ES2834910T3

ES2834910T3 - Aptámeros de PDGF y VEGF que tienen una estabilidad mejorada y su uso en el tratamiento de enfermedades y trastornos mediados por PDGF y VEGF

Info

Publication number: ES2834910T3
Application number: ES14842475T
Authority: ES
Inventors: Nebojsa Janjic; Daniel W Drolet; Amy D Gelinas; Chi Zhang; Michael Vrkljan
Original assignee: Somalogic Inc
Current assignee: Somalogic Inc
Priority date: 2013-09-09
Filing date: 2014-09-08
Publication date: 2021-06-21
Anticipated expiration: 2034-09-08
Also published as: EP3044334A1; CA2920508A1; US10544419B2; US20160177307A1; EP3693472A1; US9695424B2; JP2016529911A; CA2920508C; CA3221709A1; WO2015035305A1; JP6949916B2; JP2020010716A; JP6630273B2; EP3044334A4; US20170247702A1; US9994857B2; EP3044334B1; JP2021072835A; US20180258432A1; JP2023040156A

Abstract

Una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico: (A) 5'-C-G-A-C-A-G-C-A-Z-G-Z-A-Z-G-C-A-C-A-Z-C-Z-3' (SEQ ID NO:830), donde Z es una pirimidina modificada en C-5 y al menos una de las posiciones 4, 9, 10, 11 y 12 de la molécula de ácido nucleico comprende un enlace o resto fosforotioato, donde la posición 1 es el primer nucleósido que comienza enel extremo 5' de la molécula de ácido nucleico; o (B) 5'-C1-G-A-C1'2-A-G1-C1-A-Z2-G2-Z2-A2-Z2-G1-C1-A1-C1-A1-Z-C1-Z1-3' (SEQ ID NO:833), donde, C1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una citidina, una desoxicitidina y una 2'-O-metilcitidina; C1'2 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una citidina, una citidina que comprende un enlace fosforotioato, una desoxicitidina, una desoxicitidina que comprende un enlace fosforotioato, una 2'-O-metilcitidina y una 2'-O-metilcitidina que comprende un enlace fosforotioato; G1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una guanosina, una desoxiguanosina y una 2'-O-metilguanosina; G2 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una guanosina, una guanosina que comprende un enlace fosforotioato, una desoxiguanosina y una desoxiguanosina que 20 comprende un enlace fosforotioato; Z1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una uridina, una desoxiuridina, una 2'-O-metiluridina, una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) y una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un grupo 2'-O-metilo; Z2 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una uridina, una uridina que comprende un enlace fosforotioato, una desoxiuridina, una desoxiuridina que comprende un enlace fosforotioato, una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) y una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un enlace fosforotioato; Z se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una uridina, una desoxiuridina y una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU); A1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una adenosina, una desoxiadenosina y una 2'-O-metiladenosina; A2 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una adenosina, una adenosina que comprende un enlace fosforotioato, una desoxiadenosina y una desoxiadenosina que comprende un enlace fosforotioato; y donde la molécula de ácido nucleico comprende al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco enlaces fosforotioato.

Description

DESCRIPCIÓN

Aptámeros de PDGF y VEGF que tienen una estabilidad mejorada y su uso en el tratamiento de enfermedades y trastornos mediados por PDGF y VEGF

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

[0001] La presente solicitud reivindica prioridad a la solicitud provisional de los EE.UU. n .° de serie 61/875.660, depositada el 9 de septiembre de 2013, cuya solicitud se incorpora como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0002] La presente descripción se refiere generalmente al campo de los ácidos nucleicos y más particularmente a aptámeros capaces de unirse al factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y aptámeros capaces de unirse al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). En algunas realizaciones, dichos aptámeros son útiles como agentes terapéuticos para prevenir, tratar y/o mejorar trastornos proliferativos, que incluyen, pero no se limitan a, aterosclerosis, degeneración macular, fibrosis, cáncer y otros trastornos en los que se ha implicado PDGF y/o VEGF. En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a construcciones de aptámeros que son capaces de unirse a VEGF y PDGF, ya sea simultáneamente o de manera mutuamente exclusiva, y son útiles como agentes terapéuticos.

[0003] El listado de secuencias titulado "sequence Listing.txt", fue creado el 8 de septiembre de 2014 y tiene un tamaño de 1.005 kilobytes.

ANTECEDENTES

[0004] La siguiente descripción proporciona un resumen, de información y no es una admisión de que cualquiera de la información proporcionada o publicaciones a las que se hace referencia en esta invención es técnica anterior a la presente descripción.

[0005] Los factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF-A, -B, -C y -D) son mitógenos omnipresentes y factores quimiotácticos para muchas células del tejido conectivo (Fredriksson, L., y col. (2004) Cytokine Growth Factor Rev. 15(4):197). Los PDGF se producen como dímeros unidos a disulfuro y contienen un dominio de factor de crecimiento de pliegues de nudos de cisteína que funciona a través de la unión a los receptores de PDGF a y p en la superficie de una célula (Claesson-Welsh, L., y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:4917). La unión de PDGF induce la dimerización del receptor, lo que conduce a la autofosforilación en residuos de tirosina intracelular (Claesson-Welsh, J. (1994) Biol. Chem., 269:32023). PDGF-BB está involucrado en varios trastornos proliferativos, incluyendo aterosclerosis, fibrosis, degeneración macular y cáncer (Ostman, A., y col. (2001) Adv. Cancer Res. 80:1; Appelmann, I. , y col. (2010) Recent Results Cancer Res. 180:51; Trojanowska, M., y col. (2008) Rheumatology (Oxford) 47(Suppl 5):2; Rutherford y col. (1997) Atherosclerosis 130:45; Smits y col. (1992) Am. J. Pathol. 140:639; Heldin y col. (1991) Endocrinology 129:2187; Floege and Johnson (1995) Miner. Electrolyte Metab. 21:271; Raines y col. (1990) Experimental Pharmacology, Peptide Growth Factors and Their Receptors, Sporn & Roberts, págs. 173-262, Springer, Heidelberg.).

[0006] VEGF es un homodímero unido a disulfuro secretado que estimula selectivamente las células endoteliales para proliferar, migrar y producir enzimas que degradan la matriz, todos los cuales son procedimientos necesarios para la formación de nuevos vasos sanguíneos (Conn, G., y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1323; Ferrara, N. y col. (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 161:851; Gospodarowicz, D., y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7311; Pepper, M.S., y col. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181:902; Unemori, E.N., y col. (1992) J. Cell. Physiol. 153:557). Además de ser el único mitógeno específico de células endoteliales conocido, el VEGF es único entre los factores de crecimiento angiogénicos por su capacidad para inducir un aumento transitorio en la permeabilidad de los vasos sanguíneos a las macromoléculas (Dvorak, H.F., y col. (1979) J. Immunol. 122:166; Senger, D.R., y col. (1983) Science 219:983; Senger, D.R., y col. (1986) Cancer Res. 46:5629). El aumento de la permeabilidad vascular y el depósito resultante de proteínas plasmáticas en el espacio extravascular facilitan la formación de nuevos vasos al proporcionar una matriz provisional para la migración de células endoteliales. De hecho, la hiperpermeabilidad es un rasgo característico de los nuevos vasos (Dvorak, H.F., y col. (1995) Am. J. Pathol.

146:1029). Además, la angiogénesis compensatoria inducida por hipoxia tisular también está mediada por VEGF (Levy, A.P., y col. (1996) J. Biol. Chem., 271:2746; Shweiki, D., y col. (1991) Nature, 359:843). La identificación de VEGF como una proteína inducible por hipoxia, junto con la observación complementaria de que la hiperoxia causa la supresión de la expresión del VEGF, proporciona un mecanismo atractivo para ajustar la demanda de oxígeno con el suministro vascular (Benjamin, L.E., y col. (1999) J. Clin. Invest. 103:159; Alon, T., y col. (1995) Nat. Med. 1:1024).

[0007] Varias isoformas de proteína VEGF se producen como resultado del corte y empalme alternativo de los ocho exones del gen que codifica VEGF (Eming, S.A., y col. (2006) J. Invest. Dermatol. Symp. Proc.1 1:79). Las isoformas más prevalentes son VEGF-121, VEGF-165 y VEGF-189. El procesamiento proteolítico de VEGF puede generar isoformas adicionales. VEGF-165 se puede escindir mediante plasmina entre Arg-110 y Ala-111 para generar VEGF-110, que es funcionalmente equivalente a VEGF-121 (Keyt, B.A., y col. (1996) J. Biol. Chem., 271:7788). VEGF-189 puede escindirse mediante uroquinasa dentro del dominio del exón 6 y a continuación puede escindirse adicionalmente mediante plasmina para generar VEGF-110 (Plouet, J., y col., (1997) J. Biol. Chem., 272:13390). Además, un subconjunto de metaloproteasas matriciales (MMP), que incluyen MMP-3, -7, -9 y -19, son capaces de escindir VEGF-165 y VEGF-189 en etapas secuenciales para generar VEGF-113, que es funcionalmente equivalente a VEGF-110. Por lo tanto, la abundancia relativa de formas difusas y unidas a la matriz de VEGF en un tejido dado se determina mediante la combinación de corte y empalme alternativo y procesamiento proteolítico que se produce en las células del tejido (Ferrara, N., y col. (2006) Retina, 26:859).

[0008] La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) sigue siendo la principal causa de ceguera en personas mayores de 55 años. La enfermedad se caracteriza por la formación de depósitos insolubles llamados drusas dentro de la mácula, la parte de la retina que tiene la mayor densidad de fotorreceptores y está involucrada en la visión central. En las etapas iniciales de la DMAE, los depósitos son avasculares y la enfermedad generalmente progresa lentamente. Sin embargo, en aproximadamente el 10 % de los pacientes, esta denominada forma "seca" de DMAE se vasculariza y se convierte en la forma "húmeda" de DMAE, durante la cual la enfermedad se vuelve más progresiva y la visión se deteriora a un ritmo más rápido. En muchos casos, la progresión de la visión central borrosa a la ceguera virtual se produce en menos de dos años. En la fase avanzada de la enfermedad, la forma exudativa o húmeda de la DMAE, nuevos vasos sanguíneos penetran desde el coriocapilar hacia la parte central de la retina (mácula), ocluyendo la visión central. En los Estados Unidos, la prevalencia de DMAE húmeda es de aproximadamente 1,8 millones y se espera que aumente a cerca de 3 millones para 2020. La incidencia de DMAE húmeda en los Estados Unidos es de aproximadamente 210.000 personas cada año.

[0009] Recientemente, la DMAE se ha tratado bloqueando la inducción de angiogénesis y filtración de vasos sanguíneos mediada por VEGF mediante inyección directa en el ojo de antagonistas de alta afinidad que se unen al VEGF, evitando la interacción del VEGF con sus receptores de la superficie celular en las células endoteliales.

[0010] Existe evidencia considerable de que la doble inhibición de la señalización de VEGF y PDGF-B conduce a un bloqueo más eficiente de la angiogénesis junto con la regresión de los nuevos vasos sanguíneos. Por ejemplo, la evidencia clínica sugiere que la inhibición doble de VEGF y PDGF-B puede lograr una inhibición más completa de la angiogénesis ocular en pacientes con DMAE. Un inhibidor de aptámero de PDGF-B (E10030), originalmente descubierto en NeXstar Pharmaceuticals (Green, L.S., y col. (1996) Biochemistry 35:14413; las patentes de los EE.UU. n.° 6.207.816; 5.731.144; 5.731.424; y 6.124.449), está siendo desarrollado por Ophthotech Corporation como un tratamiento para la DMAE. E10030 (Fovista®) es un aptámero modificado a base deADN que se une a PDGF-AB o PDGF-BB con una Kd de aproximadamente 100 pM e inhibe las funciones de PDGF-B tanto in vitro como in vivo.

[0011] En un estudio de fase 1, la terapia anti-PDGF con E10030 probada en combinación con la terapia anti-VEGF Lucentis® dio como resultado una ganancia de visión de tres líneas en el 59 % de los pacientes tratados después de 12 semanas de terapia. Este es un porcentaje considerablemente mayor de pacientes con agudeza visual mejorada en comparación con el 34-40 % observado históricamente con Lucentis solo. Además, el tratamiento combinado fue acompañado de una marcada regresión neovascular en todos los participantes del estudio. La eficacia mejorada con el tratamiento combinado se corroboró recientemente en un estudio de fase 2 de 449 pacientes con DMAE húmeda. Los pacientes que recibieron la combinación de Fovista (1,5 mg) y Lucentis obtuvieron una media de 10,6 letras de visión a las 24 semanas, en comparación con 6,5 letras para los pacientes que recibieron Lucentis en monoterapia (p=0,019), lo que representa un beneficio adicional de agudeza visual del 62 %.

[0012] El documento WO 2004/094614 menciona compuestos aptaméricos contra VEGF y PDGF utilizados en combinación y aptámeros para PDGF en asociación con un aptámero de VEGF en el tratamiento de cánceres.

RESUMEN

[0013] La presente descripción proporciona aptámeros que se unen al factor de crecimiento derivado de plaquetas B (PDGF-B, que incluye PDGF-BB y PDGF-AB), aptámeros que se unen al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, que incluye VEGF-121 y VEGF-165) y construcciones de aptámeros que comprenden un aptámero que se une a PDGF-B y un aptámero que se une a VEGF. Los aptámeros y construcciones de aptámeros descritos son útiles como agentes terapéuticos para prevenir, tratar y/o mejorar enfermedades o afecciones proliferativas, que incluyen, pero no se limitan a, aterosclerosis, degeneración macular, fibrosis, retinopatía diabética y cáncer, y/u otras enfermedades o afecciones en las que PDGF y/o VEGF están implicados. En diversas realizaciones, las construcciones de aptámeros son capaces de unirse a cada uno de VEGF y PDGF-B independientemente y/o VEGF y PDGF-B simultáneamente. Se incluyen composiciones o formulaciones farmacéuticas que comprenden un aptámero de PDGF, un aptámero de VEGF o una construcción de aptámero de VEGF/PDGF-B o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los anteriores y al menos un portador farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones se pueden preparar en cualquier forma de dosificación farmacéuticamente aceptable adecuada.

[0014] La invención se define según las reivindicaciones. Por lo tanto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico:

(A) 5'-C-G-A-C-A-G-C-A-Z-G-Z-A-Z-G-C-A-C-A-Z-C-Z - 3' (SEQ ID NO:830),

donde Z es una pirimidina modificada en C-5 y al menos una de las posiciones 4, 9, 10, 11 y 12 de la molécula de ácido nucleico comprende un enlace o resto fosforotioato, donde la posición 1 es el primer nucleósido que comienza enel extremo 5' de la molécula de ácido nucleico; o

(B) 5'-C1-G-A-C1'2-A-G1-C1-A-Z2-G2-Z2-A2-Z-G1-C1-A1-C1-A1-Z-C1-Z1-3' (SEQ ID NO:833),

donde,

C1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una citidina, una desoxicitidina y una 2'-O-metilcitidina;

C12 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una citidina, una citidina que comprende un enlace fosforotioato, una desoxicitidina, una desoxicitidina que comprende un enlace fosforotioato, una 2'-O-metilcitidina y una 2'-O-metilcitidina que comprende un enlace fosforotioato;

G1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una guanosina, una desoxiguanosina y una 2'-O-metilguanosina;

G2 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una guanosina, una guanosina que comprende un enlace fosforotioato, una desoxiguanosina y una desoxiguanosina que comprende un enlace fosforotioato;

Z1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una uridina, una desoxiuridina, una 2'-O-metiluridina, una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) y una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un grupo 2'-O-metilo;

Z2 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una uridina, una uridina que comprende un enlace fosforotioato, una desoxiuridina, una desoxiuridina que comprende un enlace fosforotioato, una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) y una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un enlace fosforotioato;

Z se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una uridina, una desoxiuridina y una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU);

A1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una adenosina, una desoxiadenosina y una 2'-O-metiladenosina;

A2 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una adenosina, una adenosina que comprende un enlace fosforotioato, una desoxiadenosina y una desoxiadenosina que comprende un enlace fosforotioato; y

donde la molécula de ácido nucleico comprende al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco enlaces fosforotioato.

[0015] La invención también proporciona la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1(A), donde:

(i) al menos dos, tres, cuatro o cinco de las posiciones 4, 9, 10, 11 y 12 de la molécula de ácido nucleico comprenden un enlace o resto o fosforotioato, y donde la posición 1 es el primer nucleósido que comienza en el extremo 5' de la molécula de ácido nucleico;

(ii) al menos una de las posiciones 1,4, 6, 7, 14, 15, 16, 17, 18, 20 y 21 de la molécula de ácido nucleico comprende una modificación de 2'-O-metilo, y donde la posición 1 es el primer nucleósido que comienza en el extremo 5' de la molécula de ácido nucleico;

(iii) al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez u once de las posiciones 1, 4, 6, 7, 14, 15, 16, 17, 18, 20 y 21 de la molécula de ácido nucleico comprenden una modificación de 2'-O-metilo, y donde la posición 1 es el primer nucleósido que comienza en el extremo 5' de la molécula de ácido nucleico;

(iv) la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO:545 y 800-821; o (v) la molécula de ácido nucleico comprende once nucleósidos 2'-O-metilo y cuatro o cinco enlaces o restos fosforotioato.

[0016] La invención también proporciona la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1(A) o 2(i)-(v),

donde:

la pirimidina modificada en C-5 independientemente, y para cada aparición, se selecciona del grupo que consiste en 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU), 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-fenetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PedU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThdU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (iBudU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-triptaminocarboxiamida) -2'-O-metiluridina, 5- (N-triptaminocarboxiamida)-2'-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxiamida]-2'-desoxiuridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuidina (NapdU), 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'O-metiluridina, 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida-2'-desoxiuridina (2NapdU), 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida-2'-O-metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)--2'-fluorouridina y 5- (N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2'-desoxiuridina).

[0017] La invención también proporciona la molécula de ácido nucleico de:

(i) una cualquiera de las reivindicaciones 1(A), 2(i)-(iii), 2(v) o 3, donde la molécula de ácido nucleico se une a una proteína PDGF con una afinidad de unión de inferior a 10 nM, inferior a 5 nM, inferior a 2 nM, inferior a 1 nM o inferior a 0,1 nM;

(ii) la reivindicación 3, donde la molécula de ácido nucleico se une a una proteína VEGF con una afinidad de unión inferior a 10 nM, inferior a 5 nM, inferior a 2 nM, inferior a 1 nM o inferior a 0,1 nM; o

(iii) una cualquiera de las reivindicaciones 1(A), 2(i), 3, 4(i) o 4(ii), donde la molécula de ácido nucleico comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve nucleósidos 2'-O-metilo.

[0018] La invención también proporciona la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde:

(i) la molécula de ácido nucleico comprende además un desoxinucleótido invertido en el extremo 3' de la molécula de ácido nucleico; opcionalmente, donde el desoxinucleótido es una desoxitimidina; y/o

(ii) la molécula de ácido nucleico es menos sensible a una nucleasa en comparación con la misma molécula de ácido nucleico sin un enlace o resto fosforotioato; opcionalmente, donde la nucleasa es una enzima DNasa; opcionalmente, donde la enzima DNasa es una enzima DNasa I o una enzima DNasa II; y/o

(iii) la molécula de ácido nucleico es más estable en humor vítreo de conejos blancos de Nueva Zelanda en comparación con la misma molécula de ácido nucleico sin un enlace o resto fosforotioato.

[0019] La invención también proporciona la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1(B), donde: (i) C1'2 es una 2'-O-metilcitidina que comprende un enlace fosforotioato; opcionalmente, donde Z1 es una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un grupo 2'-O-metilo;

(ii) Z2 es una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un enlace fosforotioato; (iii) Z es una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU);

(iv) C1 es una 2'-O-metilcitidina;

(v) G1 es una 2'-O-metilguanosina;

(vi) G2 es una desoxiguanosina que comprende un enlace fosforotioato

(vii) A1 es una 2'-O-metiladenosina; o

(viii) A2 es una desoxiadenosina que comprende un enlace fosforotioato

[0020] La invención también proporciona una composición que comprende dos moléculas de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6; opcionalmente donde:

(i) la composición está en la forma seleccionada del grupo que consiste en una solución, un polvo, un gel y una emulsión; o

(ii) las dos moléculas de ácido nucleico están unidas covalentemente o no covalentemente unidas.

[0021] La invención también proporciona la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1(A), 1(B), 2(i)-(v), 4(i), 6(i), 6(ii) o 6(v), donde la molécula de ácido nucleico inhibe la fosforilación mediada por PDGF de un receptor de PDGF.

[0022] La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y un portador farmacéuticamente aceptable; opcionalmente, donde la composición farmacéutica es para inyección intravítrea. Opcionalmente, la composición farmacéutica se utiliza en:

(i) tratar la degeneración macular; opcionalmente, donde la degeneración macular es degeneración macular relacionada con la edad; opcionalmente, donde la degeneración macular es degeneración macular seca relacionada con la edad o degeneración macular húmeda relacionada con la edad;

(ii) prevenir la degeneración macular en un sujeto en riesgo de desarrollar degeneración macular; opcionalmente, donde la degeneración macular es degeneración macular relacionada con la edad; opcionalmente, donde la degeneración macular es degeneración macular seca relacionada con la edad o degeneración macular húmeda relacionada con la edad;

(iii) tratar una afección oftálmica; opcionalmente, donde la afección oftálmica se selecciona del grupo que consiste en retinitis, degeneración macular, coroiditis, retinopatía, retinopatía hipertensiva, retinopatía diabética, ojo seco crónico, pérdida de visión relacionada con el SIDA, ambliopía, hemianopía, oclusiones de la vena retiniana, tracoma, queratocono, inflamación coriorretiniana, retinopatía serosa central, uveítis, distrofia retiniana, edema, glaucoma y catarata;

iv) tratar la fibrosis; opcionalmente, donde la fibrosis se selecciona de fibrosis pulmonar, fibrosis renal, fibrosis ocular, fibrosis corneal, enfermedad ocular fibrótica del segmento posterior, cicatrización fibrovascular rential y fibrosis quística;

v) tratar una enfermedad cardiovascular; opcionalmente, donde la enfermedad cardiovascular se selecciona de aterosclerosis, reestenosis, una afección relacionada con hipertrofia cardíaca y un trastorno vascular; o vi) tratar el cáncer; opcionalmente, donde el cáncer se selecciona de cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de mama, melanoma, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer ocular, linfoma, cáncer de endometrio, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer renal, cáncer de próstata, leucemia y cáncer de tiroides.

[0023] En un aspecto, la descripción proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleica: 5'-C-G-A-C-A-G-C-A-Z-G-Z-A-Z-G-C-A-C-A-Z-C-Z-3' (SEQ ID NO:830), donde Z es una pirimidina modificada en C-5 y al menos una de las posiciones 4, 9, 10, 11 y 12 de la molécula de ácido nucleico comprende un enlace o resto fosforotioato, donde la posición 1 es el primer nucleósido que comienza en el extremo 5' de la molécula de ácido nucleico. En un aspecto relacionado, las al menos dos, tres, cuatro o cinco de las posiciones 4, 9, 10, 11 y 12 de la molécula de ácido nucleico comprenden un enlace o resto fosforotioato, y donde la posición 1 es el primer nucleósido que comienza en el extremo 5' de la molécula de ácido nucleico.

[0024] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez nucleósidos 2'-O-metilo. En un aspecto relacionado, al menos una de las posiciones 1, 4, 6, 7, 14, 15, 16, 17, 18, 20 y 21 de la molécula de ácido nucleico comprende una modificación de 2'-O-metilo, y donde la posición 1 es el primer nucleósido que comienza en el extremo 5' de la molécula de ácido nucleico. En otro aspecto relacionado más, las al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez u once de las posiciones 1, 4, 6, 7, 14, 15, 16, 17, 18, 20 y 21 de la molécula de ácido nucleico comprenden una modificación de 2'-O-metilo, y donde la posición 1 es el primer nucleósido que comienza en el extremo 5' de la molécula de ácido nucleico.

[0025] En otro aspecto, la pirimidina modificada en C-5 independientemente, y para cada aparición, se selecciona del grupo que consiste en 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU), 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-fenetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PedU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThdU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (iBudU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-triptaminocarboxiamida) -2'-O-metiluridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxiamida-2'-desoxiuridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, y 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2'-desoxiuridina). En un aspecto relacionado, la pirimidina modificada en C-5 es una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU).

[0026] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende ADN, ARN o una combinación de los mismos.

[0027] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico se une a una proteína PDGF con una afinidad de unión inferior a 10 nM, inferior a 5 nM, inferior a 2 nM o inferior a 1 nM.

[0028] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende además un desoxinucleótido invertido en el extremo 3' de la molécula de ácido nucleico. En un aspecto relacionado, el desoxinucleótido es una desoxitimidina.

[0029] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico es menos sensible a una nucleasa en comparación con la misma molécula de ácido nucleico sin un enlace o resto fosforotioato. En un aspecto relacionado, la nucleasa es una enzima DNasa. En otro aspecto relacionado más, la enzima DNasa es una enzima DNasa I o DNasa II.

[0030] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico es más estable en humor vítreo de conejos blancos de Nueva Zelanda en comparación con la misma molécula de ácido nucleico sin un enlace o resto fosforotioato.

[0031] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en los aptámeros 5169 que tienen el siguiente número de ID de aptámero 146, 150-159, 172-182 y 188.

[0032] En un aspecto relacionado, la molécula de ácido nucleico comprende once nucleósidos 2'-O-metilo y cuatro o cinco enlaces o restos fosforotioato.

[0033] En un aspecto relacionado, la molécula de ácido nucleico comprende al menos un nucleótido que tiene un enlace o resto fosforotioato y un grupo 2'-O-metilo.

[0034] En otro aspecto, esta descripción proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleica: 5'C-C-G-Z-Z-C-A-A-G-Z-G-Z-Z-G-Z-A-G-A-Z-Z-Z-A-A-A-A-Z-G-G-3' (SEQ ID NO:831), donde Z es una pirimidina modificada en C-5 y al menos una de las posiciones 24, 25 y 26 de la molécula de ácido nucleico comprende un enlace o resto fosforotioato, donde la posición 1 es el primer nucleósido que comienza en el extremo 5' de la molécula de ácido nucleico. En un aspecto relacionado, al menos dos o tres de las posiciones 24, 25 y 26 comprenden un enlace o resto fosforotioato, y donde la posición 1 es el primer nucleósido que comienza en el extremo 5' de la molécula de ácido nucleico.

[0035] En un aspecto relacionado, la molécula de ácido nucleico comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve nucleósidos 2'-O-metilo.

[0036] En otro aspecto, al menos una de las posiciones 1, 6, 9, 12, 15, 17, 18, 22, 28 y 29 de la molécula de ácido nucleico comprende una modificación de 2'-O-metilo, y donde la posición 1 es el primer nucleósido que comienza en el extremo 5' de la molécula de ácido nucleico. En un aspecto relacionado, al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve de las posiciones 1,6, 9, 12, 15, 17, 18, 22, 28 y 29 de la molécula de ácido nucleico comprenden una modificación de 2'-O-metilo, y donde la posición 1 es el primer nucleósido que comienza en el extremo 5' de la molécula de ácido nucleico.

[0037] En otro aspecto, la pirimidina modificada en C-5 independientemente, y para cada aparición, se selecciona del grupo que consiste en 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU), 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-fenetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PedU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThdU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (iBudU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-triptaminocarboxiamida) -2'-O-metiluridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxiamida-2'-desoxiuridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, y 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2'-desoxiuridina). En un aspecto relacionado, la pirimidina modificada en C-5 es una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU).

[0038] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende ADN, ARN o una combinación de los mismos.

[0039] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico se une a una proteína VEGF con una afinidad de unión inferior a 10 nM, inferior a 5 nM, inferior a 2 nM o inferior a 1 nM.

[0040] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende además un desoxinucleótido invertido en el extremo 3' de la molécula de ácido nucleico. En un aspecto relacionado, el desoxinucleótido es una desoxitimidina.

[0041] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico es menos sensible a una nucleasa en comparación con la misma molécula de ácido nucleico sin un enlace o resto fosforotioato. En un aspecto relacionado, la nucleasa es una enzima DNasa. En otro aspecto relacionado más, la enzima DNasa es una enzima DNasa I o DNasa II.

[0042] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico es más estable en humor vítreo de conejos blancos de Nueva Zelanda en comparación con la misma molécula de ácido nucleico sin un enlace o resto fosforotioato.

[0043] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en los aptámeros 4867-31 que tienen el siguiente número de ID de aptámero 192, 409-417, 419-429 ,438-445 y 475-483.

[0044] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende nueve o diez nucleósidos 2'-O-metilo y uno, dos o tres enlaces o restos fosforotioato.

[0045] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende al menos un nucleótido que tiene un enlace o resto fosforotioato y un grupo 2'-O-metilo.

[0046] En otro aspecto, la descripción proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleica: 5'-Z-Z"-A-C-H-G-Z-Z-A-C-V-C-G-C-G-Z'-Z-Z-A-Z-A-G-C-G-G - 3' (SEQ ID NO:832), donde Z, Z' y Z" se seleccionan independientemente, para cada aparición del grupo que consiste en 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU), 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-fenetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PedU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThdU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (iBudU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NapdU), 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-3,4-metilendioxibencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (MBndU) y 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2'-desoxiuridina); V es un enlazador de tres carbonos y H es un enlazador de hexaetilenglicol; y al menos una de las posiciones 8, 9, 15, 16 y 17 de la molécula de ácido nucleico comprende un enlace o resto fosforotioato, donde la posición 1 es el primer nucleósido que comienza en el extremo 5' de la molécula de ácido nucleico, y H y V se consideran una única posición a los efectos de contar las posiciones de la molécula de ácido nucleico. En un aspecto relacionado, Z y Z' se seleccionan independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU), 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-fenetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PedU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThdU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (iBudU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TrpdU), 5-(Ntriptaminocarboxiamida) -2'-O-metiluridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-fluorodina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina y 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2'-desoxiuridina). En otro aspecto relacionado, Z se selecciona de forma independiente, para cada aparición, de una 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU) o metilendioxibencil-dU. En otro aspecto relacionado, Z' es una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU).

[0047] En otro aspecto, al menos dos o tres de las posiciones 8, 9, 15, 16 y 17 comprenden un enlace o resto fosforotioato, y donde la posición 1 es el primer nucleósido que comienza en el extremo 5' de la molécula de ácido nucleico, y H y V se consideran una única posición a los efectos de contar las posiciones de la molécula de ácido nucleico.

[0048] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho nucleósidos 2-O-metilo.

[0049] En otro aspecto, al menos una de las posiciones 3, 7, 12, 13, 18, 19, 21 y 24 de la molécula de ácido nucleico comprende una modificación 2'-O-metilo, y donde la posición 1 es el primer nucleósido que comienza en el extremo 5' de la molécula de ácido nucleico, y H y V se consideran una única posición a los efectos de contar las posiciones de la molécula de ácido nucleico. En un aspecto relacionado, al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho de las posiciones 3, 7, 12, 13, 18, 19, 21 y 24 de la molécula de ácido nucleico comprenden una modificación 2'-O-metilo, y donde la posición 1 es el primer nucleósido que comienza enel extremo 5' de la molécula de ácido nucleico, y H y V se consideran una única posición a los efectos de contar las posiciones de la molécula de ácido nucleico.

[0050] En otro aspecto, la Z es una 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU).

[0051] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende ADN, ARN o una combinación de los mismos.

[0052] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico se une a una proteína PDGF con una afinidad de unión inferior a 10 nM, inferior a 5 nM, inferior a 2 nM o inferior a 1 nM. En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico inhibe la fosforilación mediada por PDGF de un receptor de PDGF.

[0053] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende además un desoxinucleótido invertido en el extremo 3' de la molécula de ácido nucleico. En un aspecto relacionado, el desoxinucleótido es una desoxitimidina.

[0054] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico es menos sensible a una nucleasa en comparación con la misma molécula de ácido nucleico sin un enlace o resto fosforotioato. En un aspecto relacionado, la nucleasa es una enzima DNasa. En otro aspecto relacionado más, la enzima DNasa es una enzima DNasa I o DNasa II.

[0055] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico es más estable en humor vítreo de conejos blancos de Nueva Zelanda en comparación con la misma molécula de ácido nucleico sin un enlace o resto fosforotioato.

[0056] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en los aptámeros 4149-8 que tienen el siguiente número de ID de aptámero 379, 391, 418-426, 431-437 y 453-459.

[0057] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende siete u ocho nucleósidos 2'-O-metilo y cuatro, cinco, seis, siete u ocho enlaces o restos fosforotioato.

[0058] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende al menos un nucleótido que tiene un enlace o resto fosforotioato y un grupo 2'-O-metilo.

[0059] En otro aspecto, la descripción proporciona una composición que comprende dos moléculas de ácido nucleico seleccionadas de las moléculas de ácido nucleico descritas en esta invención.

[0060] En otro aspecto, la composición tiene la forma seleccionada del grupo seleccionado de una solución, un polvo, un gel y una emulsión.

[0061] En otro aspecto, las dos moléculas de ácido nucleico están unidas covalentemente o no covalentemente unidas.

[0062] En otro aspecto, esta descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas en esta invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

[0063] En otro aspecto, la composición farmacéutica es para inyección intravítrea.

[0064] En otro aspecto, esta descripción proporciona un procedimiento para tratar la degeneración macular que comprende administrar a un sujeto con degeneración macular una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica como se describe en esta invención.

[0065] En otro aspecto, esta descripción proporciona un procedimiento para prevenir la degeneración macular que comprende administrar a un sujeto en riesgo de desarrollar degeneración macular una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica como se describe en esta invención.

[0066] En otro aspecto, esta descripción proporciona un procedimiento para tratar una afección oftálmica que comprende administrar a un sujeto con una afección oftálmica una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica como se describe en esta invención. En un aspecto relacionado, la afección oftálmica se selecciona del grupo que consiste en retinitis, degeneración macular, coroiditis, retinopatía, retinopatía hipertensiva, retinopatía diabética, ojo seco crónico, pérdida de visión relacionada con el SIDA, ambliopía, hemianopía, oclusiones de la vena retiniana, tracoma, queratocono, inflamación corioretiniana, retinopatía serosa central, uveítis, distrofia retiniana, edema, glaucoma y catarata.

[0067] En otro aspecto, la degeneración macular es degeneración macular relacionada con la edad. En un aspecto relacionado, la degeneración macular es degeneración macular seca relacionada con la edad o degeneración macular húmeda relacionada con la edad.

[0068] En otro aspecto, esta descripción proporciona un procedimiento para tratar la fibrosis que comprende administrar a un sujeto con fibrosis una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica como se describe en esta invención. En un aspecto relacionado, la fibrosis se selecciona de fibrosis pulmonar, fibrosis renal y fibrosis quística.

[0069] En otro aspecto, esta descripción proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad cardiovascular que comprende administrar a un sujeto con la enfermedad cardiovascular una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica como se describe en esta invención. En un aspecto relacionado, la enfermedad cardiovascular se selecciona de aterosclerosis, reestenosis, una afección relacionada con hipertrofia cardíaca y un trastorno vascular.

[0070] En otro aspecto, esta descripción proporciona un procedimiento para tratar el cáncer que comprende administrar a un sujeto con cáncer una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica como se describe en esta invención. En un aspecto relacionado, el cáncer se selecciona de cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de mama, melanoma, cáncer de colon y recto, linfoma, cáncer de endometrio, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer renal, cáncer de próstata, leucemia y cáncer de tiroides.

[0071] En otro aspecto, esta descripción proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleica: 5'-C1-G-A-C1'2-A-G1-C1-A-Z2-G2-Z2-A2-Z-G1-C1-A1-C1-A1-Z-C1-Z1-3' (SEQ ID NO:833), donde C1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una citidina, una desoxicitidina y una 2'-O-metilcitidina; C1'2 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una citidina, una citidina que comprende un enlace fosforotioato, una desoxicitidina, una desoxicitidina que comprende un enlace fosforotioato, una 2'-O-metilcitidina y una 2'-O-metilcitidina que comprende un enlace fosforotioato; G1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una guanosina, una desoxiguanosina y una 2'-O-metilguanosina; G2 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una guanosina, una guanosina que comprende un enlace fosforotioato, una desoxiguanosina y una desoxiguanosina que comprende un enlace fosforotioato; Z se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una uridina, una desoxiuridina y una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU); Z1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una uridina, una desoxiuridina, una 2'-O-metiluridina, una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) y una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un grupo 2'-O-metilo; Z2 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una uridina, una uridina que comprende un enlace fosforotioato, una desoxiuridina, una desoxiuridina que comprende un enlace fosforotioato, una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2-desoxiuridina (NapdU) y una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un enlace fosforotioato; A1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una adenosina, una desoxiadenosina y una 2'-O-metiladenosina; A2 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una adenosina, una adenosina que comprende un enlace fosforotioato, una desoxiadenosina y una desoxiadenosina que comprende un enlace fosforotioato; y donde la molécula de ácido nucleico comprende al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco enlaces fosforotioato.

