JP4951339B2 - 眼血管新生疾患の治療のための併用療法 - Google Patents

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Description

本出願は、眼科学及び医学の分野に関する。より詳細には、本発明は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の両方を阻害する薬剤の組合せを使用した眼の血管新生疾患の治療に関する。
新生血管形成とも呼ばれる血管新生は、既存血管からの発芽形成及び周辺組織へのこれらの侵入を含む。関連過程である血管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、既に組織全体に存在する内皮細胞及び血管芽細胞の分化、及び続いて血管を形成するためにこれらが共に結合することを含む。
血管新生は発生の間広汎に起こり、また損傷又は傷害後に組織への血流を回復するために創傷治癒の間健常身体においても起こる。血管新生は、しかしながら、癌及び腫瘍形成にも関係付けられてきた。実際に、腫瘍組織中の血管の量は、乳癌（Ｗｅｉｄｎｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８４：１８７５−１８８７）、前立腺癌（Ｗｅｉｄｎｅｒら（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４３：４０１−４０９）、脳腫瘍（Ｌｉら（１９９４）Ｌａｎｃｅｔ ３４４：８２−８６）、及び黒色腫（Ｆｏｓｓら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：２９００−２９０３）における強力な負の予後指標である。血管新生はまた、最近になってリウマチ病学、皮膚科学、心臓病学及び眼科学を含む医学の多くの領域において他の疾患状態にも関係付けられた。特に、望ましくない又は病的な組織特異的血管新生は、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症及び乾癬を含むある種の特定疾患状態に結びついてきた（例えばＦａｎら（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１６：５７；及びＦｏｌｋｍａｎ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：２７）。さらに、血管透過性の変化は、正常及び病的な生理的過程の両方において役割を果たすと思われる（Ｃｕｌｌｉｎａｎ−Ｂｏｖｅら（１９９３）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３３：８２９；Ｓｅｎｇｅｒら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ １２：３０３）。これらの疾患の各々における血管新生過程は、発生的血管新生及び腫瘍血管新生と多くの特徴を共有すると考えられるが、各々はまた、周辺細胞の影響によって与えられるユニークな側面も有し得る。
いくつかの眼疾患は血管新生の変化を含む。例えば成人失明の主要原因の第３位である（米国では失明のほぼ７％を占める）糖尿病性網膜症は、広汎な血管新生事象に関連する。非増殖性網膜症は網膜内の血管周囲細胞の選択的喪失を伴い、これらの喪失は、関連毛細血管の拡張及び血流の増加をもたらす。拡張した毛細血管では、内皮細胞が増殖してアウトパウチング（ｏｕｔｐｏｕｃｈｉｎｇｓ）を形成し、これが微細動脈瘤となって、隣接毛細血管は、これらの微細動脈瘤の周囲の網膜の領域が灌流されないようにブロックされる。最終的に、微細動脈瘤の隣接領域の間に短絡血管が出現し、微細動脈瘤及び非灌流網膜の領域を伴う初期糖尿病性網膜症の臨床像が見られる。微細動脈瘤が漏出し、毛細血管が出血して、滲出物及び出血を引き起こし得る。ひとたびバックグラウンド糖尿病性網膜症の初期段階が確立されると、この状態が何年にもわたって進行し、増殖性糖尿病性網膜症及び症例の約５％では失明へと進む。増殖性糖尿病性網膜症は、網膜の一部の領域が継続してこれらの毛細血管を失い続け、非灌流状態となった時に起こり、円板上及び網膜の他の場所で新しい血管の出現を導く。これらの新生血管は硝子体へと発育し、容易に出血して、網膜前出血を導く。進行した増殖性糖尿病性網膜症では、大量の硝子体出血が硝子体腔の主要部分を満たすことがある。加えて、新生血管は、牽引網膜剥離を導き得る線維組織増殖を伴う。
糖尿病性網膜症は、主として真性糖尿病の持続を伴う；従って、個体群が加齢すると共に及び糖尿病患者がより長く生存すると共に、糖尿病性網膜症の発生率は上昇する。レーザー療法は、現在、非増殖性及び増殖性糖尿病性網膜症の両方において使用される。黄斑領域の周囲の漏出微細動脈瘤のフォーカルレーザー治療は、臨床的に重要な黄斑浮腫を有する患者の５０％において視力喪失を低下させる。増殖性糖尿病性網膜症において、汎網膜光凝固は、網膜全体（黄斑領域を除く）に散らばる数千のごく小さな熱傷を生じさせる；この治療は失明率を６０％低下させる。黄斑浮腫及び増殖性糖尿病性網膜症の早期治療は患者の９５％において５年間失明を予防するが、後期治療はわずかに５０％においてしか失明を予防しない。従って、早期診断と治療が極めて重要である。
血管新生を含むもう１つの眼疾患は、６５歳以上のアメリカ人のおよそ１０人に１人が罹患する疾患である、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）である。ＡＭＤは、網膜の中心領域である黄斑の一連の病的変化によって特徴付けられ、視力の低下を伴い、特に中心視力に影響を及ぼす。ＡＭＤは、感覚網膜のすぐ下にある網膜色素上皮と呼ばれる細胞の単層を含む。これらの細胞は、これらと接触している網膜の部分、すなわち視覚色素を含む光受容細胞に栄養を与え、支持する。網膜色素上皮は、ＡＭＤでは薄くなり、硬化している、基底膜複合体であるブルーフ膜上にある。新しい血管は、豊富な血管床を含む、この下にある脈絡膜からブルーフ膜を突破し得る。これらの血管は、次に、網膜色素上皮の下で及び網膜色素上皮と感覚網膜の間でも液体を漏出させ得る又は出血させ得る。この後の線維性瘢痕形成は、光受容細胞の栄養供給を断ってこれらの死滅を導き、中心視力の喪失を生じさせる。この種の加齢性黄斑症は、漏出血管及び網膜下の浮腫又は血液の故に「滲出」型と呼ばれる。滲出型は加齢性黄斑症の１０％を占めるに過ぎないが、高齢者における黄斑変性からの法的盲の症例の９０％を生じさせる。「萎縮」型の加齢性黄斑症は、この上にある光受容細胞喪失と共に網膜色素上皮の崩壊を含む。萎縮型は視力を低下させるが、通常は２０／５０−２０／１００のレベルに過ぎない。
ＡＭＤは、対象がより大きく又はより小さく見える又は直線がゆがむ、曲がる又は中心部分がない、中心視力の歪曲を伴う。滲出型ＡＭＤでは、黄斑領域に感覚網膜の小さな剥離が認められることがあるが、網膜下新生血管膜の決定的な診断は蛍光眼底血管造影を必要とする。萎縮型では、ドルーゼが黄斑領域の色素沈着パターンを乱すことがある。ドルーゼは、細胞内に突き出した網膜色素上皮の基底膜の突出であり、これらを前方へと膨らませる。加齢性黄斑症における危険因子としてのこれらの役割は明らかでない。萎縮型の加齢性黄斑症については現在のところ治療法が存在しない。レーザー治療は滲出型加齢性黄斑症において使用され、最初に血管新生膜を消失させ、１８ヶ月で約５０％の患者においてさらなる視力喪失を防ぐ。６０ヶ月までになると、しかしながら、２０％だけがまだ実質的な恩恵を受ける。
塩基性及び酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α及びβ（ＴＧＦα、ＴＧＦβ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、アンギオゲニン、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む、血管新生の多数の分子メディエイターが特定されている。血管新生に関わる他の刺激因子は、アンギオポエチン−１、Ｄｅｌ−１、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、レプチン、ミッドカイン、胎盤成長因子、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラヌリン、プロリフェリン及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）を含む。加えて、血管新生の制御は、アンギオアレスチン、アンギオスタチン（プラスミノーゲンフラグメント）、抗血管新生アンチトロンビンＩＩＩ、軟骨由来阻害因子（ＣＤＩ）、ＣＤ５９補体フラグメント、エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩフラグメント）、フィブロネクチンフラグメント、ｇｒｏ−β、ヘパリナーゼ、ヘパリン六糖類フラグメント、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インターフェロンα／β／γ、インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）、インターロイキン−１２、クリングル５（プラスミノーゲンフラグメント）、メタロプロテイナーゼ阻害因子（ＴＩＭＰ）、２−メトキシエストラジオール、胎盤リボヌクレアーゼ阻害因子、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子、血小板因子−４（ＰＦ４）、プロラクチン１６ｋＤフラグメント、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、レチノイド、テトラヒドロコルチゾール−Ｓ、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、バスキュロスタチン及びバソスタチン（カルレティキュリンフラグメント）を含む、身体によって生産される多くの血管新生の負の調節因子によってさらに仲介される。
これらの血管新生調節因子の中で、ＶＥＧＦは、腫瘍成長を伴う異常血管新生の正の調節因子として鍵となる役割を果たすと思われる（Ｂｒｏｗｎら（１９９６）Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（ＧｏｌｄｂｅｒｇとＲｏｓｅｎ編集）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂａｓｅｌ，及びＴｈｏｍａｓ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：６０３−６０６において総説されている）。さらに、最近、シグナル伝達分子のＰＤＧＦファミリーのＰＤＧＦ−Ｂ成員の役割が検討されている。これが、時として壁細胞とも称される、血管周囲細胞、例えば血管平滑筋、血管間膜細胞及び血管周囲細胞、の形成、増殖及び適切な機能において役割を果たすと思われるからである。
発生、創傷治癒及び腫瘍形成を伴う、血管新生又は新生血管形成について多くが知られるようになってきたが、これらの形態の血管新生と眼血管新生の間に相違があるのかどうかはまだ決定されないままである。重要な点として、例えば心臓における側副血管形成を伴う血管新生は有益であり、生物に適合し得るが、例えばＡＭＤを伴う、病的眼血管新生は公知の恩恵がなく、しばしば失明を導く（総説についてはＣａｍｐｏｃｈｉａｒｏ（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８４：３０１−１０参照）。従って、血管新生を伴う分子事象の理解は進歩したが、この理解を利用して、ＡＭＤと共に起こる脈絡膜血管新生及び糖尿病性網膜症などの眼血管新生疾患及び障害を含む、血管新生疾患及び障害を治療するためのさらなる方法を開発する必要性が存在する。
抗ＶＥＧＦ及び抗ＰＤＧＦ薬の組合せが、意外にも、眼血管新生疾患を治療するために相乗的な治療上の恩恵を与えることが発見された。
従って、本発明は、血管新生疾患と診断された又は血管新生疾患を発症する危険度の高い患者を治療するための方法を特徴とする。この方法は、一次又は補助治療として抗ＶＥＧＦ薬及び抗ＰＤＧＦ薬を患者に投与することを含む。
１つの側面では、本発明は、ＰＤＧＦアンタゴニスト及びＶＥＧＦアンタゴニストを、同時に又は互いに約９０日以内に、患者において血管新生疾患を抑制するために十分な量で投与することにより、この必要のある患者において血管新生疾患を抑制するための方法を提供する。
もう１つの側面では、本発明は、ＰＤＧＦアンタゴニスト及びＶＥＧＦアンタゴニストを、同時に又は互いに９０日以内に、患者を治療するために十分な量で投与することにより、血管新生疾患と診断された又は血管新生疾患を発症する危険度の高い患者を治療するための方法を提供する。
これらの側面の特定実施態様では、本発明の方法は、ＰＤＧＦアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストを互いに約１０日以内に投与することを含む。本発明の方法のもう１つの実施態様では、ＰＤＧＦアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストを互いに５日以内に投与する。本発明の方法のさらにもう１つの実施態様では、ＰＤＧＦアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストを互いに約２４時間以内に投与する。本発明の方法の１つの特定実施態様では、前記ＰＤＧＦアンタゴニストと前記ＶＥＧＦアンタゴニストを同時に投与する。
もう１つの実施態様では、本発明の方法は、ＰＤＧＦ−ＢアンタゴニストであるＰＤＧＦアンタゴニストの投与を含む。さらにもう１つの実施態様では、本発明の方法は、ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストであるＶＥＧＦアンタゴニストの投与を含む。
一部の実施態様では、本発明の方法は、核酸分子、アプタマー、アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム、ＲＮＡｉ分子、タンパク質、ペプチド、環状ペプチド、抗体、抗体フラグメントの結合フラグメント、糖、ポリマー又は小有機化合物であるＰＤＧＦアンタゴニストの投与を含む。もう１つの実施態様では、本発明の方法は、核酸分子、アプタマー、アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム、ＲＮＡｉ分子、タンパク質、ペプチド、環状ペプチド、抗体、抗体フラグメントの結合フラグメント、糖、ポリマー又は小有機化合物であるＶＥＧＦアンタゴニストの投与を含む。
１つの特定実施態様では、本発明の方法は、ＥＹＥ００１アプタマーなどの、アプタマーであるＶＥＧＦアンタゴニストの投与を含む。もう１つの実施態様では、本発明の方法は、抗体又はこの結合フラグメントであるＶＥＧＦアンタゴニストの投与を含む。
１つの特定実施態様では、本発明の方法は、アプタマー、抗体又はこの結合フラグメントであるＰＤＧＦアンタゴニストの投与を含む。もう１つの特定実施態様では、本発明の方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであるＰＤＧＦアンタゴニストの投与を含む。
本発明のこの側面のさらにもう１つの実施態様では、ＰＤＧＦアンタゴニスト及び／又はＶＥＧＦアンタゴニストはプロドラッグである。
１つの実施態様では、本発明の方法は、眼血管新生疾患を抑制する又は治療するための手段を提供する。一部の実施態様では、本発明の方法による治療又は抑制を受け入れやすい眼血管新生疾患は、虚血性網膜症、虹彩血管新生、眼内血管新生、加齢性黄斑変性、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性網膜虚血又は増殖性糖尿病性網膜症を含む。さらにもう１つの実施態様では、本発明の方法は、この必要のある患者、又は乾癬もしくは慢性関節リウマチと診断された又はこのような疾患を発症する危険度の高い患者において、乾癬又は慢性関節リウマチを抑制する又は治療するための手段を提供する。
本発明はまた、ＰＤＧＦアンタゴニスト及びＶＥＧＦアンタゴニストの両剤並びに医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。この側面では、ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦアンタゴニストは、どちらも、患者において血管新生疾患を抑制するために十分な量で存在する。
この側面の１つの実施態様では、前記医薬組成物は、ＰＤＧＦ−ＢアンタゴニストであるＰＤＧＦアンタゴニストを含む。もう１つの実施態様では、前記医薬組成物は、ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストであるＶＥＧＦアンタゴニストを含む。
一部の実施態様では、本発明の医薬組成物は、核酸分子、アプタマー、アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム、ＲＮＡｉ分子、タンパク質、ペプチド、環状ペプチド、抗体、抗体フラグメントの結合フラグメント、糖、ポリマー又は小有機化合物であるＰＤＧＦアンタゴニストを含む。もう１つの実施態様では、本発明の医薬組成物は、核酸分子、アプタマー、アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム、ＲＮＡｉ分子、タンパク質、ペプチド、環状ペプチド、抗体、抗体フラグメントの結合フラグメント、糖、ポリマー又は小有機化合物であるＶＥＧＦアンタゴニストを含む。
他の特定実施態様では、本発明の医薬組成物は、ＥＹＥ００１アプタマーなどの、アプタマーであるＶＥＧＦアンタゴニストを含む。１つの実施態様では、本発明の医薬組成物は、抗体又はこの結合フラグメントであるＶＥＧＦアンタゴニストを含む。
１つの特定実施態様では、本発明の医薬組成物は、抗体又はこの結合フラグメントであるＰＤＧＦアンタゴニストを含む。もう１つの特定実施態様では、本発明の医薬組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであるＰＤＧＦアンタゴニストを含む。
本発明の医薬組成物は、ミクロスフェア又はヒドロゲル製剤を含む、医薬的に許容される担体を含み得る。
さらにもう１つの実施態様では、ＰＤＧＦアンタゴニスト及び／又はＶＥＧＦアンタゴニストはプロドラッグである。
もう１つの実施態様では、本発明の医薬組成物は、眼血管新生疾患を抑制する又は治療するための手段を提供する。一部の実施態様では、本発明の医薬組成物による治療又は抑制を受け入れやすい眼血管新生疾患は、虚血性網膜症、虹彩血管新生、眼内血管新生、加齢性黄斑変性、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性網膜虚血又は増殖性糖尿病性網膜症を含む。さらに他の実施態様では、本発明の医薬組成物は、この必要のある患者、又は乾癬もしくは慢性関節リウマチと診断された又はこのような疾患を発症する危険度の高い患者において、乾癬又は慢性関節リウマチを抑制する又は治療するための手段を提供する。
本発明はまた、ＰＤＧＦアンタゴニスト及びＶＥＧＦアンタゴニストの両方を含む医薬パックを提供する。この側面の１つの実施態様では、前記医薬パックは、ＰＤＧＦ−ＢアンタゴニストであるＰＤＧＦアンタゴニストを含む。この側面のもう１つの実施態様では、前記医薬パックは、ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストであるＶＥＧＦアンタゴニストを含む。
もう１つの実施態様では、医薬パックのＰＤＧＦアンタゴニスト及びＶＥＧＦアンタゴニストは、別々に及び個別投与量で製剤される。さらにもう１つの実施態様では、医薬パックのＰＤＧＦアンタゴニスト及びＶＥＧＦアンタゴニストは一緒に製剤される。
一部の特定実施態様では、本発明の医薬パックは、ＥＹＥ００１アプタマーなどの、アプタマーであるＶＥＧＦアンタゴニストを含む。他の実施態様では、本発明の医薬パックは、抗体又はこの結合フラグメントであるＶＥＧＦアンタゴニストを含む。
一部の実施態様では、本発明の医薬パックは、抗体又はこの結合フラグメントであるＰＤＧＦアンタゴニストを含む。他の特定実施態様では、本発明の医薬パックは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであるＰＤＧＦアンタゴニストを含む。この側面のさらにもう１つの実施態様では、ＰＤＧＦアンタゴニスト及び／又はＶＥＧＦアンタゴニストはプロドラッグである。
本明細書において言及する全ての公開文献、特許及び特許出願は、参照によりここに組み込まれる。
（定義）
ここで使用する、以下の用語及び語句は以下で述べる意味を有するものとする。異なる定義がない限り、ここで使用する全ての技術及び学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
「アンタゴニスト」とは、標的分子の活性又は産生を部分的に又は完全に阻害する物質を意味する。特に、ここで選択的に適用される「アンタゴニスト」という用語は、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲ遺伝子発現のレベル、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル又はタンパク質活性を低下させることができる物質を意味する。アンタゴニストの例示的な形態は、例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド（環状ペプチドなど）、抗体又は抗体フラグメント、ペプチドミメティック、核酸分子、アンチセンス分子、リボザイム、アプタマー、ＲＮＡｉ分子及び低分子量有機分子を含む。ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ及びＰＤＧＦ／ＰＤＧＦＲリガンド／受容体標的のアンタゴニスト阻害の例示的な非限定的機構は、リガンドの合成及び／又は安定性の抑制（例えばリガンド遺伝子／核酸を標的するアンチセンス、リボザイム又はＲＮＡｉ組成物を使用して）、リガンドのこのコグネイト受容体への結合のブロッキング（例えば抗リガンドアプタマー、抗体又は可溶性のおとりコグネイト受容体を使用して）、受容体の合成及び／又は安定性の抑制（例えばリガンド受容体遺伝子／核酸を標的するアンチセンス、リボザイム又はＲＮＡｉ組成物を使用して）、受容体のこのコグネイト受容体への結合のブロッキング（例えば受容体抗体を使用して）、及びコグネイトリガンドによる受容体の活性化のブロッキング（例えば受容体チロシンキナーゼ阻害剤を使用して）を含む。加えて、アンタゴニストは標的分子を直接又は間接的に阻害し得る。
ここで使用する「抗体」という用語は、例えばいかなるアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ等）であっても、全抗体を包含することを意図しており、及び脊椎動物（例えば哺乳動物）タンパク質、炭水化物等を認識し、同時にこれらと特異的に反応する抗体のフラグメントを包含する。抗体は従来の手法を用いて断片化することができ、フラグメントは、全抗体に関して上述したのと同じように有用性に関してスクリーニングすることができる。従って、前記用語は、一定のタンパク質と選択的に反応することができる抗体分子のタンパク質分解切断された又は組換え生産された部分のセグメントを含む。このようなタンパク質分解及び／又は組換えフラグメントの非限定的な例は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ及びペプチドリンカーによって連結されたＶ［Ｌ］及び／又はＶ［Ｈ］ドメインを含む一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖは、共有結合又は非共有結合によって２又はそれ以上の結合部位を有する抗体を形成し得る。本発明は、ポリクローナル、モノクローナル、又は抗体及び組換え抗体の他の精製製剤を包含する。
ここでは「核酸リガンド」と交換可能に使用される、「アプタマー」という用語は、特定三次元立体配座をとるこの能力を通して、標的に結合し、及び標的に拮抗（すなわち阻害）作用を及ぼす核酸を意味する。本発明の標的はＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ（又はこれらのコグネイト受容体ＰＤＧＦＲ又はＶＥＧＦＲ）であり、従って、ＰＤＧＦアプタマー又は核酸リガンド又はＶＥＧＦアプタマー又は核酸リガンド（又はＰＤＧＦＲアプタマー又は核酸リガンド又はＶＥＧＦＲアプタマー又は核酸リガンド）という用語を使用する。アプタマーによる標的の阻害は、標的の結合によって、標的を触媒的に変化させることによって、標的又は標的の機能活性を修飾する／変化させるように標的と反応することによって、自殺阻害因子におけるように標的に共有結合することによって、標的ともう１つ別の分子の間の反応を促進することによって起こり得る。アプタマーは、多数のリボヌクレオチド単位、デオキシリボヌクレオチド単位、又は両方のタイプのヌクレオチド残基の混合物で構成され得る。アプタマーは、以下でさらに詳述するように１又はそれ以上の修飾塩基、糖又はリン酸骨格単位をさらに含み得る。
「抗体アンタゴニスト」とは、標的ＰＤＧＦ又はＶＥＧＦの１又はそれ以上の活性をブロックする又は有意に低下させることができる、ここで定義するような抗体分子を意味する。例えばＶＥＧＦ阻害抗体は、血管新生を刺激するＶＥＧＦの能力を阻害し得る又は低下させ得る。
ヌクレオチド配列は、２つの配列の塩基の各々がマッチする、すなわちワトソン−クリック型塩基対を形成することができる場合、もう１つのヌクレオチド配列に「相補的」である。「相補鎖」という用語は、ここでは「相補物」という用語と交換可能に使用される。核酸鎖の相補物は、コード鎖の相補物又は非コード鎖の相補物であり得る。
「保存された残基」又は「保存的アミノ酸置換」という語句は、一定の共通特性に基づくアミノ酸のグループを指す。個々のアミノ酸の間の共通特性を定義するための機能的方法は、相同生物の対応タンパク質の間のアミノ酸変化の規格化頻度を分析することである。このような分析によれば、アミノ酸のグループは、グループ内のアミノ酸が互いと選択的に交換され、従って全体的タンパク質構造への影響において互いに最も類似している場合に定義され得る（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．とＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。このようにして定義されるアミノ酸群の例は：
（ｉ）Ｇｌｕ及びＡｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓから成る、電荷を有する群、
（ｉｉ）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓから成る、正電荷を有する群、
（ｉｉｉ）Ｇｌｕ及びＡｓｐから成る、負電荷を有する群、
（ｉｖ）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐから成る、芳香族群、
（ｖ）Ｈｉｓ及びＴｒｐから成る、窒素環群、
（ｖｉ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅから成る、大きな脂肪族非極性群、
（ｖｉｉ）Ｍｅｔ及びＣｙｓから成る、わずかに極性の群、
（ｖｉｉｉ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ及びＰｒｏから成る、小残基群、
（ｉｘ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ及びＣｙｓから成る、脂肪族群、及び
（ｘ）Ｓｅｒ及びＴｈｒから成る、小ヒドロキシル群
を含む。
上記に示した群に加えて、各々のアミノ酸残基はこれ自体の群を形成することができ、個々のアミノ酸によって形成される群は、単に、当技術分野において一般的に使用されるこのアミノ酸についての１文字及び／又は３文字略語によって称され得る。
ここで使用する「相互作用する」という用語は、本来、タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、核酸−核酸、及びタンパク質−小分子又は核酸−小分子などの、分子間の検出可能な関係又は関連性（例えば生化学的相互作用）を含むことが意図されている。
「相互作用タンパク質」という用語は、例えばＰＤＧＦ又はＶＥＧＦタンパク質、又はこれらの対応するコグネイト受容体などの、対象とするタンパク質と相互作用する、結合する及び／又はさもなければ関連することができるタンパク質を指す。
ＤＮＡ又はＲＮＡなどの、核酸に関してここで使用する「単離」という用語は、それぞれ、巨大分子の天然ソース中に存在する他のＤＮＡ又はＲＮＡから分離された分子を指す。同様に、ポリペプチドに関してここで使用する「単離」という用語は、ポリペプチドのソース中に存在する他のタンパク質から分離されたタンパク質分子を指す。ここで使用する単離という用語はまた、細胞物質、ウイルス物質、又は組換えＤＮＡ手法によって生産されるときは培地、又は化学合成されるときは化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない核酸又はペプチドを指す。
「単離核酸」は、天然ではフラグメントとして生じず、天然状態では認められない核酸フラグメントを含むことが意図されている。「単離」という用語はまた、ここでは他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを指すために使用され、精製及び組換えポリペプチドの両方を包含することが意図されている。
ここで使用する、「標識」及び「検出可能標識」という用語は、放射性同位体、蛍光因子、化学発光成分、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害因子、染料、金属イオン、リガンド（例えばビオチン又はハプテン）等を含むが、これらに限定されない、検出することができる分子を指す。「フルオレッサー」という用語は、検出可能範囲内の蛍光を発することができる物質又はこの部分を指す。本発明の下で使用し得る標識の特定例は、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨ、α−、β−ガラクトシダーゼ及びホースラデイッシュペルオキシダーゼを含む。
「細胞内の遺伝子の発現のレベル」は、細胞内の遺伝子によってコードされる、ｍＲＮＡ、並びにｍＲＮＡ前駆体新生転写産物、転写産物プロセシング中間体、成熟ｍＲＮＡ及び分解産物のレベル、並びにこの遺伝子から翻訳されるタンパク質のレベルを指す。
ここで使用する、「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び、適切な場合は、リボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを指す。この用語はまた、等価物として、ヌクレオチド類似体から作られるＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかの類似体を包含すると理解されるべきであり、記述される実施態様に該当するときは、一本鎖（センス又はアンチセンス）及び二本鎖ポリヌクレオチド、ＥＳＴ、染色体、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びｒＲＮＡは、核酸と称し得る分子の代表的な例である。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に生じる塩基、糖及び糖間（骨格）結合から成るヌクレオチド又はヌクレオシド単量体のオリゴマー又はポリマーを指す。この用語はまた、同様に機能する、非天然に生じる単量体又はこの部分を含む修飾又は置換オリゴマーを包含する。置換オリゴマーの組込みは、細胞取込みの強化又はヌクレアーゼ抵抗性上昇を含む因子に基づき、当技術分野において公知のように選択される。オリゴヌクレオチド全体又はこの一部だけが、置換オリゴマーを含み得る。
