JP2021072835A - 安定性が向上したｐｄｇｆ及びｖｅｇｆアプタマー並びにｐｄｇｆ及びｖｅｇｆ媒介性の疾患及び障害の治療におけるそれらの使用 - Google Patents

安定性が向上したｐｄｇｆ及びｖｅｇｆアプタマー並びにｐｄｇｆ及びｖｅｇｆ媒介性の疾患及び障害の治療におけるそれらの使用 Download PDF

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Abstract

【課題】血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＰＤＧＦ−ＡＢを含めたＰＤＧＦ−Ｂ）に結合するアプタマー、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ−１２１及びＶＥＧＦ−１６５を含めたＶＥＧＦ）に結合するアプタマー並びにＰＤＧＦ−Ｂに結合するアプタマー及びＶＥＧＦに結合するアプタマーを含むアプタマー構築物を提供する。【解決手段】特定の配列からなる核酸配列を含む核酸分子であって、記核酸分子の位置８、９、１５、１６及び１７の少なくとも１個がホスホロチオエート結合または部分を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドであり、Ｈ及びＶが前記核酸分子の位置を数えるための単一の位置とみなされる、前記核酸分子である。【選択図】なし

Description

関連出願
〔０００１〕関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年９月９日に出願されたＵ．Ｓ．特許仮出願第６１／８７５，６６０号に対して優先権を主張するものであり、この出願は、その全体が参照により組み込まれる。
〔０００２〕 本開示は一般に核酸分野に関し、より詳細には、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に結合することができるアプタマー及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合することができるアプタマーに関する。いくつかの実施形態では、そうしたアプタマーは、限定されないが、アテローム性動脈硬化症、黄斑変性症、線維症、癌並びにＰＤＧＦ及び／またはＶＥＧＦが関与している他の障害を含めた増殖性障害を予防する、治療する及び／または改善するための治療剤として有用である。いくつかの実施形態では、本開示は、同時にまたは相互排他的にＶＥＧＦ及びＰＤＧＦに結合することができ、治療剤として有用であるアプタマー構築物に関する。
〔０００３〕 ２０１４年９月８日に作成され、１，００５キロバイトのサイズの「ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と題する配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
〔０００４〕 以下の説明は情報の概要を提供し、本明細書で提供される情報または本明細書で言及される刊行物のいずれも本開示に対する先行技術であることを認めるものではない。
〔０００５〕 血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ及び−Ｄ）は、多くの結合組織細胞に対する遍在性の分裂促進因子及び走化性因子である（Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ
Ｒｅｖ．１５（４）：１９７）。ＰＤＧＦはジスルフィド結合した二量体として存在し、細胞表面上のＰＤＧＦ受容体α及びβに対する結合を介して機能するシステインノットフォールド増殖因子ドメインを含む（Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４９１７）。ＰＤＧＦの結合は受容体の二量体化を誘導し、これによって、細胞内のチロシン残基での自己リン酸化が起こる（Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ，Ｊ．（１９９４）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３２０２３）。ＰＤＧＦ−ＢＢは、アテローム性動脈硬化症、線維症、黄斑変性症及び癌を含めた、いくつかの増殖性障害に関与する（Oｓｔｍａｎ，Ａ．，ｅｔ
ａｌ．（２００１）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８０：１；Ａｐｐｅｌｍａｎｎ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１８０：５１；Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ）４７（Ｓｕｐｐｌ ５）：２；Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １３０：４５；Ｓｍｉｔｓ
ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４０：６３９；Ｈｅｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２９：２１８７；Ｆｌｏｅｇｅ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９９５）Ｍｉｎｅｒ．Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ Ｍｅｔａｂ．２１：２７１；Ｒａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎ
ｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｓｐｏｒｎ ＆ Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｐｐ．１７３−２６２，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）。
〔０００６〕 ＶＥＧＦは分泌性のジスルフィド結合ホモ二量体であり、内皮細胞を選択的に刺激して、急増させ、遊走させ、マトリックス分解酵素を産生させ、これらのすべては、新しい血管の形成に必要とされるプロセスである（Ｃｏｎｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１３２３；Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６１：８５１；Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７３１１；Ｐｅｐｐｅｒ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８１：９０２；Ｕｎｅｍｏｒｉ，Ｅ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５３：５５７）。唯一の既知の内皮細胞特異的分裂促進因子であることに加えて、ＶＥＧＦは、高分子に対する血管透過性の一過的な増大を誘導する能力において、血管新生増殖因子の中でユニークである（Ｄｖｏｒａｋ，Ｈ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２２：１６６；Ｓｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：９８３；Ｓｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６：５６２９）。血管透過性の増大及びその結果として生じた血管外スペースでの血漿タンパク質の沈着は、内皮細胞の遊走のための暫定的なマトリックスを提供することによって新しい血管の形成を促進する。透過性亢進は、実際、新しい血管の特徴である（Ｄｖｏｒａｋ，Ｈ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６：１０２９）。さらに、組織の低酸素によって誘導される代償性血管新生もＶＥＧＦに媒介される（Ｌｅｖｙ，Ａ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２７４６；Ｓｈｗｅｉｋｉ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５９：８４３）。低酸素誘導性タンパク質としてのＶＥＧＦの同定は、高酸素がＶＥＧＦの発現の抑制を引き起こすという相補的な知見とともに、酸素需要を血管供給と調和させるための魅力的なメカニズムを提供する（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｌ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１５９；Ａｌｏｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０２４）。
〔０００７〕 ＶＥＧＦタンパク質のいくつかのアイソフォームは、ＶＥＧＦをコードする遺伝子の８エクソンの選択的スプライシングの結果として生じる（Ｅｍｉｎｇ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｐｒｏｃ．１１：７９）。最も広く認められるアイソフォームは、ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１６５及びＶＥＧＦ−１８９である。ＶＥＧＦのタンパク分解性プロセシングによって、さらなるアイソフォームが生成され得る。ＶＥＧＦ−１６５は、プラスミンによってＡｒｇ−１１０とＡｌａ−１１１の間で切断され得、これによってＶＥＧＦ−１１０が生成され、これは、ＶＥＧＦ−１２１と機能的に同等である（Ｋｅｙｔ，Ｂ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７７８８）。ＶＥＧＦ−１８９は、ウロキナーゼによってエクソン６ドメイン内で切断され得、次いで、プラスミンによってさらに切断され得、これによってＶＥＧＦ−１１０が生成される（Ｐｌｏｕｅｔ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１３３９０）。加えて、ＭＭＰ−３、−７、−９及び−１９を含めた、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のサブセットは、連続的なステップでＶＥＧＦ−１６５及びＶＥＧＦ−１８９を切断することができ、これによってＶＥＧＦ−１１３が生成され、これは、ＶＥＧＦ−１１０と機能的に同等である。したがって、所与の組織におけるＶＥＧＦのマトリックス結合性形態及び拡散性形態の相対的存在量は、組織の細胞で生じる選択的スプライシングとタンパク分解性プロセシングの組み合わせによって決定される（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．，ｅｔ
ａｌ．（２００６）Ｒｅｔｉｎａ ２６：８５９）。
〔０００８〕 加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、５５歳を超える人々の失明の主因のままである。この疾患は、光受容体が最も高密度であり、中心視野に関与する網膜の部分である黄班内でのドルーゼンと呼ばれる不溶性沈着物の形成を特徴とする。ＡＭＤの初期段階では、沈着物は無血管性であり、この疾患は、一般にゆっくりと進行する。しかし、患者の約１０％では、このいわゆる「ドライ」型のＡＭＤは、血管新生化され、「ウェット」型のＡＭＤになり、その間に、この疾患はより進行性になり、より速い速度で視力が悪化する。多くの場合、中心視野のぼやけから事実上の失明への進行が２年未満に生じる。この疾患の進行した段階である、滲出型またはウェット型のＡＭＤでは、新しい血管が脈絡毛細管から網膜の中心部（黄班）に侵入し、中心視野を塞ぐ。米国では、ウェットＡＭＤの患者数は約１８０万人であり、２０２０年までに増加して３００万人に近いことが予想される。米国でのウェットＡＭＤの発生率は、毎年約２１０，０００人である。
〔０００９〕 最近、ＡＭＤは、ＶＥＧＦに結合する高親和性アンタゴニストを眼に直接注射し、内皮細胞における細胞表面受容体とのＶＥＧＦの相互作用を防止することによってＶＥＧＦ媒介性の血管新生及び血管漏出の誘導をブロックすることにより治療されている。
〔００１０〕 ＶＥＧＦとＰＤＧＦ−Ｂのシグナリングの二重阻害が、新しい血管の退縮と相まって、より効率的な血管新生のブロックにつながるというかなりの証拠がある。例えば、臨床的エビデンスは、ＶＥＧＦとＰＤＧＦ−Ｂの二重阻害が、ＡＭＤ患者において、眼部の血管新生のより完全な阻害を達成することができることを示唆する。ＮｅＸｓｔａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓで最初に発見された、ＰＤＧＦ−Ｂのアプタマーインヒビター（Ｅ１００３０）（Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：１４４１３；Ｕ．Ｓ．特許第６，２０７，８１６号；第５，７３１，１４４号；第５，７３１，４２４号；及び第６，１２４，４４９号）は、Ｏｐｈｔｈｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって、ＡＭＤに対する治療薬として開発中である。Ｅ１００３０（Ｆｏｖｉｓｔａ（登録商標））は、約１００ｐＭのＫｄでＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢに結合し、インビトロ及びインビボの両方でＰＤＧＦ−Ｂの機能を阻害する、ＤＮＡベースの修飾アプタマーである。
〔００１１〕 第１相試験において、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）抗ＶＥＧＦ療法と組み合わせて試験したＥ１００３０を用いる抗ＰＤＧＦ療法は、療法から１２週後に、治療患者の５９％において、３ラインの視力向上がもたらされた。これは、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ単独で歴史的に観察された３４〜４０％と比較して、視力が向上した患者に関してかなり高いパーセンテージである。加えて、この併用療法は、すべての試験参加者において新生血管の顕著な退縮を伴った。併用療法による有効性の増強は、ウェットＡＭＤを有する４４９人の患者の第２相試験において最近確証された。Ｆｏｖｉｓｔａ（１．５ｍｇ）とＬｕｃｅｎｔｉｓの組み合わせを受けた患者は、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ単独療法を受けた患者の６．５文字と比較して、２４週間で平均１０．６文字の視力が向上し（ｐ＝０．０１９）、これは、６２％のさらなる視力の上昇（ｂｅｎｅｆｉｔ）を意味する。
〔００１２〕 本開示は、血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＰＤＧＦ−ＡＢを含めたＰＤＧＦ−Ｂ）に結合するアプタマー、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ−１２１及びＶＥＧＦ−１６５を含めたＶＥＧＦ）に結合するアプタマー並びにＰＤＧＦ−Ｂに結合するアプタマー及びＶＥＧＦに結合するアプタマーを含むアプタマー構築物を提供する。開示されるアプタマー及びアプタマー構築物は、限定されないが、アテローム性動脈硬化症、黄斑変性症、線維症、糖尿病性網膜症及び癌並びに／またはＰＤＧＦ及び／もしくはＶＥＧＦが関与している他の疾患もしくは病気状態を含めた増殖性の疾患または病気を予
防する、治療する及び／または改善するための治療剤として有用である。様々な実施形態では、アプタマー構築物は、ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦ−Ｂのそれぞれに独立に、並びに／またはＶＥＧＦ及びＰＤＧＦ−Ｂに同時に結合することができる。ＰＤＧＦアプタマー、ＶＥＧＦアプタマーもしくはＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ−Ｂアプタマー構築物または前述のいずれかの医薬的に許容可能な塩及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物または製剤が含まれる。そうした組成物は、任意の適切な医薬的に許容可能な剤形で調製することができる。
〔００１３〕 一態様では、本開示は、核酸配列：５’−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｚ−Ｇ−Ｚ−Ａ−Ｚ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｚ−Ｃ−Ｚ−３’（配列番号８３０）を含む核酸分子を提供し、ここでは、ＺはＣ−５修飾ピリミジンであり、核酸分子の位置４、９、１０、１１及び１２の少なくとも１個はホスホロチオエート結合または部分を含み、位置１は核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである。関連した態様では、核酸分子の位置４、９、１０、１１及び１２の少なくとも２、３、４または５個はホスホロチオエート結合または部分を含み、位置１は核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである。
〔００１４〕 別の態様では、核酸分子は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを含む。関連した態様では、核酸分子の位置１、４、６、７、１４、１５、１６、１７、１８、２０及び２１の少なくとも１個は、２’−Ｏ−メチル修飾を含み、位置１は核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである。さらに別の関連した態様では、核酸分子の位置１、４、６、７、１４、１５、１６、１７、１８、２０及び２１の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個は、２’−Ｏ−メチル修飾を含み、位置１は核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである。
〔００１５〕 別の態様では、Ｃ−５修飾ピリミジンは、独立に、それぞれの出現について、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン及び５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）から成る群から選択される。関連した態様では、Ｃ−５修飾ピリミジンは、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である。
〔００１６〕 別の態様では、核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせを含む。
〔００１７〕 別の態様では、核酸分子は、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満ま
たは１ｎＭ未満の結合親和性で、ＰＤＧＦタンパク質に結合する。
〔００１８〕 別の態様では、核酸分子は、核酸分子の３’末端に逆位デオキシヌクレオチドをさらに含む。関連した態様では、デオキシヌクレオチドはデオキシチミジンである。
〔００１９〕 別の態様では、核酸分子は、ホスホロチオエート結合または部分を有さない同じ核酸分子と比較してヌクレアーゼに対する感受性が低い。関連した態様では、ヌクレアーゼはＤＮａｓｅ酵素である。さらに別の関連した態様では、ＤＮａｓｅ酵素はＤＮａｓｅ ＩまたはＤＮａｓｅ ＩＩ酵素である。
〔００２０〕 別の態様では、核酸分子は、ホスホロチオエート結合または部分を有さない同じ核酸分子と比較して、ニュージーランドホワイトウサギの硝子体液中でより安定的である。
〔００２１〕 別の態様では、核酸分子は、以下のアプタマーＩＤ番号、１４６、１５０〜１５９、１７２〜１８２及び１８８を有する５１６９アプタマーから成る群から選択される。
〔００２２〕 関連した態様では、核酸分子は、１１個の２’−Ｏ−メチルヌクレオシド及び４または５個のホスホロチオエート結合または部分を含む。
〔００２３〕 関連した態様では、核酸分子は、ホスホロチオエート結合または部分及び２’−Ｏ−メチル基を有する、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
〔００２４〕 別の態様では、本開示は、核酸配列：５’−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｚ−Ｚ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｚ−Ｇ−Ｃ−Ｚ−Ｚ−Ｇ−Ｚ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｚ−Ｇ−Ｇ−３’（配列番号８３１）を含む核酸分子を提供し、ここでは、ＺはＣ−５修飾ピリミジンであり、核酸分子の位置２４、２５及び２６の少なくとも１個はホスホロチオエート結合または部分を含み、位置１は核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである。関連した態様では、位置２４、２５及び２６の少なくとも２または３個はホスホロチオエート結合または部分を含み、位置１は核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである。
〔００２５〕 関連した態様では、核酸分子は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８または９個の２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを含む。
〔００２６〕 別の態様では、核酸分子の位置１、６、９、１２、１５、１７、１８、２２、２８及び２９の少なくとも１個は２’−Ｏ−メチル修飾を含み、位置１は核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである。関連した態様では、核酸分子の位置１、６、９、１２、１５、１７、１８、２２、２８及び２９の少なくとも２、３、４、５、６、７、８または９個は２’−Ｏ−メチル修飾を含み、位置１は核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである。
〔００２７〕 別の態様では、Ｃ−５修飾ピリミジンは、独立に、それぞれの出現について、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミ
ド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン及び５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）から成る群から選択される。関連した態様では、Ｃ−５修飾ピリミジンは５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である。
〔００２８〕 別の態様では、核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせを含む。
〔００２９〕 別の態様では、核酸分子は、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満または１ｎＭ未満の結合親和性でＶＥＧＦタンパク質に結合する。
〔００３０〕 別の態様では、核酸分子は、核酸分子の３’末端に逆位デオキシヌクレオチドをさらに含む。関連した態様では、デオキシヌクレオチドはデオキシチミジンである。
〔００３１〕 別の態様では、核酸分子は、ホスホロチオエート結合または部分を有さない同じ核酸分子と比較して、ヌクレアーゼに対する感受性が低い。関連した態様では、ヌクレアーゼはＤＮａｓｅ酵素である。さらに別の関連した態様では、ＤＮａｓｅ酵素はＤＮａｓｅ ＩまたはＤＮａｓｅ ＩＩ酵素である。
〔００３２〕 別の態様では、核酸分子は、ホスホロチオエート結合または部分を有さない同じ核酸分子と比較して、ニュージーランドホワイトウサギの硝子体液中でより安定的である。
〔００３３〕 別の態様では、核酸分子は、以下のアプタマーＩＤ番号、１９２、４０９〜４１７、４１９〜４２９、４３８〜４４５及び４７５〜４８３を有する４８６７−３１アプタマーから成る群から選択される。
〔００３４〕 別の態様では、核酸分子は、９または１０個の２’−Ｏ−メチルヌクレオシド及び１、２または３個のホスホロチオエート結合または部分を含む。
〔００３５〕 別の態様では、核酸分子は、ホスホロチオエート結合または部分及び２’−Ｏ−メチル基を有する、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
〔００３６〕 別の態様では、本開示は、核酸配列：５’−Ｚ−Ｚ’’−Ａ−Ｃ−Ｈ−Ｇ−Ｚ−Ｚ−Ａ−Ｃ−Ｖ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｚ’−Ｚ−Ｚ−Ａ−Ｚ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−３’（配列番号８３２）を含む核酸分子を提供し、ここでは、Ｚ、Ｚ’及びＺ’’は、独立に、それぞれの出現について、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフ
ェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）及び５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）から成る群から選択され；；Ｖは３炭素リンカーであり、Ｈはヘキサエチレングリコールリンカーであり；核酸分子の位置８、９、１５、１６及び１７の少なくとも１個はホスホロチオエート結合または部分を含み、位置１は核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドであり、Ｈ及びＶは核酸分子の位置を数えるための単一の位置とみなされる。関連した態様では、Ｚ及びＺ’は、独立に、それぞれの出現について、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン及び５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）から成る群から選択される。別の関連した態様では、Ｚは、独立に、それぞれの出現について、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）またはメチレンジオキシベンジル−ｄＵから選択される。別の関連した態様では、Ｚ’は５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である。
〔００３７〕 別の態様では、位置８、９、１５、１６及び１７の少なくとも２または３個はホスホロチオエート結合または部分を含み、位置１は核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドであり、Ｈ及びＶは核酸分子の位置を数えるための単一の位置とみなされる。
〔００３８〕 別の態様では、核酸分子は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７または８個の２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを含む。
〔００３９〕 別の態様では、核酸分子の位置３、７、１２、１３、１８、１９、２１及び２４の少なくとも１個は２’−Ｏ−メチル修飾を含み、位置１は核酸分子の５’末端
からの最初のヌクレオシドであり、Ｈ及びＶは核酸分子の位置を数えるための単一の位置とみなされる。関連した態様では、核酸分子の位置３、７、１２、１３、１８、１９、２１及び２４の少なくとも２、３、４、５、６、７または８個は２’−Ｏ−メチル修飾を含み、位置１は核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドであり、Ｈ及びＶは核酸分子の位置を数えるための単一の位置とみなされる。
〔００４０〕 別の態様では、Ｚは５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）である。
〔００４１〕 別の態様では、核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせを含む。
〔００４２〕 別の態様では、核酸分子は、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満または１ｎＭ未満の結合親和性で、ＰＤＧＦタンパク質に結合する。別の態様では、核酸分子は、ＰＤＧＦ受容体のＰＤＧＦ媒介性リン酸化を阻害する。
〔００４３〕 別の態様では、核酸分子は、核酸分子の３’末端に逆位デオキシヌクレオチドをさらに含む。関連した態様では、デオキシヌクレオチドはデオキシチミジンである。
〔００４４〕 別の態様では、核酸分子は、ホスホロチオエート結合または部分を有さない同じ核酸分子と比較して、ヌクレアーゼに対する感受性が低い。関連した態様では、ヌクレアーゼはＤＮａｓｅ酵素である。さらに別の関連した態様では、ＤＮａｓｅ酵素はＤＮａｓｅ ＩまたはＤＮａｓｅ ＩＩ酵素である。
〔００４５〕 別の態様では、核酸分子は、ホスホロチオエート結合または部分を有さない同じ核酸分子と比較して、ニュージーランドホワイトウサギの硝子体液中でより安定的である。
〔００４６〕 別の態様では、核酸分子は、以下のアプタマーＩＤ番号、３７９、３９１、４１８〜４２６、４３１〜４３７及び４５３〜４５９を有する４１４９−８アプタマーから成る群から選択される。
〔００４７〕 別の態様では、核酸分子は、７または８個の２’−Ｏ−メチルヌクレオシド及び４、５、６、７または８個のホスホロチオエート結合または部分を含む。
〔００４８〕 別の態様では、核酸分子は、ホスホロチオエート結合または部分及び２’−Ｏ−メチル基を有する、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
〔００４９〕 別の態様では、本開示は、本明細書に記載の核酸分子から選択される２つの核酸分子を含む組成物を提供する。
〔００５０〕 別の態様では、組成物は、溶液、粉末、ゲル及び乳濁液から選択される群から選択される形態である。
〔００５１〕 別の態様では、２つの核酸分子は共有結合または非共有結合している。
〔００５２〕 別の態様では、本開示は、本明細書に記載の核酸分子のいずれかの少なくとも１つの核酸分子及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
〔００５３〕 別の態様では、医薬組成物は硝子体内注射用である。
〔００５４〕 別の態様では、本開示は、黄斑変性症を有する対象に治療有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む、黄斑変性症の治療方法を提供する。
〔００５５〕 別の態様では、本開示は、黄斑変性症を発症する危険性がある対象に治療有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む、黄斑変性症の予防方法を提供する。
〔００５６〕 別の態様では、本開示は、眼の病気を有する対象に治療有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む、眼の病気の治療方法を提供する。関連した態様では、眼の病気は、網膜炎、黄斑変性症、脈絡膜炎、網膜症、高血圧性網膜症、糖尿病性網膜症、慢性ドライアイ、エイズ関連視力喪失、弱視、半盲、網膜静脈閉塞症、トラコーマ、円錐角膜、脈絡網膜の炎症、中心性漿液性網膜症、ブドウ膜炎、網膜ジストロフィー、浮腫、緑内障及び白内障から成る群から選択される。
〔００５７〕 別の態様では、黄斑変性症は加齢性黄斑変性症である。関連した態様では、黄斑変性症はドライ加齢性黄斑変性症またはウェット加齢性黄斑変性症である。
〔００５８〕 別の態様では、本開示は、線維症を有する対象に治療有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む、線維症の治療方法を提供する。関連した態様では、線維症は、肺線維症、腎線維症及び嚢胞性線維症から選択される。
〔００５９〕 別の態様では、本開示は、心血管疾患を有する対象に治療有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む、心血管疾患の治療方法を提供する。関連した態様では、心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、心肥大関連状態及び血管障害から選択される。
〔００６０〕 別の態様では、本開示は、癌を有する対象に治療有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療方法を提供する。関連した態様では、癌は、膀胱癌、肺癌、乳癌、黒色腫、結腸及び直腸癌、リンパ腫、子宮内膜癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、白血病並びに甲状腺癌から選択される。
〔００６１〕 別の態様では、本開示は、核酸配列：５’−Ｃ１−Ｇ−Ａ−Ｃ１，２−Ａ−Ｇ１−Ｃ１−Ａ−Ｚ２−Ｇ２−Ｚ２−Ａ２−Ｚ−Ｇ１−Ｃ１−Ａ１−Ｃ１−Ａ１−Ｚ−Ｃ１−Ｚ１−３’（配列番号８３３）を含む核酸分子を提供し、ここでは、Ｃ１は、独立に、それぞれの出現について、シチジン、デオキシシチジン及び２’−Ｏ−メチルシチジンから成る群から選択され；Ｃ１，２は、独立に、それぞれの出現について、シチジン、ホスホロチオエート結合を含むシチジン、デオキシシチジン、ホスホロチオエート結合を含むデオキシシチジン、２’−Ｏ−メチルシチジン及びホスホロチオエート結合を含む２’−Ｏ−メチルシチジンから成る群から選択され；Ｇ１は、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、デオキシグアノシン及び２’−Ｏ−メチルグアノシンから成る群から選択され；Ｇ２は、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、ホスホロチオエート結合を含むグアノシン、デオキシグアノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシグアノシンから成る群から選択され；Ｚは、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン及び５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）から成る群から選択され；Ｚ１は、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）及び２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（Ｎ
ａｐｄＵ）から成る群から選択され；Ｚ２は、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、ホスホロチオエート結合を含むウリジン、デオキシウリジン、ホスホロチオエート結合を含むデオキシウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）及びホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）から成る群から選択され；Ａ１は、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、デオキシアデノシン及び２’−Ｏ−メチルアデノシンから成る群から選択され；Ａ２は、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、ホスホロチオエート結合を含むアデノシン、デオキシアデノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンから成る群から選択され；ここでは、核酸分子は、少なくとも１、２、３、４または５個のホスホロチオエート結合を含む。
〔００６２〕 関連した態様では、Ｃ１は、２’−Ｏ−メチルシチジンである。関連した態様では、Ｃ１，２は、ホスホロチオエート結合を含む２’−Ｏ−メチルシチジンである。関連した態様では、Ｇ１は、２’−Ｏ−メチルグアノシンである。関連した態様では、Ｇ２は、ホスホロチオエート結合を含むデオキシグアノシンである。関連した態様では、Ｚ１は、２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である。関連した態様では、Ｚ２は、ホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である。関連した態様では、Ａ１は、２’−Ｏ−メチルアデノシンである。関連した態様では、Ａ２は、ホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンである。
〔００６３〕 別の態様では、本開示は、核酸配列：５’−Ｃ１−Ｃ−Ｇ−Ｚ−Ｚ−Ｃ１−Ａ−Ａ−Ｇ１−Ｚ−Ｇ−Ｃ１−Ｚ−Ｚ−Ｇ１−Ｚ−Ａ１−Ｇ１−Ｇ−Ａ−Ｚ−Ｚ1−
Ｚ−Ａ２−Ａ２−Ａ２−Ｚ−Ｇ１−Ｇ１−３’（配列番号８３４）を含む核酸分子を提供し、ここでは、Ｃ１は、独立に、それぞれの出現について、シチジン、デオキシシチジン及び２’−Ｏ−メチルシチジンから成る群から選択され；Ｇ１は、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、デオキシグアノシン及び２’−Ｏ−メチルグアノシンから成る群から選択され；Ｇ１は、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、デオキシグアノシン及び２’−Ｏ−メチルグアノシンから成る群から選択され；Ｚは、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン及び５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）から成る群から選択され；Ｚ１は、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）及び２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）から成る群から選択され；Ａ１は、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、デオキシアデノシン及び２’−Ｏ−メチルアデノシンから成る群から選択され；Ａ２は、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、ホスホロチオエート結合を含むアデノシン、デオキシアデノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンから成る群から選択され；ここでは、核酸分子は、少なくとも１、２、３、４または５個のホスホロチオエート結合を含む。
〔００６４〕 関連した態様では、Ｃ１は、２’−Ｏ−メチルシチジンである。関連した態様では、Ｇ１は、２’−Ｏ−メチルグアノシンである。関連した態様では、Ｚは、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である。関連した態様では、Ｚ１は、２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である。関連した態様では、Ａ１は、２’−Ｏ−メチルアデノシンである。関連した態様では、Ａ２は、ホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンである。
別の態様では、本開示は、核酸配列：５’−Ｚ−Ｚ’’−Ａ１−Ｃ−Ｈ−Ｇ−Ｚ１−Ｚ２−Ａ２−Ｃ−Ｖ−Ｃ１−Ｇ１−Ｃ−Ｇ２−Ｚ’２−Ｚ２−Ｚ１−Ａ１−Ｚ−Ａ１−Ｇ−Ｃ−Ｇ１−３’（配列番号８３５）を含む核酸分子を提供し、ここでは、Ｃ１は、独立に、それぞれの出現について、シチジン、デオキシシチジン及び２’−Ｏ−メチルシチジンから成る群から選択され；Ｇ１は、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、デオキシグアノシン及び２’−Ｏ−メチルグアノシンから成る群から選択され；Ｇ２は、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、ホスホロチオエート結合を含むグアノシン、デオキシグアノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシグアノシンから成る群から選択され；Ｚは、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）及び５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）から成る群から選択され；Ｚ’’は、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）及び５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）から成る群から選択され；Ｚ’２は、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、ホスホロチオエート結合を含むウリジン、デオキシウリジン、ホスホロチオエート結合を含むデオキシウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、ホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、ホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）及びホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）から成る群から選択され；Ｚ１は、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、メチレンジオキシベンジル−ｄＵ及び２’−Ｏ−メチル基を含むメチレンジオキシベンジル−ｄＵから成る群から選択され；Ｚ２は、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、ホスホロチオエート結合を含むウリジン、デオキシウリジン、ホスホロチオエート結合を含むデオキシウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）及びホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、ホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、メチレンジオキシベンジル−ｄＵ及びホスホロチオエート結合を含むメチレンジオキシベンジル−ｄＵから成る群から選択され；Ａ１は、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、デオキシアデノシン及び２’−Ｏ−メチルアデノシンから成る群から選択され；Ａ２は、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、ホスホロチオエート結合を含むアデノシン、デオキシアデノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンから成る群から選択され；Ｖは３炭素リンカーであり；Ｈはヘキサエチレングリコールリンカーであり；ここでは、核酸分子は、少なくとも１、２、３、４または５個のホスホロチオエート結合を含む。
〔００６５〕 関連した態様では、Ｃ１は、２’−Ｏ−メチルシチジンである。関連し
た態様では、Ｇ１は、２’−Ｏ−メチルグアノシンである。関連した態様では、Ｇ２は、ホスホロチオエート結合を含むデオキシグアノシンである。関連した態様では、Ｚは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）である。関連した態様では、Ｚ’２は、ホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である。関連した態様では、関連した態様では、Ｚ１は、２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）である。関連した態様では、Ｚ２は、ホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）である。関連した態様では、Ａ１は、２’−Ｏ−メチルアデノシンである。関連した態様では、Ａ２は、ホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンである。
〔００６６〕 別の態様では、本開示は、本明細書に記載の核酸分子のいずれか１つから成る群から選択される２つの核酸分子を含む組成物を提供する。
〔００６７〕 関連した態様では、組成物は、溶液、粉末、ゲル及び乳濁液から選択される群から選択される形態である。
〔００６８〕 関連した態様では、２つの核酸分子は共有結合または非共有結合している。
〔００６９〕 別の態様では、核酸分子は、ＰＤＧＦ受容体のＰＤＧＦ媒介性リン酸化を阻害する。
〔００７０〕 別の態様では、本開示は、本明細書に記載の少なくとも１つの核酸分子及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
〔００７１〕 関連した態様では、医薬組成物は硝子体内注射用である。
〔００７２〕 別の態様では、本開示は、黄斑変性症を有する対象に、本明細書に記載の少なくとも１つの核酸分子及び医薬的に許容可能な担体を含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、黄斑変性症の治療方法を提供する。
〔００７３〕 別の態様では、本開示は、黄斑変性症を発症する危険性がある対象に、本明細書に記載の少なくとも１つの核酸分子及び医薬的に許容可能な担体を含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、黄斑変性症の予防方法を提供する。
〔００７４〕 別の態様では、本開示は、眼の病気を有する対象に、本明細書に記載の少なくとも１つの核酸分子及び医薬的に許容可能な担体を含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、眼の病気の治療方法を提供する。
〔００７５〕 関連した態様では、眼の病気は、網膜炎、黄斑変性症、脈絡膜炎、網膜症、高血圧性網膜症、糖尿病性網膜症、慢性ドライアイ、エイズ関連視力喪失、弱視、半盲、網膜静脈閉塞症、トラコーマ、円錐角膜、脈絡網膜の炎症、中心性漿液性網膜症、ブドウ膜炎、網膜ジストロフィー、浮腫、緑内障及び白内障から成る群から選択される。
〔００７６〕 関連した態様では、黄斑変性症は加齢性黄斑変性症である。
〔００７７〕 関連した態様では、黄斑変性症はドライ加齢性黄斑変性症またはウェット加齢性黄斑変性症である。
〔００７８〕 別の態様では、本開示は、線維症を有する対象に、本明細書に記載の少なくとも１つの核酸分子及び医薬的に許容可能な担体を含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、線維症の治療方法を提供する。
〔００７９〕 関連した態様では、線維症は、肺線維症、腎線維症及び嚢胞性線維症から選択される。
〔００８０〕 別の態様では、本開示は、心血管疾患を有する対象に、本明細書に記載の少なくとも１つの核酸分子及び医薬的に許容可能な担体を含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、心血管疾患の治療方法を提供する。
〔００８１〕 関連した態様では、心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、心肥大関連状態及び血管障害から選択される。
〔００８２〕 別の態様では、本開示は、癌を有する対象に、本明細書に記載の少なくとも１つの核酸分子及び医薬的に許容可能な担体を含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療方法を提供する。
〔００８３〕 関連した態様では、癌は、膀胱癌、肺癌、乳癌、黒色腫、結腸及び直腸癌、リンパ腫、子宮内膜癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、白血病並びに甲状腺癌から選択される。
〔００８４〕 関連した態様では、本明細書に記載の核酸分子のいずれか１つはアプタマーである。
〔００８５〕 別の態様では、本開示は、ＰＤＧＦ及び／またはＶＥＧＦによって媒介される疾患または病気を予防する、治療する及び／または改善する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ＰＤＧＦアプタマー、ＶＥＧＦアプタマー及び／もしくはＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ−Ｂアプタマー構築物またはこれらのいずれかを含む医薬組成物を、哺乳動物などの対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。特に、線維症、アテローム性動脈硬化症、黄斑変性症、糖尿病性網膜症及び／または癌を治療する、予防する及び／または改善する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ及び／またはＶＥＧＦによって媒介される疾患または病気は、ＰＤＧＦ及び／またはＶＥＧＦの活性が、疾患または病気に直接的または間接的に寄与し得るものである。そうした疾患または病気としては、限定されないが、線維症、アテローム性動脈硬化症、黄斑変性症、糖尿病性網膜症及び癌が挙げられる。いくつかの実施形態では、治療、予防及び／または改善される疾患または病気は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症または他の眼部疾患、例えば、緑内障、慢性ドライアイ、エイズ関連視力喪失、弱視、半盲、網膜静脈閉塞症、トラコーマ、円錐角膜、脈絡網膜の炎症、中心性漿液性網膜症、ブドウ膜炎、網膜炎、高血圧性網膜症、網膜ジストロフィーなどである。いくつかの実施形態では、治療、予防及び／または改善される疾患または病気は、腎線維症または腎臓癌である。