[0072] En un aspecto relacionado, C1 es una 2'-O-metilcitidina. En un aspecto relacionado, C1'2 es una 2'-O-metilcitidina que comprende un enlace fosforotioato. En un aspecto relacionado, G1 es una 2'-O-metilguanosina. En un aspecto relacionado, G2 es una desoxiguanosina que comprende un enlace fosforotioato. En un aspecto relacionado, Z1 es una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un grupo 2'-O-metilo.

En un aspecto relacionado, Z2 es una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un enlace fosforotioato. En un aspecto relacionado, A1 es una 2'-O-metiladenosina. En un aspecto relacionado, A2 es una desoxiadenosina que comprende un enlace fosforotioato.

[0073] En otro aspecto, esta descripción proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleica: 5'-C1-C-G-Z-Z-C1-A-A-G1-Z-G-C1-Z-Z-G1-Z-A1-G1-G-A-Z-Z1-Z-A2-A2-A2-Z-G1-G1-3' (SEQ ID NO:834), donde C1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una citidina, una desoxicitidina y una 2'-O-metilcitidina; G1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una guanosina, una desoxicuanosina y una 2'-O-metilguanosina; G1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una guanosina, una desoxiguanosina y una 2'-O-metilguanosina; Z se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una uridina, una desoxiuridina y una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU); Z1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una uridina, una desoxiuridina, una 2'-O-metiluridina, una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) y una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un grupo 2'-O-metilo; A1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una adenosina, una desoxiadenosina y una 2'-O-metiladenosina; A2 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una adenosina, una adenosina que comprende un enlace fosforotioato, una desoxiadenosina y una desoxiadenosina que comprende un enlace fosforotioato; y donde la molécula de ácido nucleico comprende al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco enlaces fosforotioato.

[0074] En un aspecto relacionado, C1 es una 2'-O-metilcitidina. En un aspecto relacionado, G1 es una 2'-O-metilguanosina. En un aspecto relacionado, Z es una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU). En un aspecto relacionado, Z1 es una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un grupo 2'-O-metilo. En un aspecto relacionado, A1 es una 2'-O-metiladenosina. En un aspecto relacionado, A2 es una desoxiadenosina que comprende un enlace fosforotioato.

En otro aspecto, esta descripción proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleica: 5'-Z-Z"-A1 -C-H-G-Z1 -Z2-A2-C-V-C-C1-G1 -C-G2-Z2-Z2-Z1 -A1 -Z-A1 -G-C-G-G1 -3' (SEQ ID NO:835), donde C1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una citidina, una desoxicitidina y una 2'-O-metilcitidina; G1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una guanosina, una desoxiguanosina y una 2'-O-metilguanosina; G2 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una guanosina, una guanosina que comprende un enlace fosforotioato, una desoxiguanosina y una desoxiguanosina que comprende un enlace fosforotioato; Z se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una uridina, una desoxiuridina, una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), una 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NapdU), una 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU) y una 5-(N-3,4-metilendioxibencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (MBndU); Z" se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una uridina, una desoxiuridina, una 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU) y una 5-(N-3,4-metilendioxibencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (MBndU); Z'2 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una uridina, una uridina que comprende un enlace fosforotioato, una desoxiuridina, una desoxiuridina que comprende un enlace fosforotioato, una 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU), una 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU) que comprende un enlace fosforotioato, una 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NapdU), una 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NapdU) que comprende un enlace fosforotioato, una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) y una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un enlace fosforotioato; Z1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una uridina, una desoxiuridina, una 2'-O-metiluridina, una 5-(N naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un grupo 2'-O-metilo, una 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU), una 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU) que comprende un grupo 2'-O-metilo, unametilenodioxibencil-dU y una metilenodioxibencil-dU que comprende un grupo 2'-O-metilo; Z2 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una uridina, una uridina que comprende un enlace fosforotioato, una desoxiuridina, una desoxiuridina que comprende un enlace fosforotioato, una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) y una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un enlace fosforotioato, una 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU), una 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU) que comprende un enlace fosforotioato, una metilenodioxibencil-dU y una metilenodioxibencil-dU que comprende un enlace fosforotioato; A1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una adenosina, una desoxiadenosina y una 2'-O-metiladenosina; A2 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una adenosina, una adenosina que comprende un enlace fosforotioato, una desoxiadenosina y una desoxiadenosina que comprende un enlace fosforotioato; V es un enlazador de tres carbonos; H es enlazador de hexaetilenglicol; y donde la molécula de ácido nucleico comprende al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco enlaces fosforotioato.

[0075] En un aspecto relacionado, C1 es una 2'-O-metilcitidina. En un aspecto relacionado, G1 es una 2'-O-metilguanosina. En un aspecto relacionado, G2 es una desoxiguanosina que comprende un enlace fosforotioato. En un aspecto relacionado, Z es una 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU). En un aspecto relacionado, Z'2 es una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un enlace fosforotioato. En un aspecto relacionado, Z1 es una 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU) que comprende un grupo 2'-O-metilo. En un aspecto relacionado, Z2 es una 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU) que comprende un enlace fosforotioato. En un aspecto relacionado, A1 es una 2'-O-metiladenosina. En un aspecto relacionado, A2 es una desoxiadenosina que comprende un enlace fosforotioato.

[0076] En otro aspecto, esta descripción proporciona una composición que comprende dos moléculas de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en una cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas en esta invención.

[0077] En un aspecto relacionado, la composición tiene la forma seleccionada del grupo seleccionado de una solución, un polvo, un gel y una emulsión.

[0078] En un aspecto relacionado, las dos moléculas de ácido nucleico están unidas covalentemente o no covalentemente unidas.

[0079] En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico inhibe la fosforilación mediada por PDGF de un receptor de PDGF.

[0080] En otro aspecto, esta descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de ácido nucleico descrita en esta invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

[0081] En un aspecto relacionado, la composición farmacéutica es para inyección intravítrea.

[0082] En otro aspecto, esta descripción proporciona un procedimiento para tratar la degeneración macular que comprende administrar a un sujeto con degeneración macular una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de ácido nucleico descrita en esta invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

[0083] En otro aspecto, esta descripción proporciona un procedimiento para prevenir la degeneración macular que comprende administrar a un sujeto en riesgo de desarrollar degeneración macular una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de ácido nucleico descrita en esta invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

[0084] En otro aspecto, esta descripción proporciona un procedimiento para tratar una afección oftálmica que comprende administrar a un sujeto con una afección oftálmica una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de ácido nucleico descrita en esta invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

[0085] En un aspecto relacionado, la afección oftálmica se selecciona del grupo que consiste en retinitis, degeneración macular, coroiditis, retinopatía, retinopatía hipertensiva, retinopatía diabética, ojo seco crónico, pérdida de visión relacionada con el SIDA, ambliopía, hemianopía, oclusiones de la vena retiniana, tracoma, queratocono, inflamación corioretiniana, retinopatía serosa central, uveítis, distrofia retiniana, edema, glaucoma y catarata.

[0086] En un aspecto relacionado, la degeneración macular es degeneración macular relacionada con la edad.

[0087] En un aspecto relacionado, la degeneración macular es degeneración macular seca relacionada con la edad o degeneración macular húmeda relacionada con la edad.

[0088] En otro aspecto, esta descripción proporciona un procedimiento para tratar la fibrosis que comprende administrar a un sujeto con fibrosis una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de ácido nucleico descrita en esta invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

[0089] En un aspecto relacionado, la fibrosis se selecciona de fibrosis pulmonar, fibrosis renal y fibrosis quística.

[0090] En otro aspecto, esta descripción proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad cardiovascular que comprende administrar a un sujeto con la enfermedad cardiovascular una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de ácido nucleico descrita en esta invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

[0091] En un aspecto relacionado, la enfermedad cardiovascular se selecciona de aterosclerosis, reestenosis, una afección relacionada con hipertrofia cardíaca y un trastorno vascular.

[0092] En otro aspecto, esta descripción proporciona un procedimiento para tratar el cáncer que comprende administrar a un sujeto con cáncer una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de ácido nucleico descrita en esta invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

[0093] En un aspecto relacionado, el cáncer se selecciona de cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de mama, melanoma, cáncer de colon y recto, linfoma, cáncer de endometrio, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer renal, cáncer de próstata, leucemia y cáncer de tiroides.

[0094] En un aspecto relacionado, cualquiera de la molécula de ácido nucleico descrita en esta invención es un aptámero.

[0095] En otro aspecto, la presente descripción proporciona procedimientos para prevenir, tratar y/o mejorar una enfermedad o afección mediada por PDGF y/o VEGF. En algunas realizaciones, un procedimiento comprende administrar un aptámero de PDGF, un aptámero de VEGF y/o una construcción de aptámero de VEGF/PDGF-B, o composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de estos, a un sujeto, tal como un mamífero. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. Específicamente, se proporcionan procedimientos para tratar, prevenir y/o mejorar la fibrosis, aterosclerosis, degeneración macular, retinopatía diabética y/o cáncer. En algunas realizaciones, una enfermedad o afección mediada por PDGF y/o VEGF es aquella en la que la actividad de PDGF y/o VEGF puede contribuir directa o indirectamente a la enfermedad o afección. Dichas enfermedades o afecciones incluyen, pero no se limitan a, fibrosis, aterosclerosis, degeneración macular, retinopatía diabética y cáncer. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección a tratar, prevenir y/o mejorar es degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), retinopatía diabética u otras enfermedades oculares, tales como glaucoma, ojo seco crónico, pérdida de visión relacionada con el SIDA, ambliopía, hemianopía, oclusiones de la vena retiniana, tracoma, queratocono, inflamación corioretiniana, retinopatía serosa central, uveítis, retinitis, retinopatía hipertensiva, distrofia retiniana, etc. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección a tratar, prevenir y/o mejorar es fibrosis renal o cáncer renal.

[0096] En algunas realizaciones, los aptámeros y construcciones de aptámeros descritos en esta invención tienen aplicaciones potenciales que van desde el descubrimiento y diagnóstico de biomarcadores (Ostroff, R.M., y coll. (2010) PLoS One, 5:e15003; Mehan, M., y col. (2012) PLoS One 7:e35157) a la histoquímica y formación de imágenes (Gupta, S., y col. (2011) Appl. Inmunohistochem. Mol. Morphol. 19:273).

[0097] En algunas realizaciones, se puede lograr un efecto terapéutico (por ejemplo, tratar, prevenir y/o mejorar la fibrosis, aterosclerosis, degeneración macular o cáncer, etc.) mediante la administración de un aptámero de PDGF, un aptámero de VEGF y/o una construcción de aptámero de PDGF/VEGF de modo que el aptámero o construcción de aptámero esté expuesto a PDGF y/o VEGF y pueda unirse a estos. En algunas realizaciones, dicha unión se produce independientemente del procedimiento de administración del aptámero al sujeto que se está tratando. En algunas realizaciones, el efecto terapéutico puede lograrse administrando el aptámero de PDGF, aptámero de VEGF o construcción de aptámero de PDGF/VEGF de modo que se exponga y se una a PDGF y/o VEGF y evite o reduzca la unión de PDGF y/o VEGF a uno o más receptores celulares.

[0098] En algunas realizaciones, la unión de un aptámero de PDGF a PDGF-BB o PDGF-AB interfiere con la unión de PDGF-BB o PDGF-AB al receptor PDGF-a. En algunas realizaciones, la unión de un aptámero de PDGF a PDGF-BB o PDGF-AB interfiere con la unión de PDGF-BB o PDGF-AB al receptor PDGF-p. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF a PDGF-BB o PDGF-AB reduce la fosforilación de un receptor de PDGF (tal como el receptor PDGF-a y/o el receptor PDGF-p).

[0099] En algunas realizaciones, la unión de un aptámero de VEGF a VEGF-121, VEGF-110, VEGF-165, VEGF-189 u otro fragmento proteolítico funcionalmente activo o empalmado alternativamente de VEGF interfiere con la unión del factor de crecimiento a VEGFR-1 (Flt-1). En algunas realizaciones, la unión de un aptámero de VEGF a VEGF-121, VEGF-110, VEGF-165, VEGF-189 u otro fragmento proteolítico funcionalmente activo o empalmado alternativamente de VEGF interfiere con la unión del factor de crecimiento a VEGFR-2 (KDR). En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF reduce la fosforilación de un receptor de VEGF (tal como el receptor VEGF-1 y/o el receptor VEGF-1).

[0100] En algunas realizaciones, una construcción de aptámero PDGF/VEGF reduce el nivel de fosforilación de un receptor de PDGF (tal como el receptor PDGF-a y/o el receptor PDGF-p) y reduce el nivel de fosforilación de un receptor de VEGF (tal como VEGFR-1 y/o VEGFR-2). En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF, un aptámero de VEGF o una construcción de aptámero de PDGF/VEGF reduce la señalización a lo largo de la vía de transducción de señal de un receptor de PDGF y/o un receptor de VEGF.

[0101] En algunas realizaciones, se administra un aptámero de PDGF, un aptámero de VEGF o una construcción de aptámero de PDGF/VEGF con uno o más agentes activos adicionales. Dicha administración puede ser secuencial o en combinación.

[0102] En algunas realizaciones, un procedimiento de diagnóstico in vitro comprende poner en contacto un aptámero de PDGF con una muestra sospechosa de comprender PDGF. En algunas realizaciones, un procedimiento de diagnóstico in vivo comprende administrar un aptámero de PDGF marcado adecuadamente a un individuo sospechoso de tener una enfermedad o trastorno mediado por PDGF, donde el aptámero de PDGF marcado se detecta con el fin de diagnosticar o evaluar el estado de salud del individuo. El marcado utilizado puede seleccionarse conforme a la modalidad de formación de imágenes que se utilizará.

[0103] En algunas realizaciones, un procedimiento de diagnóstico in vitro comprende poner en contacto un aptámero de VEGF con una muestra sospechosa de comprender VEGF. En algunas realizaciones, un procedimiento de diagnóstico in vivo comprende administrar un aptámero de VEGF marcado adecuadamente a un individuo sospechoso de tener enfermedad o trastorno mediado por VEGF, donde el aptámero de VEGF marcado se detecta con el fin de diagnosticar o evaluar el estado de salud del individuo. El marcado utilizado puede seleccionarse conforme a la modalidad de formación de imágenes que se utilizará.

[0104] En algunas realizaciones, un procedimiento de diagnóstico in vitro comprende poner en contacto una construcción de aptámero de PDGF/VEGF con una muestra sospechosa de comprender PDGF y/o VEGF. En otro aspecto, la presente descripción proporciona un procedimiento de diagnóstico in vivo que comprende obtener una construcción de aptámero de PDGF/VEGF marcada adecuadamente, inyectar la construcción de aptámero de PDGF/VEGF marcada en un individuo sospechoso de tener una enfermedad o trastorno mediado por PDG^f/VEGF, y detectar la construcción de aptámero de PDGF/VEGF marcada con el fin de diagnosticar o evaluar el estado de salud del individuo. El marcado utilizado puede seleccionarse conforme a la modalidad de formación de imágenes que se utilizará.

[0105] En algunas realizaciones, la presente invención proporciona construcciones de aptámeros que comprenden un aptámero de PDGF y un aptámero de VEGF.

[0106] En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona un aptámero que se une eficientemente a una proteína predominantemente a través de interacciones hidrófobas.

[0107] En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona un complejo de aptámero-proteína, donde el aptámero se une a la proteína sustancialmente a través de interacciones hidrófobas.

[0108] En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona un aptámero capaz de formar un complejo cocristal con una diana de proteína, donde el complejo comprende menos de 7 enlaces de hidrógeno.

[0109] En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona un aptámero capaz de formar un complejo cocristal con una diana de proteína, donde el complejo comprende un dominio pseudonudo que implica 16 nucleótidos o menos.

[0110] En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona un aptámero capaz de unirse a una diana de proteína, donde el aptámero se une a la diana de proteína con menos o igual a 1 contacto polar por 100 A2 de área de interfaz, donde el contacto polar comprende uno o más enlaces de hidrógeno y una o más interacciones de cargacarga, y donde el área de interfaz es una fracción del área de superficie de proteína ocupada por el aptámero.

[0111] En otro aspecto, la presente descripción proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleica: 5'-C-C-C-G-Z-Z-C1-A-A-G1-Z-G-C1-Z-Z-G1-Z-A1-G1-G-A-Z-Z1-Z-A2-A2-A2-Z-G1-G1-3' (SEQ ID NO:836), donde C1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una citidina, una desoxicitidina y una 2'-O-metilcitidina; G1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una guanosina, una desoxicuanosina y una 2'-O-metilguanosina; Z se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una uridina, una desoxiuridina y una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU); Z1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una uridina, una desoxiuridina, una 2'-O-metiluridina, una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) y una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un grupo 2'-O-metilo; A1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una adenosina, una desoxiadenosina y una 2'-O-metiladenosina; A2 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una adenosina, una adenosina que comprende un enlace fosforotioato, una desoxiadenosina y una desoxiadenosina que comprende un enlace fosforotioato; y donde la molécula de ácido nucleico comprende al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco enlaces fosforotioato.

[0112] En un aspecto relacionado, C1 es una 2'-O-metilcitidina. En un aspecto relacionado, G1 es una 2'-O-metilguanosina. En un aspecto relacionado, Z es una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU). En un aspecto relacionado, Z1 es una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un grupo 2'-O-metilo. En un aspecto relacionado, A1 es una 2'-O-metiladenosina. En un aspecto relacionado, A2 es una desoxiadenosina que comprende un enlace fosforotioato.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra (A) la determinación de los valores de Kd para tres aptámeros modificados con constantes de disociación lentas y aptámero E10030; (B) la inhibición de la fosforilación estimulada por PDGF-BB de PDGFRp por tres aptámeros de PDGF descritos en esta invención y un oligonucleótido de control mezclado.; (C) las relaciones de Kd para aptámeros modificados frente al aptámero original, 4149-8_130, en el que una nucleobase de Bn-dU particular ha sido reemplazada por otra nucleobase de dU modificada, en relación con el aptámero original (un valor de 1 indica que el aptámero modificado inhibe la fosforilación de PDGFRp por igual que el progenitor, mientras que un valor >1 indica que el aptámero modificado tiene una actividad inhibidora menos potente en comparación con el progenitor).

La figura 2 muestra (A) una tabla de contactos intramoleculares del aptámero 4149-8_260 y contactos del aptámero-PDGF; (B) una representación de contactos intramoleculares no polares y aptámero-PDGF; y (C) una representación de contactos polares intramoleculares y aptámero-PDGF; como se describe en el ejemplo 2. Las interacciones hidrófobas (no polares) incluyen interacciones n-n (interacciones aromáticas cara a cara y borde a cara) y contacto de van der Waals (vW). Las interacciones polares incluyen enlaces de hidrógeno (líneas discontinuas) e interacciones de carga-carga (líneas continuas. Determinados residuos de aptámeros (por ejemplo, dC4, dG6, dA9, dC10, dC12, dG13, dC14, dG15, dG22, dC23 y 2'-O-metil G24) participan en el apareamiento de bases canónicas y apilamiento de bases, como se muestra en B y C, y 2'-O-metil A11 se extruye.

La figura 3 muestra (A) la secuencia de consenso para un conjunto de clones del grupo SELEX según lo determinado por pirosecuenciación 454 y la frecuencia de nucleótidos en cada posición, y las secuencias para seis de los clones; y (B) los valores de Kd para aptámeros modificados en función del aptámero original 4149-8, que se modificaron tal como se muestra, tal como se describe en el ejemplo 1.

La figura 4 ilustra determinadas vistas estereoscópicas de un complejo PDGF-BB:4149-8_260, como se describe en el ejemplo 2.

La figura 5 muestra (A) la afinidad de unión de diversos aptámeros para diferentes isoformas diméricas de PDGF, en presencia y ausencia de ARNt 200 nM; y (B) una alineación de las secuencias de aminoácidos para las formas maduras de PDGF-A, -B, -C y -D; como se describe en el ejemplo 3. Los residuos de aminoácidos para PDGF-A que se muestran en negrita participan en la unión de propéptidos, y los residuos de aminoácidos para PDGF-B que se muestran en negrita participan en la unión de PDGFRp (Shim y col., (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

107(25):11307). El sombreado del recuadro indica residuos involucrados en la unión del aptámero 4149-8_260 a la cadena 1 de PDGF-B (sombreado oscuro) y la cadena 2 de PDGF-B (sombreado claro).

La figura 6 muestra (A) la relación de Kd para aptámeros modificados realizados sustituyendo cada posición indicada en el aptámero 4149-8_38 (SED ID NO:38) con un enlazador C-3 de tres carbonos, y los valores de Kd para la unión de PDGF-BB, la unión de PDGF-AB, así como la CI celular ⁵⁰para cinco aptámeros modificados basados en el aptámero original 4149-8; y (B) las relaciones de Kd para aptámeros modificados basados en el aptámero original 4149-8_130 (SEQ ID NO:130), en el que una nucleobase de Bn-dU particular ha sido reemplazada por otra nucleobase de dU modificada, en relación con el aptámero original (los números <1 indican que el aptámero modificado tiene mayor afinidad que el aptámero original, y los números >1 indican que el aptámero modificado tiene menor afinidad que el aptámero original); como se describe en el ejemplo 1.

La figura 7 muestra (A) un diagrama de cinta del homodímero PDGF-BB unido al aptámero 4149-8_260 (SEQ ID NO:211); y (B) una representación esquemática y representación estructural de la conformación del aptámero cuando se une a una subunidad PDGF-B; como se describe en el ejemplo 2. Los pares de bases no canónicas se codifican en función de la nomenclatura de Leontis y Westhof (Leontis N.B. y col. (2003) Curr. Opin. Struct. Biol.

13(3):300). Gris oscuro = cadena 1 de PDGF-B; gris claro = cadena 2 de PdGf-B; Bn = Bn-dU, Pe = Pe-dU, Th = Th-dU.

Las figuras 8A-L ilustran determinadas características estructurales del aptámero de PDGF a partir de la estructura cristalina del complejo de aptámero PDGF-BB:4149-8_260, como se describe en el ejemplo 2. La figura 8A ilustra la estructura del aptámero, que muestra dominios, apareamiento de bases e interacciones de apilamiento. Los tallos del mininudo se desvían significativamente del ADN de forma B debido a los ángulos sustanciales de pandeo y hélice, así como al infraenrollamiento helicoidal. Bn20 es la bisagra que interactúa con el tallo 5' a través del apilamiento con U8. La figura 8B ilustra la vista de extremo del tallo 1 (S1). La figura 8C ilustra las vistas laterales S1 y L2. Los nucleótidos modificados forman un cúmulo hidrófobo con Bn2, Bn7 y Bn8 del tallo 5' que interactúa con Bn16, Pe17, Th18 y Bn20 del mininudo. Bn8 realiza interacciones de borde a cara n-n con Bn16 y Bn20. El par de bases dU-dU no canónicas utiliza la unión H al enlazador amida de Bn20. La figura 8D ilustra los detalles del par de bases no canónicas entre Pe-dU17 y Bn-dU20. La figura 8E ilustra interacciones aromáticas que estabilizan la base del mininudo S1. La figura 8F ilustra una triple base que se forma entre el par Watson-Crick C10-G15 en el nucleótido S1 y L2, A21. La clasificación Leontis-Westhof de esta triple base es cis Watson-Crick/Watson-Crick, trans Sugar edge/Hoogsteen (Leontis N.B. y col. (2003) Curr. Opin. Struct. Biol. 13:300). La triple base no es plana, ya que hay un ángulo de torsión de la hélice de 34° entre A21 y G15, así como un considerable pandeo y torsión de la hélice entre el par de bases Watson-Crick (tabla 5). La figura 8G ilustra el residuo mA11, la base extruida única en L1 y el giro de la estructura principal. La figura 8H ilustra una vista axial de S2. La figura 8I ilustra una vista axial del motivo del tallo 5' que resalta la desviación significativa del ADN de forma B. Los parámetros helicoidales C1'-C1' globales indican que el par dU-dU está torcido en exceso (40°), lo que resulta en una curvatura de ~ 124° en la estructura principal que se aplana hasta casi lineal (~ 172°) entre BndU1 y Bn-dU2. El desplazamiento radial significativo entre Bn-dU7-Bn-dU8 y el desplazamiento casi nulo entre BndU2-dA3 resulta en una mayor superposición de apilamiento entre las bases 2-4 y 6-7. La figura 8J que ilustra el par de bases no canónicas entre Bn-dU2 y Bn-dU8. La figura 8K ilustra la unión entre dominios formada por nucleótidos modificados. La figura 8L ilustra Bn8 que realiza interacciones de borde a cara n-n con Bn16 y Bn20 que definen la topología de la unión entre dominios. El impacto perjudicial de sustituir Bn-dU en la posición 8 del aptámero 4149-8_260 (SEQ ID NO:211) con un iB-dU (sEq ID NO:255) es evidente en las imágenes de llenado de espacio mostradas en la figura 8M y la figura 8N. Bn8 (8M) es capaz de realizar interacciones n-n energéticamente favorables con grupos aromáticos vecinos y permite que el SOMAmer se empaque más firmemente. Por el contrario, iB8 (8N) no es aromático y, por lo tanto, carece de la capacidad de interaccionar con apilamiento n con grupos aromáticos vecinos. Además, el grupo iB no es tan grande y deja un agujero en el centro del cúmulo hidrófobo.

La figura 9 ilustra determinadas interacciones de proteína-aptámero, tal como se describe en el ejemplo 2. En la figura 9A, Bn-dU1 ocupa un bolsillo debajo de un puente de sal en la interfaz del homodímero. La base U1 forma enlaces de hidrógeno con la estructura principal de proteínas en Val39 mientras que el anillo bencilo se intercala entre la cadena lateral alifática de Arg 56 y el enlace disulfuro de Cys43-Cys52. En la figura 9B, Bn2 tiene una interacción de bordes con Trp40 y está enclavado entre las cadenas laterales de metileno de Asn55 y Leu38. La figura 9C ilustra que el anillo aromático de Bn7 se esconde contra las partes alifáticas de las cadenas laterales de Asn54 y Asn55. La figura 9D ilustra que las cadenas laterales de Leu38 e Ile75 presentan una superficie hidrófoba para que el anillo bencílico de Bn-dU8 entre en contacto con la proteína. La figura 9E ilustra que Bn16 tiene apilamiento n de borde a cara con Trp40 y contacto de van der Waals con la región alifática de Arg73. La figura 9F ilustra que Pe17 está rodeado por las cadenas laterales hidrófobas de Leu38, Trp40, Arg73 e Ile75. Arg73 forma un enlace de hidrógeno con el enlazador amida de Pe-dU17 y una interacción de carga-carga con la estructura principal del aptámero. La figura 9G ilustra Th18 rodeado por las cadenas laterales hidrófobas de Arg73, Ile75 y Phe84. La figura 9H ilustra que las interacciones de apilamiento entre la proteína y el aptámero están presentes entre Pro82 y Bn20 y U8, y Phe84 hace contacto de borde a cara con U20. Bn20 hace contacto hidrófobo adicional con Ile77 y Lys80.

La figura 10 muestra las seis estructuras cocristales de aptámeros tradicionales (ID de PDB: vWF, 3HXO; trombina, 3QLP; ARNt de GlnRs, 1EXD; IgG humana, 3AGV; proteína de recubrimiento MS26MSF; NF-kB, 10OA) que se analizaron para determinar el número de contactos polares (enlaces de hidrógeno más interacciones de carga-carga) y el área de superficie de contacto. Los resultados se grafican frente a las afinidades de unión informadas para estos seis complejos aptámero-diana (barras grises oscuras) y para tres SOMAmers (barras grises claras) que incluyen el complejo PDGF-SL5 (4149-8_260) y dos estructuras SOMAmer-diana no publicadas. La relación entre el número de contactos polares y el área de superficie de contacto para los seis aptámeros tradicionales se analizó mediante regresión lineal, y el intervalo de confianza del 99 % se indica mediante el sombreado gris en la parte inferior de la figura. La figura 10B ilustra la complementariedad de forma del complejo PDGF-SOMAmer tal como se muestra por Pe-dU17 y Th-dU18. A la izquierda, la cadena PDGF 1 se muestra como una superficie gris oscura, Pe-dU17 y Th-dU18 se muestran como representaciones de relleno de espacio. A la derecha, la misma vista que el panel izquierdo, excepto que Pe-dU17 se muestra como una representación en bastón. La figura 10C ilustra el detalle de la interacción de Bn-dU1 con PDGF, con la cadena PDGF 1 mostrada como una superficie gris oscura, la cadena PDGF 2 mostrada como una superficie gris clara, la cadena PDGF 2 mostrada como una superficie gris clara, y Bn-dU1 mostrada como una representación de relleno de espacio. La figura 11 muestra una comparación de la unión de SL5 y PDGFRp a PDGF-BB. (A) Copristal del receptor que muestra el homodímero de PDGF (cadena 1, gris medio; cadena 2, gris claro) y el dominio extracelular del receptor de color gris oscuro (de Shim, A.H., y col. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. uSA. 107(25):11307). (B) Complejo de homodímero de PDGF (cadena 1, gris medio; cadena 2, gris claro) y SL5 (gris oscuro). (C) Secuencia de aminoácidos de la forma madura de PDGF-B. El sombreado del recuadro indica residuos de contacto con 4149-8_260, PDGFRp o ambos. Los residuos de PDGF que hacen un contacto de 4 A con 4149-8_260, pero no entran en contacto con PDGFRp están encuadrados sin sombreado. Los residuos de PDGF que hacen contacto de 4 A con PDGFRp, pero no entran en contacto con 4149-8_260 están encuadrados con sombreado gris oscuro. Los residuos de PDGF que hacen contacto de 4 A con 4149-8_260 y PDGFRp están encuadrados con sombreado gris medio.

La figura 12 ilustra determinadas modificaciones de pirimidina C-5 ejemplares que pueden incorporarse en aptámeros, tales como aptámeros de constante de disociación lenta.

La figura 13 muestra una gráfica representativa de la inhibición de la fosforilación de PDGF Pp inducida por PDGF-BB en fibroblastos Hs27 con SOMAmers 4149-8_379 (marcado como OH-4149-8_379) o SOMAmer 4149-8_379 modificado con enlazador 5' amino (marcado como N-4149-8_379), como se describe en el ejemplo 4.

La figura 14 muestra la secuencia de consenso para un conjunto de clones de unión a PDGf del grupo SELEX según lo determinado por pirosecuenciación 454 y la frecuencia de nucleótidos en cada posición, como se describe en el ejemplo 5.

La figura 15 muestra las relaciones de Kd para aptámeros modificados basados en el aptámero original 4867-31_143, en el que una nucleobase de Nap-dU particular ha sido reemplazada por otra nucleobase de dU modificada, en relación con el aptámero original (los números <1 indican que el aptámero modificado tiene mayor afinidad que el aptámero original, y los números >1 indican que el aptámero modificado tiene menor afinidad que el aptámero original); como se describe en el ejemplo 7.

La figura 16 muestra la secuencia de consenso para un conjunto de clones de unión a VEGF del grupo SELEX según lo determinado por pirosecuenciación 454 y la frecuencia de nucleótidos en cada posición, como se describe en el ejemplo 7.

La figura 17 muestra el porcentaje de fosforilación de VEGFR2 en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) estimuladas con VEGF-121 o VEGF-165 y los aptámeros de VEGF 4867-31_43 y 4867-31_192, como se describe en el ejemplo 9.

La figura 18 muestra (A) la inhibición de la fosforilación de PDGF Rp inducida por PDGF en fibroblastos Hs27 con el aptámero de PDGF 4149-8_379 (círculos abiertos) y la construcción de aptámero de PDGF/VEGF 4149-8_401 (círculos cerrados); y (B) la inhibición de la fosforilación de VEGF R2 inducida por VEGF en HUVEC con el aptámero de VEGF 4867-31_192 (círculos abiertos) y la construcción de aptámero de PDGF/VEGF 4149-8_401 (círculos cerrados); como se describe en el ejemplo 11.

La figura 19 muestra la unión simultánea de PDGF y VEGF mediante la construcción de aptámero de PDGF/VEGF SL1012 (20 kDa PEG-N-4149-8_401) en (A) placas de microtitulación recubiertas con el VEGF con adición de PDGF biotinilado, y (B) placas de microtitulación recubiertas con PDGF con adición de VEGF biotinilado, como se describe en el ejemplo 12.

La figura 20 muestra la unión simultánea de PDGF y VEGF por construcciones de aptámeros de PDGF/VEGF (A) SL1012 ( PEG-N-4149-8_401 de 20 kDa) y (B) SL1013 (PEG-N-4149-8-401 de 40 kDa), en placas de microtitulación que se recubrieron con PDGF con la adición de VEGF biotinilado, como se describe en el ejemplo 12.

La figura 21 muestra la unión simultánea de PDGF y VEGF por diversas construcciones de aptámeros de PDGF/VEGF en (A) placas de microtitulación recubiertas con VEGF con la adición de PDGF biotinilado, y (B) placas de microtitulación recubiertas con PDGF con la adición de VEGF biotinilado, como se describe en el ejemplo 12.

La figura 22 muestra (A) una gráfica de un número de contactos polares (definidos como la suma de enlaces de hidrógeno e interacciones de carga-carga) frente al área de interfaz para aptámeros tradicionales (diamantes) y SOMAmers (círculos) (el ajuste de regresión lineal tiene un R2 = 0,91 con una pendiente de 0,016; las líneas discontinuas representan los intervalos de confianza del 99 % de esta tendencia, no encontrándose los SOMAmers dentro de esos límites), (B) una gráfica de unión deenergía libre frente a contactos polares para aptámeros tradicionales (diamantes) y SOMAmers (círculos) (el ajuste de regresión lineal tiene un R2 = 0,64 con una pendiente de 0,073) y (C) una tabla que muestra diversas propiedades termodinámicas y características de contacto de seis estructuras cristalinas de aptámero-proteína anteriores y tres estructuras cristalinas de SOMAmer-proteína, que incluyen PDGF-BB:4149-8_260, como se describe en el ejemplo 2. (C) Características de interacción para aptámeros y SOMAmers unidos a dianas proteicas (bibliografía de figuras: (a) Convery y col. (1998) Nat. Struct. Biol. 5(2): 133; (b) Nomura y col. (2010) Nucleic Acids Res. 38(21): 7822; (c) Pagano y col. (2008) Biophys. J.

94(2):562; (d) Huang y col (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(16)9268; (e) Huang y col. (2009) Structure 17(11):1476; (f) Bullock y col. (2000) Nat. Struct. Biol. 7(6):497. Los cálculos de energía libre se determinaron a partir de las afinidades de unión medidas para SOMAmers, o los valores de Kd publicados usando las siguientes temperaturas: MS2, trombina, NFkB, vWF y GlnR, temperatura ambiente (296 k ); IgG, 298 K; SOMAmers, 310 K. Los SOMAmers muestran una tendencia hacia afinidades de unión más altas; la energía libre media de unión, o valor -AG, es de 11,4 ± 1,3 kcal/mol para los seis aptámeros y 14,3 kcal/mol ± 0,8 kcal/mol para los tres SOMAmers. Los átomos de contacto de proteínas dentro de 4 A de cada ligando se determinaron en PyMOL. Los cálculos del área de interfaz se realizaron con PISA (aptámeros) (Krissinel y col. (2007) J. Mol. Biol. 372(3):774) o PyMOL (SOMAmers) (DeLano (2002) The Pymol Molecular Graphics System, Delano Scientific, San Carlos, CA). Dentro de este conjunto de datos relativamente pequeño de interacciones evaluadas cristalográficamente, los aptámeros se acoplan a sus dianas con una eficiencia media del ligando de 0,21 ± 0,14 kcal/mol por átomo de contacto que no sea hidrógeno, en comparación con 0,16 ± 0,04 kcal/mol por átomo de contacto que no sea hidrógeno para los SOMAmers. Las energías libres de unión por área de interfaz también son similares, con un valor medio de 0,017 ± 0,009 kcalmol'1^ ' 2 para los aptámeros y 0,012 ± 0,001 tealmoMA’2 para los SOMAmers. El valor de la energía libre de unión por contacto polar, calculado a partir de los valores en la tabla, es aproximadamente el doble de grande para los SOMAmers (promedio de 1,75 ± 0,36 kcal/mol por contacto polar) que para los aptámeros (0,89 ± 0,56 kcal/mol por contacto polar).

La figura 23 muestra gráficas del porcentaje del aptámero restante de longitud completa 4867-31_192 (concentración inicial de 250 nM) frente al tiempo cuando se digiere a 37 °C durante el número indicado de horas con 0,002 unidades/pl de DNasa I (A) o 0,24 unidades/pl de DNasa II (B) como se describe en el ejemplo 14. Los productos de digestión se separaron del aptámero de longitud completa mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y las bandas se visualizaron con SYBR Gold. El porcentaje de banda de aptámero de longitud completa se determinó mediante densitometría.

