PT1660057E

PT1660057E - Terapia de associação para o tratamento de distúrbios neovasculares oculares

Info

Publication number: PT1660057E
Application number: PT04782166T
Authority: PT
Inventors: David Shima; Perry Calias; Anthony P Adamis
Original assignee: Ophthotech Corp
Priority date: 2003-08-27
Filing date: 2004-08-26
Publication date: 2012-08-02
Also published as: SI1660057T1; KR101218889B1; KR101471732B1; EP1660057B1; AU2010224423A1; US8685397B2; ES2388138T3; AR046682A1; WO2005020972A3; CA2536912A1; TW200526238A; KR101501870B1; NZ601544A; CN102380098B; TWI414300B; EP1660057A2; JP4951339B2; CN1934255A; US20100119522A1; TW201444564A

Description

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DESCRIÇÃO "TERAPIA DE ASSOCIAÇÃO PARA O TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS NEOVASCULARES OCULARES"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se aos campos de oftalmologia e medicina. Mais especificamente, esta invenção refere-se ao tratamento de distúrbios neovasculares do olho utilizando uma associação de agentes que inibem tanto o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) como o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A angiogénese, também chamada neovascularização, envolve a formação de rebentos a partir de vasos sanguíneos preexistentes e a sua invasão para tecido circundante. Um processo relacionado, a vasculogénese, envolve a diferenciação de células endoteliais e angioblastos que já estão presentes num tecido e a sua junção subsequente uns com os outros para formar vasos sanguíneos. A angiogénese ocorre extensivamente durante o desenvolvimento e também ocorre no corpo saudável durante a cicatrização de feridas para restabelecer o fluxo sanguíneo para os tecidos após lesão ou insulto. No entanto, a angiogénese também foi implicada na formação de cancro e tumores. Na realidade, a quantidade de vasos sanguíneos num tecido tumoral é um indicador prognóstico negativo forte no cancro da mama (Weidner et al., (1992) J. Natl. Câncer

Inst. 84:1875-1887), cancro da próstata (Weidner et al., (1993) Am. J. Pathol. 143:401-409), tumores do cérebro (Li et al., (1994) Lancet 344:82-86) e melanoma (Foss et al., (1996) Câncer Res. 56:2900-2903). A angiogénese também foi 2 recentemente implicada noutros estados patológicos em muitas áreas da medicina, incluindo reumatologia, dermatologia, cardiologia e oftalmologia. Em particular, a angiogénese especifica de tecido indesejável ou patológica foi associada a certos estados patológicos específicos incluindo artrite reumatoide, aterosclerose e psoríase (ver por exemplo, Fan et al., (1995) Trends Pharmacol. Sei. 16: 57; e Folkman (1995) Nature Med. 1: 27). Além disso, julga-se que a alteração da permeabilidade vascular desempenha um papel em processos fisiológicos normais e patológicos (Cullinan-Bove et al., (1993) Endocrinol. 133: 829; Senger et al., (1993) Câncer and Metastasis Reviews 12: 303). Embora seja provável que o processo angiogénico em cada uma destas doenças partilhe muitas características com a angiogénese do desenvolvimento e angiogénese de tumores, cada uma delas também pode ter aspetos únicos conferidos pela influência das células circundantes. Vários distúrbios oculares envolvem alterações na angiogénese. Por exemplo, a retinopatia diabética, a terceira principal causa de cegueira no adulto (que contribui para quase 7% de cegueira nos EUA), está associada a eventos angiogénicos extensos. A retinopatia não proliferativa é acompanhada pela perda seletiva de pericitos na retina e a sua perda resulta na dilatação de capilares associados e num aumento resultante do fluxo sanguíneo. Nos capilares dilatados, as células endoteliais proliferam e formam divertículos, os quais se tornam microaneurismas, e os capilares adjacentes ficam bloqueados pelo que a área de retina circundante a estes microaneurismas não é perfundida. Eventualmente surgem vasos derivados entre áreas adjacentes de microaneurismas, e é observado um quadro clínico de retinopatia diabética precoce com microaneurismas e áreas de retina não perfundida. Os microaneurismas originam perdas e os vasos 3 capilares podem sangrar, originando exsudatos e hemorragias. Uma vez estabelecidas as fases iniciais da retinopatia diabética de fundo, a condição progride ao longo de um periodo de anos, transformando-se em retinopatia diabética proliferativa e cegueira em cerca de 5% dos casos. A retinopatia diabética proliferativa ocorre quando algumas áreas da retina continuam a perder os seus vasos capilares e tornam-se não perfundidas, originando o aparecimento de novos vasos no disco e noutras partes da retina. Estes novos vasos sanguíneos crescem para dentro do corpo vitreo e sangram facilmente, originando hemorragias pré-retinianas. Na retinopatia diabética proliferativa avançada, uma hemorragia vitrea maciça pode preencher uma porção importante da cavidade vitrea. Além disso, os novos vasos são acompanhados pela proliferação de tecido fibroso que pode levar a deslocamento da retina. A retinopatia diabética está principalmente associada à duração da diabetes mellitus; por conseguinte, à medida que a população envelhece e os doentes diabéticos vivem mais, a prevalência da retinopatia diabética aumentará. A terapia de laser é atualmente utilizada tanto na retinopatia diabética não proliferativa como na proliferativa. 0 tratamento com laser focal dos microaneurismas com perda em torno da área macular reduz a perda visual em 50% dos doentes com edema macular clinicamente significativo. Na retinopatia diabética proliferativa, a fotocoagulação panretiniana resulta em vários milhares de queimaduras minúsculas espalhadas por toda a retina (poupando a área macular); este tratamento reduz a taxa de cegueira em 60 por cento. O tratamento precoce do edema macular e da retinopatia diabética proliferativa previne a cegueira durante 5 anos em 95% dos doentes, enquanto o tratamento tardio previne a cegueira em apenas 50 por cento. Por 4 conseguinte, o diagnóstico e tratamento precoces são essenciais.