〔００８６〕 いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるアプタマー及びアプタマー構築物は、バイオマーカーの発見及び診断（Ｏｓｔｒｏｆｆ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５：ｅ１５００３；Ｍｅｈａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ３５１５７）から組織化学及びイメージング（Ｇｕｐｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．１９：２７３）におよぶ潜在的用途を有する。
〔００８７〕 いくつかの実施形態では、治療効果（例えば、線維症、アテローム性動脈硬化症、黄斑変性症または癌などを治療する、予防する及び／または改善すること）は、ＰＤＧＦアプタマー、ＶＥＧＦアプタマー及び／またはＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物を投与し、その結果、アプタマーまたはアプタマー構築物がＰＤＧＦ及び／またはＶＥＧＦに曝露され、ＰＤＧＦ及び／またはＶＥＧＦに結合することによって、達成され得る。いくつかの実施形態では、そうした結合は、治療を受ける対象へのアプタマーの送達方法にかかわらず生じる。いくつかの実施形態では、治療効果は、ＰＤＧＦアプタマー、ＶＥＧＦアプタマーまたはＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物を投与し、その結果、それらが、ＰＤＧＦ及び／またはＶＥＧＦに曝露され、ＰＤＧＦ及び／またはＶＥＧＦに結合し、１つまたは複数の細胞受容体へのＰＤＧＦ及び／またはＶＥＧＦの結合を防止するまたは低減することによって、達成され得る。
〔００８８〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢへのＰＤＧＦアプタマーの結合は、ＰＤＧＦ−α受容体へのＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢの結合を妨げる。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢへのＰＤＧＦアプタマーの結合は、ＰＤＧＦ−β受容体へのＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢの結合を妨げる。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢに対するＰＤＧＦアプタマーは、ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦ−α受容体及び／またはＰＤＧＦ−β受容体など）のリン酸化を低減する。
〔００８９〕 いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１１０、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８９またはＶＥＧＦの別の選択的スプライシングされたもしくは機能的に活性なタンパク質分解断片へのＶＥＧＦアプタマーの結合は、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）への増殖因子の結合を妨げる。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１１０、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８９またはＶＥＧＦの別の選択的スプライシングされたもしくは機能的に活性なタンパク質分解断片へのＶＥＧＦアプタマーの結合は、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）への増殖因子の結合を妨げる。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦ−１受容体及び／またはＶＥＧＦ−１受容体など）のリン酸化を低減する。
〔００９０〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物は、ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦ−α受容体及び／またはＰＤＧＦ−β受容体など）のリン酸化レベルを低減し、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ−１及び／またはＶＥＧＦＲ−２など）のリン酸化レベルを低減する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマー、ＶＥＧＦアプタマーまたはＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物は、ＰＤＧＦ受容体及び／またはＶＥＧＦ受容体のシグナル伝達経路に沿ったシグナリングを低減する。
〔００９１〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマー、ＶＥＧＦアプタマーまたはＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物は、１種または複数のさらなる活性薬剤とともに投与される。そのような投与は、連続的でもよいし、組み合わせてもよい。
〔００９２〕 いくつかの実施形態では、インビトロ診断法は、ＰＤＧＦを含む疑いがある試料にＰＤＧＦアプタマーを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、インビボ診断法は、適切に標識されたＰＤＧＦアプタマーをＰＤＧＦ媒介性の疾患または障害を有する疑いがある個体に投与することを含み、ここでは、標識されたＰＤＧＦアプタマーは、個体の健康状態を診断または評価する目的で検出される。使用されるイメージング様式に従って、使用される標識を選択することができる。
〔００９３〕 いくつかの実施形態では、インビトロ診断法は、ＶＥＧＦを含む疑いが
ある試料にＶＥＧＦアプタマーを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、インビボ診断法は、適切に標識されたＶＥＧＦアプタマーをＶＥＧＦ媒介性の疾患または障害を有する疑いがある個体に投与することを含み、ここでは、標識されたＶＥＧＦアプタマーは、個体の健康状態を診断または評価する目的で検出される。使用されるイメージング様式に従って、使用される標識を選択することができる。
〔００９４〕 いくつかの実施形態では、インビトロ診断法は、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物をＰＤＧＦ及び／またはＶＥＧＦを含む疑いがある試料と接触させることを含む。別の態様では、本開示は、適切に標識されたＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物を得ること、標識されたＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物をＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ媒介性の疾患または障害を有する疑いがある個体に注射すること、及び個体の健康状態を診断または評価する目的で、標識されたＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物を検出することを含むインビボ診断法を提供する。使用されるイメージング様式に従って、使用される標識を選択することができる。
〔００９５〕 いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＤＧＦアプタマー及びＶＥＧＦアプタマーを含むアプタマー構築物を提供する。
〔００９６〕 いくつかの実施形態では、本開示は、主に疎水性相互作用を介して効率的にタンパク質に結合するアプタマーを提供する。
〔００９７〕 いくつかの実施形態では、本開示は、アプタマーが実質的に疎水性相互作用を介してタンパク質に結合する、アプタマー−タンパク質複合体を提供する。
〔００９８〕 いくつかの実施形態では、本開示は、タンパク質標的との共結晶複合体を形成することができるアプタマーであって、複合体が７個より少ない水素結合を含む、アプタマーを提供する。
〔００９９〕 いくつかの実施形態では、本開示は、タンパク質標的との共結晶複合体を形成することができるアプタマーであって、複合体が、１６個以下のヌクレオチドを含むシュードノットドメインを含む、アプタマーを提供する。
〔００１００〕 いくつかの実施形態では、本開示は、タンパク質標的に結合することができるアプタマーであって、１００Å２の界面面積あたり１以下の極性接触でタンパク質標的に結合し、極性接触が、１つまたは複数の水素結合及び１つまたは複数の電荷−電荷相互作用を含み、界面面積が、アプタマーに占有されるタンパク質表面領域部分である、アプタマーを提供する。
〔００１０１〕 別の態様では、本開示は、核酸配列：５’−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｚ−Ｚ−Ｃ１−Ａ−Ａ−Ｇ１−Ｚ−Ｇ−Ｃ１−Ｚ−Ｚ−Ｇ１−Ｚ−Ａ１−Ｇ１−Ｇ−Ａ−Ｚ−Ｚ1−
Ｚ−Ａ２−Ａ２−Ａ２−Ｚ−Ｇ１−Ｇ１−３’（配列番号８３６）を含む核酸分子を提供し、ここでは、Ｃ１は、独立に、それぞれの出現について、シチジン、デオキシシチジン及び２’−Ｏ−メチルシチジンから成る群から選択され；Ｇ１は、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、デオキシグアノシン及び２’−Ｏ−メチルグアノシンから成る群から選択され；Ｚは、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン及び５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）から成る群から選択され；Ｚ１は、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）及び２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）から成る群
から選択され；Ａ１は、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、デオキシアデノシン及び２’−Ｏ−メチルアデノシンから成る群から選択され；Ａ２は、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、ホスホロチオエート結合を含むアデノシン、デオキシアデノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンから成る群から選択され；ここでは、核酸分子は、少なくとも１、２、３、４または５個のホスホロチオエート結合を含む。
〔００１０２〕 関連した態様では、Ｃ１は、２’−Ｏ−メチルシチジンである。関連した態様では、Ｇ１は、２’−Ｏ−メチルグアノシンである。関連した態様では、Ｚは、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である。関連した態様では、Ｚ１は、２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である。関連した態様では、Ａ１は、２’−Ｏ−メチルアデノシンである。関連した態様では、Ａ２は、ホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンである。
（Ａ）３つの低オフ速度（ｓｌｏｗ ｏｆｆ ｒａｔｅ）修飾アプタマー及びアプタマーＥ１００３０に関するＫｄ値の測定；（Ｂ）本明細書に記載の３つのＰＤＧＦアプタマー及びスクランブルされた対照オリゴヌクレオチドによる、ＰＤＧＦＲβのＰＤＧＦ−ＢＢ刺激性リン酸化の阻害；（Ｃ）親アプタマー４１４９−８＿１３０に対する修飾アプタマーのＫｄ比（ここでは、親アプタマーと比較して、特定のＢｎ−ｄＵ核酸塩基が別の修飾ｄＵ核酸塩基に置き換えられている）（１の値は、修飾アプタマーがＰＤＧＦＲβのリン酸化を親と同様に阻害することを示すが、１超の値は、修飾アプタマーが親と比較して阻害活性が弱いことを示す）を示す図である。 同上。 実施例２に記載されている、（Ａ）アプタマー４１４９−８＿２６０の分子内接触及びアプタマー−ＰＤＧＦ接触の表；（Ｂ）非極性分子内接触及びアプタマー−ＰＤＧＦ接触の描写；及び（Ｃ）極性分子接触内及びアプタマー−ＰＤＧＦ接触の描写を示す図である。疎水性（非極性）相互作用は、π−π相互作用（面−面と端−面の両方の芳香族相互作用）及びファンデルワールス接触（ｖＷ）を含む。極性相互作用は、水素結合（破線）及び電荷−電荷相互作用（実線を含む。ある種のアプタマー残基（例えば、ｄＣ４、ｄＧ６、ｄＡ９、ｄＣ１０、ｄＣ１２、ｄＧ１３、ｄＣ１４、ｄＧ１５、ｄＧ２２、ｄＣ２３及び２’−Ｏ−メチルＧ２４）は、Ｂ及びＣで示すように、標準の塩基対合及び塩基スタッキングに関与し、２’−Ｏ−メチルＡ１１は押し出されている。 同上。 実施例１に記載されている、（Ａ）４５４ピロシーケンシングによって決定されたＳＥＬＥＸプールからの一連のクローンに対するコンセンサス配列、及び各位置でのヌクレオチドの出現頻度及びこれらのクローンのうちの６つに対する配列；並びに（Ｂ）示されるように修飾された、親アプタマー４１４９−８に基づく修飾アプタマーに対するＫｄ値を示す図である。 同上。 実施例２に記載されている、ＰＤＧＦ−ＢＢ：４１４９−８＿２６０複合体のある種の立体像を図示する図である。 実施例３に記載されている、（Ａ）２００ｎＭ ｔＲＮＡの存在下及び非存在下での、異なるＰＤＧＦ二量体アイソフォームに対する様々なアプタマーの結合親和性；及び（Ｂ）ＰＤＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ及び−Ｄの成熟型に対するアミノ酸配列のアライメントを示す図である。ＰＤＧＦ−Ａに対する太字で示すアミノ酸残基はプロペプチド結合に関与し、ＰＤＧＦ−Ｂに対する太字で示すアミノ酸残基は、ＰＤＧＦＲβ結合に関与する（Ｓｈｉｍ ｅｔ ａｌ，（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７（２５）：１１３０７）。陰影付きボックスは、アプタマー４１４９−８＿２６０の、ＰＤＧＦ−Ｂ鎖１（濃い陰影付き）及びＰＤＧＦ−Ｂ鎖２（薄い陰影付き）への結合に関与する残基を示す。 実施例１に記載されている、（Ａ）アプタマー４１４９−８＿３８（配列番号３８）のそれぞれの示された位置を３つの炭素のＣ−３リンカーで置換することによって作製された修飾アプタマーのＫｄ比、及びＰＤＧＦ−ＢＢ結合、ＰＤＧＦ−ＡＢ結合に対するＫｄ値、並びに親アプタマー４１４９−８に基づく５つの修飾アプタマーに対する細胞のＩＣ５０；並びに（Ｂ）親アプタマー４１４９−８＿１３０（配列番号１３０）に基づく修飾アプタマーに対するＫｄ比（ここでは、親アプタマーと比較して、特定のＢｎ−ｄＵ核酸塩基が別の修飾ｄＵ核酸塩基に置き換えられている）（１未満の数は、修飾アプタマーが親アプタマーよりも親和性が大きいことを示し、１超の数は、修飾アプタマーが親アプタマーよりも親和性が低いことを示す）示す図である。 同上。 実施例２に記載されている、（Ａ）アプタマー４１４９−８＿２６０（配列番号２１１）に結合したＰＤＧＦ−ＢＢホモ二量体のリボン図；及び（Ｂ）ＰＤＧＦ−Ｂサブユニットに結合した場合のアプタマーコンフォメーションの模式的描写及び構造的描写を示す図である。非標準塩基対は、Ｌｅｏｎｔｉｓ及びＷｅｓｔｈｏｆの命名法（Ｌｅｏｎｔｉｓ Ｎ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１３（３）：３００）に基づいてコード化される。ダークグレー＝ＰＤＧＦ−Ｂ鎖１；ライトグレー＝ＰＤＧＦ−Ｂ鎖２；Ｂｎ＝Ｂｎ−ｄＵ、Ｐｅ＝Ｐｅ−ｄＵ、Ｔｈ＝Ｔｈ−ｄＵ。 同上。 図８Ａ〜Ｌは、実施例２に記載されている、ＰＤＧＦ−ＢＢ：４１４９−８＿２６０アプタマー複合体の結晶構造からの、ＰＤＧＦアプタマーのある種の構造的特徴を図示する。図８Ａは、ドメイン、塩基対合及びスタッキング相互作用を示す、アプタマー構造を図示する。ミニノットのステムは、かなりのバックリング及びプロペラ角度並びにらせんの巻き方が少ない（ｕｎｄｅｒｗｉｎｄｉｎｇ）の理由から、Ｂ型ＤＮＡから著しく逸脱する。Ｂｎ２０は、Ｕ８とのスタッキングを介して５’ステムと接続するヒンジである。図８Ｂは、ステム１（Ｓ１）の端面図を図示する。図８Ｃは、Ｓ１及びＬ２の側面図を図示する。修飾ヌクレオチドは、ミニノットのＢｎ１６、Ｐｅ１７、Ｔｈ１８及びＢｎ２０と相互作用する５’ステムのＢｎ２、Ｂｎ７及びＢｎ８と疎水性クラスターを形成する。Ｂｎ８は、Ｂｎ１６及びＢｎ２０と端−面π−π相互作用する。非標準ｄＵ−ｄＵ塩基対は、Ｂｎ２０のアミドリンカーへＨ結合を利用する。図８Ｄは、Ｐｅ−ｄＵ１７とＢｎ−ｄＵ２０の間の非標準塩基対の詳細を図示する。図８Ｅは、ミニノットＳ１の塩基を安定化させる芳香族相互作用を図示する。図８Ｆは、Ｓ１のＣ１０−Ｇ１５ワトソン‐クリック対とＬ２ヌクレオチド、Ａ２１の間に形成される塩基トリプルを図示する。この塩基トリプルのＬｅｏｎｔｉｓ−Ｗｅｓｔｈｏｆ分類は、シスワトソン‐クリック／ワトソン‐クリック、トランス糖端／フーグスティーン（Ｌｅｏｎｔｉｓ Ｎ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１３：３００）である。Ａ２１とＧ１５の間に３４°のプロペラねじり角度があり、ワトソン・クリック塩基対間にかなりのバックリング及びプロペラのねじれがあるので（表５）、塩基トリプルは平面状ではない。図８Ｇは、Ｌ１中の単一の押し出された塩基である残基ｍＡ１１及び骨格回転を図示する。図８Ｈは、Ｓ２の軸方向像である。図８Ｉは、Ｂ型ＤＮＡからの著しい逸脱を強調する、５’ステムモチーフの軸方向像を図示する。包括的なＣ１’−Ｃ１’らせんパラメーターは、ｄＵ−ｄＵ対が過度にねじれており（４０°）、その結果、Ｂｎ−ｄＵ１とＢｎ−ｄＵ２の間で直線近く（約１７２°）まで平らになる約１２４°の屈曲が骨格中に生じることを示す。Ｂｎ−ｄＵ７−Ｂｎ−ｄＵ８間の著しい半径方向変位（ｒａｄｉａｌ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）及びＢｎ−ｄＵ２−ｄＡ３間の０に近い変位は、塩基２〜４とび６〜７の間により大きなスタッキングの重複をもたらす。図８Ｊは、Ｂｎ−ｄＵ２とＢｎ−ｄＵ８の間の非標準塩基対を図示する。図８Ｋは、修飾ヌクレオチドによって形成されるドメイン間接合部を図示する。図８Ｌは、ドメイン間接合部のトポロジーを規定するＢｎ１６及びＢｎ２０との端−面π−π相互作用を起こす、Ｂｎ８を図示する。アプタマー４１４９−８＿２６０（配列番号２１１）の位置８のＢｎ−ｄＵをｉＢ−ｄＵ（配列番号２５５）で置換することの有害な影響は、図８Ｍ及び図８Ｎに示す空間充填像で明らかである。Ｂｎ８（８Ｍ）は、隣接した芳香族基とエネルギー的に有利なπ−π相互作用を起こすことができ、ＳＯＭＡｍｅｒをより密に充填させる。これに対して、ｉＢ８（８Ｎ）は芳香族ではないので、隣接した芳香族基とπ−スタッキング相互作用する能力を欠く。さらに、ｉＢ基は、大きなものではなく、疎水性クラスターの中央に孔を残す。 同上。 同上。 実施例２に記載されている、ある種のタンパク質−アプタマー相互作用を図示する図である。図９Ａでは、Ｂｎ−ｄＵ１は、ホモ二量体界面での塩橋下のポケットを占有する。Ｕ１塩基は、Ｖａｌ３９でタンパク質骨格へ水素結合するが、一方でベンジル環は、Ａｒｇ５６の脂肪族側鎖とＣｙｓ４３−Ｃｙｓ５２のジスルフィド結合の間に挟まれている。図９Ｂでは、Ｂｎ２はＴｒｐ４０とのエッジワイズ相互作用を有し、Ａｓｎ５５及びＬｅｕ３８のメチレン側鎖間に位置する。図９Ｃは、Ｂｎ７の芳香族環が、Ａｓｎ５４及びＡｓｎ５５側鎖の脂肪族部分に対して折り重ねる（ｔｕｃｋｓ ｕｐ）ことを図示する。図９Ｄは、Ｌｅｕ３８及びＩｌｅ７５の側鎖がＢｎ−ｄＵ８のベンジル環に疎水性面を提供して、タンパク質と接触していることを図示する。図９Ｅは、Ｂｎ１６が、Ｔｒｐ４０との端−面π−スタッキング及びＡｒｇ７３の脂肪族領域とのファンデルワールス接触を有することを図示する。図９Ｆは、Ｐｅ１７が、Ｌｅｕ３８、Ｔｒｐ４０、Ａｒｇ７３及びＩｌｅ７５の疎水性側鎖で取り囲まれていることを図示する。Ａｒｇ７３はＰｅ−ｄＵ１７のアミドリンカーと水素結合し、アプタマー骨格と電荷−電荷相互作用する。図９Ｇは、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５及びＰｈｅ８４の疎水性側鎖に取り囲まれたＴｈ１８を図示する。図９Ｈは、タンパク質とアプタマーの間のスタッキング相互作用が、Ｐｒｏ８２とＢｎ２０とＵ８との間に存在し、Ｐｈｅ８４がＵ２０と端−面接触することを図示する。Ｂｎ２０は、Ｉｌｅ７７及びＬｙｓ８０へさらに疎水性接触する。 極性接触（水素結合プラス電荷−電荷相互作用）の数及び接触表面領域について解析された、従来のアプタマー（ＰＤＢ ＩＤ：ｖＷＦ、３ＨＸＯ；トロンビン、３ＱＬＰ；ＧｌｎＲｓ ｔＲＮＡ、１ＥＸＤ；ヒトＩｇＧ、３ＡＧＶ；ＭＳ２外被タンパク質、６ＭＳＦ；ＮＦ−ｋＢ、１ＯＯＡ）の６つの共結晶構造を示す図である。結果を、これら６つのアプタマー−標的複合体（ダークグレーの棒）について並びにＰＤＧＦ−ＳＬ５（４１４９−８＿２６０）複合体及び２つの未発表のＳＯＭＡｍｅｒ−標的構造体を含めた３つのＳＯＭＡｍｅｒ（ライトグレーの棒）について報告された結合親和性に対してプロットする。６つの従来のアプタマーに関する極性接触の数と接触表面領域の間の関連性を線形回帰によって解析し、９９％信頼区間を図の底部にグレーの陰影で示す。図１０Ｂは、Ｐｅ−ｄＵ１７及びＴｈ−ｄＵ１８によって示される、ＰＤＧＦ−ＳＯＭＡｍｅｒ複合体の形状相補性を図示する。左、ＰＤＧＦ鎖１をダークグレー面として示し、Ｐｅ−ｄＵ１７及びＴｈ−ｄＵ１８を空間充填表示として示す。右、スティック図としてＰｅ−ｄＵ１７を示す以外は、左のパネルと同じ図である。図１０Ｃは、ＰＤＧＦとのＢｎ−ｄＵ１の相互作用の詳細を図示し、ＰＤＧＦ鎖１をダークグレー面として示し、ＰＤＧＦ鎖２をライトグレー面として示し、Ｂｎ−ｄＵ１を空間充填表示として示す。 ＰＤＧＦ−ＢＢに結合しているＳＬ５とＰＤＧＦＲβの比較を示す図である。（Ａ）ＰＤＧＦホモ二量体（鎖１、ミディアムグレー；鎖２、ライトグレー）及びダークグレーで着色された受容体細胞外ドメインを示す受容体の共結晶（Ｓｈｉｍ，Ａ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７（２５）：１１３０７から）。（Ｂ）ＰＤＧＦホモ二量体の複合体（鎖１、ミディアムグレー；鎖２、ライトグレー）及びＳＬ５（ダークグレー）。（Ｃ）ＰＤＧＦ−Ｂ成熟型のアミノ酸配列。陰影付きボックスは、４１４９−８＿２６０、ＰＤＧＦＲβまたは両方への接触残基を示す。４１４９−８＿２６０と４Åの接触をするが、ＰＤＧＦＲβと接触しないＰＤＧＦ残基を陰影なしで枠で囲む。ＰＤＧＦＲβと４Åの接触をするが、４１４９−８＿２６０と接触しないＰＤＧＦ残基をダークグレーの陰影付きで枠で囲む。４１４９−８＿２６０とＰＤＧＦＲβの両方と４Åの接触をするＰＤＧＦ残基をミディアムグレーの陰影をつけて枠で囲む。 低オフ速度アプタマーなどのアプタマー中に組み込むことができるある種の例示的Ｃ−５ピリミジン修飾を図示する図である。 図１２の続き。 図１２の続き。 実施例４に記載されている、ＳＯＭＡｍｅｒ ４１４９−８＿３７９（ＯＨ−４１４９−８＿３７９として表示される）または５’アミノリンカー修飾されたＳＯＭＡｍｅｒ ４１４９−８＿３７９（Ｎ−４１４９−８＿３７９として表示される）を用いた、Ｈｓ２７線維芽細胞におけるＰＤＧＦ−ＢＢ誘導性ＰＤＧＦ Ｒβリン酸化の阻害の代表的なプロットを示す図である。 実施例５に記載されている、４５４ピロシーケンシングによって決定されたＳＥＬＥＸプールからの一連のＰＤＧＦ−結合クローンに対するコンセンサス配列、及び各位置でのヌクレオチドの出現頻度を示す図である。 実施例７に記載されている、親アプタマー４８６７−３１＿１４３に基づく修飾アプタマーに対するＫｄ比を示す図である。特定のＮａｐ−ｄＵ核酸塩基が、親アプタマーと比較して、別の修飾ｄＵ核酸塩基に置き換えられている（１未満の数は、修飾アプタマーが親アプタマーよりも親和性が大きいことを示し、１超の数は、修飾アプタマーが親アプタマーよりも親和性が低いことを示す）。 図１５の続き。 実施例７に記載されている、４５４ピロシーケンシングによって決定されたＳＥＬＥＸプールからの一連のＶＥＧＦ結合クローンに対するコンセンサス配列、及び各位置でのヌクレオチドの出現頻度を示す図である。 実施例９に記載されている、ＶＥＧＦ−１２１またはＶＥＧＦ−１６５並びにＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１＿４３及び４８６７−３１＿１９２で刺激されたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における、ＶＥＧＦＲ２のリン酸化パーセントを示す図である。 （Ａ）実施例１１に記載されている、ＰＤＧＦアプタマー４１４９−８＿３７９（白丸）及びＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物４１４９−８＿４０１（黒丸）を用いた、Ｈｓ２７線維芽細胞におけるＰＤＧＦ誘導性ＰＤＧＦ Ｒβリン酸化の阻害；並びに（Ｂ）ＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１＿１９２（白丸）及びＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物４１４９−８＿４０１（黒丸）を用いた、ＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦ誘導性ＶＥＧＦ Ｒ２リン酸化の阻害を示す図である。 実施例１２に記載されている、（Ａ）ビオチン標識ＰＤＧＦを加えた、ＶＥＧＦでコーティングされたマイクロタイタープレート及び（Ｂ）ビオチン標識ＶＥＧＦを加えた、ＰＤＧＦでコーティングされたマイクロタイタープレート上での、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物ＳＬ１０１２（２０ｋＤａ ＰＥＧ−Ｎ−４１４９−８＿４０１）による、ＰＤＧＦとＶＥＧＦの同時結合を示す図である。 実施例１２に記載されている、ビオチン標識ＶＥＧＦを加えた、ＰＤＧＦでコーティングされたマイクロタイタープレート上での、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物（Ａ）ＳＬ１０１２（２０ｋＤａ ＰＥＧ−Ｎ−４１４９−８＿４０１）及び（Ｂ）ＳＬ１０１３（４０ｋＤａ ＰＥＧ−Ｎ−４１４９−８−４０１）による、ＰＤＧＦとＶＥＧＦの同時結合を示す図である。 実施例１２に記載されている、（Ａ）ビオチン標識ＰＤＧＦを加えた、ＶＥＧＦでコーティングされたマイクロタイタープレート及び（Ｂ）ビオチン標識ＶＥＧＦを加えた、ＰＤＧＦでコーティングされたマイクロタイタープレート上での、様々なＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物による、ＰＤＧＦとＶＥＧＦの同時結合を示す図である。 実施例２に記載されている、（Ａ）極性接触の数（水素結合と電荷−電荷相互作用の合計と定義される）対従来のアプタマー（菱形）及びＳＯＭＡｍｅｒ（円）に関する界面面積（線形回帰当てはめは、０．０１６の傾きを伴うＲ２＝０．９１を有する；破線は、このトレンドの９９％信頼区間を表し、ＳＯＭＡｍｅｒはこれらの境界の外側にある）のプロット、（Ｂ）自由エネルギー結合対従来のアプタマー（菱形）及びＳＯＭＡｍｅｒ（円）に関する極性接触（線形回帰当てはめは、０．０７３の傾きを伴うＲ２＝０．６４を有する）のプロット、並びに（Ｃ）６つの以前のアプタマー−タンパク質結晶構造及びＰＤＧＦ−ＢＢ：４１４９−８＿２６０を含めた３つのＳＯＭＡｍｅｒ−タンパク質結晶構造の様々な熱力学特質及び接触特性を示す表を示す図である。（Ｃ）タンパク質標的に結合したアプタマー及びＳＯＭＡｍｅｒに関する相互作用の特徴（図の参考文献：（ａ）Ｃｏｎｖｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５（２）：１３３；（ｂ）Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３８（２１）：７８２２；（ｃ）Ｐａｇａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．９４（２）：５６２；（ｄ）Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００（１６）：９２６８；（ｅ）Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １７（１１）：１４７６；（ｆ）Ｂｕｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７（６）：４９７。自由エネルギーの計算は、以下の温度：ＭＳ２、トロンビン、ＮＦｋＢ、ｖＷＦ及びＧｌｎＲｓ、室温（２９６Ｋ）；ＩｇＧ、２９８Ｋ；ＳＯＭＡｍｅｒ、３１０Ｋを使用して、ＳＯＭＡｍｅｒに対する測定した結合親和性または発表されたＫｄ値から決定した。ＳＯＭＡｍｅｒは、より高い結合親和性へのトレンドを示し；結合の平均自由エネルギーまたは−ΔＧ値は、６つのアプタマーについて１１．４±１．３ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、３つのＳＯＭＡｍｅｒについて１４．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ±０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌである。各リガンドの４Å内のタンパク質接触原子をＰｙＭＯＬにおいて決定した。界面面積の計算は、ＰＩＳＡ（アプタマー）（Ｋｒｉｓｓｉｎｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７２（３）：７７４）またはＰｙＭＯＬ（ＳＯＭＡｍｅｒｓ）（ＤｅＬａｎｏ （２００２）Ｔｈｅ Ｐｙｍｏｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｄｅｌａｎｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）を用いて行った。結晶学的に評価された相互作用に関するこの比較的小さなデータセット内で、ＳＯＭＡｍｅｒについての非水素接触原子あたり０．１６±０．０４ｋｃａｌ／ｍｏｌと比較して、アプタマーは、非水素接触原子あたり０．２１±０．１４ｋｃａｌ／ｍｏｌの平均リガンド効率でその標的に結合する。界面面積あたりの結合の自由エネルギーも同様であり、アプタマーに対して０．０１７±０．００９ｋｃａｌ・ｍｏｌ−１・Å−２、及びＳＯＭＡｍｅｒに対して０．０１２±０．００１ｋｃａｌ・ｍｏｌ−１・Å−２という平均値を有する。表中の値から計算された、極性接触あたりの結合の自由エネルギーの値は、ＳＯＭＡｍｅｒ（極性接触あたり平均１．７５±０．３６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）が、アプタマー（極性接触あたり０．８９±０．５６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の約２倍の大きさである。 同上。 実施例１４に記載されている、残存全長アプタマー４８６７−３１＿１９２（２５０ｎＭの出発濃度）のパーセント対０．００２ユニット／μＬのＤＮａｓｅ Ｉ（Ａ）または０．２４ユニット／μＬのＤＮａｓｅ ＩＩ（Ｂ）で、指定の時間数にわたって３７℃で消化した時間のプロットを示す図である。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって消化産物を全長アプタマーから分離し、バンドをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄで可視化した。全長アプタマーバンドのパーセントをデンシトメトリーによって決定した。 実施例１４に記載されている、残存全長アプタマー（２５０ｎＭの出発濃度）のパーセント対０．２４ユニット／μＬのＤＮａｓｅ ＩＩとともに、指定の時間数にわたって３７℃でインキュベートした時間のプロットを示す図である。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって消化産物を全長アプタマーから分離し、バンドをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄで可視化した。アプタマー識別番号（アプタマーＩＤ番号）で示されるように、残存全長アプタマーのパーセントをデンシトメトリーによって決定した。アプタマーＩＤ番号４８６７−３１＿１９２に対するプロットは、図２３Ｂで示すものと同じプロットである。 実施例１４に記載されている、残存全長アプタマー（５００ｎＭの出発濃度）のパーセント対ニュージーランドホワイトウサギから得られた９０％硝子体液において、指定の時間数にわたって３７℃でインキュベートした時間のプロットを示す図である。（アプタマーをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄで染色した。アプタマー識別番号（アプタマーＩＤ番号）で示されるように、残存全長アプタマーのパーセントをデンシトメトリーによって決定した。 実施例１４に記載されている、残存全長アプタマー５１６９−４＿１４６（２５０ｎＭの出発濃度）のパーセント対０．０１ユニット／μＬのＤＮａｓｅ Ｉ（Ａ）または０．１２ユニット／μＬのＤＮａｓｅ ＩＩ（Ｂ）で、指定の時間数にわたって３７℃で消化した時間のプロットを示す図である。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって消化産物を全長アプタマーから分離し、バンドをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄで可視化した。全長アプタマーのパーセントをデンシトメトリーによって決定した。 実施例１４に記載されている、残存全長アプタマー５１６９−４＿１８２（２５０ｎＭの出発濃度）のパーセント対０．０１ユニット／μＬのＤＮａｓｅ Ｉとともに、指定の時間数にわたって３７℃でインキュベートした時間のプロットを示す図である。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって消化産物を全長アプタマーから分離し、バンドをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄで可視化した。全長アプタマーのパーセントをデンシトメトリーによって決定した。 実施例１４に記載されている、残存全長アプタマー（５００ｎＭの出発濃度）のパーセント対ニュージーランドホワイトウサギから得られた９０％硝子体液において、指定の時間数にわたって３７℃でインキュベートした時間のプロットを示す図である。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって消化産物を全長アプタマーから分離し、バンドをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄで可視化した。アプタマー識別番号（アプタマーＩＤ番号）で示されるように、全長アプタマーのパーセントをデンシトメトリーによって決定した。 実施例１４に記載されている、残存全長アプタマー（２５０ｎＭの出発濃度）のパーセント対０．０１ユニット／μＬのＤＮａｓｅ Ｉとともに、指定の時間数にわたって３７℃でインキュベートした時間のプロットを示す図である。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって消化産物を全長アプタマーから分離し、バンドをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄで可視化した。アプタマー識別番号（アプタマーＩＤ番号）で示されるように、残存全長アプタマーのパーセントをデンシトメトリーによって決定した。 実施例１４に記載されている、残存全長アプタマー４１４９−８＿３７９（２５０ｎＭの出発濃度）のパーセント対０．１２ユニット／μＬのＤＮａｓｅ ＩＩとともに、指定の時間数にわたって３７℃でインキュベートした時間のプロットを示す図である。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって消化産物を全長アプタマーから分離し、バンドをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄで可視化した。全長アプタマーのパーセントをデンシトメトリーによって決定した。 実施例１４に記載されている、残存全長アプタマー（２５０ｎＭの出発濃度）のパーセント対０．１２ユニット／μＬのＤＮａｓｅ ＩＩとともに、指定の時間数にわたって３７℃でインキュベートした時間のプロットを示す図である。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって消化産物を全長アプタマーから分離し、バンドをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄで可視化した。アプタマー識別番号（アプタマーＩＤ番号）で示されるように、全長アプタマーのパーセントをデンシトメトリーによって決定した。アプタマーＩＤ番号４１４９−８＿３７９に対するプロットは、図３０で示すものと同じプロットである。
〔00133〕 次に、本発明の代表的な実施形態について詳細に言及する。列挙した実施
形態とともに本発明を説明するが、本発明がそれらの実施形態に限定されることを意図す
るものではないことを理解されたい。それどころか、本発明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得るすべての代替物、変更及び均等物をカバーすることが意図される。
〔00134〕 本発明の実施で使用することができ、本発明の実施の範囲内である、本明
細書に記載のものと同様または均等な多くの方法及び材料を、当業者なら認識するであろう。本発明は、記載される方法及び材料に決して限定されるものではない。
〔00135〕 別段規定されない限りは、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は
、本発明が属する分野（複数可）の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または均等ないかなる方法、装置及び材料も本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法、装置及び材料を次に記載する。
〔00136〕 本開示で引用されるすべての刊行物、公開特許文献及び特許出願は、本開
示が関係する分野（複数可）の技術レベルの指標となる。本明細書で引用されるすべての刊行物、公開特許文献及び特許出願は、あたかも、それぞれ個々の刊行物、公開特許文献または特許出願が参照により組み込まれると具体的に及び個々に示されたのと同じ程度で、参照により本明細書に組み込まれる。
〔00137〕 添付の特許請求の範囲を含めて、本開示で使用する場合、単数形「ａ」、
「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈において特に明記しない限り、複数形の意味を含み、「少なくとも１つの」及び「１つまたは複数の」と互換的に使用される。したがって、「１つのアプタマー」に対する言及は、アプタマーの混合物などを含む。
〔00138〕 本明細書で使用する場合、用語「約」は、数値が関連する事項の基本的機
能が変化しないような、数値のわずかな修正または変動を表す。
〔00139〕 本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む
こと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含むこと（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」及びそれらの任意の変形は、非排他的包含をカバーすることが意図され、したがって、要素または要素のリストを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）または含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）プロセス、方法、プロセスによる生成物、または物質の組成物は、それらの要素のみを含むのではなく、明確に列挙されない他の要素、またはそうしたプロセス、方法、プロセスによる生成物または物質の組成物に固有の他の要素を含むことができる。
〔00140〕 本明細書で使用する場合、用語「ヌクレオチド」は、リボヌクレオチドも
しくはデオキシリボヌクレオチドまたはそれらの修飾型及びそれらの類似体を指す。ヌクレオチドは、プリン（例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、及びそれらの誘導体及び類似体）並びにピリミジン（例えば、シトシン、ウラシル、チミン及びそれらの誘導体及び類似体）を含む種を含有する。
〔00141〕 本明細書で使用する場合、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリ
ヌクレオチド」は、互換的に使用されて、ヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド並びにこれらの種類の核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの修飾体を含み、ここでは、任意の位置でのヌクレオチドユニットへの様々な実体または部分の給合が含まれる。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸」は、二本鎖分子または一本鎖分子及び三重らせん分子を含む。核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、アプタマーという用語よりも広義の用語であ
り、したがって、核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドという用語は、アプタマーである、ヌクレオチドのポリマーを含むが、核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドという用語は、アプタマーに限定されない。
〔00142〕 本明細書で使用する場合、用語「修飾する」、「修飾された」、「修飾」
及びそれらの任意の変形は、オリゴヌクレオチドに関連して使用される場合、オリゴヌクレオチドの４つの構成ヌクレオチド塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｔ／Ｕ及びＣ）の少なくとも１つが天然に存在するヌクレオチドの類似体またはエステルであることを意味する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ抵抗性を与える。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、主にタンパク質標的とのアプタマーの疎水性相互作用を導き、その結果、高い結合効率及び安定な共結晶複合体をもたらす。Ｃ−５位に置換を有するピリミジンは、修飾ヌクレオチドの例である。修飾には、骨格修飾、メチル化、イソ塩基のイソシチジン及びイソグアニジンなどの異例な塩基対合の組み合わせなどが含まれ得る。修飾には、キャップ形成などの３’及び５’修飾も含まれ得る。他の修飾としては、類似体との天然に存在するヌクレオチドの１つまたは複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバミン酸など）を有するもの及び荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有するもの、インターカレーター（例えばアクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、並びに修飾結合（例えばαアノマー核酸など）を有するものを挙げることができる。さらに、ヌクレオチドの糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかを、ホスホネート基もしくはリン酸基に置き換えることができ；標準的な保護基で保護することができ；またはさらなるヌクレオチドもしくは固体支持体へのさらなる結合を調製するように活性化することができる。５’末端及び３’末端のＯＨ基をリン酸化することができ、またはアミン、約１から約２０炭素原子の有機キャップ形成基部分、いくつかの実施形態では約１０から約８０ｋＤａにおよぶポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、いくつかの実施形態では約２０から約６０ｋＤａにおよぶＰＥＧポリマー、もしくは他の親水性もしくは疎水性の生物学的ポリマーもしくは合成ポリマーで置換することができる。いくつかの実施形態では、修飾は、ピリミジンのＣ−５位のものである。これらの修飾は、Ｃ−５位での直接的なアミド結合を介して、または他のタイプの結合によって生成することができる。
〔00143〕 ポリヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フ
ルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環糖類似体、α−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体及び脱塩基ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドを含めた、一般に当技術分野で既知であるリボース糖またはデオキシリボース糖の類似型を含むこともできる。上記のように、１つまたは複数のホスホジエステル結合を代替の連結基に置き換えることができる。これらの代替の連結基としては、リン酸が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）に置き換えられ、ここでは、各ＲまたはＲ’が、独立に、Ｈまたはエーテル（−Ｏ−）結合を任意に含む置換もしくは無置換のアルキル（１〜２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルキルである実施形態が挙げられる。ポリヌクレオチド中のすべての結合が同一である必要はない。例えばポリアミド骨格のような代替の骨格構造と同様に、糖、プリン及びピリミジンの類似型の置換は、最終生成物の設計において有利であり得る。
〔00144〕 本明細書で使用する場合、用語「ヌクレアーゼ」は、オリゴヌクレオチド
のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断することができる酵素を指
す。本明細書で使用する場合、用語「エンドヌクレアーゼ」は、オリゴヌクレオチドの内部の部位でホスホジエステル結合（複数可）を切断する酵素を指す。本明細書で使用する場合、用語「エキソヌクレアーゼ」は、オリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドを結合するホスホジエステル結合（複数可）を切断する酵素を指す。生体液は、一般的には、エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼの両方の混合物を含む。
〔00145〕 本明細書で使用する場合、用語「ヌクレアーゼ抵抗性の」及び「ヌクレア
ーゼ抵抗性」は、オリゴヌクレオチドがエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼの基質として働く能力が低減し、その結果、そうした酵素と接触した場合に、オリゴヌクレオチドが分解されないか、未修飾ヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドよりもゆっくりと分解されることを指す。
〔00146〕 本明細書で使用する場合、用語「Ｃ−５修飾ピリミジン」は、限定されな
いが、図１２に図示される部分を含めた、Ｃ−５位に修飾を有するピリミジンを指す。Ｃ−５修飾ピリミジンの例としては、Ｕ．Ｓ．特許第５，７１９，２７３号及び第５，９４５，５２７号に記載されているものが挙げられる。Ｃ−５修飾の例としては、以下から独立に選択される置換基とのＣ−５位におけるデオキシウリジンの置換が挙げられる：真下に図示するような、ベンジルカルボキシアミド（あるいは、ベンジルアミノカルボニル）（Ｂｎ）、ナフチルメチルカルボキシアミド（あるいは、ナフチルメチルアミノカルボニル）（Ｎａｐ）、トリプタミノカルボキシアミド（あるいは、トリプタミノカルボニル）（Ｔｒｐ）、フェネチルカルボキシアミド（あるいは、フェネチルアミノカルボニル）（Ｐｅ）、チオフェニルメチルカルボキシアミド（あるいは、チオフェニルメチルアミノカルボニル）（Ｔｈ）及びイソブチルカルボキシアミド（あるいは、イソブチルアミノカルボニル）（ｉＢｕ）。
Figure 2021072835
〔00147〕 Ｃ−５修飾ピリミジンの化学修飾は、２’位の糖修飾、環外アミンでの修
飾及び４−チオウリジンの置換などと、単独でまたは任意の組み合わせで組み合わせるこ
ともできる。
〔00148〕 代表的なＣ−５修飾ピリミジンとしては、以下が挙げられる：５−（Ｎ−
ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンまたは５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）。
〔00149〕 ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成の前または後のいずれかで修飾
することができる。オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、１つまたは複数の非ヌクレオチド成分で中断されてもよい。修飾オリゴヌクレオチドを、例えば、任意の適切な標識成分とコンジュゲートさせることなどによって、重合の後にさらに修飾することができる。
〔00150〕 本明細書で使用する場合、用語「少なくとも１つのピリミジン」は、核酸
の修飾に言及する場合、核酸中の１つの、いくつかの、またはすべてのピリミジンを指し、核酸中のＣ、ＴまたはＵのいずれかまたはすべての、いずれかまたはすべての出現が修飾されていても、されていなくてもよいことを示す。
〔00151〕 本明細書で使用する場合、別段の指定がない限り、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ及びＴ
は、それぞれ、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＵ及びｄＴを示す。
〔00152〕 本明細書で使用する場合、「核酸リガンド」、「アプタマー」及び「クロ
ーン」は互換的に使用されて、標的分子に対して望ましい作用を有する、天然に存在しない核酸を指す。望ましい作用としては、限定されないが、標的の結合、標的を触媒的に変化させること、標的または標的の機能活性を修飾または変更する方法で標的と反応すること、標的に共有結合すること（自殺インヒビターと同様）、及び標的と別の分子の間の反応を促進することが挙げられる。いくつかの実施形態では、作用は標的分子に対する特異的結合親和性であり、そうした標的分子は、ワトソン／クリック塩基対合または三重らせん形成と無関係なメカニズムを介して核酸リガンドに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、ここでは、アプタマーは、標的分子が結合するという既知の生理機能を有する核酸ではない。所与の標的に対するアプタマーは、アプタマーが標的のリガンドである場合、（ａ）候補混合物を標的に接触させること（ここでは、候補混合物の他の核酸と比べて標的に対して親和性が増大した核酸を候補混合物の残部から分割することができる）；（ｂ）親和性が増大した核酸を候補混合物の残部から分割すること；及び（ｃ）親和性が増大した核酸を増幅して、リガンドが豊富な核酸混合物を得て、それによって、標的分子のアプタマーを同定すること、を含む方法によって、核酸の候補混合物から同定される核酸を含む。親和性相互作用は程度の問題であることが認識されるが、この文脈では、標的に対するアプタマーの「特異的結合親和性」は、アプタマーが、一般に、混合
物または試料中の他の非標的成分に結合するよりもはるかに高い親和性度で、標的に結合することを意味する。「アプタマー」または「核酸リガンド」は、特定のヌクレオチド配列を有する１つのタイプまたは種の核酸分子のコピーのセットである。アプタマーは、任意の適切な数のヌクレオチドを含むことができる。「アプタマー」は、１を超えるそのような分子のセットを指す。異なるアプタマーは、同じまたは異なる数のヌクレオチドを有することができる。アプタマーはＤＮＡでもＲＮＡでもよく、一本鎖でも二本鎖でも、二本鎖または３本鎖領域を含んでいてもよい。
〔00153〕 本明細書で使用する場合、「ＳＯＭＡｍｅｒ」または低オフ速度修飾アプ
タマーは、３０分以上、６０分以上、９０分以上、１２０分以上、１５０分以上、１８０分以上、２１０分以上または２４０分以上のオフ速度（ｔ１／２）を有するアプタマー（疎水性修飾を有する、少なくとも１つのヌクレオチドを含むアプタマーを含める）を指す。いくつかの実施形態では、ＳＯＭＡｍｅｒは、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ａｐｔａｍｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｏｆｆ−Ｒａｔｅｓ」と題するＵ．Ｓ．特許第７，９４７，４４７号に記載されている、改良ＳＥＬＥＸ方法を使用して生成される。
〔00154〕 本明細書で使用する場合、「タンパク質」は、「ペプチド」、「ポリペプ
チド」または「ペプチド断片」と同義に使用される。「精製された」ポリペプチド、タンパク質、ペプチドまたはペプチド断片は、アミノ酸配列が得られる細胞、組織もしくは無細胞の供給源からの細胞性物質もしくは他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合、化学的な前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。
〔00155〕 本明細書で使用する場合、「共結晶構造」または「共結晶複合体」は、２
つ以上の相互作用分子を含む結晶構造である。
〔00156〕 本明細書で使用する場合、「心血管の病気または疾患」は、心臓及びその
血管系に関する病気または疾患を意味する。そうした病気または疾患のいくつかの例は、動脈瘤、アンギナ、不整脈、アテローム性動脈硬化症、心房細動、うっ血性心不全、心筋症、冠動脈心疾患、再狭窄、虚血、左室肥大、末梢血管疾患、心筋梗塞、高血圧、心臓弁膜症及び拘束性心疾患である。
〔00157〕 本明細書で使用する場合、「線維症」は、結合組織の肥厚及び瘢痕をもた
らし、それが器官の機能不全につながる、器官における過剰及び異常な量の線維性結合組織の形成によって引き起こされる、疾患または病気を意味する。そうした疾患及び病気の例は、肺線維症、腎線維症、肝線維症及び嚢胞性線維症である。
〔00158〕 本明細書で使用する場合、「ＡＭＤ」または「加齢性黄斑変性症」または
「黄斑変性症」は、網膜への損傷によって引き起こされ、黄班と呼ばれる視野の中心において視力喪失をもたらす、眼の病気を意味する。ＡＭＤは、「ウェット」及び「ドライ」型で生じる。「ウェット」ＡＭＤでは、血管は、網膜の後ろの脈絡膜から増殖する。「ドライ」ＡＭＤでは、細胞の残骸（ドルーゼン）が網膜と脈絡膜の間に蓄積する。いずれの型においても、網膜は剥離し得る。
〔00159〕 本明細書で使用する場合、「眼科疾患」または「眼の病気」または「眼部
疾患」または「眼部の病気」は、眼部の血管新生障害、例えば、黄斑変性症（「ウェット」及び「ドライ」）、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、角膜血管新生、増殖性糖尿病性網膜症（糖尿病性網膜症の最も重度の段階）、ブドウ膜炎（黄斑浮腫につながることが多い眼の炎症状態）、白内障手術後の嚢胞様黄斑浮腫、近視性変性（強度の近視を有する患者が脈絡膜血管新生を発症する状態）、炎症性黄斑変性症（感染または他
の原因により黄斑領域に炎症を有する患者が脈絡膜血管新生を発症する状態）、及び虹彩血管新生（虹彩表面の新しい血管増殖に関与する、糖尿病性網膜症または網膜静脈閉塞症の重篤な合併症）に影響を及ぼすまたは関与する、任意の疾患または病気を指す。
〔00160〕 本明細書で使用する場合、「腎臓疾患」または「腎臓の病気」は、増殖性
の腎臓障害、例えば、糸球体腎炎、メサンギウム増殖性腎臓疾患、多発性嚢胞腎疾患、腎臓癌、急性腎不全、腎障害、アミロイド症、浮腫、線維症、糸球体疾患、腎梗塞及び腎炎に影響を及ぼすまたは関与する、任意の疾患または病気を指す。
〔00161〕 本明細書で使用する場合、「癌」は、無秩序且つ異常な細胞増殖が関与す
る疾患または病気を意味する。一般的な癌のいくつかの例は、膀胱癌、肺癌、乳癌、黒色腫、結腸及び直腸癌、リンパ腫、子宮内膜癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、白血病並びに甲状腺癌である。
〔00162〕 本明細書で使用する場合、「調節する」は、増大させるもしくは低下させ
ることによって、ペプチドもしくはポリペプチドのレベルを変更すること、または増大させるもしくは低下させることによって、ペプチドもしくはポリペプチドの安定性または活性を変更することを意味する。用語「阻害する」は、ペプチドもしくはポリペプチドのレベルを低下させること、またはペプチドもしくはポリペプチドの安定性もしくは活性を低下させることを意味する。一実施形態では、調節または阻害されるタンパク質はＰＤＧＦである。
〔00163〕 本明細書で使用する場合、用語「生物活性」は、生理学的または病態生理
学的プロセスに影響を与えることができる（例えば、結合、シグナリングなどを介する）１つまたは複数の細胞内または細胞外のプロセスに対する効果を示す。
〔00164〕 本明細書で使用する場合、用語「血小板由来増殖因子」及び「ＰＤＧＦ」
は、ＰＤＧＦ Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤアイソフォーム並びにそれらのホモまたはヘテロ二量体ＡＡ、ＢＢ、ＡＢ、ＣＣ及びＤＤを指す。場合によっては、文脈によって、ＰＤＧＦのどのアイソフォーム及び／またはヘテロ二量体が意味されるかが決まる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＰＤＧＦアプタマーは、ＰＤＧＦ−Ｂアイソフォーム並びにそのアイソフォームを含むホモ及びヘテロ二量体に結合するが、アプタマーは、ＰＤＧＦへ結合すると記載される場合がある。天然に存在するヒトＰＤＧＦ ＡＡ、ＡＢ及びＢＢアイソフォーム並びに変異体が、定義に特に含まれる。本明細書で使用する場合、ＰＤＧＦには、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、霊長類、ウマ及びウシを含めた、すべての哺乳類種のＰＤＧＦが含まれる。非限定的な例示的ヒトＰＤＧＦ−Ｂアイソフォーム前駆体は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０１１２７．１に示される配列を有する。非限定的な例示的ヒトＰＤＧＦ−Ｂアイソフォーム成熟タンパク質は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０１１２７．１のアミノ酸８２から２４１または８２から１９０の配列を有し得る（ＰＤＧＦ−Ｂのアミノ酸１から１６０または１から１０９として、本明細書で言及される）。
〔00165〕 本明細書で使用する場合、「ＰＤＧＦ受容体」は、ＰＤＧＦが結合し、Ｐ
ＤＧＦによって活性化される受容体、例えば、ＰＤＧＦ受容体α及びＰＤＧＦ受容体βを指す。ＰＤＧＦ受容体には、限定されないが、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ウマ、霊長類及びウシを含めた、任意の哺乳類種の受容体が含まれる。非限定的な例示的ヒトＰＤＧＦＲβ前駆体は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０９６１９．１に示される配列を有する。非限定的な例示的ヒトＰＤＧＦＲβ成熟タンパク質は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０９６１９．１のアミノ酸３３から１１０６の配列を有する。非限定的な例示的ヒトＰＤＧＦＲα前駆体は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ１６２３４．１に示される配列を
有する。非限定的な例示的ヒトＰＤＧＦＲα成熟タンパク質は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ１６２３４．１のアミノ酸２４から１０８９の配列を有する。
〔00166〕 「ＰＤＧＦアプタマー」は、ＰＤＧＦに結合することができ、ＰＤＧＦの
活性を修正することができるアプタマーである。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、ＰＤＧＦの活性をインビトロで阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、ＰＤＧＦの活性をインビボで阻害する。ＰＤＧＦの非限定的な例示的活性は、ＰＤＧＦ受容体、例えば、ＰＤＧＦ受容体α（ＰＤＧＦ Ｒα）またはＰＤＧＦ受容体β（ＰＤＧＦ Ｒβ）のＰＤＧＦ媒介性リン酸化である。
〔00167〕 いくつかの実施形態では、本明細書で定義される「ＶＥＧＦアプタマー」
は、任意にリンカーによって結合した、単量体、二量体または多量体構築物である。
〔00168〕 本明細書で使用する場合、用語「血管内皮増殖因子」及び「ＶＥＧＦ」は
、アイソフォーム及び変異体、例えば、ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１４５、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８３、ＶＥＧＦ−１８９及びＶＥＧＦ−２０６を含めた、天然に存在するＶＥＧＦを指す。本明細書で使用する場合、ＶＥＧＦには、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、霊長類、ウマ及びウシを含めた、すべての哺乳類種のＶＥＧＦが含まれる。非限定的な例示的ヒトＶＥＧＦ前駆体は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ１５６９２．２に示される配列を有する。ＶＥＧＦ−１２１は、例えば、Ｔｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５９：２１９；Ｂｏｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１８７１７に記載されている。
〔00169〕 本明細書で使用する場合、「ＶＥＧＦ受容体」は、ＶＥＧＦが結合し、Ｖ
ＥＧＦによって活性化される受容体、例えば、ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２を指す。ＶＥＧＦ受容体には、限定されないが、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ウマ、霊長類及びウシを含めた、任意の哺乳類種の受容体が含まれる。非限定的な例示的ヒトＶＥＧＦＲ−１前駆体は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ１７９４８．２に示される配列を有する。非限定的な例示的ヒトＶＥＧＦＲ−１成熟タンパク質は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ１７９４８．２のアミノ酸２７から１３３８の配列を有する。非限定的な例示的ヒトＶＥＧＦＲ−２前駆体は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ３５９６８．２に示される配列を有する。非限定的な例示的ヒトＶＥＧＦＲ−２成熟タンパク質は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ３５９６８．２のアミノ酸２０から１３５６の配列を有する。
〔00170〕 「ＶＥＧＦアプタマー」は、ＶＥＧＦに結合することができ、ＶＥＧＦの
活性を修正することができるアプタマーである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、ＶＥＧＦの活性をインビトロで阻害する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、ＶＥＧＦの活性をインビボで阻害する。ＶＥＧＦの非限定的な例示的活性としては、ＶＥＧＦ受容体、例えば、ＶＥＧＦＲ−１またはＶＥＧＦＲ−２のＶＥＧＦ媒介性リン酸化が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ−１２１への結合についてアプタマー４８６７−３１＿１８３と競合するＶＥＧＦアプタマーが提供される。
〔00171〕 いくつかの実施形態では、本明細書で定義される「ＶＥＧＦアプタマー」
は、任意にリンカーによって結合した、単量体、二量体または多量体構築物である。
〔00172〕 用語「ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物」及び「ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ
アプタマー構築物」は、互換的に使用されて、ＰＤＧＦアプタマーとＶＥＧＦアプタマーを含む構築物を指す。「ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物」及び「ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアプタマー構築物」における単語「ＰＤＧＦ」及び「ＶＥＧＦ」の順序は、どのようにアプタマーが結合されるかの指標とならず、例えば、順序は、どちらのアプタマーがアプ
タマー構築物の最も５’側の位置にあるか、及びどちらのアプタマーがアプタマー構築物の最も３’側の位置にあるかを示さない。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物は、ＰＤＧＦとＶＥＧＦに同時に結合することがきる。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物は、ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦのそれぞれに別々に結合することができる。ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物では、ＰＤＧＦアプタマーとＶＥＧＦアプタマーは、例えばストレプトアビジン及びビオチンなどの結合対を介して、共有結合的または非共有結合的に結合され得る。ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物は、ＰＤＧＦアプタマーとＶＥＧＦアプタマーの間にリンカーを含むことができる。
〔00173〕 本明細書で使用する場合、「ＰＤＧＦによって媒介される疾患または病気
」は、ＰＤＧＦ活性が疾患または病気に直接的または間接的につながり得る疾患または病気を指す。非限定の例示的な、ＰＤＧＦによって媒介される疾患または病気としては、心血管疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、心肥大関連状態及び血管障害；眼科疾患、例えば、黄斑変性症；線維症；並びに癌が挙げられる。
〔00174〕 本明細書で使用する場合、「ＶＥＧＦに媒介される疾患または病気」は、
ＶＥＧＦ活性が疾患または病気に直接的または間接的につながり得る疾患または病気を指す。非限定の例示的な、ＶＥＧＦに媒介される疾患または病気としては、心血管疾患、自己免疫疾患、炎症性リウマチ疾患、眼科疾患及び疾患プロセスの様々な段階での癌が挙げられる。心血管疾患の非限定例は、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、心肥大関連状態及び血管障害である。眼科疾患の非限定例は、網膜炎、黄斑変性症、脈絡膜炎、網膜症、浮腫、緑内障及び白内障である。
〔00175〕 本明細書で使用する場合、用語「医薬的に許容可能な」は、動物、より詳
細には、ヒトにおける使用について、連邦または州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方もしくは他の一般に認識される薬局方に列挙されていることを意味する。用語「担体」は、それとともに治療剤が投与される希釈剤、補助剤、賦形剤またはビヒクルを指し、限定されないが、水及び油などの滅菌した液体が挙げられる。
〔00176〕 本明細書で使用する場合、ＰＤＧＦアプタマー、ＶＥＧＦアプタマーまた
はＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物の「医薬的に許容可能な塩」または「塩」という用語は、イオン結合を含み、一般的には、開示される化合物を酸または塩基と反応させることによって生成される、個体への投与に適した開示される化合物の生成物である。医薬的に許容可能な塩としては、限定されないが、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、アリールアルキルスルホン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩及び酒石酸塩を含めた酸付加塩；Ｌｉ、Ｎａ、Ｋなどのアルカリ金属カチオン、ＭｇもしくはＣａなどのアルカリ土類金属塩または有機アミン塩を挙げることができる。
〔00177〕 本明細書で使用する場合、用語「医薬組成物」は、個体への投与に適した
形態でＰＤＧＦアプタマー、ＶＥＧＦアプタマーまたはＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物を含む製剤である。医薬組成物は、一般的には、意図された投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、限定されないが、経口及び非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、吸入、局所、経皮、経粘膜及び直腸内投与が挙げられる。
〔00178〕 本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」は、一般に、本明細書に記
載のように予防、軽減、または治療される障害または病気の少なくとも１つの症状を改善するのに必要な量を意味する。本開示のＰＤＧＦアプタマー、ＶＥＧＦアプタマーまたはＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物に関する場合、語句「治療有効量」は、そうした治
療を必要としている有意な数の個体においてアプタマーが投与されることに対して、特定の薬理学的応答を与えるアプタマー投薬量を意味する。特定の場合の特定の個体に投与される治療有効量のアプタマーは、当業者によってそうした投薬量が治療有効量であるとしても、本明細書に記載の病気／疾患の治療において必ずしも有効とは限らないことを強調する。
〔00179〕 用語「ＳＥＬＥＸ」及び「ＳＥＬＥＸプロセス」は、本明細書で互換的に
使用されて、一般に、（１）望ましい方法で、例えば高親和性でタンパク質と結合することによって、標的分子と相互作用する核酸の選択と（２）それら選択された核酸の増幅との組み合わせを指す。ＳＥＬＥＸプロセスは、特定の標的分子に高親和性であるアプタマーを同定するのに使用することができる。
〔00180〕 ＳＥＬＥＸは、一般に、核酸の候補混合物を調製すること、所望の標的分
子に候補混合物を結合させて、親和性複合体を形成すること、未結合の候補核酸から親和性複合体を分離すること、親和性複合体から核酸を分離及び単離すること、核酸を精製すること、並びに特異的なアプタマー配列を同定することを含む。このプロセスは、選択されたアプタマーの親和性をさらに洗練させるために、複数ラウンドを含むことができる。このプロセスは、プロセスの１または複数の箇所で増幅ステップを含むことができる。例えば、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」と題するＵ．Ｓ．特許第５，４７５，０９６号を参照されたい。ＳＥＬＥＸプロセスは、標的に共有結合するアプタマー及び標的に非共有結合するアプタマーを生成するのに使用することができる。例えば、「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ」と題するＵ．Ｓ．特許第５，７０５，３３７号を参照されたい。
〔00181〕 ＳＥＬＥＸプロセスは、向上した特性、例えば、向上したインビボ安定性
または向上した送達特性などをアプタマーに与える修飾ヌクレオチドを含む高親和性アプタマーを同定するのに使用することができる。そうした修飾の例としては、リボース及び／またはリン酸及び／または塩基の位置での化学的置換が挙げられる。修飾ヌクレオチドを含む、ＳＥＬＥＸプロセスにより同定されたアプタマーは、「Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」と題するＵ．Ｓ．特許第５，６６０，９８５号に記載されており、これは、ピリミジンのＣ５及び／または２’位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載している。Ｕ．Ｓ．特許第５，５８０，７３７号（上記を参照されたい）は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）及び／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１つまたは複数のヌクレオチドを含む、非常に特異的なアプタマーを記載している。物理的及び化学的特質が拡大した核酸ライブラリー並びにＳＥＬＥＸ及びフォトＳＥＬＥＸにおけるその使用を記載する、「ＳＥＬＥＸ ａｎｄ ＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ」と題するＵ．Ｓ．特許公開第２００９００９８５４９号も参照されたい。
〔00182〕 ＳＥＬＥＸは、望ましいオフ速度特性を有するアプタマーを同定するのに
使用することもできる。標的分子に結合することができるアプタマーを生成するための改良ＳＥＬＥＸ方法を記載する、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ａｐｔａｍｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｏｆｆ−Ｒａｔｅｓ」と題するＵ．Ｓ．特許第７，９４７，４４７号を参照されたい。それぞれの標的分子からの解離速度がより低いアプタマー及びフォトアプタマーを生成する方法が記載されている。この方法は、候補混合物を標的分子に接触させること、核酸−標的複合体の形成を起こさせること、及び低オフ速度強化プロセスを実施することを含み、ここでは、速い解離速度を有する核酸−標的複合体が解離し、再形成しないが、一方で、低解離速度を有する複合体は、インタクトな
ままである。さらに、この方法は、オフ速度性能が向上したアプタマーを生成するために、候補核酸混合物の生成における修飾ヌクレオチドの使用を含む（「ＳＥＬＥＸ及びＰｈｏｔｏＳＥＬＥＸ」と題するＵ．Ｓ．特許公開第２００９／００９８５４９号を参照されたい）。（Ｕ．Ｓ．特許第７，８５５，０５４号及びＵ．Ｓ．特許公開第２００７／０１６６７４０号も参照されたい。）。これらの出願のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
〔00183〕 いくつかの実施形態では、以下を含む、標的分子に結合するアプタマーを
選択する方法が提供される：（ａ）核酸の候補混合物を調製すること（ここでは、候補混合物は、候補混合物の少なくとも１つのまたはそれぞれの核酸の少なくとも１つのピリミジンがＣ５位で化学的に修飾されている修飾核酸を含む）；（ｂ）候補混合物を標的分子と接触させること（ここでは、候補混合物の他の核酸と比べて標的分子に対する親和性が増大した核酸が標的分子に結合し、核酸−標的分子複合体を形成する）；（ｃ）親和性が増大した核酸を候補混合物の残部から分割すること；及び（ｄ）親和性が増大した核酸を増幅して、親和性が増大した標的分子に結合することができる核酸配列が富化された核酸混合物を得て、これによって、標的分子に対するアプタマーを同定すること。ある種の実施形態では、この方法は、低オフ速度強化プロセスを実施することをさらに含む。
〔00184〕 本明細書では、「標的（Ｔａｒｇｅｔ）」または「標的分子」または「標
的（ｔａｒｇｅｔ）」は、核酸が望ましい方法で作用することができる任意の化合物を指す。標的分子は、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、病原体、有害物質、基質、代謝物、遷移状態類似体、補助因子、インヒビター、薬物、色素、栄養素、増殖因子、細胞、組織、前述のいずれかの任意の部分または断片であり得るが、これらに限定されない。事実上、任意の化学的または生物学的エフェクターは、適切な標的であり得る。任意のサイズの分子が標的として働くことができる。標的と核酸の間の相互作用の可能性または強さを増強するために、標的をある種の方法で修飾することもできる。標的は、特定の化合物または分子の任意の軽微な変形、例えばタンパク質の場合には、例えば、アミノ酸配列、ジスルフィド結合形成、糖鎖付加、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは修飾、例えば標識成分とのコンジュゲーションにおける軽微な変形を含むこともでき、これらは、分子の同一性を実質的に変更しない。「１つの標的分子」または「１つの標的」は、アプタマーに結合することができる分子または多分子性構造体の１つのタイプまたは種のコピーのセットである。「複数の標的分子」または「複数の標的」は、１つを超える、そうした分子のセットを指す。標的がペプチドであるＳＥＬＥＸプロセスの実施形態は、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＳＥＬＥＸ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ」と題する、Ｕ．Ｓ．特許第６，３７６，１９０号に記載されている。
例示的ＰＤＧＦアプタマー
〔00185〕 本開示のＰＤＧＦアプタマーは、低解離速度でＰＤＧＦに結合するアプタマ
ーの選択及び生成のための代表的な方法を記載する実施例１に記載されているように、低オフ速度を有するアプタマーを同定するための改良ＳＥＬＥＸ方法を使用して同定した。ベンジル−ｄＵ（Ｂｎ−ｄＵ）、ｄＡ、ｄＣ及びｄＧから成るランダムＤＮＡライブラリーを使用して選択した。この方法を使用して、アプタマー４１４９−８＿１（配列番号１）と命名された、ＰＤＧＦ−ＢＢに対するＤＮＡアプタマーを同定した。
〔00186〕 アプタマー４１４９−８＿１（配列番号１）を使用して、ＰＤＧＦに対し
て強い親和性を維持するのに必要とされる最小配列長を同定するために研究を行った。５’末端及び３’末端からの体系的なトランケーションにより、２９ヌクレオチド（４１４９−８＿３８；配列番号３８）から成るコアモチーフを同定した。アプタマー４１４９−
８＿３８は、ＰＤＧＦ−ＢＢに対して高親和性結合を示した（２０ｐＭのＫｄ値；図６）。
〔00187〕 アプタマー４１４９−８＿１（配列番号１）を選択した配列プールについ
て、さらなるシーケンシング研究を行った。並行ピロシーケンシングを使用する大規模なハイスループット法である４５４シーケンシングは、偏りのない試料調製及び非常に正確な配列解析を提供する。図３で示すように、このシーケンシングデータを使用して、ＰＤＧＦアプタマーに対するコンセンサス配列を同定した。さらに、図６に図示するヌクレオチド置換研究によって、コンセンサス配列におけるＢｎｄＵの８個の位置のうちの６個がＰＤＧＦ結合にとって望ましいが、ＢｎｄＵの４個の位置は、結合活性をほとんどまたは全く失うことなくｄＴで置き換えることができることが発見された。アプタマー４１４９−８＿１（配列番号１）に対する各位置でのヌクレオチドの出現頻度のグラフィック描写とともに、コンセンサス配列を図３Ａに示す。
〔00188〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列：
５’−ＮＺＶＳＬｎＳ’Ｖ’ＺＡＣＮＮｍＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ−３’（配列番号５００）を含み、
ここでは、
Ｖは、Ａ、ＣまたはＧから選択され；
Ｖ’は、Ｃ、ＧまたはＺから選択され、Ｖ’はＶに相補的であり；
Ｓ及びＳ’は、ＣまたはＧから独立に選択され、ＳとＳ’は互いに相補的であり；
各Ｎは、任意の天然に存在するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドから独立に選択され；
各Ｚは、修飾ピリミジンから独立に選択され；
Ｌは、任意の天然に存在するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、炭化水素リンカー、ポリエチレングリコールリンカーまたはそれらの組み合わせから選択され；
ｎは０から２０であり；ｍは０から２０であり；ここでは、１つまたは複数のヌクレオチド挿入が任意に含まれる。
〔00189〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列：
５’−ＺＺＶＳＬｎＳ’Ｖ’ＺＡＣＮＮｍＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ−３’（配列番号５０１）を含み、ここでは、Ｖ、Ｖ’、Ｎ、Ｓ、Ｓ’、Ｚ、Ｌ、ｎ及びｍは上記で定義された通りである。
〔00190〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列：
５’−ＺＺＶＣＬｎＧＶ’ＺＡＣＮＭＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ−３’（配列番号５０２）を含み、
ここでは、Ｚ、Ｖ、Ｖ’、Ｎ、Ｚ、Ｌ及びｎは、上記で定義された通りであり、ＭはＣ及びＡから選択される。
〔00191〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列：
５’−ＺＺＡＣＬｎＧＺＺＡＣＡＣＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ−３’（配列番号５０３）を含み、ここでは、Ｚ、Ｌ及びｎは上記で定義された通りである。
〔00192〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列：５’−ＺＺＡＣ
ＧＡＣＺＡＣＧＺＺＡＣＡＣＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ−３’（配列番号５０４）を含み、ここでは、Ｚは上記で定義された通りである。
〔00193〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列：
５’−ＺＶＳＬｎＳ’Ｖ’ＺＡＣＮＮｍＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧ−３’（配列番号５０７
）を含み、
ここでは、
Ｖは、Ａ、ＣまたはＧから選択され；
Ｖ’は、Ｃ、ＧまたはＺから選択され、Ｖ’はＶに相補的であり；
Ｓ及びＳ’は、ＣまたはＧから独立に選択され、ＳとＳ’は他方と相補的であり；
各Ｎは、修飾または未修飾ヌクレオチドから独立に選択され；
各Ｚは、修飾ピリミジンから独立に選択され；
Ｌは、置換または無置換のＣ２〜Ｃ２０リンカー及び修飾または未修飾ヌクレオチドから選択され；
ｎは１から５０であり；ｍは０から５０であり；
ここでは、１つまたは複数のヌクレオチド挿入が任意に含まれる。
〔00194〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列：
５’−Ｚ’ＺＶＳＬｎＳ’Ｖ’ＺＡＣＮＮｍＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣ−３’（配列番号５０８）を含み、ここでは、Ｚ’は修飾ピリミジンまたはｄＴであり；Ｖ、Ｖ’、Ｎ、Ｓ、Ｓ’、Ｚ、Ｌ、ｎ及びｍは上記で定義された通りである。
〔00195〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列：
５’−Ｚ’ＺＶＣＬｎＧＶ’ＺＡＣＮＭＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣ−３’（配列番号５０９）を含み、
ここでは、Ｚ、Ｚ’、Ｖ、Ｖ’、Ｚ、Ｌ及びｎは、上記で定義された通りであり、ＭはＣ及びＡから選択される。
〔00196〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列：
５’−Ｚ’ＺＡＣＬｎＧＺＺＡＣＡＣＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣ−３’（配列番号５１０）を含み、ここでは、Ｚ、Ｚ’、Ｌ及びｎは上記で定義された通りである。
〔00197〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列：
５’−Ｚ’ＺＡＣＧＡＣＺＡＣＧＺＺＡＣＡＣＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣ−３’（配列番号５１１）を含み、ここでは、Ｚ及びＺ’は上記で定義された通りである。
〔00198〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列：
５’−ＺＡＢＬｐＧＹＺＡＢＫｑＧＣＧＺＺＹＤＹＡＧ−３’（配列番号５０５）を含み、
ここでは、各Ｚは独立に、修飾ピリミジンであり；
各Ｂは、Ｃ及び置換または無置換のＣ２〜Ｃ１０リンカーから独立に選択され；
各Ｌは、置換または無置換のＣ２〜Ｃ１０リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー及び修飾または未修飾ヌクレオチドから独立に選択され、ここでは、ｐは１から１０であり；
各Ｙは、修飾または未修飾ピリミジンから独立に選択され；
各Ｋは、置換または無置換のＣ２〜Ｃ１０リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー及び修飾または未修飾ヌクレオチドから独立に選択され、ここでは、ｑは１から５であり；
Ｄは、Ａ及び置換または無置換のＣ２〜Ｃ１０リンカーから選択される。
〔00199〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列：
５’−ＸＺＡＢＬｎＧＹＺＡＢＬｎＧＣＧＺＺＹＤＹＡＧＢＥ−３’（配列番号５０６）を含み、
ここでは、Ｘは、修飾または未修飾ピリミジン及び置換または無置換のＣ２〜Ｃ１０リンカーから選択されるか、存在せず；Ｅは、Ｇ及び置換または無置換のＣ２〜Ｃ１０リン
カーから選択されるか、存在しない。
〔00200〕 配列ＮＺＶＳ（配列番号７６１）及びＳ’Ｖ’ＺＡＣＮＮｍＧＣＧＺＺＺ
ＡＺＡＧＣＧ（配列番号７６２）含むをアプタマー構築物
ここでは、
Ｖは、Ａ、ＣまたはＧから選択され；Ｖ’は、Ｃ、ＧまたはＺから選択され、Ｖ’は、Ｃ、ＧまたはＺから選択され、Ｖ’はＶに相補的であり；
Ｓ及びＳ’は、ＣまたはＧから独立に選択され、ＳとＳ’は互いに相補的であり；
Ｎは、任意の天然に存在するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドから独立に選択され；
Ｚは、修飾ピリミジンから独立に選択され；
ｍは１から２０であり；
１つまたは複数のヌクレオチド挿入が任意に含まれる）。
〔00201〕 いくつかの実施形態では、Ｚは修飾ウリジンである。いくつかの実施形態
では、各Ｚは、本明細書で定義されるＣ−５修飾ピリミジンから独立に選択される。いくつかの実施形態では、各Ｚは、以下から独立に選択される：
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、
５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、
５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、
５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、
５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、
５−（Ｎ−Ｒ−スレオニンイルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２Ｎａ
ｐｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン。
〔00202〕 ある種の実施形態では、ＰＤＧＦ及び／またはＶＥＧＦアプタマーの部分
（Ｙ）は、結合を維持するのに必要でない可能性があり、連続したＰＤＧＦ及び／またはＶＥＧＦアプタマーのある部分は修飾され得、限定されないが、スペーサーまたはリンカー部分との置き換えが含まれる。これらの実施形態では、例えば、ＹをＹ’−Ｑ−Ｙ’’−Ｑ’−Ｙ’’’と表すことができ、ここでは、Ｙ’、Ｙ’’及びＹ’’’は、ＰＤＧＦ及び／またはＶＥＧＦアプタマーの一部であるか、異なるＰＤＧＦ及び／またはＶＥＧＦアプタマーのセグメントであり、Ｑ及び／またはＱ’は、元のＰＤＧＦ及び／またはＶＥＧＦアプタマーのある種の核酸の特徴を修正するスペーサーまたはリンカー分子である。Ｑ及びＱ’が存在しない場合は、Ｙ’、Ｙ’’及びＹ’’’は、１つの連続したＰＤＧＦ及び／またはＶＥＧＦアプタマー（Ｙ）を表す。
〔00203〕 本明細書で使用する場合、「リンカー」は、共有結合的または非共有結合
的相互作用を介して２つ以上の分子実体を結合し、１つまたは複数の分子実体の機能的特質を保存する方法で分子実体の空間的な分離を可能にし得る、分子実体である。リンカーは、スペーサーとしても知られ得る。適切なリンカー配列は、本開示に基づいて、当業者によって容易に確認される。
〔00204〕 本明細書で使用する場合、リンカーは、限定されないが、ポリヌクレオチ
ド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロックド核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣物、脂肪族、芳香族もしくは複素芳香族炭素分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、細胞受容体、リガンド、脂質、これらの構築体の任意の断片または誘導体、前述の任意の組み合わせ、または任意の他の化学構造もしくは成分を含む群から選択される、１つまたは複数の分子または副成分を含むことができる。
〔00205〕 いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＬはポリエチレングリコール
リンカーである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＬはヘキサエチレングリコールリンカーである。いくつかの実施形態では、Ｌは置換または無置換のＣ２〜Ｃ１０リ
ンカーである。いくつかの実施形態では、ｐは１、２、３、４、５、６、７または８である。いくつかの実施形態では、ｐは１、２または３である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＫはポリエチレングリコールリンカーである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＫはヘキサエチレングリコールリンカーである。いくつかの実施形態では、Ｋは置換または無置換のＣ２〜Ｃ１０リンカーである。いくつかの実施形態では、ｑは１または２である。いくつかの実施形態では、ｑは１である。
〔00206〕 様々な実施形態では、ｍは、０から２０、０から１９、０から１８、０か
ら１７、０から１６、０から１５、０から１５、０から１４、０から１３、０から１２、０から１１、０から１０、０から９、０から８、０から７、０から６、０から５、０から４または０から３でもよい。
〔00207〕 いくつかの実施形態では、Ｌは、１８原子ヘキサエチレングリコールリン
カーなどのリンカーでもよい。いくつかの実施形態では、Ｌは、ヌクレオチドとリンカーの組み合わせでもよい。非限定例として、以下のアプタマー（配列番号６７及び６９）は、ヘキサエチレングリコール（Ｈｅｇ）リンカーを含む：
（配列番号６７）５’−Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｃ−Ｈｅｇ−Ｇ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｂｎ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−３’
（配列番号６９）５’−Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｈｅｇ−Ｃ−Ｇ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｂｎ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−３’
ここでは、Ｂｎはベンジル−ｄＵであり、Ｈｅｇはヘキサエチレングリコールリンカーである。
〔00208〕 いくつかの実施形態では、以下のアプタマーのように、Ｎをリンカーに置
き換えることができる：
（配列番号３２９）５’−Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｃ−Ｈｅｇ−Ｇ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｃ−Ｃ３−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｂｎ−Ａ−Ｇ−Ｃ−３’
（配列番号４０８）５’−Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｃ−Ｈｅｇ−Ｇ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｃ−Ｃ３−Ｃ−Ｇ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｂｎ−Ａ−Ｇ−３’
ここでは、Ｂｎはベンジル−ｄＵであり、Ｈｅｇはヘキサエチレングリコールリンカーであり、Ｃ３は３炭素リンカーである。
〔00209〕 さらなるＰＤＧＦアプタマーを、低解離速度でＰＤＧＦに結合するアプタ
マーの選択及び生成のための代表的な方法を記載する実施例５に記載されているように、低オフ速度を有するアプタマーを同定するための改良ＳＥＬＥＸ方法を使用して同定した。ナフチル−ｄＵ（Ｎａｐ−ｄＵ）、ｄＡ、ｄＣ及びｄＧから成るランダムＤＮＡライブラリーを使用して選択した。このスクリーニングで、ＰＤＧＦアプタマー５１６９−４＿２６を同定した。
〔00210〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦに特異的に結合するアプタマーが提供
され、ここでは、アプタマーは、ＰＤＧＦへの結合についてＰＤＧＦアプタマー５１６９−４＿２６と競合する。いくつかのそのような実施形態では、アプタマーは、疎水性核酸塩基修飾を含む少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む。さらに、いくつかのそのような実施形態では、疎水性核酸塩基修飾は修飾ピリミジンである。いくつかの実施形態では、各修飾ピリミジンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチル
カルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン及び５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）から独立に選択され得る。
〔00211〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦに特異的に結合するアプタマーが提供
され、ここでは、アプタマーは、配列：
５’−ＡＣＡＬｎＺＧＺＡＺＧＬｍＺＬＺ−３’（配列番号５１２）を含み；
ここでは、各Ｚは独立に、修飾ピリミジンであり；各Ｌは、置換または無置換のＣ２〜Ｃ５０リンカー、ポリエチレングリコールリンカー及び修飾または未修飾ヌクレオチドから独立に選択され；ｎは１から５であり；ｍは１から１０である。
〔00212〕 いくつかの実施形態では、それぞれ、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミ
ド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン及び５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）から独立に選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、または各Ｚは、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である。いくつかの実施形態では、ｎは１、２、３、４または５である。いくつかの実施形態では、ｍは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。いくつかの実施形態では、ｎは３である。いくつかの実施形態では、ｍは４である。いくつかのそのような実施形態では、各Ｌは、修飾ヌクレオチド、未修飾ヌクレオチド及びＣ３リンカーから独立に選択される。
〔00213〕 Ｃ２〜Ｃ５０リンカーまたはスペーサーは、２から５０個の炭素原子鎖（
Ｃ２〜Ｃ５０）（飽和、不飽和、直鎖、分枝または環状）、０から１０個のアリール基、０から１０のヘテロアリール基及び０から１０個の複素環基の含む骨格でもよく、これは、任意に、エーテル（−Ｏ−）結合（例えば、限定されないが、１つまたは複数のエチレングリコールユニット−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−を含めた、１つまたは複数のアルキレングリコールユニット；１つまたは複数の１，３−プロパンジオールユニット−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−など）；アミン（−ＮＨ−）結合；アミド（−ＮＣ（Ｏ）−）結合；及びチオエーテル（−Ｓ−）結合などを含み；ここでは、各骨格炭素原子は独立に、