La figura 24 muestra gráficos del porcentaje de aptámero restante de longitud completa (concentración inicial de 250 nM) frente al tiempo cuando se incuba a 37 °C durante el número indicado de horas con 0,24 unidades/pl de DNasa II como se describe en el ejemplo 14. Los productos de digestión se separaron del aptámero de longitud completa mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y las bandas se visualizaron con SYBR Gold. El porcentaje de aptámero de longitud completa restante, como lo indica el número de identificación del aptámero. (n.° de ID de aptámero), se determinó mediante densitometría. La gráfica para el n.° de ID deaptámero 4867-31_192 es la misma gráfica que se muestra en la figura 23B.

La figura 25 muestra gráficas del porcentaje de aptámero restante de longitud completa (concentración inicial de 500 nM) frente al tiempo cuando se incuba a 37 °C durante el número indicado de horas en humor vítreo al 90 % obtenido de conejos blancos de Nueva Zelanda como se describe en el ejemplo 14. (Los aptámeros se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y se tiñeron con SYBR Gold. El porcentaje de aptámero de longitud completa restante, como lo indica el número de identificación del aptámero. (n.° de ID de aptámero), se determinó mediante densitometría.

La figura 26 muestra gráficas del porcentaje del aptámero restante de longitud completa 5169-4_146 (concentración inicial de 250 nM) frente al tiempo cuando se digiere a 37 °C durante el número indicado de horas con 0,01 unidades/pl de DNasa I (A) o 0,12 unidades/pl de DNasa II (B) como se describe en el ejemplo 14. Los productos de digestión se separaron del aptámero de longitud completa mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y las bandas se visualizaron con SYBR Gold. El porcentaje de aptámero de longitud completa se determinó mediante densitometría.

La figura 27 muestra una gráfica del porcentaje del aptámero restante de longitud completa 5169-4_182 (concentración inicial de 250 nM) frente al tiempo cuando se incuba a 37 °C durante el número indicado de horas con 0,01 unidades/pl de DNasa I como se describe en el ejemplo 14. Los productos de digestión se separaron del aptámero de longitud completa mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y las bandas se visualizaron con SYBR Gold. El porcentaje de aptámero de longitud completa se determinó mediante densitometría. La figura 28 muestra gráficas del porcentaje de aptámero restante de longitud completa (concentración inicial de 500 nM) frente al tiempo cuando se incuba a 37 °C durante el número indicado de horas en humor vitreo al 90 % obtenido de conejos blancos de Nueva Zelanda como se describe en el ejemplo 14. Los productos de digestión se separaron del aptámero de longitud completa mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y las bandas se visualizaron con SYBR Gold. El porcentaje de aptámero de longitud completa, como lo indica el número de identificación del aptámero (n.° deID de aptámero), se determinó mediante densitometría.

La figura 29 muestra gráficas del porcentaje de aptámero restante de longitud completa (concentración inicial de 250 nM) frente al tiempo cuando se incuba a 37 °C durante el número indicado de horas con 0,01 unidades/pl de DNasa I como se describe en el ejemplo 14. Los productos de digestión se separaron del aptámero de longitud completa mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y las bandas se visualizaron con SYBR Gold. El porcentaje de aptámero de longitud completa restante, como lo indica el número de identificación del aptámero. (n.° de ID de aptámero), se determinó mediante densitometría.

La figura 30 muestra una gráfica del porcentaje del aptámero restante de longitud completa 4149-8_379 (concentración inicial de 250 nM) frente al tiempo cuando se incuba a 37 °C durante el número indicado de horas con 0,12 unidades/pl de DNasa II como se describe en el ejemplo 14. Los productos de digestión se separaron del aptámero de longitud completa mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y las bandas se visualizaron con SYBR Gold. El porcentaje de aptámero de longitud completa se determinó mediante densitometría.

La figura 31 muestra gráficas del porcentaje de aptámero restante de longitud completa (concentración inicial de 250 nM) frente al tiempo cuando se incuba a 37 °C durante el número indicado de horas con 0,12 unidades/pl de DNasa II como se describe en el ejemplo 14. Los productos de digestión se separaron del aptámero de longitud completa mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y las bandas se visualizaron con SYBR Gold. El porcentaje de aptámero de longitud completa, como lo indica el número de identificación del aptámero (n.° de ID de aptámero), se determinó mediante densitometría. La gráfica para el n.° de ID de aptámero 4149-8_379 es la misma gráfica que se muestra en la figura 30.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0114] La invención se define según las reivindicaciones.

[0115] A continuación, se hará referencia en detalle a realizaciones representativas de la invención. Si bien la invención se describirá junto con las realizaciones enumeradas, se entenderá que la invención no pretende limitarse a esas realizaciones. Por el contrario, la invención pretende cubrir todas las alternativas, modificaciones y equivalentes que pueden incluirse dentro del alcance de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones.

[0116] Un experto en la materia reconocerá muchos procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta invención, que podrían usarse y están dentro del alcance de la práctica de la presente invención. La presente invención no se limita en modo alguno a los procedimientos y materiales descritos.

[0117] A menos que se definan de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en esta invención tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la(s) materia(s) a la(s) que pertenece esta invención. Aunque cualquier procedimiento, dispositivos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta invención se pueden utilizar en la práctica o ensayo de la invención, a continuación, se describen los procedimientos, dispositivos y materiales preferidos.

[0118] Todas las publicaciones, documentos de patente publicados y solicitudes de patente citadas en esta descripción son indicativas del nivel de habilidad en la(s) materia(s) a la(s) que pertenece la descripción.

[0119] Tal como se usa en esta descripción, incluidas las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referencias plurales, a menos que el contenido indique claramente lo contrario, y se usan indistintamente con "al menos uno" y "uno o más." Por lo tanto, la referencia a "un aptámero" incluye mezclas de aptámeros y similares.

[0120] Tal como se usa en esta invención, el término "aproximadamente" representa una modificación o variación insignificante del valor numérico de modo que la función básica del elemento al que se refiere el valor numérico no cambia.

[0121] Tal como se usan en esta invención, los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "contiene", "que contiene" y cualquier variación de los mismos, pretenden cubrir una inclusión no exclusiva, de modo que un procedimiento, procedimiento, procedimiento derivado del producto o composición de materia que comprende, incluye o contiene un elemento o lista de elementos no incluye solo esos elementos, sino que puede incluir otros elementos no enumerados expresamente o inherentes a dicho procedimiento, procedimiento, procedimiento derivado del producto o composición de materia.

[0122] Tal como se usa en esta invención, el término "nucleótido" se refiere a un ribonucleótido o un desoxirribonucleótido, o una forma modificada delmismo, así como un análogo del mismo. Los nucleótidos incluyen especies que incluyen purinas (por ejemplo, adenina, hipoxantina, guanina y sus derivados y análogos) así como pirimidinas (por ejemplo, citosina, uracilo, timina y sus derivados y análogos).

[0123] Tal como se usan en esta invención, "ácido nucleico", "oligonucleótido" y "polinucleótido" se usan indistintamente para referirse a un polímero de nucleótidos e incluyen híbridos de a Dn , ARN, ADN/ARN y modificaciones de este tipo de ácidos nucleicos, oligonucleótidos y polinucleótidos, donde se incluye la unión de diversas entidades o restos a las unidades de nucleótidos en cualquier posición. Los términos "polinucleótido", "oligonucleótido" y "ácido nucleico" incluyen moléculas de cadena doble o simple, así como moléculas de triple hélice. El ácido nucleico, el oligonucleótido y el polinucleótido son términos más amplios que el término aptámero y, por lo tanto, los términos ácido nucleico, oligonucleótido y polinucleótido incluyen polímeros de nucleótidos que son aptámeros, pero los términos ácido nucleico, oligonucleótido y polinucleótido no se limitan a aptámeros.

[0124] Tal como se usan en esta invención, los términos "modificar", "modificado", "modificación" y cualquier variación de los mismos, cuando se usan con referencia a un oligonucleótido, significan que al menos una de las cuatro bases de nucleótidos constituyentes (es decir, A, G, T/U y C) del oligonucleótido es un análogo o éster de un nucleótido de origen natural. En algunas realizaciones, el nucleótido modificado confiere resistencia a nucleasas al oligonucleótido. En algunas realizaciones, los nucleótidos modificados conducen a interacciones predominantemente hidrófobas de aptámeros con dianas proteicas que dan como resultado una alta eficiencia de unión y complejos cocristales estables. Una pirimidina con una sustitución en la posición C-5 es un ejemplo de un nucleótido modificado. Las modificaciones pueden incluir modificaciones de la estructura principal, metilaciones, combinaciones de apareamiento de bases inusuales tales como las isobases isocitidina e isoguanidina y similares. Las modificaciones también pueden incluir modificaciones de 3' y 5', tales como bloqueo. Otras modificaciones pueden incluir la sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural por un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y aquellas con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellas con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellas que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquilantes, y aquellas con enlaces modificados (porejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). Además, cualquiera de los grupos hidroxilo normalmente presentes en el azúcar de un nucleótido puede reemplazarse por un grupo fosfonato o un grupo fosfato; protegerse por grupos de protección estándar; o activarse para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales o a un soporte sólido. Los grupos OH terminales 5' y 3' pueden fosforilarse o sustituirse con aminas, restos de grupos de bloqueo orgánicos de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono, polímeros de polietilenglicol (PEG) en algunas realizaciones que varían de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 kDa, polímeros PEG en algunas realizaciones que varían de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 kDa u otros polímeros biológicos o sintéticos hidrófilos o hidrófobos. En algunas realizaciones, las modificaciones están en la posición C-5 de las pirimidinas. Estas modificaciones se pueden producir a través de un enlace amida directamente en la posición C-5 o mediante otros tipos de enlaces.

[0125] Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que se conocen generalmente en la técnica, que incluyen 2'-O-metil-, 2'-O-alilo, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclico, azúcares a-anóméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos tales como ribósido de metilo. Tal como se señaló anteriormente, uno o más enlaces fosfodiéster pueden reemplazarse por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen realizaciones donde el fosfato se reemplaza por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR²("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH²("formacetal"), donde cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C) que contiene opcionalmente un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o aralquilo. No es necesario que todos los enlaces en un polinucleótido sean idénticos. La sustitución de formas análogas de azúcares, purinas y pirimidinas puede ser ventajosa en el diseño de un producto final, al igual que las estructuras de estructura principal alternativas como una estructura principal de poliamida, por ejemplo.

[0126] Tal como se usa en esta invención, el término "nucleasa" se refiere a una enzima capaz de escindir el enlace fosfodiéster entre subunidades de nucleótidos de un oligonucleótido. Tal como se usa en esta invención, el término "endonucleasa" se refiere a una enzima que escinde el(los) enlace(s) fosfodiéster en un sitio interno al oligonucleótido. Tal como se usa en esta invención, el término "exonucleasa" se refiere a una enzima que escinde el(los) enlace(s) fosfodiéster que unen los nucleótidos finales de un oligonucleótido. Los fluidos biológicos típicamente contienen una mezcla de endonucleasas y exonucleasas.

[0127] Tal como se usan en esta invención, los términos "resistente a nucleasas" y "resistencia a nucleasas" se refieren a la capacidad reducida de un oligonucleótido para servir como sustrato para una endo- o exonucleasa, de modo que, cuando se pone en contacto con dicha enzima, el oligonucleótido no se degrada o se degrada más lentamente que un oligonucleótido compuesto de nucleótidos no modificados.

[0128] Tal como se usa en esta invención, el término "pirimidina modificada en C-5" se refiere a una pirimidina con una modificación en la posición C-5 que incluye, pero no se limita a, aquellos restos ilustrados en la figura 12. Los ejemplos de una pirimidina modificada en C-5 incluyen las descritas en las patentes de los EE. UU. n.° 5.719.273 y 5.945.527. Los ejemplos de una modificación de C-5 incluyen la sustitución de desoxiuridina en la posición C-5 con un sustituyente seleccionado independientemente de: bencilcarboxiamida (alternativamente bencilaminocarbonilo) (Bn), naftilmetilcarboxiamida (alternativamente naftilmetilaminocarbonilo) (Nap), triptaminocarboxiamida (alternativamente triptaminocarbonilo) (Trp), fenetilcarboxiamida (alternativamente fenetilamino carbonilo) (Pe), tiofenilmetilcarboxiamida (alternativamente tiofenilmetilaminocarbonilo) (Th) e isobutilcarboxiamida (alternativamente isobutilaminocarbonilo) (iBu) como se ilustra inmediatamente a continuación.

tiofemlmetilcarboxamida fenetilcarboxamida

[0129] Las modificaciones químicas de una pirimidina modificada en C-5 también se pueden combinar, de forma individual o en cualquier combinación, con modificaciones de azúcar en la posición 2', modificaciones en aminas exocíclicas y sustitución de 4-tiouridina y similares.

[0130] Las pirimidinas modificadas en C-5 representativas incluyen: 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU), 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (iBudU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-fenetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PedU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThdU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina o 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2'-desoxiuridina).

[0131] Los nucleótidos se pueden modificar antes o después de la síntesis de un oligonucleótido. Una secuencia de nucleótidos en un oligonucleótido puede interrumpirse por uno o más componentes no nucleotídicos. Un oligonucleótido modificado puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, tal como, por ejemplo, mediante conjugación con cualquier componente de marcado adecuado.

[0132] Tal como se usa en esta invención, el término "al menos una pirimidina", cuando se refiere a modificaciones de un ácido nucleico, se refiere a una, varias o todas las pirimidinas en el ácido nucleico, lo que indica que cualquiera o todas las apariciones de cualquiera o todas de las C, T o U en un ácido nucleico pueden modificarse o no.

[0133] Tal como se usa en esta invención, A, C, G, U y T denotan dA, dC, dG, dU y dT respectivamente, a menos que se especifique lo contrario.

[0134] Tal como se usa en esta invención, "ligando de ácido nucleico", "aptámero" y "clon" se usan indistintamente para referirse a un ácido nucleico de origen no natural que tiene una acción deseable en una molécula diana. Una acción deseable incluye, pero no se limita a, la unión de la diana, el cambio catalítico de la diana, la reacción con la diana de una manera que modifica o altera la diana o la actividad funcional de la diana, la unión covalente a la diana (como en un inhibidor del suicidio) y la facilitación de la reacción entre la diana y otra molécula. En algunas realizaciones, la acción es la afinidad de unión específica para una molécula diana, siendo dicha molécula diana una estructura química tridimensional distinta de un polinucleótido que se une al ligando de ácido nucleico a través de un mecanismo que es independiente del apareamiento de bases Watson/Crick o la formación de triple hélice, donde el aptámero no es un ácido nucleico que tiene la función fisiológica conocida de estar unido por la molécula diana. Los aptámeros para una diana dada incluyen ácidos nucleicos que se identifican a partir de una mezcla candidata de ácidos nucleicos, donde el aptámero es un ligando de la diana, mediante un procedimiento que comprende: (a) poner en contacto la mezcla candidata con la diana, donde los ácidos nucleicos que tienen una afinidad aumentada con la diana en relación con otros ácidos nucleicos en la mezcla candidata se pueden dividir del resto de la mezcla candidata; (b) dividir los ácidos nucleicos de afinidad aumentada del resto de la mezcla candidata; y (c) amplificar los ácidos nucleicos de afinidad aumentada para producir una mezcla enriquecida con ligando de ácidos nucleicos, mediante la cual se identifican aptámeros de la molécula diana. Se reconoce que las interacciones de afinidad son una cuestión de grado; sin embargo, en este contexto, la "afinidad de unión específica" de un aptámero por su diana significa que el aptámero se une a su diana generalmente con un grado de afinidad mucho mayor que se une a otros componentes no diana en una mezcla o muestra. Un "aptámero" o "ligando de ácido nucleico" es un conjunto de copias de un tipo o especie de molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos particular. Un aptámero puede incluir cualquier número adecuado de nucleótidos. "Aptámeros" se refieren a más de uno de estos conjuntos de moléculas. Diferentes aptámeros pueden tener números iguales o diferentes de nucleótidos. Los aptámeros pueden ser ADN o ARN y pueden ser de cadena simple, cadena doble o contener regiones de cadena doble o cadena triple.

[0135] Tal como se usa en esta invención, un "SOMAmer" o aptámero modificado de constante de disociación lenta se refiere a un aptámero (que incluye un aptámero que comprende al menos un nucleótido con una modificación hidrófoba) con una constante de disociación (ty2) de > 30 minutos, > 60 minutos, > 90 minutos, > 120 minutos, > 150 minutos, > 180 minutos, > 210 minutos o > 240 minutos. En algunas realizaciones, los SOMAmers se generan usando los procedimientos SELEX mejorados descritos en la patente de los EE.UU. n .° 7.947.447, titulada "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates".

[0136] Tal como se usa en esta invención, "proteína" se usa como sinónimo de "péptido", "polipéptido" o "fragmento peptídico". Un polipéptido, proteína, péptido o fragmento peptídico "purificado" está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula, tejido o fuente libre de células de la cual se obtiene la secuencia de aminoácidos, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente.

[0137] Tal como se usa en esta invención, "estructura cocristal" o "complejo cocristal" es una estructura cristalina que comprende dos o más moléculas que interactúan.

[0138] Tal como se usa en esta invención, "afección o enfermedad cardiovascular" significa una afección o enfermedad relacionada con el corazón y su sistema vascular. Algunos ejemplos de dichas afecciones o enfermedades son aneurisma, angina, arritmia, aterosclerosis, fibrilación auricular, insuficiencia cardíaca congestiva, cardiomiopatía, cardiopatía coronaria, reestenosis, isquemia, hipertrofia del ventrículo izquierdo, enfermedad vascular periférica, infarto de miocardio, hipertensión, cardiopatía valvular y cardiopatía restrictiva.

[0139] Tal como se usa en esta invención, "fibrosis" significa una enfermedad o afección causada por la formación de una cantidad excesiva y anormal de tejido conectivo fibroso en un órgano que resulta en engrosamiento y cicatrización del tejido conectivo, lo que conduce a un mal funcionamiento del órgano. Los ejemplos de dichas enfermedades y afecciones son fibrosis pulmonar, fibrosis renal, fibrosis hepática y fibrosis quística.

[0140] Tal como se usa en esta invención, "DMAE" o "degeneración macular relacionada con la edad" o "degeneración macular" significa una afección del ojo que es causada por daño a la retina y resulta en una pérdida de visión en el centro del campo visual, llamada mácula. La DMAE se produce en formas "húmedas" y "secas". En la DMAE "húmeda", los vasos sanguíneos crecen desde la coroides detrás de la retina. En la DMAE "seca", se acumulan residuos celulares (drusas) entre la retina y la coroides. En cualquiera de las formas, la retina puede desprenderse.

[0141] Tal como se usa en esta invención, "enfermedad oftálmica" o "afección oftálmica" o "enfermedad ocular" o "afección ocular" se refiere a cualquier enfermedad o afección que afecte o involucre trastornos de neovascularización ocular, tales como degeneración macular ("húmeda" y "seca"), retinopatía de prematuridad, retinopatía diabética, glaucoma neovascular, neovascularización corneal, retinopatía diabética proliferativa (la etapa más grave de la retinopatía diabética), uveítis (una afección inflamatoria del ojo que a menudo conduce a edema macular), edema macular cistoide después de la cirugía de cataratas, degeneración miope (una afección en la que un paciente con un alto grado de miopía desarrolla neovascularización coroidea), degeneración macular inflamatoria (una afección en la que un paciente con inflamación en el área macular debido a infecciones u otras causas, desarrolla neovascularización coroidea) y neovascularización del iris (una complicación grave de la retinopatía diabética o la oclusión de la vena retiniana que implica el crecimiento de nuevos vasos sanguíneo en la superficie del iris).

[0142] Tal como se usa en esta invención, "enfermedad renal" o "afección renal" se refiere a cualquier enfermedad o afección que afecte o implique trastornos renales proliferativos tales como glomerulonefritis, enfermedades renales proliferativas masangiales, enfermedad renal poliquística, cánceres renales, insuficiencia renal aguda, nefropatía, amiloidosis, edema, fibrosis, enfermedades glomerulares, infarto renal y nefritis.

[0143] Tal como se usa en esta invención, "cáncer" significa una enfermedad o afección que implica un crecimiento celular no regulado y anormal. Algunos ejemplos de cánceres comunes son cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de mama, melanoma, cáncer de colon y recto, linfoma, cáncer de endometrio, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer renal, cáncer de próstata, leucemia y cáncer de tiroides.

[0144] Tal como se usa en esta invención, "modular" significa alterar, ya sea aumentando o disminuyendo, el nivel de un péptido o polipéptido, o alterar, ya sea aumentando o disminuyendo, la estabilidad o actividad de un péptido o un polipéptido. El término "inhibir" significa disminuir el nivel de un péptido o un polipéptido o disminuir la estabilidad o actividad de un péptido o un polipéptido. En una realización, la proteína que se modula o inhibe es PDGF.

[0145] Tal como se usa en esta invención, el término "bioactividad" indica un efecto sobre uno o más procedimientos celulares o extracelulares (por ejemplo, mediante unión, señalización, etc.) que puede afectar procedimientos fisiológicos o fisiopatológicos.

[0146] Tal como se usan en esta invención, los términos "factor de crecimiento derivado de plaquetas" y "PDGF" se refieren a las isoformas A, B, C y D de PDGF y sus homo o heterodímeros AA, BB, AB, C^cy DD. En algunos casos, el contexto determinará a qué isoforma y/o heterodímero de PDGF se refiere. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los aptámeros de PDGF descritos en esta invención se unen a la isoforma de PDGF-B y los homo- y heterodímeros que comprenden esa isoforma, aunque los aptámeros pueden describirse como que se unen a PDGF. Específicamente se incluyen en la definición isoformas y variantes de PDGF AA, AB y BB humanas de origen natural. Tal como se usa en esta invención, PDGF incluye todas las especies de mamíferos de PDGF, incluyendo humanos, caninos, felinos, murinos, primates, equinos y bovinos. Un precursor de isoforma PDGF-B humano ejemplar no limitante tiene la secuencia que se muestra en el n .° de acceso Swiss-Prot P01127.1. Las proteínas maduras de isoforma PDGF-B humanas ejemplares no limitantes pueden tener la secuencia de aminoácidos 82 a 241 u 82 a 190 del n .° de acceso Swiss-Prot P01127.1 (denominados en esta invención aminoácidos 1 a 160 o 1 a 109 de PDGF-B).

[0147] Tal como se usa en esta invención, "receptor de PDGF" se refiere a un receptor que está unido y activado por PDGF, tal como el receptor de PDGF a y el receptor de PDGF p. Los receptores de PDGF incluyen los receptores de cualquier especie de mamífero, que incluyen, pero no se limitan a, humanos, caninos, felinos, murinos, equinos, primates y bovinos. Un precursor de PDGFRp humano ejemplar no limitante tiene la secuencia que se muestra en el número de acceso Swiss-Prot P09619.1. Una proteína madura de PDGFRp humana ejemplar no limitante tiene la secuencia de aminoácidos 33 a 1106 del n .° de acceso Swiss-Prot P09619.1. Unprecursor de PDGFRa humano ejemplar no limitante tiene la secuencia que se muestra en el n .° de acceso Swiss-Prot P16234.1. Una proteína madura de PDGFRa humana ejemplar no limitante tiene la secuencia de aminoácidos 24 a 1089 del n .° de acceso Swiss-Prot P16234.1.

[0148] Un "aptámero de PDGF" es un aptámero que es capaz de unirse y modificar la actividad de PDGF. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF inhibe la actividad de PDGF in vitro. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF inhibe la actividad de PDGF in vivo. Una actividad ejemplar no limitante de PDGF es la fosforilación del receptor de PDGF mediada por PDGF, tal como el receptor de PDGF a (PDGF Ra) o el receptor de PDGF p (PDGF Rp).

[0149] En algunas realizaciones, el "aptámero de VEGF" como se define en esta invención es un monómero, dímero o una construcción de multímero, opcionalmente conectado por un enlazador.

[0150] Tal como se usan en esta invención, los términos "factor de crecimiento endotelial vascular" y "VEGF" se refieren a VEGF de origen natural, que incluye isoformas y variantes, tales como VEGF-121, VEGF-145, VEGF-165, VEGF-183, VEGF-189 y VEGF-206. Tal como se usa en esta invención, VEGF incluye todas las especies de mamíferos de VEGF, incluyendo humanos, caninos, felinos, murinos, primates, equinos y bovinos. Un percursor de VEGF humano ejemplar no limitante tiene la secuencia que se muestra en el n .° de acceso Swiss-Prot P15692.2. VEGF-121 se describe, por ejemplo, en Tee y col. (2001) Biochem. J. 359:219; Bornes y col. (2004) J. Biol. Chem., 279:18717.

[0151] Tal como se usa en esta invención, "receptor de VEGF" se refiere a un receptor que está unido y activado por VEGF, tal como VEGFR-1 y VEGFR-2. Los receptores de VEGF incluyen los receptores de cualquier especie de mamífero, que incluyen, pero no se limitan a, humanos, caninos, felinos, murinos, equinos, primates y bovinos. Un precursor de VEGFR-1 humano ejemplar no limitante tiene la secuencia que se muestra en el n .° de acceso Swiss-Prot P17948.2. Una proteína madura de VEGFR-1 humana ejemplar no limitante tiene la secuencia de aminoácidos 27 a 1338 del n .° de acceso Swiss-Prot P17948.2. Un precursor de VEGFR-2 humano ejemplar no limitante tiene la secuencia que se muestra en el n .° de acceso Swiss-Prot P35968.2. Una proteína madura de VEGFR-2 humana ejemplar no limitante tiene la secuencia de aminoácidos 20 a 1356 del n .° de acceso Swiss-Prot P35968.2.

[0152] Un "aptámero de VEGF" es un aptámero que es capaz de unirse y modificar la actividad de VEGF. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF inhibe la actividad de VEGF in vitro. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF inhibe la actividad de VEGF in vivo. Las actividades ejemplares no limitantes de VEGF incluyen la fosforilación del receptor de VEGF mediada por VEGF, tal como VEGFR-1 o VEGFR-2. En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero de VEGF que compite por la unión a VEGF-121 con el aptámero 4867-31_183.

[0153] En algunas realizaciones, el "aptámero de VEGF" como se define en esta invención es un monómero, dímero o una construcción de multímero, opcionalmente conectado por un enlazador.

[0154] Los términos "construcción de aptámero de PDGF/VEGF" y "construcción de aptámero de VEGF/PDGF" se usan indistintamente para hacer referencia a una construcción que comprende un aptámero de PDGF y un aptámero de VEGF. El orden de las palabras "PDGF" y "VEGF" en "construcción de aptámero de PDGF/VEGF" y "construcción de aptámero de VEGF/PDGF" no es indicativo de cómo se unen los aptámeros, por ejemplo, el orden no indica qué aptámero se encuentra en la posición más 5' de una construcción de aptámero y qué aptámero se encuentra en la posición más 3' en la construcción de aptámero. En algunas realizaciones, una construcción de aptámero de PDGF/VEGF es capaz de unirse a PDGF y VEGF simultáneamente. En algunas realizaciones, una construcción de aptámero de PDGf/VEGF es capaz de unirse a cada uno de PDGF y VEGF por separado. En una construcción de aptámero de PDGF/VEGF, el aptámero de PDGF y el aptámero de VEGF pueden unirse covalentemente o no covalentemente, por ejemplo, a través de un par de unión tal como estreptavidina y biotina. Una construcción de aptámero de PDGF/VEGF puede comprender un enlazador entre el aptámero de PDGF y el aptámero de VEGF.

[0155] Tal como se usa en esta invención, "enfermedad o afección mediada por PDGF" se refiere a enfermedades o afecciones en las que la actividad de PDGF puede conducir directa o indirectamente a la enfermedad o afección. Las enfermedades o afecciones ejemplares no limitantes mediadas por PDGF incluyen enfermedades cardiovasculares tales como aterosclerosis, reestenosis, afecciones relacionadas con la hipertrofia cardíaca y trastornos vasculares; enfermedades oftálmicas tales como degeneración macular; fibrosis y cánceres.

[0156] Tal como se usa en esta invención, "enfermedad o afección mediada por VEGF" se refiere a enfermedades o afecciones en las que la actividad de VEGF puede conducir directa o indirectamente a la enfermedad o afección. Las enfermedades o afecciones ejemplares no limitantes mediadas por VEGF incluyen enfermedades cardiovasculares, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades reumáticas inflamatorias, enfermedades oftálmicas y cánceres en diversas etapas del procedimiento de la enfermedad. Los ejemplos no limitantes de enfermedades cardiovasculares son aterosclerosis, reestenosis, afecciones relacionadas con la hipertrofia cardíaca y trastornos vasculares. Los ejemplos no limitantes de enfermedades oftálmicas son retinitis, degeneración macular, coroiditis, retinopatía, edema, glaucoma y catarata.

[0157] Tal como se usa en esta invención, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora de un gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y, más particularmente, en seres humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el agente terapéutico e incluye, pero no se limita a, líquidos estériles como agua y aceites.

[0158] Tal como se usa en esta invención, el término "sal farmacéuticamente aceptable" o "sal" de un aptámero de PDGF, aptámero de VEGF o una construcción de aptámero de PDGF/VEGF es un producto del compuesto descrito que contiene un enlace iónico y se produce típicamente haciendo reaccionar el compuesto descrito con un ácido o una base, adecuado para administrarse a un individuo. Una sal farmacéuticamente aceptable puede incluir, pero no se limita a, sales de adición de ácido que incluyen clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos, hidrógenosulfatos, alquilsulfonatos, arilsulfonatos, arilalquilsulfonatos, acetatos, benzoatos, citratos, maleatos, fumaratos, succinatos, lactatos y tartratos; cationes de metales alcalinos tales como Li, Na, K, sales de metales alcalinotérreos tales como Mg o Ca, o sales de aminas orgánicas.

[0159] Tal como se usa en esta invención, el término "composición farmacéutica" es una formulación que comprende un aptámero de PDGF, un aptámero de VEGF o una construcción de aptámero de PDGF/VEGF en una forma adecuada para la administración a un individuo. Una composición farmacéutica se formula típicamente para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen, pero no se limitan a, administración por vía oral y parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, por inhalación, tópica, transdérmica, transmucosa y rectal.

[0160] Tal como se usa en esta invención, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" generalmente significa la cantidad necesaria para mejorar al menos un síntoma de un trastorno o afección que debe prevenirse, reducirse o tratarse como se describe en esta invención. La frase "cantidad terapéuticamente efectiva" en lo que se refiere a los aptámeros de PDGF, aptámeros de VEGF o construcciones de aptámeros de PDGF/VEGF de la presente descripción significa la dosificación de aptámero que proporciona la respuesta farmacológica específica para la cual se administra el aptámero en un número significativo de individuos que necesitan dicho tratamiento. Se enfatiza que una cantidad terapéuticamente efectiva de un aptámero que se administra a un individuo en particular en un aspecto particular no siempre será eficaz en el tratamiento de las afecciones/enfermedades descritas en esta invención, incluso aunque dichos expertos en la materia consideren que dicha dosificación es una cantidad terapéuticamente efectiva.

[0161] Los términos "SELEX" y "procedimiento SELEX" se usan indistintamente en esta invención para referirse generalmente a una combinación de (1) la selección de ácidos nucleicos que interactúan con una molécula diana de una manera deseable, por ejemplo, mediante la unión con alta afinidad a una proteína, con (2) la amplificación de esos ácidos nucleicos seleccionados. El procedimiento SELEX se puede usar para identificar aptámeros con alta afinidad por una molécula diana específica.

[0162] SELEX generalmente incluye preparar una mezcla candidata de ácidos nucleicos, unir la mezcla candidata a la molécula diana deseada para formar un complejo de afinidad, separar los complejos de afinidad de los ácidos nucleicos candidatos no unidos, separar y aislar el ácido nucleico del complejo de afinidad, purificar el ácido nucleico e identificar una secuencia específica de aptámeros. El procedimiento puede incluir múltiples rondas para refinar adicionalmente la afinidad del aptámero seleccionado. El procedimiento puede incluir etapas de amplificación en uno o más puntos del procedimiento. Véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. n.° 5.475.096, titulada "Nucleic Acid Ligands". El procedimiento SELEX se puede usar para generar un aptámero que se une covalentemente a su diana, así como un aptámero que se une no covalentemente a su diana. Véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. n.° 5.705.337 titulada "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX".

[0163] El procedimiento SELEX se puede usar para identificar aptámeros de alta afinidad que contienen nucleótidos modificados que confieren características mejoradas al aptámero, tales como, por ejemplo, estabilidad in vivo mejorada o características de administración mejoradas. Los ejemplos de dichas modificaciones incluyen sustituciones químicas en las posiciones de ribosa y/o fosfato y/o base. Los aptámeros identificados por el procedimiento SELEX que contienen nucleótidos modificados se describen en la patente de los EE.UU. n .° 5.660.985, titulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", que describe oligonucleótidos que contienen derivados de nucleótidos modificados químicamente en las posiciones C5 y/o 2' de las pirimidinas. La patente de los EE.UU. n .° 5.580.737, véase supra, describe aptámeros altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con 2'-amino (2'-NH2), 2'-fluoro (2'-F) y/o 2'-O-metilo (2'-OMe). Véase también la publicación de patente de los EE.UU. n .° 20090098549, titulada "SELEX and PHOTOSELEX", que describe bibliotecas de ácidos nucleicos que tienen propiedades físicas y químicas aumentadas y su uso en SELEX y photoSELEX.

[0164] SELEX también se puede utilizar para identificar aptámeros que tienen características deseables de constantes de disociación. Véase la patente de los EE.UU. n .° 7.947.447, titulada "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates", que describe procedimientos SELEX mejorados para generar aptámeros que pueden unirse a moléculas diana. Se describen procedimientos para producir aptámeros y fotoaptámeros que tienen tasas de disociación más lentas de sus respectivas moléculas diana. Los procedimientos implican poner en contacto la mezcla candidata con la molécula diana, permitir que se produzca la formación de complejos de ácido nucleico-diana y realizar un procedimiento de enriquecimiento de constante de disociación lenta donde los complejos de ácido nucleico-dianao con tasas de disociación rápidas se disocian y no se reforman, mientras que los complejos con tasas de disociación lentas permanecen intactos. De manera adicional, los procedimientos incluyen el uso de nucleótidos modificados en la producción de mezclas de ácido nucleico candidatas para generar aptámeros con un rendimiento de la constante de disociación mejorado (véase la publicación de patente de los EE.U^u. n .° 2009/0098549, titulada "SELEX and PhotoSELEX"). (Véanse también la patente de los EE.UU. n .° 7.855.054 y la publicación de patente de los EE.UU. n .° 2007/0166740).

[0165] En algunas realizaciones, se proporcionan procedimientos para seleccionar aptámeros que se unen a una molécula diana, que comprenden: (a) preparar una mezcla candidata de ácidos nucleicos, donde la mezcla candidata comprende ácidos nucleicos modificados en los que al menos una pirimidina en al menos uno, o en cada, ácido nucleico de la mezcla candidata se modifica químicamente en la posición C5; (b) poner en contacto la mezcla candidata con una molécula diana, donde los ácidos nucleicos que tienen una afinidad aumentada por la molécula diana en relación con otros ácidos nucleicos en la mezcla candidata se unen a la molécula diana, formando complejos de ácido nucleico-molécula diana; (c) dividir los ácidos nucleicos de afinidad aumentada del resto de la mezcla candidata; y (d) amplificar los ácidos nucleicos de afinidad aumentada para proporcionar una mezcla de ácidos nucleicos enriquecidos en secuencias de ácidos nucleicos que son capaces de unirse a la molécula diana con afinidad aumentada, mediante lo cual se identifica un aptámero para la molécula diana. En determinadas realizaciones, el procedimiento incluye además realizar un procedimiento de enriquecimiento de constante de disociación lenta.

[0166] "Diana" o "molécula diana" o "diana" se refiere en esta invención a cualquier compuesto sobre el cual un ácido nucleico puede actuar de una manera deseable. Una molécula diana puede ser una proteína, péptido, ácido nucleico, carbohidrato, lípido, polisacárido, glicoproteína, hormona, receptor, antígeno, anticuerpo, virus, patógeno, sustancia tóxica, sustrato, metabolito, análogo del estado de transición, cofactor, inhibidor, fármaco, colorante, nutriente, factor de crecimiento, célula, tejido, cualquier porción o fragmento de cualquiera de los anteriores, etc., sin limitación. Prácticamente cualquier efector químico o biológico puede ser una diana adecuada. Las moléculas de cualquier tamaño pueden servir como dianas. Una diana también puede modificarse de ciertas maneras para mejorar la probabilidad o la fuerza de una interacción entre la diana y el ácido nucleico. Una diana también puede incluir cualquier variación menor de un compuesto o molécula particular, tal como, en el caso de una proteína, por ejemplo, variaciones menores en la secuencia de aminoácidos, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como la conjugación con un componente de marcado, que no altera sustancialmente la identidad de la molécula. Una "molécula diana" o "diana" es un conjunto de copias de un tipo o especie de molécula o estructura multimolecular que es capaz de unirse a un aptámero. Las "moléculas diana" o "diana" se refieren a más de uno de estos conjuntos de moléculas. Las realizaciones del procedimiento SELEX en el que la diana es un péptido se describen en la patente de los EE. UU. n.° 6.376.190, titulada "Modified SELEX Processes Without Purified Protein".

