一些实施方案中，患者是至少7岁，但小于约21岁。
在本文所述的任何方法或组合物的一些实施方案中，肌养蛋白治疗剂和肌生成抑制蛋白治疗剂的一种或两种经全身递送给受试者，例如，通过静脉内给予。在本文所述的任何方法或组合物的一些实施方案中，肌养蛋白治疗剂经全身递送给受试者。在本文所述的任何方法或组合物的一些实施方案中，肌生成抑制蛋白治疗剂经全身递送给受试者。
在本文所述的任何方法或组合物的一些实施方案中，肌养蛋白治疗剂和肌生成抑制蛋白治疗剂的一种或两种长期给予受试者。例如，在本文所述的任何方法或组合物的一些实施方案中，一种或两种治疗剂可各自独立地每日、每周、每月、每两周或每两个月给予。在本文所述的任何方法或组合物的一些实施方案中，治疗有效量的一种或两种治疗剂可在治疗时间内作为单次剂量(例如，每周单次剂量)或作为多次剂量(例如，两次或更多次，例如，三次、四次、五次、六次或七次剂量)，例如，每周一次或每周两次，各自独立地递送给受试者。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，首先给予肌养蛋白治疗剂和接着给予肌生成抑制蛋白治疗剂。例如，肌养蛋白治疗剂(例如，eteplirsen)可首先以足以增加在受试者的肌肉细胞中的肌养蛋白产生的量和持续时间给予，然后给予受试者肌生成抑制蛋白治疗剂。因此，在一些实施方案中，肌养蛋白治疗剂(例如，eteplirsen)每周一次以约30mg/kg受试者体重给予受试者一段时间(例如，6月、1年、18月、2年或更长)，以增加受试者的肌肉细胞中的肌养蛋白表达，然后给予肌生成抑制蛋白治疗剂。在一些实施方案中，肌养蛋白治疗剂(例如，eteplirsen)每周一次以约30-约50mg/kg受试者体重给予受试者一段时间(例如，6月、1年、18月、2年或更长)，以增加受试者风的肌肉细胞中的肌养蛋白表达，然后给予肌生成抑制蛋白治疗剂。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，首先给予肌生成抑制蛋白治疗剂和接着给予肌养蛋白治疗剂。
在一些实施方案中，用于本文所述的组合物和方法的反义寡核苷酸化合物不包括细胞穿透肽。
附图简述
图1A说明在5’端添加接头的修饰的寡聚体。图1B和1C说明与细胞穿透肽(CPP)缀合的反义寡核苷酸。图1D、1E、1F和1G说明示例性的吗啉代寡核苷酸的重复亚单位区段。
图2A说明三苯甲基哌嗪苯基氨基甲酸酯的制备。图2B说明树脂/试剂混合物的制备。
图3A说明在人横纹肌肉瘤(RD)细胞中肌生成抑制蛋白外显子2跳跃的RT-PCR产物的凝胶电泳。图3B说明在RD细胞中肌生成抑制蛋白外显子2的跳跃效率(％)。
图4A说明在RD细胞中肌生成抑制蛋白外显子2跳跃的RT-PCR产物的凝胶电泳。图4B说明肌生成抑制蛋白外显子2跳跃的相对密度测定分析。
图5A说明在C2C12和H2Kbmdx细胞中的肌生成抑制蛋白外显子2跳跃。图5B说明在C2C12细胞中肌生成抑制蛋白外显子2跳跃效率的RT-PCR产物的密度测定分析(％)。图5C说明在H2Kbmdx细胞(％)中肌生成抑制蛋白外显子2跳跃效率的RT-PCR产物的密度测定分析。
图6A说明在胫骨前肌(TA)肌肉中肌生成抑制蛋白外显子2跳跃的凝胶电泳产物。图6B说明归一化至体重的肌肉质量。图6C说明肌生成抑制蛋白外显子2跳跃的RT-PCR产物的密度测定分析。
图7A说明在mdx小鼠肌肉中肌生成抑制蛋白外显子2跳跃的凝胶电泳。图7B说明在mdx小鼠中肌生成抑制蛋白外显子2跳跃的RT-PCR产物的密度测定分析。图7C说明在mdx小鼠中归一化至初始体重的肌肉重量。图7D说明在mdx小鼠中归一化至最终体重的肌肉重量。
图8A说明在给予10mg/kg BPMO的mdx小鼠中的体重增加。图8B说明在给予10mg/kgBPMO的mdx小鼠中的肌肉质量增加。图8C说明在给予20mg/kg BPMO的mdx小鼠中的体重增加。图8D说明在给予20mg/kg BPMO的mdx小鼠中的肌肉质量增加。
图9A说明给予10mg/kg BPMO的mdx小鼠的抓握力量试验。图9B说明给予20mg/kgBPMO的mdx小鼠的抓握力量试验。图9C说明在给予10mg/kg BPMO的mdx小鼠中在TA肌肉中的电生理学试验。
图10A说明在横隔膜(DIA)中肌生成抑制蛋白外显子2跳跃的RT-PCR产物的凝胶电泳。图10B说明在DIA中肌生成抑制蛋白外显子2跳跃的RT-PCR产物的密度测定分析。图10C说明在TA中肌生成抑制蛋白外显子2跳跃的RT-PCR产物的凝胶电泳。图10D说明在TA中肌生成抑制蛋白外显子2跳跃的RT-PCR产物的密度测定分析。
图11A说明给予盐水的幼小营养不良小鼠C57BL10(阳性对照)、给予盐水的mdx小鼠(阴性对照)、给予BPMO-M23D的mdx小鼠(10mg/kg)、给予BPMO-M23D(10mg/kg)和BPMO-MSTN(10mg/kg)的mdx小鼠或给予BPMO-MSTN(10mg/kg)的mdx小鼠的归一化至初始重量的体重。统计学分析通过单向ANOVA和Bonferroni事后检验进行，在每个周比较所有组；误差棒表示S.E.M。图11B说明给予盐水的幼小营养不良小鼠C57BL10(阳性对照)、给予盐水的mdx小鼠(阴性对照)、给予BPMO-M23D(10mg/kg)的mdx小鼠、给予BPMO-M23D(10mg/kg)和BPMO-MSTN(10mg/kg)的mdx小鼠或给予BPMO-MSTN(10mg/kg)的mdx小鼠的小鼠前肢力量的抓握力量分析。
图12A说明通过外显子跳跃重构成的肌养蛋白RNA的量化。图12B说明通过免疫印迹的肌养蛋白的蛋白表达的量化。图12C说明肌生成抑制蛋白外显子2跳跃的量化。
图13A说明在幼小肌养蛋白小鼠的TA中最小Feret直径的变异系数。图13B说明幼小肌养蛋白小鼠的TA肌肉中的中央具核纤维的百分比。
图14A说明在mdx小鼠中的体重增加。图14B说明在给予BPMO-M23D或BPMO-M23D+BPMO-MSTN的mdx小鼠中肌肉质量的增加。图14C说明在给予BPMO-M23D或BPMO-M23D+BPMO-MSTN的mdx小鼠中前肢力量的抓握力量分析。图14D说明给予BPMO-M23D或BPMO-M23D+BPMO-MSTN的mdx小鼠的原位电生理学测量。
图15A说明显示在给予BPMO-M23D或BPMO-M23D+BPMO-MSTN的mdx小鼠的肌肉中通过外显子跳跃重构成的肌养蛋白RNA的凝胶电泳。图15B说明在给予BPMO-M23D或BPMO-M23D+BPMO-MSTN的mdx小鼠中RT-PCR产物的相对密度测定分析。
图16A说明在从给予BPMO-M23D或BPMO-M23D+BPMO-MSTN的mdx小鼠收获的肌肉中肌养蛋白的蛋白表达。图16B说明在从给予BPMO-M23D或BPMO-M23D+BPMO-MSTN的mdx小鼠收获的肌肉中肌养蛋白的蛋白表达的相对密度测量量化。
图17A说明显示在给予BPMO-M23D或BPMO-M23D+BPMO-MSTN的mdx小鼠的肌肉中变化的肌生成抑制蛋白跳跃的凝胶电泳。图17B说明在给予BPMO-M23D或BPMO-M23D+BPMO-MSTN的mdx小鼠中肌生成抑制蛋白跳跃的RT-PCR产物的相对密度测定分析。
图18A说明小鼠的抓握力量测试，15个读数/小鼠。图18B说明小鼠的抓握力量测试，15个读数/小鼠的3次平均值。图18C说明小鼠的抓握力量测试，3个最高读数/小鼠。
详细描述
以下描述在性质上仅是示例性的和不意图限制本发明、其应用或其用途。应理解，在整个附图中，相应的参考数字表示相同或相应的部分和特征。在本发明的各个实施方案中指出的具体实例的描述预期仅为举例说明的目的，和不意图限制本文公开的发明范围。此外，具有规定的特征的多个实施方案的描述不意图排除具有另外的特征的其它实施方案或并有规定特征的不同组合的其它实施方案。
此外，本文的各个实施方案的详细描述参考附图，其通过举例说明显示各个实施方案。尽管实施方案以足够的细节进行描述以使本领域技术人员能够实施本发明，但应理解其它实施方案可实现和在不脱离本发明的精神和范围的情况下可进行逻辑和机械变化。因此，本文的详细描述仅为说明而不是限制的目的而提供。例如，在描述、任何方法、系统或过程中论述的步骤或功能可以任何顺序执行，和不限于提供的顺序。此外，其任何步骤或功能可由一个或多个第三方外包或执行。此外，对单数的任何提及包括复数实施方案，和对超过一个组分的任何提及可包括单数实施方案。
I.定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本公开内容所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管类似或等同于本文所述的那些的任何方法和材料可用于实施或测试本公开内容的主题，但描述了优选的方法和材料。为本公开内容的目的，以下术语在下文定义。
冠词“一个”和“一种”在本文用于指冠词的一个或超过一个(即，至少一个)语法对象。通过实例的方式，“一个要素”意指一个要素或超过一个要素。
术语“约”是指变化多达参考数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过延伸所述数值的上下边界而修饰该范围。一般而言，术语“约”意图在规定值的上下修饰数值≦10％的变化。
在整个公开内容中，除非上下文另外要求，否则词语“包含”、“包括”和“含有”应理解为意指包括规定的步骤或要素或一组步骤或要素，但不排除任何其它步骤或要素或一组步骤或要素。
术语“由……组成”意指包括和限于短语“由……组成”后的任何事物。因此，短语“由……组成”表示所列要素是必需或强制的，和没有其它要素可存在。术语“基本上由……组成”意指包括该词语后所列的任何要素，和限于不干扰或促进本公开内容中对于所列要素规定的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列要素是必需或强制的，但其它要素是任选的，和可以存在或可以不存在，取决于它们是否实质影响所列要素的活性或作用。
术语“给予”或“给药”包括通过局部或全身给予，递送包括本公开内容的修饰的反义寡聚体的治疗剂给受试者。给予可以是局部的(包括经眼和粘膜，包括阴道和直肠递送)、经肺例如通过吸入或吹入粉剂或气雾剂(包括通过喷雾器)、气管内、鼻内、表皮和经皮肤)、口服或胃肠外。胃肠外给予包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内例如鞘内或室内给予。
如本文使用的“共给予”或“共-给予”或“组合疗法”通常是指给予DMD外显子-跳跃反义寡核苷酸与本文公开的一种或多种肌生成抑制蛋白治疗剂化合物的组合。换句话说，术语“共给予”或“共-给予”或“组合疗法”意指以药学上可接受的剂型给予DMD外显子-跳跃反义寡核苷酸，例如eteplirsen，伴随一种或多种肌生成抑制蛋白治疗剂化合物和任选地本文公开的一种或多种糖皮质激素：(i)其在相同的剂型中，例如，相同的片剂或药物组合物，意味着药物组合物包含DMD外显子-跳跃反义寡核苷酸例如eteplirsen、一种或多种本文公开的肌生成抑制蛋白治疗剂化合物和任选地一种或多种糖皮质激素和药学上可接受的载体；(ii)在具有相同的给予方式的单独的剂型中，例如，药盒包含适合胃肠外给予的第一药物组合物，其包含DMD外显子-跳跃反义寡核苷酸例如eteplirsen和药学上可接受的载体；适合胃肠外给予的第二药物组合物，其包含一种或多种本文公开的肌生成抑制蛋白治疗剂化合物和药学上可接受的载体；和任选地适合胃肠外给予的第三药物组合物，其包含一种或多种本文公开的糖皮质激素和药学上可接受的载体；和(iii)在具有不同的给予方式的单独的剂型中，例如，药盒包含适合胃肠外给予的第一药物组合物，其包含DMD外显子-跳跃反义寡核苷酸例如eteplirsen和药学上可接受的载体；适合口服给予的第二药物组合物，其包含一种或多种本文公开的肌生成抑制蛋白治疗剂化合物和药学上可接受的载体；和任选地适合口服给予的第三药物组合物，其包含一种或多种本文公开的糖皮质激素和药学上可接受的载体。
此外，阅读本公开内容的本领域的技术人员将理解，当超过一种本文公开的肌生成抑制蛋白治疗剂化合物被给予时，药剂不需要共有相同的给予方式，例如，药盒包含适合胃肠外给予的第一药物组合物，其包含DMD外显子-跳跃反义寡核苷酸例如eteplirsen和药学上可接受的载体；适合口服给予的第二药物组合物，其包含本文公开的第一肌生成抑制蛋白治疗剂化合物和药学上可接受的载体；和适合胃肠外给予的第三药物组合物，其包含本文公开的第二非甾体抗炎化合物和药学上可接受的载体。本领域的技术人员将理解，上文在“共给予”或“共-给予”的背景中提及的伴随给予是指包含DMD外显子-跳跃反义寡核苷酸的药物组合物和包含肌生成抑制蛋白治疗剂化合物的药物组合物可在同一时间表中给予，即，同时和同一天，或在不同的时间表中给予，即，在不同(尽管不必然不同)的时间表中。
在该方面，当包含DMD外显子-跳跃反义寡核苷酸的药物组合物和包含肌生成抑制蛋白治疗剂化合物的药物组合物在不同的时间表中给予时，这样的不同时间表在本文也可称为“背景”或“背景给予”。例如，包含DMD外显子-跳跃反义寡核苷酸的药物组合物可以某一剂型一天两次给予，和包含肌生成抑制蛋白治疗剂化合物的药物组合物可一天一次给予，使得包含DMD外显子-跳跃反义寡核苷酸的药物组合物可以但不必然与包含肌生成抑制蛋白治疗剂化合物的药物组合物在一次每日给予期间同时给予。当然，对“共给予”、“共-给予”或“组合疗法”的其它适合的变化对本领域的技术人员而言在阅读本公开内容时将是显而易见的，并且是该术语的含义的一部分。
如本文使用的“长期给予”是指连续规律长期治疗性给予，即，定期给予而无实质性中断。例如，为治疗患者的肌营养不良的目的，每日给予，持续至少几个周或月或年的时间。例如，为治疗患者的肌营养不良的目的，每月给予，持续至少几个月或几年的时间(例如，每周给予持续至少6周，每周给予持续至少12周，每周给予持续至少24周，每周给予持续至少48周，每周给予持续至少72周，每周给予持续至少96周，每周给予持续至少120周，每周给予持续至少144周，每周给予持续至少168周，每周给予持续至少180周，每周给予持续至少192周，每周给予持续至少216周或每周给予持续至少240周)。在某些实施方案中，DMD外显子跳跃化合物例如eteplirsen以30mg/kg每周一次通过静脉内输注，与本文公开的肌生成抑制蛋白治疗剂化合物组合经长期给予。
术语“接触细胞”、“引入”或“递送”包括通过本领域常规的方法，包括转染(例如，脂质体、磷酸钙、聚乙烯亚胺)、电穿孔(例如，核转染)、微注射)递送本公开内容的治疗剂至细胞。
术语"烷基"是指直链(即，非分支或无环的)、支链、环状或多环非芳族烃基，其任选地被一个或多个官能团取代。除非另外规定，"烷基"包含1-8个，和优选地1-6个碳原子。C1-C6烷基意图包括至少C1、C2、C3、C4、C5和C6烷基。低级烷基是指含有1-6个碳原子的烷基。烷基的实例包括但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、戊基、异戊基、叔戊基、环戊基、己基、异己基、环己基等。烷基可以是取代的或未取代的。说明性的取代的烷基包括但不限于，氟代甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、3-氟丙基、羟基甲基、2-羟基乙基、3-羟基丙基、苯甲基、取代的苯甲基、苯乙基、取代的苯乙基等。
术语"烷氧基"是指烷基的子集，其中上文定义的具有指定数量的碳的烷基通过氧桥连接。例如，"烷氧基"是指基团-O-烷基，其中烷基包含直链、支链、环状构型的1-8个碳原子。"烷氧基"的实例包括但不限于，甲氧基、乙氧基、n-丙氧基、i-丙氧基、t-丁氧基、n-丁氧基、s-戊氧基等。
术语"芳基"，单独或作为较大部分如"芳烷基"、"芳烷氧基"或"芳基氧基-烷基"的一部分使用，是指具有6-14个环原子的芳族环基团，例如苯基、1-萘基、2-萘基、1-蒽基和2-蒽基。"芳基"环可包含一个或多个取代基。术语"芳基"可与术语"芳环"互换使用。"芳基"还包括稠合多环芳族环系统，其中芳族环与一个或多个环稠合。有用的芳环基团的非限制性实例包括苯基、羟基苯基、卤代苯基、烷氧基苯基、二烷氧基苯基、三烷氧基苯基、亚烷基二氧基苯基、萘基、菲基、蒽基、菲并等，以及1-萘基、2-萘基、1-蒽基和2-蒽基。本文使用的术语"芳基"的范围内还包括其中芳族环与一个或多个非-芳族环稠合的基团，例如茚满基、菲啶基或四氢萘基，其中连接基团或点在芳族环上。
术语“酰基”是指C(O)R基团(其中R表示H、烷基或芳基，如上文定义)。酰基的实例包括甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、苯乙酰基和类似基团。
术语“同系物”是指通过连续添加相同的化学基团而有规律地不同的化合物。例如，化合物的同系物可通过添加一个或多个-CH2-基团、氨基酸残基、核苷酸或核苷酸类似物而不同。
术语“细胞穿透肽”(CPP)或“增强细胞摄取的肽部分”可互换使用，和是指阳离子细胞穿透肽，亦称为“运输肽”、“载体肽”或“肽转导结构域”。例如，肽-缀合的氨基磷酸酯或二氨基磷酸酯吗啉(PPMO)可包括细胞穿透肽或增强细胞摄取的肽部分，如本文所述。在各种实施方案中，肽可共价键合至修饰的反义寡聚体。在进一步的实施方案中，肽可缀合至修饰的反义寡聚体的3’端或5’端。在进一步的实施方案中，肽可连接至哌嗪基部分或3’末端吗啉环的氮原子。在一些实施方案中，细胞穿透肽或增强细胞摄取的肽部分可包括富含精氨酸的肽，如本文所述。在非限制性实例中，本文公开的修饰的反义寡聚体可连接至富含精氨酸的肽，例如(Arg)6Gly(连接至寡核苷酸的6个精氨酸和1个甘氨酸)。
本文所示的肽具有在给定的细胞培养群的约或至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的细胞内诱导细胞穿透的能力，和在全身给予时允许大分子体内易位到多种组织内。在一些实施方案中，CPP具有式[(C(O)CHR'NH)m]R”，其中R'是天然存在的氨基酸的侧链或其一个或两个碳的同系物，R”选自氢或酰基，和m是至多50的整数。另外的CPP是本领域众所周知的，和公开于例如，美国公布申请号20100016215，其通过引用以其整体并入本文。在其它实施方案中，m是选自1-50的整数，其中当m是1时，该部分是单个氨基酸或其衍生物。
术语“氨基酸”是指包含连接有伯氨基、羧酸基、侧链和氢原子的碳原子的化合物。例如，术语“氨基酸”包括但不限于甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、组氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、丝氨酸、酪氨酸、焦赖氨酸、硒代半胱氨酸和精氨酸。另外，如本文使用的，“氨基酸”还包括氨基酸的衍生物，例如酯和酰胺和盐，以及其它衍生物，包括在代谢成活性形式后具有药理性质的衍生物。因此，术语“氨基酸”应理解为包括天然存在的和非天然存在的氨基酸。
术语“电子对”是指一对价电子，其不与其它原子键合或共有。
术语“同源性”是指在两个或更多个氨基酸序列或两个或更多个核苷酸序列之间相似性的量或程度。在一些实例中，序列同源性可包括一个或多个保守取代，使得一个或多个取代不会影响主题蛋白的基本结构或功能。保守核苷酸取代可包括一个核酸取代为另一个，使得取代不改变由密码子编码的氨基酸。保守氨基酸取代可包括一个氨基酸取代为另一个，使得被取代的氨基酸具有与取代氨基酸相同或相似的类型，例如脂肪族氨基酸被另一个脂肪族氨基酸取代。同源性可使用序列比较程序例如GAP确定(Deveraux等，1984，Nucleic Acids Research 12，387-395)。以此方式，与本文所述的那些相似或基本不同长度的序列可通过插入空位至对齐进行比较，使得空位被确定，例如，通过GAP使用的比较算法。
术语“分离的”是指实质上或基本上不含在其天然状态下正常伴随其的组分的材料。例如，如本文使用的“分离的寡核苷酸”或“分离的寡聚体”可以指已从在天然存在状态下侧连它的序列纯化或除去的寡聚体，例如，从在基因组中邻近该片段的序列除去的DNA片段。术语“分离”在涉及细胞时可以指从来源受试者(例如，具有寡核苷酸重复疾病的受试者)纯化细胞(例如，成纤维细胞、成淋巴细胞)。在mRNA或蛋白的情况下，“分离”可以指从来源，例如，细胞回收mRNA或蛋白。
术语“调节”包括“增加”或“减少”一个或多个可计量参数，任选地达到定义的和/或统计学显著的量。“增加”、“增强”或“提高”或“刺激”或“刺激性”一般是指相对于由没有反义寡聚体化合物和/或治疗剂，或对照化合物引起的反应，一种或多种修饰的反义寡聚体化合物或组合物和/或一种或多种治疗剂在细胞或受试者中产生或引起较大的生理反应(例如，下游效应)的能力。相关的生理或细胞反应(体内或体外)对本领域技术人员而言是显而易见的，和可包括肌生成抑制蛋白mRNA中外显子2的包含减少(或外显子2的排除增加)，和/或在细胞或组织中，例如在有需要的受试者中功能性肌生成抑制蛋白蛋白的表达减少。其它相关的生理或细胞反应(体内或体外)可包括在肌养蛋白mRNA中具有遗传突变的一个或多个外显子的包含减少(或排除增加)，和/或在细胞或组织中功能性或半功能性肌养蛋白的蛋白表达增加。“减少”或“降低”的量通常是“统计学显著”的量，和可包括与在缺少修饰的反义寡聚体化合物和/或治疗剂的给予(例如特定受试者或组的“天然”或“自然”表达率)或给予对照化合物的情况下由有需要的受试者产生的量比较，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多倍(例如，100、500、1000倍)的减少，包括在之间和大于1的所有整数和小数点(例如，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9)。术语“减少”或“抑制”一般可涉及一种或多种反义寡聚体化合物或组合物和/或一种或多种治疗剂“减少”相关的生理或细胞反应、例如本文所述的疾病或病况的症状的能力，如根据诊断领域的常规技术测量的。“增加”或“提高”的量通常是“统计学显著”的量，和可包括与在缺少修饰的反义寡聚体化合物和/或治疗剂的给予(例如特定受试者或组的“天然”或“自然”表达率)或给予对照化合物的情况下由有需要的受试者产生的量比较，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多倍的增加(例如，100、500、1000倍)，包括在之间和大于1的所有整数和小数点(例如，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9)。术语“提高”一般可涉及一种或多种修饰的反义寡聚体化合物或组合物和/或一种或多种治疗剂“增加”相关的生理或细胞反应、例如本文所述的疾病或病况的症状的能力，如根据诊断领域的常规技术测量的。
相关的生理或细胞反应(体内或体外)对本领域技术人员而言将是显而易见的，和可包括杜兴肌营养不良(DMD)和相关病症、例如贝克肌营养不良(BMD)、肢带肌营养不良、先天性肌营养不良症、面肩肱肌营养不良、肌强直性肌营养不良、眼咽肌营养不良、远端肌营养不良、埃-德二氏肌营养不良、肌肉消瘦病况或病症例如AIDS、癌症或化学疗法相关的肌肉消瘦，和纤维化或纤维化-相关病症(例如，骨骼肌肉纤维化)的症状或病理减少。在其它实施方案中，提供治疗杜兴肌营养不良和相关病症的方法，例如，其中症状或病理的减少可伴有或涉及功能性肌养蛋白的蛋白表达增加和/或功能性肌生成抑制蛋白的蛋白表达减少。反应的“增加”可以是与在缺少修饰的反义寡聚体化合物和/或治疗剂的给予的情况下由有需要的受试者产生的量比较(例如当与特定受试者或组的“天然”或“自然”表达率相比时)或当与对照化合物相比时“统计学显著的”，和可包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％增加，包括在之间的所有整数。
如本文使用的术语“治疗剂”或“治疗试剂”是指能够生产治疗效果的试剂。在一些实施方案中，治疗剂是或包含多肽、多肽类似物、核酸、核酸类似物、适体或小分子。“多肽”、“肽”和“蛋白”可互换使用和意指任何肽连接的氨基酸链，不管长度或翻译后修饰。多肽可以是野生型蛋白、野生型蛋白的功能片段或野生型蛋白或片段的变体。变体可包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入。取代可以是保守的或非保守的。保守的取代通常包括在以下组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；和苯基丙氨酸和酪氨酸。在一些实施方案中，蛋白包括抗体或可溶性受体。在实施方案中，可溶性受体是ACVR2(例如，ACVR2B)。在一些实施方案中，核酸是编码蛋白、例如肌养蛋白、微肌养蛋白或小肌养蛋白的核酸。在实施方案中，核酸是反义寡聚体或siRNA。在一些实施方案中，反义寡聚体是本文所述的修饰的反义寡聚体。
如本文使用的，术语“抗体”是指包含两个轻链多肽和两个重链多肽的完整抗体。完整抗体包括不同的抗体同种型，包括IgM、IgG、IgA、IgD和IgE抗体。术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合化或嵌合抗体、人源化抗体、灵长类动物化抗体、去免疫抗体和全人抗体。抗体可在各种物种的任一种中制备，或源自各种物种的任一种，例如，哺乳动物，例如人、非-人灵长类动物(例如，猩猩、狒狒或黑猩猩)、马、牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠和小鼠。抗体可以是纯化的或重组的抗体。
如本文使用的，术语“抗体片段”、“抗原-结合片段”或类似术语是指保留结合靶标抗原和抑制靶标抗原活性的能力的抗体片段。这样的片段包括，例如，单链抗体、单链Fv片段(scFv)、Fd片段、Fab片段、Fab′片段或F(ab′)2片段。scFv片段是单一多肽链，其包括scFv所来源的抗体的重链和轻链可变区二者。此外，细胞内抗体、小型抗体、三特异性抗体和双特异性抗体也包括在抗体的定义中，和与在本文所述的方法中使用相容。参见例如，Todorovska等(2001)J Immunol Methods 248(1):47-66；Hudson和Kortt(1999)J ImmunolMethods231(1):177-189；Poljak(1994)Structure 2(12):1121-1123；Rondon和Marasco(1997)Annual Review of Microbiology 51:257-283，其各自通过引用以其整体并入本文。
如本文使用的，术语“抗体片段”还包括，例如，单结构域抗体例如骆驼化的单结构域抗体。参见例如，Muyldermans等(2001)Trends Biochem Sci 26:230-235；Nuttall等(2000)Curr Pharm Biotech 1:253-263；Reichmann等(1999)J Immunol Meth 231:25-38；PCT申请公布号WO 94/04678和WO 94/25591；和美国专利号6,005,079，其各自通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，本公开内容提供了单结构域抗体，其包含具有修饰的两个VH结构域，使得形成单结构域抗体。
在一些实施方案中，抗原-结合片段包括重链多肽的可变区和轻链多肽的可变区。在一些实施方案中，本文所述的抗原-结合片段包含抗体的轻链和重链多肽的CDR。
肌生成抑制蛋白，亦称为生长分化因子8(GDF-8)，属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族。肌生成抑制蛋白是由MSTN基因编码的蛋白。肌生成抑制蛋白氨基酸序列是MQKLQLCVYIYLFMLIVAGPVDLNENSEQKENVEKEGLCNACTWRQNTKSSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQVDGKPKCCFFKFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVETPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLKLDMNPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVVDRCGCS(SEQ IDNO:3502)。MSTN基因主要在人骨骼肌肉中表达和作为肌肉生长的负调节剂起作用。例如，在改造以缺少肌生成抑制蛋白基因的小鼠中证实，产生正常小鼠两倍的肌肉质量(McPherron等(1997)，Nature 387:83-90)。
在实施方案中，肌生成抑制蛋白治疗剂能够在受试者中抑制肌生成抑制蛋白活性和肌生成抑制蛋白表达的一者或两者。肌生成抑制蛋白治疗剂可以是靶向肌生成抑制蛋白前-mRNA和干扰肌生成抑制蛋白前-mRNA转录为成熟mRNA的治疗剂。在实施方案中，肌生成抑制蛋白治疗剂能够在人肌生成抑制蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃。在实施方案中，肌生成抑制蛋白治疗剂诱导肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子2跳跃和抑制含有外显子2的肌生成抑制蛋白前-mRNA的表达。肌生成抑制蛋白治疗剂可以是靶向肌生成抑制蛋白蛋白和干扰肌生成抑制蛋白蛋白与肌生成抑制蛋白受体结合的治疗剂。肌生成抑制蛋白治疗剂蛋白可以是抗-肌生成抑制蛋白抗体、例如抗-GDF8(Abcam，Cambridge MA)、Domagrozumab(PF-06252616；Pfizer Inc.)；Stamulumab(Cambridge AntibodyTechnology)；PF-3446879(Pfizer Inc.)；Landogrozumab(LY-2495655；Eli Lilly)；或Trevogrumab(REGN-103；Regeneron)。在实施方案中，肌生成抑制蛋白治疗剂可以是可溶性受体，其中可溶性受体是ACVR2(例如，ACVR2B；MTAPWVALALLWGSLCAGSGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTLLTVLAYSLLPIGGLSLIVLLAFWMYRHRKPPYGHVDIHEDPGPPPPSPLVGLKPLQLLEIKARGRFGCVWKAQLMNDFVAVKIFPLQDKQSWQSEREIFSTPGMKHENLLQFIAAEKRGSNLEVELWLITAFHDKGSLTDYLKGNIITWNELCHVAETMSRGLSYLHEDVPWCRGEGHKPSIAHRDFKSKNVLLKSDLTAVLADFGLAVRFEPGKPPGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGLVLWELVSRCKAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEELQEVVVHKKMRPTIKDHWLKHPGLAQLCVTIEECWDHDAEARLSAGCVEERVSLIRRSVNGTTSDCLVSLVTSVTNVDLPPKESSI；SEQ ID NO:3503)。在一些实施方案中，可溶性受体(例如，ACVR2B)与异源部分缀合，例如，增加治疗剂在受试者中的循环半寿期的部分。在一些实施方案中，该部分是免疫球蛋白的Fc部分(例如，人IgG Fc)。在一些实施方案中，该部分是聚乙二醇部分。在一些实施方案中，该部分包含白蛋白多肽(例如，人白蛋白)的所有或一部分。在一些实施方案中，肌生成抑制蛋白治疗剂是人ACVR2-Fc融合物，例如，ramatercept(Acceleron)。肌生成抑制蛋白治疗剂包括核酸，其中核酸选自反义寡聚体和siRNA。反义寡聚体可以是修饰的肌生成抑制蛋白反义寡聚体，如本文所述。在一些实施方案中，肌生成抑制蛋白治疗剂是小分子、例如OSX-200(Ossianix Inc)或SRK-015(Scholar Rock Inc.)。
可用于本文所述的方法和组合物的肌生成抑制蛋白的拮抗剂包括，例如，直接结合肌生成抑制蛋白(GDF-8)的试剂、例如抗-肌生成抑制蛋白抗体。这样的抗体是本领域已知的和描述于例如，国际专利申请公布号WO2006116269(Pfizer)、美国专利号8,066,996(Eli Lilly)、美国专利号7,807,159(Amgen)、美国专利号6,096,506和美国专利号6,468,535，其各自的公开内容通过引用以其整体并入本文。肌生成抑制蛋白拮抗剂还包括可溶性激活蛋白受体蛋白或包含可溶性激活蛋白的融合蛋白(例如，ACVR2-Fc融合蛋白)。可溶性激活蛋白受体蛋白描述于，例如，国际专利申请公布号WO 2010129406(Johns HopkinsUniversity)、美国专利申请公布号20090005308(Acceleron)、国际专利申请公布号WO2008/097541(Acceleron)和国际专利申请公布号WO 2010019261(Acceleron)，其各自的公开内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，肌生成抑制蛋白拮抗剂是抑制肌生成抑制蛋白的表达的核酸，例如短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微-RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子，其能够介导针对肌生成抑制蛋白的RNA干扰(RNAi)。这样的分子描述于，例如，美国专利申请公布号20050124566和美国专利号7,887,793，其各自的公开内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，核酸抑制肌生成抑制蛋白的启动子，从而抑制肌生成抑制蛋白表达，如描述于，例如，AbbottLaboratories的美国专利号6,284,882。肌生成抑制蛋白的抑制剂还包括抑制通过其受体的肌生成抑制蛋白信号传导的试剂、例如抗-ACVR2B抗体(参见例如，美国专利申请公布号20100272734(Novartis)和国际专利申请公布号WO2014172448(Anaptysbio))。还有另外的肌生成抑制蛋白的示例性抑制剂描述于国际专利申请公布号WO 2006/083183。
在一些实施方案中，首先给予肌养蛋白治疗剂和接着给予肌生成抑制蛋白治疗剂。例如，给予肌养蛋白治疗剂持续足以在给予治疗剂的受试者的肌肉中促进、恢复和/或增加功能性肌养蛋白的蛋白表达的时间。随后，肌生成抑制蛋白治疗剂被给予受试者足以例如，在受试者中提高肌肉质量、强度和/或弹性的时间。在实施方案中，肌养蛋白治疗剂能够增加受试者的肌养蛋白的表达。肌养蛋白治疗剂可增加肌养蛋白或截短形式的肌养蛋白(功能性或半功能性)的表达。截短形式的肌养蛋白包括但不限于，微肌养蛋白和小肌养蛋白(公开于EP专利号2125006，其通过引用以其整体并入本文)。肌养蛋白治疗剂可以是靶向肌养蛋白前-mRNA和调节肌养蛋白前-mRNA转录为成熟mRNA的治疗剂，例如，如本文所述的修饰的反义寡聚体。在实施方案中，肌养蛋白治疗剂能够在人肌养蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃。在实施方案中，靶向的肌养蛋白前-mRNA可具有一个或多个遗传突变。肌养蛋白治疗剂诱导外显子跳跃，使得含有一个或多个遗传突变的一个或多个外显子在加工为成熟mRNA期间从肌养蛋白前-mRNA除去。得到的截短mRNA可翻译成功能性或半功能性肌养蛋白。