無置換（すなわち、−Ｈ置換基を含む）でもよく、またはＣ１〜Ｃ３アルキル、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ハロゲン、−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−ＮＨ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）などから選択される１つまたは複数の基で置換されていてもよい。いくつかの実施形態では、Ｃ２〜Ｃ５０リンカーは、Ｃ２〜Ｃ２０リンカー、Ｃ２〜Ｃ１０リンカー、Ｃ２〜Ｃ８リンカー、Ｃ２〜Ｃ６リンカー、Ｃ２〜Ｃ５リンカー、Ｃ２〜Ｃ４リンカーまたはＣ３リンカーであり、ここでは、各炭素は、上記のように、独立に置換されていてもよい。
〔00214〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーの１つまたは複数のヌクレ
オシドは、２’位の糖修飾（２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）など）、シトシン環外アミンでの修飾、ヌクレオシド間結合の修飾及び５−メチル−シトシンから選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、３’キャップ、５’キャップ及び／または３’末端での逆位デオキシチミジンを含む。
〔00215〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、少なくとも１つの修飾
ヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、または少なくとも５つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
〔00216〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、表１、２及び６から９
（配列番号１から４９９及び５１７から５４５）に示される配列から選択される配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、１０ｎＭ未満の親和性（Ｋｄ）でＰＤＧＦに結合する、表１に示される配列及び表６から９に示される配列から選択される配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、表１、２及び６から９に示される配列（配列番号１から１から４９９及び５１７から５４５）と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、１０ｎＭ未満の親和性（Ｋｄ）でＰＤＧＦに結合する、表１に示される配列及び表６から９に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を有する。
〔00217〕 用語「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、「同一性パーセント」
、「％同一な」、「同一性％」、及びそれらの変形は、２つの核酸配列と関連して使用される場合、互換的に使用されて、最大一致について参照核酸と比較し、整列させ、（１）最も５’側の対応する（すなわち整列した）ヌクレオチド塩基と最も３’側の対応する（すなわち整列した）ヌクレオチド塩基を含むこれらのヌクレオチド塩基の間の、クエリー配列のヌクレオチド塩基の数、または（２）参照配列の全体の長さのいずれかのどちらか長い方で割った場合に、クエリー核酸またはクエリー核酸の一部のものと同じヌクレオチド塩基の数を指す。比較のための例示的配列アライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局地的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ
Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索法、コンピュータによるこれらのアルゴリズムの実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗ
ｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査によって行うことができる（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅを参照されたい）。
〔00218〕 配列同一性パーセントを決定するのに適するアルゴリズムの一例は、ベー
シック・ローカル・アライメント・検索ツール（ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）（以下「ＢＬＡＳＴ」）で使用されるアルゴリズムである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３３８９を参照されたい。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（以下「ＮＣＢＩ」）を通して公的に入手可能である。ＮＣＢＩから入手可能なソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）を使用して配列同一性を決定するのに使用されるデフォルトパラメーターは、ＭｃＧｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：Ｗ２０に記載されている。
〔00219〕 本明細書で使用する場合、ＰＤＧＦアプタマーなどの核酸の同一性パーセ
ントを記載する際に、その配列は、少なくとも、例えば、参照ヌクレオチド配列と約９５％同一であるとは、核酸配列が参照核酸配列の１００ヌクレオチドのそれぞれにつき５つの点変異まで含み得ることを除いて、核酸配列が参照配列と同一であることが意図される。換言すれば、参照核酸配列と少なくともに約９５％同一である所望の核酸配列を得るために、参照配列中のヌクレオチドの５％までは、欠損されてもよいし、別のヌクレオチドで置換されてもよいし、または参照配列中のヌクレオチドの総数の５％までのいくらかの数のヌクレオチドは、参照配列に挿入されてもよい（本明細書で挿入と言及する）。所望の配列を生成するための参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端の位置で生じてもよく、またはこれらの末端位置の間の任意の位置で、参照配列中のヌクレオチドの間に個々に分散して、もしくは参照配列内の１つもしくは複数の連続した群として分散して、これらの末端位置の間の任意の位置で生じてもよい。さらに、ヌクレオチド塩基が、（１）参照配列のヌクレオチド塩基と同じである、または（２）参照配列のヌクレオチド塩基に由来する、または（３）参照配列のヌクレオチド塩基の由来となったのと同じヌクレオチド塩基に由来する場合、同一性パーセントを決定する目的で、ヌクレオチド塩基は「同一」であるとみなされることが意図される。例えば、同一性パーセント計算する目的で、５−メチルシトシンは、シトシンと「同一」であるとみなされる。同様に、同一性パーセントを決定する目的で、図１２に示す修飾ウリジンは互いに同一であるとみなされる。参照配列は、配列番号１から４３７に示すヌクレオチド配列のうちのいずれか１つでもよい。
〔00220〕 いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＤＧＦへ結合する際にＰＤＧＦの
機能を調節するＰＤＧＦアプタマーを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＰＤＧＦアプタマーは、ＰＤＧＦ受容体、例えば、ＰＤＧＦ ＲαまたはＰＤＧＦ ＲβのＰＤＧＦ媒介性リン酸化を阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＰＤＧＦアプタマーは、ＰＤＧＦ ＲβのＰＤＧＦ媒介性リン酸化を阻害する。様々な実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、インビボでのＰＤＧＦ媒介性受容体リン酸化の阻害など、ＰＤＧＦの機能をインビボで調節する。様々な実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列番号１から４３７の配列から選択される配列を有する。様々な実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、表１及び２に示すアプタマーから選択される。様々な実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、表１に示すアプタマーから選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列番号１から１から４９９及び５１７から５４５から選択
される配列の少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列番号１から１から４９９及び５１７から５４５から選択される配列と核酸塩基配列が同一である、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０個の連続したヌクレオチドから成る。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、表１、２、６、７、８または９に示すアプタマーの少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、１０ｎＭ未満の親和性（Ｋｄ）でＰＤＧＦに結合する、表１に示すアプタマーまたは表６から９の１つに示すアプタマーの、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、表１、２、６、７、８または９に示すアプタマーの少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０個の連続したヌクレオチドから成る。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、１０ｎＭ未満の親和性（Ｋｄ）でＰＤＧＦに結合する、表１に示すアプタマーまたは表６から９の１つに示すアプタマーの、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０個の連続したヌクレオチドから成る。
〔00221〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列番号５００から５
１２；７６１及び７６２の配列から選択される核酸塩基配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列番号１から１から４９９及び５１７から５４５のいずれか１つの配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列番号１から４９９及び５１７から５４５のいずれか１つと少なくとも９５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８０％同一、または少なくとも７５％同一である。本明細書の実施形態のいずれかでは、ＰＤＧＦアプタマーは、アプタマーの５’末端、３’末端または５’末端と３’末端の両方に、さらなるヌクレオチドまたは他の化学的な部分を含むことができる。
〔00222〕 ＰＤＧＦアプタマーは、ＰＤＧＦ結合領域に加えて、任意の数のヌクレオ
チドを含むことができる。様々な実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、約１００ヌクレオチドまで、約９５ヌクレオチドまで、約９０ヌクレオチドまで、約８５ヌクレオチドまで、約８０ヌクレオチドまで、約７５ヌクレオチドまで、約７０ヌクレオチドまで、約６
５ヌクレオチドまで、約６０ヌクレオチドまで、約５５ヌクレオチドまで、約５０ヌクレオチドまで、約４５ヌクレオチドまで、約４０ヌクレオチドまで、約３５ヌクレオチドまで、約３０ヌクレオチドまで、約２５ヌクレオチドまで、または約２０ヌクレオチドまで含むことができる。
〔00223〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列番号１から４９９
及び５１７から５４５から選択されるアプタマーと同様の結合特性を有する、及びＰＤＧＦに関連するアテローム性動脈硬化症、黄斑変性症、線維症または癌状態を治療する能力を有するアプタマーから選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、（ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢ二量体に関連して）、表１、２及び６から９に示すアプタマーから選択されるアプタマーと同じ、ＰＤＧＦ−Ｂ単量体の領域に結合する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、（ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢ二量体に関連して）、表１に示すアプタマーから選択されるアプタマーと同じ、ＰＤＧＦ−Ｂ単量体の領域に結合する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、（ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢ二量体に関連して）、表６に示すアプタマーから選択されるアプタマーと同じ、ＰＤＧＦ−Ｂ単量体の領域に結合する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、（ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢ二量体に関連して）、ＰＤＧＦアプタマー４１４９−８＿２６０と同じ、ＰＤＧＦ−Ｂ単量体の領域に結合する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、ＰＤＧＦ−Ｂのアミノ酸２４から８６を含むＰＤＧＦ−Ｂの領域に結合する。いくつかのそのような実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、ＰＤＧＦへの結合について、ＰＤＧＦアプタマー４１４９−８＿２６０と競合する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満または６％未満の、タンパク質接触原子に対する極性接触で、ＰＤＧＦ−Ｂに結合する。極性接触は、水素結合と電荷−電荷相互作用の合計と定義される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、０．０１未満、０．００９未満、０．００８未満、０．００７未満または０．００６未満の、界面面積に対する極性接触の比で、ＰＤＧＦ−Ｂに結合する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、（ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢ二量体に関連して）、ＰＤＧＦアプタマー５１６９−４＿２６と同じ、ＰＤＧＦ−Ｂ単量体の領域に結合する。
〔00224〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは以下の特性の任意の組み
合わせを有する：
（ａ）ＰＤＧＦ−Ｂのアミノ酸２４から８６を含むＰＤＧＦ−Ｂの領域に結合する；
（ｂ）ＰＤＧＦへの結合について、ＰＤＧＦアプタマー４１４９−８＿２６０と競合する；
（ｃ）ＰＤＧＦへの結合について、ＰＤＧＦアプタマー５１６９−４＿２６と競合する；
（ｄ）０．０１未満、０．００９未満、０．００８未満、０．００７未満もしくは０．００６未満の、界面面積に対する極性接触の比で、ＰＤＧＦ−Ｂに結合する；及び／または
（ｅ）１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満または６％未満の、タンパク質接触原子に対する極性接触で、ＰＤＧＦ−Ｂに結合する。
〔00225〕 ＰＤＧＦに対して任意の適切な解離定数（Ｋｄ）を有するように、ＰＤＧ
Ｆアプタマーを選択することができる。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、ＰＤＧＦに対して、３０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、９ｎＭ未満、８ｎＭ未満、７ｎＭ未満、６ｎＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２ｎＭ未満または１ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）を有する。解離定数は、
以下の実施例３に記載されているように、多点タイトレーションを使用して結合アッセイを行い、式ｙ＝（最大−最少）（タンパク質）／（Ｋｄ＋タンパク質）＋最少、に当てはめて、決定することができる。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、表１、２または６から９のいずれか１つに示すアプタマーのＫｄ以下のＫｄを有するアプタマーである。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、表１または表６に示すアプタマーのＫｄ以下のＫｄを有するアプタマーである。
〔00226〕 アプタマー４１４９−８＿１は、ＰＤＧＦ単量体と１：１の化学量論で結
合する。ＰＤＧＦは、その標的受容体との反応に必要とされる、密接なホモ二量体を形成するので、アプタマー４１４９−８＿１の二量体または他の多量体型を使用して、より効率的なＰＤＧＦ活性阻害が達成される可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、アプタマー４１４９−８＿１、４１４９−８＿３７９及び配列番号５００から５１２の配列の任意の組み合わせの多量体化物である。いくつかの実施形態では、アプタマー構築物は、本明細書に記載のＰＤＧＦアプタマーのいずれかから選択される第１のアプタマーと本明細書に記載のＰＤＧＦアプタマーのいずれかを含む第２のアプタマーとを含み、ここでは、第１のアプタマーと第２のアプタマーは、同じでも異なっていてもよい。ＰＤＧＦアプタマー構築物の第１のアプタマーと第２のアプタマーは、共有結合的または非共有結合的に結合され得る。非限定的な例示的結合は当技術分野で既知であり、及び／または本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマー構築物は、２つのＰＤＧＦ単量体に同時に結合できる可能性がある。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマー構築物は、１０ｎＭ未満の親和性（Ｋｄ）でＰＤＧＦに結合する。
例示的ＶＥＧＦアプタマー
〔00227〕本開示のＶＥＧＦアプタマーは、低解離速度を有するＶＥＧＦに結合するアプ
タマーの選択及び生成のための代表的な方法を記載する実施例７に記載されるように、低オフ速度を有するアプタマーを同定するための改良ＳＥＬＥＸ方法を使用して同定した。
〔00228〕 Ｎａｐ−ｄＵ ＶＥＧＦ−１２１ ＳＥＬＥＸ実験からのクローンをトラ
ンケートして、２９ヌクレオチドの最小配列にした。このＳＯＭＡｍｅｒは、高親和性（それぞれ、９０ｐＭ及び２０ｐＭのＫｄ値）でＶＥＧＦ−１２１とＶＥＧＦ−１６５の両方に結合する。ＳＯＭＡｍｅｒはまた、両方のＶＥＧＦアイソフォームがヒト臍帯静脈内皮細胞でのＶＥＧＦＲ２のリン酸化をインビトロで誘導する能力を強力に阻害し（実施例９を参照されたい）、これは、ＳＯＭＡｍｅｒがＶＥＧＦの受容体結合ドメインに結合し、ブロックするという考えを支持する。
〔00229〕 本開示は、ＶＥＧＦ−１２１に対する阻害性アプタマーの最初の同定を提
供する。したがって、本発明のＶＥＧＦアプタマーは、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））及びアフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））（Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ １５：１７１；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４０８：２７６のようなタンパク質ベースの薬物と同様の、ＶＥＧＦの広範なインヒビターに相当する。したがって、本発明のＶＥＧＦアプタマーは、ＶＥＧＦ−１６５の選択的インヒビターであるＭａｃｕｇｅｎ（登録商標）よりもＶＥＧＦシグナリングを効果的に阻害することができる。
〔00230〕 成功したＮａｐ−ｄＵ ＶＥＧＦ−１２１ ＳＥＬＥＸ実験からのトラン
ケートされたクローンは、２９ヌクレオチドの配列を提供した。このアプタマー（またはＳＯＭＡｍｅｒ）（４８６７−３１は、高親和性（それぞれ、９０ｐＭ及び２０ｐＭのＫｄ値）でＶＥＧＦ−１２１とＶＥＧＦ−１６５の両方に結合する。このＳＯＭＡｍｅｒは
また、両方のＶＥＧＦアイソフォームがヒト臍帯静脈内皮細胞でのＶＥＧＦＲ２のリン酸化をインビトロで誘導する能力を強力に阻害し、これは、ＳＯＭＡｍｅｒがＶＥＧＦの受容体結合ドメインに結合し、ブロックするという概念を支持する。
〔00231〕 アプタマー４８６７−３１＿１９２は、１：１の化学量論でＶＥＧＦ単量
体と結合する。ＶＥＧＦは、その標的受容体との反応に必要とされる、密接なホモ二量体を形成するので、アプタマー４８６７−３１＿１９２の二量体または他の多量体型を使用して、より効率的なＶＥＧＦ活性阻害が達成される可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、アプタマー４８６７−３１＿１９２、配列番号５１３から５１６の配列の任意の組み合わせの多量体化物である。いくつかの実施形態では、アプタマー構築物は、本明細書に記載のＶＥＧＦアプタマーのいずれかから選択される第１のアプタマーと本明細書に記載のＶＥＧＦアプタマーのいずれかを含む第２のアプタマーとを含み、ここでは、第１のアプタマーと第２のアプタマーは、同じでも異なっていてもよい。ＶＥＧＦアプタマー構築物の第１のアプタマーと第２のアプタマーは、共有結合的または非共有結合的に結合され得る。非限定的な例示的結合は当技術分野で既知であり、及び／または本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマー構築物は、２つのＶＥＧＦ単量体に同時に結合できる可能性がある。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマー構築物は、１０ｎＭ未満の親和性（Ｋｄ）でＶＥＧＦに結合する。
〔00232〕 いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、１０ｎＭ未満のＫｄで
ＶＥＧＦ−１２１に結合する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、疎水性修飾を含む１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、１つまたは複数の修飾ピリミジンを含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、１つまたは複数の、図１２に示す修飾ピリミジンを含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、１つまたは複数の、図１２の群ＩＩからＶに示す修飾ピリミジンを含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、１つまたは複数の、図１２の群ＩＩＩからｖに示す修飾ピリミジンを含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、１つまたは複数の、図１２群のＩＩＩ及びＩＶに示す修飾ピリミジンを含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、１つまたは複数の（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）を含む。
〔00233〕 いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、配列：
５’−ＧＺＺＱＡＡＥＺＥＣＺＺＥＺＤＲＧＡＺＺＺＡＡＡＺＧＧ−３’（配列番号５１３）を含み、
ここでは、各Ｚは修飾ピリミジンであり；
Ｑは、任意の修飾または未修飾ヌクレオチド及び置換または無置換のＣ２〜Ｃ５０リンカーから選択されるか、存在せず；
各Ｅは、Ｇ及び置換または無置換のＣ２〜Ｃ５０リンカーから独立に選択され；
Ｄは、Ａ及び置換または無置換のＣ２〜Ｃ５０リンカーから選択され；
Ｒは、任意の修飾または未修飾ヌクレオチド及び置換または無置換のＣ２〜Ｃ５０リンカーから選択される。
〔00234〕 いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは以下から選択される配列
を含み：
５’−ＣＧＺＺＱＡＡＥＺＥＣＺＺＥＺＤＲＧＡＺＺＺＡＡＡＺＧ−３’（配列番号５１４）；
５’−ＧＺＺＱＡＡＥＺＥＣＺＺＥＺＤＲＧＡＺＺＺＡＡＡＺＧＧ−３’（配列番号５
１３）；
５’−ＣＧＺＺＱＡＡＥＺＥＣＺＺＥＺＤＲＧＡＺＺＺＡＡＡＺＧＧ−３’（配列番号５１５）；及び
５’−ＣＣＧＺＺＱＡＡＥＺＥＣＺＺＥＺＤＲＧＡＺＺＺＡＡＡＺＧＧ−３’（配列番号５１６）；
ここでは、Ｚ、Ｑ、Ｅ、Ｄ及びＲは上記で定義された通りである。
〔00235〕 いくつかの実施形態では、Ｚは修飾ウリジンである。いくつかの実施形態
では、各Ｚは、本明細書で定義されるＣ−５修飾ピリミジンから独立に選択される。いくつかの実施形態では、各Ｚは、以下から独立に選択される：
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、
５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、
５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、
５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、
５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、
５−（Ｎ−Ｒ−スレオニンイルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン。
〔00236〕 いくつかの実施形態では、各Ｚは、図１２の群ＩＩからＶに示す修飾ピリ
ミジンから独立に選択される。いくつかの実施形態では、各Ｚは、図１２の群ＩＩＩからＶに示す修飾ピリミジンから独立に選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つのまたは少なくとも８つのＺは、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である。いくつかの実施形態では、各Ｚは、図１２の群ＩＩＩからＩＶに示す修飾ピリミジンから独立に選択される。いくつかの実施形態では、各Ｚは、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である。
〔00237〕 Ｃ２〜Ｃ５０リンカーまたはスペーサーは、２から５０個の炭素原子（Ｃ
２〜Ｃ５０）（飽和、不飽和、直鎖、分枝または環状）、０から１０個のアリール基、０から１０個のヘテロアリール基及び０から１０個の複素環基の鎖を含む骨格でもよく、これは、エーテル（−Ｏ−）結合（例えば、限定されないが、１つまたは複数のエチレングリコールユニット−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−を含めた、１つまたは複数のアルキレングリコールユニット；１つまたは複数の１，３−プロパンジオールユニット−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−など）；アミン（−ＮＨ−）結合；アミド（−ＮＣ（Ｏ）−）結合；及びチオエーテル（−Ｓ−）結合などを任意に含み；ここでは、各骨格炭素原子は独立に、無置換（すなわち、−Ｈ置換基を含む）でもよく、またはＣ１〜Ｃ３アルキル、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ハロゲン、−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−ＮＨ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）などから選択される１つまたは複数の基で置換されていてもよい。いくつかの実施形態では、Ｃ２〜Ｃ５０リンカーは、Ｃ２〜Ｃ２０リンカー、Ｃ２〜Ｃ１０リンカー、Ｃ２〜Ｃ８リンカー、Ｃ２〜Ｃ６リンカー、Ｃ２〜Ｃ５リンカー、Ｃ２〜Ｃ４リンカーまたはＣ３リンカーであり、ここでは、各炭素は、上記のように、独立に置換されていてもよい。
〔00238〕 いくつかの実施形態では、各置換または無置換のＣ２〜Ｃ５０リンカーは
、置換または無置換のＣ２〜Ｃ２０リンカー、置換または無置換のＣ２〜Ｃ１０リンカー、置換または無置換のＣ２〜Ｃ８リンカー、置換または無置換のＣ２〜Ｃ６リンカー、置換または無置換のＣ２〜Ｃ５リンカー、置換または無置換のＣ２〜Ｃ４リンカー及び置換または無置換のＣ３リンカーから独立に選択される。いくつかの実施形態では、各置換または無置換のＣ２〜Ｃ５０リンカーは、置換または無置換のＣ２〜Ｃ１０リンカーである。いくつかのそのような実施形態では、各置換または無置換のＣ２〜Ｃ１０リンカーは、置換または無置換のＣ２〜Ｃ８リンカー、置換または無置換のＣ２〜Ｃ６リンカー、置換
または無置換のＣ２〜Ｃ５リンカー、置換または無置換のＣ２〜Ｃ４リンカーまたは置換または無置換のＣ３リンカーである。
〔00239〕 いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーの１つまたは複数のヌクレ
オシドは、２’位の糖修飾（２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）など）、シトシン環外アミンでの修飾、ヌクレオシド間結合の修飾及び５−メチル−シトシンから選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、３’キャップ、５’キャップ及び／または３’末端での逆位デオキシチミジンを含む。
〔00240〕 いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、少なくとも１つの修飾
ヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、または少なくとも５つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
〔00241〕 いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、表１０から１４に示す
配列から選択される配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、１０ｎＭ未満のＫｄを有する表１０から１４に示す配列から選択される配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、表１０から１４に示す配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、１０ｎＭ未満のＫｄを有する表１０から１４に示す配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を有する。同一性パーセントは、参照配列が、１０ｎＭ未満のＫｄを有する配列のような、表１０から１４に示すＶＥＧＦアプタマー配列であることを除いて、ＰＤＧＦアプタマーについて上で記載したように決定される。
〔00242〕 いくつかの実施形態では、本開示は、ＶＥＧＦへ結合する際に、ＶＥＧＦ
の機能を調節するＶＥＧＦアプタマーを提供する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、ＶＥＧＦ受容体、例えば、ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ媒介性リン酸化を阻害する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、ＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ媒介性リン酸化を阻害する。様々な実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、インビボでのＶＥＧＦ媒介性受容体リン酸化の阻害など、ＶＥＧＦの機能をインビボで調節する。様々な実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、表１０から１４に示す配列から選択される配列を有する。様々な実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは１０ｎＭ未満のＫｄを有する表１０から１４に示すアプタマーから選択される。様々な実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは表１０から１４に示すアプタマーから選択される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、１０ｎＭ未満のＫｄを有する表１０から１４に示す配列の少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、１０ｎＭ未満のＫｄを有する表１０から１４に示す配列と核酸塩基配列が同一である、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３
０個の連続したヌクレオチドから成る。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、表１０から１４に示すアプタマーの少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、１０ｎＭ未満のＫｄを有する表１０から１４に示すアプタマーの少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、表１０から１４に示すアプタマーの少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０個の連続したヌクレオチドから成る。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、１０ｎＭ未満のＫｄを有する表１０から１４に示すアプタマーの少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０個の連続したヌクレオチドから成る。
〔00243〕 本明細書の実施形態のいずれかでは、ＶＥＧＦアプタマーは、アプタマー
の５’末端、３’末端または５’末端と３’末端の両方に、さらなるヌクレオチドまたは他の化学的な部分を含むことができる。
〔00244〕 ＶＥＧＦアプタマーは、ＶＥＧＦ結合領域に加えて、任意の数のヌクレオ
チドを含むことができる。様々な実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、約１００ヌクレオチドまで、約９５ヌクレオチドまで、約９０ヌクレオチドまで、約８５ヌクレオチドまで、約８０ヌクレオチドまで、約７５ヌクレオチドまで、約７０ヌクレオチドまで、約６５ヌクレオチドまで、約６０ヌクレオチドまで、約５５ヌクレオチドまで、約５０ヌクレオチドまで、約４５ヌクレオチドまで、約４０ヌクレオチドまで、約３５ヌクレオチドまで、約３０ヌクレオチドまで、約２５ヌクレオチドまで、または約２０ヌクレオチドまで含むことができる。
〔00245〕 いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、１０ｎＭ未満のＫｄを
有する表１０から１４に示すアプタマーと同様の結合特性を有する、及びこうしたアプタマーと同様の、ＶＥＧＦに関連するアテローム性動脈硬化症、黄斑変性症、線維症及び癌状態を治療する能力を有するアプタマーから選択される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、１０ｎＭ未満のＫｄを有する表１０から１４に示すアプタマーから選択されるアプタマーと同じ、ＶＥＧＦ−１２１の領域に結合する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、１０ｎＭ未満のＫｄを有する表１０、１１、１２、１３または１４に示すＶＥＧＦアプタマーと同じＶＥＧＦ−１２１の領域に結合する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは、ＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１＿１８３と同じ、ＶＥＧＦ−１２１の領域に結合する。
〔00246〕 ＶＥＧＦアプタマーは、ＶＥＧＦに対して任意の適切な解離定数（Ｋｄ）
を有するように選択することができる。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマーは
、ＶＥＧＦ−１２１に対して、３０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、９ｎＭ未満、８ｎＭ未満、７ｎＭ未満、６ｎＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２ｎＭ未満または１ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）を有する。解離定数は、以下の実施例３に記載されているように、多点タイトレーションを使用する結合アッセイを行い、式ｙ＝（最大−最少）（タンパク質）／（Ｋｄ＋タンパク質）＋最少、に当てはめて、決定することができる。
〔00247〕 いくつかの実施形態では、アプタマー構築物は、本明細書に記載のＶＥＧ
Ｆアプタマーのいずれかから選択される第１のアプタマー及び本明細書に記載のＶＥＧＦアプタマーのいずれかを含む第２のアプタマーを含み、ここでは、第１のアプタマーと第２のアプタマーは、同じでも異なっていてもよい。ＶＥＧＦアプタマー構築物の第１のアプタマー及び第２のアプタマーは、共有結合的または非共有結合的に結合され得る。非限定的な例示的結合は当技術分野で既知であり、及び／または本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマー構築物は、２つのＶＥＧＦ単量体に同時に結合できる可能性がある。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアプタマー構築物は、１０ｎＭ未満の親和性（Ｋｄ）でＶＥＧＦに結合する。
例示的ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物
〔00248〕 腫瘍関連及び眼部の血管新生のより効率的なブロックが、新しい血管の退縮
と相まって、ＶＥＧＦとＰＤＧＦ−Ｂのシグナリング経路を併せて阻害することによって可能であるというかなりの証拠がある（Ｂｅｒｇｅｒｓ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１：１２８７；Ｊｏ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６８：２０３６）。この効果は、内皮細胞間の密接な細胞間会合を破壊することによって媒介され、これによって、初期の毛細血管の出芽及び周囲内皮細胞（または周皮細胞）が形成され、これらは、成熟するにつれて新しい血管を取り囲み、ＶＥＧＦインヒビターに対して血管を低感受性にする（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｌ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２５：１５９１；Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｌ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１５９）。本明細書に記載のアプタマーは、そうした二重インヒビターの基礎を築き得る。
〔00249〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物は、本明
細書に記載のＶＥＧＦアプタマーのいずれかに結合した、本明細書に記載のＰＤＧＦアプタマーのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物は、１０ｎＭ未満のＫｄを有する表１０から１４に示すＶＥＧＦアプタマーのいずれかに結合した、表１に示すＰＤＧＦアプタマーのいずれかを含む。結合は、共有結合でもよく、共有結合でもよい。
〔00250〕 ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物は、その３’末端もしくは３’末端
近くで、ＰＤＧＦアプタマーであって、ＶＥＧＦアプタマーの５’末端もしくは５’末端近くの箇所に結合している、ＰＤＧＦアプタマー、またはＶＥＧＦアプタマーであって、その３’末端もしくは３’末端近くで、ＰＤＧＦアプタマーの５’末端もしくは５’末端近くの箇所に結合している、ＶＥＧＦアプタマー、または構築物の各アプタマーの結合特質を保存する任意の他の配向などの、任意の配向でＰＤＧＦアプタマー及びＶＥＧＦアプタマーを含むことができる。
〔00251〕 結合が共有結合であるいくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプ
タマー構築物は、リン酸またはホスホロチオエート結合を介して結合することができる。限定されないが、ヘキサエチレングリコールリンカー、ポリエチレングリコールリンカー、置換または無置換の炭化水素リンカーなどを含めた、様々なリンカー部分を介する結合
などの、多くの他の共有結合も意図される。当業者なら、ＶＥＧＦアプタマーにＰＤＧＦアプタマーを結合させるための適切な共有結合を選択することができる。
〔00252〕 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーとＶＥＧＦアプタマーは、
非共有結合を介して結合する。非共有結合としては、限定されないが、ビオチン／ストレプトアビジン；金属結合ペプチド／金属；ハイブリダイズ可能な修飾及び／または未修飾のオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。当業者なら、ＶＥＧＦアプタマーにＰＤＧＦアプタマーを結合させるための適切な非共有結合を選択することができる。
アプタマー及びアプタマー構築物を含む医薬組成物
〔00253〕いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのアプタマーまた
はアプタマー構築物及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物が提供される。適切な担体は、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓによって出版された「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｔｗｅｎｔｙ−ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載されており、これは、参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の少なくとも１つのアプタマーまたはアプタマー構築物及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物は、ＰＤＧＦまたはＶＥＧＦインヒビターではない１種または複数の活性薬剤を含むこともできる。
〔00254〕 本明細書に記載のアプタマーは、限定されないが、注射用剤形、分散液剤
、ゲル剤、エアロゾル剤、軟膏剤、クリーム剤、凍結乾燥製剤、乾燥散剤、錠剤、カプセル剤、制御放出製剤、速溶性製剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、即時放出と制御放出の混合製剤などを含む、任意の医薬的に許容可能な剤形で利用可能である。特に、本明細書に記載のアプタマーは：（ａ）経口、肺、静脈内、動脈内、髄腔内、関節内、直腸、眼、結腸、非経口、大槽内、腟内、腹腔内、局部、頬側、経鼻及び局所投与のいずれかから選択される投与用に；（ｂ）分散液剤、ゲル剤、エアロゾル剤、軟膏剤、クリーム剤、錠剤、サシェ剤及びカプセル剤のいずれかから選択される剤形に；（ｃ）凍結乾燥製剤、乾燥散剤、速溶性製剤、制御放出製剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤及び即時放出と制御放出の混合製剤のいずれかから選択される剤形に；または（ｄ）それらの任意の組み合わせで、製剤化することができる。
〔00255〕 非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、
以下の１つまたは複数の成分を含むことができる：（１）注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌した希釈剤；（２）ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；（３）アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；（４）エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート剤；（５）酢酸、クエン酸またはリン酸などのバッファー；及び（５）塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧調整用の薬剤。ｐＨは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調整することができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器またはガラスもしくはプラスチック製の多回投与バイアルに封入することができる。
〔00256〕 注射使用に適した医薬組成物は、滅菌注射液もしくは分散体を即時調製す
るための、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散剤及び滅菌粉末を含むことができる。静脈内投与については、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ
ＥＬ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は滅菌である必要があり、容易に注射できる程度に流体である必要がある。医薬組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定的である必要があり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護される必要がある。本明細書で
使用する場合、用語「安定的」は、対象への投与に適した状況または状態のままであることを意味する。
〔00257〕 担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、
プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコールなど）、並びにそれらの適切な混合物を含めた、溶媒でも、分散媒でもよい。例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散体の場合には必要とされる粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって、微生物作用の防止を達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムなどの無機塩を組成物に含むことが好ましい。吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることによって、注射用組成物の長期吸収をもたらすことができる。
〔00258〕 滅菌注射液は、活性試薬（例えば、アプタマー及び／またはアプタマー構
築物）を、必要に応じて、上に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに、適切な量で適切な溶媒中に組み入れ、続いて濾過滅菌することによって、調製することができる。一般に、分散体は、基本的な分散媒及び任意の他の所望の成分を含む滅菌したビヒクルに、少なくとも１つのアプタマー及び／またはアプタマー構築物を組み入れることによって調製される。滅菌注射液調製用の滅菌粉末の場合には、例示的調製方法としては、真空乾燥及び凍結乾燥が挙げられ、これらの両方によって、アプタマー及び／またはアプタマー構築物プラス任意のさらなる所望の成分の粉末が、前もって滅菌濾過したそれらの溶液から得られる。
〔00259〕 いくつかの実施形態では、アプタマー及び／またはアプタマー構築物は、