APTÁMEROS DE PDGF EJEMPLARES

[0167] Los aptámeros de PDGF de la presente descripción se identificaron usando el procedimiento SELEX mejorado para identificar aptámeros que tienen constantes de disociación lentas como se describe en el ejemplo 1, que describe un procedimiento representativo para la selección y producción de un aptámero que se une a PDGF con una tasa de disociación lenta. Para la selección se utilizó una biblioteca de ADN aleatoria compuesta de bencil-dU (Bn-dU), dA, dC y dG. Usando este procedimiento, se identificó el aptámero de ADN para PDGF-BB designado como aptámero 4149-8_1 (SEQ ID NO:1).

[0168] Utilizando el aptámero 4149-8_1 (SEQ ID NO:1), se llevaron a cabo estudios para identificar la longitud de secuencia mínima necesaria para mantener una fuerte afinidad por PDGF. El truncamiento sistemático de los extremos 5' y 3' condujo a la identificación de un motivo central que consiste en 29 nucleótidos (4149-8_38; (SEQ ID NO:38). El aptámero 4149-8_38 mostró una unión de alta afinidad a PDGF-BB (valor de Kd de 20 pM; (Ffigura 6).

[0169] Se llevaron a cabo estudios de secuenciación adicionales en el grupo de secuencias del cual se seleccionó el aptámero 4149-8_1 (SEQ ID NO:1). La secuenciación 454, que es un procedimiento de alto rendimiento a gran escala que utiliza pirosecuenciación paralela, proporciona una preparación de muestra imparcial y un análisis de secuencia muy preciso. Los datos de secuenciación se utilizaron para identificar una secuencia de consenso para un aptámero de PDGF como se muestra en la figura 3. Además, los estudios de sustitución de nucleótidos ilustrados en la figura 6 condujeron al descubrimiento de que seis de las ocho posiciones de BndU en la secuencia de consenso eran deseables para la unión de PDGF, pero cuatro posiciones de BndU podrían reemplazarse con dT con poca o ninguna pérdida de actividad de unión. Una secuencia de consenso se muestra en la figura 3A, junto con una representación gráfica de la frecuencia de nucleótidos en cada posición en relación con el aptámero 4149-8_1 (SEQ ID NO:1).

[0170] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia:

5'-NZVSLnS' V 'ZACNNmGCGZZZAZAGCG-3' (SEQ ID NO:500),

donde

V se selecciona de una A, C o G;

V' se selecciona de una C, G o Z, donde V' es complementaria a V;

S y S' se seleccionan independientemente de una C o G, donde S y S' son complementarias entre sí;

cada N se selecciona independientemente de cualquier nucleótido de origen natural o modificado;

cada Z se selecciona independientemente de una pirimidina modificada;

L se selecciona de cualquier nucleótido de origen natural o modificado, un enlazador de hidrocarburos, un enlazador de polietilenglicol o una combinación de los mismos;

n es de 0 a 20; y m es de 0 a 20; y donde una o más inserciones de nucleótidos se incluyen opcionalmente.

[0171] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia:

5'-ZZVSLnS' V 'ZACNNmGCGZZZAZAGCG-3' (SEQ ID NO:501), donde V, V', N, S, S', Z, L, n y m son como se definió anteriormente.

[0172] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia:

5'-ZZVCLnGV' ZACNMGCGZZZAZAGCG-3 '(SEQ ID NO:502), donde Z, V, V', N, Z, L y n son como se definió anteriormente y M se selecciona de C y A.

[0173] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia:

5'-ZZACLnGZZACACGCGZZZAGCG-3' (SeQ ID NO:503), donde Z, L y n son como se definió anteriormente.

[0174] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia:

5'-ZZACGACZACGZZACACGCGZZZAZAGCG-3' (SEQ ID NO:504), donde Z es como se definió anteriormente.

[0175] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia

5'-ZVSLnS' V 'ZACNNmGCGZZZAZAG-3' (SEQ ID NO:507),

donde

V se selecciona de una A, C o G;

V' se selecciona de una C, G o Z, donde V' es complementaria a V;

cada N se selecciona independientemente de nucleótido modificado o no modificado;

cada Z se selecciona independientemente de una pirimidina modificada;

L se selecciona de un enlazador C²-C²⁰sustituido o no sustituido y un nucleótido modificado o no modificado; n es de 1 a 50; y m es de 0 a 50; y

donde una o más inserciones de nucleótidos se incluyen opcionalmente.

[0176] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia:

5'-Z' ZVSLnS 'V' ZACNNmGCGZZZAZAGC-3' (SEQ ID NO:508), donde Z' es una pirimidina o dT modificada; y V, V', N, S, S', Z, L, n y m son como se definió anteriormente.

[0177] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia:

5'-Z' ZVCLnGV 'ZACNMGCGZZZAZAGC-3' (SEQ ID NO:509),

donde Z, Z', V', N, Z, L y n son como se definió anteriormente y M se selecciona de C y A.

[0178] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia:

5'-Z' ZACLnGZZACACGCGZZZAZAGC-3' (sEq ID NO:510), donde Z, Z', L y n son como se definió anteriormente.

[0179] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia:

5'-Z' ZACGACZACGZZACACGCGZZZAZAGC-3' (SEQ ID NO:511), donde Z y Z' son como se definió anteriormente.

[0180] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia:

5'-ZABLpGYZABKqGCGZZYDYAG-3' (SEQ ID NO:505)

donde cada Z es, independientemente, una pirimidina modificada;

cada B se selecciona independientemente de C y un enlazador C²-C¹⁰sustituido o no sustituido;

cada L se selecciona independientemente de un enlazador C²-C¹⁰sustituido o no sustituido, un enlazador de hexaetilenglicol y un nucleótido modificado o no modificado, donde p es de 1 a 10;

cada Y se selecciona independientemente de una pirimidina modificada o no modificada;

cada K se selecciona independientemente de un enlazador C²-C¹⁰sustituido o no sustituido, un enlazador de hexaetilenglicol y un nucleótido modificado o no modificado, donde q es de 1 a 5; y D se selecciona de A y un enlazador C²-C¹⁰sustituido o no sustituido.

[0181] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia:

5'-XZABLnGYZABLnGCGZZYDYAGBE-3' (SEQ ID NO:506),

donde X se selecciona de una pirimidina modificada o no modificada y un enlazador C²-C¹⁰sustituido o no sustituido, o está ausente; y E se selecciona de G y un enlazador C²-C¹⁰sustituido o no sustituido, o está ausente.

[0182] Una construcción de aptámero que comprende las secuencias NZVS (SEQ ID NO:761) y

S'V' ZACNNmGCGZZZAZAGCG (SEQ ID NO:762),

donde

V se selecciona de una A, C o G; V' se selecciona de una C, G o Z, donde V' se selecciona de una C, G o Z, donde V' es complementaria a V;

N se selecciona independientemente de cualquier nucleótido de origen natural o modificado;

Z se selecciona independientemente de una pirimidina modificada;

m es de 1 a 20; y

donde una o más inserciones de nucleótidos se incluyen opcionalmente.

[0183] En algunas realizaciones, Z es una uridina modificada. En algunas realizaciones, cada Z se selecciona independientemente de las pirimidinas modificadas en C-5 tal como se definen en esta invención. En algunas realizaciones, cada Z se selecciona independientemente de

5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU),

5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-fenetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PEdU),

5-(N-tiofenilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThdU),

5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (iBudU),

5-(N-tirosilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TyrdU),

5-(N-3,4-metilendioxibencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (MBndU),

5-(N-4-fluorobencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (FBndU),

5-(N-3-fenilpropilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (PPdU),

5-(N-imidizoliletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ImdU),

5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-desoxiuridina (T rpdU),

5-(N-R-treonilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (ThrdU),

5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-fluorouridina,

cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxiamida)-2'-desoxiuridina

5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU),

5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2'-desoxiuridina),

5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NapdU),

5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridi na,

5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NEdU),

5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NEdU),

5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BFdU),

5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BTdU),

5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina y

5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina.

[0184] En determinadas realizaciones, las porciones del aptámero (Y) de PDGF y/o VEGF pueden no ser necesarias para mantener la unión y determinadas porciones del aptámero (Y) de PDGF y/o VEGF contiguo pueden modificarse, lo que incluye, pero no se limita a, el reemplazo con un resto espaciador o enlazador. En estas realizaciones, por ejemplo, Y puede representarse como Y'-Q-Y"-Q'-Y'', donde Y', Y" e Y'' son partes de un aptámero de PDGF y/o VEGF o segmentos de diferentes aptámeros de PDGF y/o VEGF y Q y/o Q' son espaciadores o moléculas enlazadoras que modifican determinadas características de ácido nucleico del aptámero de PDGF y/o VEGF original. Cuando Q y Q' no están presentes, Y', Y"e Y'" representan un aptámero de PDGF y/o VEGF contiguo (Y).

[0185] Tal como se usa en esta invención, un "enlazador" es una entidad molecular que conecta dos o más entidades moleculares a través de un enlace covalente o interacciones no covalentes y puede permitir la separación espacial de las entidades moleculares de una manera que preserva las propiedades funcionales de una o más de las entidades moleculares. Un enlazador también puede conocerse como un espaciador. Los expertos en la materia determinarán fácilmente las secuencias de enlazadores adecuadas en función de la presente descripción.

[0186] Tal como se usa en esta invención, un enlazador puede comprender una o más moléculas o subcomponentes, seleccionados del grupo que incluye, pero no se limita a, un polinucleótido, un polipéptido, un ácido nucleico peptídico, un ácido nucleico bloqueado, un oligosacárido, un polisacárido, un anticuerpo, un aficuerpo, una imitación de anticuerpo, una molécula de carbono alifática, aromática o heteroaromática, una molécula de polietilenglicol (PEG), un receptor celular, un ligando, un lípido, cualquier fragmento derivado de estas estructuras, cualquier combinación de los anteriores o cualquier otra estructura o componente químico.

[0187] En algunas realizaciones, al menos una L es un enlazador de polietilenglicol. En algunas realizaciones, al menos una L es un enlazador de hexaetilenglicol. En algunas realizaciones, L es un enlazador C²-C¹⁰sustituido o no sustituido. En algunas realizaciones, p es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8. En algunas realizaciones, p es 1,2 o 3. En algunas realizaciones, al menos una K es un enlazador de polietilenglicol. En algunas realizaciones, al menos una K es un enlazador de hexaetilenglicol. En algunas realizaciones, K es un enlazador C²-C¹⁰sustituido o no sustituido. En algunas realizaciones, q es 1 o 2. En algunas realizaciones, q es 1.

[0188] En diversas realizaciones, m puede ser de 0 a 20, de 0 a 19, de 0 a 18, de 0 a 17, de 0 a 16, de 0 a 15, de 0 a 15, de 0 a 14, de 0 a 13, de 0 a 12, de 0 a 11, de 0 a 10, de 0 a 9, de 0 a 8, de 0 a 7, de 0 a 6, de 0 a 5, de 0 a 4 o de 0 a 3.

[0189] En algunas realizaciones, L puede ser un enlazador tal como un enlazador de hexaetilenglicol de 18 átomos. En algunas realizaciones, la L puede ser una combinación de nucleótidos y un enlazador. Como ejemplo no limitante, los siguientes aptámeros (SEQ ID NO 67 y 69) incluyen un enlazador de hexaetilenglicol (Heg):

(SEQ ID NO. 67) 5'-Bn-Bn-A-C-Heg-G-Bn-Bn-A-C-A-C-G-C-G-Bn-Bn-Bn-A-Bn-A-G-C-G-3'

(SEQ ID NO. 69) 5'-Bn-Bn-A-C-G-Heg-C-G-Bn-Bn-A-C-A-C-G-C-G-Bn-Bn-Bn-A-Bn-A-G-C-G-3'

donde Bn es bencil-dU y Heg es un enlazador de hexaetilenglicol.

[0190] En algunas realizaciones, una N puede reemplazarse por un enlazador, tal como en los siguientes aptámeros:

(SEQ ID NO. 329) 5'-Bn-Bn-A-C-Heg-G-Bn-Bn-A-C-C3-G-C-G-Bn-Bn-Bn-A-Bn-A-G-C-3'

(SEQ ID NO. 408) 5'-Bn-Bn-A-C-Heg-G-Bn-Bn-A-C-C3-C-G-Bn-Bn-Bn-A-Bn-A-G-3' donde Bn es bencil-dU, Heg es un enlazador de hexaetilenglicol y C3 es un enlazador de tres carbonos.

[0191] Se identificaron aptámeros de PDGF adicionales usando el procedimientoSELEX mejorado para identificar aptámeros que tienen constantes de disociación lentas como se describe en el ejemplo 5, que describe un procedimiento representativo para la selección y producción de un aptámero que se une a PDGF con una constante de disociación lenta. Para la selección se utilizó una biblioteca de ADN aleatoria compuesta de naftil-dU (Nap-dU), dA, dC y dG. Se identificó el aptámero PDGF 5169-4_26 en la pantalla.

[0192] En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero que se une específicamente a PDGF, donde el aptámero compite por la unión a PDGF con el aptámero de PDGF 5169-4_26. En algunas de dichas realizaciones, el aptámero comprende al menos un nucleósido modificado que comprende una modificación de nucleobase hidrófoba. Además, en algunas de dichas realizaciones, la modificación de nucleobase hidrófoba es una pirimidina modificada. En algunas realizaciones, cada pirimidina modificada puede seleccionarse independientemente de 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU), 5-(N-bencilcarboxiamida) -2'-O-metiluridina, 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-fenetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PedU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThdU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (iBudU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina y 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2'-desoxiuridina).

[0193] En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero que se une específicamente a PDGF, donde el aptámero comprende la secuencia:

5'-ACALnZGZAZGLmZLZ-3' (SEQ ID NO. 512);

donde cada Z es, independientemente, una pirimidina modificada; cada L se selecciona independientemente de un enlazador C²-C⁵⁰sustituido o no sustituido, un enlazador de polietilenglicol y un nucleótido modificado o no modificado; n es de 1 a 5; y m es de 1 a 10.

[0194] En algunas realizaciones, cada uno se selecciona independientemente de 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU), 5- (N-bencilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-fenetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PedU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThdU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (iBudU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxiamida)-2'-desoxidina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina y 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2'-desoxiuridina). En algunas realizaciones, al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o cada Z es 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU). En algunas realizaciones, n es 1, 2, 3, 4 o 5. En algunas realizaciones, m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En algunas realizaciones, n es 3. En algunas realizaciones, m es 4. En algunas de dichas realizaciones, cada L se selecciona independientemente de un nucleótido modificado, un nucleótido no modificado y un enlazador C³.

[0195] Un enlazador o espaciador C²-C⁵⁰puede ser una estructura principal que comprende una cadena de 2 a 50 átomos de carbono (C²-C⁵⁰) (cadena saturada, insaturada, lineal, ramificada o cíclica), de 0 a 10 grupos arilo, de 0 a 10 grupos heteroarilo y de 0 a 10 grupos heterocíclicos, que comprenden opcionalmente un enlace éter (-O-), (por ejemplo , una o más unidades de alquilenglicol, que incluyen, pero no se limitan a, una o más unidades de etilenglicol -O-(CH²CH²O)-; una o más unidades de 1,3-propanodiol -O-(CH²CH²CH²O)-, etc.); un enlace amina (-NH-); un enlace amida (-NC(O)-); y un enlace tioéter (-S-); etc.; donde cada átomo de carbono de la estructura principal puede estar independientemente no sustituido (es decir, que comprende sustituyentes -H) o puede estar sustituido con uno o más grupos seleccionados de un alquilo C¹a C³, -OH, -NH², -SH, -O-(alquilo C¹a C6), -S-(alquilo C¹a C6), halógeno, -OC(O) (alquilo C¹a C6), -NH-(alquilo C¹a C6) y similares. En algunas realizaciones, un enlazador C²-C⁵⁰es un enlazador C²-C²⁰, un enlazador C²-C¹⁰, un enlazador C²-C⁸, un enlazador C²-C⁶, un enlazador C²-C⁵, un enlazador C²-C⁴o un enlazador C³, donde cada carbono puede sustituirse independientemente como se describió anteriormente.

[0196] En algunas realizaciones, uno o más nucleósidos de un aptámero de PDGF comprenden una modificación seleccionada de una modificación de azúcar de posición 2' (tal como 2'-amino (2-NH²), 2'-fluoro (2'-F) o 2'-O-metilo (2'-OMe)), una modificación en una amina exocíclica de citosina, una modificación de enlace internucleósido y una 5-metil-citosina. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende una caperuza 3', una caperuza 5' y/o una desoxitimidina invertida en el extremo 3'.

[0197] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende al menos un enlace internucleósido modificado. En algunas realizaciones, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco enlaces internucleósidos son enlaces fosforotioato.

[0198] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF tiene una secuencia seleccionada de las secuencias que se muestran en las tablas 1, 2 y 6 a 9 (SEQ ID NO:1 a 499 y 517 a 545). En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF tiene una secuencia seleccionada de las secuencias que se muestran en la tabla 1 y las secuencias que se muestran en las tablas 6 a 9 que se unen a PDGF con una afinidad (Kd) inferior a 10 nM. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF tiene una secuencia que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a las secuencias que se muestran en las tablas 1,2 y 6 a 9 (SEQ ID NO:1 a 1 a 499 y 517 a 545). En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF tiene una secuencia que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a las secuencias que se muestran en la tabla 1 y las secuencias que se muestran en las tablas 6 a 9 que se unen a PDGF con una afinidad (Kd) inferior a 10 nM.

[0199] Los términos "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia", "porcentaje de identidad", " % idéntico", " % de identidad" y variaciones de los mismos, cuando se usan en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico, se usan indistintamente para referirse al número de bases de nucleótidos que son iguales en un ácido nucleico de consulta o una porción de un ácido nucleico de consulta, cuando se compara y alinea para una correspondencia máxima con un ácido nucleico de referencia, dividido por (1) el número de bases de nucleótidos en la secuencia de consulta entre e incluyendo la base de nucleótidos más 5' correspondiente (es decir, alineada) y la base de nucleótidos más 3' correspondiente (es decir, alineada), o (2) la longitud total de la secuencia de referencia, lo que sea mayor. La alineación ejemplar de secuencias para comparación se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat 'l. Acad. Sci. USA 85:2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante inspección visual (véase en general, Ausubel, F.M. y col. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience).

[0200] Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia es el algoritmo utilizado en la herramienta de búsqueda de alineación local básica (en lo sucesivo "BLAST"), véase, por ejemplo, Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol.215: 403 y Altschul y col. (1997) Nucleic Acids Res. 15:3389. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (en adelante "NCBI"). Los parámetros predeterminados utilizados para determinar la identidad de secuencia utilizando el software disponible de NCBI, por ejemplo, BLASTN (para secuencias de nucleótidos) se describen en McGinnis y col. (2004) Nucleic Acids Res. 32:W20.

[0201] Tal como se usa en esta invención, cuando se describe el porcentaje de identidad de un ácido nucleico, tal como un aptámero de PDGF, cuya secuencia es al menos, por ejemplo, aproximadamente un 95 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, se pretende que la secuencia de ácido nucleico sea idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia de ácido nucleico puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia de ácido nucleico deseada, cuya secuencia es al menos aproximadamente un 95 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico de referencia, hasta un 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia puede eliminarse o sustituirse con otro nucleótido, o se puede insertar algun número de nucleótidos, hasta el 5 % del número total de nucleótidos, en la secuencia de referencia en la secuencia de referencia (denominada en esta invención una inserción). Estas mutaciones de la secuencia de referencia para generar la secuencia deseada pueden producirse en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Además, se pretende que una base de nucleótidos se considere "idéntica" a los efectos de determinar el porcentaje de identidad, cuando la base de nucleótidos (1) es la misma que la base de nucleótidos en la secuencia de referencia, o (2) se deriva de la base de nucleótidos en la secuencia de referencia, o (3) se deriva de la misma base de nucleótidos de la cual se deriva la base de nucleótidos en la secuencia de referencia. Por ejemplo, la 5-metil citosina se considera "idéntica" a la citosina a los efectos de calcular el porcentaje de identidad. De manera similar, las uridinas modificadas que se muestran en la figura 12 se consideran idénticas entre sí a los efectos de determinar el porcentaje de identidad. La secuencia de referencia puede ser cualquiera de las secuencias de nucleótidos que se muestran en las SEQ ID NO:1 a 437.

[0202] En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona un aptámero de PDGF que, al unirse a PDGF, modula una función de PDGF. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF descrito en esta invención inhibe la fosforilación mediada por PDGF de un receptor de PDGF, tal como PDGF Ra o PDGF Rp. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF descrito en esta invención inhibe la fosforilación de PDGF Rp mediada por PDGF. En diversas realizaciones, el aptámero de PDGF modula una función de PDGF in vivo, tal como inhibir la fosforilación del receptor mediada por PDGF in vivo. En diversas realizaciones, el aptámero de PDGF tiene una secuencia seleccionada de las secuencias de las SEQ ID NO:1 a 437. En diversas realizaciones, el aptámero de PDGF se selecciona de los aptámeros que se muestran en las tablas 1 y 2. En diversas realizaciones, el aptámero de PDGF se selecciona de los aptámeros que se muestran en la tabla 1. En algunas realizacionesel aptámero de PDGF comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o al menos 30 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO:1 a 1 a 499 y 517 a 545. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF consiste en al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o al menos 30 nucleótidos contiguos que son idénticos en la secuencia de nucleobases a una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO:1 a 1 a 499 y 517 a 545. En algunas realizaciones, el aptámero de PDGF comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o al menos 30 nucleótidos contiguos de un aptámero que se muestra en la tabla 1, 2, 6, 7, 8 o 9. En algunas realizaciones, el aptámero de PDGF comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o al menos 30 nucleótidos contiguos de un aptámero que se muestra en la tabla 1 o un aptámero que se muestra en una de las tablas 6 a 9 que se une a PDGF con una afinidad (Kd) inferior a 10 nM. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF consiste en al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o al menos 30 nucleótidos contiguos de un aptámero que se muestra en la tabla 1, 2, 6, 7, 8 o 9. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF consiste en al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o al menos 30 nucleótidos contiguos de un aptámero que se muestra en la tabla 1 o un aptámero que se muestra en una de las tablas 6 a 9 que se une a PDGF con una afinidad (Kd) inferior a 10 nM.

[0203] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF tiene una secuencia de nucleobases seleccionada de las secuencias de las SEQ ID NOS. 500 a 512; 761 y 762. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF tiene la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO:1 a 1 a 499 y 517 a 545. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF es al menos un 95 % idéntico, al menos un 90 % idéntico, al menos un 85 % idéntico, al menos un 80 % idéntico o al menos un 75 % idéntico a cualquiera de las SEQ ID NO:1 a 499 y 517 a 545. En cualquiera de las realizaciones de esta invención, un aptámero de PDGF puede comprender nucleótidos adicionales u otros restos químicos en el extremo 5', el extremo 3' o tanto el extremo 5' como el extremo 3' del aptámero.

[0204] El aptámero de PDGF puede contener cualquier número de nucleótidos además de la región de unión a PDGF. En diversas realizaciones, el aptámero de PDGF puede incluir hasta aproximadamente 100 nucleótidos, hasta aproximadamente 95 nucleótidos, hasta aproximadamente 90 nucleótidos, hasta aproximadamente 85 nucleótidos, hasta aproximadamente 80 nucleótidos, hasta aproximadamente 75 nucleótidos, hasta aproximadamente 70 nucleótidos, hasta aproximadamente 65 nucleótidos, hasta aproximadamente 60 nucleótidos, hasta aproximadamente 55 nucleótidos, hasta aproximadamente 50 nucleótidos, hasta aproximadamente 45 nucleótidos, hasta aproximadamente 40 nucleótidos, hasta aproximadamente 35 nucleótidos, hasta aproximadamente 30 nucleótidos, hasta aproximadamente 25 nucleótidos o hasta aproximadamente 20 nucleótidos.

[0205] En algunas realizaciones, el aptámero de PDGF se selecciona de un aptámero que tiene características de unión y capacidad similares para tratar aterosclerosis, degeneración macular, fibrosis o afecciones cancerosas asociadas con PDGF como un aptámero seleccionado de las SEQ ID NO: 1 a 499 y 517 a 545. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF se une a la misma región de un monómero PDGF-B (en el contexto de un dímero PDGF-BB o PDGF-AB) que un aptámero seleccionado de los aptámeros que se muestran en las tablas 1, 2 y 6 a 9. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF se une a la misma región de un monómero PDGF-B (en el contexto de un dímero PDGF-BB o PDGF-AB) que un aptámero seleccionado de los aptámeros que se muestran en la tabla 1. En algunas realizaciones, un aptámero de PDG^fse une a la misma región de un monómero PDGF-B (en el contexto de un dímero PDGF-BB o PDGF-AB) que un aptámero seleccionado de los aptámeros que se muestran en la tabla 6. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGf se une a la misma región de un monómero PDGF-B (en el contexto de un dímero PDGF-BB o PDGF-AB) que el aptámero de PDGF 4149-8_260. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF se une a una región de PDGF-B que comprende los aminoácidos 24 a 86 de PDGF-B. En algunas de dichas realizaciones, el aptámero de PDGF compite por la unión a PDGF con el aptámero de PDGF 4149-8_260. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF se une a PDGF-B con menos del 15 %, menos del 14 %, menos del 13 %, menos del 12 %, menos del 11 %, menos del 10 %, menos del 9 %, menos del 8 %, menos del 7 % o menos del 6 % de contactos polares con átomos de contacto con proteínas. Los contactos polares se definen como la suma de enlaces de hidrógeno e interacciones de carga-carga. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF se une a PDGF-B con una relación de contactos polares con respecto al área de interfaz inferior a 0,01, inferior a 0,009, inferior a 0,008, inferior a 0,007 o inferior a 0,006. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF se une a la misma región de un monómero PDGF-B (en el contexto de un dímero PDGF-BB o PDGF-AB) que el aptámero de PDGF 5169-4_26.

[0206] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF tiene cualquier combinación de las siguientes características:

(a) se une a una región de PDGF-B que comprende los aminoácidos 24 a 86 de PDGF-B;

(b) compite por la unión a PDGF con el aptámero de PDGF 4149-8_260;

(c) compite por la unión a PDGF con el aptámero de PDGF 5169-4_26;

(d) se une a PDGF-B con una relación de contactos polares con respecto al área de interfaz inferior a 0,01, inferior a 0,009, inferior a 0,008, inferior a 0,007 o inferior a 0,006; y/o

(e) se une a PDGF-B con menos del 15 %, menos del 14 %, menos del 13 %, menos del 12 %, menos del 11 %, menos del 10 %, menos del 9 %, menos del 8 %, menos del 7 % o menos del 6 % de contactos polares con átomos de contacto de proteínas.

[0207] El aptámero de PDGF se puede seleccionar para tenercualquier constante de disociación adecuada (Kd) para PDGF. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF tiene una constante de disociación (Kd) para PDGF inferior a 30 nM, inferior a 25 nM, inferior a 20 nM, inferior a 15 nM, inferior a 10 nM, inferior a 9 nM, inferior a 8 nM, inferior a 7 nM, inferior a 6 nM, inferior a 5 nM, inferior a 4 nM, inferior a 3 nM, inferior a 2 nM o inferior a 1 nM. Las constantes de disociación se pueden determinar con un ensayo de unión usando una titulación de múltiples puntos y ajustando la ecuación y = (máx - min)(proteína)/(Kd proteina) min como se describe en el ejemplo 3, más adelante. En algunas realizaciones, el aptámero de PDGF es un aptámero con una Kd que es menor o igual que la Kd de un aptámero que se muestra en cualquiera de las tablas 1,2 o 6 a 9. En algunas realizaciones, el aptámero de PDGF es un aptámero con una Kd que es menor o igual que la Kd de un aptámero que se muestra en la tabla 1 o tabla 6.

[0208] El aptámero 4149-8_1 se une en una estequiometría 1:1 con un monómero de PDGF. Dado que el PDGF forma un homodímero estrecho que se requiere para la reacción con sus receptores diana, se podría lograr una inhibición más eficiente de la actividad de PDGF mediante el uso de una forma dimérica u otra forma multimérica del aptámero 4149-8_1. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el aptámero de PDGF es una multimerización de cualquier combinación de las secuencias del aptámero 4149-8_1, 4149-8_379 y las SEQ ID NO 500 a 512. En algunas realizaciones, una construcción de aptámero comprende un primer aptámero seleccionado de cualquiera de los aptámeros de PDGF descritos en esta invención, y un segundo aptámero que comprende cualquiera de los aptámeros de PDGF descritos en esta invención, donde el primer aptámero y el segundo aptámero pueden ser iguales o diferentes. El primer aptámero y el segundo aptámero de la construcción de aptámero de PDGF pueden estar unidos de forma covalente o no covalente. En la técnica se conocen enlaces ejemplares no limitantes y/o se describen en esta invención. En algunas realizaciones, una construcción de aptámero de PDGF puede ser capaz de unirse a dos monómeros de PDGF simultáneamente. En algunas realizaciones, una construcción de aptámero de PDGF se une a PDGF con una afinidad (Kd) inferior a 10 nM.

APTÁMEROS DE VEGF EJEMPLARES

[0209] Los aptámeros de VEGF de la presente descripción se identificaron usando el procedimiento SELEX mejorado para identificar aptámeros que tienen constantes de disociación lentas como se describe en el ejemplo 7, que describe un procedimiento representativo para la selección y producción de un aptámero que se une a VEGF con una tasa de disociación lenta.

[0210] Se truncó un clon de un experimento Nap-dU VEGF-121 SELEX a una secuencia mínima de 29 nucleótidos. Este SOMAmer se une a VEGF-121 y VE^gF-165 con alta afinidad (valores de Kd de 90 pM y 20 pM, respectivamente). El SOMAmer también inhibe de manera potente la capacidad de ambas isoformas de VEGF para inducir la fosforilación de VEGFR2 en células endoteliales de la vena umbilical humana in vitro (véase el ejemplo 9), que apoya la noción de que se une y bloquea el dominio de unión al receptor en VEGF.

[0211] La presente descripción proporciona la primera identificación de un aptámero inhibidor de VEGF-121. Por lo tanto, los presentes aptámeros de VEGF representan inhibidores amplios de VEGF, similares a fármacos basados en proteínas como bevacizumab (Avastin®), ranibizumab (Lucentis®) y aflibercept (Eylea®) (Papadopoulos y col. (2012) Angiogenesis 15:171; Yu y col. (2011) Biochem. Biophys. Res. Commun. 408:276. Por lo tanto, los presentes aptámeros de VEGF pueden inhibir más eficazmente la señalización de VEGF que Macugen®, que es un inhibidor selectivo de VEGF-165.

[0212] Un clon truncado del exitoso experimento Nap-dU VEGF-121 SELEX proporcionó una secuencia de 29 nucleótidos. Este aptámero (o SOMAmer) (4867-31 se une a VEGF-121 y VEGF-165 con alta afinidad (valores de K^d de 90 pM y 20 pM, respectivamente). Este SOMAmer también inhibe de manera potente la capacidad de ambas isoformas de VEGF para inducir la fosforilación de VEGFR2 en células endoteliales de la vena umbilical humana in vitro, que apoya el concepto de que se une y bloquea el dominio de unión al receptor en VEGF.

[0213] El aptámero 4867-31_192 se une en una estequiometría 1:1 con un monómero de VEGF. Dado que VEGF forma un homodímero estrecho que se requiere para la reacción con sus receptores diana, se podría lograr una inhibición más eficiente de la actividad de VEGF mediante el uso de una forma dimérica u otra forma multimérica del aptámero 4867-31_192. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el aptámero de VEGF es una multimerización de cualquier combinación de las secuencias del aptámero 4867-31_192, SEQ ID NO 513 a 516. En algunas realizaciones, una construcción de aptámero comprende un primer aptámero seleccionado de cualquiera de los aptámeros de VEGF descritos en esta invención, y un segundo aptámero que comprende cualquiera de los aptámeros de VEGF descritos en esta invención, donde el primer aptámero y el segundo aptámero pueden ser iguales o diferentes. El primer aptámero y el segundo aptámero de la construcción de aptámero de VEGF pueden estar unidos de forma covalente o no covalente. En la técnica se conocen enlaces ejemplares no limitantes y/o se describen en esta invención. En algunas realizaciones, una construcción de aptámero de VEGF puede ser capaz de unirse a dos monómeros de VEGF simultáneamente. En algunas realizaciones, una construcción de aptámero de VEGF se une a VEGF con una afinidad (Kd) inferior a 10 nM.

[0214] En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF se une a VEGF-121 con una Kd inferior a 10 nM. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende uno o más nucleótidos modificados. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende uno o más nucleótidos modificados que comprenden una modificación hidrófoba. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende una o más pirimidinas modificadas. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende una o más pirimidinas modificadas que se muestran en la figura 12. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende una o más pirimidinas modificadas que se muestran en la figura 12, grupos II a V. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende una o más pirimidinas modificadas que se muestran en la figura 12, grupos III a V. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende una o más pirimidinas modificadas que se muestran en la figura 12, grupos III y IV. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende una o más (N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridinas (NapdUs).

[0215] En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF comprende la secuencia:

5'-GZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGG-3' (SEQ ID NO. 513)

donde cada Z es una pirimidina modificada;

Q se selecciona de cualquier nucleótido modificado o no modificado y un enlazador C²-C⁵⁰sustituido o no sustituido, o está ausente;

cada E se selecciona independientemente de una G y un enlazador C²-C⁵⁰sustituido o no sustituido;

D se selecciona de A y un enlazador C²-C⁵⁰sustituido o no sustituido; y

R se selecciona de entre cualquier nucleótido modificado o no modificado y un enlazador C²-C⁵⁰sustituido o no sustituido.

[0216] En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF comprende una secuencia seleccionada de:

5'-CGZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZG-3' (SEQ ID NO. 514);

5'-GZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGG-3' (SEQ ID NO. 513);

5'-CGZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGG-3' (SEQ ID NO. 515); y

5'-CCGZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGG-3' (SEQ ID NO. 516);

donde Z, Q, E, D y R son como se definió anteriormente.

[0217] En algunas realizaciones, Z es una uridina modificada. En algunas realizaciones, cada Z se selecciona independientemente de las pirimidinas modificadas en C-5 tal como se definen en esta invención. En algunas realizaciones, cada Z se selecciona independientemente de:

5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU),

5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-fenetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PEdU),

5-(N-tiofenilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThdU),

5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (iBudU),

5-(N-tirosilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TyrdU),

5-(N-3,4-metilendioxibencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (MBndU),

5-(N-4-fluorobencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (FBndU),

5-(N-3-fenilpropilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (PPdU),

5-(N-imidizoliletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ImdU)

5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-desoxiuridina (T rpdU),

5-(N-R-treoninilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThrdU),

5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-fluorouridina,

cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxiamida)-2'-desoxiuridina,

5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU),

5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2'-desoxiuridina),

5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NapdU),

5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NEdU),

5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NEdU),

5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BFdU),

5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BTdU),

5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina y

5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina.

[0218] En algunas realizaciones, cada Z se selecciona independientemente de las pirimidinas modificadas que se muestran en la figura 12, grupos II a V. En algunas realizaciones, cada Z se selecciona independientemente de las pirimidinas modificadas que se muestran en la figura 12, grupos III a V. En algunas realizaciones, al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete o al menos ocho Z son 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU). En algunas realizaciones, cada Z se selecciona independientemente de las pirimidinas modificadas que se muestran en la figura 12, grupos III a IV. En algunas realizaciones, cada Z es 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU).

[0219] Un enlazador o espaciador C²-C⁵⁰puede ser una estructura principal que comprende una cadena de 2 a 50 átomos de carbono (C²-C⁵⁰) (cadena saturada, insaturada, lineal, ramificada o cíclica), de 0 a 10 grupos arilo, de 0 a 10 grupos heteroarilo y de 0 a 10 grupos heterocíclicos, que comprenden opcionalmente un enlace éter (-O-), (por ejemplo, una o más unidades de alquilenglicol, que incluyen, pero no se limitan a, una o más unidades de etilenglicol -O-(CH²CH²O)-; una o más unidades de 1,3-propanodiol -O-(CH²CH²CH²O)-. etc.); un enlace amina (-NH-); un enlace amida (-NC(O)-); y un enlace tioéter (-S-); etc.; donde cada átomo de carbono de la estructura principal puede estar independientemente no sustituido (es decir, que comprende sustituyentes -H) o puede estar sustituido con uno o más grupos seleccionados de un alquilo C¹a C³, -OH, -NH², -SH, -O-(alquilo C¹a C6), -S-(alquilo C¹a C6), halógeno, -OC(O) (alquilo C¹a C6), -NH-(alquilo C¹a C6) y similares. En algunas realizaciones, un enlazador C²-C⁵⁰es un enlazador C²-C²⁰, un enlazador C²-C¹⁰, un enlazador C²-C⁸, un enlazador C²-C⁶, un enlazador C²-C⁵, un enlazador C²-C⁴o un enlazador C³, donde cada carbono puede sustituirse independientemente como se describió anteriormente.