在一些实施方案中，肌养蛋白治疗剂是或包含编码功能性肌养蛋白的核酸，例如，微肌养蛋白或小肌养蛋白。在一些实施方案中，核酸通过病毒递送被引入受试者的肌肉细胞。在一些实施方案中，功能性肌养蛋白从核酸的蛋白表达受肌肉特异性的启动子驱动，例如肌肉肌酸激酶(MCK)的启动子。使用包含功能性肌养蛋白的病毒载体用于DMD基因疗法已描述于，例如，Shin等(2013)Mol Ther 21(4):750-757；Rodino-Klapac等(2011)MethodsMol Biol 709:287-298；Okada等(2013)Pharmaceuticals 6(7):813-836；Rodino-Klapac等(2010)Mol Ther 18(1):109-117；Vincent等(1993)Nature Genetics 5:130-134；Xu等(2007)Neuromusc Disorders 17:209-220；Martin等(2009)Am J Physiol Cell Physiol296:476-488；国际专利申请公布号WO 2009/088895和美国专利申请公布号2010003218和20140323956，其各自的公开内容通过引用以其整体并入本文。本领域技术人员充分知道可用于递送转基因至目的细胞的其它载体系统，例如，美国专利号5,707,618；Verhaart等(2012)Curr Opin Neurol 25(5):588-596；Odom等(2011)Mol Ther 19(1):36-45；和Koppanati等(2010)Gene Ther 17(11):1355-1362。评价转基因递送功能性肌养蛋白的正进行的临床研究包括例如，具有U.S.ClinicalTrials.gov标识符：NCT02376816(Nationwide Children’s Hospital)和NCT00428935(Nationwide Children’s Hospital)的研究以及描述于Bowles等(2012)Mol Ther 20(2):443-455的试验。
本领域技术人员完全知道，肌养蛋白基因中的各种突变对治疗性外显子跳跃易感。例如，在以下外显子中的突变的非限制性实例对外显子51跳跃易感，包括例如：45-50、47-50、48-50、49-50、50、52、52-63(莱顿杜兴肌营养不良突变数据库，莱顿大学医学中心，荷兰)。测定患者是否具有对外显子跳跃易感的DMD基因的突变也完全在本领域技术人员的范围内(参见例如，Aartsma-Rus等(2009)Hum Mut 30:293-299和Abbs等(2010)NeuromuscDisorders 20:422-427，其各自的公开内容通过引用以其整体并入本文)。
Eteplirsen(参见例如，美国专利号7,807,816，通过引用以其整体结合到本文中)已经是临床研究的对象，以测试其安全性和功效，和临床开发正在进行。Eteplirsen是二氨基磷酸酯吗啉(PMO)反义寡核苷酸。在一些实施方案中，肌养蛋白治疗剂是eteplirsen。"Eteplirsen"，亦称为"AVN-4658"，是具有碱基序列5’-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3’(SEQ ID NO:76)的PMO。Eteplirsen以CAS登记号1173755-55-9登记。化学名称包括：RNA、[P-脱氧-P-(二甲基氨基)](2’,3’-二脱氧-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环)(2’a→5’)(C-m5U-C-C-A-A-C-A-m5U-C-A-A-G-G-A-A-G-A-m5U-G-G-C-A-m5U-m5U-m5U-C-m5U-A-G)(SEQ IDNO:263)、5’-[P-[4-[[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基]羰基]-1-哌嗪基]-N,N-二甲基氨基膦酸酯]和P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-5'-O-{P-[4-(10-羟基-2,5,8-三氧杂癸酰基)哌嗪-1-基]-N,N-二甲基膦酰胺基}-2',3'-亚氨基-2',3'-开环胞苷酰基-(2'a→5')-P,3'-二脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环胸苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环胞苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环胞苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环腺苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环腺苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环胞苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环腺苷酰基-(2'a→5')-P,3'-二脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环胸苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环胞苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环腺苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环腺苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环鸟苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环鸟苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环腺苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环腺苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环鸟苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环腺苷酰基-(2'a→5')-P,3'-二脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环胸苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环鸟苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环鸟苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环胞苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环腺苷酰基-(2'a→5')-P,3'-二脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环胸苷酰基-(2'a→5')-P,3'-二脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环胸苷酰基-(2'a→5')-P,3'-二脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环胸苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环胞苷酰基-(2'a→5')-P,3'-二脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环胸苷酰基-(2'a→5')-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环腺苷酰基-(2'a→5')-2',3'-二脱氧-2',3'-亚氨基-2',3'-开环鸟苷。
Eteplirsen具有以下结构：
"肌养蛋白"是棒形胞质蛋白，并且是通过细胞膜连接肌肉纤维的细胞骨架至周围的细胞外基质的蛋白复合物的重要部分，由肌养蛋白(即，DMD)基因编码。肌养蛋白包含多个功能结构域。例如，肌养蛋白包含约氨基酸14-240的肌动蛋白结合结构域和约氨基酸253-3040的中央棒结构域。这种大的中央结构域由24个约109个氨基酸的血影蛋白-样三螺旋元件构成，其与α-辅肌动蛋白和血影蛋白具有同源性。这种重复序列通常被4个富含脯氨酸的非重复区段(亦称为铰链区)打断。重复序列15和16被18个氨基酸段分隔，其显示提供肌养蛋白的蛋白水解切割的主要位点。大多数重复序列之间的序列同一性范围为10-25％。一个重复序列包含三个α-螺旋：1、2和3。α-螺旋1和3各自由7个螺旋转角形成，其可能作为卷曲螺旋通过疏水界面相互作用。α-螺旋2具有更复杂的结构，和通过由甘氨酸或脯氨酸残基分隔的4个和3个螺旋转角的区段形成。每个重复序列由两个外显子编码，其通常在α-螺旋2的第一部分的氨基酸47和48之间被内含子中断。其它内含子存在于重复序列的不同位置，通常散布在螺旋-3上。肌养蛋白还包含在约氨基酸3080-3360的富含半胱氨酸的结构域，包括富含半胱氨酸的区段(即，15个半胱氨酸/280个氨基酸)，显示与粘霉菌(盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum))α-辅肌动蛋白的C-末端结构域的同源性。羧基-末端结构域在约氨基酸3361-3685。
肌养蛋白的氨基-末端结合F-肌动蛋白和羧基-末端结合肌膜中的肌养蛋白-相关的蛋白复合物(DAPC)。DAPC包括肌营养不良聚糖、肌聚糖、整联蛋白和小窝蛋白，和任何这些组分中的突变引起常染色体遗传的肌营养不良。当肌养蛋白缺乏时DAPC失稳，这导致成员蛋白的水平降低，和进而导致进行性纤维损伤和膜泄露。在各种形式的肌营养不良中，例如杜兴肌营养不良(DMD)和贝克肌营养不良(BMD)，肌肉细胞产生改变的和功能缺陷形式的肌养蛋白，或根本无肌养蛋白，主要归因于导致不正确剪接的基因序列的突变。缺陷型肌养蛋白的优势表达或完全缺乏肌养蛋白或肌养蛋白-样蛋白，导致肌肉退化的快速进展，如上所述。在该方面，"缺陷型"肌养蛋白可表征为如本领域已知的在某些DMD或BMD受试者中产生的肌养蛋白形式，或缺少可检测的肌养蛋白。
提及肌养蛋白时，术语“功能性”包括源自含有对应于肌养蛋白基因的所有外显子1-79的序列的mRNA转录物的那些蛋白，亦称为野生型蛋白。功能性肌养蛋白通常是指通常与在某些DMD或相关病症的受试者中存在的改变的或"缺陷型"形式的肌养蛋白相比，具有足够生物活性以减少肌肉组织的进行性降解(其否则是杜兴肌营养不良特有的)的肌养蛋白。功能性肌养蛋白可具有野生型肌养蛋白的体外或体内生物活性的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％(包括在之间的所有整数)，如根据本领域的常规技术测量的。作为一个实例，在肌肉体外培养物中肌养蛋白相关的活性可根据肌管尺寸、肌原纤维组构(或结构破坏)、收缩活性和乙酰胆碱受体的自发簇集测量(参见例如，Brown等，Journal of Cell Science.112:209-216，1999)。动物模型也是用于研究疾病的发病机理的有价值来源，和提供了测试肌养蛋白-相关活性的手段。两种用于DMD研究的最广泛使用的动物模型是mdx小鼠和金毛猎犬肌营养不良(GRMD)犬，这两者均是肌养蛋白阴性的(参见例如，Collins&Morgan，Int J Exp Pathol 84:165-172，2003)。这些和其它动物模型可用于测量各种肌养蛋白的功能活性。包括截短形式的肌养蛋白，例如通过某些本发明的反义寡聚体化合物产生的那些形式。
术语“功能性”或“半功能性”肌养蛋白包括源自含有对应于截短形式的转录物(例如，具有少于肌养蛋白基因的所有外显子1-79的肌养蛋白mRNA转录物)的序列的mRNA转录物的那些蛋白。换句话说，截短形式的肌养蛋白mRNA可排除相应肌养蛋白基因的一个或多个外显子。截短形式的肌养蛋白mRNA可表达截短或缩短形式的肌养蛋白，亦称为微肌养蛋白。
提及肌生成抑制蛋白时，术语“功能性”包括源自含有对应于肌生成抑制蛋白基因的外显子1、外显子2和外显子3的所有序列的mRNA转录物的那些蛋白，亦称为野生型蛋白。
非功能性、功能障碍或失活的肌生成抑制蛋白包括源自缺失对应于外显子1、外显子2和外显子3的序列的全基因的所有或任何部分的肌生成抑制蛋白mRNA转录物的蛋白，或包含对应于内含子1、内含子2或其它内含子序列的序列的所有或一部分的蛋白，或在非功能性状态涉及缺失源自相应的外显子或另外源自包含相应的内含子(包括其部分或全部序列)的功能元件时。非功能性、功能障碍或失活的肌生成抑制蛋白包括源自排除外显子2的肌生成抑制蛋白mRNA转录物，例如，和/或相对于野生型肌生成抑制蛋白具有减少的功能性的蛋白。
因此，在各种实施方案中，功能性或半功能性肌养蛋白的存在、表达或表达增加可例如，通过蛋白印迹分析和例如，用修饰的反义寡聚体和/或本公开内容的治疗剂处理的DMD患者来源的肌肉细胞的肌养蛋白基因表达测定。在各种实施方案中，用本公开内容的修饰的反义寡聚体和/或治疗剂处理DMD肌肉细胞或治疗需要DMD治疗的受试者可导致在正常细胞或正常受试者中肌养蛋白的蛋白表达的正常量的例如约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的量的功能性肌养蛋白的蛋白表达。
在各种实施方案中，由需要DMD治疗的组织或受试者表达的肌养蛋白或截短的肌养蛋白的功能性可通过与未处理的等同物相比，例如，肌肉纤维数量、肌肉质量增加、具有中央核的肌肉纤维的百分比和功能性肌养蛋白的量的免疫组织化学分析测定。需要DMD治疗的受试者的肌养蛋白或截短的肌养蛋白的功能性可通过身体和生理试验，例如运动功能试验，包括肌肉质量和抓握力量的测量，进一步分析。
在一些实施方案中，肌养蛋白治疗剂在目的细胞中恢复肌养蛋白表达。术语肌养蛋白合成或生产的“恢复”一般是指用如本文所述的eteplirsen治疗后在具有肌营养不良的患者中肌养蛋白包括截短形式的肌养蛋白的生产。在一些实施方案中，治疗导致在患者中新肌养蛋白生产增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％(包括在之间的所有整数)。在一些实施方案中，治疗增加肌养蛋白阳性纤维的数量至在受试者中正常值的至少20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％至100％。在其它实施方案中，治疗增加肌养蛋白阴性纤维的数量至在受试者中正常值的约20％-约60％或约30％-约50％。治疗后在患者中肌养蛋白阳性纤维的百分比可使用已知技术通过肌肉活检测定。例如，肌肉活检可获自适合的肌肉，例如患者的肱二头肌。
阳性肌养蛋白纤维的百分比分析可在治疗前和/或在治疗后或在整个治疗过程的时间点进行。在一些实施方案中，治疗后活检获自治疗前活检对侧的肌肉。治疗前和治疗后肌养蛋白表达研究可使用任何对肌养蛋白适合的测定法进行。在一个实施方案中，免疫组织化学检测在来自肌肉活检的组织切片上，使用对于肌养蛋白是标记物的抗体、例如单克隆或多克隆抗体进行。例如，可使用MANDYS106抗体，其是肌养蛋白的高度敏感的标记物。可使用任何适合的第二抗体。
在一些实施方案中，肌养蛋白阳性纤维的百分比通过阳性纤维的数量除以计数的总纤维计算。正常的肌肉样品具有100％肌养蛋白阳性纤维。因此，肌养蛋白阳性纤维的百分比可表示为正常值的百分比。当在治疗后肌肉中计数肌养蛋白-阳性纤维时，为了对治疗前肌肉以及回复体纤维中痕量水平的肌养蛋白的存在设置对照，基线可使用来自各患者的治疗前肌肉的切片设定。这可用作用于在所述患者的治疗后肌肉的切片中计数肌养蛋白-阳性纤维的阈值。在其它实施方案中，抗体染色的组织切片也可使用Bioquant图像分析软件(Bioquant Image Analysis Corporation，Nashville，TN)，用于肌养蛋白量化。总肌养蛋白荧光信号强度可报告为正常值的百分比。此外，用单克隆或多克隆抗-肌养蛋白抗体的蛋白印迹分析可用于测定肌养蛋白阳性纤维的百分比。例如，可使用来自Novacastra的抗肌养蛋白抗体NCL-Dys1。肌养蛋白生产也可通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测量。引物可经设计以测量将产生功能性肌养蛋白的肌养蛋白基因。肌养蛋白-阳性纤维的百分比也可通过测定肌聚糖复合物(β，γ)和/或神经元NOS的组分表达分析。
在一些实施方案中，治疗减慢或减少在无治疗时将预期的DMD患者的进行性呼吸肌肉功能障碍和/或衰竭。在一些实施方案中，治疗稳定DMD患者的呼吸肌肉功能。在一个实施方案中，用eteplirsen治疗可减少或消除对在无治疗时将预期的换气辅助设备的需要。在一个实施方案中，为跟踪疾病过程以及评价可能的治疗性干涉而对呼吸功能的测量包括最大吸气压力(MIP)、最大呼气压力(MEP)和最大肺活量(FVC)。MIP和MEP测量在吸入和呼气期间分别可产生的压力水平，并且是呼吸肌肉力量的灵敏度量。MIP是横隔膜肌肉虚弱的度量。
在一些实施方案中，治疗可在受试者中稳定、维持、改进或增加行走能力(例如，步行稳定)。在一些实施方案中，治疗在患者中维持、增加或减少稳定的行走距离的损失，如通过例如，6分钟行走试验(6MWT)所测量的，描述于McDonald等(Muscle Nerve，2010；42:966-74；Muscle Nerve，2010；41:500-10，其内容通过引用以其整体并入本文)。6MWT是临床上有意义的关注步行的终点，其特征为随时间进行，行走功能的变化，作为疾病状态的变化的表示。
6分钟行走距离(6MWD)的变化可表示为绝对值、百分比变化或％-预测值的变化。相对于健康同等人的典型表现，在6MWT中DMD患者的表现可通过计算％-预测值测定。例如，％-预测6MWD可使用对于男性的以下方程计算：196.72+(39.81x年龄)–(1.36x年龄2)+(132.28x以米计算的高度)。对于女性，％-预测6MWD可使用以下方程计算：188.61+(51.50x年龄)–(1.86x年龄2)+(86.10x以米计算的高度)(Henricson等PLoS Curr.，2012，version2，其内容通过引用以其整体并入本文)。
步行可通过各种方法测量，包括North Star Ambulatory Assessment(NSAA)。NSAA通过Physiotherapy Assessment and Evaluation Group of the North StartClinical Network开发，以评价具有DMD的行走男孩，和提供评分为2-0的一系列活动，其中2为正常和0为"不能独立地实现"(2006-2011MDC/North Star Clinical Network)。这些活动包括从站立最少3秒，到沿箱子上下爬动，到奔跑。在某些实施方案中，用eteplirsen治疗可维持、稳定、增加或改进步行，例如，通过NSAA测定。
在本发明的情况中，与未治疗相比，治疗剂，包括修饰的反义寡聚体，用于诱导含有外显子2的肌生成抑制蛋白mRNA的减少，导致杜兴肌营养不良症状的改善(例如功能性肌生成抑制蛋白的减少)约30％-约100％的范围，或上文公开关于功能性的百分比。这样的症状改善可在微观水平(例如肌生成抑制蛋白表达减少，通过例如，免疫组织化学、免疫荧光、蛋白印迹分析测量；肌肉生长增加；肌肉功能恢复)和生理水平(例如运动功能改进，通过身体检查评价)上观察到。
修饰的反义寡聚体用于在肌养蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃，其中肌养蛋白前-mRNA包括具有一个或多个遗传突变的外显子，或其中肌养蛋白基因的一个或多个区域已被缺失，导致涉及杜兴肌营养不良和相关病症的症状改善(例如功能性或半功能性肌养蛋白的恢复)。与未治疗相比，功能性或半功能性肌养蛋白可增加约30％-约100％的范围或上文公开的关于功能性的百分比。这样的症状改善可在微观水平(例如肌养蛋白的表达增加，通过例如，免疫组织化学、免疫荧光、蛋白印迹分析测量；肌肉生长增加；肌肉功能恢复)和生理水平(例如运动功能改进，通过身体检查评价)上观察到。
术语“核苷酸”是指包含核碱基、糖和至少一个磷酸酯基团(例如，磷酸二酯连接基团)的天然存在的核苷酸。
术语“核苷酸类似物”是指天然存在的核苷酸的衍生物或修饰，例如，包含至少一种修饰的核苷酸。这样的修饰可包括以下的至少一种：(i)修饰的核苷间连键，(ii)修饰的糖部分，或(iii)前述的组合。技术人员将理解，在关于核苷酸亚单位的任何一个组分(例如，修饰的糖)指定修饰时，核苷酸亚单位的未指定的部分可保持未修饰(例如，未修饰的核苷间连键、未修饰的核碱基)。
术语“寡核苷酸”、“寡聚体”、“寡聚物”、“反义寡核苷酸”、“反义寡聚体”、“修饰的反义寡聚体”和“反义寡聚物”和其它适合的组合和其衍生语，是指核苷酸或核苷酸类似物的线性序列，其中一个或多个核碱基可通过Watson-Crick碱基配对杂交至寡聚体所针对的称为靶标序列的靶标RNA的一部分，以在靶标序列内形成寡聚体:RNA异源双链体。特别地，术语“反义”、“寡核苷酸”、“寡聚体”、“寡聚物”和“化合物”可以各种组合使用，和可互换地是指这样的寡聚体。包含核苷酸的部分的环状亚单位可基于核糖或其它戊糖、糖类似物或在某些实施方案中可以是修饰的糖，例如，吗啉基团(参见下文基于吗啉的寡聚体的描述)。
术语“修饰的”、“非天然存在的”或“类似物”和其它适合的组合和其衍生语，当涉及寡聚体时，是指具有一个或多个核苷酸亚单位的寡聚体，所述核苷酸亚单位具有选自以下的至少一种修饰：(i)修饰的核苷间连键，例如，并非天然存在的寡核苷酸中发现的标准磷酸二酯键的核苷间连键，(ii)修饰的糖部分，例如，并非天然存在的寡核苷酸中发现的核糖或脱氧核糖部分的部分，或(iii)前述的组合。在各种实施方案中，修饰的核苷间连键选自硫代磷酸酯核苷间连键、氨基磷酸酯核苷间连键、二氨基磷酸酯核苷间连键和三氨基磷酸酯核苷间连键。在进一步的实施方案中，二氨基磷酸酯核苷间连键包含磷原子，其共价键合至(1,4-哌嗪)-1-基部分、取代的(1,4-哌嗪)-1-基部分、4-氨基哌啶-1-基部分或取代的4-氨基哌啶-1-基部分。在各种实施方案中，修饰的糖部分选自肽核酸(PNA)亚单位、锁核酸(LNA)亚单位、2'O,4'C-亚乙基-桥接的核酸(ENA)亚单位、三环-DNA(tc-DNA)亚单位、2’O-甲基亚单位、2’O-甲氧基乙基亚单位、2’-氟亚单位、2'-O-[2-(N-甲基氨基甲酰基)乙基]亚单位和吗啉亚单位。
对核苷间连键的修饰可在寡聚体的至少两个糖和/或修饰的糖部分之间。核苷酸类似物支持能够通过Watson-Crick碱基配对与天然存在的寡核苷酸碱基氢键合的碱基，其中类似物在寡聚体类似物分子和天然存在的寡核苷酸(例如，单链RNA或单链DNA)的碱基之间以序列特异性方式，以允许这样的氢键合的方式提供碱基。示例性的类似物是具有基本上不带电荷的含磷核苷间连键的那些。
“抗核酸酶”寡聚体是指以非杂交或杂交形式，核苷间连键显著抵抗通过在身体中常见的细胞外和细胞内核酸酶(例如，通过核酸外切酶例如3’-核酸外切酶、核酸内切酶、RNase H)的核酸酶裂解的寡聚体；即，寡聚体显示在寡聚体所暴露的身体中在正常的核酸酶条件下很少或没有核酸酶裂解。“抗核酸酶异源双链体”是指通过修饰的反义寡聚体与其互补靶标结合形成的异源双链体，使得异源双链体显著抵抗通过细胞内和细胞外核酸酶的体内降解，所述核酸酶能够切割双链RNA/RNA或RNA/DNA复合物。“异源双链体”是指在修饰的反义寡聚体和靶标RNA的互补部分之间的双链体。例如，抗核酸酶寡聚体可以是如本文所述的修饰的反义寡聚体。
术语“核碱基”(Nu)、“碱基配对部分”或“碱基”可互换使用，是指在天然存在的或“天然”DNA或RNA中发现的嘌呤或嘧啶碱基(例如，尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤)以及这些天然存在的嘌呤和嘧啶的类似物，其可提供改进的性质，例如对寡聚体的结合亲和力。示例性的类似物包括次黄嘌呤(核苷肌苷的碱基组分)；2,6-二氨基嘌呤；5-甲基胞嘧啶；C5-丙炔基-修饰的嘧啶；10-(9-(氨基乙氧基)吩噁嗪基)(G-clamp)等。
碱基配对部分的其它实例包括但不限于，尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和次黄嘌呤(肌苷)，其各自的氨基被酰基保护基保护；2-氟尿嘧啶、2-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、氮杂胞嘧啶、嘧啶类似物例如假异胞嘧啶和假尿嘧啶和其它修饰的核碱基，例如8-取代的嘌呤、黄嘌呤或次黄嘌呤(后两者是天然降解产物)。在Chiu和Rana,RNA,2003,9,1034-1048,Limbach et al.Nucleic Acids Research,1994,22,2183-2196和Revankar和Rao,Comprehensive Natural Products Chemistry,1999,vol.7,313中公开的修饰的核碱基也是预期的，其内容通过引用并入本文。
碱基配对部分的其它实例包括但不限于，扩展尺寸的核碱基，其中已添加一个或多个苯环。核碱基置换描述于以下实例：Glen Research catalog(www.glenresearch.com)；Krueger AT et al.,Acc.Chem.Res.,2007,40,141-150；Kool,ET,Acc.Chem.Res.,2002,35,936-943；Benner S.A.,et al.,Nat.Rev.Genet.,2005,6,553-543；Romesberg,F.E.,et al.,Curr.Opin.Chem.Biol.,2003,7,723-733；Hirao,I.,Curr.Opin.Chem.Biol.,2006,10,622-627，每个实例的内容通过引用并入本文。这些预期用于合成本文所述的各种寡聚体。扩展尺寸的核碱基的实例显示如下：
共价连接至核糖、糖类似物、修饰的糖或吗啉的核碱基包含核苷。“核苷酸”包含核苷以及至少一个磷酸酯连接基团。磷酸酯基团包含与相邻核苷的共价键，形成寡聚体。因此，核苷酸的磷酸酯基团通常称为形成“核苷间连键”。因此，核苷酸包含如本文进一步描述的核苷和核苷间连键。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的反义寡聚体包含亚单位，其中“亚单位”包括天然存在的核苷酸、如本文所述的核苷酸类似物和其组合。在某些实施方案中，本公开内容的修饰的反义寡聚体包含亚单位，其中至少一个亚单位是核苷酸类似物。
在核酸的情况下，术语“序列同一性”、“序列同源性”和“互补性”(例如“与……具有50％同一性的序列”、“与……具有50％同源性的序列”和“与……具有50％互补性的序列”)是指在核苷酸与核苷酸的基础上在比较窗内序列相同的程度。“百分比同一性”、“百分比同源性”和“百分比互补性”可通过以下计算：在比较窗内比较两个最佳比对序列，测定在两个序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)的位置数以得到匹配位置数，将匹配位置数除以在比较窗中的位置总数(即，窗口大小)并且将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。用于对齐比较窗的序列的最佳比对可通过计算机执行算法(在Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575Science DriveMadison，Wis.，USA中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过检查和通过选择的各种方法的任一种产生的最佳比对(即，导致在比较窗内最高百分比同源性)进行。也可参考BLAST家族的程序，例如公开于Altschul等Nucl.Acids Res.25:3389，1997。在各种实施方案中，本公开内容的修饰的反义寡聚体可与表1(SEQ ID NOS:1-3)和表2(SEQ ID NOS:4-15)的靶向序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性。
如本文使用的，如果在生理条件下寡聚体以显著大于40℃、45℃、50℃和在各种实施方案中60℃-80℃或更高的解链温度(Tm)杂交至靶标区，寡聚体的靶向序列“特异性杂交”至寡核苷酸的靶标区。这样的杂交优选地对应于严格杂交条件。在给定的离子强度和pH下，Tm是50％的靶向序列杂交至靶标区的互补序列的温度。这样的杂交可以修饰的反义寡聚体与靶标区“几乎”或“基本上”互补以及以完全互补发生。在一些实施方案中，寡聚体可以约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％杂交至靶标区。
如本文使用的，术语“亚单位”是指天然存在的核苷酸或包含至少一种修饰的天然存在的核苷酸。修饰可包含以下的至少一种：(i)修饰的核苷间连键，(ii)修饰的糖部分，或(iii)前述的组合。在进一步的实施方案中，修饰可包括修饰的核碱基。
如本文使用的，术语“足够的长度”是指与前-mRNA内的靶标区的至少20-50个连续核碱基互补的修饰的反义寡聚体，其中这样的互补可以完全在外显子中的靶标区内部或可以跨越在外显子/外显子或外显子/内含子区之间的剪接点。在实施方案中，足够的长度可以指与前-mRNA内的靶标区的至少12个连续核碱基互补的修饰的反义寡聚体，其中这样的互补可以完全在外显子中的靶标区内或可跨越在外显子/外显子或外显子/内含子区之间的剪接点。
修饰的肌生成抑制蛋白反义寡聚体可例如，与肌生成抑制蛋白前-mRNA的内含子1/外显子2、外显子2或外显子2/内含子2互补。在各种实施方案中，修饰的肌生成抑制蛋白反义寡聚体包含至少若干核苷酸，其能够特异性杂交至肌生成抑制蛋白前-mRNA序列的靶标区。优选地，足够长度的寡聚体为12-40个核苷酸、12-30个核苷酸、12-15个核苷酸、12-20个核苷酸、15-20个核苷酸、15-22个核苷酸、12-22个核苷酸长，包括在这些范围之间的所有整数。在一些实施方案中，肌生成抑制蛋白反义寡聚体是约12-约40或约12-约30个碱基长。在一些实施方案中，反义寡聚体是约12-约25、约15-约25或约15-约20个碱基长。在一些实施方案中，肌生成抑制蛋白反义寡聚体序列包含至少约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续或非连续的碱基，其与表1的靶标序列(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或跨越SEQ IDNO:X、SEQ ID NO:Y或SEQ ID NO:Z的至少一部分的序列)互补。
修饰的肌养蛋白反义寡聚体可与完全在外显子7、外显子8、外显子9、外显子19、外显子23、外显子44、外显子45、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子55内的靶标区互补。在各种实施方案中，修饰的肌养蛋白反义寡聚体包含至少若干核苷酸，其能够特异性杂交至肌养蛋白前-mRNA序列的靶标区。优选地，足够长度的寡聚体是17-50个核苷酸、17-40个核苷酸、14-25个核苷酸、15-30个核苷酸、17-30个核苷酸、17-27个核苷酸、10-27个核苷酸、10-25个核苷酸或10-20个核苷酸长，包括在这些范围之间的所有整数。在一些实施方案中，反义寡聚体是约17-约40或约10-约30个碱基长。在一些实施方案中，反义寡聚体是约14-约25或约17-约27个碱基长。在一些实施方案中，反义寡聚体序列包含至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续或非连续碱基，其与表2的靶标序列(例如，SEQ ID NOS:4-15)互补。
如本文使用的，术语“受试者”或“有需要的受试者”包括哺乳动物受试者，例如人受试者。示例性的哺乳动物受试者具有或有风险具有杜兴肌营养不良和相关病症。如本文使用的，术语“肌营养不良”、“杜兴肌营养不良”和“相关病症”是指人常染色体隐性疾病，通常特征为在受影响个体中肌生成抑制蛋白的过度表达或肌养蛋白基因的遗传突变。在一些实施方案中，杜兴肌营养不良和相关病症包括但不限于，贝克肌营养不良、肢带肌营养不良、先天性肌营养不良症、面肩肱肌营养不良、肌强直性肌营养不良、眼咽肌营养不良、远端肌营养不良、埃-德二氏肌营养不良、肌肉消瘦病况或病症例如AIDS、癌症或化学疗法相关的肌肉消瘦和纤维化或纤维化-相关病症(例如，骨骼肌肉纤维化)。
如本文使用的"患者"包括显示症状或有风险显示症状的任何人，其可按本文所述进行治疗，例如具有或有风险具有DMD或BMD或与这些病况有关的任何症状(例如，肌肉纤维损失)的受试者。
如本文使用的"儿科患者"是年龄1-21岁的患者(包括1和21岁)。在一些实施方案中，儿科患者是年龄7-21岁(例如，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21岁)的患者。在一些实施方案中，儿科患者是年龄小于7岁的患者。在一些实施方案中，儿科患者是7岁或更大的患者。
如本文使用的，术语“靶标”或“靶标区”是指前-mRNA转录物例如肌生成抑制蛋白或肌养蛋白前-mRNA内的区域。在各种实施方案中，肌生成抑制蛋白靶标区是包含肌生成抑制蛋白前-mRNA的内含子1/外显子2、外显子2或外显子2/内含子2的区域。在各种实施方案中，肌养蛋白靶标区是包含外显子7、外显子8、外显子9、外显子19、外显子23、外显子44、外显子45、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子55的一个或多个的区域。