Outro distúrbio ocular envolvendo a neovascularização é a degenerescência macular relacionada com a idade (AMD), uma doença que afeta aproximadamente um em cada dez Americanos acima dos 65 anos de idade. A AMD é caracterizada por uma série de alterações patológicas na mácula, a região central da retina, a qual é acompanhada por uma menor acuidade visual, que afeta e particular a visão central. A AMD envolve a camada simples de células chamada epitélio pigmentado da retina que se encontra imediatamente abaixo da retina sensitiva. Estas células alimentam e suportam a porção da retina em contacto com as mesmas, isto é, as células fotorrecetoras que contêm os pigmentos visuais. 0 epitélio pigmentado da retina encontra-se na membrana de Bruch, um complexo de membrana basal que, na AMD, espessa e torna-se esclerótica. Os novos vasos sanguíneos podem irromper através da membrana de Bruch a partir da coroide subjacente, que contém um leito vascular rico. Por sua vez, estes vasos podem perder líquido ou sangrar por baixo do epitélio pigmentado da retina e também entre o epitélio pigmentado da retina e a retina sensitiva. A cicatrização fibrosa subsequente interrompe a alimentação das células fotorrecetoras e leva à sua morte, resultando numa perda de acuidade visual central. Este tipo de maculopatia relacionada com a idade é chamada de tipo "húmido" por causa dos vasos com perda e do edema ou sangue sub-retiniano. A de tipo húmido é responsável por apenas 10% dos casos de maculopatia relacionada com a idade mas resulta em 90% de casos de cegueira legal resultante de degenerescência macular em idosos. A maculopatia relacionada com a idade de tipo "seco" envolve a desintegração do epitélio pigmentado da retina juntamente com a perda das células fotorrecetoras sobrejacentes. A de 5 tipo seco reduz a visão mas geralmente apenas para niveis de 20/50 a 20/100. A AMD é acompanhada de distorção da visão central em que os objetos parecem maiores ou menores ou as linhas lineares parecem distorcidas, arqueadas, ou sem um segmento central. Na AMID de tipo húmido pode observar-se um pequeno deslocamento da retina sensitiva na área macular, mas o diagnóstico definitivo de um membrana neovascular sub-retiniana requer angiografia com fluoresceina. Na de tipo seco, drusas podem perturbar o padrão de pigmentação na área macular. As drusas são excrescências da membrana basal do epitélio pigmentado da retina que se projetam para dentro das células, fazendo com que elas se dilatem anteriormente; o seu papel como um fator de risco na maculopatia relacionada com a idade não é claro. Não há presentemente qualquer tratamento para a maculopatia relacionada com a idade de tipo seco. O tratamento com laser é utilizado na maculopatia relacionada com a idade de tipo húmido e elimina inicialmente a membrana neovascular e previne mais perda visual em cerca de 50% dos doentes após 18 meses. No entanto, após 60 meses apenas 20% têm ainda um beneficio considerável.