「パーセント同一性」という用語は、２つのアミノ酸配列又は２つのヌクレオチド配列の間の配列同一性を指す。同一性は、各々、比較のために整列し得る、各々の配列内の位置を比較することによって決定できる。比較する配列内の等しい位置が同じ塩基又はアミノ酸によって占められているとき、これらの分子はこの位置において同一である；等しい部位が同じか又は類似アミノ酸残基（例えば立体化学的及び／又は電子特性において類似の）によって占められているとき、これらの分子はこの位置において相同（類似）と称することができる。相同性、類似性又は同一性のパーセンテージとしての表示は、比較配列によって共有される位置における同一又は類似アミノ酸の数の関数を表わす。Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ（ＨＭＭ）、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴを含む、様々な整列アルゴリズム及び／又はプログラムが使用できる。ＨＮｉＭ、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴは、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．及びｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＥＢＩを通して入手し得る。１つの実施態様では、２つの配列のパーセント同一性は、１のギャップ加重でこれらのＧＣＧプログラムによって決定することができ、例えば各々のアミノ酸ギャップは、２つの配列の間に１個のアミノ酸又はヌクレオチドミスマッチが存在するかのように加重される。整列のための他の手法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡに述べられている。望ましい場合は、配列内のギャップを許容する整列プログラムを使用して配列を整列する。Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメントにおいてギャップを許容する１つのタイプのアルゴリズムである（（１９９７）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７参照）。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ整列法を用いるＧＡＰプログラムも、配列を整列するために利用できる。ＨＭＭの使用を含むより多くの手法及びアルゴリズムは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄ Ｄａｔａｂａｎｋｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（２０００），ｅｄ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ及びＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｄａｔａｂａｓｅｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）ｅｄ．Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓに述べられている。代替的な検索方法はＭＰＳＲＣＨソフトウエアを使用するものであり、これをＭＡＳＰＡＲコンピュータで実施する。ＭＰＳＲＣＨは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して超並列コンピュータで配列を評価する。このアプローチは、遠い類縁の対合（ｄｉｓｔａｎｔｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｔｃｈｅｓ）を取り上げる能力を改善し、特に小さなギャップ及びヌクレオチド配列エラーを許容する。核酸がコードするアミノ酸配列を使用して、タンパク質及びＤＮＡデータベースの両方を検索することができる。ここの配列に関するデータベースは、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，前出に述べられている。データベースは、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、及びＤＮＡ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）を含む。
二重鎖に関して「完全にマッチする」は、二重鎖を構成するポリ又はオリゴヌクレオチド鎖が、各々の鎖のあらゆるヌクレオチドが他方の鎖のヌクレオチドとワトソン−クリック型塩基対合を受けるように互いに二本鎖構造を形成することを意味する。この用語はまた、使用し得る、デオキシイノシン、２−アミノプリン塩基を有するヌクレオシド等のような、ヌクレオシド類似体の対合も包含する。標的ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの間の二重鎖におけるミスマッチは、二重鎖中のヌクレオチドの対がワトソン−クリック型結合を受けることができないことを意味する。三重鎖に関しては、この用語は、三重鎖が、完全にマッチする二重鎖と、あらゆるヌクレオチドが完全にマッチする二重鎖の塩基対とフーグスティーン型又は逆フーグスティーン型結合を生じる３番目の鎖から成ることを意味する。
「ＲＮＡ干渉」、「ＲＮＡｉ」又は「ｓｉＲＮＡ」という用語は全て、対象遺伝子に相同な（特に対象遺伝子、例えばＰＤＧＦ又はＶＥＧＦのメッセンジャーＲＮＡに相同な）、１又はそれ以上の二本鎖ＲＮＡを標的細胞に導入することによって遺伝子又は遺伝子産物の発現を低下させる方法を指す。
多型変異体は、ポリヌクレオチド配列が１個の塩基によって異なる（例えばＰＤＧＦ又はＶＥＧＦにおける一塩基変異）「一塩基多型」（ＳＮＰ）も包含し得る。ＳＮＰの存在は、例えばある種の個体群、疾患状態又は疾患状態についての傾向の指標であり得る。
異常細胞、例えば腫瘍細胞の生物学的状態の「プロフィール」は、疾患状態に応答して変化する細胞の様々な成分のレベルを指す。細胞の成分は、ＲＮＡのレベル、タンパク質存在量のレベル又はタンパク質活性レベルを含む。
「タンパク質」という用語は、ここでは「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語と交換可能に使用される。「組換えタンパク質」という用語は、一般に、発現されるタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを適切な発現ベクターに挿入し、次にこれを用いて宿主細胞を形質転換して、異種タンパク質又はＲＮＡを発現させる、組換えＤＮＡ手法によって生産される本発明のタンパク質を指す。さらに、組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子に関して、「由来する」という語句は、天然タンパク質のアミノ酸配列又は、置換及び欠失を含む、天然に生じるタンパク質の突然変異によって生成される前記と類似のアミノ酸配列を有するタンパク質を、「組換えタンパク質」の意味に包含することが意図されている。
ここで使用する、「導入遺伝子」という用語は、細胞に導入された核酸配列（例えば標的核酸の１つ又はこのアンチセンス転写産物をコードする）を意味する。導入遺伝子は、トランスジェニック動物又はこれが導入される細胞に部分的又は全面的に非相同、すなわち外来性であり得るか、又はトランスジェニック動物又はこれが導入される細胞の内在性遺伝子に相同であるが、これが挿入される細胞のゲノムを変化させるように（例えば天然遺伝子とは異なる位置に挿入されるか又はこの挿入がノックアウトを生じさせる）動物のゲノムに挿入される又は挿入するように設計される。導入遺伝子はまた、エピソームの形態で細胞内に存在し得る。導入遺伝子は、１又はそれ以上の転写調節配列及び選択核酸の最適発現のために必要であり得る、イントロンなどの他の何からの核酸を含み得る。
「血管新生疾患」とは、腫瘍形成又は新生物形成性形質転換、すなわち癌を伴うもの以外の変化した又は調節不全の血管新生によって特徴付けられる疾患を意味する。血管新生疾患の例は、乾癬、慢性関節リウマチ、及び糖尿病性網膜症及び加齢性黄斑変性を含む眼血管新生疾患を含む。
ここで使用する、「新生血管形成」及び「血管新生」という用語は、交換可能に使用される。新生血管形成及び血管新生は、細胞、組織又は器官への新しい血管の生成を指す。血管新生の制御は、典型的にはある種の疾患において変化し、多くの場合、疾患に結びつく病的損傷は、変化した、調節不全の又は制御されない血管新生に関係する。持続的な、調節不全の血管新生は、内皮細胞の異常増殖によって特徴付けられるものを含む、多くの疾患状態で起こり、血管の漏出及び透過性を含む、これらの状態で見られる病的損傷を支持する。
「眼血管新生疾患」とは、患者の眼における変化した又は調節不全の血管新生によって特徴付けられる疾患を意味する。例示的な眼血管新生疾患は、視神経円板血管新生、虹彩血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、角膜血管新生、硝子体血管新生、緑内障、パンヌス、翼状片、黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、血管網膜症、網膜変性、ブドウ膜炎、網膜の炎症性疾患及び増殖性硝子体網膜症を含む。
被験者において血管新生疾患を「治療する」又は血管新生疾患を有する被験者を「治療する」という用語は、血管新生疾患の少なくとも１つの症状を低下させるように、被験者を医薬治療、例えば薬剤の投与に供することを指す。従って、ここで使用する「治療する」という用語は、血管新生状態又は疾患の少なくとも１つの症状を治癒すること並びに改善することを包含することが意図されている。従って、ここで使用する「治療する」は、眼血管新生疾患の治療又は予防のための医薬組成物を投与すること又は処方することを含む。
「患者」とは、何らかの動物を意味する。「動物」という用語は、ヒト及び他の霊長動物を含むが、これらに限定されない、哺乳動物を含む。この用語はまた、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ及びネコなどの家畜化動物を含む。
「ＰＤＧＦ」又は「血小板由来増殖因子」とは、血管新生又は血管新生過程に影響を及ぼす哺乳動物血小板由来増殖因子を意味する。ここで使用する、「ＰＤＧＦ」という用語は、ＰＤＧＦ−Ｂ（図１（Ａ）及び（Ｂ）参照）及びＰＤＧＦ−Ａ（図１（Ｃ）及び（Ｄ）参照）を含むＰＤＧＦの様々なサブタイプを包含する。さらに、ここで使用する、「ＰＤＧＦ」という用語は、コグネイトＰＤＧＦ受容体を通して血管新生又は血管新生過程を刺激するように働く、ＰＤＧＦ−Ｃ及びＰＤＧＦ−ＤなどのＰＤＧＦ関連血管新生因子を指す。特に、「ＰＤＧＦ」という用語は、（ｉ）ＰＤＧＦＲ−Ｂ（図３（Ａ）及び（Ｂ）参照）又はＰＤＧＦＲ−Ａ（図３（Ｃ）及び（Ｄ）参照）などのＰＤＧＦ受容体に結合する；（ｉｉ）ＶＥＧＦ受容体に関連するチロシンキナーゼ活性を活性化する；及び（ｉｉｉ）これによって血管新生又は血管新生過程に影響を及ぼす、増殖因子のクラスの成員を意味する。ここで使用する、「ＰＤＧＦ」という用語は、一般に、応答性細胞型上の血小板由来増殖因子細胞表面受容体（すなわちＰＤＧＦＲ）の結合及び活性化を通してＤＮＡ合成及び有糸分裂誘発を誘導する増殖因子のクラスの成員を指す。ＰＤＧＦは、例えば：定方向細胞遊走（走化性）及び細胞活性化；ホスホリパーゼ活性化；ホスファチジルイノシトール代謝回転及びプロスタグランジン代謝の上昇；応答性細胞によるコラーゲン及びコラゲナーゼ合成の刺激；マトリックス合成、サイトカイン産生及びリポタンパク質取込みを含む細胞代謝活性の変調；間接的に、ＰＤＧＦ受容体を持たない細胞における増殖応答の誘導；及び強力な血管収縮剤作用を含む、特異的生物作用を生じさせる。「ＰＤＧＦ」という用語は、「ＰＤＧＦ」ポリペプチド及びこの対応する「ＰＤＧＦ」コード遺伝子又は核酸の両方を包含することが意図されている。
「ＰＤＧＦ−Ａ」とは、ＰＤＧＦ及びこの対応するコード遺伝子又は核酸のＡ鎖ポリペプチドを意味する。
「ＰＤＧＦ−Ｂ」とは、ＰＤＧＦ及びこの対応するコード遺伝子又は核酸のＢ鎖ポリペプチドを意味する。
「ＶＥＧＦ」又は「血管内皮増殖因子」とは、血管新生又は血管新生過程に影響を及ぼす哺乳動物血管内皮増殖因子を意味する。ここで使用する、「ＶＥＧＦ」という用語は、例えばＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１８９を含むＶＥＧＦ−Ａ／ＶＰＦ遺伝子の選択的スプライシングによって生じるＶＥＧＦ（血管透過性因子（ＶＰＦ）及びＶＥＧＦ−Ａとしても知られる）の様々なサブタイプ（図２（Ａ）及び（Ｂ）参照）を包含する。さらに、ここで使用する、「ＶＥＧＦ」という用語は、コグネイトＶＥＧＦ受容体を通して血管新生又は血管新生過程を刺激するように働く、ＰＩＧＦ（胎盤成長因子）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ及びＶＥＧＦ−ＥなどのＶＥＧＦ関連血管新生因子を指す。特に、「ＶＥＧＦ」という用語は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）（図４（Ａ）及び（Ｂ）参照）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）（図４（Ｃ）及び（Ｄ）参照）又はＶＥＧＦＲ−３（ＦＬＴ−４）などのＶＥＧＦ受容体に結合する；（ｉｉ）ＶＥＧＦ受容体に関連するチロシンキナーゼ活性を活性化する；及び（ｉｉｉ）これによって血管新生又は血管新生過程に影響を及ぼす、増殖因子のクラスの成員を意味する。「ＶＥＧＦ」という用語は、「ＶＥＧＦ」ポリペプチド及びこの対応する「ＶＥＧＦ」コード遺伝子又は核酸の両方を包含することが意図されている。
「ＰＤＧＦアンタゴニスト」とは、ＰＤＧＦの活性又は産生を部分的に又は完全に低下させる又は阻害する物質を意味する。ＰＤＧＦアンタゴニストは、ＰＤＧＦ−Ｂなどの特定ＰＤＧＦを直接又は間接的に低下させ得る又は阻害し得る。さらに、「アンタゴニスト」の上記定義に一致する「ＰＤＧＦアンタゴニスト」は、ＰＤＧＦ関連受容体シグナルを低下させる又は阻害するようにＰＤＧＦリガンド又はこのコグネイト受容体のいずれかに作用する物質を包含し得る。このような「ＰＤＧＦアンタゴニスト」の例は、従って、例えば：ＰＤＧＦ核酸を標的するアンチセンス、リボザイム又はＲＮＡｉ組成物；ＰＤＧＦがこのコグネイト受容体に結合するのを妨げる抗ＰＤＧＦアプタマー、抗ＰＤＧＦ抗体又は可溶性ＰＤＧＦおとり受容体；コグネイトＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）核酸を標的するアンチセンス、リボザイム又はＲＮＡｉ組成物；コグネイトＰＤＧＦＲ受容体に結合する抗ＰＤＧＦＲアプタマー又は抗ＰＤＧＦＲ抗体；及びＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ阻害因子、を含む。
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」とは、ＶＥＧＦの活性又は産生を部分的に又は完全に低下させる又は阻害する物質を意味する。ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦ１６５などの特定ＰＤＧＦを直接又は間接的に低下させ得る又は阻害し得る。さらに、「アンタゴニスト」の上記定義に一致する「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、ＶＥＧＦ関連受容体シグナルを低下させる又は阻害するようにＶＥＧＦリガンド又はこのコグネイト受容体のいずれかに作用する物質を包含し得る。このような「ＶＥＧＦアンタゴニスト」の例は、従って、例えば：ＶＥＧＦ核酸を標的するアンチセンス、リボザイム又はＲＮＡｉ組成物；ＶＥＧＦがこのコグネイト受容体に結合するのを妨げる抗ＶＥＧＦアプタマー、抗ＶＥＧＦ抗体又は可溶性ＶＥＧＦおとり受容体；コグネイトＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）核酸を標的するアンチセンス、リボザイム又はＲＮＡｉ組成物；コグネイトＶＥＧＦＲ受容体に結合する抗ＶＥＧＦＲアプタマー又は抗ＶＥＧＦＲ抗体；及びＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害因子、を含む。
「血管新生疾患を抑制するために十分な量」とは、血管新生疾患又はこの症状を治療する又は予防するために必要な、本発明の組合せにおけるアンタゴニストの有効量を意味する。血管新生疾患によって引き起こされる又は血管新生疾患に寄与する状態の治療のために本発明を実施するのに使用される活性アンタゴニストの「有効量」は、投与方法、血管新生疾患の解剖学的位置、患者の年齢、体重及び全般的健康状態に依存して異なる。最終的には、医師又は獣医が適切な量と投与レジメンを決定する。このような量を、血管新生疾患を抑制するために十分な量と称する。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかである。
ポリペプチドＸの「変異体」は、１又はそれ以上のアミノ酸残基が変化しているペプチドＸのアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。変異体は、置換アミノ酸が類似の構造又は化学特性を持つ、「保存的」変化（例えばイソロイシンによるロイシンの置換）を有し得る。よりまれに、変異体は「非保存的」変化（例えばトリプトファンによるグリシンの置換）を有し得る。同様の重要でない変異はまた、アミノ酸欠失又は挿入又はこの両方を含み得る。生物学的又は免疫学的活性を失わずにいずれのアミノ酸残基を置換、挿入又は欠失し得るかを決定する手引きは、当技術分野において周知のコンピュータプログラム、例えばＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて見出し得る。
ポリヌクレオチド配列に関して使用するときの「変異体」という用語は、遺伝子のポリヌクレオチド配列又はこのコード配列に関連するポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義はまた、例えば「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」又は「多型」変異体も含み得る。スプライス変異体は、標準分子に有意の同一性を有し得るが、一般にｍＲＮＡプロセシングの間のエクソンの選択的スプライシングを原因とする、より多い又はより少ない数のポリヌクレオチドを有する。対応するポリペプチドは、付加的な機能的ドメイン又はドメインの不在を有し得る。種変異体は、ある種ともう１つ別の種で異なるポリヌクレオチド配列である。生じるポリペプチドは一般に、互いに対して有意のアミノ酸同一性を有する。多型変異体は、所与の種の個体間での特定遺伝子のポリヌクレオチド配列における変異である。
「ベクター」という用語は、これが連結されているもう１つ別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。有用なベクターの１つのタイプは、エピソーム、すなわち染色体外複製することができる核酸である。有用なベクターは、これらが連結されている核酸を自律複製及び／又は発現することができるものである。これらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指令することができるベクターを、ここでは「発現ベクター」と称する。一般に、組換えＤＮＡ手法において有用な発現ベクターは、しばしば、一般にベクター形態では染色体に結合していない環状二本鎖でループを指す、「プラスミド」の形態である。本明細書では、プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるので、「プラスミド」と「ベクター」は交換可能に使用される。しかし、本発明は、等しい機能を果たし、今後当技術分野において公知となるこのような他の形態の発現ベクターを含むことが意図されている。
（併用療法）
本発明は、一部には、血管新生疾患を有する患者のための強力な治療法として適切な増殖因子アンタゴニストを使用する、ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦ活性の両方の特異的阻害に基づく。ＰＤＧＦアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストの組合せの投与は、いずれかのアンタゴニストを単独で投与するよりも、眼血管新生疾患を治療するためにより大きな治療的恩恵を与える。抗ＶＥＧＦ薬と抗ＰＤＧＦ薬の結合作用は、網膜内皮細胞系において血管新生を刺激する上で２つの因子の間に明らかな協力が存在しないことを示す試験に照らすと予想外である（Ｃａｓｔｅｌｌｏｎら（２００１）Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．７４：５２３−３５参照）。
ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦは、身体全体にわたって、特に眼において、新しい血管の成長のための重要な刺激である。ＰＤＧＦとＶＥＧＦの両方の生物活性を阻害することを目指す併用療法は、血管新生疾患を治療する又は予防するための方法を提供する。
従って、本発明は、併用療法を用いて血管新生疾患を抑制するための方法及び組成物を特徴とする。特に、本発明は、血管細胞において働く２つの異なる細胞間連絡シグナル伝達経路、すなわちＰＤＧＦ及びＶＥＧＦシグナル伝達を、眼血管新生疾患などの血管新生疾患の治療における治療標的として利用する。この併用方法は、視神経円板血管新生、虹彩血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、角膜血管新生、硝子体血管新生、緑内障、パンヌス、翼状片、黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、血管網膜症、網膜変性、黄斑変性、ブドウ膜炎、網膜の炎症性疾患及び増殖性硝子体網膜症を含むが、これらに限定されない、眼血管新生の発現によって示される多くの眼疾患及び障害を治療するために特に有用である。ＰＤＧＦ（ＰＤＧＦ−Ｂなど）及びＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−Ａなど）シグナル伝達を阻害するアンタゴニストから成る併用療法は、２つの治療のいずれかを独立して使用するのに比べて高い治療効果をもたらす。以下で論じる例は、単一ＰＤＧＦアンタゴニストと単一ＶＥＧＦアンタゴニストの組合せを述べるが、多数のアンタゴニスト薬の組合せが望ましい場合があることは了解される。
本発明に従った抗ＰＤＧＦ及び抗ＶＥＧＦ併用療法は、単独で又は別の両方と共に実施ししてもよく、在宅で、医師の診察室、診療所、病院の外来科又は病院で提供され得る。治療は一般に、医師が治療効果を詳細に観察し、必要に応じて調整を行うことができるように病院で開始される。併用療法の期間は、治療する血管新生疾患の種類、患者の年齢及び状態、患者の疾患の病期及び種類、及び患者がどのように治療に応答するかに依存する。加えて、血管新生疾患を発症する危険度が大きい人（例えば糖尿病患者）は、症状の発現を阻止する又は遅延させるために治療を受けてもよい。本発明によって提供される１つの重要な利点は、血管新生疾患の治療のためのＰＤＧＦアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストの併用は、各々のアンタゴニストの低用量及びより少ない総活性アンタゴニストの投与を可能にし、従って、より低い毒性と副作用での同様の効果及びコストの低減を提供することである。
併用療法の各々の成分の投与の用量及び頻度は独立して管理することができる。例えば１つのアンタゴニストを１日３回投与し、２番目のアンタゴニストを１日１回投与してもよい。併用療法は、患者の身体が現在まだ予知しない何らかの副作用から回復する期間を得られるように休止期間を含む断続的周期で実施し得る。アンタゴニストはまた、１つの投与が両方のアンタゴニストを送達するように一緒に製剤し得る。
（ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦアンタゴニスト標的）
ＰＤＧＦは、最初は血小板溶解産物から単離され、血清中には存在するが血漿中には存在しない主要増殖促進作用と特定された。ＰＤＧＦのマイトジェン作用は、最初、線維芽細胞及び平滑筋細胞などの結合組織細胞及び培養中のグリア細胞に作用することが示された。別々の遺伝子（染色体７番及び２２番）によってコードされる２つの相同なＰＤＧＦアイソフォーム、ＰＤＧＦ Ａ及びＢが特定された。３つの可能な二量体全てが（ＡＡ、ＡＢ及びＢＢ）天然に生じるが、血小板からの最も豊富な種はＡＢへテロ二量体である。翻訳後、ＰＤＧＦ二量体は約３０ｋＤａ分泌タンパク質へとプロセシングされる。
高親和性でＰＤＧＦに結合する２つの細胞表面タンパク質、αとβが特定された（Ｈｅｌｄｉｎら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７８：３６６４；Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：５８６７）。どちらの種も、５つの免疫グロブリン様細胞外ドメイン、１つの膜貫通ドメイン及びキナーゼインサートドメインによって分けられた細胞内チロシンキナーゼドメインを含む。この数年間に、３つの受容体二量体（α／α、α／β及びβ／β）についての３つのＰＤＧＦアイソフォームの特異性が明らかにされた。α受容体ホモ二量体は、３つのＰＤＧＦアイソフォーム全てと高い親和性で結合し、β受容体ホモ二量体は、ＰＤＧＦ ＢＢだけと高親和性で結合し、ＰＤＧＦ ＡＢとは約１０倍低い親和性で結合し、α／β受容体へテロ二量体は、ＰＤＧＦ ＢＢ及びＰＤＧＦ ＡＢと高親和性で結合する（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ ＆ Ｈｅｌｄｉｎ（１９９３）Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａ ３２：１０１）。特異性パターンは、Ａ鎖がα受容体だけに及びＢ鎖がαとβ受容体サブユニットの両方に高親和性で結合する能力から生じると思われる。
一般に、本発明は、１又はそれ以上のＰＤＧＦ活性を阻害する物質を提供する。これらのＰＤＧＦ阻害剤又はＰＤＧＦアンタゴニストは、１又はそれ以上の形態のＰＤＧＦリガンドに作用し得る。血小板由来増殖因子は、２つの関連受容体チロシンキナーゼ、［α］受容体（ＰＤＧＦＲ−［α］）及び［β］受容体（ＰＤＧＦＲ−［β］）への結合及び二量体化を通してこれらの作用を及ぼす、Ａ鎖（ＰＤＧＦ−Ａ）及びＢ鎖（ＰＤＧＦ−Ｂ）のホモ又はヘテロ二量体を含む。加えて、ＰＤＧＦ複合体についての２つの新しいプロテアーゼ活性化リガンド、ＰＤＧＦ−Ｃ及びＰＤＧＦ−Ｄが特定された（Ｌｉら（２０００）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：３０２−９；Ｂｅｒｇｓｔｅｎら（２００１）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：５１２−６；及びＵｕｔｅｌｅら（２００１）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０３：２２４２−４７参照）。ＰＤＧＦＲの異なるリガンド結合特異性の故に、ＰＤＧＦＲ−［α］［α］はＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ及びＰＤＧＦ−ＣＣに結合し；ＰＤＧＦＲ−［β］［β］はＰＤＧＦ−ＢＢ及びＰＤＧＦ−ＤＤに結合し；一方ＰＤＧＦＲ−［α］［β］はＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ及びＰＤＧＦ−ＤＤに結合することが知られている（Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚら（２００１）ＢｉｏＥｓｓａｙｓ ２３：４９４−５０７参照）。
ＶＥＧＦは、全て新しい血管の形成に必要な過程である、増殖し、遊走して、マトリックス分解酵素を生産するように内皮細胞を選択的に刺激する、分泌性ジスルフィド結合ホモ二量体である（Ｃｏｎｎら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７：１３２３−１３２７）；ＦｅｒｒａｒａとＨｅｎｚｅｌ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６１：８５１−８５８）；Ｐｅｐｐｅｒら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８１：９０２−９０６；Ｕｎｅｍｏｒｉら（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５３：５５７−５６２）。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ遺伝子の選択的スプライシングの結果として４つの形態（ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８９、ＶＥＧＦ−２０６）で生じる（Ｈｏｕｃｋら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．５：１８０６−１８１４；Ｔｉｓｃｈｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１９４７−１１９５４）。２つのより小さな形態は拡散し得るが、より大きな２つの形態は、ヘパリンに対する高親和性の結果として、主としてこのまま細胞膜に局在する。ＶＥＧＦ−１６５もヘパリンに結合し、最も豊富な形態である。ヘパリンに結合しない唯一の形態であるＶＥＧＦ−１２１は、ＶＥＧＦ受容体に対するより低い親和性（Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：５５１９−５５２３）並びにより低い有糸分裂誘発能（Ｋｅｙｔら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７７８８−７７９５）を有すると思われる。ＶＥＧＦの生物学的作用は、この発現が内皮起源の細胞に高度に限定される２つのチロシンキナーゼ受容体（Ｆｌｔ−１及びＦｌｋ−１／ＫＤＲ）によって仲介される（ｄｅ Ｖｒｉｅｓら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：９８９−９９１；Ｍｉｌｌａｕｅｒら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：８３５−８４６；Ｔｅｒｍａｎ ら（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：５１９−５２４）。２つの機能的受容体の発現は高親和性結合を必要とするが、内皮細胞における走化性及びマイトジェンシグナル伝達は主としてＫＤＲ受容体を通して起こると思われる（Ｐａｒｋら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５６４６−２５６５４；Ｓｅｅｔｈａｒａｍら（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０：１３５−１４７；Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９８８−２６９９５）。血管の発達にとってのＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ受容体の重要性は、最近、ＶＥＧＦ遺伝子についての１個の対立遺伝子を欠くマウス（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３５−４３９；Ｆｅｒｒａｒａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３９−４４２）又はＦｌｔ−１の両方対立遺伝（Ｆｏｎｇら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７６：６６−７０）又はＦｌｋ−１遺伝子（Ｓｈａｌａｂｙら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７６：６２−６６）を欠くマウスにおいて明らかにされた。各々の場合に、胚の死亡を生じさせる血管形成の異なる異常が認められた。