硝子体内注射用に製剤化される。硝子体内投与用の適切な製剤は、例えば、に記載されている。眼部薬物送達は、例えば、Ｒａｗａｓ−Ｑａｌａｊｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．３７：３４５；Ｂｏｃｈｏｔ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １６１：６２８；Ｙａｓｕｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｆｏｒｍｕｌ．５：１；及びＤｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｓｅｍｉｎ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２６：１０４に記載されている。いくつかの実施形態では、アプタマー及び／またはアプタマー構築物を含む医薬組成物は、１週に１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、５週に１回、６週に１回、７週に１回、８週に１回、９週に１回、１０週に１回、１１週に１回、１２週に１回、または１２週に１回より少ない頻度で、硝子体内注射によって投与される。
〔00260〕 経口組成物は、一般に、不活性な希釈剤または食用担体を含む。これらは
、例えばゼラチンカプセルに封入されるか、錠剤に圧縮され得る。治療的経口投与の目的で、アプタマー及び／またはアプタマー構築物を賦形剤と併合することができ、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形で使用することができる。経口組成物はまた、口腔洗浄薬として使用するための液体担体として調製することができ、ここでは、液体担体中の化合物は、経口的に適用され、口の中で動かされ、吐き出されるか、飲み込まれる。医薬的に適合性の結合剤及び／または補助剤物質を、組成物の一部として含むことができる。
〔00261〕 吸入による投与については、化合物は、適切な噴射剤（例えば、二酸化炭
素などのガス）を含む加圧容器もしくはディスペンサーからのエアゾールスプレー、噴霧化液剤、または適切な装置からの乾燥散剤の形で送達される。経粘膜または経皮投与については、浸透すべきバリアに適切な浸透剤が、製剤中に使用される。そうした浸透剤は、一般に当技術分野で既知であり、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩
及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、経鼻噴霧剤または坐剤を使用して達成することができる。経皮投与については、活性試薬は、一般に当技術分野で既知のように、軟膏剤、膏薬、ゲル剤またはクリーム剤に製剤化される。試薬は、（例えば、ココアバター及び他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いる）坐剤または直腸送達用の停留浣腸の形で調製することもできる。
〔00262〕 いくつかの実施形態では、アプタマー及び／またはアプタマー構築物は、
体からの急速な排除を防ぐ担体とともに調製される。例えば、埋め込み及びマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤を使用することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そうした製剤の調製方法は当業者には明白である。材料は、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＯｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから市販品として入手することもできる。
〔00263〕 リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いた、
感染細胞を標的にするリポソームを含む）も医薬的に許容可能な担体として使用することができる。これらは、例えば、Ｕ．Ｓ．特許第４，５２２，８１１号に記載されているような、当業者に知られている方法に従って、調製することができる。
〔00264〕 さらに、アプタマー及び／またはアプタマー構築物の懸濁液は、適切な油
性の注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル、トリグリセリド、またはリポソームが挙げられる。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーを、送達のために使用することもできる。任意に、懸濁液は、化合物の溶解度を増大させ、高濃度の溶液の調製を可能にするのに適切な安定化剤または薬剤を含むこともできる。
〔00265〕 場合によっては、投与の容易さ及び投薬量の均一性の理由で、投薬単位剤
形で経口または非経口組成物を製剤化するのが特に有利であり得る。本明細書で使用する場合、投薬単位剤形は、治療される対象に対する単位投薬量として適する、物理的に別々の単位を指し；各単位は、必要とされる医薬担体とともに、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量のアプタマー及び／またはアプタマー構築物を含む。本明細書に記載のアプタマー及び／または構築物の投薬単位剤形に関する仕様は、特定のアプタマー及び／またはアプタマー構築物の特性並びに達成すべき特定の治療効果並びに個体を治療するためのそうした活性薬剤を調合する分野に固有の制限によって決まり、これらに直接依存する。
〔00266〕 少なくとも１つのアプタマー及び／またはアプタマー構築物を含む医薬組
成物は、１種または複数の医薬品賦形剤を含むことができる。そうした賦形剤の例としては、限定されないが、結合剤、充填剤、潤滑剤、懸濁化剤、甘味剤、着香剤、防腐剤、緩衝剤、湿潤剤、崩壊剤、発泡剤及び他の賦形剤が挙げられる。そうした賦形剤は当技術分野で既知である。例示的賦形剤としては、以下が挙げられる：（１）様々なセルロース及び架橋型ポリビニルピロリドン、微結晶セルロース、例えばＡｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０１及びＡｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０２、ケイ化微結晶セルロース（ＰｒｏＳｏｌｖ ＳＭＣＣ（商標））、トラガカントゴム及びゼラチンを含めた結合剤；（２）充填剤、例えば、様々なデンプン、ラクトース、ラクトース一水和物及び無水ラクトース；（３）崩解剤、例えば、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、コーンスターチ、軽度に架橋結合したポリビニルピロリドン、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン及び修飾デンプン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム並びにそれらの混合物；（４）圧縮される粉末の流動性に作用する薬剤並びにステアリン酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素、例えばＡｅｒｏｓｉｌ（登
録商標）２００、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム及びシリカゲルを含めた、潤滑剤；（５）流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；（６）防腐剤、例えば、ソルビン酸カリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸及びその塩、パラヒドロキシ安息香酸の他のエステル、例えばブチルパラベン、アルコール、例えばエチルアルコールまたはベンジルアルコール、フェノール化合物、例えばフェノール、または四級化合物、例えば塩化ベンザルコニウム；（７）希釈剤、例えば医薬的に許容可能な不活性なフィラー、例えば、微結晶セルロース、ラクトース、第２リン酸カルシウム、サッカリド及び／または前述のいずれかの混合物；希釈剤の例としては、微結晶セルロース、例えばＡｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０１及びＡｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０２が挙げられる；ラクトース、例えば、ラクトース一水和物、無水ラクトース及びＰｈａｒｍａｔｏｓｅ（登録商標）ＤＣＬ２１；第２リン酸カルシウム、例えばＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓ（登録商標）；マンニトール；デンプン；ソルビトール；スクロース；及びグルコース；（８）任意の天然または人工の甘味剤、例えば、スクロース、サッカリンスクロース、キシリトール、サッカリンナトリウム、シクラメート、アスパルテーム及びアセスルファムを含めた甘味剤；（９）着香剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料、Ｍａｇｎａｓｗｅｅｔ（登録商標）（ＭＡＦＣＯの商標）、風船ガム香料、果実香料など；並びに（１０）有機酸と炭酸または炭酸水素塩などの発泡性カップル（ｅｆｆｅｒｖｅｓｃｅｎｔ ｃｏｕｐｌｅ）を含めた発泡剤。適切な有機酸としては、例えば、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、アジピン酸、コハク酸及びアルギン酸並びに無水物及び酸性塩が挙げられる。適切な炭酸及び炭酸水素塩としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸マグネシウム、グリシン炭酸ナトリウム、Ｌ−リジン炭酸塩及びアルギニン炭酸塩が挙げられる。あるいは、発泡性カップルの炭酸水素ナトリウム成分のみが存在し得る。
〔00267〕 様々な実施形態では、本明細書に記載の製剤は実質的に純粋である。本明
細書で使用する場合、「実質的に純粋」は、活性成分（例えば、アプタマー及び／またはアプタマー構築物）が存在する主な種である（すなわち、モル基準で、これらは、組成物中の任意の他の個々の種よりも豊富である）ことを意味する。いくつかの実施形態では、実質的に精製された画分は、活性成分が、存在するすべての高分子種の少なくとも約５０パーセント（モル基準）を占める組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の約８０％より多くを含む。様々な実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物中の存在するすべての高分子種の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％を含む。様々な実施形態では、活性成分は、均一になるまで精製され（従来の検出方法によって組成物中に夾雑種が検出され得ない）、ここでは、組成物は、本質的に、単一の高分子種から成る。
アプタマー及びアプタマー構築物を含むキット
〔00268〕 本開示は、本明細書に記載のアプタマー及び／またはアプタマー構築物のい
ずれかを含むキットを提供する。そうしたキットは、例えば、（１）少なくとも１つのアプタマー及び／またはアプタマー構築物；並びに（２）少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体、例えば、溶媒または溶液を含むことができる。さらなるキットの構成要素は、例えば、（１）本明細書で特定した医薬的に許容可能な適切な賦形剤、例えば、安定化剤、緩衝剤などのいずれか、（２）キットの成分を保持及び／または混合するための少なくとも１つの容器、バイアルまたは同様の器具、並びに（３）送達用器具を任意に含むことができる。
治療方法
〔00269〕本開示は、ＰＤＧＦアプタマーもしくはアプタマー構築物、ＶＥＧＦアプタマ
ーもしくはアプタマー構築物及び／またはＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアプタマー構築物の使用を介して医学的状態を予防または治療する（例えば、医学的状態の１つまたは複数の症状を
緩和する）方法を提供する。この方法は、治療有効量のそうしたアプタマー及び／またはアプタマー構築物をそれらを必要とする対象に投与することを含む。記載されるアプタマーは、予防的療法に使用することもできる。いくつかの実施形態では、アプタマー及び／またはアプタマー構築物は、経口的にまたは静脈内に投与される。
〔00270〕 治療方法で使用されるアプタマー及び／またはアプタマー構築物は、本明
細書に記載のＰＤＧＦアプタマーもしくはアプタマー構築物、ＶＥＧＦアプタマーもしくはアプタマー構築物及び／またはＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアプタマー構築物または医薬的に許容可能なそれらの塩またはそれらのプロドラッグでもよい。
〔00271〕 個体または対象は、限定されないが、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ及びウシを
含めたいかなる動物（飼育動物、家畜または野生動物）でもよく、好ましくはヒトである。本明細書で使用する場合、患者、個体及び対象という用語は、互換的に使用され得る。
〔00272〕 本明細書で使用する場合、「治療する」は、疾患、病気または障害を治療
するための患者の管理及びケアを説明し、患者において、疾患、病気もしくは障害の症状もしくは合併症の発症を予防するため；疾患、病気もしくは障害の症状もしくは合併症を緩和するため；または疾患、病気もしくは障害の存在を排除するために、アプタマー及び／またはアプタマー構築物を投与することを含む。より具体的には、「治療する」は、疾患（障害）状況の少なくとも１つの有害な症状または影響、疾患の進行、疾患の原因因子または他の異常な状態を、回復させること、減弱させること、緩和すること、最小限にすること、抑制することまたは停止させることを含む。治療は、一般に、症状及び／または病態が改善する限りにおいて継続される。
〔00273〕 本明細書で使用する場合、「予防する」は、全体的または部分的に予防す
ること；改善することもしくは管理すること；低減させることもしくは低下させること；または遅延させることもしくは停止させることを意味する。
〔00274〕 様々な実施形態では、開示される組成物及び方法は、心血管疾患、癌、線
維症、腎臓疾患または眼科疾患を治療するのに使用される。
〔00275〕 いくつかの実施形態では、開示される化合物もしくは医薬的に許容可能な
その塩またはプロドラッグを、上記のような疾患状態を向上させるまたは根絶する他の治療と組み合わせて投与することができる。開示されるアプタマー及び／またはアプタマー構築物を含む組成物は、例えば１種を超えるアプタマーを含むことができる。いくつかの例では、１種または複数のアプタマーを含む組成物は、別の有用な心血管系薬剤または抗癌剤または抗線維化剤などと組み合わせて投与される。一般に、そうした組み合わせでの使用について知られている治療剤の現在利用可能な剤形が適切である。
〔00276〕 「組み合わせ療法」（または「併用療法」）は、アプタマー及び／または
アプタマー構築物組成物と少なくとも１種の第２の薬剤を、これらの治療剤の共作用から有益効果をもたらすことが意図される特定の治療レジメンの一部として、投与することを含む。組み合わせの有益効果としては、限定されないが、治療剤の組み合わせから生じる、薬物動態的または薬力学的な共作用が挙げられる。これらの治療剤を組み合わせて投与することは、一般的に、規定された期間（選択される組み合わせに応じて、通常、数分、数時間、数日または数週）にわたって行われる。
〔00277〕 「組み合わせ療法」は、偶発的に及び任意に本開示の組み合わせをもたら
す別々の単独療法レジメンの一部として、２種以上のこれらの治療剤の投与を包含することが意図され得るが、一般的ではない。「組み合わせ療法」は、連続的な方法でのこれら
の治療剤の投与（すなわち、各治療剤は異なる時間に投与される）、及び実質的に同時の方法での、これらの治療剤または治療剤の少なくとも２つの投与を含むことが意図される。実質的に同時の投与は、例えば、固定比率の各治療剤を有する単回用量を、または各治療剤に対する単回用量を複数で対象に投与することによって、達成することができる。
〔00278〕 アプタマー及び／またはアプタマー構築物を利用する投薬レジメンは、例
えば、対象のタイプ、種、年齢、体重、性別及び医学的状態；治療すべき病気の重症度；投与経路；対象の腎臓及び肝臓の機能；並びに用いられる特定のアプタマー及び／もしくはアプタマー構築物またはそれらの塩を含めた、様々な因子に従って選択される。通常の技術を有する医師または獣医師ならば、病気の進行を予防する、病気の進行に逆らう、または病気の進行を停止させるのに必要とされる組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。
〔00279〕 一般に、投薬量、すなわち治療有効量は、１日につき、治療を受ける対象
の体重１ｋｇあたり約１μｇから約１００ｍｇの範囲にわたる。
〔00280〕以下の実施例は例示目的のみに提供され、添付の特許請求の範囲によって定義
される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に記載のすべての実施例は、当業者にとって周知であり、慣例的である標準的な技法を使用して行われた。以下の実施例に記載されている慣例的な分子生物学的技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）などの標準的な実験マニュアルに記載されているように行うことができる。
ＰＤＧＦアプタマーの選択及び配列
〔00281〕候補混合物の調製： ビオチン標識されたｓｓＤＮＡ鋳型にアニールしたＤＮ
Ａプライマーのポリメラーゼ伸長によって、部分的にランダム化されたｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの候補混合物を調製した。
〔00282〕ＳＥＬＥＸ条件： ＰＤＧＦ−ＢＢタンパク質に対するアプタマー（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、Ｂｎ−ｄＵでｄＴを置換した４０ヌクレオチドのランダム領域を含むライブラリーから、記載されているように（Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５：ｅ１５００４）、ＳｏｍａＬｏｇｉｃ Ｉｎｃによって選択された。フォワードプライマーは５’−ＣＧＣＣＣＴＣＧＴＣＣＣＡＴＣＴＣ（配列番号８３７）であり、リバースプライマーは５’−ＣＧＴＴＣＴＣＧＧＴＴＧＧＴＧＴＴＣ（配列番号８３８）であった。ＰＤＧＦ−ＢＢタンパク質をビオチン標識し、ストレプトアビジンＭｙＯｎｅ−ＳＡ（Ｄｙｎａｌ）ビーズ上に分割した。動力学的負荷（ｋｉｎｅｔｉｃ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）を使用して低解離速度を有するアプタマーの優先的な選択を達成し、ここでは、逐次的なラウンドにおいて、インキュベーション時間を延ばし、タンパク質濃度を低下させて、タンパク質−ＤＮＡ複合体を１０ｍＭデキストラン硫酸の存在下で３７℃でインキュベートした。動力学的負荷は、以下のインキュベーション時間：ラウンド４は５分、ラウンド５〜７は１５分、ラウンド８は３０分を用いて、選択のラウンド４で開始し、最終的な第８ラウンドまで継続した。
〔00283〕プールシーケンシング： 第８ラウンドのプールからのオリゴヌクレオチド配
列をクローニングし、いくつかのクローンをシーケンスした。これによって、４１４９−８＿１で例示されるような、関連した配列のファミリーが同定された。
〔00284〕ＰＤＧＦ ＳＥＬＥＸプールのディープシーケンシング： ４１４９−８＿１
アプタマーファミリー内の配列をより完全に評価するために、第８ラウンドプールを４５
４ピロシーケンシング技術を使用してシーケンスした。４５４プライマーを用いてプールＤＮＡを増幅し、ＰＣＲ産物を精製し、Ｓｅｑｕａｌ標準化プレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１０５１０−０１）を使用して標準化した。溶出液をゲル上で泳動して、各増幅産物のサイズ及び純度を確認した。精製したＰＣＲ産物を４５４ピロシーケンシング施設（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｉｎ Ａｕｒｏｒａ ＣＯ）でシーケンスした。
〔00285〕 ＣＬＵＳＴＡＬ解析によって、４５４シーケンスを４１４９−８＿１と整列
させた。プール由来の配列データセットは１０，８０３個の全長配列（すなわち、両方のプライマー配列を含むそうした配列）を含んでおり、そのうちの３，８３９個がユニークであった。これら３，８３９個のユニークな配列を、モチーフ「５’−ＺＡＣＮＣＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ」（同一性＝０．６５）（配列番号８３９）について検索し、次いでこれから上流にある「ＺＺ」（同一性＝１．０）について検索した。これらのモチーフの両方を含む４３６個の配列が見つかった。加えて、５８個の他の配列は、最初のパターンのみを含んでいたが、概して同一性が低く、上流に明らかなヘアピン構造がなかった。次いで、この４３６個の配列を以下のように整列させた。（１）「ＺＺ」に対して、（２）ループの中心に対して、及び（３）「ＺＡＣＮＣＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ」（配列番号８３９）に対して。図３Ａに列挙するように、すべての配列について、各位置での４１４９−８＿１との同一性パーセンテージを計算した。表１及び２は、４１４９−８＿１アプタマーファミリーの配列を代表する多数の配列を列挙する。
〔00286〕アプタマー合成： 固相合成に使用される修飾デオキシウリジン−５−カルボ
キサミドアミダイト試薬は、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５−トリフルオロエトキシカルボニル−２’−デオキシウリジン（（Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２７８４）の適切な一級アミンとの縮合（ＲＮＨ２、１．２当量；Ｅｔ３Ｎ、３当量；アセトニトリル；６０℃；４時間）；２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイトとの３’−Ｏ−ホスホフィチジル化（ｐｈｏｐｈｉｔｉｄｙｌａｔｉｏｎ）（１．２当量；ｉＰｒ２ＥｔＮ、３当量；ＣＨ２Ｃｌ２；−１０から０℃；４時間）；及び中性シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによる精製（Ｓｔｉｌｌ，ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４３：２９２３）によって、調製した。アプタマーは、本明細書に記載のユニークな塩基修飾をもたらすようにプロトコールにいくらか調整を加えたホスホラミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９）を使用して、固相合成によって調製した。トルエン中１０％ジクロロ酢酸を用いて４５秒間脱トリチル化を行い；５−ベンジルメルカプトテトラゾールによって活性化された１：１アセトニトリル：ジクロロメタン中０．１Ｍホスホラミダイトを用いて、３回５分間反応させて、カップリングを達成し、；機器供給業者の推奨に従って、キャップ形成及び酸化を行った。脱保護は、１：１：２のｔ−ブチルアミン：メタノール：水（Ｍｕｌｌａｈ １９９８）を用いて、２４時間摂氏３７度で反応させて、行った。２００ｎｍｏｌスケールでアプタマーを合成し、記載（Ｆｉｔｚｗａｔｅｒ ａｎｄ Ｐｏｌｉｓｋｙ（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：２７５）されているようにＵＶシャドウイングを使用して、製造者の推奨に従ってＣｏｓｔａｒ Ｓｐｉｎ−Ｘ（シリコン処理したガラスウールまたはスパンポリプロピレンプレフィルターを含まない）及びＡｍｉｃｏｎ ＹＭ３濃度を用いて、ポリアクリルアミドゲルから精製した。
〔00287〕修飾ヌクレオチドの構造活性相関及び親和性成熟： ８つのベンジル側鎖のそ
れぞれの、結合への寄与を検討するために、修飾ｄＵホスホラミダイトの特注ライブラリーを用いて、５位変異体を化学的に合成することによって、別の一連の体系的な点置換を行った。この目的のために、サイズ、極性、Ｈ結合のドナー及びアクセプターの配置、リンカーの長さ及び５位置換基の配向を変えることによって各位置の微小環境を探ることが可能になるライブラリーを設計した。この解析のための官能基を選択する際に、元の修飾（この場合ベンジル基）、（トリプトファン及びチロシンのような）抗体の相補性決定領
域（ＣＤＲ）で大きな比率を占めるアミノ酸側鎖（Ｍｉａｎ，ＩＳ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１７：１３３；Ｒａｍａｒａｊ Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１８２４：５２０）、及び小分子薬物の「プリビレッジド（ｐｒｉｖｉｌｅｇｅｄ）」断片（Ｗｅｌｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１４：３４７）というテーマに基づいて変異を含むことを目的とした。ある意味で、本発明者らは、医薬品化学において、抗体における親和性成熟の要素と構造活性相関（ＳＡＲ）の最適化を組み合わせようと努力した。ＳＥＬＥＸの間、単一修飾ヌクレオチドを利用したが、ＳＥＬＥＸ後の最適化は、修飾単量体の合成の容易さ及び固相合成との適合性のみに制約される。
〔00288〕 ５位における１４の代替部分でのベンジル基の個々の置換の効果を、解離
定数比として表される相対的親和性及びホスホ−ＰＤＧＦ Ｒβ比パーセントとして表される相対的ＰＤＧＦ Ｒβリン酸化とともに、図１Ｃ及びＤ並びに図６Ｂにまとめる。５位にメチル基のみを有するｄＴでの置換は、最も激しい変化を示し、その意味で、タンパク質のアラニンスキャニング変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１３３０）に匹敵する。驚くことではないが、これは、８個の修飾ヌクレオチド位置のうちの６個において、最も許容されない置換であった。例外はヌクレオチド１及び７であり、この場所で、この置換は十分に許容された。これら２つの位置はまた、多くの他の置換を許容し、いくつかの置き換えは、結合親和性を５倍まで向上させた（図６Ｂ）。これに対して、ヌクレオチド８、１７及び１８は、変化に対して最も高い感受性を示した。次いで、最もよい単一の置換を組み合わせて、４１４９−８＿２５５及び４１４９−８＿２６０を含めたさらなる変異体を得た（図６Ｂ）。ヌクレオチド１７のフェネチル−ｄＵ（Ｐｅ−ｄＵ）とヌクレオチド１８のチオフェン−ｄＵ（Ｔｈ−ｄＵ）を組み合わせたアプタマー４１４９−８＿２６０は、ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＰＤＧＦ−ＡＢの両方に対して優れた結合を示した（図６Ｂ）。最初に選択されたＳＯＭＡｍｅｒの親和性が既に非常に高かった（Ｋｄ＝２０ｐＭ）ので、親和性が結合アッセイの検出限界に近づき、そのため、親和性の向上度が過小評価される可能性があるということは注目すべきである。本発明者らは、初期結合がより弱い（例えば１００ｐＭから１０ｎＭ超に及ぶＫｄ値）他のＳＯＭＡｍｅｒに同様のＳＥＬＥＸ後の最適化ストラテジーを適用し、１００倍までの親和性の向上を観察した。
〔00289〕 ＰＤＧＦアプタマー４１４９−８＿２６０（ＳＬ５）のホモ二量体： Ｐ
ＤＧＦは共有結合性ホモ二量体を形成し、２つのＳＯＭＡｍｅｒは各ＰＤＧＦホモ二量体に結合するので、ホモ二量体化したＳＯＭＡｍｅｒの結合に対する効果を測定した。結合活性効果の理由から、ＰＤＧＦアプタマーのホモ二量体の親和性は、対応する単量体の親和性と比較して、実質的に向上することができた。結晶構造によって、ＳＯＭＡｍｅｒの５’末端は３８Å離れており、一方で３’末端は７４Å離れていることが示された。２箇所の間の最も短いパスがタンパク質を二分するので、３’末端へ５’末端を結合させるには、少なくとも６３Åを必要とすると思われる。容易に利用可能な化学反応に基づいて、２タイプのホモ二量体を配列した。これらは、１）Ｈｅｇあたり約２０Åの距離を与える２つから６つのＨｅｇリンカーによって結合した頭−尾のホモ二量体、及び２）１つから３つのＨｅｇと組み合わせられた、合成ダブラーサポートを介して結合した、３’−３’ホモ二量体であった。４１４９−８＿２６０のホモ二量体を、ＰＤＧＦ−ＢＢ Ｚｏｒｂａｘ結合アッセイで試験した。結合アッセイは限られた量のＳＯＭＡｍｅｒを用いて行い、タンパク質二量体あたり１つのＳＯＭＡｍｅｒの結合とタンパク質二量体あたり２つのＳＯＭＡｍｅｒの結合を区別しないと思われる。ホモ二量体の構造を表１（配列４１４９−８＿３３４から４１４９−８＿３４２まで）に示す。表１ａで示すように、Ｚｏｒｂａｘアッセイで得られたＫｄ値によって、５’−３’の立体配置において、より長いリンカーが望ましく、結合親和性を１０倍まで向上させることが示唆された。３’−３’結合したホモ二量体では、より短いリンカーが、実際は長いリンカーよりもよく機能すると思わ
れた。このことは、細胞性リン酸化の結果によって確証された。表１ａを参照されたい。
〔00290〕 これらの配列に基づくと、例示的コンセンサス配列は：
５’−ＺＺＶＣＬｎＧＶ’ＺＡＣＮＭＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ−３’（配列番号５０２）であり、
ここでは
Ｖは、Ａ、ＣまたはＧから選択され；
Ｖ’は、Ｃ、ＧまたはＺから選択され、Ｖ’はＶに相補的であり；
Ｎは、任意の天然に存在するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドから独立に選択され；
Ｍは、ＣまたはＡから選択され；
Ｚは、修飾ピリミジンから独立に選択され；Ｌは、任意の天然に存在するヌクレオチドもしくは修飾ヌクレオチド、炭化水素リンカー、ポリエチレングリコールリンカーまたはそれらの組み合わせから選択されるスペーサーであり；
ｎは０から２０であり；
ここでは、１つまたは複数のヌクレオチド挿入が任意に含まれる。
〔00291〕 配列トランケーション研究： 表３で示すように、４１４９−８＿１の５
’末端及び３’末端からの体系的なトランケーションを行って、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢに対するアプタマーの完全な結合活性を保持するのに必要とされる最小の長さを定めた。トランケーションのサブセットに関するＫｄ値を示す。Ｚ＝ベンジル−デオキシウリジン（Ｂｎ−ｄＵ）；Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴはデオキシリボヌクレオチドである。
タンパク質の発現及び精製並びにアプタマー複合体の形成
〔00292〕結晶学的研究のために、組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢタンパク質をＣｒｅａｔｉ
ｖｅ ＢｉｏＭａｒｔ（Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ）から購入した。組換えタンパク質は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞で発現された。アプタマー溶液を解凍し、次いで、約９５℃まで５分間加熱し、次いで４０℃で５分間インキュベートし、次いで室温まで冷却して、アニールさせた。アニールさせたアプタマー溶液を、１．１：１のＤＮＡ対タンパク質比でタンパク質と混合した。この複合体を、２０ｍＭリン酸Ｎａ／Ｋ（ｐＨ７）及び１００ｍＭ
ＮａＣｌを含むバッファーで５倍希釈した。得られた混合物を、１．５ｍＬのＡｍｉｃｏｎ遠心濾過器中で、約４ｍｇ／ｍＬのタンパク質に濃縮した。終濃度を最終的な保持液量から推定した。
ＰＤＧＦ−アプタマー複合体の結晶化及び構造
〔00293〕 １６oＣに設定したＣｏｍｐａｃｔ，Ｊｒ．プレート（Ｅｍｅｒａｌｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、ＷＡ）中で、シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して結晶を成長させた。データ収集用の結晶は、一次スクリーン（ＰｒｏＰｌｅｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ）から得た。ＰＤＧＦ−ＢＢ：４１４９−８＿２５５複合体の結晶は、１００ｍＭ酢酸マグネシウム、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）及び８％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００から成長させた。ＰＤＧＦ−ＢＢ：４１４９−８＿２６０複合体の結晶は、１００ｍＭ酢酸マグネシウム、１００ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．５）及び１５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００から成長させた。結晶をＬｉｔｈｏ Ｌｏｏｐｓを用いて回収し、３３％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを含む貯蔵液に素早く移して凍結保護してから、液体窒素中に直接沈めることによって瞬間冷却した。
〔00294〕 データ収集及び構造決定：Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃ
ｅ（Ａｒｇｏｎｎｅ、ＩＬ）のビームライン１９−ＩＤで、両方の構造に関するデータを収集した。ＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ ２０１０）を使用してこのデータセットを処理した。
ＰＤＧＦ−ＢＢ：４１４９−８＿２６０複合体の構造は、検索モデルとしてＰＤＧＦ−ＢＢ：βタイプＰＤＧＦ受容体複合体（ＰＤＢエントリー ３ＭＪＧ）の構造由来のＰＤＧＦのタンパク質モデルを用いて、ＣＣＰ４ソフトウェアスイート（ＣＣＰ４，１９９４）のＰｈａｓｅｒを使用した分子置換によって、最初に位相決定した。分子置換によって、非対称ユニットあたりの単一タンパク質単量体の位置を特定した。ＲＥＦＭＡＣでの制限された精密化（ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）の初期ラウンドの後の電子密度マップを調べることによって、タンパク質モデルに隣接する核酸と一致した特徴が示された。続いてアプタマーのモデルを、「ブートストラッピング」のプロセス（すなわち部分的なモデルを精密化の反復ラウンドにかけた）を通して構築し；その結果、さらなるモデル構築を可能にするわずかに向上したマップが得られた。最初に、核酸骨格密度においてリン酸イオンを構築した。次に、リン酸をｄＴ残基で置き換えた。精密化に続いて、修飾された残基を、正の差分電子密度の突出によって識別することができた。修飾された残基の同定は、アプタマーの配列登録の決定を促進し、最終ステップにおいて、ｄＴ残基を正しい核酸塩基と置き換えた。すべてのマニュアル構築は、Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ｏｂｊｅｃｔ−Ｏｒｉｅｎｔｅｄ Ｔｏｏｌｋｉｔ（Ｃｏｏｔ）（Ｅｍｓｌｅｙ ＆ Ｃｏｗｔａｎ，２００４）を使用して行った。ＰＤＧＦ−ＢＢ：４１４９−８＿２５５構造体の構造は、４１４９−８＿２６０複合体の完成モデルを使用した分子置換により解明した。
〔00295〕 各構造では、Ｔｈｒ８８及びＴｈｒ９０残基のＯγ原子の電子密度に近接
して、電子密度の突出が観察された。酵母で発現させた組換えＰＤＧＦ−Ｂについて、これらの部位でＯ−マンノシル化報告されているが（Ｓｅｔｔｉｎｅｒｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９０））、大腸菌で発現させたＰＤＧＦ−Ｂにおいて同様の翻訳後修飾を予想する理由はほとんどない。観察された電子密度によって完全な占有に満たないことが示唆されたので、スレオニン残基は、いかなる翻訳後修飾もなしでモデル化した。
〔00296〕 表４は、それぞれ４１４９−８＿２６０（配列番号２１１）及び４１４９
−８＿２５５（配列番号２０７）との２つのアプタマーリガンドのデータ収集の統計及び精密化およびモデル統計を開示する。
〔00297〕 表５は、Ｂ型ＤＮＡと比較した、ＰＤＧＦ ＢＢアプタマーについての塩
基対パラメーターを示す。ＰＤＧＦ ＢＢアプタマーは、５’ステムループドメイン及びミニノットの両方のステムにおいて逸脱したＢ型コンフォメーションをとる。必要に応じて、平均値及び標準偏差（括弧内）を示す。アプタマーの値は、ｗｅｂ３ＤＮＡ（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：Ｗ２４０）を使用した解析に基づき、（高分解能結晶構造で見られた）Ｂ−ＤＮＡの値は、Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３（１）：２２９で記載及び報告されているように、３ＤＮＡを使用して決定した。
〔00298〕 ＰＤＧＦ−ＢＢの単量体サブユニットは、タンパク質のシスチンノットフ
ァミリーに特有の逆平行の配向で二量体化する、ねじれたβシートを形成する（Ｏｅｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：３９２１）。ＳＬ５（４１４９−８＿２６０）は、長軸の両端で２つの相同部位に結合し、ホモ二量体界面を交差し、３つのＰＤＧＦループのそれぞれに接触する（図７Ａ）。ＳＯＭＡｍｅｒは、疎水性芳香族相互作用のネットワークによって結合した２つのドメインから成る（図７Ｂ）。５’末端では、短いステムはＨｅｇループでキャップされている（結晶構造中で無秩序である）が、分子の残部は、異常に小さなＨタイプシュードノットに折りたたまれ（Ａａｌｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：２２１０）、修飾ヌクレオチドは、ステムループ／シュードノット接合部でクラスター化している。注目すべきことに、８つすべての修飾ヌクレオチドがＰＤＧＦと接触している。７
つの修飾ヌクレオチドクラスターは、タンパク質上の疎水性の溝に沿って一緒にクラスター化しているが、Ｂｎ−ｄＵ１は、ＰＤＧＦホモ二量体界面のチャネルに続いて、伸長したコンフォメーションをとる。２つの天然ヌクレオチドもＰＤＧＦに接触し、残りの天然ヌクレオチドは、内部構造に寄与する（図２及び図７）。ＳＬ５の二次構造要素であるステムループ及びシュードノットは、周知の核酸構造モチーフである。しかし、修飾ヌクレオチドとのある種の従来の塩基の置き換えは、別の相互作用のための新規な官能基を提供する。ＳＬ５のこの際立った特徴によって、タンパク質結合及び標準ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの間のユニークな分子内接触のための、広域な疎水性面がをもたらされる。
〔00299〕 ＳＬ５の３’末端はＨタイプシュードノットの顕著な特徴を示すが（Ｓｔ
ａｐｌｅ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２００５）ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．３：ｅ２１３）、この分類は、この特徴的な「ミニノット」モチーフの特殊な性質を軽視している。２１ヌクレオチドを必要とする、構造的に報告された最小のＨタイプシュードノット（Ｎｏｎｉｎ−Ｌｅｃｏｍｔｅ Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４：１８４７）と比較して、ＳＬ５のミニノットは、わずか１６ヌクレオチドから成る（図７Ｂ）。さらに、ステム２（Ｓ２）の末端ｍＧ２４：ｄＣ１２塩基対の欠損は、結合親和性を低下させず（図３）、これは、１４ヌクレオチドのミニノットの機能的完全性を示すものである。前例のない骨格のねじれ及びスタッキング相互作用とともに、このミニノットは、修飾ヌクレオチドの疎水性部分の充填による安定化を介して著しく小さなサイズを獲得した、新規なシュードノット変異体を示す。
〔00300〕 ミニノットステム１（Ｓ１）は、形式上ほんの２つのワトソン・クリック
塩基対から成るが（図８Ａ）、ループ２（Ｌ２）は、名目上５塩基、すなわちＰｅ−ｄＵ１７、Ｔｈ−ｄＵ１８、ｄＡ１９、Ｂｎ−ｄＵ２０及びｍＡ２１から成る。Ｌ２とＳ１の間の相互作用はシュードノットの決定的な特徴であるが、これは、一般的にはＨ結合に限定される。これに対して、ＳＯＭＡｍｅｒのミニノットは、特殊な塩基対合に支持された、非定型のループ−ステムスタッキング相互作用を行う。特に、Ｓ１は、Ｌ２に由来する非標準Ｂｎ−ｄＵ１７：Ｂｎ−ｄＵ２０塩基対とのスタッキングによって安定化し（図８Ｃ及び図８Ｂ）、新規な骨格不連続性を有する３つの塩基対Ｓ１を効果的に作出する。以前に記載されたＵ：Ｕイミノカルボニル塩基対と対照的に、Ｐｅ−ｄＵ１７：Ｂｎ−ｄＵ２０塩基対は、Ｂｎ−ｄＵ１７のＮ３とＢｎ−ｄＵ２０のアミドリンカーのカルボニル酸素との間の単一のＨ結合を利用する（図８Ｄ）。Ｂｎ−ｄＵ２０のグリコシル結合についてのシンコンホーメーションは、Ｂｎ−ｄＵ１７とのＨ結合を妨害するするが、Ｂｎ−ｄＵ８の糖との立体的衝突なしで、Ｂｎ２０がＢｎ−ｄＵ８塩基とスタックできるようにする。特殊なＰｅ−ｄＵ１７：Ｂｎ−ｄＵ２０塩基対は、ヌクレオチド１８及び２０の間の骨格を２８０°回転させることによって可能となる（図８Ｃ）。この劇的な鎖の逆転によって、Ｂｎ−ｄＵ２０塩基がｄＡ９の糖とスタックできるようになり、Ｐｅ−ｄＵ１７と水素結合を形成できるようになる。重要なことに、Ｐｅ−ｄＵ１７：Ｂｎ−ｄＵ２０塩基対は、修飾ヌクレオチドによって与えられる疎水性相互作用を介してさらなる安定化を引き出し；Ｐｅ−ｄＵ１７側鎖のエチレン（リンカー）部分はＢｎ１６（ＣＨ：：π）に向けられているが、そのベンジル基は、π−π端−面相互作用でＢｎ２及びＴｈ１８とスタックされている（図８Ｅ）。１つのさらなるＬ２とＳ１の間の相互作用は、塩基トリプル（ｍＡ２１：ｄＧ１５：ｄＣ１０；図８Ｆ）、すなわちシュードノット中の反復性モチーフである（Ｃｈｅｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６：１２７０６）。これは、修飾ヌクレオチドを含まない、ＳＬ５における唯一の長距離三次相互作用である。
〔00301〕 ループ１（Ｌ１）は、ｍＡ１１とｄＣ１２の間の鎖内のリン酸の距離をほ
んの５．９Åに圧縮して、骨格を急な９４°回転させる単一の押し出されたヌクレオチド、ｍＡ１１から成る（図８Ｇ）。Ｈタイプシュードノットは、１つまたは２つのヌクレオ
チドをＬ１に有することが多く、これは、一般的には、Ｓ２と水素結合を形成し、らせん状の接合部にスタックする（Ｎｏｎｉｎ−Ｌｅｃｏｍｔｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４：１８４７；Ｍｉｃｈｉｅｌｓ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１０：１１０９）。押し出されたＬ１ヌクレオチドは、５’ステムドメインが修飾ヌクレオチドの疎水性部分を介してミニノットとの界面を有することができるように凝集された構造を保つのに必要である。予想通り、押し出された塩基は保存されておらず（図３）、単一のＣ３スペーサーで置き換えることができる（図６Ａ）が、おそらくミニノット形成への干渉の理由から、その欠損は結合を抑止する。
〔00302〕 ミニノットＳ１のワトソン・クリック塩基対（ｄＡ９：Ｂｎ−ｄＵ１６、
ｄＣ１０：ｄＧ１５）は、Ｓ２の鎖１がＳ１の鎖２に直接的につながる好ましいＨタイプシュードノット配置によって集まり、効率的なステムのスタッキングをもたらす（Ｋｌｅｉｎ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：３４３）。Ｓ２の３つの塩基対は、完全にワトソン‐クリック相互作用から成り、わずかにねじれが少ない（ｕｎｄｅｒｔｗｉｓｔｅｄ）Ｂ型らせん（図８Ｈ）を形成する。このねじれが少ないことは、シュードノットトポロジーについて予想されるような、Ａ型らせんにより酷似しているらせんパラメーターをもたらす。しかし、この構造のらせんの長さが短いことを考えると、これらの計算の関連性は不確かである。Ｓ２は、Ｓ１と従来の同軸スタックを形成せず、これは、Ｓ１のｄＣ１０：ｄＧ１５及びＳ２のｄＣ１４：ｄＧ２２によって形成される接合部での極度ならせん状の巻過ぎ（７０°のねじり角度）が理由である。それにもかかわらず、ステムの連続的なスタッキングは維持され、これは、ｄＣ１４がｄＧ１５とスタックし、ｄＧ２２が塩基トリプルのｍＡ２１とスタックするからである（図８Ｈ）。この接合部での広域ならせん状のねじれは、塩基トリプル形成のために副溝を広幅化すると同時に、ｍＡ２１をＳ２の主溝に架橋させるのに必要である。この立体配置は、１つまたは２つのヌクレオチドをＬ１に有するシュードノットに典型的である（Ｎｏｎｉｎ−Ｌｅｃｏｍｔｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４：１８４７；Ｍｉｃｈｉｅｌｓ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１０：１１０９）。
〔00303〕 ＳＬ５の５’ステムは、２つのワトソン・クリック塩基対（ｍＡ３：Ｂｎ
−ｄＵ７及びｄＣ４：ｄＧ６）並びにステムの基部の非標準Ｂｎ−ｄＵ２：Ｂｎ−ｄＵ８塩基対から成る（図８Ｉ）。Ｂｎ−ｄＵ２：Ｂｎ−ｄＵ８塩基対は、２つの水素結合、すなわち典型的な４−カルボニル−Ｎ３及びＢｎ−ｄＵ２塩基からＢｎ−ｄＵ８結合のアミドリンカーへのユニークな４−カルボニルを含む（図８Ｊ）。親和性が強化されたプールにおける関連した配列の解析は、ステムの基部における不変のＢｎ−ｄＵ：Ｂｎ−ｄＵブレースという注目すべき例外はあるが、５’ステムの長さ及び塩基組成は可変であることを示し（図３Ａ及びＢ）、これは、ＳＬ５の全体的な構造及び機能におけるこの非標準塩基対の重要性を強調するものである。５’ステムらせんの安定性は、ＤＵ８、Ｂｎ２０及びＰＤＧＦのＰｒｏ８２のスタッキングによってさらに強化される（図９Ｈ）。ＳＬ５の５’ステムループ及びミニノットドメインは収束し、ここで、骨格は鋭く１１１°に曲がる。５’ステムの塩基対の著しいねじり角度及び半径方向変位によって、従来のＢ型らせんよりも大きなスタッキングの重複を有する塩基２−４及び６−７が生じる（らせんのねじれが少ないことが原因）が、Ｂｎ−ｄＵ８塩基は外側に出て、Ｂｎ−ｄＵ７塩基はＢｎ−ｄＵ８のアミドリンカーとスタックする（図８Ｉ）。この非定型のらせんは、ＳＬ５の残りの部分及びＰＤＧＦとの重要な相互作用を促進し；Ｂｎ−ｄＵ８塩基はＢｎ２０とスタックするが、Ｂｎ８は、連続したπ−π端−面相互作用におけるＢｎ１６とＢｎ２０の環の間に垂直に存在する。こうした長距離三次相互作用は、ミニノットとステムループドメインの間に正確なヒンジを規定する（図８Ｌ及び８Ｋ）。最初の２つのヌクレオチドの間の湾曲の欠如は、Ｂｎ２とのＢｎ−ｄＵ１塩基の衝突を防止し、環のスタッキングを増
大する（図８Ｉ）。Ｂｎ２は、Ｂｎ７及びＢｎ８（５’ステム由来）並びにＢｎ１６、Ｐｅ１７及びＢｎ２０（ミニノット由来）によって作出された疎水性クラスターの中央に位置する（図７Ｂ、図８Ｉ及び図８Ｋ）。この疎水性クラスターはＳＯＭＡｍｅｒの安定化に寄与し、これは、ＳＬ５が、修飾ヌクレオチドを欠くその類似体よりも３０℃超高い６４℃というＴｍを示すという知見により支持された。
〔00304〕 ＳＬ５に加えて、イソブチル−ｄＵ（ｉＢ−ｄＵ）でのＢｎ−ｄＵ８の置
き換えを除いてはＳＬ５と同一であるＳＬ４（４１４９−８＿２５５）の構造も解明した。変異体ＳＬ４においてｉＢ−ｄＵ８をＰｅ−ｄＵ１７及びＴｈ−ｄＵ１８と組み合わせた場合、ＳＯＭＡｍｅｒは、大幅に弱い結合（ＳＬ５に対して約２０〜５０倍）及び７５倍低いインビトロ阻害活性を示した（図１Ａ、図１Ｂ及び図６Ｂ）。より小さな非芳香族のイソブチル側鎖は、ＳＬ５のＢｎ−ｄＵ２０、Ｂｎ−ｄＵ８及びＢｎ−ｄＵ１６のベンジル側鎖で見られるエネルギー的に有利なπ−π端−面スタッキングを形成することができない（図８Ｍ及び図８Ｎ）。これは、タンパク質界面における疎水性クラスターの中心に孔を作出し、５’ステムとミニノットドメインの間のヒンジを効果的に開放する。この置換の構造的な影響は、タンパク質の疎水性コアにおけるＰｈｅからＬｅｕへの変異にまったく類似している。そうしたタンパク質変異は十分に説明されており（Ｋａｄｏｎｏｓｏｎｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：１０６５１；Ｌｉｎ，Ｈ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１６４９：１６；Ｂａａｓｅ，Ｗ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１９：６３１）、通常、著しい不安定化作用がある。二次構造モチーフ間の接合部は、核酸の３次構造の決定において重要な役割を果たすことが知られている（Ｐｙｌｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２１：２９３）。
〔00305〕 顕著に弱い標的結合親和性にもかかわらず、ＳＬ４は、リガンドの非存在
下でＳＬ５と同様の熱融解プロファイルを示す（それぞれ６２oＣ及び６４oＣのＴｍ値）。これは、ＳＬ４におけるｉＢ−ｄＵ８置換によって作出された、空洞及び変化した接合部トポロジーは、タンパク質結合界面を不安定化するが、ＳＯＭＡｍｅｒのドメイン内構造をインタクトなままにするという考えと一致する。溶液中の遊離ＳＯＭＡｍｅｒのコンフォメーションは、タンパク質との複合体におけるものと非常に異なる可能性が高く、これは、Ｔｍと結合親和性の間の関連性を減らし得る。実際、ＳＯＭＡｍｅｒの大きな疎水性面を溶媒和させるエネルギーコストはかなりのものである可能性が高いので、複合体化していないＳＯＭＡｍｅｒが疎水性側鎖の周囲で崩壊し、疎水性側鎖が溶媒から部分的に保護されたコンフォメーションをとることが予想される。
〔00306〕 以前に記載されたタンパク質：アプタマー複合体と対照的に、疎水性相互