在各种实施方案中，术语“靶向序列”是指修饰的反义寡聚体或寡聚体类似物中的序列，其与前-mRNA转录物中的靶标序列互补。修饰的反义寡聚体的完整序列或仅一部分可与靶标序列互补。例如，在具有12-50个碱基的寡聚体中，约7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个可包含与前-mRNA转录物内的靶标区互补的序列(例如“靶向序列”)。通常，靶向序列由寡聚体中的连续碱基形成，但备选地可由非连续序列形成，其当置于一起时(例如，从寡聚体的相对末端)，构成跨越靶标序列的序列。
“靶向序列”可与靶标序列具有“几乎”或“基本上”互补性，和仍为其预期目的发挥功能，例如，增加排除具有遗传突变的一个或多个外显子的肌养蛋白mRNA表达的水平，或增加功能性或半功能性肌养蛋白的表达。在肌生成抑制蛋白的情况下，靶向序列可用于减少含有外显子2的肌生成抑制蛋白mRNA的表达水平，或减少功能性肌生成抑制蛋白的表达。优选地，本公开内容的修饰的反义寡聚体化合物与靶标序列具有在10个核苷酸中至多一个错配，或在20个中一个错配。或者，本文的修饰的反义寡聚体与本文指定的示例性的靶标序列具有至少90％序列同源性、至少95％序列同源性、至少99％序列同源性或100％序列同源性。
在肌养蛋白的情况下，靶向序列可包含选自SEQ ID NOS:76-3485的序列，选自SEQID NOS:76-3485，是选自SEQ ID NOS:76-3485的序列的至少10个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:76-3485的序列具有至少90％序列同一性的变体，其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:76-3485中的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQ ID NOS:76-3485中的每个Y是胞嘧啶(C)。在一些实施方案中，靶向序列可包含SEQ ID NO:76。
在肌生成抑制蛋白的情况下，靶向序列可包含选自SEQ ID NOS:16-75的序列，选自SEQ ID NOS:16-75，是选自SEQ ID NOS:16-75的序列的至少10个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:16-75的序列具有至少90％序列同一性的变体，其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:16-75的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQ ID NOS:16-75的每个Y是胞嘧啶(C)。
在一些实施方案中，肌生成抑制蛋白靶向序列选自：
a)SEQ ID NO:71(YYAGYYYAXYXXYXYYXGGXYYXGG)，其中Z是25；
b)SEQ ID NO:72(YAYXXAYYAGYYYAXYXXYXYYXGG)，其中Z是25；
c)SEQ ID NO:73(YYAYXXGYAXXAGAAAAXYAGY)，其中Z是22；
d)SEQ ID NO:74(GYATTAGAAAATYAGYTATAAATG)，其中Z是24；和
e)SEQ ID NO:75(YYATYYGYTTGYATTAGAAAGTYAGY)，其中Z是26；
其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:71-75的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQ ID NOS:71-75的每个Y是胞嘧啶(C)。
在各种实施方案中，靶向序列的至少一个X是T。在各种实施方案中，靶向序列的每个X是T。
在各种实施方案中，靶向序列的至少一个X是U。在各种实施方案中，靶向序列的每个X是U。
在各种实施方案中，靶向序列的至少一个Y是5mC。在各种实施方案中，靶向序列的每个Y是5mC。
在各种实施方案中，靶向序列的至少一个Y是C。在各种实施方案中，靶向序列的每个Y是C。
在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NOS:76-3485的至少一个X是T。在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NOS:76-3485的每个X是T。
在各种实施方案中，靶向序列的至少一个X是U。在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NOS:76-3485的每个X是U。
在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NOS:76-3485的至少一个Y是5mC。在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NOS:76-3485的每个Y是5mC。
在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NOS:76-3485的至少一个Y是C。在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NOS:76-3485的每个Y是C。
如本文使用的，术语“TEG”、“三乙二醇尾”或“EG3”是指缀合至寡聚体的三乙二醇部分，例如，在其3’-或5’-末端。例如，在一些实施方案中，“TEG”包括其中例如，式(I)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)和(VIII)的化合物的T具有下式：
如本文使用的，术语治疗剂或组合物的"治疗有效量"或"有效量"是指有效预防或治疗组合物有效治疗的病症的量。"病症"是指任何杜兴肌营养不良或相关病症，包括BMD、肢带肌营养不良、先天性肌营养不良症、面肩肱肌营养不良、肌强直性肌营养不良、眼咽肌营养不良、远端肌营养不良、埃-德二氏肌营养不良、肌肉消瘦病况或病症例如AIDS、癌症或化学疗法相关肌肉消瘦和纤维化或纤维化-相关病症(例如，骨骼肌肉纤维化)。
如本文使用的，术语“量化”、“定量”或其它相关词语是指测定单位体积中核酸、寡核苷酸、寡聚体、肽、多肽或蛋白的数量、质量或浓度。
在各种实施方案中，如本文使用的术语“治疗”包括治疗受试者(例如哺乳动物、例如人)或细胞以改变受试者或细胞的当前过程。治疗包括但不限于，给予药物组合物，并且可预防性执行，或在开始病理学事件或接触病因因素后执行。还包括“预防性”治疗，其可涉及减少治疗的疾病或病况的进展速率，延迟疾病或病况的发生，或减少其发生的严重性。“治疗”或“预防”不必然表明疾病或病况或其相关症状的完全根除、治愈或预防。
II.前-mRNA转录物的剪接的调节
为说明性目的，和不受理论的约束，在治疗剂是修饰的反义寡聚体时，认为这些促进阻断、抑制或调节前-mRNA的加工，例如通过抑制剪接体的作用和成熟mRNA转录物的生产，和还可诱导靶向mRNA的降解。在一些情况下，剪接体可被抑制免于结合至外显子/内含子剪接点，使得外显子/内含子剪接点跳跃和一个或多个外显子从mRNA转录物除去。具有比野生型mRNA转录物少一个或多个外显子的成熟mRNA转录物可产生mRNA转录物，其维持开放阅读框，使得mRNA转录物可翻译为功能蛋白而非降解的蛋白。从具有比野生型mRNA更少外显子的mRNA转录物翻译的蛋白可产生包含比从野生型mRNA转录物转录的蛋白更少的氨基酸残基的转录蛋白。由比野生型蛋白更少的氨基酸残基构成的功能蛋白可具有与野生型蛋白相同或相似的活性/功能性。可认为修饰的反义寡聚体“导向”或“靶向”靶标序列或其杂交的靶标区。在某些实施方案中，靶标序列包括包含前-mRNA的3’或5’剪接位点、分支点、外显子剪接增强子(ESE)或内含子剪接增强子(ISE)或参与剪接调节的其它序列的区域。在内含子中，供体位点(内含子的5’端)和受体位点(内含子的3’端)对于剪接是需要的。剪接供体位点包括在内含子的5'端的几乎不变的序列GU，在较大的较不高度保守的区域内。在内含子的3'端的剪接受体位点以几乎不变的AG序列终止内含子。靶标序列可包括：完全在外显子内的序列，其中没有一部分的靶标序列跨越剪接点；在外显子/内含子剪接点位点内；或跨越外显子/内含子剪接点。靶标序列可包括外显子/内含子供体剪接位点。
与靶标前-mRNA序列具有足够的序列互补性以调节靶标RNA的剪接的修饰的反义寡聚体包括，其中修饰的反义寡聚体具有足以触发对剪接体复合物的结合位点(其否则将影响这样的剪接)的掩蔽或位阻的序列，和/或以其它方式包括靶向前-mRNA的三维结构的改变。
A.肌生成抑制蛋白前-mRNA的剪接的调节
各个方面涉及用于调节肌生成抑制蛋白前-mRNA的内含子和外显子的剪接的方法。进一步的方面涉及抑制在肌生成抑制蛋白前-mRNA的内含子1/外显子2和外显子2/内含子2的剪接位点处的剪接。在进一步的方面，在给定的样品(例如，血清、血浆、组织、细胞等)中肌生成抑制蛋白外显子2编码mRNA的表达被抑制，例如相对于外显子-2野生型mRNA。各种方法包括给予本文所述的反义寡聚体，其含有与肌生成抑制蛋白前-mRNA内的靶标区互补的靶向序列，其中相对于外显子-2野生型(即，对照)mRNA的表达，肌生成抑制蛋白外显子2mRNA的表达受到抑制。
在各种实施方案中，修饰的反义寡聚体靶向序列具有足够的长度和与肌生成抑制蛋白前-mRNA的靶标区内的序列的互补性。在各种实施方案中，修饰的反义寡聚体内的靶向序列杂交至完全在外显子2内的靶标序列的区域，其中没有一部分的靶向序列跨越剪接点，或跨越肌生成抑制蛋白前-mRNA的内含子/外显子或外显子/内含子剪接点的区域，例如，肌生成抑制蛋白前-mRNA的内含子2/外显子2的+24/-01或+18/-07区，或外显子2/内含子2的-01/+21、-01/+25或-09/+15区。在一些实施方案中，修饰的反义寡聚体可具有约12个碱基-约40个碱基，和包括少量的错配，只要靶向序列在杂交至靶标序列时足够互补以实现剪接调节，和任选地与前-mRNA形成异源双链体，其具有45℃或更大的Tm。
在各种实施方案中，反义靶向序列和靶标序列之间的互补性程度足够形成稳定的双链体。修饰的反义寡聚体与靶标序列的互补性区域可短至12-15个碱基，但可以是12-20个碱基或更长，例如，12-40个碱基、12-30个碱基、12-25个碱基、12-22个碱基、15-25个碱基、15-22个碱基或15-20个碱基，包括在这些范围之间的所有整数。在某些实施方案中，可需要最小长度的互补碱基以达到必需的结合Tm，如本文所述的。
B.肌养蛋白前-mRNA的剪接的调节
各个方面涉及用于调节肌养蛋白前-mRNA的内含子和外显子的剪接的方法。进一步的方面涉及抑制在肌养蛋白前-mRNA的内含子/外显子的剪接点位点处和外显子/内含子剪接点的剪接。在进一步的方面，在给定的样品(例如，血清、血浆、组织、细胞等)中截短形式的肌养蛋白编码mRNA的表达提高，例如相对于全长野生型肌养蛋白mRNA。各种方法包括给予本文所述的反义寡聚体，其含有与肌养蛋白前-mRNA内的靶标区互补的靶向序列，其中相对于全长野生型(即，对照)mRNA的表达，截短形式的肌养蛋白mRNA的表达提高。
在各种实施方案中，反义寡聚体结合肌养蛋白前-mRNA的外显子内的靶标区。在实施方案中，反义寡聚体结合选自外显子7、外显子8、外显子9、外显子19、外显子23、外显子44、外显子45、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子55的外显子。在实施方案中，靶标区完全在肌养蛋白前-mRNA的外显子内，其中没有一部分的靶向序列跨越剪接点，或是跨越内含子/外显子或外显子/内含子剪接点的区域。在实施方案中，肌养蛋白前-mRNA的一个或多个外显子具有一个或多个遗传突变。在实施方案中，反义寡聚体靶向具有一个或多个遗传突变的外显子，使得在加工期间外显子从前-mRNA转录物剪接为成熟mRNA，产生缩短或截短形式的肌养蛋白mRNA。
在各种实施方案中，修饰的反义寡聚体靶向序列具有足够长度和与肌养蛋白前-mRNA的靶标区内的序列的互补性。在各种实施方案中，修饰的反义寡聚体内的靶向序列杂交至完全在一个或多个外显子内的靶标序列的区域，其中没有一部分的靶向序列跨越剪接点，或跨越肌养蛋白前-mRNA的内含子/外显子或外显子/内含子剪接点的区域。在一些实施方案中，修饰的反义寡聚体可具有约8个碱基至约50个碱基，和包括少量的错配，只要靶向序列在杂交至靶标序列时足够互补以实现剪接调节，和任选地与RNA形成异源双链体，其具有45℃或更大的Tm。
在各种实施方案中，在反义靶向序列和靶标序列之间互补性程度足以形成稳定的双链体。修饰的反义寡聚体与靶标序列的互补性区域可短至8-15个碱基，但可以是8-20个碱基或更多，例如，8-40个碱基、8-30个碱基、8-25个碱基、8-22个碱基、8-25个碱基、8-22个碱基、8-20个碱基、17-20个碱基、17-22个碱基、17个碱基-25个碱基、17-30个碱基、17-40个碱基或20-30个碱基，包括在这些范围之间的所有整数。在某些实施方案中，可能需要最小长度的互补碱基以达到必需的结合Tm，如本文所述的。
在各个方面，寡聚体经配置以具有另外的功能性，包括但不限于生物利用度、稳定性、细胞摄取和抵抗核酸酶降解。一般而言，包含50个碱基的寡聚体可能是合适的，其中至少最少数量的碱基，例如，8或12个碱基，与靶标序列互补。在各个方面，寡聚体经配置以提高易化或主动细胞摄取。在各个方面，修饰的反义寡聚体包含一个或多个氨基磷酸酯吗啉单体或二氨基磷酸酯吗啉单体亚单位。在各种实施方案中，修饰的反义寡聚体，包含约8-50个氨基磷酸酯吗啉单体或二氨基磷酸酯吗啉单体亚单位。在各种实施方案中，修饰的反义寡聚体，包含约8-30个氨基磷酸酯吗啉单体或二氨基磷酸酯吗啉单体亚单位。在各种实施方案中，修饰的反义寡聚体，包含约17-40个氨基磷酸酯吗啉单体或二氨基磷酸酯吗啉单体亚单位。在各种实施方案中，修饰的反义寡聚体，包含约12-25个氨基磷酸酯吗啉单体或二氨基磷酸酯吗啉单体亚单位。在各种实施方案中，修饰的反义寡聚体，包含约15-25个氨基磷酸酯吗啉单体或二氨基磷酸酯吗啉单体亚单位。在各种实施方案中，修饰的反义寡聚体，包含约15-22个氨基磷酸酯吗啉单体或二氨基磷酸酯吗啉单体亚单位。
在各个方面，修饰的反义寡聚体包含8-50个亚单位，任选地包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i)修饰的核苷间连键，(ii)修饰的糖部分，或(iii)前述的组合；和与前-mRNA内的10或更多个连续核苷酸的靶标区互补的靶向序列；由其组成或基本上由其组成。在各种实施方案中，靶标区包含完全在一个或多个外显子内的10、12或更多个连续核苷酸，其中没有一部分的靶向序列跨越剪接点，或在跨越肌生成抑制蛋白或肌养蛋白基因的内含子/外显子或外显子/内含子剪接点的区域内。
在各种实施方案中，肌生成抑制蛋白前-mRNA的靶标区包含在肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子2、内含子1/外显子2或外显子2/内含子2内的区域。在进一步的实施方案中，靶标区包含肌生成抑制蛋白前-mRNA的内含子2/外显子2的+24/-01或+18/-07区，或外显子2/内含子2的-01/+21、-01/+25或-09/+15区。
在各种实施方案中，肌养蛋白前-mRNA的靶标区包含在选自肌养蛋白前-mRNA的外显子7、外显子8、外显子9、外显子19、外显子23、外显子44、外显子45、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子55的一个或多个外显子内的区域。
在各个方面，修饰的反义寡聚体包含10-50个亚单位，任选地包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i)修饰的核苷间连键，(ii)修饰的糖部分，或(iii)前述的组合；和包含选自SEQ IDS 16-75和SEQ ID NOS:76-3485的序列、由其组成或基本上由其组成的靶向序列；由其组成或基本上由其组成；优选地，在一些方面，修饰的反义寡聚体包含选自SEQ IDS 71-75和SEQ ID NO:76的序列。
其它方面包括8-50个亚单位的修饰的反义寡聚体，其特异性杂交至肌生成抑制蛋白或肌养蛋白前mRNA内的靶标区。
在各种实施方案中，肌生成抑制蛋白前-mRNA内的靶标区包含肌生成抑制蛋白基因的外显子2、内含子1/外显子2或外显子2/内含子2内的区域(或跨越剪接点的区域)。在各种实施方案中，靶标区包含完全在肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子2内的区域。在各种实施方案中，靶标区包含在内含子1/外显子2或外显子2/内含子2内的区域。在各种实施方案中，靶标区包含跨越内含子1/外显子2或外显子2/内含子2剪接点的区域。在进一步的实施方案中，靶标区包含肌生成抑制蛋白前-mRNA的内含子2/外显子2的+24/-01或+18/-07区，或外显子2/内含子2的-01/+21、-01/+25或-09/+15区。
其它方面包括修饰的反义寡聚体，其具有包含修饰的糖部分的核苷酸类似物亚单位。在各种实施方案中，修饰的糖部分选自肽核酸(PNA)亚单位、锁核酸(LNA)亚单位、2'O,4'C-亚乙基-桥接的核酸(ENA)亚单位、三环-DNA(tc-DNA)亚单位、2’O-甲基亚单位、2’O-甲氧基乙基亚单位、2’-氟亚单位、2'-O-[2-(N-甲基氨基甲酰基)乙基]亚单位和吗啉亚单位。
其它方面包括修饰的反义寡聚体，其具有包含修饰的核苷间连键的核苷酸类似物亚单位。在各种实施方案中，修饰的核苷间连键选自硫代磷酸酯核苷间连键、氨基磷酸酯核苷间连键、二氨基磷酸酯核苷间连键和三氨基磷酸酯核苷间连键。在进一步的实施方案中，二氨基磷酸酯核苷间连键包含磷原子，其共价键合至(1,4-哌嗪)-1-基部分、取代的(1,4-哌嗪)-1-基部分、4-氨基哌啶-1-基部分或取代的4-氨基哌啶-1-基部分。
其它方面包括修饰的反义寡聚体，其具有包含修饰的糖部分和修饰的核苷间连键的至少一种组合的核苷酸类似物亚单位，其中各种实施方案，一个或多个亚单位选自：
吗啉亚单位，其任选地被氨基磷酸酯核苷间连键、二氨基磷酸酯核苷间连键、三氨基磷酸酯核苷间连键或硫代磷酸酯核苷间连键取代，
2’O-甲基亚单位，其任选地被氨基磷酸酯核苷间连键、二氨基磷酸酯核苷间连键或硫代磷酸酯核苷间连键取代，
2’O-甲氧基乙基亚单位，其任选地被氨基磷酸酯核苷间连键、二氨基磷酸酯核苷间连键或硫代磷酸酯核苷间连键取代，
2’-氟亚单位，其任选地被氨基磷酸酯核苷间连键、二氨基磷酸酯核苷间连键或硫代磷酸酯核苷间连键取代，
2'O,4'C-亚乙基-桥接的核酸亚单位，其任选地被氨基磷酸酯核苷间连键、二氨基磷酸酯核苷间连键或硫代磷酸酯核苷间连键取代，
2'-O-[2-(N-甲基氨基甲酰基)乙基]亚单位，其任选地被氨基磷酸酯核苷间连键、二氨基磷酸酯核苷间连键或硫代磷酸酯核苷间连键取代，
三环-DNA亚单位，其任选地被氨基磷酸酯核苷间连键、二氨基磷酸酯核苷间连键或硫代磷酸酯核苷间连键取代，
锁核酸亚单位，其任选地被氨基磷酸酯核苷间连键、二氨基磷酸酯核苷间连键或硫代磷酸酯核苷间连键取代，
吗啉亚单位，其进一步包含二氨基磷酸酯核苷间连键，其中二氨基磷酸酯的磷原子共价键合至吗啉环的氮原子，和共价键合至(1,4-哌嗪)-1-基部分或取代的(1,4-哌嗪)-1-基部分，
吗啉亚单位，其进一步包含二氨基磷酸酯核苷间连键，其中二氨基磷酸酯的磷原子共价键合至4-氨基哌啶-1-基部分或取代的4-氨基哌啶-1-基部分，
吗啉亚单位，其进一步包含二氨基磷酸酯核苷间连键，其中二氨基磷酸酯的磷原子共价键合至吗啉环的氮原子，和共价键合至二甲基氨基部分，
核糖亚单位，其被硫代磷酸酯核苷间或氨基磷酸酯核苷间连键取代，
脱氧核糖亚单位，其被硫代磷酸酯核苷间连键或氨基磷酸酯核苷间连键取代，
肽核酸亚单位，其任选地被取代，
或前述的任何组合。
在各个方面和实施方案中，本公开内容的修饰的反义寡聚体进一步包含共价键合至修饰的反义寡聚体的肽。在各种实施方案中，富含精氨酸的细胞穿透肽缀合至修饰的反义寡聚体的3’或5’端。
在各种实施方案中，修饰的反义寡聚体可由约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个碱基组成，或范围为8-50、8-40、8-30、8-25、8-20、8-18、12-30、12-25、10-20、10-18、15-30、15-25、15-20、15-18、17-20、17-30、17-40、18-30、18-25或18-20个碱基，包括在这些范围之间的所有整数。在一些实施方案中，修饰的反义寡聚体是约8-约50、约8-约40或约8-约30个碱基长。在一些实施方案中，修饰的反义寡聚体是约12-约25个碱基长。在一些实施方案中，修饰的反义寡聚体序列包含至少约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续或非连续碱基，其与肌生成抑制蛋白或肌养蛋白前-mRNA，例如肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子2、内含子1/外显子2或外显子2/内含子2，或肌养蛋白前-mRNA的外显子7、外显子8、外显子9、外显子19、外显子23、外显子44、外显子45、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子55的一个或多个，或跨越肌生成抑制蛋白或肌养蛋白前-mRNA的至少一部分的序列内的靶标序列互补。
修饰的反义寡聚体可通常包含碱基序列，其与肌生成抑制蛋白的肌生成抑制蛋白前-mRNA序列的外显子2、内含子1/外显子2或外显子2/内含子2内的序列或区域足够互补。下表1描述了外显子2、内含子1/外显子2和外显子2/内含子2内的序列或区域。
表1：肌生成抑制蛋白基因的外显子2、内含子1/外显子2和外显子2/内含子2的示例性的序列
修饰的反义寡聚体可通常包含碱基序列，其与肌养蛋白的肌养蛋白前-mRNA序列的以下一个或多个外显子内的序列或区域足够互补：外显子7、外显子8、外显子9、外显子19、外显子23、外显子44、外显子45、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子55。下表2描述以下外显子内的序列或区域：外显子7、外显子8、外显子9、外显子19、外显子23、外显子44、外显子45、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53和外显子55。
表2：肌养蛋白基因的外显子7、外显子8、外显子9、外显子19、外显子23、外显子44、外显子45、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子55的示例性的序列。
优选地，修饰的反义寡聚体有效地减少外显子、例如外显子2的表达，从而减少功能性肌生成抑制蛋白的表达。优选地，修饰的肌养蛋白反义寡聚体有效地调节肌养蛋白前-mRNA的异常剪接，从而增加功能性或半功能性肌养蛋白的表达。当寡聚体化合物具有以下能力时，这一要求任选地得到满足：被哺乳动物细胞主动摄取，和一旦摄取，与靶标mRNA形成稳定的双链体(或异源双链体)，任选地具有大于约40℃或45℃的Tm。
如本文使用的"互补"或"互补性"是指约90％-约100％的核苷酸靶向序列与靶标序列互补的修饰的反义寡聚体的靶向序列。在实施方案中，互补核苷酸靶向序列特异性杂交至靶标序列以诱导需要的效果，例如，如本文所述的治疗效果。在某些实施方案中，修饰的反义寡聚体的靶向序列可以与靶标序列100％互补或可包括错配，例如，以调节变体，只要在寡聚体靶向序列和靶标序列之间形成的异源双链体是足够稳定的，以耐受细胞核酸酶的作用和可体内发生的其它降解模式。因此，某些寡聚体靶向序列可具有明显的互补性，意味着在寡聚体靶向序列和靶标序列之间大约或至少约90％序列互补性，例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列互补性。本文提供了对核酸酶裂解较不敏感的寡聚体核苷间连键。错配如果存在的话，通常对杂合双链体的末端区域比中间更不失稳。根据众所周知的双链体稳定性原理，允许的错配数将取决于寡聚体的长度、双链体中G:C碱基对的百分比和双链体中错配位置。尽管所述修饰的反义寡聚体不需要必然包含与靶标序列的100％互补性，但其应具有足够的互补性以有效地、稳定地和特异性地结合靶标序列，使得靶标前-mRNA的剪接受到足够调节，例如，以实现本文所述的治疗效果。
不受理论的约束，认为在寡聚体和靶标序列之间形成的双链体的稳定性随结合Tm和双链体对细胞酶促裂解的敏感性变化。对于互补-序列RNA双链体的寡聚体的Tm可通过常规方法测量，例如描述于Hames et al.,Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,1985,pp.107-108或描述于Miyada C.G.和Wallace R.B.,1987,Oligomer HybridizationTechniques,Methods Enzymol.Vol.154pp.94-107中的那些，其内容通过引用并入本文。在各种实施方案中，对于互补-序列RNA双链体，修饰的反义寡聚体具有大于体温、例如大于约45℃或50℃的结合Tm。范围为60-80℃或更大的Tm也包括在内。根据众所周知的原理，对于基于互补的RNA杂合双链体，寡聚体的Tm可通过增加双链体中的C:G配对碱基的比率和/或通过增加异源双链体的长度(在碱基对中)增加。
下表3显示与肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子2、内含子1/外显子2或外显子2/内含子2内的靶标区域互补的示例性的靶向序列(以5’至3’方向)。
某些修饰的反义寡聚体因此包含表3中的序列(例如，SEQ ID NOS:16-75)、由其组成或基本上由其组成，选自SEQ ID NOS:16-75，是选自SEQ ID NOS:16-75的序列的至少12个连续核苷酸的片段或是与选自SEQ ID NOS:16-75的序列具有至少90％序列同一性的变体，其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。例如，某些修饰的反义寡聚体包含SEQ ID NOS:16-75的任何一个的约或至少约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续或非连续核苷酸。对于非连续部分，居间的核苷酸可缺失或被不同的核苷酸取代，或居间的核苷酸可加入。另外的变体实例包括在SEQ ID NOS:16-75的任何一个的整个长度上具有约或至少约90％序列同一性或同源性，例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性或同源性的寡聚体。在某些实施方案中，靶向序列选自SEQ ID NOS:16-75。
靶向肌养蛋白基因的寡核苷酸公开于WO 2006/000057、WO 2011/057350、WO2010/048586、WO 2014/100714、WO 2014/153220、美国申请号US20140315862、美国申请号US20140323544、美国申请号US20120202752、美国申请号US20030235845、美国申请号US20110312086、美国申请号US20090312532、美国申请号US20090269755、美国申请号US20130211062、美国申请号US20140343266、美国申请号US20120059042、美国申请号US20110294753、美国申请号US20140113955、美国申请号US20150166996、美国申请号US20150203849、美国申请号US20150045413和美国申请号US20140057964，其通过引用以其整体并入本文。
某些修饰的反义寡聚体因此包含表4中的序列(例如，SEQ ID NOS:76-3485)、由其组成或基本上由其组成，选自SEQ ID NOS:76-3485，是选自SEQ ID NOS:76-3485的序列的至少10个连续核苷酸的片段或是与选自SEQ ID NOS:76-3485的序列具有至少90％序列同一性的变体，其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。例如，某些修饰的反义寡聚体包含SEQ ID NOS:76-3485的任一个的约或至少约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续或非连续核苷酸。对于非连续部分，居间的核苷酸可缺失或被不同的核苷酸取代，或居间的核苷酸可加入。另外的变体实例包括在SEQ ID NOS:76-3485的任何一个的整个长度上具有约或至少约90％序列同一性或同源性，例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性或同源性的寡聚体。在某些实施方案中，靶向序列选自SEQ ID NOS:76-3485。在一些实施方案中，靶向序列可包含SEQ ID NO:76。
修饰的反义寡聚体和其变体的活性/功能性可根据本领域的常规技术测定。例如，研究的RNA的剪接形式和表达水平可通过各种众所周知的用于检测转录的核酸或蛋白的剪接形式和/或表达的任一种方法来测定。这样的方法的非限制性实例包括剪接形式的RNA的RT-PCR，接着PCR产物的大小分离、核酸杂交方法例如，RNA印迹和/或使用核酸阵列；核酸扩增方法；用于检测蛋白的免疫学方法；蛋白纯化方法；和蛋白功能或活性测定法。
RNA表达水平可通过从细胞、组织或生物体制备mRNA/cDNA(即，转录的寡核苷酸)，和通过将mRNA/cDNA与参考寡核苷酸杂交进行评价，所述参考寡核苷酸与测定的核酸或其片段互补。cDNA可任选地使用各种聚合酶链反应或体外转录方法的任一种扩增，然后与互补寡核苷酸杂交；优选地，其不被扩增。一种或多种转录物的表达也可使用定量PCR检测以评价转录物的表达水平。
III.修饰的反义寡聚体化学
A.一般特征
在各个方面和实施方案中，修饰的反义寡聚体特异性杂交至肌生成抑制蛋白前-mRNA内的靶标区。示例性的修饰的反义寡聚体包含表3中所述的靶向序列、表3中的靶向序列的至少12个连续核苷酸的片段或与表3中的靶向序列具有至少90％序列同一性的变体。其它示例性的修饰的反义寡聚体由表3所示的靶向序列组成或基本上由其组成。
在各个方面和实施方案中，修饰的反义寡聚体特异性杂交至肌养蛋白前-mRNA内的靶标区。示例性的修饰的反义寡聚体包含表4所示的靶向序列、表4中的靶向序列的至少10个连续核苷酸的片段或与表4的靶向序列具有至少90％序列同一性的变体。其它示例性的修饰的反义寡聚体由表4所示的靶向序列组成或基本上由其组成。
在进一步的方面提供抗核酸酶修饰的反义寡聚体。在各种实施方案中，提供修饰的反义寡聚体，其包含一个或多个核苷间连键修饰。在其它实施方案中，提供修饰的反义寡聚体，其包含一个或多个修饰的糖部分。在其它实施方案中，提供修饰的反义寡聚体，其包含一个或多个修饰的核苷间连键和一个或多个修饰的糖部分的组合。在其它实施方案中，提供修饰的反义寡聚体，其包含单独或与修饰的核苷间连键或修饰的糖部分的任何一种组合的修饰的核碱基。
在各种实施方案中，修饰的反义寡聚体可包含具有完全修饰的核苷间连键的寡聚体，例如，100％的核苷间连键被修饰(例如，25-mer修饰的反义寡聚体包含被本文所述的一个修饰或其任何组合修饰的24个核苷间连键)。在各种实施方案中，修饰的反义寡聚体可包含约100％-2.5％的被修饰的核苷间连键。在各种实施方案中，修饰的反义寡聚体可包含约99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或2.5％的被修饰的核苷间连键，和在之间的迭代(iteration)。在其它实施方案中，修饰的反义寡聚体可包含本文所述的修饰的任何组合。
在各种实施方案中，包括实施方案与修饰的核苷间连键的百分比的实施方案的组合，修饰的反义寡聚体可包含具有完全修饰的糖部分的寡聚体，例如，100％的糖部分被修饰的(例如，25mer修饰的反义寡聚体包含被本文所述的一个修饰或其任何组合修饰的25个糖部分)。在各种实施方案中，修饰的反义寡聚体可包含约100％-2.5％的被修饰的糖部分。在各种实施方案中，修饰的反义寡聚体可包含约99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或2.5％的被修饰的糖部分，和在之间的迭代。在其它实施方案中，修饰的反义寡聚体可包含本文所述的修饰的任何组合。
在各种实施方案中，修饰的反义寡聚体基本上不带电荷，和任选地适合作为用于跨细胞膜主动或易化运输的基质。在一些实施方案中，所有核苷间连键是不带电荷的。寡聚体与靶标前-mRNA形成稳定的双链体的能力还可涉及寡聚体的其它特征，包括修饰的反义寡聚体的长度和对于靶标的互补性程度、G:C与A:T碱基匹配的比率和任何错配碱基的位置。修饰的反义寡聚体抵抗细胞核酸酶的能力可促进试剂的存活和最终递送至细胞质。
在各种实施方案中，修饰的反义寡聚体具有至少一个在生理pH下带正电荷或是阳离子的核苷间连键。在进一步的实施方案中，修饰的反义寡聚体具有至少一个显示约5.5-约12的pKa的核苷间连键。在进一步的实施方案中，修饰的反义寡聚体包含约、至少约或不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个显示约4.5-约12的pKa的核苷间连键。在一些实施方案中，修饰的反义寡聚体包含约或至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的显示约4.5-约12的pKa的核苷间连键。任选地，修饰的反义寡聚体具有至少一个具有碱性氮和烷基、芳基或芳烷基的核苷间连键。在具体的实施方案中，一个或多个阳离子核苷间连键包含4-氨基哌啶-1-基(APN)或其衍生物。在一些实施方案中，修饰的反义寡聚体包含吗啉环。尽管不受理论的约束，但认为在寡聚体中存在一个或多个阳离子连键(例如，APN基团或APN衍生物)利于结合至靶标核苷酸中带负电荷的磷酸根。因此，在突变体RNA和含有阳离子连键的寡聚体之间形成异源双链体可通过离子吸引力和Watson-Crick碱基配对保持在一起。
在各种实施方案中，阳离子连键的数量是至少2个和不超过总核苷间连键的约一半，例如，约或不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个阳离子连键。然而，在一些实施方案中，至多所有的核苷间连键是阳离子连键，例如，总核苷间连键的约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个是阳离子连键。在进一步的实施方案中，约19-20个单体亚单位的寡聚体可具有2-10，例如，4-8个阳离子连键，和剩余的是不带电荷的连键。在其它具体的实施方案中，14-15个亚单位的寡聚体可具有2-7，例如，2、3、4、5、6或7个阳离子连键和剩余的是不带电荷的连键。在寡聚体中阳离子连键的总数量可因此从约1至10至18至20至30或更多(包括在之间的所有整数)改变，和可散布在整个寡聚体中。