組織低酸素症によって誘導される代償性血管新生は、現在では、ＶＥＧＦによって仲介されることが知られている（Ｌｅｖｙら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４６−２７５３）；Ｓｈｗｅｉｋｉら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５９：８４３−８４５）。ヒトにおける試験は、血管新生網膜疾患では高濃度のＶＥＧＦが硝子体中に存在するが、不活性又は非血管新生疾患状態では存在しないことを示した。実験的黄斑下手術後に切除したヒト脈絡膜組織も高いＶＥＧＦレベルを示した。
唯一の公知の内皮細胞特異的マイトジェンであることに加えて、ＶＥＧＦは、巨大分子に対する血管透過性の一過性上昇を誘導するこの能力において血管新生増殖因子の中でユニークである（従って、この最初の及び代替的な名称は血管透過性因子、ＶＰＦである）（Ｄｖｏｒａｋら（１９７９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２２：１６６−１７４；Ｓｅｎｇｅｒ ら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：９８３−９８５；Ｓｅｎｇｅｒら（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６：５６２９−５６３２参照）。血管透過性上昇及びこの結果としての細胞外空隙における血漿タンパク質の沈着は、内皮細胞に遊走のための仮マトリックスを提供することによって新血管形成を助ける（Ｄｖｏｒａｋら（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６：１０２９−１０３９）。高透過性は、実際に、腫瘍に関連するものを含む、新しい血管の特徴である。
（ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦアンタゴニスト）
総論
本発明は、血管新生疾患のための併用療法において一緒に使用するためのＰＤＧＦ及びＶＥＧＦのアンタゴニスト（すなわち阻害因子）を提供する。特異的ＰＤＧＦアンタゴニスト及びＶＥＧＦアンタゴニストは当技術分野において公知であり、以下の章で簡単に述べる。現在当業者に入手可能な又は今後入手可能となるさらなる他のＰＤＧＦアンタゴニスト及びＶＥＧＦアンタゴニストは、以下でさらに提供する章を含む、本明細書の教示及び手引きと共に当技術分野において常套的な慣用技術を用いて特定及び生産し得る抗体、アプタマー、アンチセンスオリゴマー、リボザイム及びＲＮＡｉ組成物を含む。
ＰＤＧＦアンタゴニスト
一般に、ＰＤＧＦ（例えばＰＤＧＦ−Ｂ）の阻害は様々な方法で達成し得る。例えばＰＤＧＦの活性又は産生を阻害する様々なＰＤＧＦアンタゴニストが入手可能であり、本発明の方法において使用することができる。例示的なＰＤＧＦアンタゴニストは、以下で述べるもののようなＰＤＧＦの核酸リガンド又はアプタマーを含む。また、ＰＤＧＦアンタゴニストは、例えば抗ＰＤＧＦ抗体又は抗体フラグメントであり得る。従って、ＰＤＧＦ分子は、受容体へのこの結合を阻害することによって不活性となる。加えて、核酸レベルでＰＤＧＦ発現を阻害するアンチセンスＲＮＡ、リボザイム及びＲＮＡｉ分子などの核酸分子は、本発明におけるアンタゴニストとして有用である。他のＰＤＧＦアンタゴニストは、ペプチド、タンパク質、環状ペプチド又は小有機化合物を含む。さらに、ＰＤＧＦのシグナル伝達作用は、例えば以下で述べるような低分子チロシンキナーゼ阻害性アンタゴニストを使用することにより、この下流シグナル伝達を断つことによって阻害し得る。化合物又は物質がＰＤＧＦアンタゴニストとして働く能力は、当技術分野において公知の方法に従って及び、さらに、Ｄａｉら（２００１）Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１５： １９１３−２５；Ｚｉｐｐｅｌら（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５０ （２）： ４２８−３４；及びＺｗｉｌｌｅｒら（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：２１９−２１に述べられているように判定し得る。
本発明はさらに、当技術分野において公知のＰＤＧＦアンタゴニスト並びに以下で裏付けられるもの及び通常技術範囲内で創造されるあらゆる等価物を包含する。例えばＰＤＧＦに対する阻害抗体は当技術分野において公知であり、例えばこの内容全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第５，９７６，５３４号、同第５，８３３，９８６号、同第５，８１７，３１０号、同第５，８８２，６４４号、同第５，６６２，９０４号、同第５，６２０，６８７号、同第５，４６８，４６８号及び国際公開公報第ＰＣＴ ＷＯ２００３／０２５０１９号に述べられているものがある。加えて、本発明は、この全体が参照によりここに組み込まれる米国特許第５，５２１，１８４号並びに国際公開公報第Ｗ０２００３／０１３５４１号、同第Ｗ０２００３／０７８４０４号、同第Ｗ０２００３／０９９７７１号、同第Ｗ０２００３／０１５２８２号及び同第Ｗ０２００４／０５２８２号に開示されているもののような、ＰＤＧＦアンタゴニストであるＮ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体を含む。
ＰＤＧＦの作用をブロックする小分子は当技術分野において公知であり、例えばこの内容全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第６，５２８，５２６号（ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）、同第６，５２４，３４７号（ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）、同第６，４８２，８３４号（ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）、同第６，４７２，３９１号（ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）、同第６，６９６，４３４号、同第６，３３１，５５５号、同第６，２５１，９０５号、同第６，２４５，７６０号、同第６，２０７，６６７号、同第５，９９０，１４１号、同第５，７００，８２２号、同第５，６１８，８３７号及び同第５，７３１，３２６号に述べられているものがある。
ＰＤＧＦの作用をブロックするタンパク質及びポリペプチドは、当技術分野において公知であり、例えばこの内容全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第６，３５０，７３１号（ＰＤＧＦペプチド類似体）、同第５，９５２，３０４号に述べられているものがある。
ＥＧＦ及び／又はＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼを阻害するビス単環式及び二環式アリール及びヘテロアリール化合物は、当技術分野において公知であり、例えばこの内容全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第５，４７６，８５１号、同第５，４８０，８８３号、同第５，６５６，６４３号、同第５，７９５，８８９号及び同第６，０５７， ３２０号に述べられているものがある。
ＰＤＧＦの阻害のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当技術分野において公知であり、例えばこの内容全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第５，８６９，４６２号及び同第５，８２１，２３４号に述べられているものがある。
ＰＤＧＦの阻害のためのアプタマー（核酸リガンドとしても知られる）は、当技術分野において公知であり、例えばこの各々の内容全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第６，５８２，９１８号、同第６，２２９，００２号、同第６，２０７，８１６号、同第５，６６８，２６４号、同第５，６７４，６８５号、及び同第５，７２３，５９４号に述べられているものがある。
当技術分野において公知の、ＰＤＧＦを阻害するための他の化合物は、この各々の内容全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第５，２３８，９５０号、同第５，４１８，１３５号、同第５，６７４，８９２号、同第５，６９３，６１０号、同第５，７００，８２２号、同第５，７００，８２３号、同第５，７２８，７２６号、同第５，７９５，９１０号、同第５，８１７，３１０号、同第５，８７２，２１８号、同第５，９３２，５８０号、同第５，９３２，６０２号、同第５，９５８，９５９号、同第５，９９０，１４１号、同第６，３５８，９５４号、同第６，５３７，９８８号及び同第６，６７３，７９８号に述べられているものを含む。
ＶＥＧＦアンタゴニスト
ＶＥＧＦ（例えばＶＥＧＦ−Ａ）の阻害は様々な方法で達成される。例えばアプタマー、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＲＮＡｉ分子及びＶＥＧＦ抗体などの核酸分子を含む、ＶＥＧＦの活性又は産生を阻害する様々なＶＥＧＦアンタゴニストが入手可能であり、本発明の方法において使用することができる。例示的なＶＥＧＦアンタゴニストは、以下で述べるもののようなＶＥＧＦの核酸リガンド又はアプタマーを含む。ＶＥＧＦ−Ａに対する特に有用なアンタゴニストは、高く、特異的な親和性で主要な可溶性ヒトＶＥＧＦアイソフォームに結合する修飾ペグ化アプタマー、ＥＹＥ００１（以前はＮＸ１８３８と称されていた）である（米国特許第６，０１１，０２０号；同第６，０５１，６９８号；及び同第６，１４７，２０４号参照）。前記アプタマーは、ＶＥＧＦに対する高親和性抗体と同様にＶＥＧＦに結合して、ＶＥＧＦを不活性化する。もう１つの有用なＶＥＧＦアプタマーは、この非ペグ化形態のＥＹＥ００１である。また、ＶＥＧＦアンタゴニストは、例えば抗ＶＥＧＦ抗体又は抗体フラグメントであり得る。従って、ＶＥＧＦ分子は、受容体へのこの結合を阻害することによって不活性となる。加えて、核酸レベルでＶＥＧＦ発現又はＲＮＡ安定性を阻害するアンチセンスＲＮＡ、リボザイム及びＲＮＡｉ分子などの核酸分子は、本発明の方法及び組成物における有用なアンタゴニストである。他のＶＥＧＦアンタゴニストは、ペプチド、タンパク質、環状ペプチド及び小有機化合物を含む。
例えば付随するシグナル伝達作用を伴わずにＶＥＧＦ受容体に結合する可溶性トランケート形態のＶＥＧＦも、アンタゴニストとして働く。さらに、ＶＥＧＦのシグナル伝達作用は、例えば以下でさらに述べるような、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ活性の低分子阻害剤を含む多くのアンタゴニストを使用することにより、この下流シグナル伝達を断つことによって阻害し得る。
化合物又は物質がＶＥＧＦアンタゴニストとして働く能力は、当技術分野において周知の多くの標準方法に従って判定し得る。例えばＶＥＧＦの生物活性の１つは、血管内皮細胞上の受容体への特異的結合を通して血管透過性を上昇させることである。この相互作用は、この後の血管液の漏出を伴う、緊密な内皮連結の弛緩を生じさせる。ＶＥＧＦによって誘導される血管漏出は、ＶＥＧＦの皮内注射の結果としての、モルモットの血管系からのエバンスブルー染料の漏出を追跡することによってインビボで測定できる（Ｄｖｏｒａｋら、Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ Ｆａｃｔｏｒ／Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓより；及び（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６：１０２９）。同様に、ＶＥＧＦのこの生物活性をブロックするアンタゴニストの能力を測定するアッセイが使用できる。
血管透過性アッセイの１つの有用な例では、ＶＥＧＦ１６５（２０−３０ｎＭ）をあらかじめ半ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）でＥＹＥ００１（３０ｎＭ−１μＭ）又は候補ＶＥＧＦアンタゴニストと混合し、この後皮内注射によってモルモットの背の毛刈りした皮膚に投与する。注射の３０分後、注射部位の周囲のエバンスブルー染料漏出を、コンピュータ形態計測分析システムを使用して標準方法に従って定量する。血管系からの指示薬染料のＶＥＧＦ誘導性漏出を阻害する化合物は、本発明の方法及び組成物における有効なアンタゴニストとみなされる。
化合物がＶＥＧＦアンタゴニストであるかどうかを判定するためのもう１つのアッセイは、いわゆる角膜血管新生アッセイである。このアッセイでは、ＶＥＧＦ１６５（３ｐｍｏｌ）を含むメタクリル酸ポリマーペレットをラットの角膜支質に移植して、正常無血管角膜内への血管増殖を誘導する。次に、候補ＶＥＧＦアンタゴニストを１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回又は２回、５日間にわたってラットに静脈内投与する。治療期間の終了時に、個々の角膜を全て顕微鏡写真撮影する。新しい血管が角膜組織において発達する程度及び候補化合物によるこれらの阻害を、顕微鏡写真の標準化形態計測分析によって定量する。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）による処置と比較したとき角膜におけるＶＥＧＦ依存性血管新生を阻害する化合物は、本発明の方法及び組成物における有用なアンタゴニストとみなされる。
候補ＶＥＧＦアンタゴニストはまた、未熟児網膜症のマウスモデルを用いて特定される。１つの有用な例では、それぞれ９、８、８、７及び７匹のマウスの同腹子を室内空気中に放置するか又は高酸素状態にして、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又は候補ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ／日で）で腹腔内処置する。次に、アッセイのエンドポイントである、網膜の内境界膜を通しての硝子体液への新しい毛細血管の成長を、全ての処置及び対照マウスからの各々の眼の２０の組織切片において、新生血管芽の顕微鏡特定及び計数によって評価する。未処置対照に比べて処置マウスにおける網膜新生血管系の減少は、有用なＶＥＧＦアンタゴニストを特定するとみなされる。
さらにもう１つの例示的スクリーニングアッセイでは、インビボでのヒト腫瘍異種移植片アッセイを用いて候補ＶＥＧＦアンタゴニストを特定する。このスクリーニングアッセイでは、候補ＶＥＧＦアンタゴニストのインビボでの効果を、ヌードマウスに移植したヒト腫瘍異種移植片（Ａ６７３横紋筋肉腫及びウィルムス腫瘍）において試験する。マウスを候補ＶＥＧＦアンタゴニストで処置する（例えば確認された腫瘍（２００ｍｇ）の発現後１日１回１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与する）。対照群を対照薬で処置する。対照に比べてＡ６７３横紋筋肉腫の腫瘍増殖及びウィルムス腫瘍を阻害すると特定された候補化合物は、本発明の方法及び組成物における有用なアンタゴニストとみなされる。
ＶＥＧＦアンタゴニスト活性を検定するさらなる方法は、当技術分野において公知であり、以下でさらに詳述する。
本発明はさらに、当技術分野において公知のＶＥＧＦアンタゴニスト並びに以下で裏付けられるもの及び通常技術範囲内で創造されるあらゆる等価物を包含する。例えばＶＥＧＦに対する阻害抗体は当技術分野において公知であり、例えばこの内容全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第６，５２４，５８３号、同第６，４５１，７６４号（ＶＲＰ抗体）、同第６，４４８，０７７号、同第６，４１６，７５８号、同第６，４０３，０８８号（ＶＥＧＦ−Ｃに対する）、同第６，３８３，４８４号（ＶＥＧＦ−Ｄに対する）、同第６，３４２，２２１号（抗−ＶＥＧＦ抗体）、同第６，３４２，２１９号、同第６，３３１，３０１号（ＶＥＧＦ−Ｂ抗体）、及び同第５，７３０，９７７号、及びＰＣＴ国際公開公報第Ｗ０９６／３００４６号、同第ＷＯ９７／４４４５３号、及び同第ＷＯ９８／４５３３１号に述べられているものがある。
ＶＥＧＦ受容体に対する抗体も、例えばこの内容全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第５，８４０，３０１号、同第５，８７４，５４２号、同第５，９５５，３１１号、同第６，３６５，１５７号、及びＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０４／００３２１１号に述べられているもののように、当技術分野において公知である。
例えばＶＥＧＦＲ関連チロシンキナーゼ活性を阻害することによって、ＶＥＧＦの作用をブロックする小分子は、当技術分野において公知であり、例えばこの各々の内容全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第６，５１４，９７１号、同第６，４４８，２７７号、同第６，４１４，１４８号、同第６，３６２，３３６号、同第６，２９１，４５５号、同第６，２８４，７５１号、同第６，１７７，４０１号、同第６０７１，９２１号、及び同第６００１，８８５号（ＶＥＧＦ発現のレチノイド阻害剤）に述べられているものがある。
ＶＥＧＦの作用をブロックするタンパク質及びポリペプチドは、当技術分野において公知であり、例えばこの各々の内容全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第６，５７６，６０８号、同第６，５５９，１２６号、同第６，５４１，００８号、同第６，５１５，１０５号、同第６，３８３，４８６号（ＶＥＧＦおとり受容体）、同第６，３７５，９２９号（ＶＥＧＦおとり受容体）、同第６，３６１，９４６号（ＶＥＦＧペプチド類似体阻害剤）、同第６，３４８，３３３号（ＶＥＧＦおとり受容体）、同第６，５５９，１２６号（ＶＥＧＦに結合して、ＶＥＧＦＲへの結合をブロックするポリペプチド）、同第６，１００，０７１号（ＶＥＧＦおとり受容体）、及び同第５，９５２，１９９号に述べられているものがある。
ＶＥＧＦ及び／又はＶＥＧＦＲ遺伝子発現及び／又は活性に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を仲介することができる短い干渉性核酸（ｓｉＮＡ）、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、例えばこの内容全体が参照によりここに組み込まれる、ＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０３／０７０９１０号に開示されているように、当技術分野において公知である。
ＶＥＧＦの阻害のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは当技術分野において公知であり、例えばこの各々の内容全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第５，６１１，１３５号、同第５，８１４，６２０号、同第６，３９９，５８６号、同第６，４１０，３２２号、及び同第６，２９１，６６７号に述べられているものがある。
ＶＥＧＦ阻害のためのアプタマー（核酸リガンドとしても知られる）は、当技術分野において公知であり、例えばこの各々の内容全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第６，７６２，２９０号、同第６，４２６，３３５号、同第６，１６８，７７８号、同第６，０５１，６９８号、及び同第５，８５９，２２８号に述べられているものがある。
抗体アンタゴニスト
本発明は、ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦに対するアンタゴニスト抗体並びにこれらのコグネイト受容体ＰＤＧＦＲ及びＶＥＧＦＲを含む。本発明の抗体アンタゴニストは、リガンドとこのコグネイト受容体の結合をブロックする。従って、本発明のＰＤＧＦアンタゴニスト抗体は、ＰＤＧＦ並びにＰＤＧＦＲ標的に対する抗体を含む。
本発明のアンタゴニスト抗体は、モノクローナル阻害抗体を含む。モノクローナル抗体又はこのフラグメントは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡなどの全ての免疫グロブリンクラス、又はＩｇＧサブクラスなどのこれらのサブクラス又はこれらの混合物を包含する。ＩｇＧ及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、又はＩｇＧＭなどのこのサブクラスは有用である。ＩｇＧサブタイプ、ＩｇＧ１／κ及びＩｇＧ２ｂ／κは、有用な実施態様として包含される。挙げられるフラグメントは全て、抗体に対応し、Ｆｖ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２フラグメントなどの軽鎖及び重鎖によって形成される結合部位を有する抗体の部分などの、哺乳動物ＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ（又はこれらのコグネイト受容体）に対して高い結合及び中和活性を示す１又は２個の抗原補体結合部位を有するトランケート又は修飾された抗体フラグメントである。Ｆｖ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２などのトランケート型二本鎖フラグメントは特に有用である。これらのフラグメントは、例えば抗体のＦｃ部分をパパイン又はペプシンなどの酵素で取り除くことによる酵素的手段によって、化学的酸化によって又は抗体遺伝子の遺伝子操作によって入手できる。また、遺伝子操作された非トランケート型フラグメントを使用することも可能であり、好都合である。抗ＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ抗体又はこのフラグメントは、単独で又は混合物中で使用することができる。
新規抗体、抗体フラグメント、この混合物又は誘導体は、好都合には１×１０−７Ｍから１×１０−１２Ｍ、又は１×１０−８Ｍから１×１０−１１Ｍ、又は１×１０−９Ｍから５×１０−１０Ｍの範囲内のＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ（又はこれらのコグネイト受容体）に対する結合親和性を有する。
遺伝子操作のための抗体遺伝子は、例えばハイブリドーマ細胞から、当業者に公知の方法で単離することができる。このために、抗体産生細胞を培養し、細胞の光学密度が十分になったとき、細胞をグアニジニウムチオシアネートで溶解し、酢酸ナトリウムで酸性化して、フェノール、クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、イソプロパノールで沈殿させて、エタノールで洗浄することにより、公知の方法でｍＲＮＡを細胞から単離する。次に逆転写酵素を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡを、直接又は遺伝子操作後、例えば部位指定突然変異誘発、挿入、逆位、欠失又は塩基交換の導入によって、適切な動物、真菌、細菌又はウイルスベクターに挿入し、適切な宿主生物において発現することができる。有用な細菌又は酵母ベクターは、大腸菌などの細菌又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母における遺伝子のクローニング及び発現のためのｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８／１９ｐＡＣＹＣ１８４、λ又は酵母μベクターである。
本発明はさらに、ＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ抗体を合成する細胞に関する。これらは、叙述したような形質転換後の動物、真菌、細菌細胞又は酵母細胞である。これらは、好都合にはハイブリドーマ細胞又はトリオーマ細胞であり、典型的にはハイブリドーマ細胞である。これらのハイブリドーマ細胞は、例えばＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ（又はこれらのコグネイト受容体）で免疫した動物から公知の方法で生産することができ、これらの抗体産生Ｂ細胞を単離し、これらの細胞をＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ結合抗体に関して選択して、続いてこれらの細胞を、例えばヒト又は動物、例えばマウス骨髄腫細胞、ヒトリンパ芽球細胞又はヘテロハイブリドーマ細胞に融合することによって（例えばＫｏｅｈｌｅｒら（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９６）又はこれらの細胞を適切なウイルスで感染させて不死化細胞系を樹立することによって生産できる。融合によって生産されるハイブリドーマ細胞系は有用であり、マウスハイブリドーマ細胞系は特に有用である。本発明のハイブリドーマ細胞系は、ＩｇＧ型の有用な抗体を分泌する。本発明のｍＡｂ抗体の結合は、高親和性で結合し、ＰＤＧＦ又はＶＥＧＦの生物活性（例えば血管新生活性）を低下させるか又は中和する。
本発明はさらに、ＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ阻害活性を保持するが、薬剤としてのこれらの使用に関連する１又はそれ以上の他の特性、例えば血清安定性又は生産効率が変化している、これらの抗ＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ抗体の誘導体を含む。このような抗ＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ抗体誘導体の例は、抗体の抗原結合領域に由来するペプチド、ペプチドミメティック、及びポリエチレングリコール、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンなどの合成ポリマー又はセルロース、セファロース又はアガロースなどの天然ポリマーのような固体又は液体担体に結合した抗体、抗体フラグメント又はペプチド、又は酵素、毒素又は３Ｈ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５５Ｆｅ、９０Ｙ、９０ｍＴｃ、７５Ｓｅなどの放射性又は非放射性マーカーとの複合体、又はローダミン、フルオレセイン、イソチオシアネート、フィコエリトリン、フィコシアニン、フルオレスカミン、金属キレート、アビジン、ストレプトアビジン又はビオチンなどの蛍光／化学発光標識に共有結合した抗体、フラグメント又はペプチドを含む。
新規抗体、抗体フラグメント、この混合物及び誘導体は、直接、乾燥後、例えば凍結乾燥後、上記担体への結合後、又は医薬製剤を生産するための他の医薬活性物質又は補助物質との製剤後に使用することができる。挙げられる活性及び補助物質の例は、他の抗体、一般的な抗生物質又はスルホンアミドなどの殺菌又は静菌作用を有する抗菌作用物質、抗腫瘍薬、水、緩衝剤、塩類溶液、アルコール、脂肪、ろう、不活性賦形剤、又はアミノ酸、増粘剤又は糖類などの非経口製品のための慣例的な他の物質である。これらの医薬製剤は疾患を制御するために使用され、ＡＭＤ及び糖尿病性網膜症を含む眼血管新生疾患及び障害を制御するために有用である。
新規抗体、抗体フラグメント、この混合物及び誘導体は、直接、又は上述したような固体又は液体担体、酵素、毒素、放射性又は非放射性標識又は蛍光／化学発光標識に結合した後、治療又は診断において使用することができる。
本発明のヒトＰＤＧＦ又はＶＥＧＦモノクローナル抗体は、当技術分野において公知の何らかの手段によって入手し得る。例えば哺乳動物をヒトＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ（又はこれらのコグネイト受容体）で免疫する。精製ヒトＰＤＧＦ及びＶＥＧＦは市販されている（例えばＣｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ並びに他の商業販売者から）。また、ヒトＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ（又はこれらのコグネイト受容体）は、ヒト胎盤組織から容易に精製し得る。抗ヒトＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ抗体を惹起するために使用される哺乳動物は限定されず、霊長動物、げっ歯動物（マウス、ラット又はウサギなど）、ウシ、ヒツジ、ヤギ又はイヌであり得る。
次に、脾細胞などの抗体産生細胞を免疫動物から取り出し、骨髄腫細胞と融合する。骨髄腫細胞は当技術分野において周知である（例えばｐ３ｘ６３−Ａｇ８−６５３、ＮＳ−０、ＮＳ−１又はＰ３Ｕ１細胞が使用し得る）。細胞融合操作は、当技術分野で公知の慣例的な方法によって実施し得る。