[0220] En algunas realizaciones, cada enlazador C²-C⁵⁰sustituido o no sustituido se selecciona independientemente de un enlazador C²-C²⁰sustituido o no sustituido, un enlazador C²-C¹⁰sustituido o no sustituido, un enlazador C²-C⁸sustituido o no sustituido, un enlazador C²-C⁶sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C5 sustituido o no sustituido, un enlazador C²-C⁴sustituido o no sustituido y un enlazador C3 sustituido o no sustituido. En algunas realizaciones, cada enlazador C²-C⁵⁰sustituido o no sustituido es un enlazador C²-C¹⁰sustituido o no sustituido. En algunas de dichas realizaciones, cada enlazador C²-C¹⁰sustituido o no sustituido es un enlazador C²-C8 sustituido o no sustituido, un enlazador C²-C⁶sustituido o no sustituido, un enlazador C²-C⁵sustituido o no sustituido, un enlazador C²-C⁴sustituido o no sustituido o un enlazador C³sustituido o no sustituido.

[0221] En algunas realizaciones, uno o más nucleósidos de un aptámero de VEGF comprenden una modificación seleccionada de una modificación de azúcar de posición 2' (tal como un 2'-amino (²-NH²), un 2'-fluoro (2'-F) o un 2'-O-metilo (2'-OMe)), una modificación en una amina exocíclica de citosina, una modificación de enlace internucleósido y una 5-metil-citosina. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF comprende una caperuza 3', una caperuza 5' y/o una desoxitimidina invertida en el extremo 3'.

[0222] En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF comprende al menos un enlace internucleósido modificado. En algunas realizaciones, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco enlaces internucleósidos son enlaces fosforotioato.

[0223] En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF tiene una secuencia seleccionada de las secuencias que se muestran en las tablas 10 a 14. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF tiene una secuencia seleccionada de las secuencias que se muestran en las tablas 10 a 14 que tienen una Kd inferior a 10 nM. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF tiene una secuencia que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a las secuencias que se muestran en las tablas 10 a 14. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF tiene una secuencia que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a las secuencias que se muestran en las tablas 10 a 14 que tienen una Kd inferior a 10 nM. El porcentaje de identidad se determina como se describió anteriormente para los aptámeros de PDGF, excepto que las secuencias de referencia son las secuencias de aptámeros de VEGF que se muestran en las tablas 10 a 14, tales como las secuencias que tienen una Kd inferior a 10 nM.

[0224] En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona un aptámero de VEGF que, al unirse a VEGF, modula una función de VEGF. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF inhibe la fosforilación mediada por VEGF de un receptor de VEGF, tal como VEGFR1 o VEGFR2. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF inhibe la fosforilación del receptor de VEGF mediada por VEGF. En diversas realizaciones, el aptámero de VEGF modula una función de VEGF in vivo, tal como inhibir la fosforilación del receptor mediada por VEGF in vivo. En diversas realizaciones, el aptámero de VEGF tiene una secuencia seleccionada de las secuencias que se muestran en las tablas 10 a 14. En diversas realizaciones, el aptámero de VEGF se selecciona de los aptámeros que se muestran en las tablas 10 a 14 que tienen una Kd inferior a 10 nM. En diversas realizaciones, el aptámero de VEGF se selecciona de los aptámeros que se muestran en las tablas 10 a 14. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o al menos 30 nucleótidos contiguos de una secuencia que se muestra en las tablas 10 a 14 que tienen una Kd inferior a 10 nM. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF consiste en al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o al menos 30 nucleótidos contiguos que son idénticos en la secuencia de nucleobases a una secuencia que se muestra en las tablas 10 a 14 que tienen una Kd inferior a 10 nM. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o al menos 30 nucleótidos contiguos de un aptámero que se muestra en las tablas 10 a 14. En algunas realizacioness, el aptámero de VEGF comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o al menos 30 nucleótidos contiguos de un aptámero que se muestra en las tablas 10 a 14 que tienen una Kd inferior a 10 nM. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF consiste en al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o al menos 30 nucleótidos contiguos de un aptámero que se muestra en las tablas 10 a 14. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF consiste en al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o al menos 30 nucleótidos contiguos de un aptámero que se muestra en las tablas 10 a 14 que tiene una Kd inferior a 10 nM.

[0225] En cualquiera de las realizaciones de esta invención, un aptámero de VEGF puede comprender nucleótidos adicionales u otros restos químicos en el extremo 5', el extremo 3' o tanto el extremo 5' como el extremo 3' del aptámero.

[0226] El aptámero de VEGF puede contener cualquier número de nucleótidos además de la región de unión a VEGF. En diversas realizaciones, el aptámero de VEGF puede incluir hasta aproximadamente 100 nucleótidos, hasta aproximadamente 95 nucleótidos, hasta aproximadamente 90 nucleótidos, hasta aproximadamente 85 nucleótidos, hasta aproximadamente 80 nucleótidos, hasta aproximadamente 75 nucleótidos, hasta aproximadamente 70 nucleótidos, hasta aproximadamente 65 nucleótidos, hasta aproximadamente 60 nucleótidos, hasta aproximadamente 55 nucleótidos, hasta aproximadamente 50 nucleótidos, hasta aproximadamente 45 nucleótidos, hasta aproximadamente 40 nucleótidos, hasta aproximadamente 35 nucleótidos, hasta aproximadamente 30 nucleótidos, hasta aproximadamente 25 nucleótidos o hasta aproximadamente 20 nucleótidos.

[0227] En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF se selecciona de un aptámero que tiene características de unión y capacidad similares para tratar aterosclerosis, degeneración macular, fibrosis y afecciones cancerosas asociadas con VEGF como un aptámero que se muestra en las tablas 10 a 14 tiene una Kd inferior a 10 nM. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF se une a la misma región de VEGF-121 que un aptámero seleccionado de los aptámeros que se muestran en las tablas 10 a 14 que tienen una Kd inferior a 10 nM. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF se une a la misma región de un VEGF-121 que un aptámero de VEGF que se muestra en la tabla 10, 11, 12, 13 o 14 que tiene una Kd inferior a 10 nM. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF se une a la misma región de VeGf ^{- 121}que el aptámero de VEGF 4867-31_183.

[0228] El aptámero de VEGF se puede seleccionar para tener cualquier constante de disociación adecuada (Kd) para VEGF. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF tiene una constante de disociación (Kd) para VEGF-121 inferior a 30 nM, inferior a 25 nM, inferior a 20 nM, inferior a 15 nM, inferior a 10 nM, inferior a 9 nM, inferior a 8 nM, inferior a 7 nM, inferior a 6 nM, inferior a 5 nM, inferior a 4 nM, inferior a 3 nM, inferior a 2 nM o inferior a 1 nM. Las constantes de disociación se pueden determinar con un ensayo de unión usando una titulación de múltiples puntos y ajustando la ecuación y = (máx - min)(proteína)/(Kd proteina) min como se describe en el ejemplo 3, más adelante.

[0229] En algunas realizaciones, una construcción de aptámero comprende un primer aptámero seleccionado de cualquiera de los aptámeros de VEGF descritos en esta invención, y un segundo aptámero que comprende cualquiera de los aptámeros de VEGF descritos en esta invención, donde el primer aptámero y el segundo aptámero pueden ser iguales o diferentes. El primer aptámero y el segundo aptámero de la construcción de aptámero de VEGF pueden estar unidos de forma covalente o no covalente. En la técnica se conocen enlaces ejemplares no limitantes y/o se describen en esta invención. En algunas realizaciones, una construcción de aptámero de VEGF puede ser capaz de unirse a dos monómeros de VEGF simultáneamente. En algunas realizaciones, una construcción de aptámero de VEGF se une a VEGF con una afinidad (Kd) inferior a 10 nM.

CONSTRUCCIONES DE APTÁMEROS DE PDGF/VEGF EJEMPLARES

[0230] Existe evidencia considerable de que un bloqueo más eficiente de la angiogénesis ocular y asociada a tumores, junto con una nueva regresión de los vasos sanguíneos, es posible con la inhibición combinada de las vías de señalización de VEGF y PDGF-B (Bergers, G., y col. (2003) J. Clin. Invest. 111:1287; Jo, N., y col. (2006) Am. J. Pathol. 168:2036). Este efecto está mediado por la interrupción de la estrecha asociación de célula-célula entre las células endoteliales, que forman brotes capilares iniciales, y las células periendoteliales (o pericitos), que rodean los nuevos vasos sanguíneos a medida que maduran, haciendo que los vasos sanguíneos sean menos susceptibles a los inhibidores del VEGF (Benjamin, L. E., y col. (1998) Development 125:1591; Benjamin, L. E., y col. (1999) J. Clin. Invest. 103:159). Los aptámeros descritos en esta invencion pueden formar la base de dicho inhibidor dual.

[0231] En algunas realizaciones, una construcción de aptámeros de PDGF/VEGF comprende cualquiera de los aptámeros de PDGF descritos en esta invención unidos a cualquiera de los aptámeros de VEGF descritos en esta invención. En algunas realizaciones, una construcción de aptámero de PDGF/VEGF comprende cualquiera de los aptámeros de PDGF que se muestran en la tabla 1 unidos a cualquiera de los aptámeros de VEGF que se muestran en la tabla 10 a 14 que tienen una Kd inferior a 10 nM. El enlace puede ser covalente o no covalente.

[0232] La construcción de aptámero de PDGF/VEGF puede comprender un aptámero de PDGF y un aptámero de VEGF en cualquier orientación, tal como un aptámero de PDGF unido en o cerca de su extremo 3' a un punto en o cerca del extremo 5' de un aptámero de VEGF, o un aptámero de VEGF unido en o cerca de su extremo 3' a un punto en o cerca del extremo 5' de un aptámero de PDGF, o cualquier otra orientación que preserve las propiedades de unión de cada aptámero de la construcción.

[0233] En algunas realizaciones en las que el enlace es covalente, la construcción de aptámero de PDGF/VEGF puede unirse a través de un enlace fosfato o fosforotioato. También se contemplan muchos otros enlaces covalentes, tales como enlaces a través de diversos restos enlazadores, que incluyen, pero no se limitan a, enlazadores de hexaetilenglicol, enlazadores de polietilenglicol, enlazadores de hidrocarburos sustituidos o no sustituidos, etc. Un experto en la materia puede seleccionar un enlace covalente adecuado para unir un aptámero de PDGF a un aptámero de VEGF.

[0234] En algunas realizaciones, el aptámero de PDGF y el aptámero de VEGF están unidos mediante un enlace no covalente. Los enlaces no covalentes incluyen, pero no se limitan a, biotina/estreptavidina; péptidos/metales de unión a metales; oligonucleótidos modificados y/o no modificados hibridables; etc. Un experto en la materia puede seleccionar un enlace no covalente adecuado para unir un aptámero de PDGF a un aptámero de VEGF.

Composiciones farmacéuticas que comprenden aptámeros y construcciones de aptámeros

[0235] En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un aptámero o construcción de aptámero descrita en esta invención y al menos un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores adecuados se describen en "Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Twenty-first Edition", publicado por Lippincott Williams & Wilkins. Las composiciones farmacéuticas que incluyen al menos un aptámero o construcción de aptámero descrito en esta invención y al menos un portador farmacéuticamente aceptable también pueden incluir uno o más agentes activos que no son un inhibidor de PDGF o VEGF.

[0236] Los aptámeros descritos en esta invención se pueden utilizar en cualquier forma de dosificación farmacéuticamente aceptable, que incluye, pero no se limita a, formas de dosificación inyectables, dispersiones líquidas, geles, aerosoles, ungüentos, cremas, formulaciones liofilizadas, polvos secos, comprimidos, cápsulas, formulaciones de liberación controlada, formulaciones de fusión rápida, formulaciones de liberación retardada, formulaciones de liberación prolongada, formulaciones de liberación pulsátil, formulaciones mixtas de liberación inmediata y de liberación controlada, etc. Específicamente, los aptámeros descritos en esta invención se pueden formular: (a) para la administración seleccionada de cualquiera de la administración por vía oral, pulmonar, intravenosa, intraarterial, intratecal, intraarticular, rectal, oftálmica, colónica, parenteral, intracisterna, intravaginal, intraperitoneal, local, bucal, nasal y tópica; (b) en una forma de dosificación seleccionada de cualquiera de las dispersiones líquidas, geles, aerosoles, ungüentos, cremas, comprimidos, sobrecitos y cápsulas; (c) en una forma de dosificación seleccionada de cualquiera de las formulaciones liofilizadas, polvos secos, formulaciones de fusión rápida, formulaciones de liberación controlada, formulaciones de liberación retardada, formulaciones de liberación prolongada, formulaciones de liberación pulsátil y formulaciones mixtas de liberación inmediata y de liberación controlada; o (d) cualquier combinación de los mismos.

[0237] Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden comprender uno o más de los siguientes componentes: (1) un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; (2) agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; (3) antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; (4) agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; (5) amortiguadores tales como acetatos, citratos o fosfatos; y (5) agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. Una preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiple de vidrio o plástico.

[0238] Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable pueden incluir soluciones acuosas estériles (donde son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersión. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina amortiguada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una jeringabilidad fácil. La composición farmacéutica debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El término "estable", tal como se usa en esta invención, significa permanecer en un estado o condición que es adecuado para la administración a un sujeto.

[0239] El portador puede ser un disolvente o un medio de dispersión que incluye, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el manteniendo del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede llevar a cabo mediante diferentes agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, y sales inorgánicas tales como cloruro de sodio, en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr mediante la inclusión en la composición de un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

[0240] Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el reactivo activo (por ejemplo, un aptámero y/o una construcción de aptámero) en una cantidad adecuada en un disolvente adecuado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando al menos un aptámero y/o construcción de aptámero en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y cualquier otro ingrediente deseado. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos ejemplares de preparación son secado al vacío y liofilización los cuales produciránun polvo de un aptámero y/o una construcción de aptámero más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente filtrada estéril del mismo.

[0241] En algunas realizaciones, se formula un aptámero y/o una construcción de aptámero para inyección intravítrea. Las formulaciones adecuadas para la administración intravítrea se describen, por ejemplo, en. La administración ocular de fármacos se analiza, por ejemplo, en Rawas-Qalaji y col. (2012) Curr. Eye Res. 37; 345; Bochot y col. (2012) J. Control Release 161:628; Yasukawa y col. (2011) Recent Pat. Drug Deliv. Formul. 5:1; y Doshi y col. (2011) Semin. Ophthalmol. 26:104. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que comprende un aptámero y/o una construcción de aptámero se administra mediante inyección intravítrea una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada cinco semanas, una vez cada seis semanas, una vez cada siete semanas, una vez cada ocho semanas, una vez cada nueve semanas, una vez cada 10 semanas, una vez cada 11 semanas, una vez cada 12 semanas o con menos frecuencia que una vez cada 12 semanas.

[0242] Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Pueden encerrarse, por ejemplo, en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. A los efectos de la administración terapéutica oral, el aptámero y/o construcción de aptámero pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, troziscos o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un portador fluido para su uso como enjuague bucal, donde el compuesto en el portador fluido se aplica por vía oral y se agita y se expectora o traga. Pueden incluirse agentes de unión farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes como parte de la composición.

[0243] Para la administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de un aerosol pulverizado desde un recipiente o dispensador a presión que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, un líquido nebulizado o un polvo seco de un dispositivo adecuado. Para la administración transmucosa o transdérmica, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a permear. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa se puede lograr mediante el uso de aerosoles nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los reactivos activos se formulan en ungüentos, pomadas, geles o cremas, como se conoce generalmente en la técnica. Los reactivos también se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para la administración rectal.

[0244] En algunas realizaciones, un aptámero y/o una construcción de aptámero se prepara con un portador que protegerá contra la eliminación rápida del cuerpo. Por ejemplo, se puede usar una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etilenvinilacetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los procedimientos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la materia. Los materiales también se pueden obtener en el mercado de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc.

[0245] Las suspensiones liposómicas (incluidos los liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) también se pueden utilizar como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar según procedimientos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en la patente de los EE.UU. n .° 4.522.811.

[0246] Además, las suspensiones de un aptámero y/o una construcción de aptámero se pueden preparar como suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. También se pueden usar polímeros amino policatiónicos no lipídicos para la administración. Opcionalmente, la suspensión también puede incluir estabilizadores o agentes adecuados para aumentar la solubilidad de los compuestos y permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.

[0247] En algunos casos, puede ser especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma unitaria de dosificación tal como se usa en esta invención, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de un aptámero y/o construcción de aptámero calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de aptámeros y/o construcciones descritas en esta invención están dictadas por y dependen directamente de las características del aptámero y/o construcción de aptámero particular y el efecto terapéutico particular que se debe lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica de componer dicho agente activo para el tratamiento de individuos.

[0248] Las composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un aptámero y/o construcción de aptámero pueden incluir uno o más excipientes farmacéuticos. Los ejemplos de dichos excipientes incluyen, pero no se limitan a, agentes de unión, agentes de relleno, agentes lubricantes, agentes de suspensión, edulcorantes, agentes saborizantes, conservantes, amortiguadores, agentes humectantes, desintegrantes, agentes efervescentes y otros excipientes. Dichos excipientes son conocidos en la técnica. Los excipientes ejemplares incluyen: (1) agentes de unión que incluyen diversas celulosas y polivinilpirrolidona reticulada, celulosa microcristalina, tal como Avicel® PH101 y Avicel® PH102, celulosa microcristalina silicificada (ProSolv SMCC™), goma tragacanto y gelatina; (2) agentes de relleno tales como diversos almidones, lactosa, lactosa monohidrato y lactosa anhidra; (3) agentes desintegrantes tales como ácido algínico, Primogel, almidón de maíz, polivinilpirrolidona ligeramente reticulada, almidón de patata, almidón de maíz y almidones modificados, croscarmelosa sódica, povidona cruzada, glicolato de almidón sódico y mezclas de los mismos; (4) lubricantes, que incluyen agentes que actúan sobre la fluidez de un polvo a comprimir, y que incluyen estearato de magnesio, dióxido de silicio coloidal, tal como Aerosil® 200, talco, ácido esteárico, estearato de calcio y gel de sílice; (5) deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; (6) conservantes, tales como sorbato de potasio, metilparabeno, propilparabeno, ácido benzoico y sus sales, otros ésteres de ácido parahidroxibenzoico tal como butilparabeno, alcoholes tales como alcohol etílico o bencílico, compuestos fenólicos tal como fenol, o compuestos cuaternarios tal como cloruro de benzalconio. (7) diluyentes tales como rellenos inertes farmacéuticamente aceptables, tales como celulosa microcristalina, lactosa, fosfato de calcio dibásico, sacáridos y/o mezclas de cualquiera de los anteriores; los ejemplos de diluyentes incluyen celulosa microcristalina, tal como Avicel® PH101 y Avicel® PH102; lactosa tal como lactosa monohidrato, lactosa anhidra y Pharmatose® DCL21; fosfato de calcio dibásico tal como Emcompress®; manitol; almidón; sorbitol; sacarosa; y glucosa; (8) agentes edulcorantes, que incluyen cualquier edulcorante natural o artificial, tal como sacarosa, sacarina sacarosa, xilitol, sacarina de sodio, ciclamato, aspartamo y acesulfamo; (9) agentes saborizantes, tales como menta, salicilato de metilo, saborizante de naranja, Magnasweet® (marca registrada de MAFCO), saborizante de goma de mascar, saborizantes de frutas y similares; y (10) agentes efervescentes, que incluyen parejas efervescentes tales como un ácido orgánico y un carbonato o bicarbonato. Los ácidos orgánicos adecuados incluyen, por ejemplo, ácidos cítricos, tartáricos, málicos, fumáricos, adípicos, succínicos y algínicos y anhídridos y sales ácidas. Los carbonatos y bicarbonatos adecuados incluyen, por ejemplo, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, carbonato de potasio, bicarbonato de potasio, carbonato de magnesio, carbonato de glicina de sodio, carbonato de L-lisina y carbonato de arginina. De manera alternativa, solo puede estar presente el componente de bicarbonato de sodio de la pareja efervescente.

[0249] En diversas realizaciones, las formulaciones descritas en esta invención son sustancialmente puras. Tal como se usa en esta invención, "sustancialmente puro" significa que el ingrediente activo (por ejemplo, un aptámero y/o una construcción de aptámero) es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición). En algunas realizaciones, una fracción sustancialmente purificada es una composición donde el ingrediente activo comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura incluirá más de aproximadamente el 80 % de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En diversas realizaciones, una composición sustancialmente pura incluirá al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o al menos aproximadamente el 99 % de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En diversas realizaciones, el ingrediente activo se purifica hasta homogeneidad (no se pueden detectar especies contaminantes en la composición mediante procedimientos de detección convencionales) donde la composición consiste esencialmente en una sola especie macromolecular.

Kits que comprenden aptámeros y construcciones de aptámeros

[0250] La presente descripción proporciona kits que comprenden cualquiera de los aptámeros y/o construcciones de aptámeros descritos en esta invención. Dichos kits pueden comprender, por ejemplo, (1) al menos un aptámero y/o construcciones de aptámeros; y (2) al menos un portador farmacéuticamente aceptable, tal como un disolvente o una solución. Los componentes adicionales del kit pueden incluir opcionalmente, por ejemplo: (1) cualquiera de los excipientes farmacéuticamente aceptables identificados en esta invención, tales como estabilizadores, amortiguadores, etc., (2) al menos un recipiente, vial o aparato similar para contener y/o mezclar los componentes del kit; y (3) un aparato para la administración.

Procedimientos de tratamiento

[0251] La presente descripción proporciona procedimientos para prevenir o tratar (por ejemplo, aliviar uno o más síntomas de) afecciones médicas mediante el uso de un aptámero o construcción de aptámero de PDGF, un aptámero o construcción de aptámero de VEGF y/o una construcción de aptámero de VEGF/PDGF. Los procedimientos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de dichos aptámeros y/o construcciones de aptámeros a un sujeto que lo necesita. Los aptámeros descritos también se pueden usar para terapia profiláctica. En algunas realizaciones, el aptámero y/o construcción de aptámero se administra por vía oral o intravenosa.

[0252] El aptámero y/o construcción de aptámero utilizado en procedimientos de tratamiento puede ser: un aptámero o construcción de aptámero de PDGF un aptámero o construcción de aptámero de VEGF, y/o una construcción de aptámero de VEGF/PDGF descritos en esta invención, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o un profármaco de los mismos.

[0253] El individuo o sujeto puede ser cualquier animal (doméstico, animal o silvestre), que incluye, pero no se limita a, gatos, perros, caballos, cerdos y ganado, y preferentemente seres humanos. Tal como se usan en esta invención, los términos paciente, individuo y sujeto se pueden usar indistintamente.

[0254] Tal como se usa en esta invención, "tratar" describe el manejo y cuidado de un paciente con la finalidad de tratar una enfermedad, afección o trastorno e incluye la administración de un aptámero y/o una construcción de aptámero para prevenir el inicio de los síntomas o complicaciones de una enfermedad, afección o trastorno; aliviar los síntomas o complicaciones de la enfermedad, afección o trastorno; o eliminar la presencia de la enfermedad, afección ^{o trastorno en el paciente. Más específicamente, "trata}r ^{incluye revertir, atenuar, aliviar, minimizar, suprimir o detener}al menos un síntoma o efecto perjudicial de una patología (trastorno), la progresión de la enfermedad, el agente causante de la enfermedad u otra afección anormal. El tratamiento generalmente se continúa siempre que los síntomas y/o la patología mejoren.

[0255] Tal como se usa en esta invención, "prevenir" significa prevenir en su totalidad o en parte; mejorar o controlar; reducir, rebajar o disminuir; o retardar o detener.

[0256] En diversas realizaciones, las composiciones y procedimientos descritos se utilizan para tratar enfermedades cardiovasculares, cánceres, fibrosis, enfermedades renales u oftalmológicas.

[0257] En algunas realizaciones, los compuestos descritos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, o profármacos, se pueden administrar en combinación con otros tratamientos que mejoran o erradican las afecciones de la enfermedad como se describió anteriormente. Las composiciones que incluyen los aptámeros y/o construcciones de aptámeros descritos pueden contener, por ejemplo, más de un aptámero. En algunos ejemplos, una composición que contiene uno o más aptámeros se administra en combinación con otro agente cardiovascular o agente anticanceroso o agente antifibrótico útil, etc. En general, las formas de dosificación actualmente disponibles de los agentes terapéuticos conocidos para su uso en dichas combinaciones serán adecuadas.

[0258] "Terapia de combinación" (o "co-terapia") incluye la administración de una composición de aptámero y/o construcción de aptámero y al menos un segundo agente como parte de un régimen de tratamiento específico destinado a proporcionar el efecto beneficioso de la co-acción de estos agentes terapéuticos. El efecto beneficioso de la combinación incluye, pero no se limita a, la co-acción farmacocinética o farmacodinámica resultante de la combinación de agentes terapéuticos. La administración de estos agentes terapéuticos en combinación típicamente se lleva a cabo durante un período de tiempo definido (generalmente minutos, horas, días o semanas dependiendo de la combinación seleccionada).

[0259] "Terapia de combinación" puede, pero generalmente no pretende abarcar la administración de dos o más de estos agentes terapéuticos como parte de regímenes de monoterapia separados que incidental y arbitrariamente resultan en las combinaciones de la presente descripción. "Terapia de combinación" pretende abarcar la administración de estos agentes terapéuticos de una manera secuencial, es decir, donde cada agente terapéutico se administra en un momento diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes terapéuticos, de una manera sustancialmente simultánea. La administración sustancialmente simultánea se puede lograr, por ejemplo, administrando al sujeto una dosis única que tiene una relación fija de cada agente terapéutico o en dosis múltiples y únicas para cada uno de los agentes terapéuticos.

[0260] El régimen de dosificación que utiliza los aptámeros y/o construcciones de aptámeros se selecciona conforme a una variedad de factores, que incluyen, por ejemplo, tipo, especie, edad, peso, género y afección médica del sujeto; la gravedad de la afección a tratar; la vía de administración; la función renal y hepática del sujeto; y el aptámero y/o construcciones de aptámeros particulares o sales de los mismos empleadas. Un médico o veterinario normalmente experto puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad efectiva de la composición necesaria para prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la afección.

[0261] En general, la dosificación, es decir, la cantidad terapéuticamente efectiva, varía de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del sujeto que se está tratando, por día.

EJEMPLOS

[0262] Los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención tal como la definen las reivindicaciones adjuntas. Todos los ejemplos descritos en esta invención se realizaron utilizando técnicas estándar, que se conocen bien y son habituales para los expertos en la materia. Las técnicas de biología molecular habituales descritas en los siguientes ejemplos se pueden llevar a cabo como se describe en los manuales de laboratorio estándar, tales como Sambrook y col. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Ejemplo 1. Selección de aptámeros de PDGF y secuencias

[0263] Preparación de mezclas candidatas: se preparó una mezcla candidata de oligonucleótidos de ssDNA parcialmente aleatorizados mediante extensión de polimerasa de un cebador de ADN recocido a una plantilla de ssDNA biotinilada.

[0264] Condiciones SELEX: SomaLogic Inc seleccionó los aptámeros para la proteína PDGF-BB (R&D Systems), como se describe (Goldy col. (2010) PLoS One 5:e15004), de una biblioteca que contiene una región aleatoria de 40 nucleótidos en la que Bn-dU se sustituyó por dT. El cebador directo fue 5'-CGCCCTCGTCCCATCTC (SEQ ID NO:837), y el cebador inverso fue 5'-CGTTCGGTTGGTGTGTTC (SEQ ID NO:838). La proteína PDGF-BB se biotiniló y se dividió en perlas de estreptavidina MyOne-SA (Dynal). La selección preferencial de aptámeros con tasas de disociación lentas se logró usando uno desafío cinético donde los complejos de proteína-ADN se incubaron en presencia de sulfato de dextrano 10 mM a 37 °C con tiempos de incubación aumentados y concentraciones de proteína disminuidas en rondas sucesivas. El desafío cinético se inició en la ronda 4 de la selección y continuó durante la 8a ronda final con tiempos de incubación de la siguiente manera: 5 minutos ronda 4, 15 minutos rondas 5-7, 30 minutos ronda 8.

[0265] Secuenciación del grupo: se clonaron secuencias de oligonucleótidos del grupo de la 8a ronda y se secuenciaron varios clones. Esto condujo a la identificación de una familia de secuencias relacionadas, como se ejemplifica en el 4149-8_1.

[0266] Secuenciación profunda del grupo PDGF SELEX: para evaluar más completamente las secuencias dentro de la familia de aptámeros 4149-8_1, el grupo de la 8a ronda se secuenció usando tecnología de pirosecuenciación 454. El a Dn del grupo se amplificó con 454 cebadores y el producto de PCR se purificó y normalizó usando una placa de normalización Sequal (Invitrogen, Cat# A10510-01). El eluido se corrió en un gel para confirmar el tamaño y la pureza de cada amplicón. El producto de PCR purificado se secuenció en la instalación de pirosecuenciación 454 en el Health Science Center de la Universidad de Colorado en Aurora CO.

[0267] Las 454 secuencias se alinearon con 4149-8_1 mediante análisis CLUSTAL. El conjunto de datos de secuencias del conjunto contenía 10.803 secuencias de longitud completa (es decir, aquellas secuencias que contenían ambas secuencias cebadoras) de las cuales 3.839 eran únicas. En estas 3.839 secuencias únicas se buscó el motivo "5'-ZACNCGCGZZZAGCG" (identidad = 0,65) (SEQ ID NO:839) y a continuación "ZZ" (identidad = 1,0) aguas arriba de este. Se encontraron 436 secuencias que contenían ambos motivos. Además, otras 58 secuencias contenían solo el primer patrón, pero con una identidad generalmente baja y sin una estructura de horquilla evidente aguas arriba. Las 436 secuencias se alinearon a continuación de la siguiente manera, (1) con respecto a "ZZ", (2) con respecto al centro del bucle y (3) con respecto a "ZACNCGCGZZZAZAGCG" (SEQ ID NO:839). Para todas las secuencias, el porcentaje de identidad en cada posición con 4149-8_1 se calculó como se indica en la figura 3A. Las tablas 1 y 2 enumeran una serie de secuencias representativas de la familia de secuencias de aptámeros 4149-8_1.

[0268] Síntesis de aptámeros: los reactivos de amidita de desoxiuridina-5-carboxamida modificados utilizados para la síntesis en fase sólida se prepararon mediante: condensación de 5'- 0-(4,4'-dimetoxitritil)-5-trifluoroetoxicarbonil-2'-desoxiuridina (Nomura y col. (1997) Nucl. Acids Res. 25:2784) con la amina primaria apropiada (RNH²,1,2 eq; Et³N, 3 eq.; acetonitrilo; 60 °C 4h); fosfitidilación 3'- O- con 2-cianoetil-N,N-diisopropilclorofosforamida (1,2 eq.; iPr²EtN, 3 eq.; CH²O ²; -10 a 0 °C; 4 h); y purificación mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice neutro (Still, y col. (1978) J. Org. Chem., 43:2923). Los aptámeros se prepararon mediante síntesis en fase sólida usando el procedimiento de la fosforamidita (Beaucage and Caruthers (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859) con algunos ajustes al protocolo para tener en cuenta las modificaciones básicas únicas descritas en esta invención. La destritilación se logró con ácido dicloroacético al 10 % en tolueno durante 45 segundos; se logró el acoplamiento con fosforamiditas 0,1 M en acetonitrilo:diclorometano 1:1 activado por 5-bencilmercaptotetrazol y se dejó reaccionar 3 veces durante 5 minutos; el bloqueo y la oxidación se realizaron según las recomendaciones del proveedor del instrumento. La desprotección se efectuó con t-butilamina:metanol:agua 1:1:2 (Mullah 1998), se hizo reaccionar durante 24 horas a 37 grados centígrados. Los aptámeros se sintetizaron a una escala de 200 nmol y se purificaron a partir de un gel de poliacrilamida usando sombreado UV como se describe (Fitzwater y Polisky (1996) Methods Enzymol. 267:275) con Costar Spin-X (sin incluir lana de vidrio siliconada o prefiltro de polipropileno hilado) y concentración de Amicon YM3 según las recomendaciones del fabricante.

[0269] Relación de actividad estructura de nucleótidos modificados y maduración de afinidad: para examinar la contribución de cada una de las ocho cadenas laterales de bencilo a la unión, se realizó otra serie de sustituciones puntuales sistemáticas sintetizando químicamente variantes de posición 5 con una biblioteca personalizada de fosforamiditas dU modificadas. Para este fin, se diseñó una biblioteca para permitir sondear el microentorno de cada una de las posiciones variando el tamaño, la polaridad, la disposición de los donantes y aceptadores de enlaces H, la longitud del enlazador y la orientación de los sustituyentes de posición 5. Al elegir los grupos funcionales para este análisis, se pretendió incluir variaciones sobre un tema de la modificación original (en este caso, el grupo bencilo), cadenas laterales de aminoácidos sobrerrepresentadas en regiones determinantes de complementariedad (CDR) de anticuerpos (como triptófano y tirosina) (Mian, IS, y col. (1991) J. Mol. Biol. 217:133; Ramaraj T. y col (2012) Biochim. Biophys. Acta. 1824:520) y fragmentos "privilegiados" de fármacos de molécula pequeña (Welsch y col. (2010) Curr. Opin. Chem. Biol. 14:347). En cierto sentido, se intenta combinar elementos de maduración de afinidad en anticuerpos y optimización de la relación de estructura-actividad (SAR) en química medicinal. Aunque se utilizó un solo nucleótido modificado durante SELEX, la optimización posterior a SELEX está limitada solo por la accesibilidad sintética de los monómeros modificados y la compatibilidad con la síntesis en fase sólida.

[0270] El efecto de las sustituciones individuales del grupo bencilo con catorce restos alternativos en la posición 5 se resume en las figuras 1C y D y la figura 6B, con afinidades relativas expresadas como tasas constantes de disociación y fosforilación relativa de PDGF Rp expresada como tasas porcentuales de fosfo-PDGF Rp. La sustitución con dT, que solo tiene un grupo metilo en la posición 5, representa el cambio más drástico, y en ese sentido es comparable a la mutagénesis de barrido de alanina en proteínas (Cunningham, B.C. y col. (1989) Science 243:1330). No es sorprendente que esta fuera la sustitución menos tolerada en seis de las ocho posiciones de nucleótidos modificados. Las excepciones fueron los nucleótidos 1 y 7, donde esta sustitución fue bien tolerada. Estas dos posiciones también toleraron muchas otras sustituciones, con algunos reemplazos que producen una mejora de hasta 5 veces en la afinidad de unión (figura 6B). Por el contrario, los nucleótidos 8, 17 y 18 mostraron la mayor sensibilidad a los cambios. A continuación, se combinaron las mejores sustituciones individuales, produciendo variantes adicionales que incluyen 4149-8_255 y 4149-8_260 (figura 6b ). El aptámero 4149-8_260, que combinó fenetil-dU (PedU) en el nucleótido 17 y tiofeno-dU (Th-dU) en el nucleótido 18, mostró una excelente unión a PDGF-BB y PDGF-AB (figura 6B). Cabe señalar que la afinidad del SOMAmer seleccionado originalmente ya era tan alta (Kd=20 pM) que se acercó al límite de detección del ensayo de unión, por lo que es posible que el grado de mejora de afinidad se subestime. Se han aplicado estrategias de optimización post-SELEX similares a otros SOMAmers con una unión inicial más débil (por ejemplo, valores de Kd que varían de 100 pM a >10 nM), y se han observado mejoras de afinidad de hasta 100 veces.

[0271] Homodímeros del aptámero de PDGF 4149-8_260 (SL5): dado que el PDGF forma un homodímero unido covalentemente, y dos SOMAmers se unen a cada homodímero de PDGF, se determinó el efecto sobre la unión de los SOMAmers homodimerizados. La afinidad de los homodímeros de aptámeros de PDGF podría mejorarse sustancialmente en comparación con la afinidad de los monómeros correspondientes, debido a los efectos de avidez. La estructura cristalina mostró que los extremos 5' del SOMAmer estaban separados 38 A, mientras que los extremos 3' estaban separados 74 A. Conectar el extremo 5' a 3' requeriría al menos 63 A, ya que la ruta más corta entre los dos puntos bisectó la proteína. Se ordenaron dos tipos de homodímeros, basados en química fácilmente disponible. Estos eran 1) homodímeros de cabeza a cola conectados por dos a seis enlazadores Heg, que proporcionan ~20 A de distancia por Heg, y 2) homodímeros 3'-3' conectados a través de un soporte de doblador sintético, combinados con uno a tres Hegs. Los homodímeros de 4149-8_260 se probaron en el ensayo de unión PDGF-BB Zorbax. El ensayo de unión se realizó con una cantidad limitante de SOMAmer, y no distinguiría la unión de un SOMAmer por dímero de proteína frente a la unión de dos SOMAmers por dímero de proteína. La estructura de los homodímeros se muestra en la tabla 1 (secuencias 4149-8_334 a 4149-8_342). Los valores de Kd obtenidos en el ensayo Zorbax sugirieron que en la configuración 5' a 3', era deseable un enlazador más largo y dio una mejora de hasta 10 veces en la afinidad de unión, como se muestra en la tabla 1a. En los homodímeros unidos 3'-3', el enlazador más corto realmente parecía funcionar mejor que el enlazador más largo. Esto fue corroborado por los resultados de fosforilación celular, véase la tabla 1a.