作用が、ＳＬ５とＰＤＧＦの間の界面を支配する（図２、図４及び図９）。ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合は、ＳＯＭＡｍｅｒあたり約１２２５Å２の埋もれた表面領域を作出する。ＳＬ５の８つの修飾ヌクレオチドは、ＰＤＧＦの１３個の非極性アミノ酸（Ａｌａ３５、Ｐｈｅ３７、Ｌｅｕ３８、Ｖａｌ３９、Ｔｒｐ４０、Ｐｒｏ４２、Ｃｙｓ５２、Ｃｙｓ５３、Ｉｌｅ７５、Ｉｌｅ７７、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３及びＰｈｅ８４）と相互作用する広域な疎水性界面を作出し、これは、全非極性接触の約半分を占め、残部は、極性アミノ酸または荷電アミノ酸、例えば、Ｇｌｕ２４、Ａｒｇ２７、Ａｓｎ３６、Ａｓｎ５４、Ａｓｎ５５、Ａｒｇ５６、Ａｒｇ７３、Ｌｙｓ７４、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８５及びＬｙｓ８６の脂肪族領域を含む（図９）。完全に非極性の残基と荷電アミノ酸の非極性部分の間の同様の相互作用は、タンパク質で観察されることが多い。したがって、ＳＯＭＡｍｅｒの修飾ヌクレオチドによって与えられる構造的多様性により、これらが、タンパク質に接近しやすい相互作用の豊富なレパートリーを模倣することが可能になる。従来のアプタマーと比較した際の、ＳＯＭＡｍｅｒによって作られる疎水性接触の程度の著しい違いは、界面
の原子が標的タンパク質の表面に提示される場合に明らかである。ＳＬ５は、塩基性アミノ酸に近接しているにもかかわらず、著しく少ない極性相互作用を示し、ＰＤＧＦとほんの６つのＨ結合及び１つの電荷−電荷相互作用しか有さない（図４）。接触表面領域と比較して、これは、アプタマーに典型的なものよりも著しく低い。６つの従来のアプタマーに関するＨ結合及び電荷−電荷相互作用（すなわち極性接触）の総数は、０．９１の相関係数及び１００Å２界面面積あたり平均１．９±０．４の極性接触で、界面面積に正比例してほぼ直線的に増加する（図１０Ａ、図２２Ａ）。ＳＬ５及び他の共結晶構造の２つのさらなるＳＯＭＡｍｅｒは、界面面積あたり半分未満の極性接触の数（１００Å２界面面積あたり平均０．７±０．２）で、このトレンドの９９％信頼区間から明らかに外れるが、その標的に対するより高い結合親和性へのトレンドを示す（図２２Ｃ）。リガンド効率（非水素接触原子あたりの結合の自由エネルギー）（Ｋｕｎｔｚ，Ｉ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：９９９７）の観点では、アプタマーとＳＯＭＡｍｅｒは異なるように思われず（図２２Ｃ）、タンパク質ベース及び少分子ベースのリガンドを用いて観察された様々な値（Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ ４５０：１００１）を包含する。界面面積あたりの結合の自由エネルギーも同様である（図２２Ｃ）。しかし、異なる点は、極性接触あたりの結合の自由エネルギーの値であり、これは、ＳＯＭＡｍｅｒがアプタマーよりも約２倍大きく（図２２Ｂ及びＣ）、これは、ＳＯＭＡｍｅｒは、結合へのより大きな助力を疎水性相互作用から引き出すという考えと一致する。
〔00307〕 電荷−電荷相互作用は、折りたたまれたタンパク質の安定性に０．２ｋｃ
ａｌ／ｍｏｌ未満を寄与することが多い（Ｓａｌｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２０：７７９。これに対して、単一のメチレン基だけを埋めると、球状タンパク質の安定性及び／または結合相互作用に約１〜１．５ｋｃａｌ／ｍｏｌが寄与されると推定される（Ｋｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｔ．，Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３３：７８４；Ｐａｃｅ，Ｃ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０８：５１４）。ＳＯＭＡｍｅｒの構造によって、疎水性相互作用に強く依存していることが明らかになり、この意味で、タンパク質へのその結合は、典型的なタンパク質−タンパク質相互作用により酷似している。この知見に一致して、ＰＤＧＦに対するＳＬ５の親和性は、幅広い塩濃度（０．１から１．０Ｍ ＮａＣｌ）またはｐＨ値（５．０から８．８）にわたって事実上低下しないことを示し、これは、従来のアプタマーで見られる効果（Ａｈｍａｄ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６：ｅ２７０５１；Ｔａｎｇ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．Ｓｃｉ．３１５：９９）と対照的である。
〔00308〕 ＳＥＬＥＸ後の最適化は、形状相補性の微調整及び疎水性充填相互作用を
促進する。例えば、タンパク質界面における例外的なＰｅ−ｄＵ１７及びＴｈ−ｄＵ１８の形状相補性（図１０Ｂ）は、構造活性相関で確証される（図６Ｂ）。Ｂｎ−ｄＵ１はまた、ＰＤＧＦ−ＢＢとユニークな相互作用を形成し、ベンジル環が、Ｃｙｓ４３−Ｃｙｓ５２ジスルフィド結合及びＰＤＧＦの鎖１のＧｌｕ２４と鎖２のＡｒｇ５６の間の塩橋によって形成されるトンネル内に位置する（図１０Ｃ）。結晶構造によって、結合ポケットは、より大きな二環式置換基を含めた様々な側鎖を収容することができ、それによって、タンパク質と接触するこの箇所を増強することが示唆される。実際、本発明者らは、結合親和性を５から１０倍増強する、いくつかの修飾ヌクレオチド置換をこの位置で同定した（図６Ｂ）。
〔00309〕 ＰＤＧＦ−ＢＢ：ＳＬ５構造の注目すべき特徴は、ＳＯＭＡｍｅｒがＰＤ
ＧＦＲβを模倣する程度である。受容体は、ＰＤＧＦ界面の７つの疎水性アミノ酸を含む疎水性相互作用を主に介してＰＤＧＦに結合する（Ｓｈｉｍ，Ａ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７：１１３０７）。ＳＬ
５の結合部位は、タンパク質上の同じ疎水性の溝を占有するＢｎ−ｄＵ芳香族環を有する受容体のものと大きく重複する（図１１）。ＰＤＧＦは受容体と２４残基を有するＳＬ５の両方に接触し、２４残基のうちの１０は共有されている。これらの共有されたまたは「プロミスキャスな（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）」残基は、ＰＤＧＦの表面の結合エネルギーのホットスポットに相当する可能性がある（Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ ４５０：１００１；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：３８３。しかし、ＰＤＧＦ Ｒβと比較して、ＳＬ５は、ＰＤＧＦ−ＢＢに対して１０倍高い親和性を示す（Ｌｏｋｋｅｒ，Ｎ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３３０３７）。これらの知見に一致して、ＳＬ５はＰＤＧＦ−ＢＢの強力なインヒビターである（図１Ｂ及び図６Ｂ）。
結合親和性アッセイ
〔00310〕 標的結合親和性を決定するために、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及びγ−３２Ｐ−ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、ＳＯＭＡｍｅｒを５’末端標識した。結合アッセイは、約０．０３〜０．０５ｎＭの濃度の放射標識されたＳＯＭＡｍｅｒ（約２０，０００ｃ．ｐ．ｍ）及び１０−７から１０−１２Ｍに及ぶ濃度の標的タンパク質を、１×ＳＢ１８Ｔバッファー（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５；１２０ｍＭ ＮａＣｌ；５ｍＭ ＫＣｌ；５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０．０１％ＴＷＥＥＮ−２０）中で３７℃で３０分間インキュベートすることによって行った。結合した複合体を、Ｚｏｒｂａｘ樹脂と混合し、Ｄｕｒａｐｏｒｅフィルタープレートで捕獲した。結合したＳＯＭＡｍｅｒの画分をＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（ＦＵＪＩ ＦＬＡ−３０００）で定量化した。生の結合データをＺｏｒｂａｘ樹脂への放射標識されたＳＯＭＡｍｅｒの非特異的なバックグラウンド結合に対して補正した。平衡解離定数（Ｋｄ）を、以前に記載されたように（Ｊｅｌｌｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１１２２７）決定した。図５で示すように、２００ｎＭの濃度の競合物のｔＲＮＡをアイソフォームの特異性研究に含む。ＰＤＧＦ−ＢＢ／ＳＯＭＡｍｅｒとＥ１００３０の相互作用に対する塩依存性を測定するために、結合親和性アッセイを、４０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、０．０１％ＴＷＥＥＮ−２０及び１００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭまたは１．０ＭのいずれかのＮａＣｌ）の存在下で、上記のように行い、解析した。単純線形回帰を使用して、塩濃度対解離定数の両対数プロットを適合させた。プロットの傾きは、（Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｇ．Ｓ．（１９６９）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．５１：９２４）の対イオン凝集理論によって説明されているように、タンパク質結合の際にＤＮＡから遊離した対イオンの数を表す。ＰＤＧＦに対するアプタマー４１４９−８＿２６０（配列番号２１１）の親和性は、幅広い塩濃度（０．１から１．０Ｍ ＮａＣｌ）またはｐＨ値（５．０から８．８）にわたってほとんど変化を示さず、これは、従来のアプタマーで見られる効果（Ａｈｍａｄ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６：ｅ２７０５１；Ｔａｎｇ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．３１５：９９）と対照的である。
ＰＤＧＦ−ＢＢの細胞性リン酸化アッセイ
〔00311〕ＰＤＧＦ−ＢＢ活性。ＰＤＧＦ−ＢＢ ＳＯＭＡｍｅｒがＰＤＧＦ Ｒβの
活性化を阻害する能力を試験するために、Ｈｓ２７ヒト包皮線維芽細胞（アメリカ培養細胞系統保存機関）を５０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、２４時間血清飢餓させた。ＳＯＭＡｍｅｒ（図で示す様々な濃度）を、ＰＤＧＦ−ＢＢ（２０ｎｇ／ｍＬ）（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＭａｒｔ）とともに血清フリー培地において３０分間３７°Ｃでインキュベートし、次いで、血清飢餓させたＨｓ２７細胞にこの複合体を加えた。刺激してから５分後に、上清を捨て、溶解バッファー＃９（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ：
１％ＮＰ−４０代替品、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ活性化オルトバナジウム酸ナトリウム、１０μｇ／ｍＬアプロチニン及び１０μｇ／ｍＬロイペプチン）中で、細胞を氷上で５分間溶解した。製造者の指示書に従ってＤｕｏＳｅｔホスホ−ＰＤＧＦ Ｒβキット（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ホスホ−ＰＤＧＦ Ｒβのエライザ検出を行った。ホスホ−ＰＤＧＦ ＲβパーセントをＯＤ４５０で測定し、刺激なしの対照で、プレートの吸光度及びバックグラウンドシグナルについて補正した。実験は、一般に、２連または３連で行った。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ３．０でプロットし、非線形回帰を使用して一部位競合曲線に当てはめた。ＳＯＭＡｍｅｒ４１４９−８＿３７９及び５’アミノリンカー修飾されたＳＯＭＡｍｅｒ４１４９−８＿３７９についてＩＣ５０測定の代表的なプロットを図１３に示し、それぞれ１．６ｎＭ及び１．７ｎＭのＩＣ５０値である。
〔00312〕 クローン４１４９−８の変異体の活性スクリーニングのために、上記と同
じ条件下であるが、単一濃度（一般に２０ｎＭ）のＳＯＭＡｍｅｒ変異体において、Ｈｓ２７線維芽細胞におけるＰＤＧＦ−ＢＢ誘導性ＰＤＧＦ Ｒβリン酸化の阻害パーセントを評価した。
Ｎａｐ−ｄＵ修飾に基づくさらなるＰＤＧＦリガンド
〔00313〕 高親和性でＰＤＧＦ−ＢＢに結合するアプタマーを同定するために、Ｎａ
ｐ−ｄＵ修飾ヌクレオチドを含むライブラリーを用いて別のＳＥＬＥＸ実験を行った。選択は、上記の実施例１に記載されているものと実質的に類似した方法で行い、その結果、Ｎａｐ−ｄＵアプタマークローン５１６９−４を同定した。
〔00314〕 ＰＤＧＦ Ｎａｐ−ｄＵ ＳＥＬＥＸプールのディープシーケンシング：
５１６９−４＿１アプタマーファミリー内の配列をより完全に評価するために、４５４ピロシーケンシング技術を使用して第７ラウンドのプールをシーケンスした。４５４プライマーを用いてプールＤＮＡを増幅し、ＰＣＲ産物を精製し、Ｓｅｑｕａｌ標準化プレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１０５１０−０１）を使用して標準化した。溶出液をゲル上で泳動して、各増幅産物のサイズ及び純度を確認した。精製したＰＣＲ産物を、４５４ピロシーケンシング施設（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ
Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ ｉｎ Ａｕｒｏｒａ，ＣＯ）でシーケンスした。
〔00315〕 このプールからの配列データセットは８，２７３個の全長配列（すなわち
、両方のプライマー配列を含むそうした配列）を含んでおり、そのうちの１，６２９がユニークであった。これら１，６２９ユニークな配列を使用して、配列セットにおいて、４−ｍｅｒから３０−ｍｅｒまでのすべてのあり得るｎ−ｍｅｒを数えることによって、統計学的に有意なｎ−ｍｅｒパターンを見つけた。同定された各ｎ−ｍｅｒの数を同じ組成のプールからランダムに予想される数と比較することによって、統計学的に有意なパターンが見つかった。この配列セット中で２つの主要なパターンを同定し、５１６９−４＿１が、１１個の配列で見つかった保存配列モチーフ「ＡＰＧＰＡＰＧＣＡＣＡＰＣＰ」によって定義された第２のパターン内に整列していることが分かった。このモチーフに対する、すべてのユニークな配列の検索（同一性＝０．７５）によって、５１個の配列が見つかり、次いで、これらをモチーフによって整列させた。図１４に列挙するように、すべての配列について、アライメントの各位置での部分同一性（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を計算し、コンセンサス配列を示した。
〔00316〕 配列トランケーション研究：表６で示すように、５０ヌクレオチドの５１
６９−４クローンの５’末端及び３’末端からの体系的なトランケーションを行って、ア
プタマーのヒトＰＤＧＦ−ＢＢに対する完全な結合活性を保持するのに必要とされる最小の長さを定めた。これらのトランケーションに対するＫｄ値を示す（Ｐ＝ナフチル−デオキシウリジン（Ｎａｐ−ｄＵ）；Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴはデオキシリボヌクレオチド）。５１６９−４クローンは、トランケーションに非常に適していることが判明し、５０−ｍｅｒと比較して向上した結合親和性（それぞれ１７ｐＭ及び２９ｐＭ）でＰＤＧＦ−ＢＢに結合する２１ヌクレオチド配列を同定した（５１６９−４＿２６）。５１６９−４＿２６の２１−ｍｅｒは、５０−ｍｅｒの９個のＮａｐ−ｄＵ修飾ヌクレオチドと対比して、５つのＮａｐ−ｄＵ修飾ヌクレオチドを含んでいた。
〔00317〕 ５１６９−４＿２６（２１−ｍｅｒ）におけるＣ３スペーサー単一置換：
Ｎａｐ−ｄＵ ＰＤＧＦ−ＢＢアプタマーのＳＥＬＥＸ修飾後の第１ラウンドは、２１−ｍｅｒの５１６９−４＿２６のすべての位置でのＣ３スペーサーウォークを含んでいた。Ｃ３スペーサーウォークは、完全に除去できる可能性があり、Ｃ３スペーサーまたは他のリンカー、例えばヘキサエチレングリコール（Ｈｅｇ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーで置き換えることができる、高親和性結合に必要とされない塩基を同定することを意図する。Ｃ３スペーサー置換についての結果を表７に示す。この表では、「Ｐ」はＮａｐ−ｄＵを示し、「Ｃ３」はＣ３スペーサーを示し；Ａ、Ｃ及びＧはデオキシリボヌクレオチドを示し、「ＮＢ」は１００ｎＭ ＰＤＧＦ−ＢＢまで結合がないことを示す。以下の３部位は、わずかな結合親和性の低下でＣ３置換を許容した：Ｃ１、Ｇ６及びＣ７（以下に示すように、番号付けは２１−ｍｅｒを参照する）。１つの位置、Ｃ１５は、５１６９−４＿２６と比較して結合親和性に影響を及ぼさずに、Ｃ３スペーサー置換を許容した。
〔00318〕 ５１６９−４＿２６（２１−ｍｅｒ）における２’−Ｏ−メチル単一置換
： このヌクレアーゼ抵抗性置換を許容することができる位置を同定するために、すべての天然塩基において２’Ｏ−メチル置換を行った。本発明者らの実験室で合成した２’Ｏ−メチルＮａｐホスホラミダイト（Ｎａｐ−ｍＵ）を用いて、Ｎａｐ−ｍＵ単一置換を許容すると思われるＮａｐ−ｄＵの位置も評価した。加えて、各Ｎａｐ−ｄＵの重要性を評価するために、デオキシチミジン（Ｔ）でＮａｐ−ｄＵを置換した。結合親和性の結果を表８に示し、これは、すべての位置が様々な程度に２’Ｏ−メチル置換を許容したことを示す。各デオキシシチジンの位置（Ｃ）での２’Ｏ−メチル置換の影響は、結合親和性の２倍の低下までの５１６９−４＿２６と比較して、、結合親和性に変化をもたらさなかった。４つのデオキシグアノシン位置（Ｇ）は、２’Ｏ−メチルで置換した場合、５１６９−４＿２６と比較して、Ｇ１４における５．５倍の結合親和性の増大からＧ１０における５．５倍の結合親和性の低下まで変動する結果を示した。６つのデオキシアデノシン位置（Ａ）における２’Ｏ−メチル置換は、結合親和性に対して０から５０倍を越える悪影響があった。２’Ｏ−メチル置換に最も感受性である３つは、アプタマーの５’末端に向かうデオキシアデノシン（Ａ３、Ａ５及びＡ８）であった。位置２１のＮａｐ−ｄＵのみ、結合親和性に影響を及ぼさずにＮａｐ−ｍＵ置換を完全に許容したが、位置１１のＮａｐ−ｍＵ置換は、５１６９−４＿２６と比較して、２．５倍の結合親和性の低下を示した。残りのＮａｐ−ｍＵ置換は、１５から３０倍の結合親和性の低下をもたらした。（１００ｎＭまでのＰＤＧＦ−ＢＢの濃度で）結合を完全に排除した唯一の置換は、位置１２及び２１でのデオキシチミジン置換であり、残りのデオキシチミジン置換は、結合親和性に対して著しい負の効果（４００倍超）があった。表８では、Ｐ＝５−ナフタレン修飾ｄＵであり、上付きの１は２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドを示す。Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴは天然に存在するデオキシリボヌクレオチドを表し、「ＮＢ」は１００ｎＭ ＰＤＧＦ−ＢＢまで結合がないことを示す。
〔00319〕 ５１６９−４＿２６（２１−ｍｅｒ）における複数の２’−Ｏ−メチル置
換。５１６９−４＿２６における２’−Ｏ−メチル置換の組合せ効果は、変異体５１６９
−４＿１４６を含めた、結合親和性が向上したいくつかの変異体の同定につながる。この２１−ｍｅｒは２’Ｏ−メチルによってヌクレアーゼ保護された１１の位置を有し、その結合親和性は親トランケート体、５１６９−４＿２６よりも少なくとも２０倍大きい（それぞれ０．６０ｐＭ対１７ｐＭ）。多くの他の変異体も、３から１０個の２’Ｏ−メチルの組み合わせにより、著しい結合親和性の向上（約３倍）を有していた。表９では、Ｐ＝５−ナフタレン修飾ｄＵであり、上付きの１は２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドを示し、Ａ、Ｃ及びＧは天然に存在するデオキシリボヌクレオチドを表し、「ＮＢ」は３．２ｎＭのＰＤＧＦ−ＢＢまで結合がないことを示す。
ＰＤＧＦ Ｎａｐ−ｄＵアプタマーの活性アッセイ
〔00320〕 ＰＤＧＦ Ｒβの活性化に対するＰＤＧＦ Ｎａｐ−ｄＵアプタマーの阻
害的影響を解析するために、実施例４に記載されるように細胞性リン酸化阻害アッセイを行った。試験した４つのアプタマー配列は、以下のＩＣ５０値でＰＤＧＦ Ｒβの活性化を阻害した：５１６９−４＿２６、ＩＣ５０＝１．６ｎＭ；５１６９−４＿８４、ＩＣ５０＝３．３ｎＭ；５１６９−４＿８５、ＩＣ５０＝７．３ｎＭ；５１６９−４＿１１２、ＩＣ５０＝１．０ｎＭ。
ＶＥＧＦアプタマーの選択及び配列
〔00321〕 候補混合物の調製： ビオチン標識されたｓｓＤＮＡ鋳型にアニールした
ＤＮＡプライマーのポリメラーゼ伸長によって、部分的にランダム化されたｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの候補混合物を調製した。
〔00322〕 ＶＥＧＦ ＳＥＬＥＸの条件： 組換えヒトＶＥＧＦ−１２１タンパク質
に対するアプタマー（両方ともＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）は、Ｎａｐ−ｄＵでｄＴを置換した４０ヌクレオチドのランダム領域を含むライブラリーから、記載されているように（Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ５：ｅ１５００４）ＳｏｍａＬｏｇｉｃ Ｉｎｃによって選択された。ＶＥＧＦ−１２１に対して、フォワードプライマーは５’−ＧＣＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＣ−３’であり、リバースプライマーは５’−ＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣ−３’であった。ＶＥＧＦ−１２１タンパク質をビオチン標識し、ストレプトアビジンＭｙＯｎｅ−ＳＡ（Ｄｙｎａｌ）ビーズ上に分割した。動力学的負荷を使用して低解離速度を有するアプタマーの優先的な選択を達成し、ここでは、逐次的なラウンドにおいて、インキュベーション時間を延ばし、タンパク質濃度を低下させて、タンパク質−ＤＮＡ複合体を１０ｍＭデキストラン硫酸の存在下で３７℃でインキュベートした。ＶＥＧＦ−１２１ ＳＥＬＥＸでは、ラウンド４及び５は、１５分の動力学的負荷を含むが、ラウンド６及び７（最終ラウンド）は３０分の動力学的負荷を含んでいた。
〔00323〕 血管内皮増殖因子、ＶＥＧＦ−１２１の最小の選択的スプライシング型は
、ＳＥＬＥＸにとって難しいタンパク質標的である。本発明者らは、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡのライブラリーまたはリボースの２’位で修飾された核酸ライブラリーを用いて、わずかな程度の親和性度の向上さえも以前に得ることができなかった。これは、２つの理由で注目すべきことである。第１に、シスチンノットスーパーファミリーのメンバーの中で、ＶＥＧＦ−１２１は、１２４Ｃα原子について１．９Åの平均二乗偏差で、ＰＤＧＦ−ＢＢに対して最も高い構造的類似性を有する（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。第２に、より大きく、最も広く認められるＶＥＧＦアイソフォーム、ＶＥＧＦ−１６５は、ＳＥＬＥＸの優れた標的であることが証明されている。例えば、（黄斑変性症治療のために）今までに規制当局の承認を受けた唯一のアプタマーベースの治療剤であるペガプタニブ（Ｍａｃｕｇｅｎ）は、ヘパリン結合性のエクソン７にコードされるド
メイン（ＶＥＧＦ−１２１で欠けている）を介してＶＥＧＦ−１６５のみに結合する（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｒｕｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１６５とＰＤＧＦ−ＢＢの間の１つの相違点は全体の電荷であり、それぞれ５．８、８．５及び１０．１というｐＩ値を有する。これは、アプタマー結合における極性相互作用の重要性を指摘する。成功したＶＥＧＦ−１２１に対する親和性強化は、ＳＥＬＥＸ Ｎａｐ−ｄＵライブラリーで最終的に達成された。
〔00324〕 ＶＥＧＦ−１２１ Ｎａｐ−ｄＵアプタマー配列の同定： 上記のように
行ったＮａｐ−ｄＵ ＳＥＬＥＸ実験から、単一の位置が異なる非常に関連した２つの高親和性変異体（４８６７−１５及び４８６７−３１）を同定した。クローン４８６７−３１は、一連の欠損実験で２９−ｍｅｒにトランケートされていた（表７）。単一のヌクレオチドの違いは最小配列の５’境界の外側であるので、両方の高親和性クローン（４８６７−１５及び４８６７−３１）のトランケーションが、同じ２９−ｍｅｒをもたらすことは注目すべきである。高親和性結合を有するより短い配列を含むトランケート変異体、すなわち２９−ｍｅｒの４８６７−３１＿１４３（５’−ＣＣＧＰＰ ＣＡＡＧＰ ＧＣＰＰＧ ＰＡＧＧＡ ＰＰＰＡＡ ＡＰＧＧ−３’；「Ｐ」はＮａｐ−ｄＵの一文字記号である））及びそれに近い変異体は、０．１〜１ｎＭに及ぶ互角の親和性で、ヒトＶＥＧＦ−１２１、ヒトＶＥＧＦ−１６５、マウスＶＥＧＦ−１２０及びラットＶＥＧＦ−１６４に結合する（表１０）。この表では、「Ｐ」はＮａｐ−ｄＵを示し；Ａ、Ｃ及びＧは天然に存在するデオキシリボヌクレオチドを示し、「ＮＢ」は１００ｎＭのＶＥＧＦまで結合がないことを示す。
〔00325〕 ４８６７−１５＿２（５０−ｍｅｒ）におけるＣ３スペーサー単一置換。
ＶＥＧＦ−１２１アプタマーのＳＥＬＥＸ修飾後の第１ラウンドは、５０ｍｅｒの４８６７−１５＿２（トランケートされた５０−ｍｅｒ）のすべての位置でのＣ３スペーサーウォークであった。Ｃ３スペーサーウォークは、完全に除去できる可能性があり、Ｃ３スペーサーまたは他のリンカー、例えばヘキサエチレングリコール（Ｈｅｇ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーで置き換えることができる、高親和性結合に必要とされない塩基を同定することを意図する。Ｃ３スペーサー置換についての結果を表１１に示す。この表では、「Ｐ」はＮａｐ−ｄＵを示し、「Ｖ」はＣ３スペーサーを示し；Ａ、Ｃ及びＧは、天然に存在するデオキシリボヌクレオチドを示し、「ＮＢ」は１００ｎＭのＶＥＧＦまで結合がないことを示す。以下の少なくとも３つの内部部位はＣ３置換を許容した：Ｃ１７、Ｇ２６及びＧ２９（以下に示すように、番号付けは５０−ｍｅｒを参照する）。
〔00326〕 ４８６７−３１＿４３（３２−ｍｅｒ）における２’−Ｏ−メチル単一置
換。２’Ｏ−メチル置換を、このヌクレアーゼ抵抗性置換を許容することができる位置を同定するために、天然塩基において行った。加えて、各Ｎａｐ−ｄＵの重要性を評価するために、２’−ＯＭｅ−ウリジン（２’−ＯＭｅＵ）でＮａｐ−ｄＵを置換した。加えて、次に、この３２ｍｅｒに関して、押し出された塩基であると仮定されたある内部位置でＣ３スペーサーを試験した。内部欠損及び代替塩基も、３つの位置のそれぞれで試験した。選択したＳＯＭＡｍｅｒ（２０ｎＭの単一濃度）についての結合親和性及び細胞培養阻害データを以下に示す。結果を表１２に示し、これは、Ｃ８（表１１のＣ１７）は、より短いトランケートにおいてＣ３への置換を完全に許容しなかったことを示す。他の２つの推定上の押し出された塩基（Ｇ１７及びＧ２０）は、この文脈におけるＣ３または代替塩基置換として、優れた結合及び機能活性を保持する。それらの位置での内部欠損は許容されなかった。この実験では、Ｎａｐ−ｄＵ修飾のどれも２’ＯＭｅ−Ｕで置き換えることができなかった。しかし、いくつかの内部部位は２’ＯＭｅ修飾を許容した。表１２では、Ｐ＝５−ナフタレン修飾ｄＵであり、上付きの１は２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドを示し、Ｖ＝３炭素スペーサーであり、空のボックスはヌクレオシド欠損を示す。Ａ、Ｃ、Ｇ
及びＵは天然に存在するデオキシリボヌクレオチドを表す。
〔00327〕 ４８６７−３１＿１４３（２９−ｍｅｒ）における２’−Ｏ−メチルＮａ
ｐ−ｄＵ置換及び複数の２’−Ｏ−メチル置換。本発明者らの実験室で合成した２’Ｏ−メチルＮａｐホスホラミダイト（Ｎａｐ−ｍＵ）を用いて、Ｎａｐ−ｍＵ単一置換を許容すると思われるＮａｐ−ｄＵの位置を評価した。加えて、各天然塩基において、２’ＯＭｅとＣ３リンカー置換の組み合わせを試験した。選択したＳＯＭＡｍｅｒ（２０ｎＭの単一濃度）についての結合親和性及び細胞培養阻害データを以下に示す。以下の表１３で示すように、Ｎａｐ−ｄＵ残基の大部分はＯＭｅ置換を許容しなかったが、位置２２でのＮａｐ−ｄＵに対するＮａｐ−ｍＵの置換は、親和性を１０倍増大させ、優れた阻害活性を与えた。この表では、上付きの「１」は２’−Ｏ−メチル置換を示し、「Ｖ」はＣ３スペーサーを示す。２’−ＯＭｅの組み合わせは、親和性に基づいて大部分は許容性に優れるが、ある種の組み合わせは著しい阻害活性の低下を示した。
〔00328〕 ２’−Ｏ−メチルとＣ３置換の組合せ効果によって、変異体４８６７−３
１＿１８８を含めた、結合親和性が向上したいくつかの変異体が同定された。この２９−ｍｅｒは、２’ＯＭｅまたはＣ３のいずれかによってヌクレアーゼ保護された１０個の位置を有し、その結合親和性は、親トランケート体、４８６７−３１＿１４３よりも約３倍密接である（それぞれ３８ｐＭ対１４０ｐＭ）。変異体４８６７−３１＿１８８は、親ＳＯＭＡｍｅｒと比較して、互角の細胞性阻害活性を保持する。表１３を参照されたい。
〔00329〕 Ｎａｐ−ｍＵを許容した唯一の位置はヌクレオチド２２（親配列として４
８６７−３１＿１４３トランケート体を使用）であった。このＮａｐ−ｍＵ置換は、次に、最もよく組み合わされた２’ＯＭｅ ＳＯＭＡｍｅｒ、４８６７−３１＿１８８のバックグラウンドに入れられた。加えて、ヌクレアーゼ保護された塩基が分子に強剛性を与え、それによって結合が増大し得るという可能性を検討するために、位置１５でのＣ３スペーサーとの元のｄＧの置換をその位置での２’−ＯＭｅ置換と比較した。最もよい集計結果は、親の２９−ｍｅｒトランケート変異体４８６７−３１＿１４３と比較して今や９個の保護された位置を有する変異体、４８６７−３１＿１９２で得られた（以下の表１４を参照されたい；上付きの「１」は２’−Ｏ−メチル置換を示し、「Ｖ」はＣ３スペーサーを示す）。
〔00330〕 修飾ヌクレオチドの構造活性相関及び親和性成熟： １０個のナフチル側
鎖のそれぞれの、結合に対する寄与を検討するために、修飾ｄＵホスホラミダイトの特注ライブラリーを用いて５位変異体を化学的に合成することによって、別の一連の体系的な点置換を行った。この目的のために、サイズ、極性、Ｈ結合のドナー及びアクセプターの配置、リンカーの長さ及び５位置換基の配向を変えることによって各位置の微小環境を探ることが可能になるライブラリーを設計した。この解析のための官能基を選択する際に、元の修飾（この場合ナフチル基）、（トリプトファン及びチロシンのような）抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）で大きな比率を占めるアミノ酸側鎖（Ｍｉａｎ，Ｉ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１７：１３３；Ｒａｍａｒａｊ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１８２４：５２０）、及び小分子薬物の「プリビレッジド」断片（１７）というテーマに基づいて変異を含むことを目的とした。図１５は、Ｋｄ値の比（置換／無置換）として表される、これらの置換の結果を示す。１０個のＮａｐ−ｄＵの位置のそれぞれを試験した１７個の異なる修飾置換のうち、４つの置換（Ｔｒｐ−ｄＵ２７、ＮＥ−ｄＵ１６、ＭＢｎ−ｄＵ１０及びＢＴ−ｄＵ１６）だけが、ほとんどまたは全く結合親和性の影響がなかった。すべての他の置換は、様々な程度に結合親和性を弱くした。
〔00331〕 ＶＥＧＦ ＳＥＬＥＸプールのディープシーケンシング： ４１４９−８
＿１アプタマーファミリー内の配列をより完全に評価するために、４５４ピロシーケンシング技術を使用して、富化されたプールをシーケンスした。４５４プライマーを用いてプールＤＮＡを増幅し、ＰＣＲ産物を精製し、Ｓｅｑｕａｌ標準化プレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１０５１０−０１）を使用して標準化した。溶出液をゲル上で泳動して、各増幅産物のサイズ及び純度を確認した。精製したＰＣＲ産物を、４５４ピロシーケンシング施設（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ ｉｎ ＡｕｒｏｒＡ、ＣＯ）でシーケンスした。
〔00332〕 ＣＬＵＳＴＡＬ解析によって４５４シーケンスを４８６７−３１と整列さ
せた。プールからの配列データセットは、１３，１３９個の全長配列（すなわち、両方のプライマー配列を含むそうした配列）を含んでおり、そのうちの２，２３５個がユニークであった。これら２，２３５個のユニークな配列を、モチーフ５’−ＣＣＧＰＰ ＣＡＡＧＰ ＧＣＰＰＧ ＰＡＧＧＡ ＰＰＰＡＡ ＡＰＧＧ−３’について検索した。このモチーフを含む８６個の配列が見つかった。図１６に列挙するように、すべての配列について、各位置での４８６７−３１との同一性パーセンテージを計算した。
ＶＥＧＦの結合親和性アッセイ
〔00333〕 標的結合親和性を決定するために、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及びγ−３２Ｐ−ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、ＳＯＭＡｍｅｒを５’末端標識した。結合アッセイは、約０．０３〜０．０５ｎＭの濃度の放射標識されたＳＯＭＡｍｅｒ（約２０，０００ｃ．ｐ．ｍ）及び１０−７から１０−１２Ｍに及ぶ濃度の標的タンパク質を、１ＸＳＢ１８Ｔバッファー（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５；１２０ｍＭ ＮａＣｌ；５ｍＭ ＫＣｌ；５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０．０１％ＴＷＥＥＮ−２０）中で、３７℃で３０分間インキュベートすることによって行った。結合した複合体を、Ｚｏｒｂａｘ樹脂と混合し、Ｄｕｒａｐｏｒｅフィルタープレートで捕獲した。結合したＳＯＭＡｍｅｒの画分をＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（ＦＵＪＩ ＦＬＡ−３０００）で定量化した。生の結合データをＺｏｒｂａｘ樹脂への放射標識されたＳＯＭＡｍｅｒの非特異的なバックグラウンド結合に対して補正した。平衡解離定数（Ｋｄ）を以前に記載されたように（Ｊｅｌｌｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１２２７）決定した。
ＶＥＧＦの活性アッセイ
〔00334〕 ＶＥＧＦの−Ｒ２（血管内皮増殖因子受容体２）の細胞性キナーゼ活性に
対するＶＥＧＦ１２１ ＳＯＭＡｍｅｒの阻害的影響を解析するために、内生的に高レベルのＶＥＧＦ Ｒ２を発現するヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｌｏｎｚａ、＃ＣＣ−２５１９）を使用した。ＨＵＶＥＣ細胞を、２％ＦＢＳ、増殖因子（ｈＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、ＶＥＧＦ、ＨＦＧＦ−Ｂ、Ｒ３−ＩＧＦ−１）、ヘパリン、アスコルビン酸及びＧＡ−１０００（ゲンタマイシン、アンホテリシン−Ｂ）を含むＥＧＭ−２ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（＃ＣＣ−３１６２）を補充したＥＧＭ−２（内皮細胞増殖培地）に蒔いた。ＨＵＶＥＣ細胞が７０から８０％コンフルエンスに達したら、この細胞を２４ウェルプレートに蒔き（１０５細胞／ウェル）、血清フリー培地で一晩飢餓させた。
〔00335〕 ＳＯＭＡｍｅｒ（２０ｎＭの単一濃度またはある濃度範囲）を、１％ＢＳ
Ａを含む２０ｎｇ／ｍＬ（１ｎＭ）のＶＥＧＦ−１２１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、＃４４６４−ＶＳ）を有する培養物に、３７℃で３０分間加えた。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、プレインキュベートしたＶＥＧＦ−１２１／ＳＯＭＡｍｅｒ複合体で５分間刺激した。処理した細胞をＰＢＳで２回再び洗浄し、Ｈａｌｔホスファターゼインヒビター（Ｔｈｅ
ｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃７８４２８）を補充した氷冷の溶解バッファー（１％ＮＰ−４０代替品、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ活性化オルトバナジウム酸ナトリウム、１０μｇ／ｍＬアプロチニン及び１０μｇ／ｍＬロイペプチンを加えた。ヒトホスホ−ＶＥＧＦ
Ｒ２／ＫＤＲキット（Ｒ＆Ｄ、ＤＹＣ１７６６−２）を使用して、ＶＥＧＦ Ｒ２のリン酸化について細胞可溶化物を測定した。
〔00336〕 インビトロでの機能活性実験では、２０ｎＭのスクリーニング濃度でのク
ローン４８６７−３１の様々なトランケート変異体は、不死化したまたは初代のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）においてＶＥＧＦ−１２１またはＶＥＧＦ−１６５（１〜４ｎＭ）によって誘導されるＶＥＧＦＲ２のリン酸化を、本質的に完全に阻害することができる。ＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１＿４３及び４８６７−３１＿１９２について、ＩＣ５０測定の代表的なプロットを図１７に示し、それぞれ２．２ｎＭ及び２．１ｎＭのＩＣ５０値を有する。
〔00337〕 クローン４８６７−３１の変異体の活性スクリーニングのために、単一濃
度（一般に２０ｎＭ）のＳＯＭＡｍｅｒ変異体以外は上記と同じ条件下で、ＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦ誘導性ＶＥＧＦ Ｒ２リン酸化の阻害パーセントを評価した。
ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦアプタマーのホモ二量体構築物
〔00338〕 ＰＤＧＦ−ＢＢとＶＥＧＦの両方とも、チロシンキナーゼ受容体を二量体
させて受容体の自己リン酸化及びシグナル伝達を導くことによって生物学的効果を発揮する、ジスルフィド結合したホモ二量体である。ＰＤＧＦ−ＢＢアプタマー４１４９−８＿２６０の場合のように（結晶構造に基づく）、１つを超えるアプタマーがそのタンパク質標的に結合することができる場合、そうしたアプタマーは、タンパク質への個々のアプタマーサブユニットの同時結合を可能にするように、多量体構築物において共有結合され得る。これは、結合活性効果を介して親和性の向上につながり得る。容易に利用可能な化学反応に基づいて、２つのタイプのホモ二量体を合成した。これらは、１）Ｈｅｇあたり約２０Åの距離を与える０から６つのＨｅｇリンカーによって結合した頭−尾のホモ二量体、及び２）それぞれの側で１つから３つのＨｅｇ（すなわち、二量体において２つ、４つまたは６つのＨｅｇ総数）と組み合わせられた、合成ダブラーサポートを介して結合した、３’−３’ホモ二量体。４１４９−８＿３７９、５１６９−４＿２６及び４８６７−３１＿１９２のホモ二量体を競合結合アッセイで試験した。競合物の結合親和性の決定のために、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及びγ−３２Ｐ−ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、アプタマーリガンドを５’末端標識した。競合アッセイは、固定濃度の放射標識されたリガンド（１．０ｎＭ）を様々な濃度の競合物のアプタマー（１０−１１から１０−６Ｍ）と前もって混合することによって行った。リガンドと競合物の希釈物を、標的タンパク質（１００ｐＭ）とともに、１ＸＳＢ１８Ｔバッファー（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５；１２０ｍＭ ＮａＣｌ；５ｍＭ ＫＣｌ；５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０．０１％ＴＷＥＥＮ−２０）中で、３７℃で６０分間インキュベートした。結合した複合体を、Ｚｏｒｂａｘ樹脂と混合し、Ｄｕｒａｐｏｒｅフィルタープレートで捕獲した。結合したリガンドの画分をＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（ＦＵＪＩ ＦＬＡ−３０００）で定量化した。生の結合データを、競合物の添加なしの結合に対して標準化した。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ３．０でプロットし、非線形回帰を使用して一部位競合曲線に当てはめて、競合物のアプタマー（Ｋｉ）について平衡解離定数を決定した。
ＰＤＧＦホモ二量体：配列４１４９−８＿３７９（配列４１４９−８＿４３８から４１４９−８＿４４７まで）及び５１６９−４＿２６（配列５１６９−４＿１３４から５１６９−４＿１４３まで）のＰＤＧＦホモ二量体の構造を表１５に示す。４１４９−８＿３７９
ベースのホモ二量体については、競合アッセイで得られたＫｉ値によって、５’−３’の立体配置において、より長いリンカーが望ましいことが示唆され、これは、Ｈｅｇリンカーなしと比較して、５つのＨｅｇリンカーで１０倍を越える結合親和性の向上が測定された（それぞれ０．２５ｐＭ対４．２ｐＭ）ためである。３’−３’結合した４１４９−８＿３７９ホモ二量体では、より長い４つ及び６つのＨｅｇリンカーも、リンカーなしより少なくとも１０倍よく、２つのＨｅｇリンカーよりも約２倍よく機能した。５１６９−４＿２６ベースのホモ二量体については、Ｋｉ値によって、より長いＨｅｇリンカーは５’−３’の立体配置において有利であることが示され、これは、Ｋｉが、Ｈｅｇリンカーなしについての２８ｐＭから６つのＨｅｇリンカーについての３．６ｐＭへ向上したからである。５’−３’の立体配置において、５つと６つのＨｅｇリンカーについてのＫｉ値の違いはなかった。３’−３’結合した５１６９−４＿２６ベースのホモ二量体では、同じパターンが観察され、Ｈｅｇリンカーの長さが伸びるに従ってＫｉが向上した。これら６つのＨｅｇリンカーは、Ｈｅｇリンカーなしと比較して５倍のＫｉの向上を示した（それぞれ２．０ｐＭ対１１ｐＭ）。表１５及び１６では、Ｚ＝ベンジル−デオキシウリジン（Ｂｎ−ｄＵ）であり、Ｐ＝５−ナフタレン修飾ｄＵ（Ｎａｐ−ｄＵ）であり、Ｍ＝メチレンジオキシベンジル−ｄＵ（ＭＢｎ−ｄＵ）であり、上付きの１は２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドを示し、上付なしはデオキシリボヌクレオチドを示し、「Ｃ３」は３炭素リンカーを示し、「Ｈ」はヘキサエチレングリコールリンカーを示す。
ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦヘテロ二量体アプタマー構築物
〔00339〕 ＰＤＧＦアプタマー４１４９−８及びＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１
に基づくヘテロ二量体。
ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦに対して特異性を有する構築物を開発することを目的として、ＰＤＧＦアプタマーに結合したＶＥＧＦアプタマーを含む様々なアプタマー構築物を設計し、試験した。試験した第１のアプタマー構築物は、ＰＤＧＦ変異体４１４９−８＿２７３とＶＥＧＦ ４８６７−３１＿１８３を組み合わせた。アプタマー構築物を頭−尾で合成し、両方の配向（５’末端にＰＤＧＦアプタマーまたは５’末端にＶＥＧＦアプタマーのいずれかを有する）で、０から３つのヘキサエチレングリコール（Ｈｅｇ）リンカーによって結合した。結果を以下の表１７及び１８に示す。表１７では、「Ｚ」はＢｎ−ｄＵを示し、「Ｐ」はＮａｐ−ｄＵを示し、上付きの「１」は２’−Ｏ−メチル置換を示し、上付なしはデオキシリボヌクレオチドを示し、「Ｖ」はＣ３スペーサーを示し、「Ｈ」はヘキサエチレングリコール（Ｈｅｇ）リンカーを示す。表１８では、残存活性パーセントは、対照（アプタマーなし）と比較した、２０ｎＭアプタマーの存在下でのＨｓ２７線維芽細胞における分画のＰＤＧＦ βＲリン酸化レベルを示す。
〔00340〕 ＰＤＧＦ−ＢＢ、−ＡＢ、ＶＥＧＦ−１２１及びＶＥＧＦ−１６５に対す
る結合親和性に基づくと、アプタマー構築物４１４９−８＿３２０は、この実験において最もよい結果をもたらすように思えた。表１８で示すように、ＰＤＧＦ細胞性リン酸化アッセイでもアプタマー構築物を試験した。機能的アッセイのデータに基づくと、試験したすべてのアプタマー構築物は、Ｈｓ２７線維芽細胞において、ＰＤＧＦ−ＢＢ誘導性ＰＤＧＦ βＲリン酸化を阻害した。アプタマー構築物４１４９−８＿３１３、４１４９−８＿３１４、４１４９−８＿３１５、４１４９−８＿３１６、４１４９−８＿３１９及び４１４９−８＿３２０は、ＰＤＧＦ−ＢＢ誘導性ＰＤＧＦ βＲリン酸化を２０ｎＭ未満のＩＣ５０値で阻害した。アプタマー構築物４１４９−８＿３１７及び４１４９−８＿３１８は、約２０ｎＭのＩＣ５０値を有していた。
〔00341〕 ４１４９−８＿３２０（５’ＰＤＧＦ−３Ｈｅｇ−ＶＥＧＦ３’）の立体
配置に基づいて、ＰＤＧＦアプタマー４１４９−８＿３７９及びＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１＿１９２を含む４１４９−８＿４０１を合成した。表１９を参照されたい。こ
の表では、「Ｚ」はＢｎ−ｄＵを示し、「Ｐ」はＮａｐ−ｄＵを示し、ＭはＭＢｎ−ｄＵを示し、上付きの「１」は２’−Ｏ−メチル置換を示し、上付なしはデオキシリボヌクレオチドを示し、「Ｃ３」はＣ３スペーサーを示し、「Ｈ」はヘキサエチレングリコール（Ｈｅｇ）リンカーを示す。アプタマー構築物４１４９−８＿４０１は、その前駆体アプタマー構築物、４１４９−８＿３２０と同等以上の、ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＶＥＧＦ１２１に対する結合親和性を示した。表２０を参照されたい。
〔00342〕 アプタマー構築物４１４９−８＿３２０及び４１４９−８＿４０１は、Ｈ
ｓ２７線維芽細胞において、それぞれ約１ｎＭ及び５ｎＭのＩＣ５０値でＰＤＧＦ−ＢＢ誘導性ＰＤＧＦ−Ｒβリン酸化を阻害した。さらに、２０ｋＤａまたは４０ｋＤａのＰＥＧのいずれかにコンジュゲートした５’アミノリンカーを含むアプタマー構築物４１４９−８＿４０１は、Ｈｓ２７線維芽細胞において、約１ｎＭのＩＣ５０値でＰＤＧＦ−ＢＢ誘導性ＰＤＧＦ−Ｒβリン酸化を阻害する能力を維持した。これらの結果は、アッセイにおけるすべてのＰＤＧＦ（１ｎＭの単量体）の化学量論的タイトレーション／阻害と一致する。
〔00343〕 アプタマー４１４９−８＿３７９及び４８６７−３１＿１９２を含む別の
セットのアプタマー構築物を試験して、全体的なリンカーの長さ並びにＰＤＧＦ及びＶＥＧＦアプタマーの配向の影響を決定した。以下の表２１を参照されたい。５’末端にＶＥＧＦを用いて、１つから６つのＨｅｇリンカーを試験した。５’末端にＰＤＧＦを用いて、３つのＨｅｇリンカーを有する４１４９−８＿４０１を含めて、２つから６つのＨｅｇリンカーを試験した。１つのＨｅｇリンカー変異体は、関連した変異体である４１４９−８＿３１８において、やや低減した結合を示したので、この配向で試験しなかった。結合データを表１６に示す。ＰＤＧＦ−ＢＢに対してやや弱い親和性を示した４１４９−８＿４０８及び４１４９−８＿４０９を除いて、アプタマー構築物の大部分はよく機能した。比較のために、ＯｐｈｔｈｏｔｅｃｈのアプタマーＥ１００３０（Ｆｏｖｉｓｔａ）の結合親和性を含める。
〔00344〕 アプタマー構築物４１４９−８＿４０１がインビトロでＰＤＧＦ及びＶＥ
ＧＦの両方の活性を阻害する能力を、上記の受容体リン酸化実験で試験した。アプタマー構築物４１４９−８＿４０１は、ＰＤＧＦ単量体４１４９−８＿３７９のものに匹敵する効力で（それぞれ２．４ｎＭ及び１．７ｎＭのＩＣ５０値）、Ｈｓ２７線維芽細胞においてＰＤＧＦ誘導性ＰＤＧＦＲβリン酸化を阻害した。同様に、アプタマー構築物４１４９−８＿４０１は、ＶＥＧＦ単量体４８６７−３１＿１９２のものに匹敵する効力で（それぞれ０．７ｎＭ及び２．１ｎＭのＩＣ５０値）、ＨＵＶＥＣ細胞においてＶＥＧＦ誘導性ＶＥＧＦＲ２リン酸化を阻害した。図１８は、この実験の結果を示す。図１８Ａは、（Ａ）ＰＤＧＦアプタマー４１４９−８＿３７９（白丸）及びＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物４１４９−８＿４０１（黒丸）を用いた、Ｈｓ２７線維芽細胞におけるＰＤＧＦ誘導性ＰＤＧＦ Ｒβリン酸化の阻害、並びに（Ｂ）ＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１＿１９２（白丸）及びＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物４１４９−８＿４０１（黒丸）を用いた、ＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦ誘導性ＶＥＧＦ Ｒ２リン酸化の阻害を示す。