細胞融合操作に供した後の細胞を、次に、ハイブリドーマを選択するためにＨＡＴ選択培地で培養する。この後、抗ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。このスクリーニングは、例えば産生されたモノクローナル抗体を、ヒトＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ（又はこれらのコグネイト受容体）を固定した壁に結合させる、サンドイッチ酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）等によって実施し得る。この場合、二次抗体として、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等のような酵素で標識した、免疫動物の免疫グロブリンに特異的な抗体を使用し得る。標識酵素をこの基質と反応させ、生じた色を測定することによって標識を検出し得る。基質として、３，３−ジアミノベンジジン、２，２−ジアミノビス−ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール、４−アミノアンチピリン、ｏ−フェニレンジアミン等を生成し得る。
上述した操作により、抗ヒトＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ抗体を生産するハイブリドーマが選択できる。選択したハイブリドーマを、次に、慣例的な限界希釈法又は軟寒天法によってクローン化する。所望する場合は、クローン化したハイブリドーマを血清含有又は無血清培地を用いて大規模培養するか、又はマウスの腹腔内に接種して、腹水から回収し、これによって多数のクローン化ハイブリドーマを入手してもよい。
選択した抗ヒトＰＤＧＦ又はＶＥＧＦモノクローナル抗体の中から、次に、対応するリガンド／受容体対の結合及び活性化を妨げる能力を有するもの（例えば細胞ベースのＰＤＧＦ又はＶＥＧＦアッセイ系において（上記参照））をさらなる分析と操作のために選択する。抗体が受容体／リガンドの結合及び／又は活性化をブロックする場合、これは、試験したモノクローナル抗体がヒトＰＤＧＦ又はＶＥＧＦのＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ活性を低下させる又は中和する能力を有することを意味する。すなわち、このモノクローナル抗体は、ヒトＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ（又はこれらのコグネイト受容体）の決定的に重要な結合部位を特異的に認識する及び／又は妨げる。
モノクローナル抗体は、ここではさらに、これらが所望生物活性を示す限り、起源の種、免疫グロブリンクラス又はサブクラスの名称並びに抗体フラグメント［例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２及びＦｖ］に関わりなく、抗ＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ抗体の可変ドメイン（超過変ドメインを含む）を定常ドメインで（例えば「ヒト化」抗体）、又は軽鎖を重鎖で、又は１つの種からの鎖を別の種からの鎖でスプライシングすることによって、又は、異種タンパク質との融合によって生産されるハイブリッド及び組換え抗体を含む。［例えば米国特許第４，８１６，５６７号及びＭａｇｅ ＆ Ｌａｍｏｙｉ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．７９−９７より（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）参照］。
従って、「モノクローナル」という用語は、得られる抗体の性質が抗体の実質的に均一な個体群からであることを示し、特定方法による抗体の生産を必要すると解釈されるべきではない。例えば本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記述されたハイブリドーマ方法によって作製してもよく、又は組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製してもよい。「モノクローナル抗体」はまた、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４（１９９０）に述べられている手法を用いて作製されるファージライブラリーから単離してもよい。
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はこのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２又は抗体の他の抗原結合サブ配列など）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエント抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望特異性、親和性及び容量を有するマウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒトＦＲ残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又は導入されたＣＤＲ又はＦＲ配列のいずれにおいても認められない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに改善し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全部又は実質的に全部のＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、及び全部又は実質的に全部のＦＲ残基がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含む。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含む。
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野において周知である。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外のソースから導入された１又はそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば、典型的には「外来性」可変ドメインからとられる、「外来性」残基と称される。ヒト化は、基本的にはＷｉｎｔｅｒとこの共同研究者達（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６）の方法に従うが、但し、げっ歯動物ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することによって実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、実質的に１つの無傷ヒト可変ドメイン未満がヒト以外の種からの対応配列によって置換された、キメラ抗体である。実際上、ヒト化抗体は、典型的には、一部のＣＤＲ残基及びおそらくは一部のＦＲ残基が、げっ歯動物抗体における類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
ヒト化抗体を作製するときに使用する、軽鎖及び重鎖の両方の、ヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法に従って、げっ歯動物抗体の可変ドメインの配列を公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。げっ歯動物のものに最も近いヒト配列を、次に、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる（Ｓｉｍｓら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６；及びＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１）。もう１つの方法は、軽鎖又は重鎖の特定サブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定フレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体のために使用し得る（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８９：４２８５；及びＰｒｅｓｔａら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．，１５１：２６２３）。
抗原に対する高い親和性及び他の好都合な生物学的特性を保持しながら抗体をヒト化することはさらに重要である。この目標を達成するために、１つの有用な方法によれば、ヒト化抗体は、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用した、親配列と様々な概念上のヒト化産物の分析の過程によって作製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者には熟知されている。選択した候補免疫グロブリン配列の確率的三次元配座構造を例証し、表示するコンピュータプログラムが使用可能である。これらの表示の検討は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の想定される役割の分析、すなわち候補免疫グロブリン配列がこの抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析を可能にする。このようにして、標的抗原に対する高い親和性などの所望抗体特性が達成されるように、コンセンサス及び重要配列からＦＲ残基を選択し、結合することができる。一般に、ＣＤＲ残基は、直接に及びほとんど実質的に抗原結合への影響に関与する。
ＰＤＧＦ又はＶＥＧＦに対するヒトモノクローナル抗体も本発明に包含される。このような抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の作製のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトへテロ骨髄腫細胞系は、例えばＫｏｚｂｏｒ（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３，３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６−９５によって述べられている。
今や、免疫後に、内因性免疫グロブリンの産生なしでヒト抗体の完全なレパートリーを生産することができるトランスジェニック動物（例えばマウス）を作製することが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異型マウスにおける抗体重鎖接合領域（ＪＨ）のホモ接合欠失が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記述された。このような生殖細胞系突然変異型マウスへのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は、抗原投与後にヒト抗体の産生を生じさせる（例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９０：２５５１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８；及びＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら（１９９３）Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３参照）。
また、非免疫ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体フラグメントを生産するためにファージディスプレイテクノロジー（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５３）が使用できる（総説については、例えばＪｏｈｎｓｏｎら（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３：５６４−５７１）。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかのソースがファージディスプレイのために使用できる。例えばＣｌａｃｋｓｏｎら（（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８）は、免疫マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。基本的にＭａｒｋｓら（（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７、又はＧｒｉｆｆｉｔｈら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．，１２：７２５−７３４）が述べた手法に従って、非免疫ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築し、抗原の多様なアレイ（自己抗原を含む）に対する抗体を単離することができる。
自然免疫応答では、抗体遺伝子は高い割合で突然変異を蓄積する（体細胞超突然変異）。導入される変化の一部は、より高い親和性を付与し、この後の抗原投与の間に、高親和性表面免疫グロブリンを提示するＢ細胞が選択的に複製され、分化する。この自然過程は、「チェーンシャッフリング」として知られる手法を用いることによって模倣できる（Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３参照）。この方法では、ファージディスプレイによって得た「一次」ヒト抗体の親和性を、この後重鎖及び軽鎖Ｖ領域遺伝子を非免疫ドナーから得たＶドメイン遺伝子の天然に生じる変異体レバートリー（レパートリー）で置き換えることによって改善できる。この手法は、ｎＭ範囲の親和性を有する抗体及び抗体フラグメントの生産を可能にする。非常に大きなファージ抗体レパートリーを作製するための戦略が、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６）によって述べられている。
遺伝子シャッフリングはまた、げっ歯動物抗体からヒト抗体を誘導するために使用でき、この場合ヒト抗体は出発げっ歯動物抗体に類似の親和性及び特異性を有する。「エピトープ刷込み」とも称される、この方法によれば、ファージディスプレイ手法によって得たげっ歯動物抗体の重鎖又は軽鎖Ｖドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、げっ歯動物−ヒトキメラを作製する。抗原に関する選択は、機能的抗原結合部位を回復することができるヒト可変ドメインの単離をもたらす、すなわちエピトープがパートナーの選択を支配する（刷込みする）。残りのげっ歯動物Ｖドメインを置換するためにこの工程を反復して、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日公開のＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ９３／０６２１３号参照）。ＣＤＲ移植による伝統的なげっ歯動物抗体のヒト化と異なり、この手法は、げっ歯動物起源のフレームワーク又はＣＤＲ残基を全く持たない、完全なヒト抗体を提供する。
アプタマーアンタゴニスト
本発明は、ＰＤＧＦ及び／又はＶＥＧＦ（又はこれらのコグネイト受容体）に対するアプタマーアンタゴニストを提供する。核酸リガンドとしても知られるアプタマーは、あらかじめ選択された標的に結合し、一般に、この標的に拮抗する（すなわち阻害する）非天然に生じる核酸である。
アプタマーは、オリゴマー又はオリゴヌクレオチドを生産する公知の何らかの方法によって作製することができる。多くの合成方法が当技術分野において公知である。例えば残留プリンリボヌクレオチドを含み、３’−エキソヌクレアーゼによって起こりうる分解を防ぐために逆方向チミジン残基（Ｏｒｔｉｇａｏら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２：１２９−１４６（１９９２））又は３’末端の２つのホスホロチオエート結合などの適切な３’末端を担持する２’−Ｏ−アリル修飾オリゴマーは、何らかの市販のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーでの固相β−シアノエチルホスホルアミダイト化学（Ｓｉｎｈａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：４５３９−４５５７（１９８４））によって合成することができる。１つの方法は、リボヌクレオチドのための２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）保護戦略であり（Ｕｓｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９：７８４５−７８５４（１９８７））、必要な全ての３’−Ｏ−ホスホルアミダイトが市販されている。加えて、アミノメチルポリスチレンが、この好都合な特性の故に支持体材料として使用し得る（ＭｃＣｏｌｌｕｍとＡｎｄｒｕｓ（１９９１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３２：４０６９−４０７２）。市販のフルオレセインホスホルアミダイトを使用することにより、合成の間に基質ＲＮＡの５’末端にフルオレセインを添加することができる。一般に、アプタマーオリゴマーは標準ＲＮＡサイクルを使用して合成できる。構築の完了後、密封バイアルにおいて濃縮水性アンモニア／エタノール（３：１ ｖ／ｖ）によって５５℃で８時間処理することにより、全ての塩基不安定保護基を除去する。エタノールは、さもなければ脱保護の塩基性条件下で生じるリボヌクレオチド位置での評価し得る鎖切断を導く、２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ基の早過ぎる除去を抑制する（Ｕｓｍａｎら（１９８７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９：７８４５−７８５４）。凍結乾燥後、ＴＢＤＭＳ保護されたオリゴマーをトリエチルアミントリヒドロフルオリド／トリエチルアミン／Ｎ−メチルピロリジノンの混合物によって６０℃で２時間処理することにより、中性条件下でシリル保護基の迅速で効率的な除去が得られる（Ｗｉｎｃｏｔｔら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３：２６７７−２６８４参照）。次に、完全に脱保護されたオリゴマーを、ＣａｔｈａｌａとＢｒｕｎｅｌ（（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：２０１）の手法に従ってブタノールで沈殿させ得る。精製は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって又はイオン交換ＨＰＬＣ（Ｓｐｒｏａｔら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４：２５５−２７３）と逆相ＨＰＬＣの組合せによって実施することができる。細胞における使用のために、合成したオリゴマーを、アセトン中の過塩素酸ナトリウムでの沈殿によってナトリウム塩に転換する。この後、市販されている小さな使い捨てゲルろ過カラムを使用して微量の残留塩を除去し得る。最終段階として、単離したオリゴマーの真正さをマトリックス支援レーザー脱離質量分析法（Ｐｉｅｌｅｓら（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１：３１９１−３１９６）及びヌクレオシド塩基組成物分析によって確認し得る。
開示するアプタマーはまた、ヌクレオチドサブユニットが酵素的操作のために使用可能であるときは、酵素的方法を通して生産することもできる。例えばインビトロでのＲＮＡポリメラーゼＴ７反応を通してＲＮＡ分子を作製できる。これらはまた、Ｔ７を発現する細菌株又は細胞系によって作製し、この後これらの細胞から単離することもできる。以下で論じるように、開示するアプタマーはまた、ベクター及びプロモーターを使用して直接細胞において発現することもできる。
アプタマーは、本発明の他の核酸分子と同様に、化学修飾ヌクレオチドをさらに含み得る。核酸の診断又は治療的使用において考慮すべき１つの問題は、所望効果が発現する前の、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼなどの細胞内及び細胞外酵素による体液中のホスホジエステル形態のオリゴヌクレオチドの潜在的な急速分解である。核酸リガンドのインビボでの安定性を高めるため又は核酸リガンドの送達を増強又は仲介するために、核酸リガンドのある種の化学修飾を行うことができる（参照によりここに組み込まれる、「修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」と題する米国特許出願第５，６６０，９８５号参照）。
本発明において考慮される核酸リガンドの修飾は、付加的な電荷、分極性、疎水性、水素結合、静電的相互作用及び流動性（ｆｌｕｘｉｏｎａｌｉｔｙ）を組み込んだ他の化学基を、核酸リガンド塩基に又は全体としての核酸リガンドに与えるものを含むが、これらに限定されない。このような修飾は、２’位の糖修飾、５位のピリミジン修飾、８位のプリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ又は５−ヨードウラシルの置換；骨格修飾、ホスホロチオエート又はアルキルホスフェート修飾、メチル化、イソ塩基イソシチジン及びイソグアニジン等のような異常塩基対合の組合せを含むが、これらに限定されない。修飾はまた、キャップ形成又は糖部分による修飾などの３’及び５’修飾を含み得る。本発明の一部の実施態様では、核酸リガンドは、ピリミジン残基の糖部分で修飾された２’−フルオロ（２’−Ｆ）であるＲＮＡ分子である。
アプタマーの安定性は、このような修飾の導入によって並びにＲＮＡのリン酸骨格に沿った修飾及び置換によって大きく上昇し得る。加えて、ヌクレオ塩基自体に、分解を阻止し、所望ヌクレオチド相互作用を上昇させ得る又は望ましくないヌクレオチド相互作用を低下させ得る様々な修飾を施すことができる。従って、ひとたびアプタマーの配列がわかれば、以下で述べる合成手順によって又は当業者に公知の手順によって、修飾又は置換を行うことができる。
他の修飾は、リボ核酸（すなわちＡ、Ｃ、Ｇ及びＵ）及びデオキシリボ核酸（すなわちＡ、Ｃ、Ｇ及びＴ）において生じる標準塩基、糖及び／又はリン酸骨格化学構造の変異である、修飾塩基（又は修飾ヌクレオシド又は修飾ヌクレオチド）の組込みを含む。例えばＧｍ（２’−メトキシグアニル酸）、Ａｍ（２’−メトキシアデニル酸）、Ｃｆ（２’−フルオロシチジル酸）、Ｕｆ（２’−フルオロウリジル酸）、Ａｒ（リボアデニル酸）は、本発明の範囲内に包含される。アプタマーはまた、シトシン又は、５−メチルシトシン、４−アセチルシトシン、３−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、２−チオシトシン、５−ハロシトシン（例えば５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−クロロシトシン及び５−ヨードシトシン）、５−プロピルシトシン、６−アゾシトシン、５−トリフルオロメチルシトシン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、フェノキサジンシチジン、フェノチアジンシチジン、カルバゾールシチジン又はピリリドインドールシチジンを含むシトシン関連塩基を包含し得る。アプタマーはさらに、グアニン又は、６−メチルグアニン、１−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２−プロピルグアニン、６−プロピルグアニン、８−ハログアニン（例えば８−フルオログアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン及び８−ヨードグアニン）、８−アミノグアニン、８−スルフヒドリルグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン、７−メチルグアニン、８−アザグアニン、７−デアザグアニン又は３−デアザグアニンを含むグアニン関連塩基を包含し得る。アプタマーはさらに、アデニン又は、６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、８−ハロアデニン（例えば８−フルオロアデニン、８−ブロモアデニン、８−クロロアデニン及び８−ヨードアデニン）、８−アミノアデニン、８−スルフヒドリルアデニン、８−チオアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン、７−メチルアデニン、２−ハロアデニン（例えば２−フルオロアデニン、２−ブロモアデニン、２−クロロアデニン及び２−ヨードアデニン）、２−アミノアデニン、８−アザアデニン、７−デアザアデニン又は３−デアザアデニンを含むアデニン関連塩基を包含し得る。また、ウラシル又は、５−ハロウラシル（例えば５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル及び５−ヨードウラシル）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、１−メチルプソイドウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、５−メチルアミノメチルウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アゾウラシル又は４−チオウラシルを含むウラシル関連塩基を包含する。
当技術分野において公知の他の修飾塩基変異体の例は、限定を伴わずに、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２（ｐ）（１）にリストされているもの、例えば４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、２’−メトキシシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、ｂ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルプソイドウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、ｂ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−ｂ−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、Ｎ−（（９−ｂ−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチル−カルバモイル）トレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、クエオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−ｂ−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ワイブトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジンを含む。
また、米国特許第３，６８７，８０８号、同第３，６８７，８０８号、同第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６４５，９８５号、同第５，８３０，６５３号、同第５，７６３，５８８号、同第６，００５，０９６号、及び同第５，６８１，９４１号に述べられている修飾ヌクレオ塩基も包含される。当技術分野において公知の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチド糖骨格変異体は、限定を伴わずに、例えばＦ、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２、ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、ＯＣＨ２ＯＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、Ｏ（Ｃ１−１０アルキル）、Ｏ（Ｃ２−１０アルケニル）、Ｏ（Ｃ２−１０アルキニル）、Ｓ（Ｃ１−１０アルキル）、Ｓ（Ｃ２−１０アルケニル）、Ｓ（Ｃ２−１０アルキニル）、ＮＨ（Ｃ１−１０アルキル）、ＮＨ（Ｃ２−１０アルケニル）、ＮＨ（Ｃ２−１０アルキニル）、及びＯ−アルキル−Ｏ−アルキルなどの２’リボシル置換を有するものを含む。望ましい２’リボシル置換基は、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ、（２’ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。２’置換基は、アラビノ（上）位置又はリボ（下）位置に存在し得る。
本発明のアプタマーは、上述したようなヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体、又はこの両方の組合せで作られ得るか、又はオリゴヌクレオチド類似体である。本発明のアプタマーは、ＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ（又はこれらのコグネイト受容体）に結合するオリゴマーの機能に影響を及ぼさない位置にヌクレオチド類似体を含み得る。
特定標的分子に結合する核酸リガンドの改善又は強化又は付加的なアプタマーの選択のために適合させ得るいくつかの手法がある。一般に「インビトロ遺伝学」と称される（Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９２）ＴＩＢＳ，１９：８９参照）１つの手法は、ランダムな配列のプールからの選択によるアプタマーアンタゴニストの単離を含む。開示するアプタマーを単離し得る核酸分子のプールは、約２０−４０ヌクレオチドの可変配列に隣接する不変配列を含み得る。この方法は、試験管内人工進化法（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（ＳＥＬＥＸ）と命名された。ＳＥＬＥＸ法及び関連方法によって本発明のアプタマーアンタゴニストを作製するための組成物及び方法は、当技術分野において公知であり、例えば、この各々の全体が参照によりここに組み込まれる、「核酸リガンド（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ）」と題する米国特許第５，４７５，０９６号及び「核酸リガンドを特定するための方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ）」と題する米国特許第５，２７０，１６３号において教示される。全般的なＳＥＬＥＸ工程、及び特にＶＥＧＦ及びＰＤＧＦアプタマー及び製剤は、さらに、この各々の内容が参照によりここに組み込まれる、米国特許第５，６６８，２６４号、同第５，６９６，２４９号、同第５，６７０，６３７号、同第５，６７４，６８５号、同第５，７２３，５９４号、同第５，７５６，２９１号、同第５，８１１，５３３号、同第５，８１７，７８５号、同第５，９５８，６９１号、同第６，０１１，０２０号、同第６，０５１，６９８号、同第６，１４７，２０４号、同第６，１６８，７７８号、同第６，２０７，８１６号、同第６，２２９，００２号、同第６，４２６，３３５号、同第６，５８２，９１８号に述べられている。