[0272] Con base en estas secuencias, una secuencia de consenso ejemplar es:

5'-ZZVCLnGV' ZACNMGCGZZZAZAGCG-3' (SEQ ID NO:502),

donde

V se selecciona de una A, C o G;

V' se selecciona de una C, G o Z, donde V' es complementaria a V;

M se selecciona de una C o A;

Z se selecciona independientemente de una pirimidina modificada; L es un espaciador seleccionado de cualquier nucleótido de origen natural o modificado, un enlazador de hidrocarburos, un enlazador de polietilenglicol o una combinación de los mismos; y

n es de 0 a 20;

donde una o más inserciones de nucleótidos se incluyen opcionalmente.

[0273] Estudios de truncamiento de secuencia: el truncamiento sistemático de los extremos 5' y 3' de 4149-8_1 se realizó para definir una longitud mínima necesaria para conservar la actividad de unión completa del aptámero al PDGF-BB humano, como se muestra en la tabla 3. Se muestran los valores de Kd para un subconjunto de truncamientos. Z = bencildesoxiuridina (Bn-dU); A, C, G y T son desoxirribonucleótidos.

Expresión y purificación de proteínas y formación de complejos de aptámeros

[0274] Para estudios de cristalografía, se compró proteína PDGF-BB humana recombinante de Creative BioMart (Shirley, NY). La proteína recombinante se expresó en células de E. coli. Las soluciones de aptámero se descongelaron y a continuación se recocieron calentando a ~95 °C durante 5 minutos, a continuación, se incubaron a 40 °C durante 5 minutos, a continuación, se enfriaron a temperatura ambiente. La solución de aptámero recocido se mezcló con proteína en una relación de 1,1:1 de ADN a proteína. El complejo se diluyó 5 veces en amortiguador que contenía Na/K fosfato 20 mM (pH 7) y NaCl 100 mM. La mezcla resultante se concentró a ~4 mg/ml en proteína en un filtro centrífugo Amicon de 1,5 ml. La concentración final se estimó a partir del volumen final de retenido.

Ejemplo 2. Cristalización y estructura del complejo de PDGF-aptámero

[0275] Se cultivaron cristales usando el procedimiento de difusión de vapor de gota sentada en placas Compact, Jr. (Emerald BioSystems, WA) configuradas a 16 °C. Los cristales para la recopilación de datos se obtuvieron de una pantalla primaria (ProPlex, Molecular Dimensions). El cristal para el complejo PDGF-BB:4149-8_255 se cultivó a partir de acetato de magnesio 100 mM, acetato de sodio 100 mM (pH 4,5) y PEG 8000 al 8 % (p/v). El cristal para el complejo PDGF-BB:4149-8_260 se cultivó a partir de acetato de magnesio 100 mM, cacodilato de sodio 100 mM (pH 6,5) y p Eg 6000 al 15 % (p/v). Los cristales se recogieron con Litho Loops y se crioprotegieron mediante transferencia rápida a una solución de depósito que contenía 33 % (v/v) de etilenglicol antes del enfriamiento instantáneo al sumergirse directamente en nitrógeno líquido.

[0276] Recopilación de datos y determinación de la estructura: los datos para ambas estructuras se recopilaron en la línea de haz 19-ID del Advanced Photon Source (Argonne, IL). Los conjuntos de datos se procesaron utilizando XDS (Kabsch 2010). La estructura del complejo PDGF-BB:4149-8_260 fue inicialmente escalonada mediante reemplazo molecular utilizando Phaser del paquete de software CCP4 (CCP4, 1994) con el modelo proteico de PDGF de la estructura del complejo receptor PDGF-BB:PDGF tipo beta (entrada PDB 3MJG) como modelo de búsqueda. El reemplazo molecular localizó un monómero de proteína única por unidad asimétrica. La inspección de los mapas de densidad de electrones después de una ronda inicial de refinamiento restringido en REFMAC mostró características consistentes con el ácido nucleico adyacente al modelo de proteína. El modelo del aptámero se construyó posteriormente a través de un procedimiento de "muestreo con reemplazamiento", es decir, los modelos parciales se sometieron a rondas iterativas de refinamiento; lo que resulta en mapas marginalmente mejorados que permitieron una mayor construcción de modelos. En primer lugar, los iones fosfato se construyeron en la densidad de la estructura principal del ácido nucleico. En segundo lugar, los fosfatos se sustituyeron por residuos de dT. Después del refinamiento, los residuos modificados se pudieron discernir por protuberancias de densidad de electrones de diferencia positiva. La identificación de los residuos modificados facilitó la determinación del registro de secuencia del aptámero, y en las etapas finales los residuos de dT se reemplazaron con las nucleobases correctas. Toda la construcción manual se realizó utilizando el kit de herramientas orientado a objetos cristalográficos (Coot) (Emsley & Cowtan, 2004). La estructura de la estructura PDGF-BB:4149-8_255 se resolvió mediante reemplazo molecular utilizando el modelo terminado del complejo 4149-8_260.

[0277] En cada estructura, se observó una protuberancia de densidad de electrones contigua a la densidad de electrones del átomo de Oy de los residuos Thr88 y Thr90. Aunque se ha informado de O-manosilación en estos sitios para el PDGF-B recombinante expresado en levadura (Settineri, y col., (1990)), hay pocas razones para esperar modificaciones postraduccionales similares en el PDGF-B expresado en E. coli. Como la densidad de electrones observada sugirió menos que la ocupación completa, los residuos de treonina se modelaron sin ninguna modificación postraduccional.

[0278] La tabla 4 describe estadísticas de recopilación de datos y estadísticas de refinamiento y modelo de dos ligandos de aptámeros con 4149-8_260 (SEQ ID. NO. 211) y 4149-8_255 (SEQ ID. NO. 207), respectivamente.

[0279] La tabla 5 ilustra los parámetros del par de bases para el aptámero de PDGF BB en comparación con el ADN de forma B. El aptámero de PDGF BB adopta conformaciones de forma B desviadas en el dominio de tallo bucle 5' y en ambos tallos del mininudo. Cuando proceda, se indican los valores medios y las desviaciones típicas (entre paréntesis). Los valores de aptámero se basan en análisis usando web3DNA (Zheng y col. (2009) Nucleic. Acids Res. 37:W240) y los valores de ADN B (como se encuentran en estructuras de cristal de alta resolución) se determinaron usando 3DNA como se describe e informa en Olson, y col. (2001) J. Mol. Biol. 313(1): 229.

[0280] Las subunidades monoméricas de PDGF-BB forman láminas p retorcidas que se dimerizan en una orientación antiparalela característica de la familia de proteínas de nudos de cistina (Oefner y col. (1992) EMBO J 11:3921). SL5 (4149-8_260) se une a dos sitios homólogos en cada extremo del eje largo, cruzando la interfaz de homodímero y poniendo en contacto cada uno de los tres bucles de PDGF (figura 7A). El SOMAmer está compuesto por dos dominios conectados por una red de interacciones aromáticas hidrófobas (figura 7B). En el extremo 5', un tallo corto está bloqueado con un bucle Heg (desordenado en la estructura cristalina), mientras que el resto de la molécula se pliega en un pseudonudo de tipo H extraordinariamente pequeño (Aalberts, D.P. y col. (2005) Nucleic Acids Res.

33:2210), con nucleótidos modificados que se agrupan en la unión de tallo bucle/pseudonudo. Notablemente, los ocho nucleótidos modificados están en contacto con PDG^f. Siete nucleótidos modificados se agrupan a lo largo de un surco hidrófobo en la proteína, mientras que Bn-dU1 adopta una conformación extendida, siguiendo un canal en la interfaz del homodímero de PDGF. Dos nucleótidos naturales también entran en contacto con PDGF, contribuyendo los nucleótidos naturales restantes a la estructura interna (figura 2 y figura 7). Los elementos de estructura secundaria de SL5, un tallo-bucle y un pseudonudo, son motivos estructurales de ácido nucleico bien conocidos. Sin embargo, el reemplazo de determinadas bases convencionales con nucleótidos modificados ofrece grupos funcionales novedosos para interacciones alternativas. Esta característica distintiva de SL5 da como resultado una extensa superficie hidrófoba para la unión a proteínas, así como contactos intramoleculares únicos entre nucleótidos canónicos y modificados.

[0281] Aunque el extremo 3' de SL5 muestra características distintivas de un pseudonudo de tipo H (Staple, D.W. y col. (2005) PLoS Biol. 3:e213), esta categorización subestima la naturaleza no convencional de este motivo característico de "mininudo". En comparación con el pseudonudo de tipo H estructuralmente informado más pequeño que requiere 21 nucleótidos (Nonin-Lecomte S. y col. (2006) Nucleic Acids Res. 34:1847), el mininudo SL5 consiste en solo 16 nucleótidos (figura 7B). Además, la eliminación del par de bases mG24:dC12 terminal del tallo 2 (S2) da como resultado una afinidad de unión no disminuida (figura 3), lo que demuestra la integridad funcional de un mininudo de 14 nucleótidos. Con torsiones de estructura principal e interacciones de apilamiento sin precedentes, el mininudo representa una variante de pseudonudo novedosa en la que se logra un tamaño inusualmente pequeño a través de la estabilización aportada por el empaque de los restos hidrófobos de los nucleótidos modificados.

[0282] El tallo de mininudo 1 (S1) consiste formalmente en solo dos pares de bases Watson-Crick (figura 8A), mientras que el bucle 2 (L2) está compuesto nominalmente de 5 bases, Pe-dU17, Th-dU18, dA19, Bn-dU20 y mA21. Si bien las interacciones entre L2 y S1 son una característica definitoria de los pseudonudos, típicamente se limitan a la unión H. Por el contrario, el mininudo SOMAmer realiza interacciones atípicas de apilamiento de bucle a tallo, respaldadas por un apareamiento de bases no convencional. En particular, S1 se estabiliza apilando con un par de bases Bn-dU17:Bn-dU20 no canónicas derivadas de L2 (figura 8C y figura 8B), creando efectivamente un par de tres bases S1 con una discontinuidad de estructura principal novedosa. A diferencia de los pares de bases de iminocarbonilo U:U descritos anteriormente, el par de bases Pe-dU17:Bn-dU20 utiliza un único enlace de H entre N3 de Bn-dU17 y el oxígeno del carbonilo en el enlazador de amida de Bn-dU20 (figura 8D). La conformación syn sobre el enlace glicosilo de Bn-dU20 impide la unión H con Bn-dU17, pero permite que Bn20 se apile con la base de Bn-dU8 sin chocar estéricamente con el azúcar de Bn-dU8. El par de bases no convencionales Pe-dU17:Bn-dU20 es posible gracias a un giro de 280° en la estructura principal entre los nucleótidos 18 y 20 (figura 8C). Esta dramática inversión de hebra permite que la base de Bn-dU20 se apile con el azúcar de dA9 y forme un enlace de hidrógeno con Pe-dU17. Es importante destacar que el par de bases Pe-dU17:Bn-dU20 deriva estabilización adicional a través de interacciones hidrófobas conferidas por los nucleótidos modificados; la porción de etileno (enlazador) de la cadena lateral de PedU17 se dirige hacia Bn16 (CH::n) mientras que su grupo bencilo se apila en interacciones de borde a cara n-n con Bn2 y Th18 (figura 8E). Una interacción adicional entre L2 y S1 es una base triple (mA21:dG15:dC10; figura 8F), un motivo recurrente en pseudonudos (Chen, G. y col. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:12706). Esta es la única interacción terciaria de largo alcance en SL5 que no involucra los nucleótidos modificados.

[0283] El bucle 1 (L1) consiste en un único nucleótido extruido, mA11 que permite que la estructura principal realice un giro ajustado de 94°, comprimiéndose la distancia de fosfato intracadena entre mA11 y dC12 a solo 5,9 A (figura 8G). Los pseudonudos de tipo H a menudo tienen uno o dos nucleótidos en L1, que típicamente forman enlaces de hidrógeno con S2 y se apilan en la unión helicoidal (Nonin-Lecomte, S. y col. (2006) Nucleic Acids Res. 34:1847; Michiels, P.J. y col. (2001) J. Mol. Biol. 310:1109). El nucleótido L1 extruido es necesario para mantener la estructura condensada de modo que el dominio del tallo 5' pueda interactuar con el mininudo a través de los restos hidrófobos de los nucleótidos modificados. Como se esperaba, la base extruida no se conserva (figura 3) y se puede reemplazar con un único espaciador C3 (figura 6A), sin embargo, su eliminación anula la unión, presumiblemente debido a la interferencia con la formación de mininudos.

[0284] Los pares de bases Watson-Crick del mininudo S1 (dA9:Bn-dU16, dC10:dG15) se ensamblan mediante la disposición de pseudonudo de tipo H preferida en la que la hebra uno de S2 conduce directamente a la hebra dos de S1, lo que proporciona un apilamiento eficiente de los tallos (Klein, D.J. y col. (2009) Nat. Struct. Mol. Biol. 16:343). Los tres pares de bases de S2 están compuestos en su totalidad de interacciones Watson-Crick y forman una hélice de forma B ligeramente infratorsionada (figura 8H). Esta infratorsión da como resultado parámetros helicoidales que se asemejan más a las hélices de forma A, como se espera para la topología de pseudonudos; sin embargo, la relevancia de estos cálculos es equívoca, dada la corta longitud de las hélices en esta estructura. S2 no forma una pila coaxial convencional con S1 debido al sobreenrollamiento helicoidal severo en la unión (ángulo de torsión de 70°) formado por dC10:dG15 de S1 y dC14:dG22 de S2. Sin embargo, el apilamiento continuo de los tallos se mantiene cuandodC14 se apila con dG15 y dG22 se apila con mA21 desde la triple base (figura 8H). La torsión helicoidal extensa en esta unión es necesaria para permitir que mA21 puentee el surco mayor de S2 mientras se amplía el surco menor para la formación de la triple base. Esta configuración es típica en pseudonudos con uno o dos nucleótidos en L1 (Nonin-Lecomte, S. y col. (2006) Nucleic Acids Res. 34:1847; Michiels, P.J. y col. (2001) J. Mol. Biol. 310:1109).

[0285] El tallo 5' de SL5 está compuesto por dos pares de bases Watson-Crick (mA3:Bn-dU7 y dC4:dG6) y un par de bases Bn-dU2:Bn-dU8 no canónicas en la base del tallo (figura 8I). El par de bases Bn-dU2:Bn-dU8 contiene dos enlaces de hidrógeno, un 4-carbonil-N3 típico y un 4-carbonilo único de la base Bn-dU2 al enlazador de amida del enlace Bn-dU8 (figura 8J). El análisis de secuencias relacionadas en el grupo enriquecido por afinidad muestra que la longitud y la composición base del tallo 5' pueden cambiar, con la notable excepción del par invariante Bn-dU:Bn-dU en la base del tallo (figuras 3A y B), destacando la importancia de este par de bases no canónicas en la estructura y función general de SL5. La estabilidad de la hélice del tallo 5' se ve reforzada adicionalmente por el apilamiento de dU8, Bn20 y Pro82 de PDGF (figura 9H). Los dominios tallo bucle 5' y mininudo de SL5 convergen donde la estructura principal forma una curva pronunciada de 111°. Los ángulos de torsión significativos y el desplazamiento radial de los pares de bases en el tallo 5' dan como resultado que las bases 2-4 y 6-7 tengan una mayor superposición de apilamiento (debido a la infratorsión de la hélice) que en las hélices de forma B convencionales, mientras que la base Bn-dU8 se desplaza hacia afuera y labase Bn-dU7 se apila con el enlazador de amida de Bn-dU8 (figura 8I). Esta hélice atípica facilita las interacciones críticas con el resto de SL5 y con PDGF; La base Bn-dU8 se apila con Bn20 mientras que Bn8 se encuentra perpendicularmente entre los anillos de Bn16 y Bn20 en interacciones consecutivas n-n de borde a cara. Estas interacciones terciarias de largo alcance definen una bisagra precisa entre el mininudo y los dominios tallo-bucle (figuras 8L y 8K). La falta de curvatura entre los dos primeros nucleótidos evita el choque de la base Bn-dU1 con Bn2, lo que aumenta el apilamiento de los anillos (figura 8I). Bn2 se encuentra en el centro de un cúmulo hidrófobo creado por Bn7 y Bn8 (a partir del tallo 5') y Bn16, Pe17 y Bn20 (a partir del mininudo) (figura 7B, figura 8I y figura 8K). Este cúmulo hidrófobo contribuye a la estabilización del SOMAmer, apoyado por la observación de que SL5 muestra una Tm de 64 °C, que es >30 °C más alta que su análogo que carece de los nucleótidos modificados.

[0286] Además de SL5, también se resolvió la estructura de SL4 (4149-8_255), que es idéntica a SL5 a excepción del reemplazo de Bn-dU8 con isobutil-dU (iB-dU). Cuando se combinó iB-dU8 con Pe-dU17 y Th-dU18 en la variante SL4, el SOMAmer mostró una unión sustancialmente más débil (-20-50 veces frente a SL5) y una actividad inhibidora in vitro 75 veces menor (figura 1A, figura 1B y figura 6B). La cadena lateral de isobutilo no aromático más pequeña no puede formar el apilamiento de borde a cara n-n energéticamente favorable que se observa con las cadenas laterales de bencilo de Bn-dU20, Bn-dU8 y Bn-dU16 en SL5 (figura 8M y figura 8N). Esto crea un agujero en el centro del cúmulo hidrófobo en la interfaz de proteína, desbloqueando efectivamente la bisagra entre el tallo 5' y los dominios del mininudo. El efecto estructural de esta sustitución es directamente análogo a una mutación de Phe a Leu en el núcleo hidrófobo de una proteína. Dichas mutaciones de proteínas están bien descritas (Kadonosono, T. y col. (2003) Biochemistry 42:10651; Lin, H.J. y col. (2003) Biochim. Biophys. Acta. 1649:16; Baase, W.A. y col. (2010) Protein Sci. 19:631) y generalmente tienen un efecto desestabilizador significativo. Se sabe que las uniones entre motivos de estructura secundaria juegan un papel crítico en la determinación de la estructura terciaria del ácido nucleico (Pyle, A.M. y col. (2011) Curr. Opin. Struct. Biol. 21:293).

[0287] A pesar de una afinidad de unión a diana notablemente más débil, SL4 muestra un perfil de fusión térmica similar a SL5 en ausencia de ligando (valores de Tm de 62 °C y 64 °C, respectivamente). Esto es consistente con la noción de que la cavidad y la topología de unión alterada creada por la sustitución de iB-dU8 en SL4 desestabiliza la interfaz de unión a proteínas, mientras deja intactas las estructuras intradominio del SOMAmer. Las conformaciones de SOMAmers libres en solución bien pueden ser muy diferentes de las del complejo con la proteína, lo que también podría disminuir la relación entre Tm y la afinidad de unión. De hecho, dado que es probable que el costo energético de solvatar una superficie hidrófoba grande del SOMAmer sea sustancial, se espera que el SOMAmer que no forma complejos colapse alrededor de las cadenas laterales hidrófobas y adopte una conformación en la que las cadenas laterales hidrófobas estén parcialmente protegidas del disolvente.

[0288] A diferencia de los complejos de proteína:aptámero descritos anteriormente, las interacciones hidrófobas dominan la interfaz entre SL5 y PDGF (figura 2, figura 4 y figura 9). La unión a PDGF-BB crea un área de superficie enterrada de -1225 A²por SOMAmer. Los ocho nucleótidos modificados de SL5 crean una interfaz hidrófoba extensa que interactúa con 13 aminoácidos no polares de PDGF (Ala35, Phe37, Leu38, Val39, Trp40, Pro42, Cys52, Cys53, Ile75, Ile77, Pro82, Ile83 y Phe84), que representan aproximadamente la mitad del total de contactos no polares, comprendiendo el resto regiones alifáticas de aminoácidos polares o cargados tales como Glu24, Arg27, Asn36, Asn54, Asn55, Arg56, Arg73, Lys74, Lys80, Lys85 y Lys86 (figura 9). En las proteínas, a menudo se observan interacciones similares entre residuos completamente no polares y restos no polares de aminoácidos cargados. Por lo tanto, la diversidad estructural proporcionada por los nucleótidos modificados en SOMAmers les permite imitar el rico repertorio de interacciones accesibles a las proteínas. La diferencia sorprendente en la extensión de los contactos hidrófobos realizados por el SOMAmer en comparación con los aptámeros tradicionales es evidente cuando los átomos de interfaz se muestran en las superficies de las proteínas diana. SL5 muestra notablemente unas pocas interacciones polares, que tienen solo seis enlaces H y una interacción de carga-carga con PDGF (figura 4), a pesar de la proximidad cercana a los aminoácidos básicos. En relación con el área de superficie de contacto, esto es significativamente menor que lo que es típico para los aptámeros. El número total de enlaces H e interacciones de carga-carga (es decir, contactos polares) para seis aptámeros tradicionales aumenta aproximadamente linealmente en proporción directa al área de interfaz (figura 10A, figura 22A) con un coeficiente de correlación de 0,91 y un promedio de 1,9±0,4 contactos polares por área de interfaz de 100A². SL5, así como dos SOMAmers adicionales en otras estructuras cocristales, caen claramente fuera de los intervalos de confianza del 99 % de esta tendencia, con menos de la mitad del número de contactos polares por área de interfaz (promedio de 0,7±0,2 por 100A²de área de interfaz), mientras que muestran una tendencia hacia afinidades de unión más altas para sus dianas (figura 22C). En términos de eficiencia del ligando (energía libre de unión por átomo de contacto que no sea hidrógeno) (Kuntz, I.D. y col. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U^{s a}96:9997), los aptámeros y SOMAmers no parecen ser diferentes (figura 22C), lo que abarca unintervalo de valores observados con ligandos basados en proteínas y ligandos basados en moléculas pequeñas (Wells, J.A. y col. (2007) Nature, 450:1001). Las energías libres de unión por área de interfaz también son similares (figura 22C). Lo que es diferente, sin embargo, es el valor de la energía libre de unión por contacto polar, que es aproximadamente el doble de grande para SOMAmers que para aptámeros (figura 22 B y C), consistente con la noción de que los SOMAmers derivan una mayor contribución a la unión de interacciones hidrófobas.

[0289] Las interacciones de carga-carga a menudo contribuyen con menos de 0,2 kcal/mol a la estabilidad de una proteína plegada (Sali, D. y col. (1991) J. Mol. Biol. 220:779. Por el contrario, se estima que enterrar solo un grupo metileno contribuye —1-1,5 kcal/mol a la estabilidad de la proteína globular y/o interacciones de unión (Kellis, J.T., Jr. y col. (1988) Nature, 333:784; Pace, C.N. y col. (2011) Mol. Biol. 408:514). Las estructuras de SOMAmer revelan una fuerte dependencia de las interacciones hidrófobas y, en este sentido, su unión a las proteínas se asemeja más a las interacciones de proteína-proteína típicas. De acuerdo con esta observación, la afinidad de SL5 por PDGF no muestra prácticamente ninguna disminución en un amplio intervalo de concentraciones de sal (NaCl 0,1 a 1,0 M) o valores de pH (5,0 a 8,8), a diferencia de los efectos observados con aptámeros tradicionales (Ahmad, K.M. y col. (2011) PLoS ONE 6:e27051; Tang, Q. y col. (2007) J. Colloid. Interface. Sci. 315:99).

[0290] La optimización post-SELEX facilita el ajuste fino de las interacciones de empaquetado hidrófobas y complementarias de la forma. Por ejemplo, la formaexcepcional complementaria de Pe-dU17 y Th-dU18 en la interfaz de proteína (figura 10B) se corrobora con las relaciones de estructura-actividad (figura 6B). Bn-dU1 también forma una interacción única con PDGF-BB, con el anillo bencilo sentado en un túnel formado por el enlace disulfuro Cys43-Cys52 y un puente de sal entre Glu24 de la cadena PDGF1 y Arg56 de la cadena 2 (figura 10C). La estructura cristalina sugiere que el bolsillo de unión puede acomodar una variedad de cadenas laterales, que incluyen sustituyentes bicíclicos más grandes, mejorando así este punto de contacto con la proteína. De hecho, se han identificado varias sustituciones de nucleótidos modificados en esta posición que confieren una mejora de 5 a 10 veces en la afinidad de unión (figura 6B).

[0291] Una característica notable de la estructura PDGF-BB:SL5 es el grado en que el SOMAmer imita a PDGFRp. El receptor se une al PDGF principalmente a través de interacciones hidrófobas, incluyendo siete aminoácidos hidrófobos en la interfaz de PDGF (Shim, A.H. y col. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:11307). El sitio de unión a SL5 se superpone en gran medida al del receptor con los anillos aromáticos de Bn-dU que ocupan el mismo surco hidrófobo en la proteína (figura 11). El PDGF entra en contacto tanto con el receptor como con s L5 con 24 residuos, de los cuales 10 se comparten. Estos residuos compartidos o "promiscuos" probablemente representan un punto caliente de energía de unión en la superficie de PDGF (Wells, J.A. y col. (2007) Nature, 450:1001; Clackson, T. y col. (1994) Science 267:383. Sin embargo, en comparación con PDGF Rp, SL5 muestra una afinidad 10 veces mayor por PdGf-BB (Lokker, N.A. y col. (1997) J. Biol. Chem. 272:33037). De acuerdo con estas observaciones, SL5 es un inhibidor potente de PDGF-BB (figura 1B y figura 6B).

Ejemplo 3. Ensayos de afinidad de unión

[0292] Para determinar la afinidad de unión a la diana, los SOMAmers se marcaron en el extremo 5' usando polinucleótido quinasa T4 (New England Biolabs) y y32P-ATP (Perkin Elmer). Los ensayos de unión se realizaron incubando SOMAmer radiomarcado (—20.000 c.p.m) a una concentración de —0,03-0,05 nM y proteína diana a concentraciones que varían de 10'7 a 10'12 M en amortiguador 1XSB18T (HEPES 40 mM, pH 7,5; NaCl 120 mM; KCl 5 mM; MgCl ²5 mM y TWEEN-20 al 0,01 %) a 37 °C durante 30 minutos. Los complejos unidos se mezclaron con resina Zorbax y se capturaron en placas de filtro Durapore. La fracción de SOMAmer unida se cuantificó con un PhosphorImager (FUJI FLA-3000). Los datos de unión sin procesar se corrigieron para la unión de fondo no específica de SOMAmer radiomarcado a la resina Zorbax. Las constantes de disociación de equilibrio (Kd) se determinaron como se describió anteriormente (Jellinek y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:11227). El ARNt competidor a una concentración de 200 nM se incluyó en estudios de especificidad de isoforma como se indica en la figura 5. Para determinar la dependencia de la sal de las interacciones PDGF-BB/SOMAmer y E10030, se realizaron ensayos de afinidad de unión y se analizaron como se describió anteriormente en presencia de Hepes 40 mM pH 7,5, TWEEN-20 al 0,01 % y NaCl 100 mM, 250 mM, 500 mM, 750 mM o 1,0 M). Las gráficas log-log de las concentraciones de sal frente a las constantes de disociación se ajustaron usando regresión lineal simple. La pendiente de las gráficas representa la cantidad de contraiones liberados del ADN tras la unión a proteínas, tal como se describe por la teoría de condensación de contraiones de (Manning, G.S. (1969) J. Chem. Phys. 51:924). La afinidad del aptámero 4149-8_260 (SEQ ID NO. 211) por PDGF mostró poco cambio en un amplio intervalo de concentraciones de sal (NaCl 0,1 a 1,0 M) o valores de pH (5,0 a 8,8), a diferencia de los efectos observados con los aptámeros tradicionales (Ahmad, K.M. y col. (2011) PLoS One, 6:e27051; Tang, Q. y col. (2007) J. Colloid. Interface Sci. 315:99).

Ejemplo 4. Ensayo de fosforilación celular de PDGF-BB

[0293] Actividad de PDGF-BB. Para evaluar la capacidad de los SOMAmeros de PDGF-BB para inhibir la activación de PDGF Rp, se sembraron células de fibroblastos de prepucio humano Hs27 (American Type Culture Collection) a 5000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos y se les privó de suero durante 24 horas. Se incubaron SOMAmers (concentraciones variables como se indica en las figuras) con PDGF-BB (20 ng/ml) (Creative BioMart) en medio libre de suero durante 30 minutos a 37 °C, a continuación, se añadió el complejo a células Hs27 privadas de suero. A los cinco minutos después de la estimulación, el sobrenadante se descartó y las células se lisaron en el amortiguador de lisis #9 (R&D Systems: NP-40 Alternative al 1 %, Tris 20 mM (pH 8,0), NaCl 137 mM, glicerol al 10 %, EDTA 2 mM, ortovanadato de sodio activado 1 mM, 10 pg/ml de aprotinina y 10 pg/ml de leupeptina) en hielo durante 5 minutos. La detección Elisa de fosfoPDGF Rp se realizó utilizando el kit DuoSet Phospho-PDGF Rp (R&D Systems) según las instrucciones del fabricante. El porcentaje de fosfoPDGF Rp se midió a DO⁴⁵⁰, se corrigió para la absorbancia de la placa y la señal de fondo con un control sin estimulante. Los experimentos generalmente se realizaron por duplicado o triplicado. Los datos se graficaron en GraphPad Prism 3.0 y se ajustaron a una curva de competencia de un sitio usando regresión no lineal. La gráfica representativa de la determinación de CI⁵⁰se muestra en la figura 13 para el SOMAmers 4149-8_379 y el SOMAmer 4149-8_379 modificado con enlazador 5' amino, con valores de CI⁵⁰de 1,6 nM y 1,7 nM, respectivamente.

[0294] Para el análisis de actividad de variantes del clon 4149-8, se evaluó el porcentaje de inhibición de la fosforilación de PDGF Rp inducida por PDGF-BB en fibroblastos Hs27, en las mismas condiciones que se describieron anteriormente, pero a una concentración única de variantes de SOMAmer (generalmente 20 nM).

Ejemplo 5. Liaandos de PDGF adicionales basados en la modificación de Nap-dU

[0295] Para identificar aptámeros adicionales que se unen a PDGF-BB con alta afinidad, se ha realizado otro experimento SELEX con una biblioteca que comprende nucleótidos modificados con Nap-dU. Las selecciones se realizaron de una manera sustancialmente análoga a la descrita en el ejemplo ¹anterior y dieron como resultado la identificación del clon de aptámero de Nap-dU 5169-4.

[0296] Secuenciación profunda del grupo PDGF Nap-dU SELEX: para evaluar más completamente las secuencias dentro de la familia de aptámeros 5169-4_1, se secuenció el grupo de la 7a ronda utilizando tecnología de pirosecuenciación 454. El ADN del grupo se amplificó con 454 cebadores y el producto de PCR se purificó y normalizó usando una placa de normalización Sequal (Invitrogen, Cat# A10510-01). El eluido se corrió en un gel para confirmar el tamaño y la pureza de cada amplicón. El producto de PCR purificado se secuenció en la instalación de pirosecuenciación 454 en Health Sciences Center de la Universidad de Colorado en Aurora, CO.

[0297] El conjunto de datos de secuencias del conjunto contenía 8.273 secuencias de longitud completa (es decir, aquellas secuencias que contenían ambas secuencias cebadoras) de las cuales 1.629 eran únicas. Estas 1.629 secuencias únicas se utilizaron para encontrar patrones n-mer estadísticamente significativos al contar todos los nmers posibles en el conjunto de secuencias, de 4 mers a 30 mers. Al comparar los recuentos para cada n-mer identificado con los recuentos esperados al azar para n-mers de un grupo de la misma composición, se encontraron patrones estadísticamente significativos. Se identificaron dos patrones principales en el conjunto de secuencias y 5169-4_1 se encontró alineado dentro del segundo patrón definido por el motivo de secuencia conservado "APGPAPGCACAPCP" encontrado en 11 secuencias. Una búsqueda a través de todas las secuencias únicas para este motivo (identidad = 0,75) encontró 51 secuencias que a continuación fueron alineadas por el motivo. Para todas las secuencias, la identidad fraccional en cada posición en la alineación se calculó como se indica en la figura 14, con la secuencia de consenso indicada.

[0298] Estudios de truncamiento de secuencia: el truncamiento sistemático de los extremos 5' y 3' del clon 5169-4 de 50 nucleótidos se realizó para definir una longitud mínima necesaria para conservar la actividad de unión completa del aptámero al PDGF-BB humano, como se muestra en la tabla ⁶. Se muestran los valores de Kd para estos truncamientos (P = naptildesoxiuridina (Nap-dU); A, C, G y T son desoxirribonucleótidos). El clon 5169-4 demostró ser altamente susceptible al truncamiento y se identificó una secuencia de 21 nucleótidos (5169-4_26) que se unió a PDGF-BB con afinidad de unión mejorada en comparación con el 50 mer (17 pM y 29 pM, respectivamente). El 5169-4_26 de 21-mer contenía 5 nucleótidos modificados con Nap-dU frente a 9 nucleótidos modificados con Nap-dU en el 50-mer.

[0299] Sustituciones únicas del espaciador C3 en 5169-4_26 (21-mer): la primera ronda de modificaciones post-SELEX del aptámero PDGF-BB de Nap-dU incluyó un recorrido del espaciador C3 en todas las posiciones en el 5169-4_26 de 21-mer. El recorrido del espaciador C3 pretende identificar bases no necesarias para la unión de alta afinidad que potencialmente podrían eliminarse por completo, reemplazarse con el espaciador ^c3 u otros enlazadores tales como enlazadores de hexaetilenglicol (Heg) o polietilenglicol (PEG). Los resultados para las sustituciones del espaciador C3 se muestran en la tabla 7. En esta tabla, "P" denota Nap-dU, "C3" denota el espaciador C3; A, C y G denotan desoxirribonucleótidos, y "NB" denota que no hay unión hasta PDGF-BB 100 nM. Tres sitios toleraron la sustitución de C3 con una disminución modesta en la afinidad de unión: C1, G⁶y C7 (la numeración se refiere al 21-mer, como se muestra a continuación). Una posición, C15, toleró una sustitución del espaciador C3 sin afectar la afinidad de unión, en comparación con 5169-4_26.

[0300] Sustituciones únicas de 2'-O-metilo en 5169-4_26 (21-mer): se realizaron sustituciones de 2'O-metilo en todas las bases naturales para identificar posiciones que pudieran tolerar esta sustitución resistente a la nucleasa. Con la fosforamidita 2'O-metil Nap sintetizada en los laboratorios de los investigadores (Nap-mU), también se evaluó las posiciones de Nap-dU que tolerarían sustituciones únicas de Nap-mU. Además, se sustituyó la desoxitimidina (T) por Nap-dU para evaluar la importancia de cada Nap-dU. Los resultados de afinidad de unión se muestran en la tabla ⁸y demuestran que todas las posiciones toleraron sustituciones de 2'O-metilo en diversos grados. El efecto de las sustituciones de 2'O-metilo en cada posición de desoxicitidina (C) no produjo ningún cambio en la afinidad de unión, en comparación con 5169-4_26, hasta una disminución de 2 veces en la afinidad de unión. Las cuatro posiciones de desoxiguanosina (G) mostraron resultados variables cuando se sustituyeron con 2'O-metilo de afinidad de unión aumentada 2,5 veces en G14 a afinidad de unión disminuida 5,5 veces en G10, en comparación con 5169-4_26. Las sustituciones de 2'O-metilo en las seis posiciones de desoxiadenosina (A) tuvieron de cero a más de 50 veces un efecto adverso en la afinidad de unión. Las desoxiadenosinas hacia el extremo 5' del aptámero (A3, A5 y A⁸) fueron las tres más sensibles a la sustitución de 2'O-metilo. Solo la Nap-dU en la posición 21 toleró completamente la sustitución de Nap-mU sin afectar la afinidad de unión, mientras que la sustitución de Nap-mU en la posición 11 mostró una disminución de 2,5 veces en la afinidad de unión, en comparación con 5169-4_26. Las sustituciones de Nap-mU restantes dieron como resultado una disminución de 15 a 30 veces en la afinidad de unión. Las únicas sustituciones que completaron la unión eliminada (a concentraciones de PDGF-BB de hasta 100 nM) fueron las sustituciones de desoxitimidina en las posiciones ¹²y ^{2 1}, teniendo las sustituciones de desoxitimidina restantes un efecto negativo significativo (> 400 veces) en la afinidad de unión. En la tabla ⁸, P= dU modificado con 5-naftaleno, un superíndice 1 indica un nucleósido modificado con 2'-O-metilo. A, C, G y T representan los desoxirribonucleótidos de origen natural y "NB" denota que no hay unión hasta PDGF-BB 100 nM.