在一些实施方案中，修饰的反义寡聚体可具有每2-5或2、3、4或5个不带电荷的连键约或至多约1个阳离子连键、例如每10个不带电荷的连键约4-5或4或5个。
某些实施方案包括修饰的反义寡聚体，其包含约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％个阳离子连键。在某些实施方案中，如果约25％的核苷间连键是阳离子的，可见到反义活性的最佳改进。在某些实施方案中，对于小数量例如，10-20％阳离子连键或当阳离子连键的数量范围为50-80％、例如约60％时，可见到提高。
在进一步的实施方案中，阳离子连键沿核苷间连键散布。这样的寡聚体任选地包含至少两个连续的不带电荷的连键；即，寡聚体任选地不具有沿其整个长度的严格交替的模式。在特定的情况下，每一个或两个阳离子连键沿核苷间连键被至少1、2、3、4或5个不带电荷的连键分隔。
还包括具有阳离子连键段和不带电荷的连键段的寡聚体。例如，不带电荷的连键的中间段可侧连阳离子连键段，或反之亦然。在一些实施方案中，寡聚体具有大约同等长度的5’、3’和中间区域，和在中间区域的阳离子连键的百分比大于阳离子连键的总数量的约50％、60％、70％或80％。
在某些修饰的反义寡聚体中，大多数阳离子连键(例如，70、75％、80％、90％的阳离子连键)紧靠核苷间连键的“中间区域”分布，例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个最中间的连键。例如，16、17、18、19、20、21、22、23或24-mer寡聚体可具有定位至8、9、10、11或12个最中间连键的至少50％、60％、70％或80％的总阳离子连键。
B.化学特征
修饰的反义寡聚体可包含各种核苷酸类似物亚单位。其它实例包括：
含有氨基磷酸酯的寡聚体，
含有二氨基磷酸酯的寡聚体，
含有三氨基磷酸酯的寡聚体，
含有硫代磷酸酯的寡聚体，
含有吗啉的寡聚体，其任选地被氨基磷酸酯核苷间连键或二氨基磷酸酯核苷间连键取代，
含有2’O-甲基的寡聚体，其任选地被硫代磷酸酯核苷间连键取代，
含有锁核酸(LNA)的寡聚体，其任选地被硫代磷酸酯核苷间连键取代，
含有2’O-甲氧基乙基(MOE)的寡聚体，其任选地被硫代磷酸酯核苷间连键取代，
含有2’-氟的寡聚体，其任选地被硫代磷酸酯核苷间连键取代，
含有2'O,4'C-亚乙基-桥接的核酸(ENA)的寡聚体，其任选地被硫代磷酸酯核苷间连键取代，
含有三环-DNA(tc-DNA)的寡聚体，其任选地被硫代磷酸酯核苷间连键取代，
含有2'-O-[2-(N-甲基氨基甲酰基)乙基]的寡聚体，其任选地被硫代磷酸酯核苷间连键取代，
含有吗啉的寡聚体，其进一步包含二氨基磷酸酯核苷间连键，其中二氨基磷酸酯的磷原子共价键合至吗啉环的氮原子，和共价键合至(1,4-哌嗪)-1-基部分或取代的(1,4-哌嗪)-1-基(PMOplus)部分，
含有吗啉的寡聚体，其进一步包含二氨基磷酸酯核苷间连键，其中二氨基磷酸酯的磷原子共价键合至吗啉环的氮原子，和共价键合至4-氨基哌啶-1-基部分(即，APN)或取代的4-氨基哌啶-1-基(PMO-X)部分，
吗啉亚单位，进一步包含二氨基磷酸酯核苷间连键，其中二氨基磷酸酯的磷原子共价键合至吗啉环的氮原子，和共价键合至二甲基氨基部分，
含有核糖的寡聚体，其进一步包含硫代磷酸酯核苷间连键或氨基磷酸酯核苷间连键，
含有脱氧核糖的寡聚体，进一步包含硫代磷酸酯核苷间连键寡聚体或氨基磷酸酯核苷间连键，
含有肽-缀合的二氨基磷酸酯吗啉的寡聚体(PPMO)，去进一步任选地被取代，
肽核酸(PNA)寡聚体，其进一步任选地被取代，
包括进一步的取代，
和任何上述的组合。
在某些实施方案中，二氨基磷酸酯连键的磷原子进一步被(1,4-哌嗪)-1-基部分、取代的(1,4-哌嗪)-1-基部分、4-氨基哌啶-1-基部分或取代的4-氨基哌啶-1-基部分取代。
总体上，相对于PMO和2’O-Me寡聚体，PNA和LNA化学因为其相对高的靶标结合强度而可利用较短的靶向序列。硫代磷酸酯和2’O-Me化学可组合以产生2’O-Me-硫代磷酸酯类似物。参见例如，PCT公布号WO/2013/112053和WO/2009/008725，其通过引用以其整体并入本文。
在一些情况下，修饰的反义寡聚体，例如二氨基磷酸酯吗啉寡聚体(PMO)，可缀合至细胞穿透肽(CPP)以促进细胞内递送。肽缀合的PMO被称为PPMO和某些实施方案包括描述于PCT公布号WO/2012/150960中的那些，其通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，可使用缀合或连接至例如，如本文所述的修饰的反义寡聚体的3’末端的富含精氨酸的肽序列。
1.肽核酸(PNA)
肽核酸(PNA)是DNA的类似物，其中骨架在结构上与脱氧核糖骨架是同态的，由嘧啶或嘌呤碱基所连接的N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元组成。含有天然的嘧啶和嘌呤碱基的PNA杂交至互补的寡聚体，遵从Watson-Crick碱基配对规则，和在碱基对识别方面模拟DNA(Egholm，Buchardt等1993)。PNA的核苷间连键通过肽键而不是磷酸二酯键形成，使得它们完全适合反义应用(见下文的结构)。骨架是不带电荷的，产生显示大于正常的热稳定性的PNA/DNA或PNA/RNA双链体。PNA不被核酸酶或蛋白酶识别。包含PNA亚单位的PNA寡聚体的非限制性实例如下文所述：
尽管对天然结构的根本结构变化，PNA能够以螺旋形式序列特异性结合至DNA或RNA。PNA的特征包括对互补DNA或RNA的高结合亲和力、由单碱基错配引起的失稳作用、抵抗核酸酶和蛋白酶、不依赖于盐浓度与DNA或RNA杂交、和与同型嘌呤DNA形成三链体。PANAGENE(Daejeon，Korea)已开发了Bts PNA单体(Bts；苯并噻唑-2-磺酰基)和寡聚化过程。使用Bts PNA单体的PNA寡聚化包括脱保护、偶联和帽化的重复周期。PNA可使用本领域已知的任何技术合成产生。参见例如，美国专利号6,969,766、7,211,668、7,022,851、7,125,994、7,145,006和7,179,896。对于制备PNA，亦参见美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262。PNA化合物的其它教导可见于Nielsen等，Science，254:1497-1500，1991。前述文献各自通过引用以其整体并入本文。
2.锁核酸(LNA)
修饰的反义寡聚体化合物还可包含“锁核酸”亚单位(LNA)。“LNA”是一类称为桥接核酸(BNA)的修饰的成员。BNA的特征为共价连键，其在C30-内(northern)糖褶皱中锁定核糖环的构象。对于LNA，桥包含在2’-O和4’-C位置之间的亚甲基。LNA提高骨架预组构和碱基堆积，以增加杂交和热稳定性。
LNA的结构可见于例如，Wengel等，Chemical Communicatoins(1998)455；Tetrahedron(1998)54:3607和Accounts of Chem.Research(1999)32:301)；Obika等，Tetrahedron Letters(1997)38:8735；(1998)39:5401和Bioorganic MedicinalChemistry(2008)16:9230，其通过引用以其整体并入本文。包含LNA亚单位和磷酸二酯核苷间连键的LNA寡聚体的非限制性实例如下描述：
本公开内容的化合物可掺有一个或多个LNA；在一些情况下，化合物可完全由LNA构成。用于合成单个LNA核苷亚单位和它们掺入寡聚体的方法描述于例如，美国专利号7,572,582、7,569,575、7,084,125、7,060,809、7,053,207、7,034,133、6,794,499和6,670,461，其通过引用以其整体并入本文。典型的核苷间接头包括磷酸二酯和硫代磷酸酯部分；或者，可利用含有非磷的接头。其它实施方案包括含有LNA的化合物，其中每个LNA亚单位被DNA亚单位分隔。某些化合物由交替的LNA和DNA亚单位构成，其中核苷间接头是硫代磷酸酯。
2'O,4'C-亚乙基-桥接的核酸(ENA)是BNA类型的另一个成员。ENA亚单位和磷酸二酯核苷间连键的非限制性实例如下所述：
ENA寡聚体和其制备描述于Obika等，Tetrahedron Ltt 38(50):8735，其通过引用以其整体并入本文。本公开内容的化合物可掺有一个或多个ENA亚单位。
3.硫代磷酸酯
“硫代磷酸酯”(或S-寡聚物)是天然DNA或RNA的变体，其中磷酸二酯核苷间连键的一个非桥接氧被硫替换。包含脱氧核糖亚单位和硫代磷酸酯核苷间连键的硫代磷酸酯DNA(左)和包含核糖亚单位和硫代磷酸酯核苷间连键的硫代磷酸酯RNA(右)的非限制性实例如下所述：
核苷间键的硫化减少核酸内切酶和核酸外切酶的作用，包括5’至3’和3’至5’DNAPOL 1核酸外切酶、核酸酶S1和P1、RNases、血清核酸酶和蛇毒磷酸二酯酶。硫代磷酸酯可通过两个主要途径制备：通过元素硫在二硫化碳中的溶液对膦酸氢酯的作用或通过用二硫代四乙基秋兰姆(TETD)或3H-1,2-苯并双硫醇-3-酮1,1-二氧化物(BDTD)硫化亚磷酸三酯的方法(参见例如，Iyer等，J.Org.Chem.55，4693-4699，1990，其通过引用以其整体并入本文)。后一方法避免元素硫不溶于大多数有机溶剂和二硫化碳的毒性的问题。TETD和BDTD方法还得到较高纯度的硫代磷酸酯。
4.三环-DNA和三环-硫代磷酸酯核苷酸
三环-DNA(tc-DNA)是一类受限的DNA类似物，其中每个核苷酸通过引入环丙烷环而被修饰，以限制骨架的构象柔韧性和优化扭转角γ的骨架几何形状。含有同型碱基腺嘌呤和胸腺嘧啶的tc-DNA与互补RNA形成特别稳定的A-T碱基对。三环-DNA和其合成描述于PCT公布号WO 2010/115993，其通过引用以其整体并入本文。本公开内容的化合物可掺有一个或多个三环-DNA亚单位；在一些情况下，化合物可完全由三环-DNA亚单位构成。
三环-硫代磷酸酯核苷酸是具有硫代磷酸酯核苷间连键的三环-DNA亚单位。三环-硫代磷酸酯核苷酸和其合成描述于PCT公布号WO 2013/053928，其通过引用以其整体并入本文。本公开内容的化合物可掺有一个或多个三环-DNA亚单位；在一些情况下，化合物可完全由三环-DNA核苷酸构成。三环-DNA/三环亚单位和磷酸二酯核苷间连键的非限制性实例如下所述：
5.2’O-甲基、2’O-MOE和2’-F寡聚体
“2’O-Me寡聚体”分子包含在核糖分子的2’-OH残基上携带甲基的亚单位。2’-O-Me-RNA显示与DNA相同(或类似)的行为，但被保护免于核酸酶降解。2’-O-Me-RNA还可与硫代磷酸酯寡聚体(PTO)组合用于进一步稳定。2’O-Me寡聚体(其中2’-OMe亚单位通过磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷间连键连接)可根据本领域的常规技术合成(参见例如，Yoo等，Nucleic Acids Res.32:2008-16，2004，其通过引用以其整体并入本文)。包含2’-OMe亚单位和磷酸二酯亚单位间连键的2’O-Me寡聚体的非限制性实例如下所述：
2’O-Me寡聚体还可包含硫代磷酸酯连键(2’O-Me硫代磷酸酯寡聚体)。2’O-甲氧基乙基寡聚体(2’-O MOE)，如同2’O-Me寡聚体，包含在核糖分子的2’-OH残基上带有甲氧基乙基的亚单位和论述于Martin等，Helv.Chim.Acta，78，486-504，1995，其通过引用以其整体并入本文。2’O-MOE亚单位的非限制性实例如下所述：
与前述的烷基化2’OH核糖衍生物相比，2’-氟寡聚体包含在2’位置上(代替2’OH)具有氟基团的亚单位。包含2’-F亚单位和磷酸二酯核苷间连键的2’-F寡聚体的非限制性实例如下所述：
2’-氟寡聚体进一步描述于WO 2004/043977，其通过引用以其整体并入本文。本公开内容的化合物可掺有一个或多个2’O-甲基、2’O-MOE和2’F亚单位和可利用任何本文所述的核苷间连键。在一些情况下，本公开内容的化合物可完全由2’O-甲基、2’O-MOE或2’F亚单位构成。本公开内容的化合物的一个实施方案完全由2’O-甲基亚单位构成。
6.2'-O-[2-(N-甲基氨基甲酰基)乙基]寡聚体(MCE)
MCE是可用于本公开内容的化合物的2’O修饰的核糖核苷酸的另一个实例。此处，2’OH被衍生至2-(N-甲基氨基甲酰基)乙基部分以增加核酸酶抗性。包含MCE亚单位和磷酸二酯核苷间连键的MCE寡聚体的非限制性实例如下所述：
MCE和其合成描述于Yamada等，J.Org.Chem.，76(9):3042-53，其通过引用以其整体并入本文。本公开内容的化合物可掺有一个或多个MCE亚单位。
7.基于吗啉的寡聚体
基于吗啉的寡聚体是指包含支持核碱基并代替核糖的吗啉亚单位的寡聚体，其包含吗啉环。示例性的核苷间连键包括，例如，氨基磷酸酯或二氨基磷酸酯核苷间连键，其连接一个吗啉亚单位的吗啉环氮至邻近吗啉亚单位的4’环外碳。每个吗啉亚单位包含嘌呤或嘧啶核碱基，其通过碱基特异性氢键合有效结合至寡核苷酸中的碱基。
基于吗啉的寡聚体(包括修饰的反义寡聚体)详述于例如，美国专利号5,698,685；5,217,866；5,142,047；5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,521,063；5,506,337和待审的美国专利申请号12/271,036；12/271,040；和PCT公布号WO/2009/064471和WO/2012/043730和Summerton等1997，Antisense and Nucleic Acid Drug Development,7,187-195，其通过引用以其整体并入本文。术语“吗啉亚单位”在本文如Summerton等所述使用。
在寡聚体结构内，磷酸酯基团通常称为形成寡聚体的“核苷间连键”。RNA和DNA的天然存在的核苷间连键是3’至5’磷酸二酯键。“氨基磷酸酯”基团包含具有三个连接的氧原子和一个连接的氮原子的磷，而“二氨基磷酸酯”基团包含具有两个连接的氧原子和两个连接的氮原子的磷。“三氨基磷酸酯”基团(或磷酸三酰胺基团)包含具有一个连接的氧原子和三个连接的氮原子的磷。在本文所述的基于吗啉的寡聚体的不带电荷的或阳离子核苷间连键中，一个氮总是附接至连键链。在二氨基磷酸酯连键中的第二个氮通常是吗啉环结构中的环氮。
“PMO”是指基于二氨基磷酸酯吗啉的寡聚体，其具有磷原子，所述磷原子具有(i)与吗啉环的氮原子的共价键，和(ii)与二甲基氨基的氮的第二共价键。“PMO-X”是指基于二氨基磷酸酯吗啉的寡聚体，其具有磷原子，所述磷原子具有(i)与吗啉环的氮原子的共价键，和(ii)与例如，4-氨基哌啶-1-基(即，APN)或4-氨基哌啶-1-基的衍生物的环氮的第二共价键。示例性的PMO-X寡聚体公开于PCT公布号PCT/US2011/38459和PCT公布号WO 2013/074834，其通过引用以其整体并入本文。PMO-X包括“PMO-apn”、“PMO-APN”或“APN”，其是指包含至少一个核苷间连键的PMO-X寡聚体，其中磷原子连接至吗啉基团和4-氨基哌啶-1-基(即，APN)的环氮。在特定的实施方案中，包含表3和4所示的靶向序列的修饰的反义寡聚体包含至少一个含有APN的连键或含有APN衍生物的连键。各个实施方案包括基于吗啉的寡聚体，其具有约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％含有APN/APN衍生物的连键，其中剩余的连键(如果少于100％)是不带电荷的连键，例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50的总核苷间连键是含有APN/APN衍生物的连键。
在各种实施方案中，修饰的反义寡聚体是式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中:
每个Nu是核碱基，其一起形成靶向序列；
Z是8-48的整数；
每个Y独立地选自O和–NR4，其中每个R4独立地选自H、C1-C6烷基、芳烷基、-C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)nNR5C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR5C(＝NH)NH2和G，其中R5选自H和C1-C6烷基和n是1-5的整数；
T选自OH和下式的部分：
其中:
A选自–OH、-N(R7)2R8，其中:
每个R7独立地选自H和C1-C6烷基,和
R8选自电子对和H，和
R6选自OH、–N(R9)CH2C(O)NH2和下式的部分：
其中:
R9选自H和C1-C6烷基；和
R10选自G、-C(O)-R11OH、酰基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、-C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)mNR12C(＝NH)NH2和-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR12C(＝NH)NH2，其中:
m是1-5的整数,
R11具有式-(O-烷基)y-，其中y是3-10的整数，和
y个烷基中的每个独立地选自C2-C6烷基；和
R12选自H和C1-C6烷基；
R1的每个实例独立地选自:
–N(R13)2R14，其中每个R13独立地选自H和C1-C6烷基，和R14选自电子对和H；
式(II)的部分：
其中:
R15选自H、G、C1-C6烷基、-C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)qNR18C(＝NH)NH2和-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR18C(＝NH)NH2，其中:
R18选自H和C1-C6烷基；和
q是1-5的整数,
R16选自电子对和H；和
每个R17独立地选自H和甲基；和
式(III)的部分：
其中:
R19选自H、C1-C6烷基、-C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)rNR22C(＝NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR22C(＝NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)4NH2和G，其中:
R22选自H和C1-C6烷基；和
r是1-5的整数,
R20选自H和C1-C6烷基；和
R21选自电子对和H；和
R2选自H、G、酰基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、C1-C6烷基、-C(＝NH)NH2、-C(O)-R23、-C(O)(CH2)sNR24C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR24C(＝NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)3NHC(＝NH)NH2和下式的部分：
其中,
R23具有式-(O-烷基)v-OH，其中v是3-10的整数和v个烷基中的每个独立地选自C2-C6烷基；和
R24选自H和C1-C6烷基；
s是1-5的整数；
L选自–C(O)(CH2)6C(O)–和-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)–；和
每个R25具有式–(CH2)2OC(O)N(R26)2，其中每个R26具有式–(CH2)6NHC(＝NH)NH2，和
R3选自电子对、H和C1-C6烷基，
其中G是细胞穿透肽(“CPP”)和接头部分，选自-C(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)(CH2)2NH-CPP、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NH-CPP和-C(O)CH2NH-CPP，或G具有下式：
其中CPP通过CPP羧基端的酰胺键连接至接头部分，条件是G的至多一个实例存在。
在各种实施方案中，靶向序列与肌生成抑制蛋白前-mRNA内的靶标区互补。在一些实施方案中，靶向序列与完全在外显子2内的靶标区的12或更多个连续核苷酸互补，其中没有一部分的靶向序列跨越剪接点，或与跨越肌生成抑制蛋白前-mRNA的内含子/外显子或外显子/内含子剪接点的区域(例如，SEQ ID NOS:2-3)互补。
在各种实施方案中，靶向序列与肌养蛋白前-mRNA内的靶标区互补。在一些实施方案中，靶向序列与肌养蛋白前-mRNA的外显子中的靶标区的10或更多个连续核苷酸互补，所述外显子选自外显子7、外显子8、外显子9、外显子19、外显子23、外显子44、外显子45、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子55。在实施方案中，靶标区完全在肌养蛋白前-mRNA的外显子内，其中没有一部分的靶向序列跨越剪接点，或在跨越肌养蛋白前-mRNA的内含子/外显子或外显子/内含子剪接点的区域。
在各种实施方案中，肌生成抑制蛋白靶向序列包含SEQ ID NOS:16-75之一，选自SEQ ID NOS:16-75之一，是选自SEQ ID NOS:16-75至少之一的序列的至少12个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:16-75至少之一的序列具有至少90％序列同一性的变体，其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:16-75的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQID NOS:16-75的每个Y是胞嘧啶(C)。
在一些实施方案中，式(I)的肌生成抑制蛋白靶向序列选自：
a)SEQ ID NO:71(YYAGYYYAXYXXYXYYXGGXYYXGG)，其中Z是25；
b)SEQ ID NO:72(YAYXXAYYAGYYYAXYXXYXYYXGG)，其中Z是25；
c)SEQ ID NO:73(YYAYXXGYAXXAGAAAAXYAGY)，其中Z是22；
d)SEQ ID NO:74(GYATTAGAAAATYAGYTATAAATG)，其中Z是24；和
e)SEQ ID NO:75(YYATYYGYTTGYATTAGAAAGTYAGY)，其中Z是26；
其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:71-75的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQ ID NOS:71-75的每个Y是胞嘧啶(C)。
在各种实施方案中，肌养蛋白靶向序列包含SEQ ID NOS:76-3485之一，选自SEQID NOS:76-3485之一，是选自SEQ ID NOS:76-3485至少之一的序列的至少10个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:76-3485至少之一的序列具有至少90％序列同一性的变体，其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:76-3485的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQ ID NOS:76-3485的每个Y是胞嘧啶(C)。在一些实施方案中，靶向序列可包含SEQ IDNO:76。
在各种实施方案中，靶向序列的至少一个X是T。在各种实施方案中，靶向序列的每个X是T。
在各种实施方案中，靶向序列的至少一个X是U。在各种实施方案中，靶向序列的每个X是U。
在各种实施方案中，靶向序列的至少一个Y是5mC。在各种实施方案中，靶向序列的每个Y是5mC。
在各种实施方案中，靶向序列的至少一个Y是C。在各种实施方案中，靶向序列的每个Y是C。
在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NO:76-3485的至少一个X是T。在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NO:76-3485的每个X是T。
在各种实施方案中，靶向序列的至少一个X是U。在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NO:76-3485的每个X是U。
在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NO:76-3485的至少一个Y是5mC。在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NO:76-3485的每个Y是5mC。
在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NO:76-3485的至少一个Y是C。在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NO:76-3485的每个Y是C。
在一些实施方案中，R3是下式的部分：
其中L选自-C(O)(CH2)6C(O)–或–C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)–,和
每个R25具有式–(CH2)2OC(O)N(R26)2，其中每个R26具有式-(CH2)6NHC(＝NH)NH2。这样的部分进一步描述于美国专利号7,935,816，其通过引用以其整体并入本文。
在某些实施方案中，R3可包含下文所述的任一部分：
在各种实施方案中，每个Y是O，R2选自H或G，R3选自电子对或H。在一些实施方案中，R2是G，其中CPP具有选自SEQ ID NOS:3486-3501的序列。在某些实施方案中，R2是H。
在某些实施方案中，每个R1是-N(CH3)2。在一些实施方案中，约50-90％的R1基团是二甲基氨基(即-N(CH3)2)。在某些实施方案中，约70％-约80％的R1基团是二甲基氨基。在某些实施方案中，约75％的R1基团是二甲基氨基。在某些实施方案中，约66％的R1基团是二甲基氨基。
在本公开内容的一些实施方案中，R1可选自：
在某些实施方案中，至少一个R1是：
在某些实施方案中，T具有下式：
其中A是–N(CH3)2和R6具有下式：
其中R10是-C(O)R11OH。
在一些实施方案中，每个Y是O和T选自：
在某些实施方案中，T具有下式：
在各种实施方案中，每个Y是O，和R2选自H或G，R3选自电子对或H。在一些实施方案中，R2是G，其中CPP具有选自下文所述的SEQ ID NOS:3486-3501的序列。
在其它实施方案中，修饰的反义寡聚体是式(IV)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
每个Nu是核碱基，其一起形成靶向序列；
Z是8-48的整数；
每个Y独立地选自O和–NR4，其中每个R4独立地选自H、C1-C6烷基、芳烷基、-C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)nNR5C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR5C(＝NH)NH2和G，其中R5选自H和C1-C6烷基和n是1-5的整数；
T选自OH和下式的部分：
其中:
A选自–OH和-N(R7)2R8，其中:
每个R7独立地选自H和C1-C6烷基,和
R8选自电子对和H，和
R6选自OH、–N(R9)CH2C(O)NH2和下式的部分：
其中:
R9选自H和C1-C6烷基；和
R10选自G、-C(O)-R11OH、酰基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、-C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)mNR12C(＝NH)NH2和-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR12C(＝NH)NH2，其中:
m是1-5的整数,
R11具有式-(O-烷基)y-，其中y是3-10的整数，和
y个烷基中的每个独立地选自C2-C6烷基；和
R12选自H和C1-C6烷基；
R2选自H、G、酰基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、C1-C6烷基、-C(＝NH)NH2和-C(O)-R23；和
R3选自电子对、H和C1-C6烷基。
在各种实施方案中，靶向序列与肌生成抑制蛋白前-mRNA内的靶标区互补。在一些实施方案中，靶向序列与完全在外显子2内的靶标区的12或更多个连续核苷酸互补，其中没有一部分的靶向序列跨越剪接点，或与跨越肌生成抑制蛋白前-mRNA的内含子/外显子或外显子/内含子剪接点的区域(例如，SEQ ID NOS:1-3)互补。
在各种实施方案中，靶向序列与肌养蛋白前-mRNA内的靶标区互补。在一些实施方案中，靶向序列与肌养蛋白前-mRNA的外显子内的靶标区的10或更多个连续核苷酸互补，所述外显子选自外显子7、外显子8、外显子9、外显子19、外显子23、外显子44、外显子45、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子55。在实施方案中，靶标区完全在肌养蛋白前-mRNA的外显子内，其中没有一部分的靶向序列跨越剪接点，或在跨越肌养蛋白前-mRNA的内含子/外显子或外显子/内含子剪接点(例如，SEQ ID NOS:76-3485)的区域。
在各种实施方案中，肌生成抑制蛋白靶向序列包含SEQ ID NOS:4-15之一，选自SEQ ID NOS:4-15之一，是选自SEQ ID NOS:4-15至少之一的序列的至少12个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:4-15至少之一的序列具有至少90％序列同一性的变体，其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:4-15的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQ IDNOS:4-15的每个Y是胞嘧啶(C)。
在一些实施方案中，式(IV)的肌生成抑制蛋白靶向序列选自:
a)SEQ ID NO:71(YYAGYYYAXYXXYXYYXGGXYYXGG)，其中Z是25；
b)SEQ ID NO:72(YAYXXAYYAGYYYAXYXXYXYYXGG)，其中Z是25；
c)SEQ ID NO:73(YYAYXXGYAXXAGAAAAXYAGY)，其中Z是22；
d)SEQ ID NO:74(GYATTAGAAAATYAGYTATAAATG)，其中Z是24；和
e)SEQ ID NO:75(YYATYYGYTTGYATTAGAAAGTYAGY)，其中Z是26；
其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:71-75的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQ ID NOS:71-75的每个Y是胞嘧啶(C)。
在各种实施方案中，肌养蛋白靶向序列包含SEQ ID NOS:76-3485之一，选自SEQID NOS:76-3485之一，是选自SEQ ID NOS:76-3485至少之一的序列的至少10个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:76-3485至少之一的序列具有至少90％序列同一性的变体，其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:76-3485的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQ ID NOS:76-3485的每个Y是胞嘧啶(C)。在一些实施方案中，靶向序列可包含SEQ IDNO:76。
在各种实施方案中，Y是O，R2选自H或G，R3选自电子对或H。在一些实施方案中，R2是G，其中CPP具有选自SEQ ID NOS:9-24的序列。在某些实施方案中，R2是H。
在一些实施方案中，Y是O和T选自：
在一些实施方案中，T具有下式：
R2是氢；和R3是电子对。
在其它实施方案中，修饰的反义寡聚体是式(V)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中:
每个Nu是核碱基，其一起形成靶向序列；
Z是8-48的整数；
每个Y独立地选自O和–NR4，其中每个R4独立地选自H、C1-C6烷基、芳烷基、-C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)nNR5C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR5C(＝NH)NH2和G，其中R5选自H和C1-C6烷基和n是1-5的整数；
T选自OH和下式的部分：
其中:
A选自–OH、-N(R7)2R8，其中:
每个R7独立地选自H和C1-C6烷基,和
R8选自电子对和H，和
R6选自OH、–N(R9)CH2C(O)NH2和下式的部分：
其中:
R9选自H和C1-C6烷基；和
R10选自G、-C(O)-R11OH、酰基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、-C(＝NH)NH2、-C(O)(CH2)mNR12C(＝NH)NH2和-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR12C(＝NH)NH2，其中:
m是1-5的整数,
R11具有式-(O-烷基)y-，其中y是3-10的整数，和
y个烷基中的每个独立地选自C2-C6烷基；和
R12选自H和C1-C6烷基；
其中G是细胞穿透肽(“CPP”)和接头部分，选自-C(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)(CH2)2NH-CPP、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NH-CPP和-C(O)CH2NH-CPP，或G具有下式：
其中CPP通过CPP羧基端的酰胺键连接至接头部分，条件是G的至多一个实例存在。
在各种实施方案中，靶向序列与肌生成抑制蛋白前-mRNA内的靶标区互补。在一些实施方案中，靶向序列与完全在外显子2内的靶标区的12或更多个连续核苷酸互补，其中没有一部分的靶向序列跨越剪接点，或与跨越肌生成抑制蛋白前-mRNA的内含子/外显子或外显子/内含子剪接点的区域(例如，SEQ ID NOS:1-3)互补。