簡単に述べると、ＳＥＬＥＸ法は、結合親和性及び選択性の実質的にあらゆる所望判定基準を達成するための、同じ一般的選択スキームを使用する、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択及び選択標的への結合、分離及び増幅の逐次反復を含む。典型的にはランダム化配列のセグメントを含む、核酸の混合物から出発して、ＳＥＬＥＸ法は、結合のために好都合な条件下で混合物を標的に接触させること、標的分子に特異的に結合した核酸から非結合核酸を分離すること、核酸−標的複合体を解離すること、核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅して核酸のリガンド濃縮混合物を生産すること、この後、所望に応じた回数のサイクルを通して結合、分離、解離及び増幅の工程を反復し、標的分子に高度特異的な高親和性核酸リガンドを生産することの工程を含む。
基本的ＳＥＬＥＸ法は、多くの特定目的を達成するために改変されてきた。例えば「構造に基づいて核酸を選択するための方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」と題する米国特許第５，７０７，７９６号は、折れ曲がりＤＮＡなどの特定構造特徴を有する核酸分子を選択するための、ゲル電気泳動と組み合わせたＳＥＬＥＸ工程の使用を述べている。「ＳＥＬＥＸ；核酸リガンドの光選択及び溶液ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＳＥＬＥＸ）」と題する米国特許第５，７６３，１７７号は、標的分子と結合する及び／又は光架橋する及び／又は光不活化することができる光反応基を含む核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸに基づく方法を述べている。「テオフィリンとカフェインを識別する高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｔｈａｔ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ ａｎｄ Ｃａｆｆｅｉｎｅ）」と題する米国特許第５，５８０，７３７号は、Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸと称される、非ペプチド性であり得る密接に関連する分子を識別することができる高度特異的核酸リガンドを特定するための方法を述べている。「ＳＥＬＥＸ：溶液ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＳＥＬＥＸ）」と題する米国特許第５，５６７，５８８号は、標的分子に対して高親和性と低親和性を有するオリゴヌクレオチドの間の分離を極めて効率的に達成する、ＳＥＬＥＸに基づく方法を述べている。
ＳＥＬＥＸ法は、改善されたインビボでの安定性又は改善された送達特性などの、改善された特徴をリガンドに付与する修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの特定を包含する。このような修飾の例は、リボース及び／又はリン酸及び／又は塩基位置での化学的置換を含む。ＳＥＬＥＸ法によって特定された、修飾ヌクレオチドを含む核酸リガンドが、「修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」と題する米国特許第５，６６０，９８５号に記述されており、前記特許は、ピリミジンの５位及び２’位で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを述べている。米国特許第５，５８０，７３７号、前出は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）及び／又は２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１又はそれ以上のヌクレオチドを含む高度特異的核酸リガンドを述べている。現在は放棄された、「分子内求核置換による公知及び新規２’修飾ヌクレオシドの調製の新規方法（Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｎｏｗｎ ａｎｄ Ｎｏｖｅｌ ２’Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｂｙ Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」と題する、１９９４年６月２２日出願の米国特許出願第０８／２６４，０２９号は、様々な２’修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを述べている。
ＳＥＬＥＸ法は、それぞれ、「ＳＥＬＥＸ：キメラＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＳＥＬＥＸ）」と題する米国特許第５，６３７，４５９号、及び「ＳＥＬＥＸ：混合ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｂｌｅｎｄｅｄ ＳＥＬＥＸ）」と題する米国特許第５，６８３，８６７号に述べられているように、選択オリゴヌクレオチドを他の選択オリゴヌクレオチド及び非オリゴヌクレオチド機能性単位と組み合わせることを包含する。これらの特許は、他の分子の望ましい特性と、オリゴヌクレオチドの広い範囲の形状及び他の特性、及び効率的な増幅及び複製特性の組み合わせを可能にする。
ＳＥＬＥＸ法はさらに、この全体が参照によりここに組み込まれる、「核酸リガンド複合体（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）」と題する米国特許第６，０１１，０２０号に述べられているように、診断又は治療複合体において選択核酸リガンドと脂質親和性化合物又は非免疫原性高分子量化合物を組み合わせることを包含する。
アプタマーアンタゴニストはまた、コンピュータモデリング手法の使用を通して改善することができる。分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍ及びＱＵＡＮＴＡプログラム、Ｐｏｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）である。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化及び分子動力学機能を達成する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリング及び解析を実施する。ＱＵＡＮＴＡは、分子の相互間の、相互反応性構築、修飾、視覚化及び挙動の分析を可能にする。これらの適用は、ＲＮＡ及びＤＮＡ分子の二次構造を定義し、表示するように適合させ得る。
これらの様々な修飾を有するアプタマーを、次に、ＰＤＧＦ細胞に基づく増殖活性アッセイなどの、対象とするＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ機能のための何らかの適切なアッセイを用いて機能に関して試験することができる。
前記修飾は、ＳＥＬＥＸ工程前又はＳＥＬＥＸ工程後修飾であり得る。ＳＥＬＥＸ工程前修飾は、ＳＥＬＥＸ標的に対する特異性と改善されたインビボ安定性の両方を備えた核酸リガンドを生じる。２’−ＯＨ核酸リガンドに対して為されるＳＥＬＥＸ工程後修飾は、核酸リガンドの結合能力に有害な影響を及ぼすことなく改善されたインビボでの安定性をもたらすことができる。
本発明のアプタマーを生産するために有用な他の修飾は当業者に公知である。このような修飾は、ＳＥＬＥＸ工程後に（これまでに特定された非修飾リガンドの修飾）又はＳＥＬＥＸ工程への組込みによって実施し得る。
アプタマー又は核酸リガンドは一般に、及び特にＶＥＧＦアプタマーは、非常に安定であり、従ってエキソヌクレアーゼに対する感受性を低下させ、全体的安定性を上昇させるように５’キャップ及び３’キャップ形成するときに有効である。従って、本発明は、１つの実施態様では、５’末端に５’−５’逆ヌクレオシドキャップ構造及び３’末端の３’−３’逆ヌクレオドシキャップ構造を有する、一般的なアプタマー及び特に抗ＶＥＧＦアプタマーのキャップ形成に基づく。従って、本発明は、５’末端では５’−５’逆ヌクレオシドキャップで及び３’末端では３’−３’逆ヌクレオドシキャップでキャップ形成されている抗ＶＥＧＦ及び／又は抗ＰＤＧＦアプタマー、すなわち核酸リガンドを提供する。
本発明のある種の特に有用なアプタマーは、これらの末端に５’−５’及び３’−３’逆ヌクレオドシキャップ構造を有するものを含むが、これらに限定されない、抗ＶＥＧＦアプタマー組成物である。このような抗ＶＥＧＦキャップアプタマーは、ＲＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマー又は混合（すなわちＲＮＡとＤＮＡの両方）組成物を有するアプタマーであり得る。本発明の適切な抗ＶＥＧＦアプタマー配列は、ヌクレオチド配列ＧＡＡＧＡＡＵＵＧＧ（配列番号１５）；又はヌクレオチド配列ＵＵＧＧＡＣＧＣ（配列番号１６）；又はヌクレオチド配列ＧＵＧＡＡＵＧＣ（配列番号１７）を含む。特に有用なのは、配列：Ｘ−５’−５’−ＣＧＧＡＡＵＣＡＧＵＧＡＡＵＧＣＵＵＡＵＡＣＡＵＣＣＧ−３’−３’−Ｘ（配列番号１８）
［配列中、各々のＣ、Ｇ、Ａ及びＵは、それぞれ、天然に生じるヌクレオチド、シチジン、グアニジン、アデニン及びウリジン、又はこれに対応する修飾ヌクレオチドを表わし；Ｘ−５’−５’は、アプタマーの５’末端をキャップする逆ヌクレオチドであり、３’−３’−Ｘは、アプタマーの３’末端をキャップする逆ヌクレオチドであり；及び残りのヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドは、５’−３’ホスホジエステル結合によって連続的に結合している］
を有する本発明のキャップ形成された抗ＶＥＧＦアプタマーである。一部の実施態様では、キャップされた抗ＶＥＧＦアプタマーのヌクレオチドの各々は、個々に、−ＯＨ（リボ核酸（ＲＮＡ）について標準的である）又は−Ｈ（デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）について標準的である）などの２’リボシル置換を担持する。他の実施態様では、２’リボシル位置が、Ｏ（Ｃ１−１０アルキル）、Ｏ（Ｃ１−１０アルケニル）、Ｆ、Ｎ３又はＮＨ２置換基で置換されている。
さらなる特定の非限定的な例では、５’−５’キャップされた抗ＶＥＧＦアプタマーは、構造：Ｔｄ−５’−５’−ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ３’−３’−Ｔｄ（配列番号１９）
［配列中、「Ｇｍ」は２’−メトキシグアニル酸を表わし、「Ａｍ」は２’−メトキシアデニル酸を表わし、「Ｃｆ」は２’−フルオロシチジル酸を表わし、「Ｕｆ」は２’−フルオロウリジル酸を表わし、「Ａｒ」は２’−リボアデニル酸を表わし、及び「Ｔｄ」はデオキシリボチミジル酸を表わす］
を有する。
（アンチセンス、リボザイム、及びＤＮＡ酵素アンタゴニスト）
ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦを標的するアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは、これらのメッセンジャーＲＮＡからのタンパク質翻訳を阻害することによって又はそれぞれ対応するＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ ｍＲＮＡの分解を標的することによってＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ阻害を生じさせる。上述したこれらのＰＤＧＦ及びＶＥＧＦ標的核酸は、これらのＰＤＧＦ及びＶＥＧＦリボザイム及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計及び合成のために有用な配列を提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムの設計及び合成の方法は当技術分野において公知である。付加的な手引きをここで提供する。
特異的で有効なｍＲＮＡ標的オリゴヌクレオチド（アンチセンスＯＤＮ）及びリボザイム及びアンチセンスを設計する上での１つの問題は、標的ｍＲＮＡ（これ自体が部分的自己対合二次構造に折りたたまれている）におけるアンチセンス対合のアクセス可能部位を特定するという問題である。ＲＮＡ対合のアクセス可能性を予測するためのコンピュータ支援アルゴリズムと分子スクリーニングの組合せは、大部分のｍＲＮＡ標的に対する特異的で有効なリボザイム及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの作製を可能にする。実際に、アンチセンス又はリボザイム阻害剤に対する標的ＲＮＡ分子のアクセス可能性を判定するためのいくつかのアプローチが記述されている。１つのアプローチは、できるだけ多くのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを適用するインビトロスクリーニングアッセイを使用する（Ｍｏｎｉａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，２：６６８−６７５； 及びＭｉｌｎｅｒら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：５３７−５４１参照）。もう１つは、ＯＤＮのランダムなライブラリーを利用する（Ｈｏら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４：１９０１−１９０７；Ｂｉｒｉｋｈら（１９９７）ＲＮＡ ３：４２９−４３７；及びＬｉｍａら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：６２６−６３８）。アクセス可能な部位は、ＲＮアーゼＨ切断によって観測することができる（Ｂｉｒｉｋｈら、前出；及びＨｏら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：５９−６３参照）。ＲＮアーゼＨは、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖のホスホジエステル骨格の加水分解切断を触媒する。
もう１つのアプローチでは、半ランダムな、キメラ化学合成ＯＤＮのプールを使用して、インビトロ合成したＲＮＡ標的上のＲＮアーゼＨによって切断されるアクセス可能部位を特定する。次にプライマー延長分析を使用して、標的分子においてこれらの部位を特定する（Ｌｉｍａら、前出）。ＲＮＡにおいてアンチセンス標的を設計するための他のアプローチは、ＲＮＡに関するコンピュータ支援折りたたみモデルに基づく。有効な切断をスクリーニングするためのランダムなリボザイムライブラリーの使用に関して、いくつかの報告が公開されている（Ｃａｍｐｂｅｌｌら（１９９５）ＲＮＡ １：５９８−６０９；Ｌｉｅｂｅｒら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１５：５４０−５５１；及びＶａｉｓｈら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３６：６４５９−６５０１参照）。
ＯＤＮ及びＲＮアーゼＨのランダムな又は半ランダムなライブラリーを利用する、他のインビトロアプローチは、コンピュータシミュレーションより有用であると考えられる（Ｌｉｍａら、前出）。しかし、最近の所見は、ポリヌクレオチドのアニーリング相互作用がＲＮＡ結合タンパク質によって影響されることを示唆しているので、インビトロ合成したＲＮＡの使用はインビボでのアンチセンスＯＤＮのアクセス可能性を予測しない（Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７：９９−１０２；Ｐｏｒｔｍａｎら（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．，１３：２１３−２２１；及びＢｅｒｔｒａｎｄとＲｏｓｓｉ（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．，１３：２９０４−２９１２参照）。この内容が参照によりここに組み込まれる、米国特許第６，５６２，５７０号は、インビボでの状態を模倣する、細胞抽出物の存在下でｍＲＮＡ内のアクセス可能部位を判定するための組成物及び方法を提供する。
簡単に述べると、この方法は、内因性ＲＮＡ結合タンパク質を含有する細胞抽出物を含む、又は１もしくはそれ以上のＲＮＡ結合タンパク質の存在によって細胞抽出物を模倣する反応媒質中でのハイブリダイゼーション条件下で、天然又はインビトロ合成ＲＮＡを、定義されたアンチセンスＯＤＮ、リボザイム又はＤＮＡ酵素と共に、又はランダムな又は半ランダムなＯＤＮ、リボザイム又はＤＮＡ酵素ライブラリーと共にインキュベートすることを含む。標的ＲＮＡ内のアクセス可能部位に相補的ないかなるアンチセンスＯＤＮ、リボザイム又はＤＮＡ酵素も、この部位にハイブリダイズする。定義されたＯＤＮ又はＯＤＮライブラリーを使用するときは、ハイブリダイゼーションが起こったＲＮＡを切断するために、ハイブリダイゼーションの間にＲＮアーゼＨが存在するか又はハイブリダイゼーション後にＲＮアーゼＨを添加する。リボザイム又はＤＮＡ酵素を使用するときは、リボザイム及びＤＮＡ酵素がハイブリダイゼーションの生じたＲＮＡを切断するので、ＲＮアーゼＨは存在し得るが、必要ではない。一部の場合は、内因性ｍＲＮＡ、ＲＮＡ結合タンパク質及びＲＮアーゼＨを含有する細胞抽出物におけるランダムな又は半ランダムなＯＤＮライブラリーを使用する。
次に、様々な方法を使用して、アンチセンスＯＤＮ、リボザイム又はＤＮＡ酵素が結合し、切断が起こった標的ＲＮＡ上の部位を特定することができる。例えばターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ依存性ポリメラーゼ連鎖反応（ＴＤＰＣＲ）がこのために使用し得る（ＫｏｍｕｒａとＲｉｇｇｓ（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２６：１８０７−１１）。逆転写工程を使用してＲＮＡ鋳型をＤＮＡに変換し、続いてＴＤＰＣＲを実施する。本発明では、ＴＤＰＣＲ法のために必要な３’末端を、対象とする標的ＲＮＡを何らかの適切なＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）で逆転写することによって創造する。これは、試験下にある標的ＲＮＡ分子の部分から下流（すなわちＲＮＡ分子の５’→３’方向）の領域において第一ＯＤＮプライマー（Ｐ１）をＲＮＡにハイブリダイズすることによって達成される。ｄＮＴＰの存在下でポリメラーゼは、ＲＮＡをＰ１の３’末端からＤＮＡにコピーし、アンチセンスＯＤＮ／ＲＮアーゼＨ、リボザイム又はＤＮＡ酵素のいずれかによって創造される切断部位でコピーを終結する。新しいＤＮＡ分子（第一鎖ＤＮＡと称する）は、ＴＤＰＣＲ法のＰＣＲ部分のための第一鋳型として働き、これを使用して、ＲＮＡ上に存在する、対応するアクセス可能な標的配列を特定する。
例えば、ＴＤＰＣＲ手順をこの後使用し得る、すなわちグアノシン三リン酸（ｒＧＴＰ）と逆転写したＤＮＡをターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の存在下で反応させて、ＤＮＡ分子の３’末端に（ｒＧ）２−４尾部を付加する。次に、（ｒＧ）２−４尾部と塩基対合する一本鎖に、３’２−４突出部を有する二本鎖ＯＤＮリンカーを連結する。次に２つのＰＣＲプライマーを付加する。最初のプライマーは、（ｒＧ）２−４尾部に連結するＴＤＰＣＲリンカーの鎖（時として低級鎖（ｌｏｗｅｒ ｓｔｒａｎｄ）と称する）に相補的なリンカープライマー（ＬＰ）である。他方のプライマー（Ｐ２）は、Ｐ１と同じであり得るが、Ｐ１に関して入れ子され得る、すなわちＰ１によって結合される領域から少なくとも部分的に上流（すなわちＲＮＡ分子の３’→５’方向）であるが、試験下にある標的ＲＮＡ分子の部分の下流である領域において標的ＲＮＡに相補的である。すなわち、アクセス可能な結合部位を有するかどうかを判定するための試験下にある標的ＲＮＡの部分は、Ｐ２に相補的な領域の上流にある部分である。この後、ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下で公知のようにＰＣＲを実施して、プライマーＬＰ及びＰ２によって規定されるＤＮＡセグメントを増幅する。増幅産物を、次に、様々な公知の方法のいずれかによって捕獲し、続いて自動ＤＮＡシーケンサーで塩基配列決定して、切断部位の正確な特定を提供する。ひとたびこの同一性が決定されれば、規定された配列のアンチセンスＤＮＡ又はリボザイムを、インビトロ又はインビボでの使用のために合成することができる。
特定遺伝子の発現におけるアンチセンス介在は、合成アンチセンスオリゴヌクレオチド配列の使用によって達成できる（例えばＬｅｆｅｂｖｒｅ−ｄ’Ｈｅｌｌｅｎｃｏｕｒｔら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｃｙｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．，６：７；Ａｇｒａｗａｌ（１９９６） ＴＩＢＴＥＣＨ，１４：３７６；及びＬｅｖ−Ｌｅｈｍａｎら（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐ．ＣｏｈｅｎとＳｍｉｃｅｋ編集（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）参照）。簡単に述べると、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、対象とする標的ｍＲＮＡを相補し、ＲＮＡ：ＡＳ二重鎖を形成するように設計されたＤＮＡの短い配列、典型的には１５−３０量体であり得るが、７量体程度に小さくてもよい（Ｗａｇｎｅｒら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３）。この二重鎖形成は、関連ｍＲＮＡのプロセシング、スプライシング、輸送又は翻訳を妨げ得る。さらに、一部のＡＳヌクレオチド配列は、これらの標的ｍＲＮＡとハイブリダイズしたとき細胞ＲＮアーゼＨ活性を惹起することができ、ｍＲＮＡ分解を生じさせる（Ｃａｌａｂｒｅｔｔａら（１９９６） Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２３：７８参照）。この場合、ＲＮアーゼＨは二重鎖のＲＮＡ成分を切断し、潜在的にＡＳを遊離させて、標的ＲＮＡの付加的な分子とさらにハイブリダイズすることができる。付加的な作用機構は、転写的に不活性であると考えられる三重らせんを形成する、ＡＳとゲノムＤＮＡの相互作用から生じる。
上記で論じたようなアンチセンス配列の非限定的な例として、これに加えて又はこれに代わるものとして、リボザイムが遺伝子機能の抑制のために使用できる。これは、アンチセンス療法が化学量論的理由によって制限される場合に特に必要である。同じ配列を標的するリボザイムが使用できる。リボザイムは、標的ＲＮＡ内の特定部位を切断するＲＮＡ触媒能力を有するＲＮＡ分子である。リボザイムによって切断されるＲＮＡ分子の数は、１：１化学量論によって予測される数よりも多い（ＨａｍｐｅｌとＴｒｉｔｚ（１９８９） Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８：４９２９−３３；及びＵｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２８：５９６−６００参照）。従って、本発明はまた、ＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ ｍＲＮＡ種のアクセス可能ドメインを標的し、適切な触媒中心を含むリボザイム配列の使用を可能にする。リボザイムは、当技術分野において公知のように及び以下でさらに論じるように作製され、送達される。リボザイムはアンチセンス配列と組み合わせて使用し得る。
リボザイムはＲＮＡのホスホジエステル結合切断を触媒する。グループＩ型イントロン、ＲＮアーゼＰ、デルタ型肝炎ウイルスリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム及びもともとはタバコリングスポットウイルスサテライトＲＮＡ（ｓＴＲＳＶ）のマイナス鎖に由来するヘアピンリボザイムを含む、いくつかのリボザイム構造ファミリーが特定されている（Ｓｕｌｌｉｖａｎ（１９９４）Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇ．，（Ｓｕｐｐｌ．）１０３：９５Ｓ；及び米国特許第５，２２５，３４７号参照）。後者の２つのファミリーは、リボザイムが、ローリングサークル型複製の間に作られるオリゴマーからモノマーを分離すると考えられている、ウイロイド及びウイルソイドに由来する（Ｓｙｍｏｎｓ （１９８９）ＴＩＢＳ，１４：４４５−５０；Ｓｙｍｏｎｓ（１９９２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１：６４１−７１）。ハンマーヘッド及びヘアピンリボザイムモチーフは、最も一般的には遺伝子治療のためのｍＲＮＡのトランス切断に適合される。本発明において使用するリボザイムの種類は、当技術分野において公知のように選択される。ヘアピンリボザイムは現在臨床試験中であり、特に有用な種類である。一般にリボザイムは３０−１００ヌクレオチドの長さである。
標的ｍＲＮＡ転写産物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子は当技術分野において公知であり（例えばＰＤＧＦ（配列番号１）又はＶＥＧＦ（配列番号３））、ｍＲＮＡの翻訳を妨げるためにも使用できる（例えばＰＣＴ国際公開公報第Ｗ０９０／１１３６４号； Ｓａｒｖｅｒら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１２２２−１２２５及び米国特許第５，０９３，２４６号参照）。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムは特定ｍＲＮＡを破壊するために使用できるが、ハンマーヘッドリボザイムの使用は特に有用である。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する隣接領域によって指定される位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の必要条件は、標的ｍＲＮＡが２個の塩基の以下の配列：５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッドリボザイムの構築と生産は当技術分野において周知であり、ＨａｓｅｌｏｆｆとＧｅｒｌａｃｈ（（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５８５）の中でより詳細に説明されている。
本発明のリボザイムはまた、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）において天然に生じ（ＩＶＳ又はＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡとして知られる）、
Ｔｈｏｍａｓ Ｃｅｃｈと共同研究者達によって広汎に記述されているようなＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以下「チェック（Ｃｅｃｈ）型リボザイム」と称する）を包含する（Ｚａｕｇら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：５７４−５７８；ＺａｕｇとＣｅｃｈ（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３１：４７０−４７５；Ｚａｕｇら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２４：４２９−４３３；国際公開公報第Ｗ０８８／０４３００号；ＢｅｅｎとＣｅｃｈ（１９８６）Ｃｅｌｌ，４７：２０７−２１６参照）。チェック型リボザイムは、標的ＲＮＡの切断を起こった後、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズする、８塩基対活性部位を有する。本発明は、８塩基対活性部位配列を標的するチェック型リボザイムを含む。本発明は特定理論の操作機序に限定されないが、最近の報告は、ハンマーヘッドリボザイムがＲＮＡ翻訳及び／又はｍＲＮＡ標的の特異的切断をブロックすることによって機能することを指示しているので、本発明におけるハンマーヘッドリボザイムの使用は、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦに対するアンチセンスの使用よりも有利であると考えられる。
アンチセンスアプローチにおけるように、リボザイムは修飾オリゴヌクレオチドで構成することができ（例えば改善された安定性、標的性等のため）、標的ｍＲＮＡを発現する細胞に送達される。送達の有用な方法は、トランスフェクトされた細胞が、標的メッセージを破壊して翻訳を阻害するために十分な量のリボザイムを生産するように、強力な構成的ｐｏｌ ＩＩＩ又はｐｏｌ ＩＩプロモーターの制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用することを含む。リボザイムは、アンチセンス分子と異なって、触媒的であるので、効率のためにより低い細胞内濃度を必要とする。