[0301] Múltiplesustituciones de 2'-O-metilo en 5169-4_26 (21-mer). Los efectos combinados de las sustituciones de 2'-O-metilo en 5169-4_26 conducen a la identificación de varias variantes con afinidad de unión mejorada, incluida la variante 5169-4_146. Este 21-mer tiene 11 posiciones que están protegidas con nucleasa por 2'O-metilo y su afinidad de unión es al menos 20 veces mayor que el truncado original, 5169-4_26 (0,60 pM frente a 17 pM, respectivamente). Muchas otras variantes también tuvieron mejoras significativas (aproximadamente 3 veces) en la afinidad de unión con combinaciones de 3 a 102'O-metilos. En la tabla 9, P= dU modificada con 5-naftaleno, un superíndice 1 indica un nucleósido modificado con 2'-O-metilo, A, C y G representan los desoxirribonucleótidos de origen natural y "NB" denota que no hay unión hasta PDGF-BB 3,2 nM.

Ejemplo 6. Ensayo de actividad del aptámero Nap-dU de PDGF

[0302] Para analizar el impacto inhibidor de los aptámeros de PDGF Nap-dU en la activación de PDGF Rp, los ensayos de inhibición de fosforilación celular se realizaron como se describe en el ejemplo 4. Las cuatro secuencias de aptámeros probadas inhibieron la activación de PDGF Rp con valores de CI⁵⁰de la siguiente manera: 5169-4_26, CI⁵⁰= 1,6 nM; 5169-4_84, CI50=^{3 , 3}nM; 5169-4_85, CI50=^{7 , 3}nM; 5169-4_112, CI50=^{1 , 0}nM.

Ejemplo 7. Selección de aptámeros de VEGF y secuencias

[0303] Preparación de mezclas candidatas: se preparó una mezcla candidata de oligonucleótidos de ssDNA parcialmente aleatorizados mediante extensión de polimerasa de un cebador de ADN recocido a una plantilla de ssDNA biotinilada.

[0304] Condiciones SELEX de VEGF: SomaLogic Inc seleccionó aptámeros para la proteína VEGF-121 humana recombinante (ambos de R&D Systems), como se describe (Gold y col. (2010) PloS One 5:e15004), de una biblioteca que contiene una región aleatoria de 40 nucleótidos en la que se sustituyó Nap-dU por dT. Para VEGF-121, el cebador directo fue 5'-GCCACCCTGCCCTC-3' y el cebador inverso fue 5'-GAGGACACAGACAGACAGACAC-3'. La proteína VEGF-121 se biotiniló y se dividió en perlas de estreptavidina MyOne-SA (Dynal). La selección preferencial de aptámeros con tasas de disociación lentas se logró usando uno desafío cinético donde los complejos de proteína-ADN se incubaron en presencia de sulfato de dextrano 10 mM a 37 °C con tiempos de incubación aumentados y concentraciones de proteína disminuidas en rondas sucesivas. En el VEGF-121 SELEX, las rondas 4 y 5 incluyeron un desafío cinético de 15 minutos, mientras que las rondas ⁶y 7 (ronda final) incluyeron un desafío cinético de 30 minutos.

[0305] La forma más pequeña de corte y empalme alternativo del factor de crecimiento endotelial vascular, VEGF-121, es una diana de proteína difícil para SELEX. Con bibliotecas de ADN o ARN de origen natural, o con bibliotecas de ácido nucleico modificadas en la posición ²' de ribosa, anteriormente no se ha logrado obtener ni siquiera un modesto grado de mejora de la afinidad. Esto es notable por dos razones. En primer lugar, entre los miembros de la superfamilia de nudos de cistina, el VEGF-121 tiene la mayor similitud estructural con el PDGF-BB, con una desviación media cuadrática de 1,9 A para 124 átomos de Ca (Muller y col., 1997). En segundo lugar, la isoterma de VEGF más grande y prevalente, VEGF-165, ha demostrado ser una buena diana para SELEX. Por ejemplo, pegaptanib (Macugen), el único agente terapéutico basado en aptámeros que ha recibido aprobación reglamentaria hasta la fecha (para el tratamiento de la degeneración macular), se une solo al VEGF^{- 1 6 5}a través del dominio codificado por el exón-7 de unión a heparina, que carece de VEGF-121 (Lee y col., 2005; Ruckman y col., 1998). Una diferencia entre VEGF-121, VEGF^{- 1 6 5}y p Dg F-BB es la carga global, con valores de pI de 5,8, 8,5 y 10.,1, respectivamente. Esto señala la importancia de las interacciones polares en la unión de aptámeros. El enriquecimiento de afinidad exitoso para VEGF-121 se logró en última instancia con una biblioteca Nap-dU SELEX.

[0306] Identificación de secuencias de aptámeros Nap-dU de VEGF-121: se identificaron dos variantes de alta afinidad altamente relacionadas que difieren en una sola posición (4867-15 y 4867-31) a partir de un experimento Nap-dU SELEX realizado como se describió anteriormente. El clon 4867-31 se ha truncado a 29 mer en una serie de experimentos de eliminación (tabla 7). Vale la pena señalar que el truncamiento de ambos clones de alta afinidad (4867-15 y 4867-31) da como resultado los mismos 29 mer, ya que la diferencia de nucleótidos individuales está fuera del límite 5' de la secuencia mínima. Las variantes truncadas que abarcan la secuencia más corta con unión de alta afinidad, 4867-31_143 de 29 mer (5'-CCGPP CAAGP GCPPG PAGGA PPPAA APGG-3'; donde "P" es la designación de una sola letra para Nap-dU) y sus variantes cercanas, se unen a VEGF-121 humano, VEGF-165 humano, VEGF-120 de ratón y VEGF-164 de rata con afinidades comparables, que varían de 0,1 a 1 nM (tabla 10). En esta tabla, "P" denota Nap-dU; A, C y G denotan los desoxirribonucleótidos de origen natural y "NB" denota que no hay unión hasta VEGF 100 nM.

[0307] Sustituciones únicas del espaciador C3 en 4867-15_2 (50-mer). La primera ronda de modificaciones post-SELEX del aptámero VEGF-121 fue un recorrido del espaciador C3 en todas las posiciones en el 4867-15_2 de 50 mer (50-mer truncado). El recorrido del espaciador C3 pretende identificar bases no necesarias para la unión de alta afinidad que potencialmente podrían eliminarse por completo, reemplazarse con el espaciador C3 u otros enlazadores tales como enlazadores de hexaetilenglicol (Heg) o polietilenglicol (PEG). Los resultados para las sustituciones del espaciador C3 se muestran en la tabla 11. En esta tabla, "P" denota Nap-dU, "V" denota el espaciador C3; A, C y G denotan los desoxirribonucleótidos de origen natural y "NB" denota que no hay unión hasta VEGF 100 nM. Al menos tres sitios internos toleraron la sustitución de C3: C17, G26 y G29 (la numeración se refiere al 50 mer como se muestra a continuación).

[0308] Sustituciones únicas de 2'-O-metilo en 4867-31_43 (32-mer). Se realizaron sustituciones de 2'O-metilo en bases naturales para identificar posiciones que pudieran tolerar esta sustitución resistente a la nucleasa. Además, se sustituyó 2'-OMe-uridina (2'-OMeU) por Nap-dU para evaluar la importancia de cada Nap-dU. Además, los espaciadores ^c3 se probaron en determinadas posiciones internas hipotetizadas para ser bases extruidas, ahora en el contexto del 32mer. También se probaron eliminaciones internas y bases alternativas en cada una de las tres posiciones. Los datos de afinidad de unión e inhibición del cultivo celular para los SOMAmers seleccionados (concentración única de 20 nM) se muestran a continuación. Los resultados se muestran en la tabla 12 y demuestran que C⁸(C17 en la tabla 11) no toleró completamente la sustitución de C3 en el contexto del truncado más corto. Las otras dos bases extruidas putativas (G17 y G20) conservan una buena unión y actividad funcional como C3 o sustituciones de bases alternativas en este contexto. No se toleraron las eliminaciones internas en esas posiciones. Ninguna de las modificaciones de Nap-dU podría reemplazarse con 2'OMe-U en este experimento. Sin embargo, varios sitios internos toleraron modificaciones de 2'OMe. En la tabla 12, P= dU modificado con 5-naftaleno, y un superíndice 1 indica un nucleósido modificado con 2 '-OMe, V=espaciador de 3 carbonos, y un recuadro vacío indica una eliminación de nucleósidos. A, C, G y U representan los desoxirribonucleótidos de origen natural.

[0309] Sustituciones de 2'-O-metil Nap-dU y múltiples sustituciones de 2'-O-metilo en 4867-31-143 (29-mer). Con la fosforamidita 2'O-metil Nap sintetizada en los laboratorios de los investigadores (Nap-mU), se evaluó las posiciones de Nap-dU que tolerarían sustituciones únicas de Nap-mU. Además, se probaron combinaciones de sustituciones de 2'OMe y enlazador C3 en cada una de las bases naturales. Los datos de afinidad de unión e inhibición del cultivo celular para los SOMAmers seleccionados (concentración única de 20 nM) se muestran a continuación. Como se muestra en la tabla 13 a continuación, la mayoría de los residuos de Nap-dU no toleraron la sustitución de OMe, pero la sustitución de Nap-mU por Nap-dU en la posición 22 proporcionó un aumento de 10 veces en la afinidad y una excelente actividad inhibidora. En esta tabla, el superíndice "1" denota una sustitución de 2'-O-metilo, "V" denota el espaciador C3. Las combinaciones 2'-OMe fueron en su mayoría bien toleradas basadas en la afinidad, pero determinadas combinaciones mostraron una sorprendente pérdida de actividad inhibidora.

[0310] Los efectos combinados de las sustituciones de 2'-O-metilo y C3 condujeron a la identificación de varias variantes con afinidad de unión mejorada, incluida la variante 4867-31_188. Este 29 mer tiene 10 posiciones que están protegidas con nucleasa por OMe 2'o C3 y su afinidad de unión es aproximadamente 3 veces más estrecha que el truncado original, 4867-31_143 (38 pM frente a 140 pM, respectivamente). La variante 4867-31_188 conserva una actividad de inhibición celular comparable en relación con el SOMAmer original. Véase la tabla 13.

[0311] La única posición que toleró Nap-mU fue el nucleótido 22 (usando el truncado 4867-31_143 como secuencia original). Esta sustitución de Nap-mU se colocó a continuación en el fondo del mejor SOMAmer 2'OMe combinado, 4867-31_188. Además, la sustitución del dG original en la posición 15 con un espaciador C3 se comparó con la sustitución de 2'-OMe en esa posición para examinar la posibilidad de que la base protegida con nucleasa pudiera añadir rigidez a la molécula y, por lo tanto, aumentar la unión. El mejor resultado agregado se obtuvo con la variante 4867-31_192, que ahora tiene 9 posiciones protegidas en comparación con la variante truncada original de 29 mer 4867-31_143 (véase la tabla 14 a continuación; el superíndice "1" denota una sustitución de 2'-O-metilo y "V" denota el espaciador C3).

[0312] Relación de estructura actividad de nucleótidos modificados y maduración de afinidad: para examinar la contribución de cada una de las diez cadenas laterales de naftilo a la unión, se realizó otra serie de sustituciones puntuales sistemáticas sintetizando químicamente variantes de posición 5 con una biblioteca personalizada de fosforamiditas dU modificadas. Para este fin, se diseñó una biblioteca para permitir sondear el microentorno de cada una de las posiciones variando el tamaño, la polaridad, la disposición de los donantes y aceptadores de enlaces H, la longitud del enlazador y la orientación de los sustituyentes de posición 5. Al elegir los grupos funcionales para este análisis, se pretendió incluir variaciones sobre un tema de la modificación original (en este caso, el grupo naftilo), cadenas laterales de aminoácidos sobrerrepresentadas en regiones determinantes de complementariedad (CDR) de anticuerpos (como triptófano y tirosina) (Mian, I.S. y col. (1991) J. Mol. Biol. 217:133; Ramaraj, T. y col. (2012) Biochim. Biophys. Acta. 1824:520), y fragmentos "privilegiados" de fármacos de molécula pequeña (17). La figura 15 muestra los resultados de estas sustituciones, representadas como la relación de valores de Kd (sustituidos/no sustituidos). De las 17 sustituciones de modificación diferentes probadas de cada una de las diez posiciones de Nap-dU, solo cuatro sustituciones (Trp-dU 27, NE-dU 16, MBn-dU 10 y BT-dU 16) tuvieron poco o ningún efecto de la afinidad de unión. Todas las demás sustituciones resultaron en una afinidad de unión más débil, en diversos grados.

[0313] Secuenciación profunda del grupo VEGF SELEX: para evaluar más completamente las secuencias dentro de la familia de aptámeros 4149-8_1, el grupo enriquecido se secuenció usando tecnología de pirosecuenciación 454. El ADN del grupo se amplificó con 454 cebadores y el producto de PCR se purificó y normalizó usando una placa de normalización Sequal (Invitrogen, Cat# A10510-01). El eluido se corrió en un gel para confirmar el tamaño y la pureza de cada amplicón. El producto de PCR purificado se secuenció en la instalación de pirosecuenciación 454 en Health Sciences Center de la Universidad de Colorado en Aurora, CO.

[0314] Las 454 secuencias se alinearon con 4867-31 mediante análisis CLUSTAL. El conjunto de datos de secuencias del conjunto contenía 13.139 secuencias de longitud completa (es decir, aquellas secuencias que contenían ambas secuencias cebadoras) de las cuales 2.235 eran únicas. Estas 2.235 secuencias únicas se buscaron para el motivo 5'-CCGPP CAAGP GCPPG PAGGA PPPAA APGG-3'. Hubo ⁸⁶secuencias encontradas que contenían estos motivos. Para todas las secuencias, el porcentaje de identidad en cada posición con 4867-31 se calculó como se indica en la figura 16.

Ejemplo 8. Ensayos de afinidad de unión a VEGF

[0315] Para determinar la afinidad de unión a la diana, los SOMAmers se marcaron en el extremo 5' usando polinucleótido quinasa T4 (New England Biolabs) y y³²P-ATP (Perkin Elmer). Los ensayos de unión se realizaron incubando SOMAmer radiomarcado (-20.000 c.p.m) a una concentración de -0,03-0,05 nM y proteína diana a concentraciones que varían de 10'7 a 10'12 M en amortiguador 1XSB18T (HEPES 40 mM, pH 7,5; NaCl 120 mM; KCl 5 mM; MgCl ²5 mM y TWEEN-20 al 0,01 %) a 37 °C durante 30 minutos. Los complejos unidos se mezclaron con resina Zorbax y se capturaron en placas de filtro Durapore. La fracción de SOMAmer unida se cuantificó con un PhosphorImager (FUJI FLA-3000). Los datos de unión sin procesar se corrigieron para la unión de fondo no específica de SOMAmer radiomarcado a la resina Zorbax. Las constantes de disociación de equilibrio (Kd) se determinaron como se describió anteriormente (Jellinek y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11227).

Ejemplo 9. Ensayo de actividad de VEGF

[0316] Para analizar el impacto inhibidor de los SOMAmers de VEGF121 en la actividad de quinasa celular de VEGF-R2 (receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular), se utilizaron células endoteliales de vena umbilical humana (HuVEC) (Lonza, #CC-2519) que expresa un nivel endógeno alto de VEGF-R2. Las células HUVEC se colocaron en placas en EGM-2 (medio de crecimiento celular endotelial) complementado con EGM-2 BulletKit (#CC-3162) que contenía FBS al 2 %, factores de crecimiento (hEGF, hidrocortisona, VEGF, HFGF-B, R3-IGF-1), heparina, ácido ascórbico y GA-1000 (gentamicina, anfotericina-B). Cuando las células HUVEC alcanzaron una confluencia del 70 al 80 %, se colocaron en placas en placa de 24 pocillos (105 células/pocillo) y se privaron de alimento durante la noche con medio libre de suero.

[0317] Se añadieron SOMAmers (una sola concentración a 20 nM o un intervalo de concentraciones) a los cultivos con 20 ng/ml (1 nM) de VEGF-121 (R&D System, #4464-VS) que contenía BSA al 1 % a 37 °C durante 30 minutos. Las células se lavaron en PBS dos veces y se estimularon con el complejo VEGF-121/SOMAmers preincubado durante 5 minutos. Las células tratadas se lavaron nuevamente con PBS dos veces y se añadió amortiguador de lisis helado (NP-40 Alternative al 1 %, Tris 20 mM (pH ⁸, 0), NaCl 137 mM, glicerol al 10 %, EDTA 2 mM, ortovanadato de sodio activado 1 mM, 10 pg/ml de aprotinina y 10 pg/ml de leupeptina complementada con un inhibidor de fosfatasa Halt (Thermo Scientific, #78428). Los lisados celulares se midieron para la fosforilación de VEGF-R2 mediante el uso del kit de fosfo-VEGF R2/KDR humano (R&D, DYC 1766-2).

[0318] En experimentos de actividad funcional in vitro, diversas variantes truncadas del clon 4867-31 a una concentración de selección de 20 nM son capaces de inhibir esencialmente completamente la fosforilación de VEGFR2 inducida por VEGF-121 o VEGF-165 (1-4 nM) en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) inmortalizadas o primarias. Una gráfica representativa de la determinación de CI⁵⁰se muestra en la figura 17 para los aptámeros de VEGF 4867-31_43 y 4867-31_192, con valores de CI⁵⁰de 2,2 nM y 2,1 nM, respectivamente.

[0319] Para el análisis de actividad de variantes del clon 4867-31, se ha evaluado el porcentaje de inhibición de la fosforilación de VEGF R2 inducida por VEGF en HUVEC, en las mismas condiciones que se describieron anteriormente pero a una sola concentración de variantes de SOMAmer (generalmente 20 nM).

Ejemplo 10. Construcciones homodiméricas de aptámeros de PDGF y VEGF

[0320] Tanto PDGF-BB como VEGF son homodímeros unidos a disulfuro que ejercen sus efectos biológicos al dimerizar sus receptores de tirosina quinasa, lo que conduce a la autofosforilación del receptor y la transducción de señales. Si más de un aptámero puede unirse a su diana de proteína, como es el caso del aptámero de PDGF-BB 4149-8_260 (basado en las estructuras de cristal), dichos aptámeros pueden unirse covalentemente en una construcción multimérica de una manera que permita la unión simultánea de subunidades de aptámero individuales a la proteína. Esto puede conducir a una mejora en la afinidad a través del efecto de avidez. Se sintetizaron dos tipos de homodímeros, basados en química fácilmente disponible. Estos fueron 1) homodímeros de cabeza a cola conectados por cero a seis enlazadores Heg, que proporcionan una distancia de -20 A por Heg, y 2) homodímeros 3'-3' conectados a través de un soporte de doblador sintético, combinados con uno a tres Hegs en cada lado (es decir, dos, cuatro o seis Hegs en total en el dímero). Los homodímeros de 4149-8_379, 5169-4_26 y 4867-31_192 se probaron en un ensayo de unión competitiva. Para determinar las afinidades de unión del competidor, los ligandos de aptámeros se marcaron en el extremo 5' usando polinucleótido quinasa T4 (New England Biolabs) y y³²P-ATP (Perkin Elmer). Los ensayos de competencia se realizaron premezclando una concentración fija de ligando radiomarcado (1,0 nM) con concentraciones variables de aptámero competidor (10'11 a 10'6 M). Las diluciones de ligando y competidor se incubaron con la proteína diana (100 pM) en amortiguador 1XSB18T (HEPES 40 mM, pH 7,5; NaCl 120 mM; KCl 5 mM; MgCl ²5 mM y TWEEN-20 al 0,01 %) a 37 °C durante 60 minutos. Los complejos unidos se mezclaron con resina Zorbax y se capturaron en placas de filtro Durapore. La fracción de ligando unido se cuantificó con un PhosphorImager (FUJI FLA-3000). Los datos de unión sin procesar se normalizaron para la unión sin adición del competidor. Los datos se graficaron en GraphPad Prism 3.0 y se ajustaron a una curva de competencia de un sitio usando regresión no lineal para determinar las constantes de disociación de equilibrio para los aptámeros competidores (Ki). Homodímeros de PDGF: la estructura de los homodímeros de PDGF de las secuencias 4149-8_379 (secuencias 4149-8_438 a 4149-8_447) y 5169-4_26 (secuencias 5169-4_134 a 5169-4_143) se muestran en la tabla 15. Para los homodímeros basados en 4149-8_379, los valores de Ki obtenidos en el ensayo de competencia sugirieron que en la configuración 5' a 3', era deseable un enlazador más largo, ya que se midió una mejora mayor que 10 veces en la afinidad de unión con cinco enlazadores Heg en comparación con ningún enlazador Heg (0,25 pM frente a 4,2 pM, respectivamente). En los homodímeros 4149-8_379 unidos 3' a 3', los cuatro y seis enlazadores Heg más largos también rindieron al menos 10 veces mejor que ningún enlazador y aproximadamente 2 veces mejor que los dos enlazadores Heg. Para los homodímeros basados en 5169-4_26, los valores de Ki indicaron que un enlazador Heg más largo era ventajoso en la configuración 5 'a 3', ya que la K i mejoraba de 28 pM para ningún enlazador Heg a 3,6 pM para seis enlazadores Heg. No hubo diferencia en los valores de Ki para cinco y seis enlazadores Heg en la configuración de 5' a 3'. En los homodímeros basados en 5169-4_26 unidos 3' a 3' se observó el mismo patrón, con la mejora de Ki a medida que aumentaba la longitud del enlazador Heg. Los seis enlazadores Heg mostraron una mejora de 5 veces en la Ki en comparación con ningún enlazador Heg (2,0 pM frente a 11 pM, respectivamente). En las tablas 15 y 16, Z = bencildesoxiuridina (Bn-dU), P= dU modificado con 5-naftaleno (Nap-dU), M=metilendioxibencil-dU (MBn-dU), un superíndice 1 indica un nucleósido modificado con 2'-O-metilo, ningún superíndice indica desoxirribonucleótidos, "C3" indica un enlazador de tres carbonos y "H" indica un enlazador de hexaetilenglicol.

Ejemplo 11. Construcciones de aptámeros heterodiméricos de PDGF/VEGF

[0321] Heterodímeros basados en el aptámero de PDGF 4149-8 y el aptámero de VEGF 4867-31. Con el objetivo de desarrollar construcciones con especificidad para PDGF y VEGF, se diseñó y probó una variedad de construcciones de aptámeros que comprenden un aptámero de VEGF unido a un aptámero de PDGF. Las primeras construcciones de aptámeros probaron la variante de PDGF combinada 4149-8_273 y VEGF 4867-31_183. Las construcciones de aptámero se sintetizaron de cabeza a cola, se conectaron por cero a tres enlazadores de hexaetilenglicol (Heg), en ambas orientaciones (ya sea con el aptámero de PDGF en el extremo 5' o el aptámero de VEGF en el extremo 5'). Los resultados se muestran en la tabla 17 y 18 a continuación. En la tabla 17, "Z" denota BndU, "P" denota Nap-dU, el superíndice "1" denota una sustitución 2'-O-metilo, ningún superíndice indica desoxirribonucleótidos, "V" denota el espaciador C3 y "H" denota un enlazador de hexaetilenglicol (Heg). En la tabla 18, el porcentaje de actividad restante denota niveles fraccionales de fosforilación de PDGF pR en fibroblastos Hs27 en presencia de aptámero 20 nM en relación con el control (sin aptámero).

[0322] Con base en la afinidad de unión para PDGF-BB, -AB, VEGF-121 y VEGF-165, la construcción de aptámero 4149-8_320 pareció dar los mejores resultados en este experimento. También se probó las construcciones de aptámeros en el ensayo de fosforilación celular de PDGF, como se muestra en la tabla 18. Con base en los datos del ensayo funcional, todas las construcciones de aptámeros probadas inhibieron la fosforilación de PDGF pR inducida por PDGF-BB en fibroblastos Hs27. Las construcciones de aptámeros 4149-8_313, 4149-8_314, 4149-8_315, 4149-8_316, 4149-8_319 y 4149-8_320 inhibieron la fosforilaciónde PDGF pR inducida por PDGF-BB con valores de CI⁵⁰de <20 nM. Las construcciones de aptámeros 4149-8_317 y 4149-8_318 tenían valores de CI⁵⁰de ~20 nM.

[0323] Se sintetizó 4149-8_401, basado en la configuración de 4149-8_320 (5 'PDGF-3Heg-VEGF3'), que comprende el aptámero de PDGF 4149-8_379 y el aptámero de VEGF 4867-31_192. Véase la tabla 19. En esta tabla, "Z" denota Bn-dU, "P" denota Nap-dU, M denota MBn-dU, el superíndice "1" denota una sustitución de 2'-O-metilo, ningún superíndice denota desoxirribonucleótidos, "C3" denota el espaciador C3 y "H" denota un enlazador de hexaetilenglicol (Heg). La construcción de aptámero 4149-8_401 mostró afinidad de unión para PDGF-BB y VEGF121 que era equivalente o mejor que la afinidad de unión de su construcción de aptámero precursor, 4149-8_320. Véase la tabla ^{2 0}.

[0324] Las construcciones de aptámeros 4149-8_320 y 4149-8_401 inhibieron la fosforilación de PDGF-pR inducida por PDGF-BB en fibroblastos Hs27 con valores de CI⁵⁰de aproximadamente 1 nM y 5 nM, respectivamente. Además, la construcción de aptámero 4149-8_401 que comprende un enlazador 5' amino conjugado con PEG de 20 kDa o de 40 kDa mantuvo la capacidad de inhibir la fosforilación de PDGF-Rp inducida por PDGF-BB en fibroblastos Hs27 con valores de CI⁵⁰de aproximadamente 1 nM. Esos resultados son consistentes con la titulación/inhibición estequiométrica de todo el PDGF en el ensayo (monómero 1 nM).

[0325] Se probó otro conjunto de construcciones de aptámeros que comprenden los aptámeros 4149-8_379 y 4867-31_192 para determinar el efecto de la longitud total del enlazador y la orientación de los aptámeros de PDGF y VEGF. Véase la tabla 21. Con VEGF en el extremo 5', se probó de uno a seis enlazadores Heg. Con PDGF en el extremo 5', se probó de dos a seis enlazadores Heg, incluyendo 4149-8_401, que tiene tres enlazadores Heg. Una variante de enlazador Heg no se probó en esta orientación porque mostró una unión algo reducida en una variante relacionada 4149-8_318. Los resultados se muestran en la tabla 16. La mayoría de las construcciones de aptámeros tuvieron un buen desempeño, con la excepción de 4149-8_408 y 4149-8_409, que mostraron una afinidad algo más débil por PDGF-BB. La afinidad de unión del aptámero E10030 de Ophthotech (Fovista) se incluye para la comparación.

[0326] La capacidad de la construcción de aptámero 4149-8_401 para inhibir la actividad de PDGF y VEGF in vitro se probó en los experimentos de fosforilación de receptores como se describió anteriormente. La construcción de aptámero 4149-8_401 inhibió la fosforilación de PDGFRp inducida por PDGF en fibroblastos Hs27 con potencia comparable a la del monómero de PDGF 4149-8_379 (valores de CI⁵⁰de 2,4 nM y 1,7 nM, respectivamente). De manera similar, la construcción de aptámero 4149-8_401 inhibió la fosforilación de VEGFR2 inducida por VEGF en células HUVEC con potencia comparable a la del monómero de VEGF 4867-31_192 (valores de CI⁵⁰de 0,7 nM y 2,1 nM, respectivamente). La figura ¹⁸muestra los resultados de ese experimento. La figura 18A muestra (A) la inhibición de la fosforilación de PDGF Rp inducida por PDGF en fibroblastos Hs27 con el aptámero de P^dG^f4149-8_379 (círculos abiertos) y la construcción de aptámero de PDGF/VEGF 4149-8_401 (círculos cerrados), y (B) la inhibición de la fosforilación de VEGF R2 inducida por VEGF en HUVEC con el aptámero de VEGF 4867-31_192 (círculos abiertos) y la construcción de aptámero de PDGF/VEGF 4149-8_401 (círculos cerrados).

[0327] Heterodímeros basados en el aptámero de PDGF 5169-4 y el aptámero de VEGF 4867-31. Se ha diseñado y probado construcciones de heterodímeros adicionales basadas en las variantes del aptámero de PDGF 5169-4_26 y el aptámero de VEGF 4867-31_192. Las construcciones de aptámerosse sintetizaron de cabeza a cola, se conectaron por de uno a seis enlazadores de hexaetilenglicol (Heg), en ambas orientaciones (ya sea con el aptámero de PDGF en el extremo 5' o el aptámero de VEGF en el extremo 5'). Los resultados se muestran en la tabla 22. Con VEGF en el extremo 5', entre tres y seis enlazadores Heg dieron como resultado las afinidades más altas. Las afinidades en general fueron ligeramente más bajas cuando la secuencia de aptámeros de VEGF-121 estaba en el extremo 3', encontrándose la mayoría de los valores de Kd en el intervalo de 100-300 pM, excepto para la secuencia de cinco enlazadores Heg que tenía una Kd de 56 pM. Con PDGF en el extremo 5', los valores de Kd variaron de 11 pM para tres enlazadores Heg a 0,54 pM para cuatro enlazadores Heg, encontrándoselos valores de Kd restantes en el medio para todas las demás longitudes de enlazador Heg. Cuando PDGF estaba en el extremo 3' hubo una tendencia hacia una mayor afinidad de unión a medida que la longitud del enlazador aumentaba, con un enlazador Heg que tiene una Kd de 5,3 pM y seis enlazadores Heg que tienen una Kd de 0,20 pM. En la tabla 22, "P" denota NapdU, el superíndice "¹" denota una sustitución ²'-O-metilo, ningún superíndice denota desoxirribonucleótidos y "H" denota un enlazador de hexaetilenglicol (Heg).

Ejemplo 12. Unión simultánea de construcciones de aptámeros de PDGF/VEGF a VEGF y PDGF

[0328] Para demostrar la capacidad de las construcciones de aptámeros de PDGF/VEGF para unirse a VEGF y PDGF simultáneamente, se desarrolló un ensayo sándwich. Brevemente, las placas Nunc Maxisorp® se recubrieron con PDGF-BB humano o VEGF-121 humano (20 ng/ml). Después de bloquear los pocillos con una solución de BSA al 1 %, se añadió la construcción de aptámero de PDGF/VEGF (10 nM) y se dejó unir a la diana de proteína adsorbida. Después del lavado, la proteína complementaria biotinilada (PDGF-BB 2 nM para placas recubiertas con VEGF-121 y VEGF-121 2 nM o VEGF-165 para placas recubiertas con PDGF-BB) se dejó unir para formar un complejo ternario. Después de otro lavado, se añadió estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP-SA) y se dejó formar un complejo cuaternario. Después de un lavado final, se añadió un sustrato de peroxidasa de rábano picante formador de color según las instrucciones del fabricante (kit de sustrato Thermo Scientific TMB 34021) y la reacción se detuvo cuando fue apropiado mediante la adición de H²SO⁴1,6 M. La absorbancia por pocillo a 450 nm se determinó con el lector de placas Spectramax M5 con comprobación automática. Paralelamente al procedimiento descrito anteriormente, se ejecutó un conjunto de cuatro experimentos de control en los que se excluyó uno de los 4 componentes que componen el complejo cuaternario.

[0329] Como se muestra en la figura 19, la construcción de aptámero de PDGF/VEGF SL1012 (PEG-N-4149-8_401 de 20 kDa) fue capaz de unirse simultáneamente a VEGF-121 humano y PDGF-BB. Se observó una señal fuerte cuando se añadieron todos los componentes del complejo cuaternario (completo), mientras que la ausencia de cualquiera de los 4 componentes dio como resultado una señal de fondo o casi de fondo. Se obtuvieron resultados similares con placas recubiertas con PDGF y VEGF, lo que indica que el orden de adición de proteína a la construcción de aptámero no importaba. Como se muestra en la figura 19, SL1012 fue capaz de unirse simultáneamente a VEGF-165 humano y PDGF-BB. La figura 19A muestra placas de microtitulación recubiertas con VEGF con adición de PDGF biotinilado. La figura 19B muestra placas de microtitulación recubiertas con PDGF con adición de VEGF biotinilado. Los datos se presentan como la media intervalo de confianza del 95 % (n=3). Se observó una señal fuerte cuando se añadieron todos los componentes del complejo cuaternario (completo), mientras que la exclusión de cualquiera de los cuatro componentes dio como resultado una señal de fondo o casi de fondo. Los datos también demuestran que la adición de un resto PEG al extremo 5' de la construcción de aptámero no excluye la actividad de unión simultánea.

[0330] La unión simultánea de VEGF-165 humano y PDGF-BB humano a (A) SL1012 o y (B) SL1013 (PEG-N-4149-8-401 de 40 kDa) se muestra en la figura 20. Las placas de microtitulación se recubrieron con PDGF con adición de VEGF biotinilado. Completo significa la adición de todos los componentes del complejo cuaternario, mientras que cada condición sin uno de los cuatro componentes se muestra en los gráficos. Los datos se presentan como la media intervalo de confianza del 95 % (n=3)

[0331] Se realizó un experimento similar con diversas construcciones de aptámeros que no contenían el resto PEG. En este experimento, solo se incluyó un control sin aptámero porque los resultados anteriores demostraron el requisito de que los otros componentes del complejo generen señal. Como se muestra en la figura 21, las construcciones de aptámeros 4149-8_317, 4149-8_318, 4149-8_320, 4149-8_401 y 4149-8_414 se unen simultáneamente a PDGF y VEGF independientemente del orden de adición de proteínas. La figura 21(A) muestra placas de microtitulación recubiertas con VEGF con adición de PDGF biotinilado y la figura 21(B) muestra placas de microtitulación recubiertas con PDGF con adición de PDGF biotinilado.

Añadirdatos sobre la unión simultánea de construcciones heterodiméricas basadas en las variantes del aptámero de PDGF 5169-4 y el aptámero de VEGF 4867-31.

Ejemplo 13. Estudios farmacocinéticos intravítreos

[0332] Se realizaron pruebas farmacocinéticas oculares iniciales para comprender cómo se comportan los aptámeros y las construcciones de aptámeros en el ojo. Cuatro aptámeros y construcciones de aptámeros se probaron como se muestra en la tabla 23.

[0333] Para cada aptámero o construcción de aptámero, se realizó una única inyección intravítrea en ambos ojos de cinco conejos blancos de Nueva Zelanda (10 ojos). Los animales recibieron una dosis de 0,5 mg/ojo (SL1010 y SL1011) o una dosis de 1,0 mg/ojo (SL1012 y SL1013). Estas dosis representan únicamente el peso del aptámero o construcción de aptámero (el peso del PEG se excluyó de los cálculos). Todos los artículos de prueba se formularon en solución salina amortiguada con fosfato. Para cada aptámero o artículo de prueba de construcción de aptámero, se recogieron muestras de humor vítreo de ambos ojos de un animal a las 2, 24, 48, 96 o 192 horas después de la dosis. Las muestras de humor vítreo se almacenaron congeladas hasta que se analizaron.

[0334] Las concentraciones de humor vítreo de los aptámeros o construcciones de aptámeros se determinaron mediante procedimientos de ensayo de cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) con detección por absorbancia a 260 nanómetros (nm). Brevemente, el hidrogel vítreo se cortó haciéndolo pasar varias veces a través de una aguja de calibre 20. Las proteínas vítreas se precipitaron mediante la adición de 2 volúmenes de 2-etoxietanol. Después de la centrifugación, el sobrenadante se recuperó e inyectó en una columna Acquity® C18 (0,2 x 100 mm). La temperatura de la columna fue de 80 °C y el caudal se mantuvo a 0,2 ml/min. El amortiguador A consistió en TEAA pH 7,0 y acetonitrilo al 5 %. El amortiguador B consistió en acetonitrilo al 100 %. El programa mantuvo el amortiguador B al 50 % durante 1 minuto después de la inyección de la muestra y a continuación el amortiguador B se aumentó linealmente al 70 % durante 4 minutos. La detección se realizó mediante absorbancia a 260 nm. Las concentraciones (equivalente de ácido libre) de aptámero o construcción de aptámero en el humor vítreo se determinaron mediante interpolación de las unidades de absorbancia pico de las muestras desconocidas con las obtenidas mediante una curva estándar preparada con concentraciones conocidas de aptámero o construcción de aptámero.

[0335] Los resultados del ejemplo 10 se resumen en la tabla 24.

[0336] Un ajuste de regresión lineal habitual del logaritmo natural de la concentración vítrea frente al tiempo dio como resultado estimaciones para las semividas vítreas de 105, 47, 69 y 92 horas para SL1010, SL1011, SL1012 y SL1013, respectivamente. La tabla 25 muestra los resultados, junto con el intervalo de confianza del 95 %.

[0337] Estas semividas vítreas se comparan favorablemente con las semividas en conejos NZW de inhibidores terapéuticos de VEGF de tamaño similar, tales como Macugen (83 horas, Eyetech Study Group (2002) Retina 22:143) y Lucentis (70 horas, Gaudreault y col. (2007) Retina 27:1260). Por lo tanto, estos aptámeros y construcciones de aptámeros pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades oculares tales como DMAE y retinopatía diabética.