在各种实施方案中，靶向序列与肌养蛋白前-mRNA内的靶标区互补。在一些实施方案中，靶向序列与肌养蛋白前-mRNA的外显子内的靶标区的10或更多个连续核苷酸互补，所述外显子选自外显子7、外显子8、外显子9、外显子19、外显子23、外显子44、外显子45、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子55。在实施方案中，靶标区完全在肌养蛋白前-mRNA的外显子内，其中没有一部分的靶向序列跨越剪接点，或在跨越肌养蛋白前-mRNA的内含子/外显子或外显子/内含子剪接点的区域(例如，SEQ ID NOS:4-15)。
在各种实施方案中，肌生成抑制蛋白靶向序列包含SEQ ID NOS:16-75之一，选自SEQ ID NOS:16-75之一，是选自SEQ ID NOS:16-75至少之一的序列的至少12个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:16-75至少之一的序列具有至少90％序列同一性的变体，其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:16-75的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQID NOS:16-75的每个Y是胞嘧啶(C)。
在一些实施方案中，式(V)的肌生成抑制蛋白靶向序列选自：
a)SEQ ID NO:71(YYAGYYYAXYXXYXYYXGGXYYXGG)，其中Z是25；
b)SEQ ID NO:72(YAYXXAYYAGYYYAXYXXYXYYXGG)，其中Z是25；
c)SEQ ID NO:73(YYAYXXGYAXXAGAAAAXYAGY)，其中Z是22；
d)SEQ ID NO:74(GYATTAGAAAATYAGYTATAAATG)，其中Z是24；和
e)SEQ ID NO:75(YYATYYGYTTGYATTAGAAAGTYAGY)，其中Z是26；
其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:71-75的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQ ID NOS:71-75的每个Y是胞嘧啶(C)。
在各种实施方案中，肌养蛋白靶向序列包含SEQ ID NOS:76-3485之一，选自SEQID NOS:76-3485之一，是选自SEQ ID NOS:76-3485至少之一的序列的至少10个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:76-3485至少之一的序列具有至少90％序列同一性的变体，其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:76-3485的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQ ID NOS:76-3485的每个Y是胞嘧啶(C)。在一些实施方案中，靶向序列可包含SEQ IDNO:76。
在各种实施方案中，每个Y是O，和T选自：
在一些实施方案中，T具有下式：
在某些实施方案中，本公开内容的反义寡聚体是式(VI)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
每个Nu是核碱基，其一起形成靶向序列；
Z是15-25的整数；
每个Y是O；
每个R1独立地选自:
在各种实施方案中，至少一个R1是–N(CH3)2。在一些实施方案中，每个R1是–N(CH3)2。
在各种实施方案中，靶向序列与肌生成抑制蛋白前-mRNA内的靶标区互补。在一些实施方案中，靶向序列与完全在外显子2内的靶标区的12或更多个连续核苷酸互补，其中没有一部分的靶向序列跨越剪接点，或与跨越肌生成抑制蛋白前-mRNA的内含子/外显子或外显子/内含子剪接点的区域(例如，SEQ ID NOS:1-3)互补。
在各种实施方案中，靶向序列与肌养蛋白前-mRNA内的靶标区互补。在一些实施方案中，靶向序列与肌养蛋白前-mRNA的外显子内的靶标区的10或更多个连续核苷酸互补，所述外显子选自外显子7、外显子8、外显子9、外显子19、外显子23、外显子44、外显子45、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子55。在实施方案中，靶标区完全在肌养蛋白前-mRNA的外显子内，其中没有一部分的靶向序列跨越剪接点，或在跨越肌养蛋白前-mRNA的内含子/外显子或外显子/内含子剪接点的区域(例如，SEQ ID NOS:4-15)。
在各种实施方案中，肌生成抑制蛋白靶向序列包含SEQ ID NOS:16-75之一，选自SEQ ID NOS:16-75之一，是选自SEQ ID NOS:16-75至少之一的序列的至少12个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:16-75至少之一的序列具有至少90％序列同一性的变体，其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:16-75的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQID NOS:16-75的每个Y是胞嘧啶(C)。
在一些实施方案中，式(VI)的肌生成抑制蛋白靶向序列选自：
a)SEQ ID NO:71(YYAGYYYAXYXXYXYYXGGXYYXGG)，其中Z是25；
b)SEQ ID NO:72(YAYXXAYYAGYYYAXYXXYXYYXGG)，其中Z是25；
c)SEQ ID NO:73(YYAYXXGYAXXAGAAAAXYAGY)，其中Z是22；
d)SEQ ID NO:74(GYATTAGAAAATYAGYTATAAATG)，其中Z是24；和
e)SEQ ID NO:75(YYATYYGYTTGYATTAGAAAGTYAGY)，其中Z是26；
其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:71-75的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQ ID NOS:71-75的每个Y是胞嘧啶(C)。
在各种实施方案中，肌养蛋白靶向序列包含SEQ ID NOS:76-3485之一，选自SEQID NOS:76-3485之一，是选自SEQ ID NOS:76-3485至少之一的序列的至少10个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:76-3485至少之一的序列具有至少90％序列同一性的变体，其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:76-3485的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQ ID NOS:76-3485的每个Y是胞嘧啶(C)。在一些实施方案中，靶向序列可包含SEQ IDNO:76。
在一些实施方案中，反义寡聚体是式(VII)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
每个Nu是核碱基，其一起形成靶向序列；和
Z是8-48的整数；
每个Y是O；
每个R1独立地选自:
R2选自H、酰基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、C1-C6烷基、-C(＝NH)NH2和-C(O)-R23；和
R3选自电子对、H和C1-C6烷基。
在各种实施方案中，靶向序列与肌生成抑制蛋白前-mRNA内的靶标区互补。在一些实施方案中，靶向序列与完全在肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子内的靶标区的12或更多个连续核苷酸互补，或与跨越肌生成抑制蛋白前mRNA的内含子/外显子或外显子/内含子剪接点的区域(例如，SEQ ID NOS:1-3)互补。
在各种实施方案中，靶向序列与肌养蛋白前-mRNA内的靶标区互补。在一些实施方案中，靶向序列与肌养蛋白前-mRNA的外显子内的靶标区的10或更多个连续核苷酸互补，所述外显子选自外显子7、外显子8、外显子9、外显子19、外显子23、外显子44、外显子45、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子55。在实施方案中，靶标区完全在肌养蛋白前-mRNA的外显子内，其中没有一部分的靶向序列跨越剪接点，或在跨越肌养蛋白前-mRNA的内含子/外显子或外显子/内含子剪接点的区域(例如，SEQ ID NOS:4-15)。
在各种实施方案中，肌生成抑制蛋白靶向序列包含SEQ ID NOS:16-75之一，选自SEQ ID NOS:16-75之一，是选自SEQ ID NOS:16-75至少之一的序列的至少12个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:16-75至少之一的序列具有至少90％序列同一性的变体，其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:16-75的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQID NOS:16-75的每个Y是胞嘧啶(C)。
在一些实施方案中，式(VII)的肌生成抑制蛋白靶向序列选自：
a)SEQ ID NO:71(YYAGYYYAXYXXYXYYXGGXYYXGG)，其中Z是25；
b)SEQ ID NO:72(YAYXXAYYAGYYYAXYXXYXYYXGG)，其中Z是25；
c)SEQ ID NO:73(YYAYXXGYAXXAGAAAAXYAGY)，其中Z是22；
d)SEQ ID NO:74(GYATTAGAAAATYAGYTATAAATG)，其中Z是24；和
e)SEQ ID NO:75(YYATYYGYTTGYATTAGAAAGTYAGY)，其中Z是26；
其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:71-75的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQ ID NOS:71-75的每个Y是胞嘧啶(C)。
在各种实施方案中，肌养蛋白靶向序列包含SEQ ID NOS:76-3485之一，选自SEQID NOS:76-3485之一，是选自SEQ ID NOS:76-3485至少之一的序列的至少10个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:76-3485至少之一的序列具有至少90％序列同一性的变体，其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:76-3485的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQ ID NOS:76-3485的每个Y是胞嘧啶(C)。在一些实施方案中，靶向序列可包含SEQ IDNO:76。
在各种实施方案中，靶向序列的至少一个X是T。在各种实施方案中，靶向序列的每个X是T。
在各种实施方案中，靶向序列的至少一个X是U。在各种实施方案中，靶向序列的每个X是U。
在各种实施方案中，靶向序列的至少一个Y是5mC。在各种实施方案中，靶向序列的每个Y是5mC。
在各种实施方案中，靶向序列的至少一个Y是C。在各种实施方案中，靶向序列的每个Y是C。
在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NO:76-3485的至少一个X是T。在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NO:76-3485的每个X是T。
在各种实施方案中，靶向序列的至少一个X是U。在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NO:76-3485的每个X是U。
在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NO:76-3485的至少一个Y是5mC。在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NO:76-3485的每个Y是5mC。
在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NO:76-3485的至少一个Y是C。在各种实施方案中，SEQ ID NOS:16-75和SEQ ID NO:76-3485的每个Y是C。
在某些实施方案中，反义寡聚体是式(VIII)的化合物:
或其药学上可接受的盐，其中：
每个Nu是核碱基，其一起形成靶向序列；和
Z是8-48的整数。
在各种实施方案中，靶向序列与肌生成抑制蛋白前-mRNA内的靶标区互补。在一些实施方案中，靶向序列与外显子/内含子剪接位点内的靶标区的12或更多个连续核苷酸互补，或与跨越肌生成抑制蛋白前mRNA的内含子/外显子或外显子/内含子剪接点的区域(例如，SEQ ID NOS:1-3)互补。
在各种实施方案中，靶向序列与肌养蛋白前-mRNA内的靶标区互补。在一些实施方案中，靶向序列与肌养蛋白前-mRNA的外显子内的靶标区内的10或更多个连续核苷酸互补，所述外显子选自外显子7、外显子8、外显子9、外显子19、外显子23、外显子44、外显子45、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子55。在实施方案中，靶标区完全在肌养蛋白前-mRNA的外显子内，其中没有一部分的靶向序列跨越剪接点，或在跨越肌养蛋白前-mRNA的内含子/外显子或外显子/内含子剪接点的区域(例如，SEQ ID NOS:4-15)。
在各种实施方案中，肌生成抑制蛋白靶向序列包含SEQ ID NOS:16-75之一，选自SEQ ID NOS:16-75之一，是选自SEQ ID NOS:16-75至少之一的序列的至少12个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:16-75至少之一的序列具有至少90％序列同一性的变体，其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:16-75的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQID NOS:16-75的每个Y是胞嘧啶(C)。
在一些实施方案中，肌生成抑制蛋白靶向序列选自:
a)SEQ ID NO:71(YYAGYYYAXYXXYXYYXGGXYYXGG)，其中Z是25；
b)SEQ ID NO:72(YAYXXAYYAGYYYAXYXXYXYYXGG)，其中Z是25；
c)SEQ ID NO:73(YYAYXXGYAXXAGAAAAXYAGY)，其中Z是22；
d)SEQ ID NO:74(GYATTAGAAAATYAGYTATAAATG)，其中Z是24；和
e)SEQ ID NO:75(YYATYYGYTTGYATTAGAAAGTYAGY)，其中Z是26；
其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:71-75的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQ ID NOS:71-75的每个Y是胞嘧啶(C)。
在各种实施方案中，肌养蛋白靶向序列包含SEQ ID NOS:76-3485之一，选自SEQID NOS:76-3485之一，是选自SEQ ID NOS:76-3485至少之一的序列的至少10个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:76-3485至少之一的序列具有至少90％序列同一性的变体，其中每个X独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中每个Y独立地选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方案中，SEQ ID NOS:76-3485的每个X是胸腺嘧啶(T)，和SEQ ID NOS:76-3485的每个Y是胞嘧啶(C)。在一些实施方案中，靶向序列可包含SEQ IDNO:76。
在一些实施方案中，本公开内容的反义寡聚体，包括式(I)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)和(VIII)的化合物的每个Nu独立地选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、次黄嘌呤(肌苷)、2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C5-丙炔基-修饰的嘧啶和10-(9-(氨基乙氧基)吩噁嗪基)。在一些实施方案中，本公开内容的反义寡聚体，包括式(I)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)和(VIII)的化合物的靶向序列包含选自SEQ ID NOS:2、3、4或6的序列，选自SEQ IDNOS:2、3、4或6，是选自SEQ ID NOS:2、3、4或6的序列的至少12个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:2、3、4或6的序列具有至少90％序列同一性的变体，其中X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和其中I是肌苷。
可根据本公开内容使用的另外的修饰的反义寡聚体/化学包括描述于以下专利和专利公布中的那些，其通过引用以其整体并入本文：PCT公布号WO 2007/002390；WO 2010/120820；和WO 2010/148249；美国专利号7,838,657；和美国专利申请号2011/0269820。
C.吗啉亚单位和氨基磷酸酯核苷间接头的制备
吗啉单体亚单位、修饰的核苷间连键和包含它们的寡聚体可按例如，美国专利号5,185,444和7,943,762所述制备，其通过引用以其整体并入本文。吗啉亚单位可根据以下通用反应方案I制备。
反应方案1.吗啉亚单位的制备、保护和活化
参考反应方案1，在B代表碱基配对部分和PG代表保护基时，吗啉亚单位可从所示的相应核糖核苷(1)制备。吗啉亚单位(2)可任选地通过与适合的保护基前体、例如三苯甲基氯反应得到保护。3’保护基通常在固态寡聚体合成期间被除去，如下文更详细描述的。碱基配对部分可合适地被保护，用于固相寡聚体合成。适合的保护基包括用于腺嘌呤和胞嘧啶的苯甲酰基、用于鸟嘌呤的苯乙酰基和用于次黄嘌呤(I)的特戊酰基氧基甲基。特戊酰基氧基甲基可引入次黄嘌呤杂环碱基的N1位置上。尽管可利用未保护的次黄嘌呤亚单位，但当碱基被保护时活化反应的收率更优越。其它适合的保护基包括公开于美国专利号8,076,476中的那些，其通过引用以其整体并入本文。
化合物3与活化的磷化合物4反应，得到具有需要的连键部分化合物5的吗啉亚单位。结构4的化合物可使用本领域的技术人员已知的各种方法制备。例如，这样的化合物可通过相应胺和磷酰氯反应制备。在该方面，胺起始材料可使用本领域已知的任何方法制备，例如描述于实施例和美国专利号5,185,444、7,943,762和8,779,128中的那些方法，其通过引用以其整体并入本文。
结构5的化合物可用于固相自动化寡聚体合成，以制备包含核苷间连键的寡聚体。这样的方法是本领域众所周知的。简言之，结构5的化合物可在5’端修饰以包含至固体支持物的接头。例如，化合物5可通过包含L11和L15的接头连接至固体支持物。一旦被支持，保护基(例如，三苯甲基)被除去，和游离胺与结构5的第二化合物的活化的磷部分反应。该顺序重复，直至获得需要长度的寡聚物。在5’端的保护基可被除去，或留下(如果需要5’-修饰)。寡聚物可使用各种方法从固体支持物除去，例如用DTT接着氢氧化铵处理。
修饰的吗啉亚单位和基于吗啉的寡聚体的制备更详细描述于实施例。含有各种修饰的连键的基于吗啉的寡聚体可使用本文所述的方法、本领域已知的方法和/或本文通过引用描述的方法制备。实施例还描述了之前所述制备的基于吗啉的寡聚体的整体修饰(参见例如，PCT公布号WO 2008/036127，其通过引用以其整体并入本文)。
术语“保护基”是指封闭化合物的一些或所有反应性部分和阻止所述部分参与化学反应的化学部分，直到保护基被除去，例如，列举和描述于T.W.Greene,P.G.M.Wuts,protective groups in Organic Synthesis,3rd ed.John Wiley&Sons(1999)中的那些部分，其通过引用以其整体并入本文。在利用不同的保护基时，每个(不同的)保护基可通过不同的手段除去，这可能是有利的。在完全不同的反应条件下切除的保护基允许这样的保护基的差异除去。例如，保护基可通过酸、碱和氢解除去。基团例如三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、乙缩醛和叔丁基二甲基甲硅烷基是酸不稳定的，和在用Cbz基团(其可通过氢解除去)和Fmoc基团(其是碱不稳定的)保护的氨基存在时可用于保护羧基和羟基反应性部分。羧酸部分可用碱不稳定基团，例如但不限于甲基或乙基封闭，和在用酸不稳定基团(例如叔丁基氨基甲酸酯)或用酸和碱均稳定的但可水解除去的氨基甲酸酯封闭的胺存在时，羟基反应性部分可用碱不稳定基团例如乙酰基封闭。
羧酸和羟基反应性部分也可用水解可除去的保护基例如苯甲基封闭，而胺基团可用碱不稳定基团例如Fmoc封闭。用于合成式(I)的化合物的特别有用的胺保护基是三氟乙酰胺。羧酸反应性部分可用氧化可除去的保护基例如2,4-二甲氧基苯甲基封闭，而共存在的氨基可用氟不稳定的甲硅烷基氨基甲酸酯封闭。
在酸和碱保护基存在时可使用烯丙基封闭基团，因为后者是稳定的，和可随后通过金属或pi酸催化剂除去。例如，在酸不稳定的叔丁基氨基甲酸酯或碱不稳定的乙酸胺保护基存在时，烯丙基封闭的羧酸可用钯(0)催化的反应脱保护。又一种形式的保护基是化合物或中间体可连接的树脂。只要残基连接至树脂，官能团被封闭和不能反应。一旦从树脂释放，官能团可用于反应。
典型的封闭/保护基是本领域已知的和包括但不限于以下部分：
除非另外注明，所有化学品获自Sigma-Aldrich-Fluka(St.Louis，MO)。苯甲酰基腺苷、苯甲酰基胞苷和苯乙酰基鸟苷获自Carbosynth Limited(Berkshire，UK)。
含有如本文所述的其它连键修饰的PMO、PMOplus、PPMO和PMO-X的合成使用本领域已知的和描述于待审的美国专利申请号12/271,036和12/271,040和PCT公布号WO 2009/064471中的方法进行，其通过引用以其整体并入本文。
具有3’三苯甲基修饰的PMO基本上如PCT公布号WO 2009/064471中所述合成，除了省略脱三苯甲基化步骤之外。
D.细胞穿透肽
本公开内容的修饰的反义寡聚体化合物可缀合至肽，在本文亦称为细胞穿透肽(CPP)。在某些优选的实施方案中，肽是有效提高化合物运输至细胞的富含精氨酸的肽运输部分。运输部分优选地连接至寡聚体的末端。肽具有在给定细胞培养群体的细胞的30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内(包括在之间的所有整数)诱导细胞穿透的能力，和在全身给予后在多种组织中允许大分子体内易位。在一个实施方案中，细胞穿透肽可以是富含精氨酸的运输肽。在另一个实施方案中，细胞穿透肽可以是Penetratin或Tat肽。这些肽是本领域众所周知的和公开于例如，美国申请号2010-0016215 A1，其通过引用以其整体并入本文。一种缀合肽至本公开内容的修饰的反义寡聚体的方法可见于PCT公布WO2012/150960，其通过引用以其整体并入本文。本公开内容的肽缀合的寡聚体的一些实施方案在CPP和修饰的反义寡聚体之间利用甘氨酸作为接头。例如，本公开内容的肽缀合的PMO由R6-G-PMO组成。
相对于在缺少连接的运输部分时寡聚体的摄取，上述的运输部分已显示极大提高连接的寡聚体的细胞进入。相对于未缀合的化合物，摄取优选地提高至少10倍，和更优选地20倍。
富含精氨酸的运输肽(即，细胞穿透肽)的使用特别可用于实施本公开内容。某些运输肽显示高度有效地递送反义化合物至原代细胞，包括肌肉细胞(Marshall，Oda等2007；Jearawiriyapaisarn，Moulton等2008；Wu，Moulton等2008，其通过引用以其整体并入本文)。此外，与其它已知的运输肽例如Penetratin和Tat肽相比，本文所述的运输肽当缀合至反义PMO时，证实提高改变数种基因转录物的剪接的能力(Marshall，Oda等2007，其通过引用以其整体并入本文)。
示例性的运输肽，不包括接头，在下表5中提供。
表5：示例性的运输肽
A指定给CPP SEQ ID NOS的序列不包括连键部分(例如，C(cys)、G(gly)、P(pro)、Ahx、B、AhxB，其中Ahx和B分别是指6-氨基己酸和β-丙氨酸)。
在各种实施方案中，G(如在式I、IV和V中所述)是细胞穿透肽(“CPP”)和接头部分，其选自-C(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)(CH2)2NH-CPP、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NH-CPP和-C(O)CH2NH-CPP，或G具有下式：
其中CPP通过CPP羧基端的酰胺键连接至接头部分。在一些实施方案中，CPP选自SEQ ID NOS:3486-3501。
在一些实施方案中，G(如在式I、IV和V中所述)具有下式：
其中Ra选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基，和J是4-9的整数。在某些实施方案中J是6。
在一些实施方案中，CPP(如在式I、IV和V中所述)具有下式：
其中Ra选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基，和J是4-9的整数。在某些实施方案中，CPP是SEQ ID NO:15。在各种实施方案中，J是6。在一些实施方案中，Ra选自H和乙酰基。例如，在一些实施方案中，Ra是H。在某些实施方案中，Ra是乙酰基。
IV.制剂
本公开内容的化合物也可与其它分子、分子结构或化合物的混合物混合、包封、缀合或以其它方式缔合，作为例如，脂质体、受体靶向分子、口服、直肠、局部或其它制剂，用于帮助摄取、分布和/或吸收。教导制备这样的摄取、分布和/或吸收辅助制剂的代表性的美国专利包括但不限于，美国专利号5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；和5,595,756，其通过引用以其整体并入本文。
本公开内容的反义化合物包括任何药学上可接受的盐、酯或这样的酯的盐，或在给予动物包括人时能够提供(直接或间接)生物活性代谢物或其残余物的任何其它化合物。因此，例如，本公开内容还涉及本公开内容的化合物的前药和药学上可接受的盐、这样的前药的药学上可接受的盐和其它生物等效物。
术语“前药”表示以无活性形式制备的治疗剂，其在身体或其细胞内通过内源酶或其它化学和/或条件的作用转化为活性形式(即，药物)。特别地，本公开内容的寡聚体的前药形式根据公开于1993年12月9日公布的Gosselin等PCT公布号WO 1993/24510或Imbach等PCT公布号WO 1994/26764和美国专利号5,770,713中的方法，作为SATE[(S-乙酰基-2-硫代乙基)磷酸酯]衍生物制备，其通过引用以其整体并入本文。
术语“药学上可接受的盐”是指本公开内容的化合物的生理学和药学上可接受的盐：即，保留母体化合物的需要的生物活性和不引起对其不需要的毒性作用的盐。对于寡聚体，药学上可接受的盐和其用途的实例进一步描述于美国专利号6,287,860，其通过引用以其整体并入本文。
本公开内容还包括药物组合物和制剂，其包括本公开内容的反义化合物。本公开内容的药物组合物可以各种方式给予，取决于需要局部还是全身性治疗和取决于治疗的区域。给予可以是局部(包括经眼和至粘膜，包括阴道和直肠递送)、经肺例如通过吸入或吹入粉剂或气雾剂，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和经皮肤)、口服或胃肠外。胃肠外给予包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内，例如，鞘内或心室内给予。认为具有至少一个2′-O-甲氧基乙基修饰的寡聚体特别可用于口服给予。用于局部给予的药物组合物和制剂可包括经皮肤贴剂、软膏剂、洗剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规药用载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是需要或合适的。包衣避孕套、手套等也可使用。
本公开内容的药物制剂，其可以单位剂型方便提供，可根据药学工业众所周知的常规技术制备。这样的技术包括使活性成分与药用载体或赋形剂缔合的步骤。总体上，制剂通过以下制备：使活性成分与液体载体或细分固体载体或二者均匀和紧密缔合，然后如果需要，使产物成形。
本公开内容的组合物可配制为许多可能的剂型的任一种，例如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆剂、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本公开内容的组合物还可配制为在水性、非水性或混合介质中的混悬剂。水性混悬剂可进一步包含增加混悬剂的粘度的物质，包括，例如，羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。混悬剂还可包含稳定剂。
本公开内容的药物组合物包括但不限于，溶液、乳剂、泡沫和含脂质体制剂。本公开内容的药物组合物和制剂可包含一种或多种渗透促进剂、载体、赋形剂或其它活性或无活性成分。
乳剂通常是一种液体以通常超过0.1μm直径的液滴形式分散在另一种中的异质系统。除了分散相之外，乳剂可包含另外的组分，和可作为溶液存在于水相、油相或自身作为单独的相的活性药物。微乳剂作为本公开内容的实施方案包括在内。乳剂和其用途是本领域众所周知的和进一步描述于美国专利号6,287,860，其通过引用以其整体并入本文。
本公开内容的制剂包括脂质体制剂。如本公开内容使用的，术语“脂质体”意指由以一个或多个球形双层排列的两亲脂质构成的囊泡。脂质体是单层或多层囊泡，其具有从亲脂材料形成的膜和包含待递送的组合物的水性内部。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，认为其与带负电荷的DNA分子相互作用以形成稳定的复合物。认为pH敏感或带负电荷的脂质体俘获DNA而不是与其复合。阳离子和非阳离子脂质体二者已用于递送DNA至细胞。
脂质体还包括“空间稳定的”脂质体，如本文使用的，该术语是指脂质体包含一种或多种专门的脂质，其当掺入脂质体时相对于缺少所述专门的脂质的脂质体导致提高的循环寿命。空间稳定的脂质体的实例是那些，其中脂质体的形成囊泡的脂质部分的一部分包含一种或多种糖脂，或用一种或多种亲水寡聚体、例如聚乙二醇(PEG)部分衍生。脂质体和其用途进一步描述于美国专利号6,287,860，其通过引用以其整体并入本文。
本公开内容的药物制剂和组合物还可包括表面活性剂。表面活性剂在药物产品、制剂和乳剂中的用途是本领域众所周知的。表面活性剂和其用途进一步描述于美国专利号6,287,860，其通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开内容利用各种渗透促进剂来实现核酸、特别是寡聚体的有效递送。除了帮助非-亲脂药物跨细胞膜扩散，渗透促进剂还提高亲脂药物的渗透性。渗透促进剂可分类为属于五个主要类别之一，即，表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合性非表面活性剂。渗透促进剂和其用途进一步描述于美国专利号6,287,860，其通过引用以其整体并入本文。
本领域技术人员将认识到，制剂根据其预期用途、即给予途径而常规设计。
用于局部给予的制剂包括其中本公开内容的寡聚体与局部递送剂例如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些。脂质和脂质体包括中性(例如二油酰基磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰基磷脂酰胆碱)、阴离子(例如二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油DMPG)和阳离子(例如二油酰基四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰基磷脂酰乙醇胺DOTMA)。
对于局部或其它给予，治疗剂，包括本公开内容的寡聚体，可包封在脂质体内或可与其(特别是与阳离子脂质体)形成复合物。或者，治疗剂可与脂质、特别是阳离子脂质复合。脂肪酸和酯、其药学上可接受的盐和其用途进一步描述于美国专利号6,287,860，其通过引用以其整体并入本文。局部制剂详细描述于1999年5月20日提交的美国专利申请号09/315,298和Mourich等2009，J.Invest.Dermatol.，129(8):1945-53，其通过引用以其整体并入本文。
用于口服给予的组合物和制剂包括粉剂或颗粒剂、微粒、微颗粒、在水或非水性介质中的混悬剂或溶液剂、胶囊、凝胶胶囊、囊剂、片剂或微片剂。增稠剂、矫味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是需要的。口服制剂是其中本公开内容的寡聚体与一种或多种渗透促进剂、表面活性剂和螯合剂结合给予的那些。表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。胆汁酸/盐和脂肪酸和其用途进一步描述于美国专利号6,287,860，其通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，本公开内容提供了渗透促进剂的组合，例如，脂肪酸/盐与胆汁酸/盐的组合。示例性的组合是月桂酸的钠盐、癸酸和UDCA。其它渗透促进剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚。本公开内容的寡聚体可以包括喷雾干燥颗粒或复合形成微颗粒或纳米颗粒的颗粒形式口服递送。寡聚体复合剂和其用途进一步描述于美国专利号6,287,860，其通过引用以其整体并入本文。寡聚体的口服制剂和其制备详细描述于美国专利申请号09/108,673(1998年7月1日提交)、09/315,298(1999年5月20日提交)和10/071,822(2002年2月8日提交)，其通过引用以其整体并入本文。