上述したように、必要な場合は、使用方法及び送達のための必要に応じてアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド又はリボザイムの生物活性を実質的に妨げない当技術分野において公知の何らかの方法によって、ヌクレアーゼ抵抗性を与えることができる（Ｉｙｅｒら（１９９０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５５：４６９３−９９；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９８５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５４：３６７−４０２；ＳｐｉｔｚｅｒとＥｃｋｓｔｅｉｎ（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：１１６９１−７０４；Ｗｏｏｌｆら（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：１７６３−６９；及びＳｈａｗら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８： １１６９１−７０４）。アプタマーについて上述したように、ヌクレアーゼ抵抗性を高めるためにアンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムに施すことができる非限定的な代表的修飾は、リン酸骨格内のリン又は酸素へテロ原子、短鎖アルキル又はシクロアルキル糖間結合又は短鎖へテロ原子又はヘテロ環式糖間結合を修飾することを含む。これらは、例えば２’フッ化、Ｏ−メチル化、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート及びモルホリノオリゴマーを調製することを含む。例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムは、４−６個の３’末端ヌクレオチド塩基間にホスホロチオエート結合を有し得る。また、ホスホロチオエート結合は全てのヌクレオチド塩基を連結し得る。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常は、有効な濃度で有意の毒性を示さず、動物において十分な薬力学的半減期を示し（Ａｇａｒｗａｌら（１９９６）ＴＩＢＴＥＣＨ，１４：３７６）、ヌクレアーゼ抵抗性である。またＡＳ−ＯＤＮのためのヌクレアーゼ抵抗性は、ヌクレオチド配列ＣＧＣＧＡＡＧＣＧを有する３’末端の９ヌクレオチドループ形成配列を有することによって提供され得る。アビジン−ビオチン複合反応の使用も、血清ヌクレアーゼ分解に対するＡＳ−ＯＤＮの改善された保護のために使用できる（ＢｏａｄｏとＰａｒｄｒｉｄｇｅ（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，３：５１９−２３参照）。この概念によれば、ＡＳ−ＯＤＮ薬はこれらの３’末端でモノビオチニル化される。アビジンと反応させたとき、これらは、非複合ＯＤＮに比べて６倍改善された安定性を有する緊密なヌクレアーゼ抵抗性複合体を形成する。
他の試験は、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドのインビボでの延長を示した（Ａｇａｒｗａｌら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：７５９５）。おそらく循環からの外来ＡＳ−オリゴヌクレオチドを取り除く排除機構として有用な、この過程は、延長が起こる結合オリゴヌクレオチドにおける遊離３’末端の存在に依存する。従って、この重要な位置の部分的ホスホロチオエート、ループ保護又はビオチン−アビジンは、これらのＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチドの安定性を確実にするために十分なはずである。
上述したような修飾塩基を使用することに加えて、ヌクレオチドの構造が根本的に変化しており、治療又は実験試薬としてより良好に適するヌクレオチドの類似体を製造することができる。ヌクレオチド類似体の一例は、ＤＮＡ（又はＲＮＡ）におけるデオキシリボース（又はリボース）リン酸骨格が、ペプチドで認められるものに類似する、ポリアミド骨格に置き換えられているペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ類似体は、酵素による分解に対して抵抗性であり、インビボ及びインビトロで長い寿命を有することが示された。さらに、ＰＮＡは、相補的ＤＮＡ配列に対してＤＮＡ分子よりも強く結合することが示された。この所見は、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖の間に電荷反発がないことに帰せられる。オリゴヌクレオチドに施すことができる他の修飾は、ポリマー骨格、モルホリノポリマー骨格（例えばこの内容が参照によりここに組み込まれる、米国特許第５，０３４，５０６号参照）、環式骨格又は悲環式骨格、糖ミメティック又はオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善することができる他の何らかの修飾を含む。
本発明のさらなる側面は、例えばＰＤＧＦ又はＶＥＧＦなどの標的ｍＲＮＡの発現を低下させるＤＮＡ酵素の使用に関する。ＤＮＡ酵素は、アンチセンス及びリボザイムテクノロジーの両方の機械論的特徴の一部を組み込んでいる。ＤＮＡ酵素は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと非常に類似して、特定標的核酸配列を認識するが、リボザイムに極めて類似して、触媒的であり、標的核酸を特異的に切断する。
現在２つの基本的なタイプのＤＮＡ酵素が存在し、これらの両方がＳａｎｔｏｒｏとＪｏｙｃｅ（例えば米国特許第６，１１０，４６２号参照）によって特定された。１０−２３ＤＮＡ酵素は、２本の腕をつなぐループ構造を含む。２本の腕は、特定標的核酸を認識することによって特異性を与え、一方ループ構造は、生理的条件下で触媒機能を提供する。
簡単に述べると、標的核酸を特異的に認識し、切断するＤＮＡ酵素を設計するためには、当業者は最初にユニーク標的配列を特定しなければならない。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて概説したのと同じアプローチを用いて実施することができる。一部の場合には、ユニーク又は実質的にユニークな配列は、約１８−２２ヌクレオチドのＧ／Ｃに富む配列である。高いＧ／Ｃ含量は、ＤＮＡ酵素と標的核酸の間のより強力な相互作用を確実にするのを助ける。
ＤＮＡ酵素を合成するとき、この酵素にメッセージを標的する特異的アンチセンス認識配列を、ＤＮＡ酵素の２本の腕を含み、ＤＮＡ酵素ループが２本の特定腕の間に置かれるように分割する。
ＤＮＡ酵素を作製し、投与する方法は、例えば米国特許第６１１０４６２号に見出される。同様に、インビトロ又はインビボでＤＮＡリボザイムを送達する方法は、ここで概説するようなＲＮＡリボザイムを送達する方法を含む。加えて、当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様に、ＤＮＡ酵素が、場合により安定性を改善し、分解に対する抵抗性を高めるように修飾できることを認識する。
ＲＮＡｉアンタゴニスト
本発明の一部の実施態様は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によってＶＥＧＦ及びＰＤＧＦの抑制を実施するための材料及び方法を利用する。ＲＮＡｉは、真核細胞において起こり得る配列特異的転写後遺伝子抑制の過程である。一般に、この過程は、この配列に相同な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘導される特定配列のｍＲＮＡの分解を含む。例えば特定一本鎖ｍＲＮＡ（ｓｓ ｍＲＮＡ）の配列に対応する長いｄｓＲＮＡの発現は、このメッセージを不安定化し、これによって対応する遺伝子の発現に「干渉する」。従って、何らかの選択遺伝子を、この遺伝子についてのｍＲＮＡの全部又は実質的部分に対応するｄｓＲＮＡを導入することによって抑制し得る。長いｄｓＲＮＡが発現されるときは、最初にリボヌクレアーゼＩＩＩによって２１−２２塩基対程度の長さのより短いｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドにプロセシングされると思われる。従って、ＲＮＡｉは、比較的短い相同なｄｓＲＮＡの導入又は発現によって実施され得る。実際に、比較的短い相同ｄｓＲＮＡの使用は、以下で論じるようなある種の利点を有すると考えられる。
哺乳動物細胞は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって影響される少なくとも２つの経路を有する。ＲＮＡｉ（配列特異的）経路では、開始ｄｓＲＮＡを、上述したようにまず短い干渉（ｓｉ）ＲＮＡに分割する。ｓｉＲＮＡは、各々の３’末端に２ヌクレオチドの突出部を備えた約１９ヌクレオチドｓｉＲＮＡを形成する、約２１ヌクレオチドのセンス及びアンチセンス鎖を有する。短い干渉ＲＮＡは、特定メッセンジャーＲＮＡを分解のために標的することを可能にする配列情報を提供すると考えられる。これに対し、非特異的経路は、これが少なくとも約３０塩基対の長さである限り、いかなる配列のｄｓＲＮＡによっても引き金を引かれる。非特異的作用は、ｄｓＲＮＡが２つの酵素：この活性形態で翻訳開始因子ｅＩＦ２をリン酸化して、全てのタンパク質合成を停止させるＰＫＲ（二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ）、及び全てのｍＲＮＡを標的する非特異的酵素、ＲＮアーゼＬを活性化する分子を合成する、２’，５’オリゴアデニレートシンテターゼ（２’，５’−ＡＳ）、を活性化するために起こる。非特異的経路はストレス又はウイルス感染に対する宿主応答であると考えられ、一般に、非特異的経路の作用は、本発明の特に有用な方法では最小限に抑えられる。重要な点として、非特異的経路を誘導するにはより長いｄｓＲＮＡが必要であると思われ、従って、約３０塩基対より短いｄｓＲＮＡは、ＲＮＡｉによる遺伝子抑制を実施するために特に有用である（Ｈｕｎｔｅｒら（１９７５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５０：４０９−１７；Ｍａｎｃｈｅら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２：５２３９−４８；Ｍｉｎｋｓら（１９７９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４：１０１８０−３；及びＥｌｂａｓｈｉｒら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１１： ４９４−８参照）。
ＲＮＡｉを実施するために使用する一部の二本鎖オリゴヌクレオチドは、３０塩基対未満の長さであり、約２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８又は１７塩基対のリボ核酸を含み得る。場合により、本発明のｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは３’突出末端を含み得る。非限定的な例示的２−ヌクレオチド３’突出部はいかなる種類のリボヌクレオチド残基で構成されてもよく、さらには、ＲＮＡ合成のコストを低下させ、細胞培地において及びトランスフェクト細胞内でｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ抵抗性を上昇させ得る、２’−デオキシチミジン残基で構成され得る（Ｅｌｂａｓｈｉら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−８参照）。
５０、７５、１００又はさらに５００塩基対又はそれ以上のより長いｄｓＲＮＡｓも、本発明の一部の実施態様において使用し得る。ＲＮＡｉを実施するためのｄｓＲＮＡの例示的濃度は、約０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１．０ｎＭ、１．５ｎＭ、２５ｎＭ又は１００ｎＭであるが、処理する細胞の性質、遺伝子標的及び当業者には容易に認識できる他の因子に依存して他の濃度も使用し得る。例示的なｄｓＲＮＡは、化学合成し得るか又は適切な発現ベクターを用いてインビトロ又はインビボで生産し得る。例示的な合成ＲＮＡは、当技術分野で公知の方法を用いて（例えばＥｘｐｅｄｉｔｅ ＲＮＡホスホルアミダイト及びチミジンホスホルアミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ））化学合成される２１ヌクレオチドＲＮＡを含む。合成オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の方法を用いて（例えばＥｌｂａｓｈｉｒら（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５：１８８−２００参照）脱保護し、ゲル精製し得る。より長いＲＮＡは、当技術分野で公知の、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどのプロモーターから転写し得る。インビトロプロモーターの下流の可能な両方向に置かれた単一ＲＮＡ標的は、標的の両方の鎖を転写して、所望標的配列のｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドヌクレオチドを生産する。
オリゴヌクレオチドの設計に使用される特定配列は、標的（例えばＰＤＧＦ（例えば配列番号２）又はＶＥＧＦ（例えば配列番号４））の発現される遺伝子メッセージに含まれるヌクレオチドの隣接配列であり得る。適切な標的配列を選択するために、当技術分野で公知のプログラム及びアルゴリズムを使用し得る。加えて、規定された一本鎖核酸配列の二次構造を予測し、折りたたまれたｍＲＮＡの露出一本鎖領域において生じる可能性が高い配列の選択を可能にするように設計されたプログラムを用いて、上記で付加的に述べたように最適配列を選択し得る。適切なオリゴヌクレオチドを設計するための方法及び組成物は、例えばこの内容が参照によりここに組み込まれる、米国特許第６，２５１，５８８号に認められる。ｍＲＮＡは、一般にリボヌクレオチドの配列内にタンパク質合成を指令するための情報を含む線状分子と考えられている。しかし、試験は、大部分のｍＲＮＡには多くの二次及び三次構造が存在することを明らかにした。ＲＮＡにおける二次構造エレメントは、主として、同じＲＮＡ分子の異なる領域の間のワトソン−クリック型相互作用によって形成される。重要な二次構造エレメントは、分子内二本鎖領域、ヘアピンループ、二重鎖ＲＮＡのバルジ及び内部ループを含む。三次構造エレメントは、二次構造エレメントが互いに又は一本鎖領域と接触してより複雑な三次元構造を生じるときに形成される。多くの研究者が、数多くのＲＮＡ二重鎖構造の結合エネルギーを測定し、ＲＮＡの二次構造を予測するために使用できる一組の規則を導き出した（例えばＪａｅｇｅｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：７７０６（１９８９）；及びＴｕｒｎｅｒら（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，１７：１６７参照）。前記規則は、ＲＮＡ構造エレメントの特定において、特に、沈黙化ＲＮＡｉ、リボザイム又はアンチセンステクノロジーのために標的するｍＲＮＡの特に有用なセグメントであり得る、一本鎖ＲＮＡ領域を特定する上で有用である。従って、ＲＮＡｉを仲介するｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計のため並びに本発明の適切なリボザイム及びハンマーヘッドリボザイム組成物の設計のために、ｍＲＮＡ標的の特定セグメントを特定することができる。
ｄｓオリゴヌクレオチドは、リポソーム、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）などの、当技術分野において公知の担体組成物を用いて、接着細胞系に関して前記製造者によって記述されているように異種標的遺伝子でのトランスフェクションによって細胞に導入し得る。内因性遺伝子を標的するためのｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドのトランスフェクションは、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施し得る。トランスフェクション効率は、ｐＡＤ３をコードするｈＧＦＰのコトランスフェクション後に哺乳動物細胞系に関して蛍光顕微鏡を用いて確認し得る（Ｋｅｈｌｅｎｂａｃｋら（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４１：８６３−７４）。ＲＮＡｉの有効性は、ｄｓＲＮＡの導入後、多くのアッセイのいずれかによって評価し得る。これらは、新しいタンパク質合成が抑制された後の内因性プールの代謝回転のために十分な時間をおいた後、標的遺伝子産物を認識する抗体を用いるウエスタンブロット分析、及び存在する標的ｍＲＮＡのレベルを測定するためのノーザンブロット分析を含むが、これらに限定されない。
本発明における使用のためのＲＮＡｉテクノロジーのさらなる組成物、方法及び適用は、参照によりここに組み込まれる、米国特許第６，２７８，０３９号、同第５，７２３，７５０号及び同第５，２４４，８０５号に示されている。
受容体チロシンキナーゼ阻害剤アンタゴニスト
当技術分野において公知のチロシンキナーゼアンタゴニスト及び当技術分野の常用技術及び参照によりここに組み込まれる当技術分野の教示を用いて入手し得るこの変異体及び代替物も本発明に包含される。ＰＤＧＦ（及びＶＥＧＦ）の細胞外シグナルは、ＰＤＧＦ受容体（及びＶＥＧＦ受容体）によって実施され、細胞膜結合シグナル伝達複合体の下流の基質タンパク質に影響を及ぼす、チロシンキナーゼを介したリン酸化事象によって細胞の他の部分と連絡している。従って、ＰＤＧＦ（及び／又はＶＥＧＦ）シグナル伝達の受容体キナーゼ段階で働くアンタゴニストも、本発明の方法において有効である。
ＰＤＧＦＲ又はＶＥＧＦＲなどのチロシンキナーゼ受容体酵素に対して選択的な多くの種類のチロシンキナーゼ阻害剤が公知である（ＳｐａｄａとＭｙｅｒｓ（（１９９５）Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，５：８０５）及びＢｒｉｄｇｅｓ（（１９９５） Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，５：１２４５）。加えて、ＬａｗとＬｙｄｏｎは、チロシンキナーゼ阻害剤の潜在的抗癌作用を要約した（（１９９６）Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｄｒｕｇｓ： Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔ Ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，２４１−２６０）。例えば米国特許第６，５２８，５２６号は、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）チロシンキナーゼ活性の選択的阻害を示す置換キノキサリン化合物を述べている。ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ活性の公知の阻害剤は、Ｍａｇｕｉｒｅら（（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７：２１２９）及びＤｏｌｌｅら（（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７：２６２７）によって報告されたキノリンベースの阻害剤を含む。フェニルアミノ−ピリミジンベースの阻害剤のクラスが、最近、欧州特許第５６４４０９号の中でＴｒａｘｌｅｒらによって、及びＺｉｍｍｅｒｍａｎら（（１９９６）Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，６：１２２１−１２２６）によって、及びＢｕｃｈｄｕｎｇｅｒら（（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９２：２５５８）によって報告された。ＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼ活性を阻害する上で有用なキナゾリン誘導体は、ビスモノ及び二環式アリール化合物及びヘテロアリール化合物（例えば国際公開公報第ＷＯ９２／２０６４２号参照）、キノキサリン誘導体（（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５４：６１０６−６１１４参照）、ピリミジン誘導体（日本特許出願公開第８７８３４／９４号）及びジメトキシキノリン誘導体（Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ １１６ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｊａｐａｎ（Ｋａｎａｚａｗａ）（１９９６），２，ｐ．２７５，２９（Ｃ２）１５−２参照）を含む。
ＶＥＧＦチロシンキナーゼ阻害剤の例は、シンノリン誘導体、例えばこの内容全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第６，５１４，９７１号に述べられているものを含む。他のこのようなシンノリン誘導体も公知である。例えば（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．，３８：３４８２−７は、４−（３−ブロモアニリノ）シンノリンを開示している；（１９６８）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃ，（９）：１１５２−５は、６−クロロ−４−フェノキシシンノリンを開示している；（１９８４）Ｊ．Ｋａｒｎａｔａｋ Ｕｎｉｖ．，Ｓｃｉ．，２９：８２−６は、ある種の４−アニリノシンノリンを開示している；及び（１９７３）Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．，１１：２１１−１３は、ある種の４−フェニルチオシンノリンを開示している。さらに、（１９７３）Ｊ．Ｋａｒｎａｔａｋ Ｕｎｉｖ．，１８： ２５−３０は、ある種の４−フェノキシシンノリンを開示し、（１９８４）Ｊ．Ｋａｒｎａｔａｋ Ｕｎｉｖ．，Ｓｃｉ．，２９：８２−６は、２つの化合物：４−（４−メトキシアニリノ）−６，７−ジメトキシシンノリン及び４−（３−クロロアニリノ）−６，７−ジメトキシシンノリンを開示している。さらに、４位で−−Ｏ−−、−−Ｓ−−、−−ＮＨ−−及び−−ＣＨ２−−から選択される基によって連結されたフェニル環を有するある種のシンノリンが、米国特許第５，０１７，５７９号、米国特許第４，９５７，９２５号、米国特許第４，９９４，４７４号、及び欧州特許第ＥＰ ０３０２７９３ Ａ２号に述べられている。
ＶＥＧＦＲ及び／又はＰＤＧＦＲの阻害のためのさらなる他の関連化合物は、新規化合物を、従来のアッセイを用いて対象とする受容体チロシンキナーゼ活性へのこれらの作用に関してスクリーニングすることによって入手可能である。候補ＰＤＧＦＲ又はＶＥＧＦＲ低分子有機阻害剤による有効な阻害は、細胞ベースのアッセイ系並びに当技術分野において公知の他のアッセイ系を用いて観測することができる。
例えばＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼに対する活性についての１つの試験は以下の通りである。試験は、Ｆｌｔ−１ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼを用いて実施する。詳細な手順は次の通りである：２０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７．５、３ｍＭ二塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、３ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、１０ｕＭバナジン酸ナトリウム、０．２５ｍｇ／ｍｌポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２００００、１ｍＭジチオトレイトール及び３ｕｇ／．ｍｕ．ｌポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）４：１（Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中のキナーゼ溶液３０μｌ（Ｆｌｔ−１のキナーゼドメイン１０ｎｇ（Ｓｈｉｂｕｙａら（１９９０）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，５：５１９−２４参照）、８ｕＭ［３３Ｐ］−ＡＴＰ（０．２μＣｉ）、１％ジメチルスルホキシド及び試験する化合物０−１００μＭを一緒に室温で１０分間インキュベートする。次に０．２５Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ｐＨ７ １０μｌを添加して反応を終了させる。多チャンネルディスペンサー（ＬＡＢ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＵＳＡ）を使用して、２０μｌのアリコートをＰＶＤＦ（＝ポリ二フッ化ビニル）Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）に適用し、マイクロタイターフィルター多岐管を通して、真空に接続する。液体を完全に除去した後、０．５％リン酸（Ｈ３ＰＯ４）を含む浴中で連続４回及びエタノールで１回洗浄して、毎回１０分間振とうしながらインキュベートし、この後Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔ Ｍａｎｉｆｏｌｄにのせて、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ．ＲＴＭ．（βシンチレーションカウンター液）１０μｌの添加後に放射能を測定する。３つの濃度（一般に０．０１μｍｏｌ、０．１μｍｏｌ及び１μｍｏｌ）の各化合物の阻害に関するパーセンテージの線形回帰分析によってＩＣ５０値を決定する。活性チロシン阻害剤化合物のＩＣ５０値は、０．０１μＭから１００μＭの範囲内であり得る。
さらに、ＶＥＧＦ誘導性ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ／自己リン酸化活性の阻害を、細胞に関するさらなる実験で確認することができる。簡単に述べると、ヒトＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ／ＫＤＲ）を恒久的に発現するトランスフェクトＣＨＯ細胞を、６穴細微培養プレート中の完全培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加）に接種し、約８０％の集密度を示すまで３７℃、５％ＣＯ２の下でインキュベートする。試験する化合物を培地（ＦＣＳなし、０．１％ウシ血清アルブミン添加）に希釈し、細胞に添加する（対照は、試験化合物なしの培地を含む）。３７℃で２時間のインキュベーション後、組換えＶＥＧＦを加える；最終ＶＥＧＦ濃度は２０ｎｇ／ｍｌである。３７℃でさらに５分間インキュベートした後、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗い、直ちに溶解緩衝液１００μｌ／穴に溶解する。次に溶解産物を遠心分離して細胞核を除去し、市販のタンパク質アッセイ（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて上清のタンパク質濃度を測定する。この後、溶解産物を直ちに使用するか又は、必要に応じて、−２００℃で保存することができる。
次にＫＤＲ受容体のリン酸化を測定するためにサンドイッチＥＬＩＳＡを実施する：ＫＤＲに対するモノクローナル抗体を黒色ＥＬＩＳＡプレート（ＯｐｔｉＰｌａｔｅ（商標）、ＰａｃｋａｒｄからのＨＴＲＦ−９６）に固定する。プレートを洗って、残りの遊離タンパク質結合部位をＰＢＳ中１％ＢＳＡで飽和する。次に細胞溶解産物（タンパク質２０μｇ／ウエル）を、アルカリホスファターゼ（例えばＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹからのＰＹ２０：ＡＰ）と結合した抗ホスホチロシン抗体と共に、これらのプレートにおいて４℃で一晩インキュベートする。再びプレートを洗い、次に捕獲したリン酸化受容体への抗ホスホチロシン抗体の結合を、発光ＡＰ基質（Ｅｍｅｒａｌｄ ＩＩと共に即時使用のＣＤＰ−Ｓｔａｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴＲＯＰＩＸ Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて明らかにする。発光は、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒで測定する。陽性対照（ＶＥＧＦ又はＰＤＧＦで刺激した）のシグナルと陰性対照（ＶＥＧＦ又はＰＤＧＦで刺激せず）のシグナルの間の差は、ＶＥＧＦ誘導性ＫＤＲ受容体リン酸化（＝１００％）に対応する。試験物質の活性を、ＶＥＧＦ誘導性ＫＤＲ受容体リン酸化の阻害％として算定し、最大阻害の２分の１を誘導する物質の濃度をＥＤ５０（５０％阻害のための有効用量）と定義する。活性チロシン阻害剤化合物は、０．００１μＭ−６μＭ、典型的には０．００５μＭ−０．５μＭの範囲内のＥＤ５０値を有する。
（医薬製剤及び治療投与）
抗ＶＥＧＦ及び抗ＰＤＧＦ薬は、乾癬、慢性関節リウマチ及び眼血管新生疾患を含む、血管新生疾患の治療において有用である。特に重要であるのは、黄斑変性又は糖尿病性網膜症などの眼血管新生疾患を抑制するための、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストと組み合わせてＰＤＧＦ−Ｂアンタゴニスト化合物を使用する療法である。従って、ひとたび患者が血管新生疾患を有する又は発症する危険度が高いと診断されれば、それぞれＰＤＧＦ及びＶＥＧＦのマイナス作用をブロックするためにＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせたＰＤＧＦアンタゴニストの投与によって患者を治療し、これによって血管新生疾患の発症を抑制して、血管新生に関連する有害作用を軽減する。本発明に従った方法の実施は角膜浮腫を生じさせない。上記で論じたように、様々なＰＤＧＦ及びＶＥＧＦアンタゴニストが本発明において使用し得る。
本発明に従った抗ＰＤＧＦ及び抗ＶＥＧＦ併用療法は、単独で又は別の治療と組み合わせて使用でき、在宅で、医師の診察室、診療所、病院の外来科又は病院で提供され得る。治療は一般に、医師が治療効果を詳細に観察し、必要に応じて調整を行うことができるように病院で開始される。併用療法の期間は、治療する血管新生疾患の種類、患者の年齢及び状態、患者の疾患の病期及び種類、及び患者がどのように治療に応答するかに依存する。加えて、血管新生疾患を発症する危険度が大きい人（例えば糖尿病患者）は、症状の発現を阻止する又は遅延させるために治療を受けてもよい。本発明によって提供される１つの重要な利点は、血管新生疾患の治療のためのＰＤＧＦアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストの併用は、各々のアンタゴニストの低用量及びより少ない総活性アンタゴニストの投与を可能にし、従って、より低い毒性と副作用での同様の効果及びコストの低減を提供することである。
併用療法の各々のアンタゴニストの投与は、他方のアンタゴニストと合わせて、血管新生疾患の治療のために有効なアンタゴニスト濃度を生じさせる何らかの適切な手段によって実施し得る。各々のアンタゴニストは、例えば適切な担体物質と混合してもよく、一般に組成物の総重量の１−９５重量％の量で存在する。組成物は、眼、経口、非経口（例えば静脈内、筋肉内、皮下）、直腸、経皮、鼻、又は吸入投与に適する投与形態で提供され得る。従って、組成物は、例えば錠剤、カプセル、丸剤、粉末、顆粒、懸濁液、乳剤、溶液、ヒドロゲルを含むゲル、ペースト、軟膏、クリーム、硬膏、供給送達装置、坐薬、浣腸、注射剤、移植片、スプレー又はエーロゾルの形態であり得る。単一アンタゴニスト又は２もしくはそれ以上のアンタゴニストを含有する医薬組成物は、従来の製薬慣例に従って製剤し得る（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，（第２０版）Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集、２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．及びＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．ＳｗａｒｂｒｉｃｋとＪ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ編集、１９８８−２００２，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。