〔00345〕 ＰＤＧＦアプタマー５１６９−４及びＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１
に基づくヘテロ二量体。
ＰＤＧＦアプタマー５１６９−４＿２６及びＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１＿１９２の変異体に基づくさらなるヘテロ二量体構築物を設計し、試験した。アプタマー構築物を頭−尾で合成し、両方の配向（５’末端にＰＤＧＦアプタマーまたは５’末端にＶＥＧＦアプタマーのいずれかを有する）で、１つから６つのヘキサエチレングリコール（Ｈｅｇ）リンカーによって結合した。表２２に結果を示す。５’末端にＶＥＧＦを用いると、３つから６つの間のＨｅｇリンカーが最も高い親和性をもたらした。ＶＥＧＦ−１２１アプ
タマー配列が３’末端にある時は一般に親和性はわずかに低く、５６ｐＭのＫｄを有していた５つのＨｅｇリンカー配列を除いて、大部分のＫｄ値は１００〜３００ｐＭの範囲に入った。５’末端にＰＤＧＦを用いると、Ｋｄ値は、３つのＨｅｇリンカーに対する１１ｐＭから４つのＨｅｇリンカーに対する０．５４ｐＭまでに及び、残りのＫｄ値は、すべての他のＨｅｇリンカーの長さの間に入った。ＰＤＧＦが３’末端にある場合は、リンカーの長さが伸びるに従って、より高い結合親和性に向かうトレンドがあり、１つのＨｅｇリンカーは５．３ｐＭのＫｄを有し、６つのＨｅｇリンカーは０．２０ｐＭのＫｄを有していた。表２２では、「Ｐ」はＮａｐ−ｄＵを示し、上付きの「１」は２’−Ｏ−メチル置換を示し、上付なしはデオキシリボヌクレオチドを示し、「Ｈ」はヘキサエチレングリコール（Ｈｅｇ）リンカーを示す。
ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦへのＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物の同時結合
〔00346〕 ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物が同時にＶＥＧＦ及びＰＤＧＦに結
合する能力を実証するために、サンドイッチアッセイを開発した。手短に言えば、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレートをヒトＰＤＧＦ−ＢＢまたはヒトＶＥＧＦ−１２１（２０ｎｇ／ｍＬ）のいずれかでコーティングした。１％ＢＳＡ溶液でウェルをブロッキングしてから、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物を加え（１０ｎＭ）、吸着したタンパク質標的に結合させた。洗浄してから、ビオチン標識された相補的タンパク質（ＶＥＧＦ−１２１をコーティングしたプレートに対して２ｎＭのＰＤＧＦ−ＢＢ及びＰＤＧＦ−ＢＢをコーティングしたプレートに対して２ｎＭのＶＥＧＦ−１２１またはＶＥＧＦ−１６５）を結合させて、３元複合体を形成した。さらに洗浄してから、西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートしたストレプトアビジン（ＨＲＰ−ＳＡ）を加えて、４元複合体を形成させた。最終的な洗浄の後、製造業者の指示に従って（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＴＭＢ基質キット３４０２１）発色性の西洋ワサビペルオキシダーゼ基質を加え、適切な時に１．６Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止した。ウェルあたりの４５０ｎｍでの吸光度を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５プレートリーダーを用いて自動検査（ａｕｔｏ ｃｈｅｃｋ ｏｎ）で測定した。上記の方法と並行して、４元複合体を構成する４成分のうちの１つを除いた、一連の４つの対照実験を行った。
〔00347〕 図１９で示すように、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物ＳＬ１０１２
（２０ｋＤａ ＰＥＧ−Ｎ−４１４９−８＿４０１）は、ヒトＶＥＧＦ−１２１及びＰＤＧＦ−ＢＢに同時に結合することができた。４元複合体のすべての成分が加えられた（完全）場合に強いシグナルが観察されたが、４成分のうちのいずれか１つを欠くと、バックグラウンドまたはバックグラウンド近くのシグナルになった。ＰＤＧＦをコーティングしたプレート及びＶＥＧＦをコーティングしたプレートで同様の結果が得られ、これは、アプタマー構築物へのタンパク質添加の順序は問題とならなかったことを示す。図１９で示すように、ＳＬ１０１２はヒトＶＥＧＦ−１６５及びＰＤＧＦ−ＢＢに同時に結合することができた。図１９Ａは、ビオチン標識ＰＤＧＦを加えた、ＶＥＧＦでコーティングされたマイクロタイタープレートを示す。図１９Ｂは、ビオチン標識ＶＥＧＦを加えた、ＰＤＧＦでコーティングされたマイクロタイタープレートを示す。データは、平均＋９５％信頼区間（ｎ＝３）として示す。４元複合体のすべての成分が加えられた（完全）場合に強いシグナルが観察されたが、成分のうちのいずれかを除くと、バックグラウンドまたはバックグラウンド近くのシグナルになった。データは、アプタマー構築物の５’末端へのＰＥＧ部分の付加は、同時結合活性を妨げないことも示す。
〔00348〕 （Ａ）ＳＬ１０１２または及び（Ｂ）ＳＬ１０１３（４０ｋＤＡのＰＥＧ
−Ｎ−４１４９−８−４０１）へのヒトＶＥＧＦ−１６５及びヒトＰＤＧＦ−ＢＢの同時結合を図２０に示す。マイクロタイタープレートを、ビオチン標識ＶＥＧＦを加えてＰＤＧＦでコーティングした。完全は、４元複合体のすべての成分の添加を意味し、４成分の
うちの１つがない各条件をグラフに示す。データは、平均＋９５％信頼区間（ｎ＝３）として示す。
〔00349〕 ＰＥＧ部分を含まない様々なアプタマー構築物を用いて、同様の実験を行
った。先の結果によって、シグナルを生成するのに複合体の他の成分が必要であることが示されたので、この実験では、アプタマーなしの対照のみを含む。図２１で示すように、アプタマー構築物４１４９−８＿３１７、４１４９−８＿３１８、４１４９−８＿３２０、４１４９−８＿４０１及び４１４９−８＿４１４は、タンパク質添加の順序にかかわらず、ＰＤＧＦとＶＥＧＦに同時に結合した。図２１（Ａ）は、ビオチン標識ＰＤＧＦを加えた、ＶＥＧＦでコーティングされたマイクロタイタープレートを示し、図２１（Ｂ）は、ビオチン標識ＰＤＧＦを加えた、ＰＤＧＦでコーティングされたマイクロタイタープレートを示す。
ＰＤＧＦアプタマー５１６９−４及びＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１の変異体に基づくヘテロ二量体構築物の同時結合に関するデータを加える。
硝子体内薬物動態研究
〔00350〕 アプタマー及びアプタマー構築物が眼の中でどのように挙動するかを理解
するために、最初の眼薬物動態試験を行った。表２３で示すように、４つのアプタマー及びアプタマー構築物を試験した。
〔00351〕 各アプタマーまたはアプタマー構築物について、５匹のニュージーランド
ホワイトウサギの両眼（１０個の眼）に単回の硝子体内注射を行った。０．５ｍｇ／眼の用量（ＳＬ１０１０及びＳＬ１０１１）または１．０ｍｇ／眼の用量（ＳＬ１０１２及びＳＬ１０１３）のいずれかを動物に与えた。これらの用量は、アプタマーまたはアプタマー構築物の重量のみに相当する（ＰＥＧの重量は計算から除外した）。すべての試験物は、リン酸緩衝食塩水に製剤化した。各アプタマーまたはアプタマー構築物の試験物について、投与後２、２４、４８、９６または１９２時間目に１動物の両眼から硝子体液試料を収集した。硝子体液試料は、アッセイするまで凍結保存した。
〔00352〕 アプタマーまたはアプタマー構築物の硝子体液濃度を、２６０ナノメート
ル（ｎｍ）の吸光度による検出で、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）アッセイ法によって測定した。手短に言えば、硝子体ヒドロゲルを、２０ゲージの針を数回通過させることによって剪断した。２倍量の２−エトキシエタノールを添加することによって、硝子体タンパク質を沈殿させた。遠心分離に続いて、上清を回収し、Ａｃｑｕｉｔｙ（登録商標）Ｃ１８カラム（０．２×１００ｍｍ）に注入した。カラム温度は８０℃であり、流速は０．２ｍＬ／分で維持した。バッファーＡは、ＴＥＡＡ ｐＨ７．０及び５％アセトニトリルから成っていた。バッファーＢは、１００％アセトニトリルから成っていた。プログラムは試料注入後１分間５０％バッファーＢを保持し、次いで、バッファーＢを４分にわたり直線的に７０％まで増大させた。２６０ｎＭの吸光度によって検出した。既知の濃度のアプタマーまたはアプタマー構築物で作成された検量線によって得られたものに対して未知試料のピーク吸光度ユニットを補間することによって、硝子体液中のアプタマーまたはアプタマー構築物の濃度（遊離酸当量）を決定した。
〔00353〕 この実験の結果を表２４に示す。
〔00354〕 硝子体濃度対時間の自然対数の通常の線形回帰当てはめにより、ＳＬ１０
１０、ＳＬ１０１１、ＳＬ１０１２及びＳＬ１０１３についてそれぞれ１０５、４７、６９及び９２時間の硝子体半減期が推定された。表２５は、結果を９５％信頼区間とともに示す。
〔00355〕 これらの硝子体半減期は、同様のサイズの治療的ＶＥＧＦインヒビター、
例えば、Ｍａｃｕｇｅｎ（８３時間、Ｅｙｅｔｅｃｈ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ（２００２）Ｒｅｔｉｎａ ２２：１４３）及びＬｕｃｅｎｔｉｓ（７０時間、Ｇａｕｄｒｅａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｒｅｔｉｎａ ２７：１２６０）のＮＺＷウサギにおける半減期に引けを取らない。したがって、これらのアプタマー及びアプタマー構築物は、ＡＭＤ及び糖尿病性網膜症などの眼部疾患の治療に有用であり得る。
材料及び方法
〔00356〕本実施例は、続行する実施例で使用される一般的な方法及び材料の概要を提供
する。
〔00357〕 質量分析（ＬＣＭＳ）に連結した液体クロマトグラフィーによるヌクレアー
ゼ感受性部位の決定： ＤＮａｓｅ Ｉによる消化のために、ポリアクリルアミドゲル精製したアプタマー（５００ｎＭの終濃度）を、１５０μＬの全反応量で、ヌクレアーゼバッファー（５１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．６、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２）において３７℃で、組換えヒトＤＮａｓｅ Ｉ（Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＣＳＩ１０７１９）（４１４９−８＿３７９に対して０．３ユニット及び５１６９−４＿１４６に対して３ユニット）とともにインキュベートした。０、３０及び６０分にアリコート（５０μＬ）を収集し、９５℃で５分間インキュベートして反応を終了した。ＤＮａｓｅ ＩＩでの消化のために、５００ｎＭのゲル精製されたアプタマーを、１５０μＬの全反応量で、ヌクレアーゼバッファー（１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．６、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ ＮａＣｌ）において３７℃で、ブタＤＮａｓｅ ＩＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（４８６７−３１＿１９２に対して１８ユニット、４１４９−８＿３７９に対して１ユニット）とともにインキュベートした。アリコートを収集し、上記のように反応を停止した。４８６７−３１＿１９２及び４１４９−８＿３７９の５’−アミンを含むバージョン及び５１６９−４＿１４６の５’−ＯＨを含むバージョンをこれらの実験に利用した。
〔00358〕 ヌクレアーゼ消化に続いて、全長及びアプタマー断片を液体クロマトグラ
フィーによって分離し、紫外吸光度及び質量分析（ＬＣＭＳ）で検出した。手短に言えば、真空脱ガス装置（型番Ｇ１３２２Ａ）、オートサンプラー（型番Ｇ１３１３Ａ）、バイナリーポンプモジュール（型番Ｇ１３１２Ａ）、温度コントロールを有するカラムマネージャー（型番Ｇ１３１６Ａ）及び可変波長検出器（型番Ｇ１３１４Ａ））を備えた、Ｂｒｕｋｅｒ Ｅｓｑｕｉｒｅ ３０００イオントラップ質量分析計に連結されたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣから成るＬＣＭＳシステムで試料を解析した。ＬＣＭＳの実施は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ（登録商標）ソフトウェア（バージョンＢ．０１．０３）を用いて行った。クロマトグラフィーは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＰＲＰ−３、２．１×１５０ｍｍカラムを使用して８０℃で行った。移動相Ａは、１０ｍＭピペリジン及び１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ約１０（調整されていない）を含んでおり；移動相Ｂは、７５／２５のアセトニトリル／水中に１０ｍＭピペリジン及び１０ｍＭイミダゾールを含んでいた。流速は０．２５ｍＬ／分であり、傾斜容出は０〜１分：０％Ｂ；１〜２０分：０〜５３％Ｂであった。試料（２０μＬ）を注入し、吸光度を２５４ｎＭで測定した。典型的な質量分析検出のソース条件は以下のようであった：負イオンエレクトロスプレーイオン化モード、５０ｐｓｉでのネブライザー圧力、７Ｌ／分での乾燥ガス、ソース温度を３２５℃に設定、及びキャピラリー電圧を３０００Ｖに設定。トラップ条件は、スキャン範囲２００から２２００ｍ／ｚ、蓄積時間５０ミリ秒、トラップドライブ９２、平均化２５スペクトルであった。
〔00359〕 Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ（登録商標）２．０を使
用してデータを処理した。ＴＩＣにおいて観察されたピークの全域にわたって合計し、Ｓｖｉｔｓｋｙ−Ｇｏｌａｙアルゴリズム（スムージング幅＝０．８ｍ／ｚ、サイクル＝２）を使用してスムージングすることによって、マススペクトルを得た。Ｄａｌｔｏｎｉｃｓソフトウェア内のアルゴリズムを使用して、スペクトルをデコンヴォルーションした。パラメーターは、２０００〜３００００Ｄａの間の質量範囲、１０％の存在量カットオフ（ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｃｕｔｏｆｆ）、３の成分の最小ピーク（ｍｉｎｉｍｕｍ ｐｅａｋｓ ｉｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ３）及び０．０５％の分子量の一致（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ）を含んでいた。
〔00360〕 ＤＮａｓｅ Ｉのアプタマー安定性アッセイ： ２５０ｎＭの終濃度のポ
リアクリルアミドゲル精製アプタマーを、１００μＬの全反応量で、ヌクレアーゼバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．６、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ
ＣａＣｌ２）において３７℃で、２または１０ユニット／ｍＬの組換えヒトＤＮａｓｅ
Ｉ（Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＣＳＩ１０７１９）とともにインキュベートした。様々な時間で、２０μＬのアリコートを収集し、等量の２×ゲルローディングバッファー（９３．８５％ホルムアミド、０．０３％ＳＤＳ、２０ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．０１％キシレンシラノール及び０．０１％オレンジＧ）を加えて反応を停止し、９５℃で２分間加熱した。試料を１５％ＴＢＥポリアクリルアミド変性ゲル（８Ｍ尿素）にロードし、２００Ｖで２０分間電気泳動を行った。約２μＭのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｓ１１４９４）で１０分間ゲルを染色して、バンドを可視化た。ＦｌｏｕｒＣｈｅｍ（登録商標）Ｑ解析ソフトウェア（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）を使用して、各時点での残存全長アプタマーの量を定量化した。必要に応じて、バックグラウンド除去の後に各バンドの強度を測定し、データを、０時点での全長投入ＤＮＡの残存パーセンテージとして示す。５’末端アミンを持つアプタマー４１４９−８＿３７９を除いて、５’末端にヒドロキシルを有するアプタマーをこれらの実験に利用した。
〔00361〕 ＤＮａｓｅ ＩＩのアプタマー安定性アッセイ： ２５０ｎＭの終濃度の
ポリアクリルアミドゲル精製アプタマーを、１００μＬの全反応量で、ヌクレアーゼバッファー（０．１Ｍ ＮａＯＡｃ ｐＨ４．６、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ ＮａＣｌ２）において３７℃で、１２０ユニット／ｍＬまたは２４０ユニット／ｍＬのブタＤＮａｓｅ ＩＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）とともにインキュベートした。様々な時間で、２０μＬのアリコートを収集し、等量の２×ゲルローディングバッファー（９３．８５％ホルムアミド、０．０３％ＳＤＳ、２０ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．０１％キシレンシラノール及び０．０１％オレンジＧ）を加えて反応を停止し、９５℃で２分間加熱した。試料を１５％ＴＢＥポリアクリルアミド変性ゲル（８Ｍ尿素）にロードし、２００Ｖで２０分間電気泳動を行った。約２μＭのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｓ１１４９４）で１０分間ゲルを染色して、バンドを可視化した。ＦｌｏｕｒＣｈｅｍ（登録商標）Ｑ解析ソフトウェア（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）を使用して、各時点での残存全長ＳＯＭＡｍｅｒの量を、定量化した。必要に応じて、バックグラウンド除去後に各バンドの強度を測定し、データを、０時点での全長投入ＤＮＡの残存パーセンテージとして示す。５’末端アミンを持つアプタマー４１４９−８＿３７９を除いて、５’末端にヒドロキシルを有するアプタマーをこれらの実験に利用した。
〔00362〕 ウサギ硝子体液におけるＳＯＭＡｍｅｒ安定性アッセイ： ニュージーラ
ンドホワイトウサギ由来の９０％のプールされた硝子体液（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＩＩＣ、カタログ番号ＲＡＢ−ＶＩＴＨＵＭ中で、５００ｎＭの終濃度のポリアクリルアミドゲル精製アプタマーをインキュベートした。試料を、２００μＬの全反応量で、
３７℃でインキュベートした（試料は、０．０６７％の終濃度のリン酸緩衝食塩水も含んでいた）。様々な時点で、２０μＬのアリコートを収集し、等量の２×ゲルローディングバッファー（９３．８５％ホルムアミド、０．０３％ＳＤＳ、２０ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．０１％キシレンシラノール及び０．０１％オレンジＧ）を加えて、反応を停止した。処理するまで試料を−２０℃で貯蔵した。各試料に１００μＬの水を加え、続いて、１５０μＬの２５：２４：１フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ＡＭＲＥＳＣＯ）を加えた。試料を混合し、１６，１００×ｇで１５分間遠心分離した。水相を収集し、ゲル解析まで−２０℃で凍結した。試料（１５μＬ）を１５％ＴＢＥポリアクリルアミド変性ゲル（８Ｍ尿素）にロードし、電気泳動を約２０分間２００Ｖで行った。約２μＭのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｓ１１４９４）で１０分間ゲルを染色して、バンドを可視化した。ＦｌｏｕｒＣｈｅｍ（登録商標）Ｑ解析ソフトウェア（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）を使用して、各時点での残存全長ＳＯＭＡｍｅｒの量を定量化した。必要に応じて、バックグラウンド除去後に各バンドの強度を測定し、データを、０時点での全長投入ＤＮＡの残存パーセンテージとして示す。
〔00363〕 競合結合アッセイ法： Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及びγ−［３２Ｐ］ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、競合結合アッセイでリガンドとして使用されるアプタマーを５’末端標識した。非標識競合物（１０−６から１０−１１Ｍに及ぶ濃度）と等量の２ｎＭのリガンドとを１×ＳＢ１８Ｔバッファー［４０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０．０１％ＴＷＥＥＮ−２０］中で混ぜることによって、競合アッセイを行った。１×ＳＢ１８Ｔバッファーに入れた２００ｐＭの濃度のヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ）をリガンド／競合物の混合物に加え、反応物を３７℃で４０分間インキュベートした。結合した複合体を、Ｚｏｒｂａｘ（登録商標）樹脂（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合し、Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）フィルタープレートで捕獲した。各ウェルのシグナルをＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（ＦＵＪＩ ＦＬＡ−３０００）で定量化した。生の結合データをバックグラウンドシグナルに対して補正し、競合物なしに関する結合画分に対して標準化した。阻害定数（Ｋｉ）を決定するために、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）６でデータをプロットし、一部位競合曲線に当てはめた。
ヌクレアーゼ安定性が向上したＶＥＧＦアプタマー
〔00364〕 本実施例は、アプタマーのヌクレアーゼ安定性を向上する、ＶＥＧＦアプ
タマーに適用される化学修飾を提供する。本実施例では、アプタマーに関して以下の省略形を使用する：ＰはＮａｐｄＵであり、２’−ＯＭｅは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである。ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合するように選択されたＮａｐｄＵ含有低オフ速度修飾アプタマー（ＳＯＭＡｍｅｒ）のヌクレアーゼ抵抗性を増強するために、ＶＥＧＦタンパク質への結合が顕著に影響されないヌクレオチドの位置に２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）基を付加した。これらの試みによって、２９ヌクレオチド配列内に９個の２’−ＯＭｅ基を含むアプタマー４８６７−３１＿１９２が発見された。４８６７−３１＿１９２におけるＮａｐ−ｄＵ ヌクレオチド、２’−ＯＭｅ置換及び３’末端での逆位デオキシチミジンの付加の使用は、共に、未修飾ＤＮＡと比較してかなりの程度のヌクレアーゼ保護を与える。それにもかかわらず、いくつかのヌクレアーゼの存在下で、４８６７−３１＿１９２はまだ十分に安定的でない。例えば、ヒト組換えＤＮａｓｅ Ｉに対して安定的である一方（図２３Ａ）、４８６７−３１＿１９２はブタＤＮａｓｅ ＩＩによって消化される（図２３Ｂ）。図２３Ｂで示すように、全長アプタマーの量の経時的低下は、ＤＮａｓｅ ＩＩによる消化に対する感受性を示す。
〔00365〕 さらにホスホロチオエート結合を使用してアプタマーを安定化させること
の実現可能性を判定するために、アプタマー４８６７−３１＿１９２のどの位置がＶＥＧＦ１２１への結合に顕著に影響を与えることなくホスホロチオエート結合を受容することができるかを決定する目的で、個々のホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオエートの体系的な置換（「ホスホロチオエートウォーク」実験）を行った。本実施例及び続行する実施例のすべての配列について、上付きの「１」を有するヌクレオチドは、ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル修飾を有することを示し、上付きの「２」を有するヌクレオチドは、ヌクレオチドが３’−ホスホロチオエート基を有し、そのヌクレオチドをその直ぐ３’側のヌクレオチドに結合させることを示す）。上付きの「１」及び「２」の両方を有するヌクレオチドは、ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル修飾と３’−ホスホロチオエート基の両方を有し、そのヌクレオチドをその直ぐ３’側のヌクレオチドに結合させることを示す。すべてのアプタマーを、３’末端での逆位デオキシチミジンを含めて、結合について試験した。このウォークの結果を表２６に示す。すべてではないがほとんどの試験した位置は、結合に極度に影響を与えることなくホスホロチオエート結合を受容することができた。重要な例外は位置３（４８６７−３１＿４１０）のグアニンであり、この場合、天然ホスホジエステル結合に対するホスホロチオエート結合の置換は、ＶＥＧＦ１２１に対する親和性を２９，２５９倍低減した。
〔00366〕 ヌクレアーゼ感受性部位を予測することができないので、ＤＮａｓｅ Ｉ
Ｉ感受性切断部位の位置（複数可）を、実施例１４に記載されているようにブタＤＮａｓｅ ＩＩとともにインキュベーションした後に、質量分析によって同定した（データ非表示）。アプタマー４８６７−３１＿１９２（３’末端での逆位デオキシチミジンの付加を有する）については、２つの主な断片を同定した。断片１はヌクレオチド１から２４までを含んでいたが、断片２はヌクレオチド１から２５までを含んでいた。したがって、表２７で示すように、ヌクレオチド位置２４及び２５、２５及び２６並びに２６及び２７の間の様々な組み合わせでホスホロチオエート結合でホスホジエステル結合を置換した一連のアプタマーを作出した。顕著に影響を受けた結合がないので、これらの位置の３つすべてにおける置換は受け入れられた（表２６）。位置１での２’−ＯＭｅシトシンの付加の有無にかかわらず、ホスホロチオエート置換を試験した（表２７）。ヌクレアーゼ安定性実験については、その後のすべてのアプタマーは、３’末端の逆位デオキシチミジンを含めて、研究した。
〔00367〕 ＤＮａｓｅ ＩＩに対する感受性を実施例１４に記載されているように検
討し、図２４にデータを示す。位置２４及び２５並びに２５及び２６の間にホスホロチオエート結合を有する、試験したすべてのアプタマーは、これら２つの位置で修飾されていないアプタマーよりも、このアッセイで安定的であった。このトレンドは、位置１の２’−ＯＭｅを有するまたは有さないアプタマーについて観察された。
〔00368〕 アプタマー４８６７−３１＿１９２及び両方の重要な位置にホスホロチオ
エート結合を有するアプタマーのサブセットを、９０％ウサギ硝子体液中での安定性について次に試験した（図２５）。本発明者らは、眼部障害を治療するための、ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦに対するアプタマーベースのアンタゴニストの開発を考えているので、硝子体液における安定性は、その治療的有効性と関係がある。残存全長アプタマーのパーセント対インキュベーション時間のプロット（図２５）に例示するように、ホスホロチオエート結合で修飾されたすべてのアプタマーは、４８６７−３１＿１９２（ホスホロチオエート結合を有さない）よりも、この生体マトリックスにおいて安定的（１９２時間）であった。
〔00369〕 これらの置換が結合に悪影響を及ぼさなかったことを確実にするために、
実験を行って、ヒトＶＥＧＦ１２１タンパク質への結合について各アプタマーを試験した。試験したすべての配列は、標的への高親和性結合を保持していた。この実験で得られた
解離定数（Ｋｄ値）を表２７に示す。
〔00370〕 図２４は、実施例１４に記載されている、残存全長アプタマーのパーセン
テージ対ＤＮａｓｅ ＩＩでのインキュベーション時間を示す。アプタマー識別番号（アプタマーＩＤ番号）で示されるアプタマー（すべて２５０ｎＭ）を、指定の時間数にわたって３７℃で、０．２４ユニット／μＬのＤＮａｓｅ ＩＩとともにインキュベートし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって消化産物を分離した。デンシトメトリーで測定して、残存全長アプタマーのパーセンテージ対インキュベーション時間をプロットした。図２４のアプタマーＩＤ番号４８６７−３１＿１９２に対するプロットは、図２３Ｂで示すものと同じプロットである。
〔00371〕 図２５は、実施例１４に記載されている、残存全長アプタマーのパーセン
テージ対硝子体液におけるインキュベーション時間を示す。アプタマー識別番号（アプタマーＩＤ番号）で示されるアプタマー（すべて５００ｎＭ）をニュージーランドホワイトウサギから得られた９０％硝子体液において、指定の時間数にわたって３７℃でインキュベートした。アプタマーをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。図２５は、デンシトメトリーで測定した、各全長アプタマーバンドの残存パーセント対時間を示す。
〔00372〕 要約すると、これらのデータは、概して、ホスホロチオエート結合（複数
可）を有する４８６７−３１アプタマーは、４８６７−３１アプタマーホスホロチオエート結合（複数可）なしよりもヌクレアーゼ消化に対する感受性が低く、さらに、ホスホロチオエート結合（複数可）を有する４８６７−３１アプタマーは、ＶＥＧＦタンパク質標的に対する結合親和性を保持することを示す。
ヌクレアーゼ安定性が向上したＰＤＧＦアプタマー
〔00373〕 本実施例は、アプタマーのヌクレアーゼ安定性を向上する、ＰＤＧＦアプ
タマー（例えば５１６９−４）に適用される化学修飾を提供する。本実施例では、アプタマーに関して以下の省略形を使用する：ＰはＮａｐｄＵであり、２’−ＯＭｅは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである。
〔00374〕 ヒト血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＢＢ）に結合するように選択された、
ＮａｐｄＵ含有低オフ速度修飾アプタマー（ＳＯＭＡｍｅｒ）のヌクレアーゼ抵抗性を増強するために、２’−Ｏ−メチル基（２’−ＯＭｅ）を、ＰＤＧＦタンパク質への結合が影響を受けないか、最小限の影響しか受けないヌクレオチド位置に付加した。これらの試みによって、２１ヌクレオチド配列内に１１個の２’−ＯＭｅ基を含むアプタマー５１６９−４＿１４６が発見された。これらの１１個の２’−ＯＭｅ修飾及び３’末端の逆位デオキシチミジンを用いると、５１６９−４＿１４６はＤＮａｓｅ ＩＩに対して安定的であるが、ＤＮＡｓｅ Ｉに対しては安定的でない（図２６）。したがって、ＤＮａｓｅ ＩよりもＤＮａｓｅ ＩＩに対して感受性である、実施例１５に記載されているＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１＿１９２と対照的に、ＰＤＧＦ−ＢＢアプタマー５１６９−４＿１４６は、ＤＮａｓｅ ＩＩと比較してＤＮａｓｅ Ｉに対してより高い感受性を示す。換言すれば、ＤＮａｓｅ ＩＩではなくＤＮａｓｅ Ｉに対する５１６９−４＿１４６の感受性は、実施例１５で見つかった結果と逆であり、ヌクレアーゼに対するアプタマーの感受性が予測不可能であることを示す。これは、特定のヌクレアーゼによる分解への固有の感受性を予測することができず、実験的に決定しなければらなないことを示唆する。一旦特定のヌクレアーゼに対するこの感受性が決定されれば、残りの感受性の位置でのさらなるホスホロチオエート置換によって、さらなる安定性が達成される可能性がある。図２６Ａで示すように、全長アプタマーの経時的低下は、ＤＮａｓｅ Ｉによる消化に対す
る感受性を示す。
〔00375〕 図２６で示すように、アプタマー５１６９−４＿１４６（２５０ｎＭ）を
、実施例１４に記載されているように、指定の時間数にわたって３７℃で、０．０１ユニット／μＬのＤＮａｓｅ Ｉ（図２６Ａ）または０．１２ユニット／μＬのＤＮａｓｅ ＩＩ（図２６Ｂ）とともにインキュベートし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって消化産物を分離した。デンシトメトリーで測定して、残存全長アプタマーのパーセンテージ対インキュベーション時間をプロットした。
〔00376〕 さらにホスホロチオエート結合を使用してアプタマーを安定化させること
の実現可能性を判定するために、どの位置がアプタマーＰＤＧＦへの結合に顕著に影響を与えることなくホスホロチオエートを受容することができるを決定する目的で、「ホスホロチオエートウォーク」実験を５１６９−４＿１４６について行った。このウォークの結果を表２８に示す。試験したすべてのアプタマーは、３’末端に逆位デオキシチミジンを含んでいた。ホスホロチオエート置換は、５１６９−４＿１４６配列のすべての位置で許容性に優れていた。ＰＤＧＦへの結合の最大の悪化は１．８倍の親和性の低減であった（５１６９−４＿１５４）。
〔00377〕 実施例１５と同様に、５１６９−４＿１４６（３’末端に逆位デオキシチ
ミジンを有する）のＤＮａｓｅ Ｉによる切断に対して感受性であるヌクレオチドの位置を質量分析によって同定し、これらの最も感受性の「ヌクレアーゼ部位」は、天然の３’−ホスホジエステル結合の代わりの３’−ホスホロチオエート結合の置換によって保護されていた。
〔00378〕 アプタマー５１６９−４＿１４６について、ヒト組換えＤＮａｓｅ Ｉで
の消化後にいくつかの断片を同定した。これらの断片によって、ヌクレオチド位置９及び１０；１０及び１１；１１及び１２；並びに１２及び１３の間の、ＤＮａｓｅ Ｉ感受性部位が明らかとなった。したがって、これらの４つの位置でホスホジエステルをホスホロチオエート結合で置換し、アプタマー５１６９−４＿１８２と称されるアプタマーを作出した（表２９）。これらのアプタマーを、３’末端での逆位デオキシチミジンを含めて、ヌクレアーゼ抵抗性について試験した。前の場合と同様に、ＤＮａｓｅ Ｉに対する感受性を検討した（図２７）。ホスホロチオエート含有アプタマーは、５１６９−４＿１４６よりも明らかに安定的であった。
〔00379〕 図２７で示すように、アプタマー５１６９−４＿１８２（２５０ｎＭ）を
、実施例１４に記載されているように、指定の時間数にわたって３７℃で、０．０１ユニット／μＬのＤＮａｓｅ Ｉとともにインキュベートし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって消化産物を分離した。ＳＹＢＲ ｇｏｌｄでバンドを可視化し、デンシトメトリーで測定して、残存全長アプタマーのパーセンテージ対インキュベーション時間をプロットした。
〔00380〕 同じアプタマーを、９０％ウサギ硝子体液中での安定性についても試験し
た（図２８）。残存全長アプタマーのパーセント対インキュベーション時間のプロット（図２８）に図示するように、アプタマー５１６９−４＿１８２（ホスホロチオエート結合を有する）は、５１６９−４＿１４６（ホスホロチオエート結合を有さない）よりも、この生体マトリックスにおいて安定的であった。
〔00381〕 図２８で示すように、実施例１４に記載されているように、ニュージーラ
ンドホワイトウサギから得られた９０％硝子体液において、示されたアプタマー（５００ｎＭ）を指定の時間数にわたって３７℃でインキュベートした。ポリアクリルアミドゲル
電気泳動によってアプタマーを可視化した。図２８は、デンシトメトリーで測定した、各全長アプタマーバンドの残存パーセント（ＳＯＭＡｍｅｒ）対時間を示す。
〔00382〕 ５１６９−４＿１８２は５１６９−４＿１４６より明らかに安定的であっ
たが、５１６９−４＿１８２のＤＮａｓｅ Ｉ消化産物は、はっきりと見えた（データ非表示）。実施例１４に記載されている質量分析を使用して、この主な消化産物の切断部位をヌクレオチド位置４と５の間として同定した。ヌクレオチドの位置４は２’−ＯＭｅ部分によって既に保護されていたので、これは驚くべきことであった（表２９）。この結果は、２’−ＯＭｅ置換されたヌクレオチドに隣接するホスホジエステル結合を切断することができるヌクレアーゼが存在するという事実を示す。それにもかかわらず、３’−ホスホロチオエート結合で、５１６９−４＿１８２のヌクレオチド位置４と５の間の天然のホスホジエステル結合を置換して、アプタマー５１６９−４＿１８８が作出された（表２９）。前の場合と同様に、ＤＮａｓｅ Ｉに対する感受性を検討した（図２９）。アプタマー５１６９−４＿１８２及び５１６９−４＿１８８は、５１６９−４＿１４６より安定的であった。５１６９−４＿１８８のヌクレオチド４と５の間のホスホロチオエート結合の付加によって、５１６９−４＿１８２（データ非表示）について観察された安定的消化産物の出現が排除され、これによって、ＤＮａｓｅ Ｉに対してより安定になった（図２９）。
〔00383〕 図２９で示すように、アプタマー識別番号（アプタマーＩＤ番号）で示さ
れるアプタマーを、実施例１４に記載されているように、指定の時間数にわたって３７℃で０．０１ユニット／μＬのＤＮａｓｅ Ｉとともにインキュベートし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって消化産物を分離した。ＳＹＢＲ ｇｏｌｄでバンドを可視化し、デンシトメトリーで測定して、残存全長アプタマーのパーセンテージ対インキュベーション時間をプロットした。
〔00384〕 これらの置換が結合に悪影響を及ぼさなかったことを確実にするために、
実験を行って、ヒトＰＤＧＦＢＢタンパク質に対する各アプタマーの親和性を決定した。試験したすべての配列は、標的への高親和性結合を保持していた。この実験で得られた解離定数（Ｋｄ値）を表２９に示す。
〔00385〕 要約すると、これらのデータは、概して、ホスホロチオエート結合（複数
可）を有する５１６９−４アプタマーは、ホスホロチオエート結合（複数可）を有さない５１６９−４アプタマーよりもヌクレアーゼ消化に対する感受性が低く、さらに、ホスホロチオエート結合（複数可）を有する５１６９−４アプタマーは、ＰＤＧＦタンパク質標的に対する結合親和性を保持することを示す。
ヌクレアーゼ安定性が向上したさらなるＰＤＧＦアプタマー
〔00386〕 本実施例は、アプタマーのヌクレアーゼ安定性を向上する、ＰＤＧＦアプ
タマー（例えば、４１４９−８）に適用される化学修飾を提供する。本実施例では、アプタマーに関して以下の省略形を使用する：ＰはＮａｐｄＵであり；２’−ＯＭｅは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；ＢｎはベンジルｄＵ（ＢｎｄＵ）であり；Ｍはメトキシベンジル（ＭＢｎｄＵ）であり；Ｖは３炭素スペーサーであり；ｉはｉＢｕｄＵである。
〔00387〕 ヒト血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＢＢ）に結合するように選択されたＢ
ｎｄＵ含有低オフ速度修飾アプタマー（ＳＯＭＡｍｅｒ）のヌクレアーゼ抵抗性を増強するために、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）基を、ＰＤＧＦタンパク質への結合が顕著に影響されないヌクレオチド位置に付加した。これらの試みによって、２４ヌクレオチド配列内に７個の２’−ＯＭｅ基を含むアプタマー４１４９−８＿３７９が発見された。こ
れら７個の２’−ＯＭｅ修飾を用いてさえも、４１４９−８＿３７９は、まだヌクレアーゼ消化に耐性でない。例えば、組換えヒトＤＮａｓｅ Ｉ（データ非表示）及びブタＤＮａｓｅ ＩＩ（図３０）で４１４９−８＿３７９を消化することができる。図３０で示すように、全長アプタマーの経時的低下は、ＤＮａｓｅ ＩＩによる消化に対する感受性を示す。４１４９−８＿３７９についての、ＤＮａｓｅ Ｉ及びＤＮａｓｅ ＩＩの両方に対するこの感受性は、実施例１５及び１６に関して見られたものと異なり、これは、再びアプタマーのヌクレアーゼ安定性が予測不可能であることを示すものである。
〔00388〕 図３０で示すように、アプタマー４１４９−８＿３７９（２５０ｎＭ）を
、実施例１４に記載されているように、指定の時間数にわたって３７℃で、０．１２ユニット／μＬのＤＮａｓｅ ＩＩとともにインキュベートし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって消化産物を分離した。ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄでバンドを可視化し、デンシトメトリーで測定して、残存全長アプタマーのパーセンテージ対インキュベーション時間をプロットした。
〔00389〕 このアプタマーのヌクレアーゼ抵抗性をさらに増強するために、ＤＮａｓ
ｅ Ｉ及びＤＮａｓｅ ＩＩの作用に対する感受性ヌクレオチドの位置を、実施例１４に記載されている方法によって質量分析により同定した。ヌクレオチド位置１５と１６の間及びヌクレオチド位置１６及の１７間にＤＮａｓｅ Ｉ感受性部位を同定した。ヌクレオチド位置９と１０の間にＤＮａｓｅ ＩＩ感受性の部位を同定した。したがって、これらの３つの位置で、ホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合で置換した。加えて、ホスホロチオエート結合でヌクレオチド１７と１８の間のホスホジエステル結合を置換した。最後に、位置２の３，４メチレンジオキシベンジル−ｄＵヌクレオチド（すなわちＭＢｎｄＵ；表３０及び３１においてＭで表される）をＢｎｄＵで置き換え、位置１６のＢｎｄＵをＮａｐｄＵで置き換えた。このアプタマーを４１４９−８＿４５４と称した（表３０）。４１４９−８＿４５４の修飾に加えて、アプタマー４１４９−８＿４５５を作出し、これはまた、位置１３として２’−ＯＭｅ Ｇを、及びヌクレオチド８と９の間の天然のホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオエート結合を含んでいた（表３０）。完全なホスホロチオエートウォークは行わなかったが、いくつかの配列を作出し、ＰＤＧＦＢＢに対する親和性について試験した（表３１）。アプタマーを作出するためのガイドとして働いたこれらの配列のいくつかを表３１に示す。
〔00390〕 すべてのアプタマーが３’末端に逆位デオキシチミジンを含んでいる場合
に、前の場合と同様に、ＤＮａｓｅ ＩＩに対する感受性を検討した（図３１）。結果は、アプタマー４１４９−８＿４５５が、４１４９−８＿３７９よりも安定的である４１４９−８＿４５４よりも安定的であったことを示す。
〔00391〕 アプタマー４１４９−８＿３７９及び３’末端に逆位デオキシチミジンの
付加を有する４１４９−８＿４５４を、９０％ウサギ硝子体液における安定性について試験した（データ非表示）。しかし、この生体マトリックスにおいて、４１４９−８＿３７９と比較して、さらなる安定性は４１４９−８＿４５４で得られなかった。
〔00392〕 これらの置換が結合に悪影響を及ぼさなかったことを確実にするために、
実験を行って、ヒトＰＤＧＦＢＢタンパク質に対する各アプタマーの親和性を決定した。試験したすべての配列は、標的に対する結合親和性を保持していた。この実験で得られた解離定数（Ｋｄ値）を表３０に示す。
〔00393〕 図３１で示すように、アプタマーＩＤ番号（すなわち、４１４９−８＿３
７９；４１４９−８＿４５４及び４１４９−８＿４５５）で示したアプタマーを、指定の時間数にわたって３７℃でＤＮａｓｅ ＩＩとともにインキュベートし、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって消化産物を分離した。ゲル画像からデンシトメトリーで測定して、全長アプタマーのパーセント対インキュベーション時間をプロットした。図３１のアプタマーＩＤ番号４１４９−８＿３７９に対するプロットは、図３０で示すものと同じプロットである。
〔00394〕 前述の実施形態及び実施例は、例としてのみ意図される。特定の実施形態
、実施例または特定の実施形態もしくは実施例の要素は、特許請求の範囲のいずれかの重要な、必要とされるまたは必須の要素または特徴として解釈されない。添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を逸脱することなく、開示される実施形態に対して様々な変更、修飾、置換及び他の変形を行うことができる。図面及び実施例を含む本明細書は、制限するものではなく、例示的に考慮されるべきであり、すべてのそうした修飾及び置換は、本発明の範囲内に含まれることが意図される。したがって、本発明の範囲は、上述の実施例ではなく、添付の特許請求の範囲及びその法的均等物によって決定されるべきである。例えば、方法または方法クレームのいずれかに記載されるステップは、いかなる実行可能な順序でも実施することができ、実施形態、実施例または特許請求の範囲のいずれかに提示される順序に限定されるものではない。
表１．ＰＤＧＦに対して１０ｎＭ以下のＫｄ値を有する４１４９−８＿１及びトランケート変異体の配列の代表
Figure 2021072835
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上付なしはデオキシリボースを示す
上付きのｏは２’−フルオロを示す
上付きの１は２’−Ｏ−メチルを示す
上付きの２はホスホロチオエート（デオキシリボース）を示す
Ｃ３＝３炭素リンカー
Ｈｅｇ＝ヘキサエチレングリコールリンカー
Ｎａｐ＝ナフチル−ｄＵ
Ｐｅ＝フェネチル−ｄＵ
ＢＴ＝ベンゾチオフェニル−ｄＵ
Ｔｈ＝チオフェニル−ｄＵ
Ｉｂ＝イソブチル−ｄＵ
Ｔｒｐ＝トリプタミニル−ｄＵ
２Ｎａｐ＝２−ナフチル−ｄＵ
２ＮＥ＝２−ナフチルエチル−ｄＵ
ＮＥ＝ナフチルエチル−ｄＵ
ＭＢｎ＝メチレンジオキシベンジル−ｄＵ
ＰＰ＝フェンプロピル−ｄＵ
Ｔｙｒ＝チロシル−ｄＵ
ＦＢｎ＝フルオロベンジル−ｄＵ
Ｂｎ＝ベンジル−ｄＵ
３’−ダブラー＝シンメトリックダブラーホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０−１９２０−０２）
表１ａ．ＰＤＧＦアプタマー４１４９−８＿２６０（ＳＬ５）のホモ二量体：
Figure 2021072835
表２．ＰＤＧＦに対して１０ｎＭを超えるＫｄ値を有するトランケート変異体の配列の代表
Figure 2021072835
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上付なしはデオキシリボースを示す
上付きのｏは２’−フルオロを示す
上付きの１は２’−Ｏ−メチルを示す
上付きの２はホスホロチオエート（デオキシリボース）を示す
Ｃ３＝３炭素リンカー
Ｈｅｇ＝ヘキサエチレングリコールリンカー
Ｎａｐ＝ナフチル−ｄＵ
Ｐｅ＝フェネチル−ｄＵ
ＢＴ＝ベンゾチオフェニル−ｄＵ
Ｔｈ＝チオフェニル−ｄＵ
Ｉｂ＝イソブチル−ｄＵ
Ｔｒｐ＝トリプタミニル−ｄＵ
２Ｎａｐ＝２−ナフチル−ｄＵ
２ＮＥ＝２−ナフチルエチル−ｄＵ
ＮＥ＝ナフチルエチル−ｄＵ
ＭＢｎ＝メチレンジオキシベンジル−ｄＵ
ＰＰ＝フェンプロピル−ｄＵ
Ｔｙｒ＝チロシル−ｄＵ
ＦＢｎ＝フルオロベンジル−ｄＵ
Ｂｎ＝ベンジル−ｄＵ
表３．ＰＤＧＦアプタマークローン４１４９−８＿１のトランケーション
Figure 2021072835
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表５．Ｂ型ＤＮＡと比較した、ＰＤＧＦ ＢＢアプタマーの塩基対パラメーター
Figure 2021072835
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表１１：４８６７−１５＿２のすべての位置でのＣ３スペーサー置換
Figure 2021072835
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表１８：ＰＤＧＦ−ＶＥＧＦアプタマー構築物の結合親和性及びインビトロ活性
Figure 2021072835
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〔00365〕 さらにホスホロチオエート結合を使用してアプタマーを安定化させることの実現可能性を判定するために、アプタマー４８６７−３１＿１９２のどの位置がＶＥＧＦ１２１への結合に顕著に影響を与えることなくホスホロチオエート結合を受容することができるかを決定する目的で、個々のホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオエートの体系的な置換（「ホスホロチオエートウォーク」実験）を行った。本実施例及び続行する実施例のすべての配列について、上付きの「１」を有するヌクレオチドは、ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル修飾を有することを示し、上付きの「２」を有するヌクレオチドは、ヌクレオチドが３’−ホスホロチオエート基を有し、そのヌクレオチドをその直ぐ３’側のヌクレオチドに結合させることを示す）。上付きの「１」及び「２」の両方を有するヌクレオチドは、ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル修飾と３’−ホスホロチオエート基の両方を有し、そのヌクレオチドをその直ぐ３’側のヌクレオチドに結合させることを示す。すべてのアプタマーを、３’末端での逆位デオキシチミジンを含めて、結合について試験した。このウォークの結果を表２６に示す。すべてではないがほとんどの試験した位置は、結合に極度に影響を与えることなくホスホロチオエート結合を受容することができた。重要な例外は位置３（４８６７−３１＿４１１）のグアニンであり、この場合、天然ホスホジエステル結合に対するホスホロチオエート結合の置換は、ＶＥＧＦ１２１に対する親和性を２９，２５９倍低減した。