用于胃肠外、鞘内或心室内给予的组合物和制剂可包括无菌水性溶液，其还可包含缓冲液、稀释剂和其它适合的添加剂，例如但不限于渗透促进剂、载体化合物和其它药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一相关的实施方案中，本公开内容的组合物可包含靶向第一核酸的一种或多种反义化合物、特别是寡聚体，和靶向第二核酸靶标的一种或多种另外的反义化合物。或者，本公开内容的组合物可包含靶向相同核酸靶标的不同区域的两种或更多种反义化合物。反义化合物的许多实例是本领域已知的。两种或更多种组合化合物可一起或序贯使用。
V.使用方法
某些涉及治疗具有杜兴肌营养不良或相关病症的受试者的方法，包括给予受试者肌养蛋白治疗剂，所述受试者还接受肌生成抑制蛋白治疗剂。
在各方面中，给予具有DMD或相关病症的受试者治疗剂。在实施方案中，在用如本文所述的修饰的反义寡聚体治疗前，将一种或多种治疗剂给予受试者。在实施方案中，在给予修饰的反义寡聚体之前、同时或之后，可将一种或多种治疗剂给予受试者。在实施方案中，治疗剂是蛋白或核酸。在一些实施方案中，蛋白是抗体或可溶性受体。在实施方案中，可溶性受体是ACVR2。在实施方案中，核酸是反义寡聚体或siRNA。在一些实施方案中，反义寡聚体是如本文所述的修饰的反义寡聚体。
在实施方案中，治疗剂是能够抑制受试者的肌生成抑制蛋白活性或肌生成抑制蛋白表达的一者或二者的肌生成抑制蛋白治疗剂。肌生成抑制蛋白治疗剂可以是靶向肌生成抑制蛋白前-mRNA和干扰肌生成抑制蛋白前-mRNA转录为成熟mRNA的治疗剂。在实施方案中，肌生成抑制蛋白治疗剂在人肌生成抑制蛋白前-mRNA加工期间能够诱导外显子跳跃。在实施方案中，肌生成抑制蛋白治疗剂诱导肌生成抑制蛋白前-mRNA中外显子2的跳跃和抑制含有外显子2的肌生成抑制蛋白前-mRNA的表达。肌生成抑制蛋白治疗剂可以是靶向肌生成抑制蛋白和干扰肌生成抑制蛋白与肌生成抑制蛋白受体结合的治疗剂。
肌生成抑制蛋白治疗剂选自蛋白和核酸。蛋白可以是抗-肌生成抑制蛋白抗体、例如抗-GDF8(Abcam，Cambridge MA)或可溶性受体。在实施方案中，可溶性受体是ACVR2。核酸选自反义寡聚体和siRNA。反义寡聚体可以是如本文所述的修饰的肌生成抑制蛋白反义寡聚体。
在实施方案中，治疗剂是能够增加受试者的肌养蛋白的肌养蛋白治疗剂。肌养蛋白治疗剂可增加功能性或半功能性的肌养蛋白或截短形式的肌养蛋白的表达。截短形式的肌养蛋白包括但不限于，微肌养蛋白和小肌养蛋白(公开于EP专利号2125006，其通过引用以其整体并入本文)。肌养蛋白治疗剂可以是靶向肌养蛋白前-mRNA和调节肌养蛋白前-mRNA转录为成熟mRNA的治疗剂。在实施方案中，肌养蛋白治疗剂能够在人肌养蛋白前-mRNA加工期间诱导外显子跳跃。在实施方案中，靶向的肌养蛋白前-mRNA具有一种或多种遗传突变。肌养蛋白治疗剂诱导外显子跳跃，使得在加工为成熟mRNA期间含有一种或多种遗传突变的一个或多个外显子从肌养蛋白前-mRNA除去。得到的截短的mRNA能够翻译为功能性或半功能性肌养蛋白。
在一些方面，修饰的肌养蛋白反义寡聚体包含足够长度和互补性的核苷酸序列以特异性杂交至肌养蛋白基因的前-mRNA内的区域，其中修饰的反义寡聚体与该区域的结合在肌养蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃。在实施方案中，在肌养蛋白前-mRNA加工期间外显子跳跃导致具有遗传突变的一个或多个外显子从前-mRNA除去。在实施方案中，从肌养蛋白前-mRNA除去具有遗传突变的一个或多个外显子增加在受试者的细胞和/或组织中未突变的肌养蛋白前-mRNA的水平。未突变的肌养蛋白前-mRNA在受试者中的水平增加可进一步转化为功能性或半功能性肌养蛋白的表达增加。因此，本公开内容涉及通过使用如本文所述的修饰的肌养蛋白反义寡聚体来增加未突变的肌养蛋白mRNA的水平，增加功能性或半功能性肌养蛋白的方法。
在一些方面，修饰的肌生成抑制蛋白反义寡聚体包含足够长度和互补性的核苷酸序列以特异性杂交至肌生成抑制蛋白基因的前-mRNA内的区域，其中修饰的反义寡聚体与该区域的结合在肌生成抑制蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃。在实施方案中，修饰的肌生成抑制蛋白寡聚体与该区域的结合在受试者的细胞和/或组织中减少含有外显子2的肌生成抑制蛋白mRNA的水平。在受试者中含有外显子2的肌生成抑制蛋白mRNA的水平减少可进一步转化为功能性肌生成抑制蛋白的表达减少。
方法还包括治疗患有或有风险发生杜兴肌营养不良(DMD)或相关病症的个体，包括与治疗剂组合给予有效量的本公开内容的修饰的反义寡聚体至受试者。修饰的反义寡聚体可以或可以不在相同的组合物中并且可以或可以不共给予受试者。在各种实施方案中，修饰的反义寡聚体与治疗剂同时或几乎同时给予。在进一步的实施方案中，修饰的反义寡聚体在与治疗剂基本上不同的时间给予。如本文所述的修饰的反义寡聚体靶向的示例性的序列显示在表1和2中。
还包括治疗剂和修饰的反义寡聚体，用于治疗DMD或相关病症或用于制备用于治疗DMD或相关病症的药物，所述治疗或药物包含治疗剂。在实施方案中，药物包括如本文所述的修饰的反义寡聚体，例如，其中修饰的反义寡聚体包含10-50个亚单位，任选地具有至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i)修饰的核苷间连键，(ii)修饰的糖部分，或(iii)前述的组合；和与肌养蛋白或肌生成抑制蛋白前-mRNA的靶标区内的10或更多个连续核苷酸互补的靶向序列。
在各种实施方案中，靶向序列与肌生成抑制蛋白前-mRNA内的靶标区互补。在一些实施方案中，靶向序列与完全在外显子2内的靶标区的12或更多个连续核苷酸互补，其中没有一部分的靶向序列跨越剪接点，或与跨越肌生成抑制蛋白前-mRNA的内含子/外显子或外显子/内含子剪接点的区域(例如，SEQ ID NOS:1-3)互补。在一些实施方案中，修饰的反义寡聚体的靶向序列(a)包含选自SEQ ID NOS:16-75的序列，(b)选自SEQ ID NOS:16-75，(c)是选自SEQ ID NOS:16-75的序列的至少12个连续核苷酸的片段，或(d)是与选自SEQ IDNOS:16-75的序列具有至少90％序列同一性的变体，其中X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和C选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。
在各种实施方案中，靶向序列与肌养蛋白前-mRNA内的靶标区互补。在一些实施方案中，靶向序列与肌养蛋白前-mRNA的外显子内的靶标区的10或更多个连续核苷酸互补，所述外显子选自外显子7、外显子8、外显子9、外显子19、外显子23、外显子44、外显子45、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子55。在实施方案中，靶标区完全在肌养蛋白前-mRNA的外显子内，其中没有一部分的靶向序列跨越剪接点，或在跨越肌养蛋白前-mRNA的内含子/外显子或外显子/内含子剪接点的区域(例如，SEQ ID NOS:4-15)。在一些实施方案中，修饰的反义寡聚体的靶向序列(a)包含选自SEQ ID NOS:76-3485的序列，(b)选自SEQID NOS:76-3485，(c)是选自SEQ ID NOS:76-3485的序列的至少10个连续核苷酸的片段，或(d)是与选自SEQ ID NOS:76-3485的序列具有至少90％序列同一性的变体，其中X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和C选自胞嘧啶(C)或5-甲基胞嘧啶(5mC)。
在一些实施方案中，治疗DMD或相关病症的方法或用于治疗DMD或相关病症的药物包括具有包含修饰的糖部分的核苷酸类似物亚单位的修饰的反义寡聚体。修饰的糖部分可选自肽核酸(PNA)亚单位、锁核酸(LNA)亚单位、2'O,4'C-亚乙基-桥接的核酸(ENA)亚单位、三环-DNA(tc-DNA)亚单位、2’O-甲基亚单位、2’O-甲氧基乙基亚单位、2’-氟亚单位、2'-O-[2-(N-甲基氨基甲酰基)乙基]亚单位和吗啉亚单位。
这些其它方面和实施方案包括具有包含修饰的核苷间连键的核苷酸类似物亚单位的修饰的反义寡聚体。在各种实施方案中，修饰的核苷间连键选自硫代磷酸酯核苷间连键、氨基磷酸酯核苷间连键、二氨基磷酸酯核苷间连键。在进一步的实施方案中，二氨基磷酸酯核苷间连键包含磷原子，其共价键合至(1,4-哌嗪)-1-基部分、取代的(1,4-哌嗪)-1-基部分、4-氨基哌啶-1-基部分或取代的4-氨基哌啶-1-基部分。
这些其它方面和实施方案包括修饰的反义寡聚体，其具有包含修饰的糖部分和修饰的核苷间连键的至少一种组合的核苷酸类似物亚单位。
在一些实施方案中，修饰的反义寡聚体被哺乳动物细胞主动摄取。在进一步的实施方案中，修饰的反义寡聚体可缀合至如本文所述的运输部分(例如，运输肽或CPP)，以促进这样的摄取。各个方面涉及使用如本文所述的修饰的反义寡聚体在细胞、组织和/或受试者中减少含有外显子2的肌生成抑制蛋白mRNA转录物和/或功能性肌生成抑制蛋白的表达的方法。在一些情况下，相对于对照，例如，对照细胞/受试者(例如，不具有杜兴肌营养不良或相关病症的受试者)、没有修饰的反义寡聚体的对照组合物、缺少治疗和/或早期时间点，含有外显子2的肌生成抑制蛋白mRNA转录物和/或功能性肌生成抑制蛋白减少或降低约或至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。还包括相对于健康对照的水平，例如，不具有杜兴肌营养不良或相关病症的受试者，减少含有外显子2的mRNA转录物或功能性肌生成抑制蛋白的表达的方法。如本文使用的，“有效量”或“治疗量”是指与对照细胞/受试者相比，能够以关于当给予受试者时的增加公开的一定范围的百分比，结合肌生成抑制蛋白前-mRNA转录物的靶标区和减少含有外显子2的肌生成抑制蛋白mRNA转录物和功能性肌生成抑制蛋白的表达的修饰的反义寡聚体的剂量。
各个方面涉及用于使用如本文所述的修饰的反义寡聚体，在细胞、组织和/或受试者中调节肌养蛋白前-mRNA的内含子和外显子的剪接和增加肌养蛋白或截短的肌养蛋白前-mRNA的表达的方法。在进一步的方面，例如相对于全长野生型肌养蛋白前-mRNA，截短形式的肌养蛋白前-mRNA的表达提高。在一些情况下，相对于对照，例如，对照细胞/受试者(例如，不具有杜兴肌营养不良或相关病症的受试者)、没有修饰的反义寡聚体的对照组合物、缺少治疗和/或早期时间点，肌养蛋白mRNA转录物和/或功能性或半功能性肌养蛋白增加或提高约或至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。方法还包括相对于健康对照的水平，例如，不具有杜兴肌营养不良或相关病症的受试者，增加肌养蛋白mRNA转录物或功能性或半功能性肌养蛋白的表达。如本文使用的，“有效量”或“治疗量”是指与对照细胞/受试者相比，能够以关于当给予受试者时的增加公开的一定范围的百分比，结合肌养蛋白前-mRNA转录物的靶标区和增加肌养蛋白或截短的肌养蛋白mRNA转录物和功能性肌养蛋白的表达的修饰的反义寡聚体的剂量。
方法还包括在如本文所述的细胞、组织和/或受试者中减少功能性/活性肌生成抑制蛋白的表达。在某些情况下，相对于对照，例如，对照细胞/受试者(例如，不具有杜兴肌营养不良或相关病症的受试者)、没有治疗剂的对照组合物、缺少治疗和/或早期时间点，功能性/活性肌生成抑制蛋白的水平减少约或至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。方法还包括相对于受影响的对照的水平，例如，具有杜兴肌营养不良或相关病症的受试者，减少功能性/活性肌生成抑制蛋白的表达。
方法还包括在如本文所述的细胞、组织和/或受试者中增加功能性或半功能性/活性肌养蛋白的表达。在某些情况下，相对于对照，例如，对照细胞/受试者(例如，不具有杜兴肌营养不良或相关病症的受试者)、没有治疗剂的对照组合物、缺少治疗和/或早期时间点，功能性或半功能性/活性肌养蛋白的水平增加约或至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。方法还包括相对于受影响的对照的水平，例如，具有杜兴肌营养不良或相关病症的受试者，增加功能性或半功能性/活性肌养蛋白的表达。
方法还包括在受试者中使用治疗剂与如本文所述的反义寡聚体的组合抑制杜兴肌营养不良和相关病症的进展。
在一些实施方案中，在一种或多种适合的药用载体中将治疗剂和修饰的反义寡聚体给予显示DMD或相关病症的一种或多种症状的受试者。如本文使用的，术语“治疗”是指改善DMD或相关病症或与DMD或相关病症有关的至少一种可辨别的症状。在一些实施方案中，“治疗”是指不一定可由受试者辨别的至少一种可测量的物理和/或生物参数的改善。受试者可经历例如，肌肉力量和协调的物理改进。这些参数可通过例如，自我评价试验、医生检查、物理和生理测量的实验室检验和来自受试者的样品的生物学试验评价。在另一个实施方案中，“治疗”是指减慢DMD或相关病症的进展或逆转其进展。如本文使用的，“预防”或“抑制”是指延迟发生DMD或相关病症或减少发生DMD或相关病症的风险。
合适时，方法包括减少或改善有需要的受试者的DMD和相关病症的一种或多种症状。具体实例包括进行性肌肉虚弱的症状，例如经常跌倒、从躺位或坐位难以起身、行走和跳跃困难、蹒跚步态、足趾行走、腓肠肌大、肌肉疼痛和僵硬和学习失能。
方法还包括增加受试者的骨骼肌肉质量。方法还包括治疗或预防受试者、健康受试者或患有疾病、病症或病况的受试者的肌肉质量减少。方法还包括治疗患有疾病、病症或病况的受试者的骨骼肌肉质量缺乏。在各种实施方案中，在给予治疗剂和本文所述的反义寡聚体的一者或二者之前在患者中测量肌生成抑制蛋白和肌养蛋白的一者或二者的血液或组织水平。有效量的治疗剂和本文的反义寡聚体的一者或二者被给予受试者。在选择的时间和给予反义寡聚体后在受试者中测量肌生成抑制蛋白和肌养蛋白的一者或二者的血液或组织水平。任选地，治疗剂和反义寡聚体的一者或二者的剂量和/或剂量方案根据测量调整，例如，增加剂量以确保治疗量的一者或二者提供给受试者。选择的时间可包括给予治疗剂和本文所述的反义寡聚体的一者或二者后的时间量，以允许吸收至血流和/或被肝脏和其它代谢过程代谢的时间。在一些实施方案中，选择的时间可以是给予后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、18、20、22或24小时。在一些实施方案中，选择的时间可以是给予后约12、18或24小时。在其它实施方案中，选择的时间可以是给予后约1、2、3、4、5、6或7天。
结合这样的治疗，可考虑药物基因组学(即，研究在个体基因型和个体对外来化合物或药物的反应之间的关系)。治疗剂代谢的差异可通过改变在药理活性药物的剂量和血液浓度之间的关系导致严重的毒性或治疗失效。因此，医生或临床医生可考虑在确定是否给予治疗剂以及定制用治疗剂治疗的剂量和/或治疗方案中应用在相关的药物基因组学研究中获得的知识。
将包括修饰的反义寡聚体的治疗剂有效给予和递送至靶标核酸是另一方面。治疗剂递送途径包括但不限于，各种系统途径，包括口服和胃肠外途径，例如，静脉内、皮下、腹膜内和肌内、以及吸入、经皮肤和局部递送。适合的途径可通过本领域技术人员确定，适合于进行治疗的受试者的病况。血管或血管外循环、血液或淋巴系统和脑脊液是RNA可引入的一些非限制性部位。
在具体的实施方案中，治疗剂通过静脉内(IV)或皮下(SC)给予受试者，即，将它们静脉内给予或递送至静脉或皮下给予或递送至在皮肤和肌肉之间的脂肪层。静脉内注射部位的非限制性实例包括臂、手、腿或足的静脉。皮下注射部位的非限制性实例包括腹部、大腿、下背或上臂。在示例性的实施方案中，PMO、PMO-X或PPMO形式的修饰的反义寡聚体通过IV或SC给予。在其它实施方案中，修饰的反义寡聚体通过肌内(IM)给予受试者，例如，它们肌内给予或递送至臂的三角肌、腿的股外侧肌、臀的腹外侧肌、臀的背外侧肌、胸腔的横隔膜和肋间肌肉。
在某些实施方案中，本公开内容的治疗剂可通过经皮肤方法递送(例如，通过将修饰的反义寡聚体掺入例如，乳剂，其中这样的修饰的反义寡聚体任选地包裹在脂质体中)。这样的经皮肤和乳剂/脂质体介导的递送方法在本领域中描述用于递送修饰的反义寡聚体，例如，美国专利号6,965,025，其通过引用以其整体并入本文。
本文所述的治疗剂还可通过植入装置递送。这样的装置的设计是公认的方法，例如，合成植入物设计描述于例如，美国专利号6,969,400，其通过引用以其整体并入本文。
治疗剂可使用公认的技术(例如，转染、电穿孔、融合、脂质体、胶体聚合物颗粒和病毒和非病毒载体以及本领域已知的其它手段)引入细胞。选择的递送方法将取决于例如，寡聚体化学、处理的细胞和细胞位置和对技术人员而言是显而易见的。例如，通过具有表面上的特定标志物的脂质体可实现定位，以指导脂质体、指导注射至含有靶细胞的组织、特定受体介导的摄取等。
如本领域已知的，治疗剂可使用，例如，包括脂质体介导的摄取、脂质缀合物、多聚赖氨酸介导的摄取、纳米颗粒介导的摄取和受体介导的内吞作用的方法，以及其它非内吞递送方式，例如微注射、透化(例如，链溶素-O透化、阴离子肽透化)、电穿孔和本领域已知的各种非侵入性非内吞递送方法递送(参考Dokka和Rojanasakul，Advanced Drug DeliveryReviews 44、35-49(2000)，其通过引用以其整体并入本文)。
治疗剂可在生理学和/或药学上可接受的任何方便的媒介或载体中给予。这样的组合物可包括本领域普通技术人员使用的各种标准药学上可接受的载体中的任一种。实例包括但不限于，盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、水、水性乙醇、乳剂例如油/水乳剂或三甘油酯乳剂、片剂和胶囊。适合的生理学上可接受的载体的选择将取决于选择的给予方式而改变。“药学上可接受的载体”意图包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，与药物给予相容。对于药用活性物质，这样的介质和试剂的使用是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，其在组合物中的使用是预期的。补充的活性化合物也可加入组合物中。
本公开内容的修饰的反义寡聚体可通常作为游离酸或游离碱使用。或者，本公开内容的化合物可以酸或碱加成盐的形式使用。本公开内容的游离氨基化合物的酸加成盐可通过本领域众所周知的方法制备，和可从有机酸和无机酸形成。适合的有机酸包括马来酸、富马酸、苯甲酸、抗坏血酸、琥珀酸、甲磺酸、乙酸、三氟乙酸、草酸、丙酸、酒石酸、水杨酸、柠檬酸、葡糖酸、乳酸、扁桃酸、肉桂酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕榈酸、乙醇酸、谷氨酸和苯磺酸。
适合的无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸和硝酸。碱加成盐包括与羧酸根阴离子形成的那些盐，和包括与有机和无机阳离子形成的盐，例如选自碱金属和碱土金属(例如，锂、钠、钾、镁、钡和钙)以及铵离子和其取代的衍生物(例如，二苯甲基铵、苯甲基铵、2-羟基乙基铵等)的那些。因此，术语“药学上可接受的盐”意图包括任何和所有可接受的盐形式。
此外，前药也包括在本公开内容的范围内。前药是任何共价键合的载体，当这样的前药被给予患者时其体内释放化合物。前药通常通过以使得通过常规操作或体内将修饰切除而得到母体化合物的方式修饰官能团制备。前药包括，例如，本公开内容的化合物，其中羟基、胺或巯基键合至任何基团，其当给予患者时，裂解以形成羟基、胺或巯基。因此，前药的代表性实例包括(但不限于)本公开内容的修饰的反义寡聚体的醇和胺官能团的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物。此外，在羧酸(-COOH)的情况下，可利用酯，例如甲基酯、乙基酯等。
在一些情况下，脂质体可用于促进修饰的反义寡聚体摄取至细胞(参见例如，Williams,S.A.,Leukemia 10(12):1980-1989,1996；Lappalainen et al.,AntiviralRes.23:119,1994；Uhlmann et al.,modified antisense oligomers:a new therapeuticprinciple,Chemical Reviews,Volume 90,No.4,25 pages 544-584,1990；Gregoriadis,G.,Chapter 14,Liposomes,Drug Carriers in Biology and Medicine,pp.287-341,Academic Press,1979)。水凝胶也可用作媒介用于修饰的反义寡聚体给予，例如，描述于PCT公布号WO 1993/01286。或者，寡聚体可在微球或微粒中给予(参见例如，Wu、G.Y.和Wu、C.H.，J.Biol.Chem.262:4429-4432，30 1987)。或者，使用与修饰的反义寡聚体复合的充气微泡可提高递送至靶标组织，如描述于美国专利号6,245,747。也可使用持续释放组合物。这些可包括成形物例如膜或微胶囊的形式的半渗透聚合物基质。各所述参考资料通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，治疗剂以有效产生至少200-400nM的峰血液浓度的治疗剂的量和方式给予。通常，一个或多个剂量的治疗剂被给予，通常以规则的时间间隔，持续约1-2周的时间。优选的口服给予剂量是约1-1000mg寡聚体/70kg。在一些情况下，大于1000mg寡聚体/患者的剂量可能是需要的。对于i.v.给予，优选剂量是约0.5mg-1000mg寡聚体/70kg。治疗剂可以规则的时间间隔给予，持续短的时间，例如，每日，持续2周或更少。然而，在一些情况下，治疗剂在较长的时间内间歇给予。给予之后可以给予抗生素或其它治疗性治疗，或与其同时进行。治疗方案可基于免疫测定、其它生物化学试验和进行治疗的受试者的生理检查的结果，按指示调整(剂量、频率、途径等)。
使用本公开内容的治疗剂的有效的体内治疗方案可根据持续时间、剂量、频率和给予途径以及进行治疗的受试者的病况(即，预防性给予相对于响应局部或全身感染给予)改变。因此，这样的体内疗法通常需要通过适合于治疗的具体病症类型的试验进行监测，和相应调整剂量或治疗方案，以实现最佳治疗结果。
治疗可例如，通过本领域已知的疾病的一般指示物监测。体内给予的治疗剂的功效可从在给予治疗剂之前、期间和之后获自受试者的生物样品(组织、血液、尿液等)测定。其中治疗剂是修饰的反义寡聚体的这样的样品的测定包括(1)使用本领域技术人员已知的程序监测与靶标和非靶标序列形成的异源双链体的存在或不存在，例如，电泳凝胶迁移测定；(2)与含有参考外显子2的肌生成抑制蛋白mRNA相比，监测不包含肌生成抑制蛋白外显子2的mRNA的量；或(3)与含有一个或多个遗传突变的参考肌养蛋白mRNA相比，监测不包含含有具有一个或多个遗传突变的一个或多个外显子的肌养蛋白mRNA的mRNA的量，如通过标准技术例如RT-PCR、RNA印迹、ELISA或蛋白质印迹测定的。在一些实施方案中，治疗通过症状评价监测。所述评价包括但不限于自我评估、医生检查、运动功能试验(例如，抓握力量试验)包括测量肌肉大小、肌肉质量、力量、反射、无意肌肉运动、电生理学试验、肌肉纤维和具有中央核的纤维的数量，和心血管功能试验，包括心电图(EKG或EGG)。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括与其它治疗剂组合给予。另外的治疗剂可在给予本发明的治疗剂之前、同时或非同时、例如之后给予。例如，治疗剂可与类固醇和/或抗生素组合给予。在另一实例中，在给予eteplirsen之前患者已用皮质类固醇治疗(例如，稳定剂量的皮质类固醇，持续4-6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24或更多周)。类固醇可以是糖皮质激素或泼尼松。糖皮质激素例如氢化可的松控制碳水化合物、脂肪和蛋白代谢，和通过阻止磷脂释放、减少嗜曙红细胞作用和许多其它机制而是抗-炎性的。盐皮质激素例如醛固酮主要通过促进在肾中钠贮留，控制电解质和水的水平。皮质类固醇是一类化学品，包括在脊椎动物的肾上腺皮质中天然产生的类固醇激素和在实验室中合成的这些激素的类似物。皮质类固醇参与各种生理过程，包括应激反应、免疫反应和炎症的调节、碳水化合物代谢、蛋白分解代射、血液电解质水平和行为。皮质类固醇包括但不限于，倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙和泼尼松。可在给予本发明的组合物之前、同时或之后给予的其它特定的目的类固醇是地夫可特和其制剂(例如，MP-104，Marathon Pharmaceuticals LLC)。
在一些实施方案中，治疗剂(例如，治疗性寡核苷酸、例如eteplirsen)的剂量是约30mg/kg，持续足以治疗DMD的时间。在一些实施方案中，治疗剂以约25mg/kg-约50mg/kg(例如，约25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50mg/kg)的剂量，例如，每周一次给予患者。在一些实施方案中，治疗剂以约25mg/kg-约50mg/kg(例如，约30mg/kg-约50mg/kg、约25mg/kg-约40mg/kg、约28mg/kg-约32mg/kg或约30mg/kg-约40mg/kg)的剂量，例如，每周一次给予患者。
在一些实施方案中，治疗剂一周一次静脉内给予。在某些实施方案中，输注时间是约15分钟-约4小时。在一些实施方案中，输注时间是约30分钟-约3小时。在一些实施方案中，输注时间是约30分钟-约2小时。在一些实施方案中，输注时间是约1小时-约2小时。在一些实施方案中，输注时间是约30分钟-约1小时。在一些实施方案中，输注时间是约60分钟。在一些实施方案中，输注时间是35-60分钟。
VI.给药
认为治疗组合物的配制和其随后给予(给药)在本领域技术人员的范围内。给药取决于待治疗的疾病状态的严重性和反应性，其中治疗过程持续数天至数月或直至实现治愈或实现疾病状态减少。最佳给药方案可根据在患者身体内药物积聚的测量计算。普通技术人员可容易确定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可根据各个寡聚体的相对效力改变，和通常可根据在体外和体内动物模型中发现有效的EC50s估算。总体上，剂量是0.01μg-100g/kg体重，和可每天、每周、每月或每年一次或多次，或甚至每2-20年一次给予。根据在体液或组织中测量的保留时间和药物浓度，本领域普通技术人员可容易估算给药重复率。成功治疗后，可能需要使患者进行维持疗法以防止疾病状态复发，其中寡聚体以维持剂量给予，范围为对于口服给予，1-1000mg寡聚体/70kg体重或对于i.v.给予，0.5mg-1000mg寡聚体/70kg体重，每日一次或多次至每20年一次。
尽管本公开内容已根据其某些实施方案进行了特定描述，但以下实施例仅用于说明本公开内容和不意图对其限制。本申请中引用的每个参考文献、专利、专利申请、GenBank登记号等通过引用以其整体并入本文。
VI.实施例
以下实施例可用于说明性目的和不应视为缩窄本发明的范围。
本公开内容的修饰的反义寡聚体(在图1A-1G中示出)经设计以结合肌养蛋白或肌生成抑制蛋白前-mRNA转录物内的靶标区，和使用以下方案制备：
用于制备活性亚单位的程序A：
在0℃向6(1eq)/二氯甲烷的搅拌溶液中加入POCl3(1.1eq)，接着加入二异丙基乙基胺(3eq)，通过冰浴冷却。15分钟后，除去冰浴和使溶液升温至室温，持续1小时。反应完成后，反应溶液用二氯甲烷稀释，用10％水性柠檬酸洗涤三次。经MgSO4干燥后，有机层通过硅胶塞，和真空浓缩。得到的磷酰胺基二氯化物(4)直接用于下一步骤，无需进一步纯化。
向磷酰胺基二氯化物(4)(1eq)、2,6-二甲基吡啶(1eq)/二氯甲烷的溶液中加入Mo(Tr)T(7)(0.5eq)/二氯甲烷溶液，接着加入N-甲基咪唑(0.2eq)。将反应在室温下搅拌过夜。反应完成后，反应溶液用二氯甲烷稀释，和用10％水性柠檬酸洗涤三次。经MgSO4干燥后，有机层过滤，然后浓缩。产物(8)通过硅胶色谱纯化(用乙酸乙酯/己烷的梯度洗脱)，然后在-20℃贮存。结构通过LCMS分析证实。
用于制备活化亚单位的程序B:
在0℃向POCl3(l.leq)/二氯甲烷的溶液中加入2,6-二甲基吡啶(2eq)，接着滴加Mo(Tr)T(7)(leq)/二氯甲烷溶液。1小时后，反应溶液用二氯甲烷稀释，和用10％水性柠檬酸快速洗涤三次。在经MgSO4干燥和蒸发溶剂后，获得需要的二氯磷酸酯(9)。
在0℃向二氯磷酸酯(leq)/二氯甲烷的溶液中逐滴加入胺(leq)/二氯甲烷溶液。15分钟后，使反应混合物升温至室温，持续约1小时。反应完成后，通过添加己烷进行沉淀，接着过滤，收集产物(8)，作为白色固体。真空下干燥后将产物贮存在-20℃。结构通过LCMS分析证实。
实施例1:((2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-l(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲基二氯磷酸酯
向磷酰氯(2.12mL、22.7mmol)的冷却的(冰/水浴)DCM溶液(20mL)中滴加2,6-二甲基吡啶(4.82mL、41.4mmol)，然后经15min滴加Mo(Tr)T(2)(10.0g、20.7mmol)的DCM溶液(20mL)(内部温度0-10℃)，然后除去浴，在环境温度下继续搅拌20min。反应用柠檬酸溶液洗涤(40mL x 3、10％w/v aq)，干燥(MgSO4)，过滤和浓缩至白色泡沫(9.79g)，其然后直接用于后面的程序。
实施例2:(6-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲基(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)氯膦酸酯
向来自实施例1的二氯磷酸酯(5.00g、5.00mmol)的冷却的(冰/水浴)DCM溶液(5mL)中逐滴加入哌啶(0.61g、4.76mmol)的DCM溶液(5mL)，然后除去浴和在环境温度下继续搅拌30min。反应物直接加载到柱上。[SiO2柱(40g)、DCM/EtOH洗脱液(梯度1:0至1:1)]的色谱提供标题化合物(2.5g)，为白色泡沫。对于l(4硝基苯基)哌嗪衍生物C46H55N8O7P计算的ESI/MS为862.4，实测m/z＝863.6(M+l)。
实施例3:1-(1-(氯((6-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲氧基)磷酰基)哌啶-4-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物
标题化合物以类似于实施例2所述的方式合成，提供标题化合物(0.6g)，为白色固体。对于l-(4-硝基苯基)哌嗪衍生物C49H60N8O7P计算的ESI/MS是903.4，实测m/z＝903.7(M+)。
实施例4:((2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲基(4-甲基哌嗪-1-基)氯膦酸酯
向磷酰氯(1.02mL、11.0mmol)的冷却的(冰/水浴)DCM溶液(10mL)中逐滴加入2,6-二甲基吡啶(3.49mL、29.9mmol)，然后逐滴加入甲基哌嗪(1.00g、10.0mmol)的DCM溶液(10mL)和继续搅拌1h。加入Mo(Tr)T(2)(4.82、10.0mmol)和NMI(79μL、1.0mmol)的DCM溶液(10mL)和搅拌4h，然后直接加载到柱上。
[SiO2柱(80g)、含2％TEA的DCM/丙酮洗脱液(梯度1:0至0:1)]的色谱提供标题化合物(0.8g)，为白色泡沫。对于l-(4-硝基苯基)哌嗪衍生物C43H48N7O8P计算的ESI/MS是834.4，实测m/z＝835.5(M+l)。
实施例5:((2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲基(4-乙基哌嗪-1-基)氯膦酸酯
标题化合物以类似于实施例4所述的方式合成，提供标题化合物(11.5g)，为白色泡沫。对于l-(4-硝基苯基)哌嗪衍生物C45H53N8O7P计算的ESI/MS是848.4，实测m/z＝849.7(M+l)。
实施例6:((2S,6R)-6-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲基(4-乙基哌嗪-1-基)氯膦酸酯
标题化合物以类似于实施例4所述的方式合成，提供标题化合物(4.5g)，为白色泡沫。对于l-(4-硝基苯基)哌嗪衍生物C52H56N11O6P计算的ESI/MS是961.4，实测m/z＝962.8(M+l)。
实施例7:((2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲基(4-异丙基哌嗪-1-基)氯膦酸酯
标题化合物以类似于实施例4所述的方式合成，提供标题化合物(3.5g)，为白色泡沫。对于l-(4-硝基苯基)哌嗪衍生物C46H55N8O7P计算的ESI/MS是862.4，实测m/z＝863.7(M+l)。
实施例8:((2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲基甲基(2-(2,2,2-三氟乙酰胺基)乙基)酰胺基氯磷酸酯
标题化合物以类似于实施例4所述的方式合成，提供标题化合物(1.0g)，为白色泡沫。对于l-(4-硝基苯基)哌嗪衍生物C44H48F3N8O8P计算的ESI/MS是904.3，实测m/z＝903.7(M-l)。
实施例9:((2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲基甲基(2-(2,2,2-三氟-N-甲基乙酰胺基)乙基)酰胺基氯磷酸酯
标题化合物以类似于实施例4所述的方式合成，提供标题化合物(1.8g)，为白色泡沫。对于l-(4-硝基苯基)哌嗪衍生物C45H50F3N8O8P计算的ESI/MS是918.3，实测m/z＝1836.6(2M+)。
实施例10:((2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲基(4-(2,2,2-三氟乙酰胺基)哌啶-1-基)氯膦酸酯