ＰＤＧＦとＶＥＧＦアンタゴニストの組合せを、１つの有用な側面では、非経口的に（例えば筋肉内、腹腔内、静脈内、眼内、硝子体内、眼球後、結膜下、トノン嚢下又は皮下注射又は移植によって）又は全身的に投与する。非経口的又は全身投与のための製剤は、無菌水性又は非水性溶液、懸濁液又は乳剤を含む。様々な水性担体、例えば水、緩衝水、食塩水等、が使用できる。他の適切な賦形剤の例は、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、ゼラチン、ヒドロゲル、水素化ナフタレン、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルを含む。このような製剤はまた、防腐剤、湿潤剤、緩衝剤、乳化剤及び／又は分散剤などの補助物質を含み得る。生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは、有効成分の放出を制御するために使用し得る。
また、ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦアンタゴニストの組合せは経口摂取によって投与することができる。経口使用を意図する組成物は、医薬組成物の製造のための当技術分野で公知の何らかの方法に従って、固体又は液体形態で製造することができる。
経口投与のための固体投与形態は、カプセル、錠剤、丸剤、粉末及び顆粒を含む。一般に、これらの医薬製剤は、非毒性の医薬的に許容される賦形剤と混合した有効成分（ＰＤＧＦ有機低分子アンタゴニスト及びＶＥＧＦ有機低分子アンタゴニストなど）を含有する。これらは、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、セルロース、デンプン、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム、カオリン等のような不活性希釈剤を含み得る。結合剤、緩衝剤及び／又は潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム）も使用し得る。錠剤及び丸剤は、付加的に腸溶剤皮と共に製剤することができる。組成物は、場合によって、より口当たりのよい製剤を提供するために甘味料、香味料、着色料、香料及び防腐剤を含み得る。
例えばＰＤＧＦ及びＶＥＧＦアンタゴニストは、眼への硝子体内注射並びに結膜下及びトノン嚢下注射によって眼内投与し得る。他の投与経路は、経強膜、眼球後、腹腔内、筋肉内及び静脈内を含む。また、薬剤送達装置又は眼内移植（以下参照）を用いてアンタゴニストの組合せを送達し得る。
経口投与のための液体投与形態は、医薬的に許容される乳剤、溶液、懸濁液、シロップ及び軟ゼラチンカプセルを含む。これらの形態は、水及び油性媒質などの当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含み、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤などの佐剤を含有し得る。
一部の場合には、ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦアンタゴニストの組合せはまた、例えばパッチによって、又は血管新生疾患に罹患しやすい又は罹患している、表皮又は眼などの領域への直接適用によって、又はイオン導入によって、局所的に投与することができる。
眼用途のための製剤は、非毒性の医薬的に許容される賦形剤と混合した有効成分を含有する錠剤を含む。これらの賦形剤は、例えば不活性希釈剤又は充填剤（例えばスクロース及びソルビトール）、潤滑剤、流動促進剤及び接着防止剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油又は滑石）であり得る。
ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦアンタゴニストは、錠剤又は他の賦形剤中で一緒に混合し得るか、又は分配し得る。一例では、第一アンタゴニストは錠剤の内側に含まれ、第二アンタゴニストは、第一アンタゴニストの放出の前に第二アンタゴニストの実質的な部分が放出されるように外側に存在する。所望する場合は、薬剤送達装置（以下参照）を使用して錠剤形態のアンタゴニストを送達し得る。
一般に、各々のアンタゴニストを、血管新生疾患の有害作用又は症状を抑制する、軽減する又は排除するのに十分な量で投与すべきである。単一投与製剤を生産するために担体物質と組み合わせる活性アンタゴニスト成分の量は、治療する被験者及び個々の投与様式に依存して異なる。
特許請求する組合せの各々のアンタゴニストの用量は、状態の重症度、状態を治療するか又は予防するか、及び治療する人の年齢、体重及び健康状態を含む、いくつかの因子に依存する。加えて、個々の患者についての薬理ゲノム学（治療薬の薬物動態、薬力学又は効果プロフィールへの遺伝子型の影響）情報が、使用する用量に影響を及ぼし得る。さらに、当業者は、正確な個々の用量は、投与するＰＤＧＦ及びＶＥＧＦアンタゴニストの特定の組合せ、投与時間、投与経路、製剤の性質、排出経路、治療する特定の血管新生疾患、疾患の重症度、及び血管新生疾患の解剖学的位置（例えば眼対体腔）を含む、様々な因子に依存して幾分調整され得ることを認識する。様々な投与経路の異なる効率を考慮して、必要用量の幅広い変動を予測すべきである。例えば経口投与は、一般に静脈内又は硝子体内注射による投与よりも高い用量レベルを必要とすると予想される。これらの用量レベルの変動は、当技術分野において周知である、最適化のための標準的な経験的常用手順を用いて調整することができる。正確な治療有効用量レベル及びパターンは、典型的には、上記で特定した因子を考慮して眼科医などの主治医によって決定される。
一般に、ヒトに経口投与するとき、ＰＤＧＦアンタゴニスト又はＶＥＧＦアンタゴニストの用量は、通常約０．００１ｍｇ−約２００ｍｇ／日、望ましくは約１ｍｇ−１００ｍｇ／日、より望ましくは約５ｍｇ−約５０ｍｇ／日である。約２００ｍｇ／日までの用量が必要なことがある。注射によるＰＤＧＦアンタゴニスト又はＶＥＧＦアンタゴニストの投与については、用量は、通常約０．１ｍｇ−約２５０ｍｇ／日、望ましくは約１ｍｇ−約２０ｍｇ／日、又は約３ｍｇ−約５ｍｇ／日である。注射は１日約４回まで実施し得る。一般に、ヒトに非経口的に又は全身的に投与するとき、ＰＤＧＦアンタゴニストと組み合わせた使用のためのＶＥＧＦアンタゴニストの用量は、通常約０．１ｍｇ−約１５００ｍｇ／日、又は約０．５ｍｇ−約１０ｍｇ／日、又は約０．５ｍｇ−約５ｍｇ／日である。約３０００ｍｇ／日までの用量が必要であり得る。
ヒトに眼科的に投与するとき、ＰＤＧＦアンタゴニストと組み合わせた使用のためのＶＥＧＦアンタゴニストの用量は、通常約０．１５ｍｇ−約３．０ｍｇ／日、又は約０．３ｍｇ−約３．０ｍｇ／日、又は約０．１ｍｇ−約１．０ｍｇ／日である。
例えば眼用途のためには、ＰＤＧＦ−Ｂ及びＶＥＧＦ−Ａアプタマー薬剤物質をｐＨ５−７のリン酸緩衝食塩水に製剤する。ｐＨ調整のために水酸化ナトリウム又は塩酸を添加してもよい。１つの作業製剤（ＷＯＲＫＩＮＧ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮ）では、ＰＤＧＦ−Ｂアプタマー及びＥＹＥ００１などのＶＥＧＦ−Ａアプタマーを個々に３つの異なる濃度：３ｍｇ／１００μｌ、２ｍｇ／１００μｌ及び１ｍｇ／１００μｌで製剤し、滅菌２７ゲージ針を取り付けた滅菌１ｍｌ、ＵＳＰＩ型目盛り付きガラス製注射器に充填する。併用薬剤製品は防腐剤不含であり、硝子体内注射のみによる単回使用を意図する。有効成分は、３０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ及び１０ｍｇ／ｍｌ濃度のＰＤＧＦ−Ｂ及びＶＥＧＦ−Ａ薬剤物質である。賦形剤は、塩化ナトリウム、ＵＳＰ；一塩基リン酸ナトリウム、一水和物、ＵＳＰ；二塩基リン酸ナトリウム、七水和物、ＵＳＰ；水酸化ナトリウム、ＵＳＰ；塩酸、ＵＳＰ；及び注射用蒸留水、ＵＳＰである。この形態では、ＰＤＧＦ−Ｂ及びＶＥＧＦ−Ａアプタマー薬剤製品は、単回使用ガラス製注射器内で提供される即時使用無菌溶液中に存在する。注射器は、溶液が室温に達するように使用の少なくとも３０分前（但し４時間以内）に冷蔵保存から取り出す。注射器内容物の投与は、ねじ付きプランジャーロッドを注射器の円筒内部のゴム栓に取り付けることを含む。製品が投与できるようにゴム製先端キャップを取り外す。ＰＤＧＦ−Ｂ及びＶＥＧＦ−Ａアプタマーを、２８日間隔で３回、１００μｌ硝子体内注射として投与する。患者は、来院ごとに３ｍｇ／注射を摂取する。必要に応じて用量を２ｍｇ又は１ｍｇに、さらに０．１ｍｇまで低減する。
投与する薬剤の詳細な量は、成分の特定の組合せに依存する。所望用量の組合せでは、ＰＤＧＦアンタゴニスト対ＶＥＧＦアンタゴニストの比率は、重量比で約５０：１、重量比で約２０：１、重量比で約１０：１、又は重量比で約４：１、約２：１又は約１：１である。
有用な併用療法は、ＰＤＧＦ−Ｂアプタマーアンタゴニスト及びＶＥＧＦ−Ａアプタマーアンタゴニストを含む。アンタゴニストは、約０．１：約５．０から約５．０：０．１のＰＤＧＦ−Ｂアプタマーアンタゴニスト対ＶＥＧＦ−Ａアプタマーアンタゴニストの重量比範囲内で組み合わせて使用する。これらの２つのアンタゴニスト（ＰＤＧＦ−Ｂ対ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト）の有用な範囲は約０．５：約２．０、又は約２．０：０．５であるが、もう１つの有用な比率は約１．０：約１．０であり、最終的にはＰＤＧＦ−Ｂアプタマーアンタゴニスト及びＶＥＧＦ−Ａアプタマーアンタゴニストの選択に依存する。
併用療法における各々の薬剤の投与は、独立して、１日１−４回を１日から１年間であり得、さらには患者の寿命の間であり得る。多くの症例では慢性の長期的投与が指示される。用量は、単回用量として又は多回用量に分けて投与し得る。一般に、所望用量を定められた間隔で長期間にわたって、通常は少なくとも数週間以上投与すべきであるが、数ヶ月又はそれ以上の長い投与期間が必要なこともある。
既存の血管新生疾患を治療することに加えて、ＰＤＧＦアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストを含む併用療法は、これらの疾患の発症を予防する又は遅らせるために予防的に投与することができる。予防適用では、特定血管新生疾患に感受性である又はさもなければ危険度が高い患者にＰＤＧＦ及びＶＥＧＦアンタゴニストを投与する。やはり、投与の正確な時期及び投与する量は、患者の健康状態、体重等のような様々な因子に依存する。
１つの実動例では、ＰＤＧＦアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストの組合せを、典型的には注射用医薬組成物の形態で、これによる治療を必要とする哺乳動物に投与する。併用側面では、例えばＰＤＧＦ−ＢアプタマーとＶＥＧＦ−Ａアプタマーを別々に又は両方を含有する医薬組成物中で投与し得る。一般に、このような投与は、注射によるか又は薬剤送達装置を用いることが好ましい。非経口、全身又は経皮投与も許容される。
上記で論じたように、ＰＤＧＦアンタゴニスト及びＶＥＧＦアンタゴニストを一緒に投与するとき、このような投与は、時間的に連続するか又は同時であり得、連続的方法は１つの投与様式である。ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦアンタゴニストを連続的に投与するとき、各々の投与は同じか又は異なる方法であり得る。連続投与のためには、しかしながら、約５秒間でのＰＤＧＦアンタゴニストの投与（約３回までの注射）及びこれに続く、６週間ごとに年間約９回までの注射によるＶＥＧＦアンタゴニストの持続的投与を用いることが有用である。ＰＤＧＦアンタゴニストは、医師によって決定されるように、各々のＶＥＧＦアンタゴニスト注射のときに投与するか又はより少ない頻度で投与し得る。連続的投与はまた、個々のアンタゴニストを異なる時点で又は異なる投与経路で又はこの両方で投与し得るが、但し併用によって有益な作用を提供する、例えば血管新生疾患を抑制するように働く組合せを含む。また、注射による投与は特に有用であることが認められる。
本発明に従った医薬組成物は、制御放出製剤を使用して、実質的に投与直後に又は投与後あらかじめ定められた時間に活性ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦアンタゴニストを放出するように製剤し得る。例えばＰＤＧＦアンタゴニスト及びＶＥＧＦアンタゴニストの少なくとも１つを含有する医薬組成物は、持続放出性組成物として提供され得る。即時又は持続放出性組成物の使用は、治療する状態の性質に依存する。前記状態が急性又は超急性疾患から成る場合は、典型的には持続放出性組成物よりも即時放出形態による治療が使用される。一部の予防的又は長期的治療のためには、持続放出性組成物も適切であり得る。
制御放出性組成物における各々のアンタゴニストの投与は、アンタゴニストが、単独で又は組合せとして、（ｉ）狭い治療指数（例えば有害副作用又は毒性反応を導く血漿濃度と治療効果を導く血漿濃度の差が小さい）；一般に、治療指数ＴＩは、中央致死量（ＬＤ５０）対中央有効量（ＥＤ５０）の比と定義される；（ｉｉ）胃腸管における狭い吸収ウインドウ；又は（ｉｉｉ）血漿濃度を治療レベルに維持するために１日の間に頻繁な投与を必要とするような、短い生物学的半減期を有する。
放出速度が治療アンタゴニストの分解又は代謝の速度を上回る制御放出を得るために、多くの戦略が利用できる。例えば制御放出は、例えば適切な制御放出性組成物及び被覆物を含む、製剤パラメータ及び成分の適切な選択によって得られる。この例は、単一又は多数単位錠剤又はカプセル組成物、油性溶液、懸濁液、乳剤、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ナノ粒子、パッチ及びリポソームを含む。このような持続又は制御放出製剤を製造するための方法は、当技術分野において周知である。
ＰＤＧＦアンタゴニスト及び／又はＶＥＧＦアンタゴニスト又はこの両方を含有する医薬組成物はまた、移植片などの薬剤送達装置を用いて送達し得る。このような移植片は、生分解性及び／又は生体適合性移植片であるか、又は非生分解性移植片であり得る。移植片は、活性物質に対して透過性又は不透過性であり得る。眼薬剤送達装置は、前眼房又は後眼房などの眼房に挿入し得るか、又は強膜、脈絡膜腔又は硝子体の外側の無血管領域に移植し得る。１つの実施態様では、移植片を、薬剤が所望治療部位、例えば眼内腔及び眼の黄斑へと経強膜拡散するように、強膜上などの無血管領域に位置づけ得る。さらに、経強膜拡散の部位は、黄斑に近位の部位などの新生血管形成部位の近くであり得る。
上述したように、本発明は、別々の医薬組成物を医薬パックにおいて組み合わせることに関する。本発明の組合せは、従って、医薬パックの成分として提供される。少なくとも２つのアンタゴニストを一緒に又は別々に、個々の投与量で製剤することができる。本発明のアンタゴニストはまた、塩として製剤するときにも有用である。
医薬パックは、一般に、（１）第一単位投与形態中に、一定量のＰＤＧＦアンタゴニスト及び医薬的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤；（２）第二単位投与形態中に、一定量のＶＥＧＦアンタゴニスト及び医薬的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤；及び（３）容器を含む。容器は成分を分離するために使用され、例えば分割ボトル又は分割ホイルパケットを含み得る。別々のアンタゴニスト組成物を、所望する場合は、単一の非分割容器内に含めてもよい。医薬パックはまた、別々のＰＤＧＦ及びＶＥＧＦアンタゴニストの投与のための指示を含み得る。医薬パックは、別々の成分を異なる投与形態で投与するとき、異なる投与レベルで投与するとき、又は処方する医師が組合せの個々の成分の滴定を所望するとき、特に好都合である。１つの実施態様では、医薬パックを、ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦアンタゴニストを意図する使用順序で一つずつ配薬するように設計する。もう１つの例では、パック内に並んで配置されたＰＤＧＦアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストの列を含むように医薬パックを設計し、１対のアンタゴニストを投与しなければならないことを使用者に伝える指示書をパック上に添付する。例示的な医薬パックは、医薬包装産業において周知の、いわゆるブリスターパックである。
（有効性）
血管新生疾患の抑制は、血管新生が緩慢化又は減少しているかどうかを測定する何らかの許容される方法によって評価される。これは、直接観察及び主観的症状又は客観的生理的指標を評価することなどの間接評価を含む。治療効果は、例えば新生血管形成の予防又は逆転、細小血管症、血管漏出又は血管浮腫又はこれらの何らかの組合せに基づいて評価し得る。眼血管新生疾患の抑制を評価するための治療効果はまた、視力の安定化又は改善の見地から定義され得る。
眼血管新生疾患を治療する又は予防する上での特定併用療法の有効性を判定する場合、注射の数日後及び少なくとも１ヵ月後に次の注射の直前に眼科医が患者を臨床的に評価してもよい。ＥＴＤＲＳ視力、コダクローム写真撮影及び蛍光眼底血管造影も、眼科医に要請に応じて最初の４ヶ月間毎月１回実施される。
例えば眼血管新生を治療するためのＰＤＧＦアンタゴニスト及びＶＥＧＦアンタゴニスト併用療法の有効性を評価するために、眼科分野において周知の標準方法に従って、加齢性黄斑変性に続発する眼窩下脈絡膜血管新生に罹患している患者におけるＶＥＧＦ−Ａアプタマー（例えばペグ化形態のＥＹＥ００１）と組み合わせたＰＤＧＦ−Ｂアプタマーの単回又は多回硝子体内注射の投与を含む試験を実施する。１つの作業試験では、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）に続発する眼窩下脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を有する患者に、ＰＤＧＦ−ＢアプタマーとＶＥＧＦ−Ａアプタマーの単回硝子体内注射を実施する。組合せの有効性を、例えば眼評価によって観測する。治療の３ヵ月後に安定な又は改善した視力を示す、例えばＥＤＴＲＳチャートで３ライン又はそれ以上の視力改善を示す患者は、眼血管新生疾患を抑制するＰＤＧＦ−Ｂアプタマー及びＶＥＧＦ−Ａアプタマーの有効用量の組合せを摂取したとみなされる。
作業試験例では、加齢性黄斑変性に続発する眼窩下ＣＮＶを有し、ＥＴＤＲＳチャートで２０／２００より劣悪な視力を有する患者に、ＰＤＧＦ−ＢアプタマーとＶＥＧＦ−Ａアプタマーの単回硝子体内注射を実施する。開始用量は各々のアンタゴニスト０．２５ｍｇで、これらを硝子体内に１回注射する。各々のアンタゴニスト０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ及び３ｍｇの用量も試験する。眼底写真撮影及び蛍光眼底血管造影を含む完全な眼検査も実施する。併用薬剤製品は、プラスチック製プランジャーに取り付けられた被覆栓及びあらかじめ取り付けられた２７ゲージ針上のゴム製先端キャップを伴う、無菌・発熱物質不含１ｃｃガラス製注射器円筒中の、１０ｍＭリン酸ナトリウム及び０．９％塩化ナトリウムに溶解したＰＤＧＦ−Ｂアプタマー及びＶＥＧＦ−Ａアプタマーから成る即時使用無菌溶液である。ＰＤＧＦ−Ｂアプタマー及びＶＥＧＦ−Ａアプタマーは、１００μｌの送達容量を与えるために、各々のアプタマーについて（オリゴヌクレオチド含量として表わした）１ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ又は３０ｍｇ／ｍｌの薬剤濃度で供給される。ＰＤＧＦ−Ｂアプタマー及びＶＥＧＦ−Ａアプタマーの注射の約３ヶ月後に、治療の有効性を評価するために視力試験を実施する。治療後に安定な又は改善した視力を示す患者、例えばＥＤＴＲＳチャートで３ライン又はそれ以上の視力上昇を示す患者は、眼血管新生疾患を抑制するＰＤＧＦ−Ｂアプタマー及びＶＥＧＦ−Ａアプタマーの有効用量の組合せを摂取したとみなされる。
（実施例）
以下の実施例は、本発明の一部の製造及び実施方法を例示するが、同様の結果を得るために代替的な方法を使用し得るので、本発明の範囲を限定することを意図しない。
角膜血管新生（角膜ＮＶ）
角膜血管新生は、眼における異常血管増殖を明瞭に視覚化することを可能にする、広く使用される動物モデルである。正常な無血管角膜へと成長する血管は良好に確認できるようになり、これを、血管後退を検討するための魅力的なモデルにしている。実験的角膜ＮＶを誘導するために、雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１８−２０ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を筋肉内塩酸ケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。ＮａＯＨ（０．２ｍＭ、２μｌ）を局所適用した。Ｎｏ．２１の刃（Ｆｅａｔｈｅｒ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を使用して角膜縁に平行な回転運動を適用することによって角膜及び縁上皮を切除した。７日後、マウスを、約２５ｍｇ／ｋｇのペガプタニブナトリウム（Ｍａｃｕｇｅｎ（商標）（Ｅｙｅｔｅｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、ＥＹＥ００１としても知られる抗ＶＥＧＦアプタマー薬）の１日２回の筋肉内注射、又は５０ｍｇ／ｋｇのＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標）／ＳＴＩ５７（（ＣＧＰ５７１４８Ｂとしても知られる）Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ，Ｂａｓｅｌ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからの２−フェニルアミノピリミジン関連チロシンキナーゼ阻害性抗ＰＤＧＦ薬）の１日２回の食餌による経口投与、又はこの両方によって７日間処置した。角膜ＮＶ誘導後１４日目に、塩酸キシラジン及び塩酸ケタミンによる深い麻酔下で、マウスに２０μｇ／ｇのフルオレセイン−イソチオシアネート結合コンカナバリンＡレクチン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を静脈内投与した。３０分後、マウスの眼を摘出し、角膜を扁平封入した（ｆｌａｔ−ｍｏｕｎｔｅｄ）。蛍光顕微鏡を用いて角膜ＮＶを視覚化し、Ｏｐｅｎｌａｂソフトウエアを用いて定量した。血管で覆われた角膜のパーセントを、総角膜面積のパーセンテージとして算定した。
ＮａＯＨ適用及び縁の上皮と角膜に対する損傷後の、角膜の血管新生へのペガプタニブナトリウムとＧｌｅｅｖｅｃの作用を検討した。ペガプタニブナトリウム（Ｍａｃｕｇｅｎ）で処置した動物は、未処置及びＧｌｅｅｖｅｃ処置眼の両方と比較して血管増殖の１９．６％（ｐ＝０．００１４）の低下を示した。ペガプタニブナトリウムとＧｌｅｅｖｅｃ（Ｍａｃ＋Ｇｌｅｅ）で処置した動物は、対照及びＧｌｅｅｖｅｃ単独で処置した動物と比較して有意に低い角膜での新生血管増殖を示した（３５．６％、ｐ＜０．０００１）（図５）。併用治療はまた、血管増殖を低下させる上でペガプタニブナトリウム（Ｍａｃｕｇｅｎ）単独よりも有効であった（１６％、ｐ＜０．０１４５）。
代表的角膜血管新生実験の結果を図６及び７にも示している。図６（Ｄ）は、Ｍａｃｕｇｅｎ（図６（Ｃ））又はＧｌｅｅｖｅｃ（図６（Ｂ））による個別処置と比較したときの、併用（Ｍａｃ＋Ｇｌｅｅ）処置角膜における新血管形成の有効な阻害を示す蛍光顕微鏡画像の写真表示である。図６（Ａ）は、対照（ＰＥＧ処置）角膜における血管新生の程度を示す蛍光顕微鏡画像の写真表示である。図７は、個別（図７（Ａ）（ＡＰＢ５処置）及び図７（Ｂ）（Ｇｌｅｅｖｅｃ処置））及び併用処置（図７（Ｃ））が新血管増殖だけを阻害し、確立された血管には影響を及ぼさないことを示す蛍光顕微鏡画像の写真表示である。図７（Ｄ）は、対照（ＰＥＧ処置）角膜における血管新生の程度を示す蛍光顕微鏡画像の写真表示である。
脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）
実験的ＣＮＶは、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）についてのモデルとしてしばしば使用される。このモデルでは、ＡＭＤ患者で認められるのと同様に、脈絡膜の血管が増殖してブルーフ膜及び網膜内へと入り込む。実験的ＣＮＶを誘導するために、雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１８−２０ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を筋肉内塩酸ケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、１％トロピカミドで瞳孔を開かせた。ダイオードレーザー光凝固（７５μｍスポットサイズ、０．１秒間、９０ｍＷ、Ｏｃｕｌｉｇｈｔ ＳＬレーザー、ＩＲＩＤＥＸ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）及び手持ちカバーガラスをコンタクトレンズとして使用して４つの熱傷を生じさせた。熱傷は、網膜の後極の３、６、９及び１２時の位置に局在した。ブルーフ膜の断裂を示す、レーザーの時点での水泡の生成は脈絡膜血管新生を得る上で重要な因子であり、従って４つの熱傷全てについて水泡を生じたマウスだけを試験に含めた。７日後、マウスを、約２５ｍｇ／ｋｇのペガプタニブナトリウムの１日２回の腹腔内注射、又は５０ｍｇ／ｋｇのＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標）／ＳＴＩ５７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ，Ｂａｓｅｌ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の１日２回の食餌による投与、又はこの両方によって７日間処置した。ＡＰＢ５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからの抗マウスＰＤＧＦＲｂ（ＣＤ１４０ｂ）抗体（抗ＰＤＧＦ薬））を用いた実験では、５ｍｇ／ｋｇの抗体を１日２回の腹腔内注射を用いて投与した。脈絡膜ＮＶ病変の面積を、ＰＥＣＡＭで染色した扁平封入脈絡膜において測定した。扁平封入を蛍光顕微鏡によって検査し、Ｏｐｅｎｌａｂソフトウエアを用いて定量した。
ペガプタニブナトリウム（Ｍａｃｕｇｅｎ（商標））で処置した眼は、未処置対照と比較してＣＮＶ面積の２４％（ｐ＝０．００７）の低下を示した（図８）。これに対し、ＡＰＢ５処置眼は対照と有意に異ならなかった（対照と比較してＣＮＶ面積の６．５％低下）。ペガプタニブナトリウムとＡＰＢ５の両方で処置した眼は、対照眼又はペガプタニブナトリウム（２２％、ｐ＝０．０１１）又はＡＰＢ５（３９．５％、ｐ＜０．０００１）のいずれか単独で処置した眼と比較して有意に少ない（４６％、ｐ＝０．００１）ＣＮＶ面積を示した（図８）。
ＰＤＧＦＲβ阻害剤を使用したとき同様の傾向が認められた。Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）処置眼は、対照眼と有意差を示さなかった（４．２％）（図９）。ペガプタニブナトリウム（Ｍａｃｕｇｅｎ（商標））で処置眼におけるＣＮＶの面積は、しかしながら、対照と有意に異なった（２７％低い、ｐ＝０．００３４）。重要な点として、ペガプタニブナトリウムとＧｌｅｅｖｅｃの両方（Ｍａｃｕｇｅｎ＋Ｇｌｅｅｖｅｃ）で処置した動物は、対照眼と比較して最小量のＣＮＶ（４６％、ｐ＜０．０００１）を示し、ペガプタニブナトリウム単独処置眼と比較してＣＮＶ面積の１９％低下（ｐ＝０．０４０７）を示した（図９）。
新生児マウスモデル
ペガプタニブナトリウム（Ｍａｃｕｇｅｎ（商標））、及び６、２０及び３０位に２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン、８、２１、２８及び２９位に２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン、９、１５、１７及び３１位に２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシグアノシン、２２位に２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシアデノシン、１０及び２３位の「Ｎ」にヘキサエチレン−グリコールホスホルアミダイト及び３２位に逆方向Ｔ（すなわち３’−３’−結合）を有する配列ＣＡＧＧＣＵＡＣＧＮ ＣＧＴＡＧＡＧＣＡＵ ＣＡＮＴＧＡＴＣＣＵ ＧＴ（配列番号２０）（この全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第６，５８２，９１８号からの配列番号１４６参照）を有するペグ化抗ＰＤＧＦアプタマー、ＡＲＣ−１２７（Ａｒｃｈｅｍｉｘ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）又はこの両方を投与することの、網膜の血管発達への作用を検討した。新生児Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、生後０日目（Ｐ０）から開始して、ＡＲＣ−１２７ １００μｇ又はＭａｃｕｇｅｎ １００μｇ又はこの両方を毎日注射した（腹腔内に）。Ｐ４にマウスの眼を摘出した。網膜血管系を、ＰＥＣＡＭ及びＮＧ−２で染色することによって又はＣｏｎＡ−ＦＩＴＣで灌流することによって扁平封入網膜において視覚化し、蛍光顕微鏡で分析した。
ＡＲＣ−１２７の注射は、網膜の発達中の血管への壁細胞集積を完全にブロックした。加えて、Ｐ４に対照未処置網膜と比較してより少ない血管増殖が認められた。これに対し、Ｍａｃｕｇｅｎは正常な血管発達を妨げなかった。しかし、ＭａｃｕｇｅｎとＡＲＣ−１２７の両方で処置したマウスは、同様であるが、ＡＲＣ−１２７単独で処置したマウスよりも有意に重篤な欠陥を示した。
これらの結果は、図１０に示すように、Ｍａｃｕｇｅｎが発達中の網膜の血管に作用を及ぼさないことを示す。ＰＤＧＦＲ−Ｂアンタゴニスト、ＡＲＣ−１２７は、血管の成長及び形態に影響を及ぼす。しかし、ＡＲＣ−１２７と組み合わせたＭａｃｕｇｅｎは、これらのいずれか単独よりも強く血管に影響する。
抗ＰＤＧＦアプタマー及び抗ＶＥＧＦ抗体による併用療法