〔00394〕 前述の実施形態及び実施例は、例としてのみ意図される。特定の実施形態、実施例または特定の実施形態もしくは実施例の要素は、特許請求の範囲のいずれかの重要な、必要とされるまたは必須の要素または特徴として解釈されない。添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を逸脱することなく、開示される実施形態に対して様々な変更、修飾、置換及び他の変形を行うことができる。図面及び実施例を含む本明細書は、制限するものではなく、例示的に考慮されるべきであり、すべてのそうした修飾及び置換は、本発明の範囲内に含まれることが意図される。したがって、本発明の範囲は、上述の実施例ではなく、添付の特許請求の範囲及びその法的均等物によって決定されるべきである。例えば、方法または方法クレームのいずれかに記載されるステップは、いかなる実行可能な順序でも実施することができ、実施形態、実施例または特許請求の範囲のいずれかに提示される順序に限定されるものではない。
国際出願時の特許請求の範囲（請求項１〜６６）
〔項１〕
核酸配列
５’−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｚ−Ｇ−Ｚ−Ａ−Ｚ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｚ−Ｃ−Ｚ−３’（配列番号８３０）を含む核酸分子であって、
ＺがＣ−５修飾ピリミジンであり、前記核酸分子の位置４、９、１０、１１及び１２の少なくとも１個がホスホロチオエート結合または部分を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである、前記核酸分子。
〔項２〕
前記核酸分子の位置４、９、１０、１１及び１２の少なくとも２、３、４または５個がホスホロチオエート結合または部分を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項１に記載の核酸分子。
〔項３〕
前記核酸分子の位置１、４、６、７、１４、１５、１６、１７、１８、２０及び２１の少なくとも１個が２’−Ｏ−メチル修飾を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項１に記載の核酸分子。
〔項４〕
前記核酸分子の位置１、４、６、７、１４、１５、１６、１７、１８、２０及び２１の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個が２’−Ｏ−メチル修飾を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項１に記載の核酸分子。
〔項５〕
前記核酸分子が配列番号５４５及び８００〜８２１から成る群から選択される、請求項１に記載の核酸分子。
〔項６〕
前記核酸分子が、１１個の２’−Ｏ−メチルヌクレオシド及び４または５個のホスホロチオエート結合または部分を含む、請求項１に記載の核酸分子。
〔項７〕
核酸配列
５’−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｚ−Ｚ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｚ−Ｇ−Ｃ−Ｚ−Ｚ−Ｇ−Ｚ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｚ−Ｇ−Ｇ−３’（配列番号８３１）を含む核酸分子であって、
ＺがＣ−５修飾ピリミジンであり、前記核酸分子の位置２４、２５及び２６の少なくとも１個がホスホロチオエート結合または部分を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである、前記核酸分子。
〔項８〕
位置２４、２５及び２６の少なくとも２または３個がホスホロチオエート結合または部分を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項７に記載の核酸分子。
〔項９〕
前記核酸分子の位置１、６、９、１２、１５、１７、１８、２２、２８及び２９の少なくとも１個が２’−Ｏ−メチル修飾を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項７に記載の核酸分子。
〔項１０〕
前記核酸分子の位置１、６、９、１２、１５、１７、１８、２２、２８及び２９の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個が２’−Ｏ−メチル修飾を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項７に記載の核酸分子。
〔項１１〕
前記Ｃ−５修飾ピリミジンが、独立に、それぞれの出現について、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン及び５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）から成る群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子。
〔項１２〕
前記Ｃ−５修飾ピリミジンが５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子。
〔項１３〕
前記核酸分子が配列番号７０６及び７６３〜７９９から成る群から選択される、請求項７に記載の核酸分子。
〔項１４〕
前記核酸分子が、９または１０個の２’−Ｏ−メチルヌクレオシド及び１、２または３個のホスホロチオエート結合または部分を含む、請求項７に記載の核酸分子。
〔項１５〕
核酸配列
５’−Ｚ−Ｚ’’−Ａ−Ｃ−Ｈ−Ｇ−Ｚ−Ｚ−Ａ−Ｃ−Ｖ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｚ’−Ｚ−Ｚ−Ａ−Ｚ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−３’（配列番号８３２）を含む核酸分子であって、
Ｚ、Ｚ’及びＺ’’が、独立に、それぞれの出現について、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）及び５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）から成る群から選択され；Ｖが３炭素リンカーであり、Ｈがヘキサエチレングリコールリンカーであり；
前記核酸分子の位置８、９、１５、１６及び１７の少なくとも１個がホスホロチオエート結合または部分を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドであり、Ｈ及びＶが前記核酸分子の位置を数えるための単一の位置とみなされる、前記核酸分子。
〔項１６〕
位置８、９、１５、１６及び１７の少なくとも２、３、４または５個がホスホロチオエート結合または部分を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドであり、Ｈ及びＶが前記核酸分子の位置を数えるための単一の位置とみなされる、請求項１５に記載の核酸分子。
〔項１７〕
前記核酸分子の位置３、７、１２、１３、１８、１９、２１及び２４の少なくとも１個が２’−Ｏ−メチル修飾を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドであり、Ｈ及びＶが前記核酸分子の位置を数えるための単一の位置とみなされる、請求項１５に記載の核酸分子。
〔項１８〕
前記核酸分子の位置３、７、１２、１３、１８、１９、２１及び２４の少なくとも２、３、４、５、６、７または８個が２’−Ｏ−メチル修飾を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドであり、Ｈ及びＶが前記核酸分子の位置を数えるための単一の位置とみなされる、請求項１５に記載の核酸分子。
〔項１９〕
Ｚが５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）であり、Ｚ’’が、独立に、それぞれの出現について、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）または５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）であり、Ｚ’が５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）または５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）である、請求項１５に記載の核酸分子。
〔項２０〕
核酸分子が配列番号３０６、３１７、３３０〜３４４、４０９及び８２２〜８２８から成る群から選択される、請求項１５に記載の核酸分子。
〔項２１〕
前記核酸分子が、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満または０．１ｎＭ未満の結合親和性でＰＤＧＦタンパク質に結合する、請求項１〜４、６、１１、１２、１４または１５〜１９に記載の核酸分子。
〔項２２〕
前記核酸分子が、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満または０．１ｎＭ未満の結合親和性でＶＥＧＦタンパク質に結合する、請求項７〜１２または１４のいずれか１項に記載の核酸分子。
〔項２３〕
前記核酸分子が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８または９個の２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを含む、請求項１、２、７、８、１１、１２、１５、１６、１９、２１または２２に記載の核酸分子。
〔項２４〕
前記核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の核酸分子。
〔項２５〕
前記核酸分子の３’末端に逆位デオキシヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の核酸分子。
〔項２６〕
前記デオキシヌクレオチドがデオキシチミジンである、請求項２５に記載の核酸分子。
〔項２７〕
核酸分子が、ホスホロチオエート結合または部分を有さない同じ核酸分子と比較して、ヌクレアーゼに対する感受性が低い、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の核酸分子。
〔項２８〕
前記ヌクレアーゼがＤＮａｓｅ酵素である、請求項２７に記載の核酸分子。
〔項２９〕
前記ＤＮａｓｅ酵素がＤＮａｓｅ ＩまたはＤＮａｓｅ ＩＩ酵素である、請求項２８に記載の核酸分子。
〔項３０〕
核酸分子が、ホスホロチオエート結合または部分を有さない同じ核酸分子と比較して、ニュージーランドホワイトウサギの硝子体液中でより安定的である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の核酸分子。
〔項３１〕
核酸配列
５’−Ｃ１−Ｇ−Ａ−Ｃ１，２−Ａ−Ｇ１−Ｃ１−Ａ−Ｚ２−Ｇ２−Ｚ２−Ａ２−Ｚ−Ｇ１−Ｃ１−Ａ１−Ｃ１−Ａ１−Ｚ−Ｃ１−Ｚ１−３’（配列番号８３３）を含む核酸分子であって、
Ｃ１が、独立に、それぞれの出現について、シチジン、デオキシシチジン及び２’−Ｏ−メチルシチジンから成る群から選択され；
Ｃ１，２が、独立に、それぞれの出現について、シチジン、ホスホロチオエート結合を含むシチジン、デオキシシチジン、ホスホロチオエート結合を含むデオキシシチジン、２’−Ｏ−メチルシチジン及びホスホロチオエート結合を含む２’−Ｏ−メチルシチジンから成る群から選択され；
Ｇ１が、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、デオキシグアノシン及び２’−Ｏ−メチルグアノシンから成る群から選択され；
Ｇ２が、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、ホスホロチオエート結合を含むグアノシン、デオキシグアノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシグアノシンから成る群から選択され；
Ｚ１が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）及び２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）から成る群から選択され；
Ｚ２が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、ホスホロチオエート結合を含むウリジン、デオキシウリジン、ホスホロチオエート結合を含むデオキシウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）及びホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）から成る群から選択され；
Ｚが、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン及び５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）から成る群から選択され；
Ａ１が、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、デオキシアデノシン及び２’−Ｏ−メチルアデノシンから成る群から選択され；
Ａ２が、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、ホスホロチオエート結合を含むアデノシン、デオキシアデノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンから成る群から選択され；
少なくとも１、２、３、４または５個のホスホロチオエート結合を含む、前記核酸分子。
〔項３２〕
Ｃ１，２が、ホスホロチオエート結合を含む２’−Ｏ−メチルシチジンである、請求項３１に記載の核酸分子。
〔項３３〕
Ｚ１が、２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である、請求項７２に記載の核酸分子。
〔項３４〕
Ｚ２が、ホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である、請求項３１に記載の核酸分子。
〔項３５〕
核酸配列
５’−Ｃ１−Ｃ−Ｇ−Ｚ−Ｚ−Ｃ１−Ａ−Ａ−Ｇ１−Ｚ−Ｇ−Ｃ１−Ｚ−Ｚ−Ｇ１−Ｚ−Ａ１−Ｇ１−Ｇ−Ａ−Ｚ−Ｚ1−Ｚ−Ａ２−Ａ２−Ａ２−Ｚ−Ｇ１−Ｇ１−３’（配列番号８３４）を含む核酸分子であって、
Ｃ１が、独立に、それぞれの出現について、シチジン、デオキシシチジン及び２’−Ｏ−メチルシチジンから成る群から選択され；
Ｇ１が、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、デオキシグアノシン及び２’−Ｏ−メチルグアノシンから成る群から選択され；
Ｚが、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン及び５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）から成る群から選択され；
Ｚ１が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）及び２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）から成る群から選択され；
Ａ１が、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、デオキシアデノシン及び２’−Ｏ−メチルアデノシンから成る群から選択され；
Ａ２が、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、ホスホロチオエート結合を含むアデノシン、デオキシアデノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンから成る群から選択され；
少なくとも１、２、３、４または５個のホスホロチオエート結合を含む、前記核酸分子。
〔項３６〕
Ｚが、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である、請求項３１または３５に記載の核酸分子。
〔項３７〕
Ｚ１が、２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である、請求項３５に記載の核酸分子。
〔項３８〕
核酸配列
５’−Ｚ−Ｚ’’−Ａ１−Ｃ−Ｈ−Ｇ−Ｚ１−Ｚ２−Ａ２−Ｃ−Ｖ−Ｃ１−Ｇ１−Ｃ−Ｇ２−Ｚ’２−Ｚ２−Ｚ１−Ａ１−Ｚ−Ａ１−Ｇ−Ｃ−Ｇ１−３’（配列番号８３５）を含む核酸分子であって、
Ｃ１が、独立に、それぞれの出現について、シチジン、デオキシシチジン及び２’−Ｏ−メチルシチジンから成る群から選択され；
Ｇ１が、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、デオキシグアノシン及び２’−Ｏ−メチルグアノシンから成る群から選択され；
Ｇ２が、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、ホスホロチオエート結合を含むグアノシン、デオキシグアノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシグアノシンから成る群から選択され；
Ｚが、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）及び５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）から成る群から選択され；
Ｚ’’が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）及び５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）から成る群から選択され；
Ｚ’２が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、ホスホロチオエート結合を含むウリジン、デオキシウリジン、ホスホロチオエート結合を含むデオキシウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、ホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、ホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）及びホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）から成る群から選択され；
Ｚ１が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、メチレンジオキシベンジル−ｄＵ及び２’−Ｏ−メチル基を含むメチレンジオキシベンジル−ｄＵから成る群から選択され；
Ｚ２が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、ホスホロチオエート結合を含むウリジン、デオキシウリジン、ホスホロチオエート結合を含むデオキシウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）及びホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、ホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、メチレンジオキシベンジル−ｄＵ（ＭＢｎｄＵ）及びホスホロチオエート結合を含むメチレンジオキシベンジル−ｄＵ（ＭＢｎｄＵ）から成る群から選択され；
Ａ１が、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、デオキシアデノシン及び２’−Ｏ−メチルアデノシンから成る群から選択され；
Ａ２が、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、ホスホロチオエート結合を含むアデノシン、デオキシアデノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンから成る群から選択され
Ｖが３炭素リンカーであり；
Ｈがヘキサエチレングリコールリンカーであり；
少なくとも１、２、３、４または５個のホスホロチオエート結合を含む、前記核酸配列。
〔項３９〕
Ｃ１が２’−Ｏ−メチルシチジンである、請求項３１、３５または３８に記載の核酸分子。
〔項４０〕
Ｇ１が２’−Ｏ−メチルグアノシンである、請求項３１、３５または３８に記載の核酸分子。
〔項４１〕
Ｇ２が、ホスホロチオエート結合を含むデオキシグアノシンである、請求項３１または３８に記載の核酸分子。
〔項４２〕
Ｚが５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）である、請求項３８に記載の核酸分子。
〔項４３〕
Ｚ’２が、ホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である、請求項３８に記載の核酸分子。
〔項４４〕
Ｚ１が、２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）である、請求項３８に記載の核酸分子。
〔項４５〕
Ｚ２が、ホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）である、請求項３８に記載の核酸分子。
〔項４６〕
Ａ１が２’−Ｏ−メチルアデノシンである、請求項３１、３５または３８に記載の核酸分子。
〔項４７〕
Ａ２が、ホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンである、請求項３１、３５または３８に記載の核酸分子。
〔項４８〕
請求項１〜４７のいずれか１項に記載の核酸分子から成る群から選択される２つの核酸分子を含む組成物。
〔項４９〕
溶液、粉末、ゲル及び乳濁液から選択される群から選択される形態である、請求項４８に記載の組成物。
〔項５０〕
前記２つの核酸分子が共有結合または非共有結合している、請求項４８に記載の組成物。
〔項５１〕
前記核酸分子がＰＤＧＦ受容体のＰＤＧＦ媒介性リン酸化を阻害する、請求項１〜６、１５〜２１、３１〜３４、３８または４１〜４５のいずれか１項に記載の核分子。
〔項５２〕
請求項１〜５１のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸分子及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
〔項５３〕
前記医薬組成物が硝子体内注射用である、請求項５２に記載の医薬組成物。
〔項５４〕
黄斑変性症を有する対象に治療有効量の請求項５２に記載の医薬組成物を投与することを含む、黄斑変性症の治療方法
〔項５５〕
黄斑変性症を発症する危険性がある対象に治療有効量の請求項５２に記載の医薬組成物を投与することを含む、黄斑変性症の予防方法。
〔項５６〕
眼の病気を有する対象に治療有効量の請求項５２に記載の医薬組成物を投与することを含む、眼の病気の治療方法。
〔項５７〕
前記眼の病気が、網膜炎、黄斑変性症、脈絡膜炎、網膜症、高血圧性網膜症、糖尿病性網膜症、慢性ドライアイ、エイズ関連視力喪失、弱視、半盲、網膜静脈閉塞症、トラコーマ、円錐角膜、脈絡網膜の炎症、中心性漿液性網膜症、ブドウ膜炎、網膜ジストロフィー、浮腫、緑内障及び白内障から成る群から選択される、請求項５６に記載の方法。
〔項５８〕
前記黄斑変性症が加齢性黄斑変性症である、請求項５４または５５に記載の方法。
〔項５９〕
前記黄斑変性症がドライ加齢性黄斑変性症またはウェット加齢性黄斑変性症である、請求項５８に記載の方法。
〔項６０〕
線維症を有する対象に治療有効量の請求項５２に記載の医薬組成物を投与することを含む、線維症の治療方法。
〔項６１〕
前記線維症が、肺線維症、腎線維症、眼部線維症、角膜線維症、後眼部線維化眼疾患、血管結合組織網膜瘢痕及び嚢胞性線維症から選択される、請求項６０に記載の方法。
〔項６２〕
心血管疾患を有する対象に治療有効量の請求項５２に記載の医薬組成物を投与することを含む、心血管疾患の治療方法。
〔項６３〕
前記心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、心肥大関連状態及び血管障害から選択される、請求項６２に記載の方法。
〔項６４〕
癌を有する対象に治療有効量の請求項５２に記載の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療方法。
〔項６５〕
前記癌が、膀胱癌、肺癌、乳癌、黒色腫、結腸癌、直腸癌、眼部の癌、リンパ腫、子宮内膜癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、白血病並びに甲状腺癌から選択される、請求項６４に記載の方法。
〔項６６〕
アプタマーである、先行する請求項のいずれか１項に記載の核酸分子。
Figure 2021072835

Claims (66)

  1. 核酸配列
    ５’−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｚ−Ｇ−Ｚ−Ａ−Ｚ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｚ−Ｃ−Ｚ−３’（配列番号８３０）を含む核酸分子であって、
    ＺがＣ−５修飾ピリミジンであり、前記核酸分子の位置４、９、１０、１１及び１２の少なくとも１個がホスホロチオエート結合または部分を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである、前記核酸分子。
  2. 前記核酸分子の位置４、９、１０、１１及び１２の少なくとも２、３、４または５個がホスホロチオエート結合または部分を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 前記核酸分子の位置１、４、６、７、１４、１５、１６、１７、１８、２０及び２１の少なくとも１個が２’−Ｏ−メチル修飾を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項１に記載の核酸分子。
  4. 前記核酸分子の位置１、４、６、７、１４、１５、１６、１７、１８、２０及び２１の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個が２’−Ｏ−メチル修飾を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項１に記載の核酸分子。
  5. 前記核酸分子が配列番号５４５及び８００〜８２１から成る群から選択される、請求項１に記載の核酸分子。
  6. 前記核酸分子が、１１個の２’−Ｏ−メチルヌクレオシド及び４または５個のホスホロチオエート結合または部分を含む、請求項１に記載の核酸分子。
  7. 核酸配列
    ５’−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｚ−Ｚ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｚ−Ｇ−Ｃ−Ｚ−Ｚ−Ｇ−Ｚ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｚ−Ｇ−Ｇ−３’（配列番号８３１）を含む核酸分子であって、
    ＺがＣ−５修飾ピリミジンであり、前記核酸分子の位置２４、２５及び２６の少なくとも１個がホスホロチオエート結合または部分を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである、前記核酸分子。
  8. 位置２４、２５及び２６の少なくとも２または３個がホスホロチオエート結合または部分を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項７に記載の核酸分子。
  9. 前記核酸分子の位置１、６、９、１２、１５、１７、１８、２２、２８及び２９の少なくとも１個が２’−Ｏ−メチル修飾を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項７に記載の核酸分子。
  10. 前記核酸分子の位置１、６、９、１２、１５、１７、１８、２２、２８及び２９の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個が２’−Ｏ−メチル修飾を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項７に記載の核酸分子。
  11. 前記Ｃ−５修飾ピリミジンが、独立に、それぞれの出現について、５−（Ｎ−ベンジル
    カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン及び５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）から成る群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子。
  12. 前記Ｃ−５修飾ピリミジンが５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子。
  13. 前記核酸分子が配列番号７０６及び７６３〜７９９から成る群から選択される、請求項７に記載の核酸分子。
  14. 前記核酸分子が、９または１０個の２’−Ｏ−メチルヌクレオシド及び１、２または３個のホスホロチオエート結合または部分を含む、請求項７に記載の核酸分子。
  15. 核酸配列
    ５’−Ｚ−Ｚ’’−Ａ−Ｃ−Ｈ−Ｇ−Ｚ−Ｚ−Ａ−Ｃ−Ｖ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｚ’−Ｚ−Ｚ−Ａ−Ｚ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−３’（配列番号８３２）を含む核酸分子であって、
    Ｚ、Ｚ’及びＺ’’が、独立に、それぞれの出現について、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）及び５−（Ｎ−
    ［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）から成る群から選択され；Ｖが３炭素リンカーであり、Ｈがヘキサエチレングリコールリンカーであり；
    前記核酸分子の位置８、９、１５、１６及び１７の少なくとも１個がホスホロチオエート結合または部分を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドであり、Ｈ及びＶが前記核酸分子の位置を数えるための単一の位置とみなされる、前記核酸分子。
  16. 位置８、９、１５、１６及び１７の少なくとも２、３、４または５個がホスホロチオエート結合または部分を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドであり、Ｈ及びＶが前記核酸分子の位置を数えるための単一の位置とみなされる、請求項１５に記載の核酸分子。
  17. 前記核酸分子の位置３、７、１２、１３、１８、１９、２１及び２４の少なくとも１個が２’−Ｏ−メチル修飾を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドであり、Ｈ及びＶが前記核酸分子の位置を数えるための単一の位置とみなされる、請求項１５に記載の核酸分子。
  18. 前記核酸分子の位置３、７、１２、１３、１８、１９、２１及び２４の少なくとも２、３、４、５、６、７または８個が２’−Ｏ−メチル修飾を含み、位置１が前記核酸分子の５’末端からの最初のヌクレオシドであり、Ｈ及びＶが前記核酸分子の位置を数えるための単一の位置とみなされる、請求項１５に記載の核酸分子。
  19. Ｚが５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）であり、Ｚ’’が、独立に、それぞれの出現について、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）または５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）であり、Ｚ’が５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）または５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）である、請求項１５に記載の核酸分子。
  20. 核酸分子が配列番号３０６、３１７、３３０〜３４４、４０９及び８２２〜８２８から成る群から選択される、請求項１５に記載の核酸分子。
  21. 前記核酸分子が、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満または０．１ｎＭ未満の結合親和性でＰＤＧＦタンパク質に結合する、請求項１〜４、６、１１、１２、１４または１５〜１９に記載の核酸分子。
  22. 前記核酸分子が、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満または０．１ｎＭ未満の結合親和性でＶＥＧＦタンパク質に結合する、請求項７〜１２または１４のいずれか１項に記載の核酸分子。
  23. 前記核酸分子が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８または９個の２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを含む、請求項１、２、７、８、１１、１２、１５、１６、１９、２１または２２に記載の核酸分子。
  24. 前記核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の核酸分子。
  25. 前記核酸分子の３’末端に逆位デオキシヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜２４の
    いずれか１項に記載の核酸分子。
  26. 前記デオキシヌクレオチドがデオキシチミジンである、請求項２５に記載の核酸分子。
  27. 核酸分子が、ホスホロチオエート結合または部分を有さない同じ核酸分子と比較して、ヌクレアーゼに対する感受性が低い、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の核酸分子。
  28. 前記ヌクレアーゼがＤＮａｓｅ酵素である、請求項２７に記載の核酸分子。
  29. 前記ＤＮａｓｅ酵素がＤＮａｓｅ ＩまたはＤＮａｓｅ ＩＩ酵素である、請求項２８に記載の核酸分子。
  30. 核酸分子が、ホスホロチオエート結合または部分を有さない同じ核酸分子と比較して、ニュージーランドホワイトウサギの硝子体液中でより安定的である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の核酸分子。
  31. 核酸配列
    ５’−Ｃ１−Ｇ−Ａ−Ｃ１，２−Ａ−Ｇ１−Ｃ１−Ａ−Ｚ２−Ｇ２−Ｚ２−Ａ２−Ｚ−Ｇ１−Ｃ１−Ａ１−Ｃ１−Ａ１−Ｚ−Ｃ１−Ｚ１−３’（配列番号８３３）を含む核酸分子であって、
    Ｃ１が、独立に、それぞれの出現について、シチジン、デオキシシチジン及び２’−Ｏ−メチルシチジンから成る群から選択され；
    Ｃ１，２が、独立に、それぞれの出現について、シチジン、ホスホロチオエート結合を含むシチジン、デオキシシチジン、ホスホロチオエート結合を含むデオキシシチジン、２’−Ｏ−メチルシチジン及びホスホロチオエート結合を含む２’−Ｏ−メチルシチジンから成る群から選択され；
    Ｇ１が、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、デオキシグアノシン及び２’−Ｏ−メチルグアノシンから成る群から選択され；
    Ｇ２が、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、ホスホロチオエート結合を含むグアノシン、デオキシグアノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシグアノシンから成る群から選択され；
    Ｚ１が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）及び２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）から成る群から選択され；
    Ｚ２が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、ホスホロチオエート結合を含むウリジン、デオキシウリジン、ホスホロチオエート結合を含むデオキシウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）及びホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）から成る群から選択され；
    Ｚが、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン及び５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）から成る群から選択され；
    Ａ１が、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、デオキシアデノシン及び２’−Ｏ−メチルアデノシンから成る群から選択され；
    Ａ２が、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、ホスホロチオエート結合を含むアデノシン、デオキシアデノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンから成る群から選択され；
    少なくとも１、２、３、４または５個のホスホロチオエート結合を含む、前記核酸分子。
  32. Ｃ１，２が、ホスホロチオエート結合を含む２’−Ｏ−メチルシチジンである、請求項３１に記載の核酸分子。
  33. Ｚ１が、２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である、請求項７２に記載の核酸分子。
  34. Ｚ２が、ホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である、請求項３１に記載の核酸分子。
  35. 核酸配列
    ５’−Ｃ１−Ｃ−Ｇ−Ｚ−Ｚ−Ｃ１−Ａ−Ａ−Ｇ１−Ｚ−Ｇ−Ｃ１−Ｚ−Ｚ−Ｇ１−Ｚ−Ａ１−Ｇ１−Ｇ−Ａ−Ｚ−Ｚ1−Ｚ−Ａ２−Ａ２−Ａ２−Ｚ−Ｇ１−Ｇ１−３’（配列
    番号８３４）を含む核酸分子であって、
    Ｃ１が、独立に、それぞれの出現について、シチジン、デオキシシチジン及び２’−Ｏ−メチルシチジンから成る群から選択され；
    Ｇ１が、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、デオキシグアノシン及び２’−Ｏ−メチルグアノシンから成る群から選択され；
    Ｚが、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン及び５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）から成る群から選択され；
    Ｚ１が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）及び２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）から成る群から選択され；
    Ａ１が、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、デオキシアデノシン及び２’−Ｏ−メチルアデノシンから成る群から選択され；
    Ａ２が、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、ホスホロチオエート結合を含むアデノシン、デオキシアデノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンから成る群から選択され；
    少なくとも１、２、３、４または５個のホスホロチオエート結合を含む、前記核酸分子。
  36. Ｚが、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である、請求項３１または３５に記載の核酸分子。
  37. Ｚ１が、２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である、請求項３５に記載の核酸分子。
  38. 核酸配列
    ５’−Ｚ−Ｚ’’−Ａ１−Ｃ−Ｈ−Ｇ−Ｚ１−Ｚ２−Ａ２−Ｃ−Ｖ−Ｃ１−Ｇ１−Ｃ−Ｇ２−Ｚ’２−Ｚ２−Ｚ１−Ａ１−Ｚ−Ａ１−Ｇ−Ｃ−Ｇ１−３’（配列番号８３５）を含む核酸分子であって、
    Ｃ１が、独立に、それぞれの出現について、シチジン、デオキシシチジン及び２’−Ｏ−メチルシチジンから成る群から選択され；
    Ｇ１が、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、デオキシグアノシン及び２’−Ｏ−メチルグアノシンから成る群から選択され；
    Ｇ２が、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、ホスホロチオエート結合を含むグアノシン、デオキシグアノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシグアノシンから成る群から選択され；
    Ｚが、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）及び５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）から成る群から選択され；
    Ｚ’’が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）及び５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）から成る群から選択され；
    Ｚ’２が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、ホスホロチオエート結合を含むウリジン、デオキシウリジン、ホスホロチオエート結合を含むデオキシウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、ホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、ホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）及びホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）から成る群から選択され；
    Ｚ１が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、メチレンジオキシベンジル−ｄＵ及び２’−Ｏ−メチル基を含むメチレンジオキシベンジル−ｄＵから成る群から選択され；
    Ｚ２が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、ホスホロチオエート結合を含むウリジン、デオキシウリジン、ホスホロチオエート結合を含むデオキシウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）及びホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、ホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、メチレンジオキシベンジル−ｄＵ（ＭＢｎｄＵ）及びホスホロチオエート結合を含むメチレンジオキシベンジル−ｄＵ（ＭＢｎｄＵ）から成る群から選択され；
    Ａ１が、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、デオキシアデノシン及び２’−Ｏ−メチルアデノシンから成る群から選択され；
    Ａ２が、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、ホスホロチオエート結合を含むアデノシン、デオキシアデノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンから成る群から選択され
    Ｖが３炭素リンカーであり；
    Ｈがヘキサエチレングリコールリンカーであり；
    少なくとも１、２、３、４または５個のホスホロチオエート結合を含む、前記核酸配列。
  39. Ｃ１が２’−Ｏ−メチルシチジンである、請求項３１、３５または３８に記載の核酸分子。
  40. Ｇ１が２’−Ｏ−メチルグアノシンである、請求項３１、３５または３８に記載の核酸分子。
  41. Ｇ２が、ホスホロチオエート結合を含むデオキシグアノシンである、請求項３１または３８に記載の核酸分子。
  42. Ｚが５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）である、請求項３８に記載の核酸分子。
  43. Ｚ’２が、ホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である、請求項３８に記載の核酸分子。
  44. Ｚ１が、２’−Ｏ−メチル基を含む５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）である、請求項３８に記載の核酸分子。
  45. Ｚ２が、ホスホロチオエート結合を含む５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）である、請求項３８に記載の核酸分子。
  46. Ａ１が２’−Ｏ−メチルアデノシンである、請求項３１、３５または３８に記載の核酸分子。
  47. Ａ２が、ホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンである、請求項３１、３５または３８に記載の核酸分子。
  48. 請求項１〜４７のいずれか１項に記載の核酸分子から成る群から選択される２つの核酸分子を含む組成物。
  49. 溶液、粉末、ゲル及び乳濁液から選択される群から選択される形態である、請求項４８に記載の組成物。
  50. 前記２つの核酸分子が共有結合または非共有結合している、請求項４８に記載の組成物。
  51. 前記核酸分子がＰＤＧＦ受容体のＰＤＧＦ媒介性リン酸化を阻害する、請求項１〜６、１５〜２１、３１〜３４、３８または４１〜４５のいずれか１項に記載の核分子。
  52. 請求項１〜５１のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸分子及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
  53. 前記医薬組成物が硝子体内注射用である、請求項５２に記載の医薬組成物。
  54. 黄斑変性症を有する対象に治療有効量の請求項５２に記載の医薬組成物を投与することを含む、黄斑変性症の治療方法
  55. 黄斑変性症を発症する危険性がある対象に治療有効量の請求項５２に記載の医薬組成物を投与することを含む、黄斑変性症の予防方法。
  56. 眼の病気を有する対象に治療有効量の請求項５２に記載の医薬組成物を投与することを含む、眼の病気の治療方法。
  57. 前記眼の病気が、網膜炎、黄斑変性症、脈絡膜炎、網膜症、高血圧性網膜症、糖尿病性網膜症、慢性ドライアイ、エイズ関連視力喪失、弱視、半盲、網膜静脈閉塞症、トラコーマ、円錐角膜、脈絡網膜の炎症、中心性漿液性網膜症、ブドウ膜炎、網膜ジストロフィー、浮腫、緑内障及び白内障から成る群から選択される、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記黄斑変性症が加齢性黄斑変性症である、請求項５４または５５に記載の方法。
  59. 前記黄斑変性症がドライ加齢性黄斑変性症またはウェット加齢性黄斑変性症である、請求項５８に記載の方法。
  60. 線維症を有する対象に治療有効量の請求項５２に記載の医薬組成物を投与することを含む、線維症の治療方法。
  61. 前記線維症が、肺線維症、腎線維症、眼部線維症、角膜線維症、後眼部線維化眼疾患、血管結合組織網膜瘢痕及び嚢胞性線維症から選択される、請求項６０に記載の方法。
  62. 心血管疾患を有する対象に治療有効量の請求項５２に記載の医薬組成物を投与することを含む、心血管疾患の治療方法。
  63. 前記心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、心肥大関連状態及び血管障害から選択される、請求項６２に記載の方法。
  64. 癌を有する対象に治療有効量の請求項５２に記載の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療方法。
  65. 前記癌が、膀胱癌、肺癌、乳癌、黒色腫、結腸癌、直腸癌、眼部の癌、リンパ腫、子宮内膜癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、白血病並びに甲状腺癌から選択される、請求項６４に記載の方法。
  66. アプタマーである、先行する請求項のいずれか１項に記載の核酸分子。
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