向磷酰氯(17.7mL、190mmol)/DCM(190mL)的冷却溶液(冰/水浴)中逐滴加入2,6-二甲基吡啶(101mL、864mmol)，然后经15min分批加入Mo(Tr)T(2)(83.5g、173mmol)(内部温度0-10℃)和搅拌。30min后，经15min逐滴加入4-氨基哌啶单三氟乙酰胺(48.9g、～190mmol)(内部温度0-8℃)和搅拌。lh后，逐滴加入DIPEA(50mL)(内部温度0-10℃)和搅拌lh。反应物用柠檬酸溶液洗涤(500mL x 3、10％w/v aq)、干燥(MgSO4)、过滤和浓缩成粘性油，其直接加载到柱上。[SiO2柱(330g)、己烷/EtOAc洗脱液(梯度1:0至0:1)]的色谱提供标题化合物(91.3g、70％收率)，为白色泡沫。对于l-(4-硝基苯基)哌嗪衍生物C43H48N7O8P计算的ESI/MS是930.9，实测m/z＝954.4(M+Na)。
实施例11-14通过上文描述的程序A制备。
实施例11:(6-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲基(4-(1-(2,2,2-三氟乙酰基)哌啶-4-基)哌嗪-l-基)氯膦酸酯
实施例12:(6-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲基(4-吗啉代哌啶-1-基)氯膦酸酯
实施例13:(6-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲基双(3-(2,2,2-三氟乙酰胺基)丙基)酰胺基氯磷酸酯
实施例14:(6-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲基[1,4'-联哌啶]-1'-基氯膦酸酯
下文的实施例15-20通过上述程序B制备。
实施例15:(6-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲基(4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)氯膦酸酯
实施例16:(6-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲基(4-(2-(二甲基氨基)乙基)哌嗪-1-基)氯膦酸酯
实施例17:(6-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲基(4-苯基哌嗪-1-基)氯膦酸酯
实施例18:(6-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲基(4-(2,2,2-三氟-N-甲基乙酰胺基)哌啶-1-基)氯膦酸酯
实施例19:(6-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲基甲基(3-(2,2,2-三氟-N-甲基乙酰胺基)丙基)酰胺基氯磷酸酯
实施例20:((2S,6R)-6-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲基(4-(2,2,2-三氟乙酰胺基)哌啶-1-基)氯膦酸酯
实施例21:(4-(吡咯烷-1-基)哌啶-1-基)膦酸二氯化物盐酸盐
向磷酰氯(5.70mL、55.6mmol)/DCM(30mL)的冷却的(冰/水浴)溶液中加入2,6-二甲基吡啶(19.4mL、167mmol)和4-(l-吡咯烷基)-哌啶(8.58g、55.6mmol)的DCM溶液(30mL)和搅拌l小时。将悬浮液过滤，和用过量的乙醚洗涤固体，提供标题的吡咯烷(17.7g、91％收率)，为白色固体。对于l-(4-硝基苯基)哌嗪衍生物C19H30N5O4P计算的ESI/MS是423.2，实测m/z＝422.2(M-l)。
实施例22:((2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲基(4-(吡咯烷-1-基)哌啶-1-基)氯膦酸酯盐酸盐
向来自实施例21的二氯氨基磷酸酯(17.7g、50.6mmol)/DCM(100mL)的搅拌的冷却(冰/水浴)溶液经10分钟逐滴加入Mo(Tr)T(2)(24.5g、50.6mmol)、2,6-二甲基吡啶(17.7mL、152mmol)和1-甲基咪唑(0.401mL、5.06mmol)的DCM溶液(100mL)。随悬浮液被搅拌，使浴升温至环境温度。6小时后，将悬浮液倾入乙醚(1L)，搅拌15分钟，过滤和用另外的乙醚洗涤固体，提供白色固体(45.4g)。粗产物通过色谱纯化[SiO2柱(120克)、DCM/MeOH洗脱液(梯度1:0至6:4)]，和将合并的级分倾入乙醚(2.5L)，搅拌15min，过滤和用另外的乙醚洗涤得到的固体，提供标题化合物(23.1g、60％收率)，为白色固体。对于l-(4-硝基苯基)哌嗪衍生物C48H57N8O7P计算的ESI/MS是888.4，实测m/z＝887.6(M-1)。
实施例23
修饰的反义寡聚体和示例性的修饰的反义寡聚体的设计和制备
三苯甲基哌嗪苯基氨基甲酸酯35的制备(图2A)：向化合物11/二氯甲烷(6mL/g11)的冷却的悬浮液中加入碳酸钾(3.2eq)/水(4mL/g碳酸钾)溶液。向这种两相混合物中缓慢加入氯甲酸苯酯(1.03eq)/二氯甲烷(2g/g氯甲酸苯酯)溶液。使反应混合物升温至20℃。反应完成后(1-2hr)，分离各层。有机层用水洗涤，和经无水碳酸钾干燥。产物35通过从乙腈结晶分离。
氨基甲酸酯醇36的制备：将氢化钠(1.2eq)悬浮于1-甲基-2-吡咯烷酮(32mL/g氢化钠)。向该悬浮液中加入三乙二醇(10.0eq)和化合物35(1.0eq)。将得到的浆液加热至95℃。反应完成后(1-2hr)，将混合物冷却至20℃。向该混合物中加入30％二氯甲烷/甲基叔丁基醚(v:v)和水。含有产物的有机层用水性NaOH、水性琥珀酸和饱和水性氯化钠连续洗涤。产物36通过从二氯甲烷/甲基叔丁基醚/庚烷结晶分离。
制备尾酸(Tail acid)37：向化合物36/四氢呋喃(7mL/g 36)溶液中加入琥珀酸酐(2.0eq)和DMAP(0.5eq)。将混合物加热至50℃。反应完成后(5hr)，将混合物冷却至20℃和用水性NaHCO3调节至pH 8.5。加入甲基叔丁基醚，和将产物提取至水层。加入二氯甲烷，和用水性柠檬酸将混合物调节至pH 3。含有产物的有机层用pH＝3柠檬酸盐缓冲液和饱和水性氯化钠的混合物洗涤。37的该二氯甲烷溶液无需分离用于制备化合物38。
38的制备：向化合物37的溶液加入N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酸亚胺(HONB)(1.02eq)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(0.34eq)，然后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(1.1eq)。将混合物加热至55℃。反应完成后(4-5hr)，将混合物冷却至20℃和用1:1 0.2M柠檬酸/盐水和盐水连续洗涤。二氯甲烷溶液经过溶剂交换为丙酮，然后交换为N,N-二甲基甲酰胺，和产物通过从丙酮/N,N-二甲基甲酰胺沉淀至饱和水性氯化钠分离。粗产物在水中再浆化数次，以除去残留的N,N-二甲基甲酰胺和盐。
引入活化“尾”到载锚树脂在二甲基咪唑烷酮(DMI)中通过用于在固相合成期间引入亚单位的程序进行。
用于合成基于吗啉的寡聚体的固体支持物的制备：该程序在具有粗糙多孔(40-60μm)玻璃料、顶置式搅拌器和允许N2鼓泡通过玻璃料或真空提取的3向Teflon管塞的硅烷化的加套肽容器(ChemGlass，NJ，USA)中进行。
在以下程序中树脂处理/洗涤步骤由两个基本操作组成：树脂液化或搅拌床反应器和溶剂/溶液提取。对于树脂液化，管塞经定位以允许N2流过玻璃料，和加入规定的树脂处理/洗涤液至反应器，和允许渗透和完全浸湿树脂。然后开始混合和将树脂浆液混合规定的时间。对于溶剂/溶液提取，停止混合和N2流，启动真空泵，然后管塞经定位以允许抽空树脂处理/洗涤液至废物。所有树脂处理/洗涤液体积是15mL/g树脂，除非另外注明。
向在硅烷化的加套肽容器中的氨基甲基聚苯乙烯树脂(100-200目；～1.0mmol/g载量，基于氮取代；75g、1eq，Polymer Labs，UK，part#1464-X799)加入1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP；20ml/g树脂)和允许树脂膨胀，同时混合1-2hr。抽空膨胀溶剂后，树脂用二氯甲烷(2x1-2min)、5％二异丙基乙基胺/25％异丙醇/二氯甲烷(2x 3-4min)和二氯甲烷(2x 1-2min)洗涤。在抽空最后的洗涤液后，树脂用二硫化物锚34/1-甲基-2-吡咯烷酮(0.17M；15mL/g树脂、～2.5eq)的溶液处理和树脂/试剂混合物在45℃加热60hr。在反应完成后，停止加热，和抽空锚溶液和树脂用1-甲基-2-吡咯烷酮(4x 3-4min)和二氯甲烷(6x 1-2min)洗涤。树脂用10％(v/v)二乙基二碳酸酯/二氯甲烷(16mL/g；2x 5-6min)溶液处理，然后用二氯甲烷(6x 1-2min)洗涤。树脂39(图2B)在N2气流下干燥1-3hr，然后在真空下干燥至恒重(±2％)。收率：初始树脂重量的110-150％。
氨基甲基聚苯乙烯-二硫化物树脂的载量测定：对于三苯基甲基(三苯甲基)的数量/克树脂，树脂载量(潜在可用的反应活性部位的数量)通过分光光度测定法测定。
将已知重量的干燥树脂(25±3mg)转移至硅烷化25ml容量瓶中，和加入～5mL的2％(v/v)三氟乙酸/二氯甲烷。通过轻轻涡旋将内容物混合，然后静置30min。用另外的2％(v/v)三氟乙酸/二氯甲烷使体积达到25mL和将内容物充分混合。使用正置换管(positivedisplacement pipette)，将含有三苯甲基的溶液的等分试样(500μL)转移至10mL容量瓶和用甲磺酸使体积达到10mL。
最终溶液中的三苯甲基阳离子含量通过431.7nm的UV吸光度测量和使用适合的体积、稀释度、消光系数(ε:41μmol-1cm-1)和树脂重量以三苯甲基/克树脂(μmol/g)计算树脂载量。一式三份进行测定和计算平均载量。
在本实施例中树脂加载程序将提供载量为大约500μmol/g的树脂。如果二硫化物锚掺入步骤在室温下进行24hr，获得300-400μmol/g的载量。
尾加载：使用与制备氨基甲基聚苯乙烯-二硫化物树脂相同的设置和体积，尾可引入固体支持物。载锚树脂首先在酸性条件下去保护和在偶联前将得到的材料中和。对于偶联步骤，使用38(0.2M)/含有4-乙基吗啉(NEM、0.4M)的DMI的溶液，代替二硫化物锚溶液。在45℃下2hr后，树脂39用5％二异丙基乙基胺/25％异丙醇/二氯甲烷洗涤两次，和用DCM洗涤一次。向树脂中加入苯甲酸酐(0.4M)和NEM(0.4M)的溶液。25min后，反应器夹套冷却至室温，和树脂用5％二异丙基乙基胺/25％异丙醇/二氯甲烷洗涤两次，和用DCM洗涤8次。将树脂40过滤，和在高真空下干燥。树脂40的载量定义为用于尾加载的初始氨基甲基聚苯乙烯-二硫化物树脂39的载量。
固相合成：基于吗啉的寡聚体在Gilson AMS-422自动肽合成仪上在2mL Gilson聚丙烯反应柱(Part#3980270)中制备。在柱放在合成仪上时，用于水流的带槽铝块置于柱周围。或者，AMS-422将添加试剂/洗涤溶液，保持指定的时间，和使用真空抽空柱。
对于范围至多约25个亚单位长的寡聚体，优选载量接近500μmol/g树脂的氨基甲基聚苯乙烯-二硫化物树脂。对于更大的寡聚体，优选载量300-400μmol/g树脂的氨基甲基聚苯乙烯-二硫化物树脂。如果具有5’-尾的分子是期需的，以相同的载量指导选择用尾加载的树脂。
制备以下试剂溶液：
脱三苯甲基化溶液：10％氰基乙酸(w/v)/4:1二氯甲烷/乙腈；中和溶液：5％二异丙基乙基胺/3:1二氯甲烷/异丙醇；偶联溶液：0.18M(或0.24M，对于生长超过20个亚单位的寡聚体)所需碱基和连键类型的活化的吗啉亚单位和0.4M N乙基吗啉/1,3-二甲基咪唑烷酮。二氯甲烷(DCM)用作过渡洗涤液，分隔不同的试剂溶液洗涤。
在模块设定至42℃的合成仪上，向含有30mg的氨基甲基聚苯乙烯-二硫化物树脂(或尾树脂)的各柱加入2mL的1-甲基-2-吡咯烷酮和允许在室温下静置30min。用2mL二氯甲烷洗涤2次后，使用以下合成循环：
表6.修饰的反义寡聚体的合成循环
各个寡聚体的序列被程序化至合成仪，使得各柱以合适的顺序接收合适的偶联溶液(A,C,G,T,I)。当柱中的寡聚体完成其最终亚单位的掺入时，柱从模块取下，和用包含4-甲氧基三苯基甲基氯(0.32M/DMI)(含有0.89M 4-乙基吗啉)的偶联溶液手动进行最后一个循环。
从树脂裂解和除去碱基和保护基：在甲氧基三苯甲基化后，树脂用2mL 1-甲基-2-吡咯烷酮洗涤8次。加入包含0.1M 1,4-二硫苏糖醇(DTT)和0.73M三乙基胺/1-甲基-2-吡咯烷酮的1mL的裂解溶液，将柱加帽，和允许在室温下静置30min。之后，将溶液排出至12mLWheaton小瓶中。将极大收缩的树脂用300μL的裂解溶液洗涤两次。向溶液加入4.0mL浓氨水(在-20℃贮存)，将小管紧密盖封(用Teflon衬里的螺旋帽)和混合物涡旋以混合溶液。将小管置于45℃炉中16-24hr以进行碱基和保护基的裂解。
粗产物纯化：小管中的氨解溶液从炉中取出，和允许冷却至室温。溶液用20mL的0.28％氨水稀释，和通过含有Macroprep HQ树脂(BioRad)的2.5x10cm柱。盐梯度(A:0.28％氨与B:1M氯化钠/0.28％氨；0-100％B/60min)用于洗脱含有甲氧基三苯甲基的峰。汇集合并的级分和根据需要的产物进一步处理。
基于吗啉的寡聚体的脱甲氧基三苯甲基化：从Macroprep纯化合并的级分用1MH3PO4处理以降低pH至2.5。初始混合后，样品在室温下放置4min，此时用2.8％氨/水将它们中和至pH 10-11。产物通过固相提取(SPE)纯化。
SPE柱填装和调节：Amberchrome CG-300M(Rohm and Haas；Philadelphia，PA)(3mL)填装至20mL玻璃料柱(BioRad Econo-Pac色谱柱(732-1011))和树脂用3mL的以下溶液漂洗：0.28％NH4OH/80％乙腈；0.5M NaOH/20％乙醇；水；50mM H3PO4/80％乙腈；水；0.5NaOH/20％乙醇；水；0.28％NH4OH。
SPE纯化：来自脱甲氧基三苯甲基化的溶液加载到柱上，和树脂用3-6mL 0.28％氨水漂洗三次。Wheaton小瓶(12mL)置于柱下和产物通过用2mL的45％乙腈/0.28％氨水洗涤两次洗脱。
产物分离：将溶液在干冰上冷冻，并将小瓶置于冷冻干燥器中以产生绒毛状白色粉末。将样品溶于水，使用注射器通过0.22微米滤器(Pall Life Sciences，Acrodisc 25mm注射器滤器，具有0.2微米HT Tuffryn膜)过滤和光密度(OD)在UV分光光度计上测量，以确定存在的寡聚体的OD单位，以及分配样品用于分析。然后将溶液放回Wheaton小瓶用于冻干。
通过MALDI分析基于吗啉的寡聚体：MALDI-TOF质谱法用于测定纯化级分的组成以及提供寡聚体的身份(分子量)的证据。在用3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(芥子酸)、3,4,5-三羟基苯乙酮(THAP)或α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)的溶液作为基质稀释后运行样品。
实施例24：PMO肌生成抑制蛋白序列的体内筛选
筛选经设计以跳跃肌生成抑制蛋白外显子2的PMO序列。在人横纹肌肉瘤(RD)和鼠成纤维细胞(正常-C2C12和营养不良-H2Kbmdx)两种细胞中体外测试PMO序列的功效。四种靶向肌生成抑制蛋白外显子2的5’端的人特异性PMO随后在RD细胞中筛选。
PMO通过Nucleofection(Neon转染系统，Life technologies，Carlsbad，CA)，按照制造商的标准方案转染。PMO的跳跃效率通过半定量RT-PCR，根据RT-PCR产物的凝胶电泳结果的密度测定分析，作为跳跃产物的密度针对跳跃和未跳跃产物的总密度的百分比评价。序列列于表7。
序列PMO 39、SEQ ID NO:48、PMO 42、SEQ ID NO:16、PMO 43、SEQ ID NO:49、PMO44、SEQ ID NO:17、PMO 45、SEQ ID NO:18和PMO 124经设计以结合鼠和人肌生成抑制蛋白外显子2二者。PMO一式三份以4个剂量(0.25、0.5、1、2μM)测试。肌生成抑制蛋白外显子2跳跃效率通过RT-PCR(图3A)和上述RT-PCR产物的密度测定分析评价，作为跳跃产物的强度针对跳跃和未跳跃产物的总强度的百分比。通过单向ANOVA对各个剂量进行统计学分析，比较PMO与PMO 28(通过GeneTools合成，其作为有效跳跃肌生成抑制蛋白外显子2的PMO得到证实)的效率(图3B)。
分析四种人特异性PMO(PMO 40、PMO 46、SEQ ID NO:21、PMO 47、SEQ ID NO:20、PMO 48、SEQ ID NO:19)，它们全部经设计以结合人肌生成抑制蛋白外显子2的5’端。PMO一式三份以1μM剂量测试，和与相同浓度的靶向3’端的PMO比较。因为这些PMO预期诱导外显子2跳跃，它们的功效通过建立的RT-PCR方案，根据上述的密度测定分析评价。RT-PCT产物的结果显示在图4A中和密度测定分析显示在图4B中。
在靶向肌生成抑制蛋白外显子2的3’端的PMO中，PMO 44、SEQ ID NO:17和45、SEQID NO:18(并且在较高浓度下，PMO 39、SEQ ID NO:48)诱导比其它更一致的跳跃，特别是在较低浓度下(图4B)。当使用靶向肌生成抑制蛋白外显子2的5’端的PMO时，跳跃功效甚至更高，其中PMO 46、SEQ ID NO:21诱导几乎100％跳跃和PMO 40和48、SEQ ID NO:19诱导约80％跳跃(图4B)。
筛选对于小鼠肌生成抑制蛋白的跳跃外显子2的PMO：在C2C12和H2Kbmdx细胞中对于PMO 39、42、43、44、45、124的剂量反应研究
在mdx小鼠模型中特异性和可再现的外显子跳跃的第一个实例由Wilton等报告(Wilton，Lloyd等1999；其内容通过引用以其整体并入本文)。通过指导反义分子至供体剪接位点，在处理培养的细胞的6小时内在肌养蛋白mRNA中诱导一致和有效的外显子23跳跃。Wilton等还描述了用更长的反义寡核苷酸靶向小鼠肌养蛋白前-mRNA的受体区。尽管指向内含子23供体剪接位点的第一反义寡核苷酸在原代培养的成肌细胞中诱导一致的外显子跳跃，但发现该化合物在表达更高水平的肌养蛋白的永生细胞培养中效率低得多。然而，通过精修靶向和反义寡核苷酸设计，特异性外显子去除的效率增加几乎大约一个数量级(Mann，Honeyman等2002；其内容通过引用以其整体并入本文)。
PMO一式四份以0.25、0.5、1、2、5μM的剂量在小鼠成肌细胞C2C12细胞中进行初始测试(图5A和图5C)。用PMO序列和0.5和2μM剂量，在重复中观察到变化的跳跃。或者，在H2Kbmdx细胞(成肌细胞营养不良细胞模型)中进行筛选，证实了更一致和可靠的结果(图5A和图5B)。
在测试的H2Kbmdx细胞培养中，在高浓度下PMO 28是最佳PMO，和在低浓度下是最有效的PMO之一(与PMOs 45、SEQ ID NO:18和39、SEQ ID NO:48相当)(图5B)。
未缀合的PMO-MSTN序列在mdx小鼠中的初步体内筛选
根据体外结果，选择PMO 39、SEQ ID NO:48、44、SEQ ID NO:17和45、SEQ ID NO:18用于本研究。PMO 124用作对照。最佳剂量为3nmole(等于18x 1014个分子)的PMO 124注入8周龄mdx小鼠的各胫骨前肌(TA)肌肉。其它PMO的量归一化至注射的相同数量的PMO 124分子。2只小鼠的2个TA肌肉用各PMO(n＝4/组)以终体积25μl(稀释于盐水)注射。肌肉在注射后2周收获。结果示于图6A、图6B和图6C。
PMO剂量的计算：
a)PMO 39、SEQ ID NO:48(18mer)＝18.5μg(2小鼠、4TA)
b)PMO 44、SEQ ID NO:17(25mer)＝25.4μg(2小鼠、4TA)
c)PMO 45、SEQ ID NO:18(25mer)＝25.5μg(2小鼠、4TA)
d)PMO 124(28mer)＝28.8μg(2小鼠、4TA)
这些量(μg)对应于18x 1014个分子/各PMO。
测试的所有PMO在体内具有生物活性。跳跃效率分别在PMO 124和45、SEQ ID NO:18处理的肌肉中最高和最低(图6C)。然而，这样的效率与肌肉重量的增加无关。用PMO 45、SEQ ID NO:18处理的肌肉重于未处理的或用PMO 124或44、SEQ ID NO:17处理的肌肉，尽管差异不显著(图6B)。
在mdx小鼠中全身性注射PMO
还检查了PMO 39、SEQ ID NO:48、44、SEQ ID NO:17、45、SEQ ID NO:18和124的全身性跳跃效率。通过尾静脉静脉内注射在8周龄mdx小鼠中进行筛选。PMO 124用作对照和剂量为200mg/kg(等于12.53x 1018个分子或20.8μmole)，在200μl盐水中稀释。其它PMO的量归一化至注射的PMO 124分子的数量。使用三只小鼠/组。肌肉在注射后2周收获，包括横隔膜-DIA、趾长伸肌-EDL、腓肠肌-GAS、比目鱼肌-SOL和胫骨前肌-TA。结果示于图7A、图7B、图7C和图7D。
PMO剂量的计算：
a)PMO 124(28mer)＝200mg/kg(3小鼠)
b)PMO 45、SEQ ID NO:18(25mer)＝176.2μg(3小鼠)
c)PMO 44、SEQ ID NO:17(25mer)＝176.8μg(3小鼠)
d)PMO 39、SEQ ID NO:48(28mer)＝128.6μg(3小鼠)
这些量(μg)对应于12.53x 1018个分子(20.8μmole)/各PMO。
在从单只小鼠收集的肌肉中，和在来自不同的小鼠的相同类型的肌肉中，跳跃结果是变化的(图7A和图7B)。然而，在单次IV注射后所有PMO在营养不良肌肉中具有生物活性。在用PMO 45、SEQ ID NO:18或124注射后，与盐水注射小鼠的类型匹配的肌肉相比，GAS和TA显示重量增加的趋势(归一化至最终体重；图7D)。
B肽缀合的PMO在C57小鼠中的体内筛选
选自之前体外和体内筛选的PMO D30(SEQ ID NO:16)、PMO39(SEQ ID NO:48)和PMO45(SEQ ID NO:18)在PMO的3’端缀合至B肽(RAhxRRBRRAhxRRBRAhxB；SEQ ID No:3499和肽羧基端的AhxB接头部分)和通过全身性尾静脉注射递送，每周一次，持续14周。B肽缀合的PMO，下文亦称为BPMO，在12周龄C57小鼠中进行，10只小鼠/组。以10或20mg/kg测试两个剂量。最后一次注射后，前肢力量通过抓握力量试验测量(图9A和图9B)。用10mg/kg BPMO处理的小鼠的TA肌肉的最大力量通过原位电生理学测量(图9C)。收获心脏、DIA和4种骨骼肌肉(EDL、GAS、SOL、TA)用于评价肌肉质量和肌生成抑制蛋白外显子跳跃。
在最后4-6周期间在20mg/kg的BPMO-39和BPMO-D30处理组中的一些小鼠不接受IV注射，因为尾静脉几乎不可见。这些小鼠改为通过IP注射。在BPMO-39、20mg/kg处理组中，两只小鼠在研究期间死亡。
结果：
1)身体和肌肉质量的增加：与盐水和混杂BPMO注射的动物的重量相比，在BPMO-39处理组(10或20mg/kg)中的小鼠体重显著增加(图8A和图8C)。当以20mg/kg使用时，BPMO-D30诱导非常高效的体重增加(图8C)。观察到肌肉质量的可变性(归一化至初始体重)，取决于给予的剂量和考虑的肌肉(图8B和图8D)。在TA(10或20mg/kg处理；图8B和图8D)和GAS(10mg/kg处理；图8B)中BPMO-39显示最一致的肌肉增加，而在TA(10mg/kg处理；图8B)或GAS(20mg/kg处理；图8D)中BPMO-D30或-45诱导质量增加。在20mg/kg处理的小鼠的DIA中，所有测试的BPMO诱导显著肌肉重量增加(图8D)。用于最后几次注射的IP递送途径可对此结果具有影响。
2)抓握力量分析：在用两个BPMO剂量处理的小鼠中进行前肢力量的测量(图9A和图9B)。BPMO-39是唯一的候选物，显示与盐水组相比提高的肌肉力量，和仅在10mg/kg处理时(图9A)。在10和20mg/kg两个剂量时，混杂BPMO出人意料地和不可解释地增加处理小鼠的前肢力量，显著不同于盐水处理小鼠(图9A和图9B)。
3)原位肌肉生理试验：用10mg/kg BPMO处理的小鼠的TA使用电生理学评价进行分析。与混杂PMO和其它测试的BPMO相比，BPMO-D30显著增加产生的最大和比力量(图9C)。
4)外显子跳跃量化：分析DIA(图10A和图10B)和TA(图10C和图10D)肌肉的肌生成抑制蛋白跳跃效率。在20mg/kg处理肌肉中的跳跃水平是10mg/kg处理肌肉的水平的3-4倍(图10B和图10D)。在使用20mg/kg剂量(DIA、图10B和TA、图10D)或10mg/kg剂量(TA、图10D)时BPMO-D30和-45比BPMO-39显著更有效。
体内筛选的暂定结果：考虑对肌肉重量、力量和外显子跳跃效率的总体影响，BPMO-D30和BPMO-45是最有效的分子。将进行组织学分析(作为关于肌纤维的横切片分析的可能数据)。
实施例25：BPMO诱导的双重外显子跳跃：肌生成抑制蛋白和肌养蛋白组合治疗
在幼小营养不良小鼠中肌养蛋白阅读框+肌生成抑制蛋白敲减的拯救。
PMO M23D(SEQ ID NO.937)在PMO的3’端缀合至B肽(RAhxRRBRRAhxRRBRAhxB；SEQID No:3499和在肽羧基端的AhxB接头部分)和称为BPMO-M23D。BPMO-M23D(10mg/kg)和/或BPMO-MSTN(D30、10mg/kg)稀释于200μl盐水和通过6周龄mdx小鼠或C57BL10小鼠的尾静脉注射。注射重复每周一次，持续10周。10只小鼠用于各治疗。5组小鼠的细节如下：
a)C57BL10小鼠+盐水(阳性对照)
b)Mdx小鼠+盐水(阴性对照)
c)Mdx小鼠+BPMO-M23D、SEQ ID NO:937(10mg/kg)
d)Mdx小鼠+BPMO-M23D、SEQ ID NO:937(10mg/kg)&BPMO-MSTN、SEQ ID NO:16(10mg/kg)
e)Mdx小鼠+BPMO-MSTN、SEQ ID NO:16(10mg/kg)
结果：
治疗12周后，在治疗的mdx小鼠中与盐水注射动物相比未观察到体重显著增加(图11A)。测量前肢力量的抓握力量分析显示，与mdx小鼠相比，注射BPMO-M23D诱导力量显著增加，而BPMO-M23D和BPMO-MSTN的共注射使力量归一化至C57小鼠(图11B)。与盐水注射的mdx小鼠相比，BPMO-MSTN治疗单独不改变治疗小鼠的肌肉力量(图11B)。上述的抓握力量试验进一步如下进行。试验在连续3天内进行(在活性笼评价之后)。在各试验中，记录5次读数/小鼠的值。每个是在30sec内测量的前肢力量的最高值，在两次读数之间具有30sec间隔。数据显示为15次/小鼠的总计(图18A)或5次读数/小鼠/试验的3x平均值(图18B)或5次读数/小鼠/试验的3x最高值(图18C)。统计学分析通过单向ANOVA&Bonferroni事后检验进行(n＝10/组)；误差棒表示S.E.M。
BPMO-M23D治疗单独或与BPMO-MSTN组合诱导非常有效的肌养蛋白外显子跳跃，在分析的所有肌肉中实现70-80％的肌养蛋白重构成，除了在心脏中约25％跳跃之外(图12A)。用BPMO-M23D与BPMO-MSTN组合治疗导致比用单独BPMO-M23D治疗更大的DMD外显子跳跃效率。肌养蛋白的恢复随后通过蛋白印迹分析证实，在骨骼肌肉中的表达范围为C57小鼠的水平的30-100％(图12B)。肌养蛋白表达通过免疫组织化学再证实。肌生成抑制蛋白外显子2跳跃在已接受双重治疗的小鼠中也是有效的，其中在所有检查的肌肉中的平均跳跃为约55％(图12C)。
在收获的肌肉中进行进一步的组织学分析，以研究治疗对肌纤维肥大和再生的影响。除了中央具核纤维的频率之外还研究肌纤维的数量和直径。评价在EDL、GAS、SOL和TA肌肉中的治疗益处。来自TA纤维分析的结果作为代表进行报告(图13A和图13B)。用BPMO-MSTN单独治疗不改变营养不良表型，而BPMO-M23D和BPMO-M23D+BPMO-D30治疗部分地改善病理，肌纤维横切片区域的可变性减少(图13A)和与未治疗的mdx肌肉相比，中央具核纤维的存在减少(图13B)。该效果主要归因于肌养蛋白恢复，其减少mdx肌肉的假肥大和肌肉退化过程。
在老年mdx小鼠中肌养蛋白阅读框+肌生成抑制蛋白的敲减的拯救
在更准确地再现(与幼小mdx小鼠相比)在人中观察到的营养不良疾病的老年(>18月龄)mdx小鼠中，BPMO-MSTN和BPMO-M23D使用与上文报告的相同的剂量方案和给予途径注射。用10mg/kg的BPMO-M23D(n＝5)或BPMOM23D(10mg/kg)和BPMO-MSTN(10mg/kg)(n＝5)或20mg/kg的混杂BPMO(n＝4)，小鼠每周一次注射，持续10周。最后一次注射后1周，小鼠进行抓握力量分析以研究前肢力量。在随后一周，治疗小鼠的TA肌肉通过电生理学进行分析，然后收集肌肉。
结果：
从第7周观察到治疗小鼠的显著体重变化(与混杂组相比)(图14A)。在用混杂、BPMO-M23D和BPMO-M23D和BPMO-MSTN治疗的小鼠的DIA、EDL、GAS、SOL、TA和心脏肌肉中测试肌肉质量(图14B)。然而，对身体或肌肉重量的统计学分析未进行，因为混杂注射小鼠逐渐死亡和在研究结束时仅1只小鼠存活。用BPMO-M23D或用BPMO-M23D和BPMO-MSTN治疗的所有小鼠对于整个研究存活。抓握力量分析证实，用BPMO-M23D或用BPMO-M23D和BPMO-MSTN治疗的小鼠比用混杂BPMO治疗的小鼠更强壮(图14C)。在单一治疗和双重治疗之间TA肌肉的最大和比力量的进一步的比较显示对肌肉损伤的伸长肌收缩(偏心收缩)的对抗力显著改进，在组合治疗组中见到更好效果(图14D)。
随后进行RT-PCR以评价肌养蛋白的外显子23的跳跃效率，证实在所有肌肉中显著水平的肌养蛋白重构成(图15A)。添加BPMO-MSTN增加BPMO-M23D的跳跃效率，与在幼小mdx小鼠中观察的一致(图15B)。肌养蛋白外显子跳跃的结果与在分析的所有肌肉中的蛋白表达显著增加相关(图16A)。此外显示，与用M23D单独治疗相比，用BPMO-MSTN和BPMO-M23D的组合治疗增加肌养蛋白水平(图16B)。
通过RT-PCR评价在收获的所有肌肉中的肌生成抑制蛋白外显子2跳跃(图17A)。跳跃水平在5％和40％之间改变，取决于分析的肌肉类型。合并所有肌肉的结果获得的平均值是约20％(图17B)。
认为上述的公开内容包括至少一种明显的发明，具有独立的功用。尽管以示例性的方式已公开本发明，本文公开和例举的其具体的实施方案不应视为限制含义，因为许多变化是可能的。可在本发明的范围内进行各种实施方案、材料、组合物和方法的等同的变化、修饰和改变，具有基本上类似的结果。本发明的主题包括本文公开的各种要素、特征、功能和/或性质的所有新的和非显而易见的组合和子组合。
关于特定的实施方案，本文已描述了益处、其它优点和问题解决方案。然而，益处、优点和问题解决方案，以及可引起任何益处、优点或方案发生或变得更明显的任何要素或要素组合，不应视为本发明的任何或所有权利要求的关键、必需或基本特征或要素。在本发明的范围内的许多变化和修饰包括所有这样的修饰。下文权利要求的所有要素的相应结构、材料、行动和等同方案意图包括与明确要求保护的其它权利要求要素组合进行功能的任何结构、材料或行动。本发明的范围应由随附权利要求和它们的法定等同方案确定，而不是由上文给出的实施例确定。
表7.序列表
在实施方案中，在本文所述的任何修饰的反义寡聚体中任何尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)核苷酸可被X或n取代。在实施方案中，每个X或n独立地选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。

Claims (99)

1.治疗具有杜兴肌营养不良和相关病症的受试者的方法，所述受试者具有在肌养蛋白基因中的突变，其对通过能够在肌养蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感，所述方法包括：
给予所述受试者有效量的反义寡聚体，所述反义寡聚体包含17-40个亚单位，并进一步包含与包含人肌养蛋白前-mRNA的外显子的靶标区中的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列，其中所述反义寡聚体诱导外显子的跳跃；
其中，所述寡聚体包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i) 修饰的核苷间连键，(ii) 修饰的糖部分，或(iii) 前述的组合；和
其中，已给予所述受试者肌生成抑制蛋白治疗剂，其在受试者中抑制肌生成抑制蛋白活性和肌生成抑制蛋白表达的一者或二者，从而治疗至少一种杜兴肌营养不良或相关病症。
2.权利要求1的方法，其中所述外显子选自外显子7、外显子8、外显子9、外显子19、外显子23、外显子44、外显子45、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子55。
3.权利要求2的方法，其中所述外显子包含外显子23。
4.权利要求2的方法，其中所述外显子包含外显子45。
5.权利要求2的方法，其中所述外显子包含外显子51。
6.权利要求2的方法，其中所述外显子包含外显子53。
7.权利要求2的方法，其中所述外显子包含外显子8、外显子44、外显子50、外显子52或外显子55。
8.权利要求1的方法，其中所述反义寡聚体包含20-30个亚单位。
9.权利要求1的方法，其中所述反义寡聚体包含选自SEQ ID NOS: 76-SEQ ID NO:3485的序列。
10.权利要求9的方法，其中所述反义寡聚体是eteplirsen。
11.权利要求1的方法，其中所述靶向序列与靶标区的至少15个连续核苷酸互补。
12.权利要求11的方法，其中所述靶向序列与靶标区的至少17个连续核苷酸互补。
13.权利要求12的方法，其中所述靶向序列与靶标区100%互补。
14.权利要求1的方法，其中所述肌生成抑制蛋白治疗剂选自一种或多种蛋白或核酸。
15.权利要求14的方法，其中所述蛋白是抗-肌生成抑制蛋白抗体。
16.权利要求14的方法，其中所述蛋白是可溶性受体。
17.权利要求14的方法，其中所述可溶性受体是ACVR2。