Ejemplo 14. Materiales y procedimientos

[0338] Este ejemplo proporciona un resumen de los procedimiento y materiales generales utilizados en los ejemplos que siguen.

[0339] Determinación de sitios sensibles a la nucleasa mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LCMS): para la digestión por DNasa I, se incubó aptámero purificado en gel de poliacrilamida (concentración final de 500 nM) con DNasa I humana recombinante (Cell Sciences, cat n.° CSI10719) (0,3 unidades para 4149-8_379 y 3 unidades para 5169-4_146) en amortiguador de nucleasa (Tris HCl 510 mM pH 7.6, MgCl²2,5 mM, CaCl²0,5 mM) a 37 °C en un volumen de reacción total de 150 pl. Se recogieron alícuotas (50 pl) a 0,30 y 60 minutos y la reacción terminó incubando a 95 °C durante 5 minutos. Para la digestión con DNasa II, se incubaron 500 nM de aptámero purificado en gel con DNasa II porcina (Worthington Biochemical Corporation) (18 unidades para 4867-31_192, ¹unidad para 4149-8_379) en amortiguador de nucleasa (acetato de sodio ¹⁰⁰mM pH 4.6, MgCl²2 mM, NaCl 15 mM) a 37 °C en un volumen de reacción total de 150 pL. Se recogieron alícuotas y las reacciones se detuvieron como se describió anteriormente. Para estos experimentos se utilizaron las versiones que contienen 5'-amina de 4867-31_192 y 4149-8_379 y la versión 5'-OH de 5169-4_146.

[0340] Después de la digestión por nucleasas, los fragmentos de longitud completa y aptámero se separaron mediante cromatografía líquida y se detectaron mediante absorbancia ultravioleta y espectrometría de masas (LCMS). Brevemente, las muestras se analizaron en un sistema LCMS que consiste en un HpLC Agilent 1100 equipado con un desgasificador de vacío (modelo # G1322A), un automuestreador (modelo # G1313A), un módulo de bomba binaria (modelo # G1312A), un administrador de columna con control de temperatura (modelo #G1316A) y un detector de longitud de onda variable (modelo # G1314A)) acoplado a un espectrómetro de masas de trampa iónica Bruker Esquire 3000. Las ejecuciones LCMS se realizaron con el software Agilent Chemstation® (versión B.01.03). La cromatografía se realizó utilizando una columna Hamilton PRP-3, 2,1 x 150 mm a 80 °C . La fase móvil A contenía piperidina 10 mM e imidazol ¹⁰mM, pH aproximadamente ¹⁰(no ajustado); la fase móvil B contenía piperidina ¹⁰mM e imidazol ¹⁰mM en acetonitrilo/agua 75/25. El caudal fue de 0,25 ml/min y la elución del gradiente fue de 0-1 minutos: 0 % de B; 1-20 minutos:0-53 % de B. Se inyectaron muestras (20 pl) y se determinó la absorbancia a 254 nm. Las condiciones de fuente típicas para la detección espectrométrica de masas fueron las siguientes: modo de ionización por electropulverización de iones negativos, presión del nebulizador a 50 psi, gas de secado a 7 l/min, la temperatura de la fuente se estableció en 325 °C y el voltaje capilar se estableció en 3000 V. Las condiciones de captura fueron intervalo de barrido de 200 a 2200 m/z, tiempo de acumulación de 50 mseg, accionamiento de trampa 92, que promedian 25 espectros.

[0341] Los datos se procesaron utilizando Daltonics DataAnalysis® 2.0. Los espectros de masas se obtuvieron sumando a través del pico observado en el TIC y por suavizado usando un algoritmo Svitsky-Golay (ancho de suavizado =0,8 m/z, ciclos=2). Los espectros se desconvolucionaron usando el algoritmo dentro del software Daltonics. Los parámetros incluyeron un intervalo de masa entre 2000-30000 Da, un corte de abundancia del 10 %, picos mínimos en el componente de 3 y un acuerdo de peso molecular del 0,05 %.

[0342] Ensayo de estabilidad del aptámero de DNasa I: los aptámeros purificados en gel de poliacrilamida a una concentración final de 250 nM se incubaron con 2 o 10 unidades/ml de DNasa I humana recombinante (Cell Sciences, cat n.° CSI10719) en amortiguador de nucleasa (Tris HCl 10 mM pH 7,6, MgCl²2,5 mM, CaCl²0,5 mM) a 37 °C en un volumen de reacción total de 100 pl. En diversos momentos, se recogió una alícuota de 20 pl y la reacción se detuvo mediante la adición de un volumen igual de amortiguador de carga de gel 2x (formamida al 93,85 %, SDS al 0,03 %, Na²EDTA 20 mMxilencilanol al 0,01 % y Orange G al 0,01 %) y calentamiento a 95 °C durante 2 minutos. Las muestras se cargaron en un gel desnaturalizante de poliacrilamida TBE al 15 % (urea ⁸M) y se realizó electroforesis a 200 V durante 20 minutos, Los geles se tiñeron con aproximadamente SYBR® Gold 2 pM (Molecular Probes, cat. n.° S11494) durante 10 minutos para visualizar las bandas. La cantidad de aptámero de longitud completa restante en cada momento se cuantificó utilizando el software de análisis FlourChem®Q (Alpha Innotech). Si es necesario, la intensidad de cada banda se determinó después de una sustracción de fondo y los datos se presentan como un porcentaje restante del ADN de entrada de longitud completa en el punto de tiempo cero. Los aptámeros con un hidroxilo en el extremo 5' se utilizaron para estos experimentos, excepto para el aptámero 4149-8_379 que albergaba una amina del extremo 5'.

[0343] Ensayo de estabilidad del aptámero de DNasa II: los aptámeros purificados en gel de poliacrilamida a una concentración final de 250 nM se incubaron con 120 unidades/ml o 240 unidades/ml de DNasa II porcina (Worthington Biochemical Corporation) en amortiguador de nucleasa (NaOAc 0,1 M pH 4,6, MgCb 2,0 mM, NaCb 15 mM) a 37 °C en un volumen de reacción total de 100 pl. En diversos momentos, se recogió una alícuota de 20 pl y la reacción se detuvo mediante la adición de un volumen igual de amortiguador de carga de gel 2x (formamida al 93,85 %, SDS al 0,03 %, Na²EDTA 20 mMxilencilanol al 0,01 % y Orange G al 0,01 %) y calentamiento a 95 °C durante 2 minutos. Las muestras se cargaron en un gel desnaturalizante de poliacrilamida TBE al 15 % (urea ⁸M) y se realizó electroforesis a 200 V durante 20 minutos. Los geles se tiñeron con aproximadamente SYBR® Gold 2 pM (Molecular Probes, cat. n.° S11494) durante 10 minutos para visualizar las bandas. La cantidad de SOMAmer de longitud completa restante en cada punto de tiempo se cuantificó utilizando el software de análisis FlourChem® Q (Alpha Innotech). Si es necesario, la intensidad de cada banda se determinó después de una sustracción de fondo y los datos se presentan como un porcentaje restante del ADN de entrada de longitud completa en el punto de tiempo cero. Los aptámeros con un hidroxilo en el extremo 5' se utilizaron para estos experimentos, excepto para el aptámero 4149-8_379 que albergaba una amina del extremo 5'.

[0344] Ensayo de estabilidad de SOMAmer en humor vitreo de conejo: los aptámeros purificados en gel de poliacrilamida a una concentración final de 500 nM se incubaron en humor vítreo agrupado al 90 % de conejos blancos de Nueva Zelanda (Bioreclamation IIC, cat. n.° RAB-VITHUM. Las muestras se incubaron a 37 °C en un volumen de reacción total de ^{2 0 0}pl (las muestras también contenían una concentración final de solución salina amortiguada con fosfato al 0,067 %). En diversos puntos de tiempo, se recogió una alícuota de 20 pl y la reacción se detuvo mediante la adición de un volumen igual de amortiguador de carga de gel 2x (formamida al 93,85 %, SDS al 0,03 %, Na²EDTA 20 mM, xilencilanol al 0,01 % y Orange G al 0,01 %). Las muestras se almacenaron a -20 °C hasta que se procesaron. A cada muestra se le añadieron 100 pl de agua seguido de 150 pl de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico 25:24:1 (AMRESCO). Las muestras se mezclaron y se centrifugaron a 16.100 x g durante 15 minutos. La fase acuosa se recogió y congeló a -20 °C hasta el análisis en gel. Las muestras (15 pl) se cargaron en un gel desnaturalizante de poliacrilamida TBE al 15 % (urea ⁸M) y se realizó electroforesis durante aproximadamente 20 minutos a 200 V. Los geles se tiñeron con aproximadamente SYBR® Gold 2 pM (Molecular Probes, cat. n.° S11494) durante 10 minutos para visualizar las bandas. La cantidad de SOMAmer de longitud completa restante en cada punto de tiempo se cuantificó utilizando el software de análisis FlourChem® Q (Alpha Innotech). Si era necesario, la intensidad de cada banda se determinó después de una sustracción de fondo y los datos se presentaron como un porcentaje restante del ADN de entrada de longitud completa en el punto de tiempo cero.

[0345] Procedimientos de ensayo de unión competitiva: los aptámeros que se usarán como ligandos en el ensayo de unión competitiva se marcaron en el extremo 5' usando polinucleótido quinasa T4 (New England Biolabs) y Y-[32P]ATP (Perkin Elmer). El ensayo de competencia se realizó combinando volúmenes iguales de ligando 2 nM con competidor no marcado (concentraciones que varían de 10'6 a 10'11 M) en 1 x amortiguador SB18T [Hepes 40 mM (pH 7,5), NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCh 5 mM y TWEEN-20 al 0,01 %]. Se añadió PDGF-BB humano (Creative Biomart) a una concentración de 200 pM en 1 X de amortiguador SB18T a las mezclas de ligando/competidor y las reacciones se incubaron a 37 °C durante 40 minutos. Los complejos unidos se mezclaron con resina Zorbax® (Agilent Technologies) y se capturaron en placas de filtro Durapore®. La señal en cada pocillo se cuantificó con un PhosphorImager (FUJI FLA-3000). Los datos de unión sin procesar se corrigieron para la señal de fondo y se normalizaron a la fracción unida para ningún competidor. Para determinar las constantes inhibidoras (Ki), los datos se graficaron en GraphPad Prism® ⁶y se ajustaron a una curva de competencia de un sitio.

Ejemplo 15. Aptámeros de VEGF con estabilidad de nucleasa mejorada

[0346] Este ejemplo proporciona las modificaciones químicas aplicadas a los aptámeros de VEGF que mejoran la estabilidad de nucleasa de los aptámeros. En este ejemplo, se utilizan las siguientes abreviaturas en contexto con el aptámero: P es NapdU y 2'-OMe es un nucleótido 2'-O-metilo. Para mejorar la resistencia a la nucleasa de los aptámeros modificados con constantes de disociación lentas que contienen NapdU (SOMAmers) seleccionados para unirse al factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF), se añadieron grupos 2'-O-metilo (2'-OMe) en posiciones de nucleótidos en las que la unión a la proteína VEGF no se vio afectada significativamente. Estos esfuerzos condujeron al descubrimiento del aptámero 4867-31_192 que contiene nueve grupos 2'-OMe dentro de la secuencia de 29 nucleótidos. El uso de nucleótidos Nap-dU, las sustituciones de 2'-OMe y la adición de una desoxitimidina invertida en el extremo 3' en 4867-31_192 juntos transmiten un grado sustancial de protección de nucleasas en comparación con el ADN no modificado. Sin embargo, 4867-31_192 todavía no es completamente estable en presencia de algunas nucleasas. Por ejemplo, si bien es estable contra la DNasa recombinante humana I (figura 23A), 4867-31_192 se digiere mediante la DNasa porcina II (figura 23B). Como se muestra en la figura 23B, una disminución en la cantidad de aptámero de longitud completa con el tiempo indica sensibilidad a la digestión por DNasa II.

[0347] Para determinar la viabilidad de estabilizar aún más el aptámero mediante el uso de enlaces fosforotioato, se realizó una sustitución sistemática de fosforotioatos en lugar de enlaces fosfodiéster individuales (el experimento de "recorrido de fosforotioato") para determinar qué posiciones del aptámero 4867-31_192 podían aceptar un enlace fosforotioato sin afectar significativamente la unión al VEGF121. Para todas las secuencias en este ejemplo y los ejemplos posteriores, un nucleótido que tiene un superíndice "¹" indica que el nucleótido tiene una modificación de ²'-O-metilo, y un nucleótido que tiene un superíndice "²" indica que el nucleótido tiene un grupo 3'-fosforotioato y une ese nucleótido al nucleótido inmediatamente 3' a él). Un nucleótido que tiene tanto el superíndice "1" como "2" indica que el nucleótido tiene una modificación 2'-O-metilo y un grupo fosforotioato 3' y une ese nucleótido al nucleótido inmediatamente 3'. Todos los aptámeros se probaron para determinar su unión con la inclusión de una desoxitimidina invertida en el extremo 3'. Los resultados del ejemplo 10 se resumen en la tabla 26. La mayoría de las posiciones probadas, pero no todas, podrían aceptar un enlace fosforotioato sin afectar gravemente la unión. Una excepción importante fue la guanina en la posición 3 (4867-31_410) donde la sustitución de un enlace fosforotioato por el enlace fosfordiéster natural redujo la afinidad por VEGF121 en 29,259 veces.

[0348] Dado que los sitios sensibles a la nucleasa no se pueden predecir, las posiciones de los sitios de escisión sensibles a la DNasa II se identificaron mediante espectrometría de masas después de la incubación con DNasa II porcina como se describe en el ejemplo 14 (datos no mostrados). Para el aptámero 4867-31_192 (con la adición de una desoxitimidina invertida en el extremo 3') se identificaron dos fragmentos principales. El fragmento uno contenía los nucleótidos 1 a 24, mientras que el fragmento dos contenía los nucleótidos 1 a 25. Por lo tanto, se creó una serie de aptámeros en los que los enlaces fosforotioato se sustituyeron por enlaces fosfodiéster en diversas combinaciones entre las posiciones de nucleótidos 24 y 25, 25 y 26, y 26 y 27 como se muestra en la tabla 27. Se permitieron sustituciones en las 3 posiciones, ya que ninguna afectó significativamente la unión (tabla 26). Las sustituciones de fosforotioato se probaron con o sin la adición de una citosina 2'-OMe en la posición 1 (tabla 27). Para los experimentos de estabilidad de nucleasas, se estudiaron todos los aptámeros posteriores con la inclusión de una desoxitimidina invertida en el extremo 3'.

[0349] La susceptibilidad a la DNasa II se examinó como se describe en el ejemplo 14 y los datos se presentan en la figura 24. Todos los aptámeros probados que tenían enlaces fosforotioato entre las posiciones 24 y 25 y 25 y 26 fueron más estables en este ensayo que los aptámeros que no se modificaron en estas dos posiciones. Esta tendencia se observó para aptámeros con o sin un 2'-OMe en la posición 1.

[0350] El aptámero 4867-31_192 y un subconjunto de aptámeros con enlaces fosforotioato en ambas posiciones clave se probaron a continuación para determinar la estabilidad en humor vítreo de conejo al 90 % (figura 25). Debido a que se está considerando desarrollar antagonistas basados en aptámeros para VEGF y PDGF para el tratamiento del trastorno ocular, la estabilidad en el humor vítreo tiene relevancia para su efectividad terapéutica. Como se ilustra en la gráfica del porcentaje de aptámeros de longitud completa restantes frente al tiempo de incubación (figura 25), todos los aptámeros modificados con enlaces fosforotioato fueron más estables (a las 192 horas) en esta matriz biológica que 4867-31_192 (sin enlaces fosforotioato).

[0351] Para asegurar que estas sustituciones no afectaran negativamente la unión, se realizó un experimento para probar cada aptámero para la unión a la proteína VEGF121 humana. Todas las secuencias probadas conservaron una unión de alta afinidad a la diana. Las constantes de disociación (valores de Kd) obtenidas en este experimento se muestran en la tabla 27.

[0352] La figura 24 muestra el porcentaje de aptámero de longitud completa restante frente al tiempo de incubación con DNasa II como se describe en el ejemplo 14. Los aptámeros (todos a 250 nM), como lo indica el número de identificación del aptámero (n.° de ID de aptámero), se incubaron a 37 °C durante el número indicado de horas con 0,24 unidades/pl de DNasa II y los productos de digestión se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida. Tal como se determina por densitrometría, se grafica el porcentaje de aptámero de longitud completa restante frente al tiempo de incubación. La gráfica para el n.° de ID de aptámero 4867-31_192 en la figura 24 es la misma gráfica que se muestra en la figura 23B.

[0353] La figura 25 muestra el porcentaje de aptámero de longitud completa restante frente al tiempo de incubación en humor vítreo como se describe en el ejemplo 14. Los aptámeros (todos a 500 nM) como lo indica el número de identificación del aptámero (n.° de ID de aptámero.) se incubaron a 37 °C durante el número indicado de horas en humor vítreo al 90 % obtenido de conejos blancos de Nueva Zelanda. Los aptámeros se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. La figura 25 muestra el porcentaje restante de cada banda de aptámero de longitud completa frente al tiempo determinado por densitometría.

[0354] En resumen, estos datos, generalmente, indican que el aptámero 4867-31 con enlaces fosforotioato es menos sensible a la digestión por nucleasas que el aptámero 4867-31 sin enlaces fosforotioato, y además, que el aptámero 4867-31 con enlaces fosforotioato conserva la afinidad de unión a la diana de proteína VEGF.

Ejemplo 16. Aptámeros de PDGF con estabilidad de nucleasa mejorada

[0355] Este ejemplo proporciona las modificaciones químicas aplicadas a los aptámeros de PDGF (por ejemplo, 5169-4) que mejoran la estabilidad de nucleasa de los aptámeros. En este ejemplo, se utilizan las siguientes abreviaturas en contexto con el aptámero: P es NapdU y 2'-OMe es un nucleótido 2'-O-metilo.

[0356] Para mejorar la resistencia a la nucleasa de los aptámeros modificados con constantes de disociación lentas que contienen NapdU (SOMAmers) seleccionados para unirse al factor de crecimiento derivado de plaquetas humanas (PDGFBB), se añadieron grupos 2'-O-metilo (2'-OMe) en posiciones de nucleótidos en las que la unión a la proteína PDGF no se vio o solo se vio mínimamente afectada. Estos esfuerzos condujeron al descubrimiento del aptámero 5169-4_146 que contiene once grupos 2'-OMe dentro de la secuencia de 21 nucleótidos. Con estas once modificaciones de 2'-OMe y una desoxitimidina invertida en el extremo 3', 5169-4_146 es estable contra la DNasa II, pero no contra la DNasa I (figura 26). Por lo tanto, a diferencia de los aptámeros de VEGF 4867-31_192 descritos en el ejemplo 15 que eran más sensibles a la DNasa II que a la DNasa I, los aptámeros de PDGF-BB 5169-4_146 muestran una mayor sensibilidad a la DNasa I en comparación con la DNasa II. En otras palabras, la sensibilidad de 5169-4_146 a la DNasa I, pero no a la DNasa II, es opuesta al resultado encontrado en el ejemplo 15 y muestra la imprevisibilidad de la sensibilidad de los aptámeros a las nucleasas. Esto sugiere que la sensibilidad intrínseca a la degradación por nucleasas específicas no puede predecirse y debe determinarse empíricamente. Una vez que se determina esta sensibilidad a una nucleasa específica, se puede lograr una estabilidad adicional con sustituciones de fosforotioato adicionales en las posiciones sensibles restantes. Como se muestra en la figura 26A, una disminución en el aptámero de longitud completa con el tiempo indica sensibilidad a la digestión por DNasa I.

[0357] Como se muestra en la figura 26, el aptámero 5169-4_146 (250 nM) se incubó a 37 °C durante el número indicado de horas con 0,01 unidades/pl de DNasa I (figura 26A) o 0,12 unidades/pl de DNasa II (figura 26B) como se describe en el ejemplo 14 y los productos de digestión se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida. Tal como se determina por densitrometría, se grafica el porcentaje de aptámero de longitud completa restante frente al tiempo de incubación.

[0358] Para determinar la viabilidad de estabilizar adicionalmente el aptámero mediante el uso de enlaces fosforotioato, se realizó un experimento de "recorrido de fosforotioato" en 5169-4_146 con el fin de determinar qué posiciones podrían aceptar un fosforotioato sin afectar significativamente la unión del aptámero al PDGF. Los resultados de este recorrido se resumen en la tabla 28. Todos los aptámeros probados incluyeron una desoxitimidina invertida en el extremo 3'. La sustitución de fosforotioato fue bien tolerada en todas las posiciones de la secuencia 5169-4_146. El deterioro máximo de la unión a PDGF fue una reducción de la afinidad en 1,8 veces (5169-4_154).

[0359] De manera similar al ejemplo 15, la posición de los nucleótidos sensibles de 5169-4_146 (con una desoxitimidina invertida en el extremo 3') para escindirse por DNasa I se identificó mediante espectrometría de masas y estos "sitios de nucleasa" más sensibles se protegieron mediante la sustitución de un enlace 3'-fosforotioato en lugar del enlace 3'-fosfodiéster natural.

[0360] Para el aptámero 5169-4_146 se identificaron varios fragmentos después de la digestión con DNasa recombinante humana I. Estos fragmentos revelaron sitios sensibles a la DNasa I entre las posiciones de nucleótidos 9 y 10; 10 y 11; 11 y 12; y 12 y 13. Por lo tanto, se creó un aptámero en el que los enlaces fosforotioato se sustituyeron por fosfodiéster en estas cuatro posiciones y se designaron como el aptámero 5169-4_182 (tabla 29). Estos aptámeros se probaron para determinar la resistencia a nucleasas con la inclusión de una desoxitimidina invertida en el extremo 3'. La susceptibilidad a la DNasa I se examinó como antes (figura 27). El aptámero que contiene fosforotioato fue claramente más estable que 5169-4_146.

[0361] Como se muestra en la figura 27, el aptámero 5169-4_182 (250 nM) se incubó a 37 °C durante el número indicado de horas con 0,01 unidades/pl de DNasa I como se describe en el ejemplo 14 y los productos de digestión se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida. Las bandas se visualizaron con SYBR Gold y, según lo determinado por densitrometría, se grafica el porcentaje de aptámero de longitud completa restante frente al tiempo de incubación.

[0362] El mismo aptámero también se probó para determinar la estabilidad en el humor vítreo de conejo al 90 % (figura 28). Como se ilustra en la gráfica del porcentaje de aptámeros de longitud completa restantes frente al tiempo de incubación (figura 28), el aptámero 5169-4_182 (con enlaces fosforotioato) fue más estable en esta matriz biológica que 5169-4_146 (sin enlaces fosforotioato).

[0363] Como se muestra en la figura 28, los aptámeros (a 500 nM) como se indica se incubaron a 37 °C durante el número indicado de horas en humor vítreo al 90 % obtenido de conejos blancos de Nueva Zelanda como se describe en el ejemplo 14. Los aptámeros se visualizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. La figura 28 muestra el porcentaje restante de cada banda de aptámero de longitud completa (SOMAmer) frente al tiempo determinado por densitometría.

[0364] Aunque 5169-4_182 fue claramente más estable que 5169-4_146, un producto de digestión de DNasa I de 5169-4_182 fue claramente visible (datos no mostrados). Usando la espectrometría de masas descrita en el ejemplo 14, el sitio de escisión para este producto de digestión principal se identificó entre las posiciones de nucleótidos 4 y 5. Esto fue sorprendente ya que la posición de nucleótido 4 ya estaba protegida por un resto 2'-OMe (tabla 29). Este resultado ilustra el hecho de que hay nucleasas capaces de escindir enlaces fosfodiéster adyacentes a nucleótidos sustituidos con 2'-OME. Sin embargo, se sustituyó un enlace 3'-fosforotioato por el enlace fosfodiéster natural entre las posiciones de nucleótidos 4 y 5 de 5169-4_182 para crear el aptámero 5169-4_188 (tabla 29). La susceptibilidad a la DNasa I se examinó como antes (figura 29). Los aptámeros 5169-4_182 y 5169-4_188 fueron más estables que 5169-4_146. La adición de un enlace fosforotioato entre los nucleótidos 4 y 5 en 5169-4_188 eliminó la apariencia del producto de digestión estable observado para 5169-4_182 (datos no mostrados) que condujo a una mejor estabilidad contra la DNasa I (figura 29).

[0365] Como se muestra en la figura 29, los aptámeros, como lo indica el número de identificación del aptámero. (n.° de ID de aptámero), se incubaron a 37 °C durante el número indicado de horas con 0,01 unidades/pl de DNasa I como se describe en el ejemplo 14 y los productos de digestión se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida. Las bandas se visualizaron con SYBR Gold y, según lo determinado por densitrometría, se grafica el porcentaje de aptámero de longitud completa restante frente al tiempo de incubación.

[0366] Para asegurar que estas sustituciones no afectaran negativamente la unión, se realizó un experimento para determinar la afinidad de cada aptámero por la proteína PDGFBB humana. Todas las secuencias probadas conservaron una unión de alta afinidad a la diana. Las constantes de disociación (valores de Kd) obtenidas en este experimento se muestran en la tabla 29.

[0367] En resumen, estos datos, generalmente, indican que el aptámero 5169-4 con enlaces fosforotioato son menos sensibles a la digestión por nucleasas que el aptámero 5169-4 sin enlaces fosforotioato, y además, que el aptámero 5169-4 con enlaces fosforotioato conserva la afinidad de unión a la diana de proteína PDGf .

Ejemplo 17. Aptámeros de PDGF adicionales con estabilidad de nucleasa mejorada

[0368] Este ejemplo proporciona las modificaciones químicas aplicadas a los aptámeros de PDGF (por ejemplo, 4149-8) que mejoran la estabilidad de nucleasa de los aptámeros. En este ejemplo, se utilizan las siguientes abreviaturas en contexto con el aptámero: P es una NapdU; 2'-OMe es un nucleótido 2'-O-metilo; Bn es un BenzyldU (BndU); M es un metoxibencilo (MBndU); V es un espaciador de 3 carbonos; e i es iBudU.

[0369] Para mejorar la resistencia a la nucleasa de los aptámeros modificados con constantes de disociación lentas que contienen BndU (SOMAmers) seleccionados para unirse al factor de crecimiento derivado de plaquetas humanas (PDGFBB), se añadieron grupos 2'-O-metilo (2'-OMe) en posiciones de nucleótidos en las que la unión a la proteína PDGF no se vio afectada significativamente. Estos esfuerzos condujeron al descubrimiento del aptámero 4149-8_379 que contiene siete grupos 2'-OMe dentro de la secuencia de 24 nucleótidos. Incluso con estas siete modificaciones de 2'-OMe, 4149-8_379 todavía no es impermeable a la digestión por nucleasas. Por ejemplo, 4149-8_379 se puede digerir con DNasa I humana recombinante (datos no mostrados) y DNasa II porcina (figura 30). Como se muestra en la figura 30, una disminución del aptámero de longitud completa con el tiempo indica sensibilidad a la digestión por DNasa II. Esta sensibilidad tanto a la DNasa I como a la DNasa II para 4149-8 379 es diferente a la encontrada para los ejemplos 15 y 16 y nuevamente muestra la imprevisibilidad de la estabilidad de la nucleasa de los aptámeros.

[0370] Como se muestra en la figura 30, el aptámero 4149-8_379 (250 nM) se incubó a 37 °C durante el número indicado de horas con 0,12 unidades/pl de DNasa II como se describe en el ejemplo 14 y los productos de digestión se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Las bandas se visualizaron con SYBR Gold y, según lo determinado por densitrometría, se grafica el porcentaje de aptámero de longitud completa restante frente al tiempo de incubación.

[0371] Con el fin de mejorar aún más la resistencia a la nucleasa de este aptámero, la posición de los nucleótidos sensibles a la acción de la DNasa I y la DNasa II se identificaron mediante espectrometría de masas mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 14. Se identificaron sitios sensibles a la DNasa I entre las posiciones de nucleótidos 15 y 16 y entre las posiciones de nucleótidos 16 y 17. Se identificó un sitio sensible a la DNasa II entre las posiciones de nucleótidos 9 y 10. Por lo tanto, los enlaces fosforotioato se sustituyeron por los enlaces fosfodiéster en estas tres posiciones. Además, se sustituyó un enlace fosforotioato por el enlace fosfodiéster entre los nucleótidos 17 y 18. Finalmente, el nucleótido 3,4 metilendioxibencil-dU (o MBndU; designado por M en las tablas 30 y 31) en la posición 2 se reemplazó con una BndU y la BndU en la posición 16 se reemplazó con una NapdU. Este aptámero se designó 4149-8_454 (tabla 30). Se creó el aptámero 4149-8_455 que, además de las modificaciones de 4149-8_454, también contenía un 2'-OMe G como posición 13 y un enlace fosforotioato en lugar del enlace fosfodiéster natural entre los nucleótidos ⁸y 9 (tabla 30). Aunque no se realizó un recorrido completo de fosforotioato, se crearon varias secuencias y se probaron para determinar la afinidad por PDGFBB (tabla 31). Algunas de estas secuencias que sirvieron como guía para crear los aptámeros se muestran en la tabla 31.

[0372] La susceptibilidad a la DNasa II se examinó como antes (figura 31) cuando todos los aptámeros contenían una desoxitimidina invertida en el extremo 3'. Los resultados muestran que el aptámero 4149-8_455 fue más estable que 4149-8_454, que fue más estable que 4149-8_379.

[0373] Los aptámeros 4149-8_379 y 4149-8_454 con la adición de una desoxitimidina invertida en el extremo 3' se probaron para determinar la estabilidad en humor vítreo de conejo al 90 % (datos no mostrados). Sin embargo, en esta matriz biológica no se obtuvo estabilidad adicional con 4149-8_454 en comparación con 4149-8_379.

[0374] Para asegurar que estas sustituciones no afectaran negativamente la unión, se realizó un experimento para determinar la afinidad de cada aptámero por la proteína PDGFBB humana. Todas las secuencias probadas conservaron su afinidad de unión a la diana. Las constantes de disociación (valores de Kd) obtenidas en este experimento se muestran en la tabla 30.

[0375] Como se muestra en la figura 31, los aptámeros como se indica por el número de ID de aptámero (es decir, 4149-8_379;4149-8_454 y 4149-8_455) se incubaron a 37 °C durante el número indicado de horas con DNasa II y los productos de digestión se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida. Como se grafica el porcentaje de aptámero de longitud completa, según lo determinado por densitrometría a partir de la imagen de gel, frente al tiempo de incubación. La gráfica para el n.° de ID de aptámero 4149-8_379 en la figura 31 es la misma gráfica que se muestra en la figura 30.

Tabla 1. Secuencias representativas del 4149-8- 1 y variantes truncadas con valores de Kd para PDGF de 10 nM o menos

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T l 1 H m ímr l m r PD F 414- 2 L :

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Tabla 2. Secuencias representativas de las variantes truncadas con valores de Kd para PDGF de más de 10 nM

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T l . Tr n mi n l l n m r PD F 414- 1.

(continuación)

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Tabla 4. Reco ilación de datos, refinamiento estadísticas de modelos.

Tabla 5. Parámetros de pares de bases para el aptámero de PDGF BB en comparación con el ADN de forma

B.

Tabla 6. Truncamientos del clon de a támero de PDGF 5169-4.

(continuación)

T l 7. i i n l i r n l i i n n 1 -42.

(continuación)

Tabla 8. Sustituciones de 2'O-metilo desoxitimidina en 5169-4 26.

continuación

T l . M li l i i n 2'- -m il n l mr PD F 1 -42.

(continuación)

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T l 12: i i n 2'- -m il n l mr VE F 4 7- 14

(continuación)

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T l 1. H m ímr PD F 414- 7 1 -42.

(continuación)

(continuación)

T l 1. H m ímr VE F 4 7-1 12.

(continuación)

Tabla 18: afinidad de unión actividad in vitro de construcciones de a támeros de PDGF-VEGF.

T l 2. Afini ni n l n r i n mr PD FVE F 414- 41

Tabla 21: afinidades de unión de construcciones de aptámeros de PDGF/VEGF que comprenden 4149-8_379

4 7- 112

Tabla 22. Afinidades de unión de construcciones de aptámeros de PDGF/VEGF que comprenden 5169-4_26 y

4867-31 192.

(continuación)

Tabla 23. A támeros construcciones de a támeros robados en estudios PK oculares.

Tabla 24. Concentraciones en el humor vítreo para aptámero y construcciones de aptámeros en los estudios farmacocinéticos oculares.

Tabla 25 Semivida del humor vitreo para aptámero y construcciones de aptámeros después de una dosis intravítrea bilateral única para conejos NZW.

Tabla 26. Recorrido de fosforotioato or el a támero 4867-31 192.

(continuación)

Tabla 27. Secuencias de los aptámeros de VEGF creados para mejorar la resistencia a la nucleasa. Se muestra la constante de disociación de unión (valores de Kd) junto con el número de restos 2'-OMe (# OMe; el superíndice "1" indica que el nucleótido tiene un 2'-O-metilo) y los enlaces 3'-fosforotioato (# P=S; el superíndice "2" indica que el nucleótido tiene un enlace fosforotioato.

(continuación)

T l 2. n r rri f f r i r l mr 1 -414.

(continuación)

Tabla 29. Secuencias de los aptámeros de PDGFBB creados para mejorar la resistencia a la nucleasa. Se muestran la constante de disociación de unión (valores de Kd) junto con el número de restos 2'-OMe (# OMe; el superíndice "1" indica que el nucleótido tiene un 2'-O-metilo) y los enlaces 3'-fosforotioato (# P=S; el superíndice "2" indica que el nucleótido tiene un enlace fosforotioato.

Tabla 30. Secuencias de los aptámeros de PDGF creados para mejorar la resistencia a la nucleasa. Se muestran la constante de disociación de unión (valores de Kd) junto con el número de restos 2'-OMe (# OMe; el superíndice "1" indica que el nucleótido tiene un 2'-O-metilo) y los enlaces 3'-fosforotioato (# P=S; el superíndice "2" indica que el nucleótido tiene un enlace fosforotioato.

(continuación)

T l 1. ni l mr PD F r r m r r l r i ni l n l .

(continuación)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico:

(A) 5'-C-G-A-C-A-G-C-A-Z-G-Z-A-Z-G-C-A-C-A-Z-C-Z-3' (SEQ ID NO:830),

(B) 5'-C1-G-A-C1'2-A-G1-C1-A-Z2-G2-Z2-A2-Z2-G1-C1-A1-C1-A1-Z-C1-Z1-3' (SEQ ID NO:833),

donde,

C1'2 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una citidina, una citidina que comprende un enlace fosforotioato, una desoxicitidina, una desoxicitidina que comprende un enlace fosforotioato, una 2'-O-metilcitidina y una 2'-O-metilcitidina que comprende un enlace fosforotioato;

Z1 se selecciona independientemente, para cada aparición, del grupo que consiste en una uridina, una desoxiuridina, una 2-O-metiluridina, una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) y una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un grupo 2'-O-metilo;

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1(A), donde:

3. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1(A) o 2(i)-(v), donde:

4. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1(A), 2(i)-(iii), 2(v) o 3, donde la molécula de ácido nucleico se une a una proteína PDGF con una afinidad de unión inferior a 10 nM, inferior a 5 nM, inferior a 2 nM, inferior a 1 nM o inferior a 0,1 nM.

5. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1(A), 2(i), 3 o 4, donde la molécula de ácido nucleico comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve nucleósidos 2'-O-metilo.

6. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde:

7. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1(B), donde:

(i) C1'2 es una 2'-O-metilcitidina que comprende un enlace fosforotioato; opcionalmente, donde Z1 es una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un grupo 2'-O-metilo;

(ii) Z2 es una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU) que comprende un enlace fosforotioato;

(iii) Z es una 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU);

(iv) C1 es una 2'-O-metilcitidina;

(v) G1 es una 2-O-metilguanosina;

(vi) G2 es una desoxiguanosina que comprende un enlace fosforotioato

(vii) A1 es una 2'-O-metiladenosina; o

(viii) A2 es una desoxiadenosina que comprende un enlace fosforotioato

8. Una composición que comprende dos moléculas de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores; opcionalmente donde:

9. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1(A), 1(B), 2(i)-(v), 4, 7(i), 7(ii) o 7(v), donde la molécula de ácido nucleico inhibe la fosforilación mediada por PDGF de un receptor de PDGF.

10. Una composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un portador farmacéuticamente aceptable; opcionalmente, donde la composición farmacéutica es para inyección intravítrea.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, para su uso en:

v) tratar una enfermedad cardiovascular; opcionalmente, donde la enfermedad cardiovascular se selecciona de aterosclerosis, reestenosis, una afección relacionada con hipertrofia cardíaca y un trastorno vascular; o

vi) tratarel cáncer; opcionalmente, donde el cáncer se selecciona de cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de mama, melanoma, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer ocular, linfoma, cáncer de endometrio, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer renal, cáncer de próstata, leucemia y cáncer de tiroides.