この実施例では、抗ＰＤＧＦアプタマーと抗ＶＥＧＦ抗体を使用する併用療法の有効性を、上述した角膜血管新生モデルを用いて明らかにする。実験的角膜ＮＶを誘導するために、雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１８−２０ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を筋肉内塩酸ケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔する。ＮａＯＨ（０．２ｍＭ、２μｌ）を局所適用する。Ｎｏ．２１の刃（Ｆｅａｔｈｅｒ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を使用して角膜縁に平行な回転運動を適用することによって角膜及び縁上皮を切除する。７日後、マウスを、米国特許第６，３４２，２２１号（参照によりここに組み込まれる）に述べられている抗ＶＥＧＦ抗体２Ｃ３ １００μｇと組み合わせた、構造４０Ｋｄ ＰＥＧ−５’−ＣＡＧＧＣＴＡＣＧＣＧＴＡＧ−ＡＧＣＡＴＣＡＴＧＡＴＣＣＴＧ（ｉＴ）−３’（配列番号２１）（ｉＴは、最後のヌクレオチドが逆方向（３’−３’結合）であることを表わす）を有する抗ＰＤＧＦアプタマー２５ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射で処置する。角膜ＮＶ誘導後１４日目に、塩酸キシラジン及び塩酸ケタミンによる深い麻酔下で、マウスに２０μｇ／ｇのフルオレセイン−イソチオシアネート結合コンカナバリンＡレクチン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を静脈内投与する。３０分後、マウスの眼を摘出し、角膜を扁平封入する。蛍光顕微鏡を用いて角膜ＮＶを視覚化し、Ｏｐｅｎｌａｂソフトウエアを用いて定量する。血管で覆われた角膜のパーセントを、総角膜面積のパーセンテージとして算定する。結果は、抗ＰＤＧＦアプタマー又は抗ＶＥＧＦ抗体単独での個別治療に比べて併用療法の効果を明らかにする。
別々の実験において、２つの関連抗ＰＤＧＦアプタマーの作用を、米国特許第６，３４２，２２１号に述べられている抗ＶＥＧＦ抗体２Ｃ３ １００μｇと組み合わせて試験する。以下の２つの抗ＰＤＧＦアプタマーのペグ化及び非ペグ化形態を試験する：（ｉ）６、２０及び３０位に２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン、８、２１、２８及び２９位に２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン、９、１５、１７及び３１位に２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシグアノシン、２２位に２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシアデノシン、１０及び２３位の「Ｎ」にヘキサエチレン−グリコールホスホルアミダイト及び３２位に逆方向Ｔ（すなわち３’−３’−結合）を有するＣＡＧＧＣＵＡＣＧＮ ＣＧＴＡＧＡＧＣＡＵ ＣＡＮＴＧＡＴＣＣＵ ＧＴ（配列番号２０）（この全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第６，５８２，９１８号からの配列番号１４６参照）；及び（ｉｉ）８位のＣにＯ−メチル−２−デオキシシチジン、９、１７及び３１位のＧに２−Ｏ−メチル−２−デオキシグアノシン、２２位のＡに２−Ｏ−メチル−２−デオキシアデニン、３０位に２−Ｏ−メチル−２−デオキシウリジン、６及び２０位のＵに２−フルオロ−２−デオキシウリジン、２１、２８及び２９位のＣに２−フルオロ−２−デオキシシチジン、１０及び２３位のＮにペンタエチレングリコールホスホルアミダイトスペーサー及び３２位に逆方向Ｔ（すなわち３’−３’−結合）を有するＣＡＧＧＣＵＡＣＧＮ ＣＧＴＡＧＡＧＣＡＵ ＣＡＮＴＧＡＴＣＣＵ ＧＴ（配列番号２２）（この全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第５，７２３，５９４号からの配列番号８７参照）。個別の抗ＰＤＧＦアプタマー又は抗ＶＥＧＦ抗体治療と比較して、併用療法の改善された抗血管新生作用を検出するために適切な対照を提供する。結果は、抗ＰＤＧＦアプタマー又は抗ＶＥＧＦ抗体単独での個別治療に比べて併用療法の効果を明らかにする。
抗ＰＤＧＦアプタマーと抗ＶＥＧＦアプタマーの併用、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）ブロック
この実施例では、脈絡膜血管新生をブロックする上での、抗ＰＤＧＦアプタマーと抗ＶＥＧＦアプタマーを使用した併用療法の有効性を、上述した脈絡膜血管新生モデルを用いて明らかにする。実験的ＣＮＶは、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）についてのモデルとしてしばしば使用される。このモデルでは、ＡＭＤ患者で認められるのと同様に、脈絡膜の血管が増殖してブルーフ膜及び網膜内へと入り込む。実験的ＣＮＶを誘導するために、雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１８−２０ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を筋肉内塩酸ケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、１％トロピカミドで瞳孔を開かせる。ダイオードレーザー光凝固（７５μｍスポットサイズ、０．１秒間、９０ｍＷ、Ｏｃｕｌｉｇｈｔ ＳＬレーザー、ＩＲＩＤＥＸ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）及び手持ちカバーガラスをコンタクトレンズとして使用して４つの熱傷を生じさせる。熱傷は、網膜の後極の３、６、９及び１２時の位置に局在した。ブルーフ膜の断裂を示す、レーザーの時点での水泡の生成は脈絡膜血管新生を得る上で重要な因子であり、従って４つの熱傷全てについて水泡を生じたマウスだけを試験に含める。７日後、マウスを２５ｍｇ／ｋｇのペガプタニブナトリウムの１日２回の腹腔内注射によって処置する。抗ＰＤＧＦアプタマーを用いる実験では、構造４０Ｋｄ ＰＥＧ−５’−ＣＡＧＧＣＴＡＣＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＴＣＡＴＧＡ−ＴＣＣＴＧ（ｉＴ）−３’（配列番号２１）（ｉＴは、最後のヌクレオチドが逆方向（３’−３’結合）であることを表わす）を有する抗ＰＤＧＦアプタマー２５ｍｇ／ｋｇをペガプタニブナトリウムと同時投与する。脈絡膜ＮＶ病変の面積を、ＰＥＣＡＭで染色した扁平封入脈絡膜において測定する。扁平封入を蛍光顕微鏡によって検査し、Ｏｐｅｎｌａｂソフトウエアを用いて定量する。結果は、対照眼又はペガプタニブナトリウム又は抗ＰＤＧＦアプタマー単独で処置した眼と比較して、併用療法で処置した眼は有意に低いＣＮＶ面積を示すことを明らかにする。
別々の実験において、２つの関連抗ＰＤＧＦアプタマーの作用を、２５ｍｇ／ｋｇのペガプタニブナトリウムの１日２回の腹腔内注射による抗ＶＥＧＦ治療と組み合わせて試験する。以下の２つの抗ＰＤＧＦアプタマーのペグ化及び非ペグ化形態を試験する：（ｉ）６、２０及び３０位に２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン、８、２１、２８及び２９位に２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン、９、１５、１７及び３１位に２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシグアノシン、２２位に２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシアデノシン、１０及び２３位の「Ｎ」にヘキサエチレン−グリコールホスホルアミダイト及び３２位に逆方向Ｔ（すなわち３’−３’−結合）を有するＣＡＧＧＣＵＡＣＧＮ ＣＧＴＡＧＡＧＣＡＵ ＣＡＮＴＧＡＴＣＣＵ ＧＴ（配列番号２０）（この全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第６，５８２，９１８号からの配列番号１４６参照）；及び（ｉｉ）８位のＣにＯ−メチル−２−デオキシシチジン、９、１７及び３１位のＧに２−Ｏ−メチル−２−デオキシグアノシン、２２位のＡに２−Ｏ−メチル−２−デオキシアデニン、３０位に２−Ｏ−メチル−２−デオキシウリジン、６及び２０位のＵに２−フルオロ−２−デオキシウリジン、２１、２８及び２９位のＣに２−フルオロ−２−デオキシシチジン、１０及び２３位のＮにペンタエチレングリコールホスホルアミダイトスペーサー及び３２位に逆方向Ｔ（すなわち３’−３’−結合）を有するＣＡＧＧＣＵＡＣＧＮ ＣＧＴＡＧＡＧＣＡＵ ＣＡＮＴＧＡＴＣＣＵ ＧＴ（配列番号２２）（この全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第５，７２３，５９４号からの配列番号８７参照）。個別の抗ＰＤＧＦアプタマー又は抗ＶＥＧＦアプタマー治療と比較して、併用療法の改善された抗血管新生作用を検出するために適切な対照を提供する。結果は、抗ＰＤＧＦアプタマー又は抗ＶＥＧＦアプタマー単独での個別治療に比べて、脈絡膜血管新生をブロックする上での併用療法の効果を明らかにする。
角膜血管新生（角膜ＮＶ）−後退
実施例１の角膜ＮＶモデルを使用して、抗ＶＥＧＦアプタマーと抗ＰＤＧＦアプタマーの組合せを検討した。１０日後、マウスを、１日２回の２５ｍｇ／ｋｇのペガプタニブナトリウム（Ｍａｃｕｇｅｎ（商標）、Ｅｙｅｔｅｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、抗ＶＥＧＦアプタマー薬）、及び／又は１日１回の５０ｍｇ／ｋｇのＡＲＣ−１２７（Ａｒｃｈｅｍｉｘ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ、構造４０Ｋｄ ＰＥＧ−５’−ＣＡＧＧＣＴＡＣＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＴＣＡＴＧＡ−ＴＣＣＴＧ（ｉＴ）−３’（配列番号２１）（ｉＴは、最後のヌクレオチドが逆方向（３’−３’結合）であることを表わす）を有する抗ＰＤＧＦアプタマー）の１０日間の腹腔内注射によって処置した。角膜ＮＶ誘導後２０日目に、眼を摘出し、角膜を扁平封入した。ＣＤ３１染色（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて角膜ＮＶを視覚化し、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウエアを用いて定量した。血管で覆われた角膜のパーセントを、総角膜面積のパーセンテージとして算定した。
ＮａＯＨ適用及び縁の上皮と角膜に対する損傷後の、角膜の血管新生後退へのペガプタニブナトリウム及び／又はＡＲＣ−１２７の作用を図１１及び１２に示す。ＡＲＣ−１２７で処置した動物は、２０日目の対照と比較して血管増殖の有意の低下を示さなかった。２０日目の対照は、１０日目の対照と比較したとき角膜血管新生の１２．９２％の上昇を示した。ペガプタニブナトリウム（Ｍａｃｕｇｅｎ）単独で処置した動物は、２０日目の対照と比較して血管増殖の１３．８１％（ｐ≦０．１６）の低下を示した。ペガプタニブナトリウムとＡＲＣ−１２７で処置した動物は、対照と比較して有意に低い角膜で新生血管増殖（２６．８５％、ｐ≦０．０２）を示した。
角膜血管新生（角膜ＮＶ）−後退
実施例１の角膜ＮＶモデルを使用して、抗ＶＥＧＦアプタマーとＰＤＧＦＢ受容体に対する抗体の組合せを検討した。１４日後、マウスを、２５ｍｇ／ｋｇのペガプタニブナトリウム（Ｍａｃｕｇｅｎ、抗ＶＥＧＦアプタマー薬）の１日２回の腹腔内注射によって、及び／又は５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＢ５（ＰＤＧＦＢ受容体に対するポリクローナル抗体）の１日２回の食餌による経口投与によって、１４日間処置した。角膜ＮＶ誘導後２８日目に、塩酸キシラジン及び塩酸ケタミンによる深い麻酔下で、マウスに２０μｇ／ｇのフルオレセイン−イソチオシアネート結合コンカナバリンＡレクチン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を静脈内投与した。３０分後、マウスの眼を摘出し、角膜を扁平封入した。蛍光顕微鏡を用いて角膜ＮＶを視覚化し、Ｏｐｅｎｌａｂソフトウエアを用いて定量した。血管で覆われた角膜のパーセントを、総角膜面積のパーセンテージとして算定した。
ＮａＯＨ適用及び縁の上皮と角膜に対する損傷後の、角膜の血管新生後退へのペガプタニブナトリウム及び／又はＡＰＢ５の作用を図１３に示す。ペガプタニブナトリウム（Ｍａｃｕｇｅｎ）で処置した動物は、対照と比較して血管増殖の８．３％の低下を示した。ペガプタニブナトリウムとＡＰＢ５で処置した動物は、対照と比較して有意に低い角膜で新生血管増殖（２１．４％）を示した。
角膜血管新生（角膜ＮＶ）−後退（治療薬の投与の順序）
実施例１の角膜ＮＶモデルを使用して、抗ＶＥＧＦアプタマーとＰＤＧＦＢ受容体に対する抗体を用いた併用療法の投与の順序の影響を検討した。１４日後、マウスを、２５ｍｇ／ｋｇのペガプタニブナトリウム（Ｍａｃｕｇｅｎ、抗ＶＥＧＦアプタマー薬）の１日２回の腹腔内注射によって及び／又は５０ｍｇ／ｋｇのＰＤＧＦＢ受容体に対するポリクローナル抗体、ＡＰＢ５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の１日２回の食餌による経口投与によって、異なる時点で７日間処置した。角膜ＮＶ誘導後２８日目に、塩酸キシラジン及び塩酸ケタミンによる深い麻酔下で、マウスに２０μｇ／ｇのフルオレセイン−イソチオシアネート結合コンカナバリンＡレクチン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を静脈内投与した。３０分後、マウスの眼を摘出し、角膜を扁平封入した。蛍光顕微鏡を用いて角膜ＮＶを視覚化し、Ｏｐｅｎｌａｂソフトウエアを用いて定量した。血管で覆われた角膜のパーセントを総角膜面積のパーセンテージとして算定し、この結果を図１４に示している。
２１−２８日目のペガプタニブナトリウム単独又は１４−２１日目のＡＰＢ５単独及びこれに続く処置なしの作用は、ＮａＯＨ適用及び縁の上皮と角膜に対する損傷後の角膜の血管新生後退に関して、対照と比較してほとんど作用を示さなかった。１４−２１日目のＡＰＢ５及び２１−２８日目のペガプタニブナトリウムで処置した動物は、対照と比較して角膜でより少ない新生血管増殖を示した（１３．４％）。
（等価物）
本発明の上述した方法及びシステムの様々な修正及び変法は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明白である。本発明を特定所望実施態様に関して説明したが、特許請求する本発明がこのような特定実施態様に不当に限定されるべきでないことは了解されねばならない。当業者は、単に常套的実験だけを用いて、ここで述べる本発明の特定実施態様に対する多くの等価物を認識する又は確認することができる。このような等価物は、本発明の範囲内に包含されることが意図されている。
ヒトＰＤＧＦ−Ｂの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０２８１１）（配列番号１）の図式的表示である。 ヒトＰＤＧＦ−Ｂの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０２８１１）（配列番号１）の図式的表示である。 ヒトＰＤＧＦ−Ｂのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ２６５７９）（配列番号２）の図式的表示である。 ヒトＰＤＧＦ−Ａの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０６３７４）（配列番号１１）の図式的表示である。 ヒトＰＤＧＦ−Ａの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０６３７４）（配列番号１１）の図式的表示である。 ヒトＰＤＧＦ−Ａのポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ２９６７７）（配列番号１２）の図式的表示である。 ヒトＶＥＧＦの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３７６）（配列番号３）の図式的表示である。 ヒトＶＥＧＦの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３７６）（配列番号３）の図式的表示である。 ヒトＶＥＧＦポリペプチドのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００３３６７）（配列番号４）の図式的表示である。 ヒトＰＤＧＦＲ−Ｂの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２６０９）（配列番号５）の図式的表示である。 ヒトＰＤＧＦＲ−Ｂの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２６０９）（配列番号５）の図式的表示である。 ヒトＰＤＧＦＲ−Ｂの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２６０９）（配列番号５）の図式的表示である。 ヒトＰＤＧＦＲ−Ｂの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２６０９）（配列番号５）の図式的表示である。 ヒトＰＤＧＦＲ−Ｂのポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２６００）（配列番号６）の図式的表示である。 ヒトＰＤＧＦＲ−Ａの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００６２０６）（配列番号１３）の図式的表示である。 ヒトＰＤＧＦＲ−Ａの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００６２０６）（配列番号１３）の図式的表示である。 ヒトＰＤＧＦＲ−Ａの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００６２０６）（配列番号１３）の図式的表示である。 ヒトＰＤＧＦＲ−Ａの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００６２０６）（配列番号１３）の図式的表示である。 ヒトＰＤＧＦＲ−Ａの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００６２０６）（配列番号１３）の図式的表示である。 ヒトＰＤＧＦＲ−Ａのポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００６１９７）（配列番号１４）の図式的表示である。 ヒトＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）の核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０６３６５７）（配列番号７）の図式的表示である。 ヒトＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）の核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０６３６５７）（配列番号７）の図式的表示である。 ヒトＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）の核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０６３６５７）（配列番号７）の図式的表示である。 ヒトＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）のポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号）（配列番号８）の図式的表示である。 ヒトＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）の核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３５１２１）（配列番号９）の図式的表示である。 ヒトＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）の核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３５１２１）（配列番号９）の図式的表示である。 ヒトＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）の核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３５１２１）（配列番号９）の図式的表示である。 ヒトＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）の核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３５１２１）（配列番号９）の図式的表示である。 ヒトＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）のポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ８８００５）（配列番号１０）の図式的表示である。 対照治療（ｃｏｎｔ）、Ｇｌｅｅｖｅｃ治療（抗ＰＤＧＦ薬）及びＭａｃｕｇｅｎ（商標）治療（すなわちペガプタニブ治療、抗ＶＥＧＦ薬）を、Ｍａｃｕｇｅｎ（商標）とＧｌｅｅｖｅｃによる併用治療（抗ＰＤＧＦ／抗ＶＥＧＦ併用療法）の結果と比較した角膜血管新生アッセイの結果のグラフ表示である。 （Ａ）は、対照（ＰＥＧ処置）マウス角膜において生じた角膜血管新生の蛍光顕微鏡画像の写真表示である。（Ｂ）は、Ｇｌｅｅｖｅｃ処置マウス角膜において生じた角膜血管新生の蛍光顕微鏡画像の写真表示である。（Ｃ）は、Ｍａｃｕｇｅｎ（商標）処置マウス角膜において生じた角膜血管新生の蛍光顕微鏡画像の写真表示である。（Ｄ）は、Ｍａｃｕｇｅｎ（商標）及びＧｌｅｅｖｅｃの両方で処置したマウス角膜において生じた角膜血管新生の蛍光顕微鏡画像の写真表示である。 （Ａ）は、正常角膜血管系がＡＰＢ５（ＰＤＧＦＲ抗体、抗ＰＤＧＦ薬）の投与によって影響を受けないことを示す蛍光顕微鏡画像の写真表示である。（Ｂ）は、正常角膜血管系がＧｌｅｅｖｅｃの投与によって影響を受けないことを示す蛍光顕微鏡画像の写真表示である。（Ｃ）は、正常角膜血管系がＭａｃｕｇｅｎ（商標）（Ｍａｃ）及びＧｌｅｅｖｅｃの併用投与によって影響を受けないことを示す蛍光顕微鏡画像の写真表示である。（Ｄ）は、正常角膜血管系がＰＥＧの投与によって影響を受けないことを示す蛍光顕微鏡画像の写真表示である。 対照治療（ｃｏｎｔ）、Ｇｌｅｅｖｅｃ治療（抗ＰＤＧＦ薬）及びＭａｃｕｇｅｎ（商標）治療（すなわちペガプタニブ治療、抗ＶＥＧＦ薬）を、Ｍａｃｕｇｅｎ（商標）とＧｌｅｅｖｅｃによる併用治療（抗ＰＤＧＦ／抗ＶＥＧＦ併用療法）の結果と比較したレーザー誘導脈絡膜血管新生アッセイの結果のグラフ表示である。 対照治療（ｃｏｎｔ）、ＡＰＢ５治療（抗ＰＤＧＦ薬として働く、抗ＰＤＧＦＲ抗体）及びＭａｃｕｇｅｎ（商標）治療（すなわちペガプタニブ治療、抗ＶＥＧＦアプタマー）を、ＭａｃｕｇｅｎとＡＰＢ５による併用治療（Ｍａｃ＋ＡＰＢ５）の結果と比較したレーザー誘導脈絡膜血管新生アッセイの結果のグラフ表示である。 対照治療（ｃｏｎｔ）、ＡＲＣ−１２７治療（抗ＰＤＧＦ薬）及びＭａｃｕｇｅｎ治療（すなわちペガプタニブ治療、抗ＶＥＧＦ薬）を、ＭａｃｕｇｅｎとＡＲＣ−１２７による併用治療（抗ＰＤＧＦ／抗ＶＥＧＦ併用療法）の結果と比較した網膜発育モデルの結果のグラフ表示である。 対照治療（ｃｏｎｔ）、ＡＲＣ−１２７治療（抗ＰＤＧＦ薬）及びＭａｃｕｇｅｎ治療（すなわちペガプタニブ治療、抗ＶＥＧＦ薬）を、ＭａｃｕｇｅｎとＡＲＣ−１２７による併用治療（抗ＰＤＧＦ／抗ＶＥＧＦ併用療法）の結果と比較した角膜血管新生アッセイの結果のグラフ表示である。 （Ａ）は、対照マウス角膜において生じた角膜血管新生の蛍光顕微鏡画像の写真表示である。（Ｂ）は、ＡＲＣ−１２７処置マウス角膜において生じた角膜血管新生の蛍光顕微鏡画像の写真表示である。（Ｃ）は、Ｍａｃｕｇｅｎ処置マウス角膜において生じた角膜血管新生の蛍光顕微鏡画像の写真表示である。（Ｄ）は、ＭａｃｕｇｅｎとＡＲＣ−１２７の両方で処置したマウス角膜において生じた角膜血管新生の蛍光顕微鏡画像の写真表示である。 対照治療（ｃｏｎｔ）、ＡＰＢ−５治療（抗ＰＤＧＦ薬）及びＭａｃｕｇｅｎ治療（すなわちペガプタニブ治療、抗ＶＥＧＦ薬）を、ＭａｃｕｇｅｎとＡＰＢ−５による併用治療（抗ＰＤＧＦ／抗ＶＥＧＦ併用療法）の結果と比較した角膜血管新生アッセイの結果のグラフ表示である。 対照治療（ｃｏｎｔ）、ＡＰＢ−５治療（抗ＰＤＧＦ薬）及びＭａｃｕｇｅｎ治療（すなわちペガプタニブ治療、抗ＶＥＧＦ薬）を、ＭａｃｕｇｅｎとＡＰＢ−５による併用治療（抗ＰＤＧＦ／抗ＶＥＧＦ併用療法）の結果と比較した角膜血管新生アッセイの結果のグラフ表示である。

Claims (8)

  1. （ｉ）６位、２０位及び３０位に２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン；８位、２１位、２８位および２９位に２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン；９位、１５位、１７位及び３１位に２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシグアノシン；２２位に２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシアデノシン；１０位及び２３位のＮにヘキサエチレン−グリコールホスホラミダイト；及び３２位に逆方向Ｔ（３’−３’−結合）を有する、配列ＣＡＧＧＣＵＡＣＧＮ ＣＧＴＡＧＡＧＣＡＵ ＣＡＮＴＧＡＴＣＣＵ ＧＴのペグ化もしくは非ペグ化アプタマーであるＰＤＧＦアンタゴニスト；
    （ｉｉ）ヒト抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体又はその結合フラグメントであるＶＥＧＦアンタゴニスト；及び
    （ｉｉｉ）医薬的に許容される担体
    を含有し、前記ＰＤＧＦアンタゴニスト及びＶＥＧＦアンタゴニストが患者において眼血管新生疾患を治療又は予防するための医薬組成物。
  2. （ｉ）６位、２０位及び３０位に２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン；８位、２１位、２８位および２９位に２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン；９位、１５位、１７位及び３１位に２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシグアノシン；２２位に２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシアデノシン；１０位及び２３位のＮにヘキサエチレン−グリコールホスホラミダイト；及び３２位に逆方向Ｔ（３’−３’−結合）を有する、配列ＣＡＧＧＣＵＡＣＧＮ ＣＧＴＡＧＡＧＣＡＵ ＣＡＮＴＧＡＴＣＣＵ ＧＴのペグ化もしくは非ペグ化アプタマーであるＰＤＧＦアンタゴニスト；
    （ｉｉ）ペガプタニブ又はそれらの塩であるＶＥＧＦアンタゴニスト；及び
    （ｉｉｉ）医薬的に許容される担体
    を含有し、前記ＰＤＧＦアンタゴニスト及びＶＥＧＦアンタゴニストが患者において眼血管新生疾患を治療又は予防するための医薬組成物。
  3. ＰＤＧＦアンタゴニストがペグ化アプタマーである請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 眼血管新生疾患を治療又は予防するための医薬の製造におけるＰＤＧＦアンタゴニストの使用であって、前記ＰＤＧＦアンタゴニストが、６位、２０位及び３０位に２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン；８位、２１位、２８位および２９位に２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン；９位、１５位、１７位及び３１位に２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシグアノシン；２２位に２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシアデノシン；１０位及び２３位のＮにヘキサエチレン−グリコールホスホラミダイト；及び３２位に逆方向Ｔ（３’−３’−結合）を有する配列ＣＡＧＧＣＵＡＣＧＮ ＣＧＴＡＧＡＧＣＡＵ ＣＡＮＴＧＡＴＣＣＵ ＧＴのペグ化もしくは非ペグ化アプタマーであり、前記医薬がヒト抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体又はその結合フラグメントであるＶＥＧＦアンタゴニストと連続して又は同時に投与される、前記使用。
  5. 眼血管新生疾患を治療又は予防するための医薬の製造におけるＰＤＧＦアンタゴニストの使用であって、前記ＰＤＧＦアンタゴニストが、６位、２０位及び３０位に２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン；８位、２１位、２８位および２９位に２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン；９位、１５位、１７位及び３１位に２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシグアノシン；２２位に２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシアデノシン；１０位及び２３位のＮにヘキサエチレン−グリコールホスホラミダイト；及び３２位に逆方向Ｔ（３’−３’−結合）を有する、配列ＣＡＧＧＣＵＡＣＧＮ ＣＧＴＡＧＡＧＣＡＵ ＣＡＮＴＧＡＴＣＣＵ ＧＴのペグ化もしくは非ペグ化アプタマーであり、前記医薬がペガプタニブ又はそれらの塩であるＶＥＧＦアンタゴニストと連続して又は同時に投与される、前記使用。
  6. ＰＤＧＦアンタゴニストがペグ化アプタマーである、請求項４又は５に記載の使用。
  7. 眼血管新生疾患が、加齢性黄斑変性、角膜血管新生又は脈絡膜血管新生である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の使用。
  8. 眼血管新生疾患が、加齢性黄斑変性、角膜血管新生又は脈絡膜血管新生である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
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