18.权利要求14的方法，其中所述核酸是至少一种反义寡聚体或siRNA。
19.权利要求18的方法，其中所述反义寡聚体包含12-40个亚单位，和进一步包含与肌生成抑制蛋白前-mRNA的靶标区的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；和
其中，所述寡聚体包含至少一个亚单位，其是具有以下的核苷酸类似物：(i) 修饰的核苷间连键，(ii) 修饰的糖部分，或(iii) 前述的组合。
20.权利要求19的方法，其中反义寡聚体包含20-30个亚单位。
21.权利要求19的方法，其中所述靶向序列与靶标区的至少15个连续核苷酸互补。
22.权利要求19的方法，其中所述靶向序列与靶标区的至少17个连续核苷酸互补。
23.权利要求19的方法，其中所述靶向序列与靶标区100%互补。
24.权利要求19的方法，其中靶标区包含SEQ ID NO: 1。
25.权利要求19的方法，其中所述外显子包含外显子2。
26.权利要求19的方法，其中所述靶标区选自(i) 核苷酸序列，其中至少一个核苷酸跨越与内含子1/外显子2和外显子2/内含子2缔合的剪接点；或(ii) 核苷酸序列，其中无核苷酸跨越与内含子1/外显子2和外显子2/内含子2缔合的剪接点。
27.权利要求26的方法，其中剪接点选自包含剪接受体位点或剪接供体位点的序列。
28.权利要求27的方法，其中剪接受体位点在SEQ ID NO: 2内提供和剪接供体位点在SEQ ID NO: 3内提供。
29.权利要求26的方法，其中(i)的所述核苷酸选自SEQ ID NOS: 16-43。
30.权利要求26的方法，其中(ii)的所述核苷酸选自SEQ ID NOS: 44-70。
31.权利要求1的方法，其中所述受试者的年龄是7岁或更大。
32.治疗杜兴肌营养不良和相关病症的方法，所述方法包括：
给予受试者有效量的反义寡聚体，其具有12-40个亚单位和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；和
其中，所述寡聚体包含至少一个亚单位，其是具有以下的核苷酸类似物：(i) 修饰的核苷间连键，(ii) 修饰的糖部分，或(iii) 前述的组合；和
其中，已给予所述受试者肌养蛋白治疗剂，其在受试者的肌肉细胞中增加功能性肌养蛋白的蛋白表达，从而治疗至少一种杜兴肌营养不良或相关病症。
33.权利要求32的方法，其中受试者具有在肌养蛋白基因中的突变，其对通过能够在人肌生成抑制蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感。
34.权利要求32的方法，其中反义寡聚体包含20-30个亚单位。
35.权利要求32的方法，其中所述靶向序列与靶标区的至少15个连续核苷酸互补。
36.权利要求32的方法，其中所述靶向序列与靶标区的至少17个连续核苷酸互补。
37.权利要求32的方法，其中反义寡聚体与靶标区100%互补。
38.权利要求32的方法，其中靶标区包含SEQ ID NO: 1。
39.权利要求32的方法，其中所述外显子包含外显子2。
40.权利要求32的方法，其中所述靶标区选自(i) 核苷酸序列，其中至少一个核苷酸跨越与内含子1/外显子2和外显子2/内含子2缔合的剪接点；或(ii) 核苷酸序列，其中无核苷酸跨越与内含子1/外显子2和外显子2/内含子2缔合的剪接点。
41.权利要求40的方法，其中剪接点选自包含剪接受体位点或剪接供体位点的序列。
42.权利要求41的方法，其中剪接受体位点在SEQ ID NO: 2内提供和剪接供体位点在SEQ ID NO: 3内提供。
43.权利要求41的方法，其中(i)的所述核苷酸选自SEQ ID NOS: 16-43。
44.权利要求41的方法，其中(ii)的所述核苷酸选自SEQ ID NOS: 44-70。
45.权利要求32的方法，其中所述肌养蛋白治疗剂选自一种或多种蛋白或核酸。
46.权利要求45的方法，其中所述核酸是反义寡聚体。
47.权利要求46的方法，其中所述反义寡聚体包含20-50个亚单位，和进一步包含与包含人肌养蛋白前-mRNA的外显子的靶标区的10或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；和
其中，所述寡聚体包含至少一个亚单位，其是具有以下的核苷酸类似物：(i) 修饰的核苷间连键，(ii) 修饰的糖部分，或(iii) 前述的组合。
48.权利要求47的方法，其中所述外显子选自外显子7、外显子8、外显子9、外显子19、外显子23、外显子44、外显子45、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子55。
49.权利要求48的方法，其中所述外显子包含外显子23。
50.权利要求48的方法，其中所述外显子包含外显子45。
51.权利要求48的方法，其中所述外显子包含外显子51。
52.权利要求48的方法，其中所述外显子包含外显子53。
53.权利要求48的方法，其中所述外显子包含外显子8、外显子44、外显子50、外显子52或外显子55。
54.权利要求47的方法，其中反义寡聚体包含20-30个亚单位。
55.权利要求47的方法，其中所述反义寡聚体包含选自SEQ ID NOS: 76 - SEQ IDNOS: 3485的序列。
56.权利要求55的方法，其中所述反义寡聚体是eteplirsen。
57.权利要求46的方法，其中所述靶向序列与靶标区的至少15个连续核苷酸互补。
58.权利要求46的方法，其中所述靶向序列与靶标区的至少17个连续核苷酸互补。
59.权利要求46的方法，其中靶向序列与靶标区100%互补。
60.治疗受试者的杜兴肌营养不良和相关病症的方法，所述受试者具有在肌养蛋白基因中的突变，其对通过能够在肌养蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感，所述方法包括：
给予受试者包含式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
每个Nu是核碱基，其一起形成靶向序列；
Z是8-48的整数；
每个Y独立地选自O和–NR4，其中每个R4独立地选自H、C1-C6烷基、芳烷基、C(=NH)NH2、C(O)(CH2)nNR5C(=NH)NH2、C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR5C(=NH)NH2和G，其中R5选自H和C1C6烷基和n是1-5的整数；
T选自OH和下式的部分：
,
其中：
A选自–OH、-N(R7)2R8，其中：
每个R7独立地选自H和C1-C6烷基，和
R8选自电子对和H，和
R6选自OH、–N(R9)CH2C(O)NH2和下式的部分：
,
其中：
R9选自H和C1-C6烷基；和
R10选自G、C(O)-R11OH、酰基、三苯甲基、4甲氧基三苯甲基、C(=NH)NH2、C(O)(CH2)mNR12C(=NH)NH2和C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR12C(=NH)NH2，其中：
M是1-5的整数，
R11具有式-(O-烷基)y-，其中y是3-10的整数，和
y个烷基中的每个独立地选自C2-C6烷基；和
R12选自H和C1-C6烷基；
R1的每个实例独立地选自：
–N(R13)2R14，其中每个R13独立地选自H和C1-C6烷基，和R14选自电子对和H；
式(II)的部分：
,
其中：
R15选自H、G、C1-C6烷基、C(=NH)NH2、C(O)(CH2)qNR18C(=NH)NH2和-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR18C(=NH)NH2，其中：
R18选自H和C1-C6烷基；和
Q是1-5的整数，
R16选自电子对和H；和
每个R17独立地选自H和甲基；和
式(III)的部分：
,
其中：
R19选自H、C1-C6烷基、C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)rNR22C(=NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)3NHC(=NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR22C(=NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)4NH2和G，其中：
R22选自H和C1-C6烷基；和
R是1-5的整数，
R20选自H和C1-C6烷基；和
R21选自电子对和H；
R2选自H、G、酰基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、C1-C6烷基、-C(=NH)NH2、-C(O)-R23、-C(O)(CH2)sNR24C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR24C(=NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)3NHC(=NH)NH2和下式的部分：
,
其中，
R23具有式-(O-烷基)v-OH，其中v是3-10的整数和v个烷基中的每个独立地选自C2-C6烷基；和
R24选自H和C1-C6烷基；
S是1-5的整数；
L选自–C(O)(CH2)6C(O)–和-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)–；和
每个R25具有式–(CH2)2OC(O)N(R26)2，其中每个R26具有式–(CH2)6NHC(=NH)NH2；和
R3选自电子对、H和C1-C6烷基，
其中G是细胞穿透肽(“CPP”)和接头部分，选自-C(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)(CH2)2NH-CPP、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NH-CPP和-C(O)CH2NH-CPP，或G具有下式：
,
其中CPP通过CPP羧基端的酰胺键连接至接头部分，条件是G的至多一个实例存在，和
其中靶向序列与包含人肌养蛋白前-mRNA的外显子的靶标区的12或更多个连续核苷酸互补；和
其中已给予所述受试者肌生成抑制蛋白治疗剂，其在受试者中抑制肌生成抑制蛋白活性和肌生成抑制蛋白表达的一者或二者，从而治疗至少一种杜兴肌营养不良或相关病症。
61.权利要求60的方法，其中每个Nu独立地是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、肌苷、次黄嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C5-丙炔基-修饰的嘧啶或10-(9-(氨基乙氧基)吩噁嗪基)。
62.权利要求60的方法，其中靶标区选自(i) 核苷酸序列，其中至少一个核苷酸跨越与所述外显子缔合的剪接点；或(ii) 核苷酸序列，其中无核苷酸跨越与所述外显子缔合的剪接点。
63.权利要求60的方法，其中靶向序列包含选自SEQ ID NOS: 76-3485的序列，是选自SEQ ID NOS: 76-3485的靶向序列的至少10个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:76-3485的靶向序列具有至少90%序列同一性的变体。
64.权利要求60的方法，其中：
i) Y是O，R2选自H或G，R3选自电子对或H；
ii) R2是G，其中CPP具有选自SEQ ID NOS: 3486-3501的序列；
iii) 每个R1是-N(CH3)2；
iv) 至少一个R1选自：
v) 50-90%的R1基团是-N(CH3)2。
65.权利要求60的方法，其中T具有下式：
,
其中A是–N(CH3)2，和R6具有下式：
,
其中R10是-C(O)R11OH。
66.权利要求60的方法，其中每个Y是O和T选自：
。
67.权利要求60的方法，其中T具有下式：
。
68.治疗受试者的杜兴肌营养不良和相关病症的方法，所述受试者具有在肌养蛋白基因中的突变，其对通过能够在肌养蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感，所述方法包括：
给予受试者包含式(VI)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
每个Nu是核碱基，其一起形成靶向序列；
Z是8-48的整数；
每个Y独立地选自O和–NR4，其中每个R4独立地选自H、C1-C6烷基、芳烷基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)nNR5C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR5C(=NH)NH2和G，其中R5选自H和C1-C6烷基和n是1-5的整数；
T选自OH和下式的部分：
其中：
A选自–OH和-N(R7)2R8，其中：
每个R7独立地选自H和C1-C6烷基，和
R8选自电子对和H，和
R6选自OH、–N(R9)CH2C(O)NH2和下式的部分：
其中：
R9选自H和C1-C6烷基；和
R10选自G、-C(O)-R11OH、酰基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)mNR12C(=NH)NH2和-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR12C(=NH)NH2，其中：
M是1-5的整数，
R11具有式-(O-烷基)y-，其中y是3-10的整数，和
y个烷基中的每个独立地选自C2-C6烷基；和
R12选自H和C1-C6烷基；
R2选自H、G、酰基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、C1-C6烷基、-C(=NH)NH2,和-C(O)-R23；和
R3选自电子对、H和C1-C6烷基，和
其中靶向序列包含选自SEQ ID NOS: 76-3485的序列，选自SEQ ID NOS: 76-3485，是选自SEQ ID NOS: 76-3485的序列的至少10个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS:76-3485的序列具有至少90%序列同一性的变体；和
其中已给予所述受试者肌生成抑制蛋白治疗剂，其在受试者中抑制肌生成抑制蛋白活性和肌生成抑制蛋白表达的一者或二者，从而治疗至少一种杜兴肌营养不良或相关病症。
69.治疗受试者的杜兴肌营养不良和相关病症的方法，所述受试者具有在肌养蛋白基因中的突变，其对通过能够在人肌养蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感，所述方法包括：
给予受试者包含式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
每个Nu是核碱基，其一起形成靶向序列；
Z是8-48的整数；
每个Y独立地选自O和–NR4，其中每个R4独立地选自H、C1-C6烷基、芳烷基、C(=NH)NH2、C(O)(CH2)nNR5C(=NH)NH2、C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR5C(=NH)NH2和G，其中R5选自H和C1C6烷基和n是1-5的整数；
T选自OH和下式的部分：
,
其中:
A选自–OH、-N(R7)2R8，其中：
每个R7独立地选自H和C1-C6烷基，和
R8选自电子对和H，和
R6选自OH、–N(R9)CH2C(O)NH2和下式的部分：
,
其中：
R9选自H和C1-C6烷基；和
R10选自G、C(O)-R11OH、酰基、三苯甲基、4甲氧基三苯甲基、C(=NH)NH2、C(O)(CH2)mNR12C(=NH)NH2和C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR12C(=NH)NH2，其中：
m是1-5的整数，
R11具有式-(O-烷基)y-，其中y是3-10的整数，和
y个烷基中的每个独立地选自C2-C6烷基；和
R12选自H和C1-C6烷基；
R1的每个实例独立地选自：
–N(R13)2R14，其中每个R13独立地选自H和C1-C6烷基，和R14选自电子对和H；
式(II)的部分：
,
其中：
R15选自H、G、C1-C6烷基、C(=NH)NH2、C(O)(CH2)qNR18C(=NH)NH2和-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR18C(=NH)NH2，其中：
R18选自H和C1-C6烷基；和
Q是1-5的整数，
R16选自电子对和H；和
每个R17独立地选自H和甲基；和
式(III)的部分：
,
其中：
R19选自H、C1-C6烷基、C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)rNR22C(=NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)3NHC(=NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR22C(=NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)4NH2和G，其中：
R22选自H和C1-C6烷基；和
R是1-5的整数，
R20选自H和C1-C6烷基；和
R21选自电子对和H；
R2选自H、G、酰基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、C1-C6烷基、-C(=NH)NH2、-C(O)-R23、-C(O)(CH2)sNR24C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR24C(=NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)3NHC(=NH)NH2和下式的部分：
,
其中，
R23具有式-(O-烷基)v-OH，其中v是3-10的整数和v个烷基中的每个独立地选自C2-C6烷基；和
R24选自H和C1-C6烷基；
S是1-5的整数；
L选自–C(O)(CH2)6C(O)–和-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)–；和
每个R25具有式–(CH2)2OC(O)N(R26)2，其中每个R26具有式–(CH2)6NHC(=NH)NH2；和
R3选自电子对、H和C1-C6烷基，
其中G是细胞穿透肽(“CPP”)和接头部分，选自-C(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)(CH2)2NH-CPP、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NH-CPP和-C(O)CH2NH-CPP，或G具有下式：
,
其中CPP通过CPP羧基端的酰胺键连接至接头部分，条件是G的至多一个实例存在，和
其中靶向序列与包含人肌养蛋白前-mRNA的外显子的靶标区的10或更多个连续核苷酸互补；和
其中已给予所述受试者肌生成抑制蛋白治疗剂，其在受试者中抑制肌生成抑制蛋白活性和肌生成抑制蛋白表达的一者或二者，从而治疗至少一种杜兴肌营养不良或相关病症。
70.权利要求69的方法，其中每个Nu独立地是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、肌苷、次黄嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C5-丙炔基-修饰的嘧啶或10-(9-(氨基乙氧基)吩噁嗪基)。
71.权利要求69的方法，其中靶向序列包含选自SEQ ID NOS: 16-75的序列，是选自SEQID NOS: 16-75的靶向序列的至少10个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS: 16-75的靶向序列具有至少90%序列同一性的变体。
72.权利要求69的方法，其中：
i) Y是O，R2选自H或G，R3选自电子对或H；
ii) R2是G，其中CPP具有选自SEQ ID NOS: 3486-3501的序列；
iii) 每个R1是-N(CH3)2；
iv) 至少一个R1选自：
v) 50-90%的R1基团是-N(CH3)2。
73.权利要求69的方法，其中T具有下式：
,
其中A是–N(CH3)2，和R6具有下式：
,
其中R10是-C(O)R11OH。
74.权利要求69的方法，其中每个Y是O，和T选自：
。
75.权利要求69的方法，其中T具有下式：
。
76.治疗受试者的杜兴肌营养不良和相关病症的方法，所述方法包括：
给予受试者包含式(VI)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
每个Nu是核碱基，其一起形成靶向序列；
Z是8-48的整数；
每个Y独立地选自O和–NR4，其中每个R4独立地选自H、C1-C6烷基、芳烷基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)nNR5C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR5C(=NH)NH2和G，其中R5选自H和C1-C6烷基和n是1-5的整数；
T选自OH和下式的部分：
其中：
A选自–OH和-N(R7)2R8，其中：
每个R7独立地选自H和C1-C6烷基，和
R8选自电子对和H，和
R6选自OH、–N(R9)CH2C(O)NH2和下式的部分：
其中：
R9选自H和C1-C6烷基；和
R10选自G、-C(O)-R11OH、酰基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)mNR12C(=NH)NH2和-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR12C(=NH)NH2，其中：
M是1-5的整数，
R11具有式-(O-烷基)y-，其中y是3-10的整数，和
y个烷基中的每个独立地选自C2-C6烷基；和
R12选自H和C1-C6烷基；
R2选自H、G、酰基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、C1-C6烷基、-C(=NH)NH2和-C(O)-R23；和
R3选自电子对、H和C1-C6烷基，和
其中靶向序列包含选自SEQ ID NOS: 16-75的序列，选自SEQ ID NOS: 16-75，是选自SEQ ID NOS: 16-75的序列的至少10个连续核苷酸的片段，或是与选自SEQ ID NOS: 16-75的序列具有至少90%序列同一性的变体，和
其中已给予所述受试者肌养蛋白治疗剂，其在受试者的肌肉细胞中增加功能性肌养蛋白的蛋白表达，从而治疗至少一种杜兴肌营养不良或相关病症。
77.肌养蛋白相关的药物组合物，其包含17-40个亚单位的反义寡聚体化合物和药学上可接受的载体，所述化合物包含：
至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i) 修饰的核苷间连键，(ii) 修饰的糖部分或(iii) 前述的组合；和
与包含人肌养蛋白前-mRNA的外显子的靶标区的10或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；
以及肌生成抑制蛋白相关的药物组合物，包含12-40个亚单位的反义寡聚体化合物和药学上可接受的载体，所述化合物包含：
至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i) 修饰的核苷间连键，(ii) 修饰的糖部分或(iii) 前述的组合；和
与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的靶标区的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列。
78.权利要求77的组合物，其中肌养蛋白相关的组合物和肌生成抑制蛋白相关的组合物在相同的药物组合物中提供。
79.用于调节受试者的肌生成抑制蛋白表达的方法，所述受试者具有遗传突变，其对通过能够在人肌生成抑制蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感，所述方法包括：
给予受试者有效量的反义寡聚体，所述反义寡聚体包含12-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；和
其中，所述寡聚体包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i) 修饰的核苷间连键，(ii) 修饰的糖部分或(iii) 前述的组合；
结合反义寡聚体至肌生成抑制蛋白前-mRNA转录物的靶标区；和
抑制靶标区转录为人肌生成抑制蛋白mRNA转录物，
其中已给予所述受试者肌养蛋白治疗剂，其在受试者中增加肌养蛋白表达。
80.用于减少受试者的外显子2的表达的方法，所述受试者具有遗传突变，其对通过能够在人肌生成抑制蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感，所述方法包括：
给予受试者有效量的反义寡聚体，所述反义寡聚体包含12-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列，并且抑制肌生成抑制蛋白mRNA转录物中外显子2的转录，
其中已给予所述受试者肌养蛋白治疗剂，其在受试者中增加肌养蛋白表达。
81.权利要求80的方法，其中在肌生成抑制蛋白mRNA转录物中外显子2表达被减少约5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
82.用于在受试者的肌肉细胞或组织中减少功能性肌生成抑制蛋白蛋白的积聚的方法，所述受试者具有在肌养蛋白基因中的突变，其对通过能够在人肌生成抑制蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感，所述方法包括：
给予受试者有效量的反义寡聚体，所述反义寡聚体包含12-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列，和
抑制肌生成抑制蛋白mRNA转录物中外显子2的转录，
其中已给予所述受试者肌养蛋白治疗剂，其在受试者中增加肌养蛋白表达。
83.用于治疗杜兴肌营养不良和相关病症的药物，包含：
包含12-40个亚单位的反义寡聚体化合物，包含
至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i) 修饰的核苷间连键，(ii) 修饰的糖部分或(iii) 前述的组合；和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；和
肌养蛋白治疗剂，其增加功能性肌养蛋白的蛋白表达。
84.抑制受试者的杜兴肌营养不良和相关病症的进展的方法，所述受试者具有在肌养蛋白基因中的突变，其对通过能够在人肌生成抑制蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感，所述方法包括：
给予受试者有效量的反义寡聚体，所述反义寡聚体包含12-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；并且抑制肌生成抑制蛋白mRNA转录物中外显子2的转录，
其中已给予所述受试者肌养蛋白治疗剂，其在受试者中增加肌养蛋白表达，从而抑制杜兴肌营养不良的进展。
85.在具有杜兴肌营养不良和相关病症的受试者中减少功能性肌生成抑制蛋白的蛋白积聚的方法，所述方法包括：
给予受试者有效量的反义寡聚体，所述反义寡聚体包含12-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；
抑制肌生成抑制蛋白mRNA转录物中外显子2的转录，
其中在受试者中功能性肌生成抑制蛋白的蛋白积聚减少，和
其中已给予所述受试者肌养蛋白治疗剂，其在受试者的肌肉细胞中增加功能性肌养蛋白的蛋白表达。
86.用于在需要治疗的受试者中治疗杜兴肌营养不良和相关病症的方法，包括：
给予有效量的反义寡聚体以在受试者中产生至少约200-400 nM的峰值血液浓度的反义寡聚体。
87.治疗受试者的骨骼肌肉质量缺乏的方法，所述受试者具有在肌养蛋白基因中的突变，其对通过能够在人肌生成抑制蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感，所述方法包括：
(a) 在受试者中测量肌生成抑制蛋白蛋白的血液或组织水平；
(b) 给予试者有效量的反义寡聚体，所述反义寡聚体包含12-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；
(c) 抑制肌生成抑制蛋白mRNA转录物中外显子2的转录；
(d) 在选择时间后，在受试者中测量肌生成抑制蛋白的蛋白水平；和,
(e) 使用在(d)中测量的水平重复所述给予，以调整给予的反义寡聚体的量的剂量或剂量方案，其中在给予反义寡聚体后在受试者中肌生成抑制蛋白的蛋白水平减少，和
其中已给予所述受试者肌养蛋白治疗剂，其在受试者的肌肉细胞中增加功能性肌养蛋白的蛋白表达。
88.抑制受试者的杜兴肌营养不良和相关病症的进展的方法，所述受试者具有在肌养蛋白基因中的突变，其对通过能够在肌养蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感，所述方法包括：
给予受试者有效量的反义寡聚体，所述反义寡聚体包含17-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌养蛋白前-mRNA的外显子的靶标区的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列，其中反义寡聚体诱导外显子的跳跃；
其中，所述寡聚体包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i) 修饰的核苷间连键，(ii) 修饰的糖部分或(iii) 前述的组合；和
其中，已给予所述受试者肌生成抑制蛋白治疗剂，其在受试者中抑制肌生成抑制蛋白活性和表达的一者或二者，从而抑制至少一种杜兴肌营养不良或相关病症的进展。
89.抑制杜兴肌营养不良的进展的方法，所述方法包括：
给予受试者有效量的反义寡聚体，所述反义寡聚体包含12-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；和
其中，所述寡聚体包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i) 修饰的核苷间连键，(ii) 修饰的糖部分或(iii) 前述的组合；和
其中已给予所述受试者肌养蛋白治疗剂，其在受试者的肌肉细胞中增加功能性肌养蛋白的蛋白表达，从而抑制杜兴肌营养不良的进展。
90.前述权利要求中任一项的反义寡聚体，进一步包含缀合至反义寡聚体的3’末端或5’末端的富含精氨酸的肽序列，其中富含精氨酸的肽序列包含选自SEQ ID NOS: 3486-3501的序列。
91.权利要求60-75中任一项的方法，其中R2是G，和CPP包含选自SEQ ID NOS: 3486-3501的序列。
92.权利要求83的药物，进一步包含缀合至反义寡聚体的3’末端的富含精氨酸的肽序列，其中富含精氨酸的肽序列包含选自SEQ ID NOS: 3486-3501的序列。
93.组合物，包含：
反义寡聚体，其包含17-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌养蛋白前-mRNA的外显子的靶标区的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；
其中所述肌养蛋白靶向的寡聚体包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i) 修饰的核苷间连键，(ii) 修饰的糖部分或(iii) 前述的组合；和
反义寡聚体，其包含12-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；
其中所述肌生成抑制蛋白靶向的寡聚体包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i) 修饰的核苷间连键，(ii) 修饰的糖部分或(iii) 前述的组合。
94.用于调节受试者的肌养蛋白表达的方法，所述受试者具有遗传突变，其对通过能够在人肌养蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感，所述方法包括：
给予受试者有效量的反义寡聚体，所述反义寡聚体包含17-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌养蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；和
其中，所述寡聚体包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i) 修饰的核苷间连键，(ii) 修饰的糖部分或(iii) 前述的组合；
其中已给予所述受试者肌生成抑制蛋白治疗剂，其在受试者中抑制肌生成抑制蛋白活性和肌生成抑制蛋白表达的一者或二者。
95.用于调节受试者的肌生成抑制蛋白表达的方法，所述受试者具有遗传突变，其对通过能够在人肌生成抑制蛋白前-mRNA的加工期间诱导外显子跳跃的反义寡聚体的治疗易感，所述方法包括：
给予受试者有效量的反义寡聚体，所述反义寡聚体包含12-40个亚单位，和进一步包含与包含人肌生成抑制蛋白前-mRNA的外显子的12或更多个连续核苷酸互补的靶向序列；和
其中，所述寡聚体包含至少一个亚单位，其为具有以下的核苷酸类似物：(i) 修饰的核苷间连键，(ii) 修饰的糖部分或(iii) 前述的组合；
其中已给予所述受试者肌养蛋白治疗剂，其在受试者的肌肉细胞中增加功能性肌养蛋白的蛋白表达。
96.权利要求1-95中任一项的方法，其中反义寡聚体、肌养蛋白治疗剂或肌生成抑制蛋白治疗剂的至少一种经全身给予受试者。
97.权利要求96的方法，其中所述受试者是人。
98.权利要求97的方法，其中所述受试者的年龄为7岁或更大。
99.权利要求98的方法，其中无反义寡聚体或肌养蛋白治疗剂包含SEQ ID NO:927。
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