Foram identificados múltiplos mediadores moleculares da angiogénese incluindo fatores de crescimento de fibroblastos básicos e ácidos (aFGF, bFGF), fatores de crescimento transformante alfa e beta (TGFa, TGFP), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), angiogenina, fator de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas (PD-ECGF), interleucina-8 (IL-8) e fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF). Outros estimuladores implicados na angiogénese incluem angiopoietina-1, Del-1, folistatina, fator de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF), fator de crescimento 6 de hepatócitos (HGF), leptina, midkine, fator de crescimento placentário, pleiotrofina (PTN), progranulina, proliferina e fator de necrose tumoral-alfa (TNF-alfa). Além disso, o controlo da angiogénese é ainda mediado por um número de reguladores negativos da angiogénese produzidos pelo corpo incluindo angioarrestina, angiostatina (fragmento de plasminogénio), antitrombina antiangiogénica III, inibidor derivado de cartilagem (CDI), fragmento do complemento CD59, endostatina (fragmento de colagénio XVIII), fragmento de fibronectina, gro-beta, heparinases, fragmento hexassacárido de heparina, gonadotrofina coriónica humana (hCG), interferão alfa/beta/gama, proteina indutivel de interferão (IP-10), interleucina-12, kringle 5 (fragmento de plasminogénio), inibidores de metaloproteinases (TIMPs), 2-metoxiestradiol, inibidor da ribonuclease placentária, inibidor do ativador de plasminogénio, fator de plaquetas-4 (PF4), fragmento de 16kD da prolactina, proteina relacionada com proliferina (PRP), retinoides, tetra-hidrocortisol-S, trombospondina-(TSP-1), vasculostatina e vasostatina (fragmentos de calreticulina).

Entre estes reguladores angiogénicos, o VEGF parece desempenhar um papel chave como um regulador positivo da angiogénese anormal que acompanha o crescimento de tumores (revisto em Brown et al., (1996) Control of Angiogenesis (Goldberg e Rosen, eds.) Birkhauser, Basel, e Thomas (1996) J. Biol. Chem. 271:603-606). Além disso, recentemente, o papel do membro PDGF-B da família PDGF de moléculas de sinalização tem estado sob investigação, uma vez que parece desempenhar um papel na formação, expansão e funcionamento apropriado de células perivasculares, por vezes referidas como células murais, por exemplo, músculo liso vascular, células mesangiais e pericitos. 7

Embora tenha sido aprendido muito sobre a angiogénese, ou neovascularização, que acompanha o desenvolvimento, a cicatrização de feridas e a formação de tumores, permanece por determinar se existem diferenças entre estas formas de angiogénese e a angiogénese ocular. De modo significativo, embora a angiogénese que acompanha, por exemplo, a formação de vasos sanguíneos colaterais no coração, possa ser benéfica e adaptável ao organismo, a neovascularização ocular patológica que acompanha, por exemplo, a AMD, não tem qualquer benefício conhecido e, frequentemente, conduz à cegueira (para uma revisão, ver Campochiaro (2000) J. Cell. Physiol. 184: 301-10). Por conseguinte, embora tenham sido feitos avanços na compreensão dos eventos moleculares que acompanham a neovascularização, existe uma necessidade para utilizar este conhecimento no desenvolvimento de outros métodos de tratamento de doenças e distúrbios neovasculares, incluindo doenças e distúrbios neovasculares oculares tais como a neovascularização coroideia que ocorre com a AMD e retinopatia diabética.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Foi determinado que a associação de agentes anti-VEGF e anti-PDGF proporciona surpreendentemente benefícios terapêuticos sinérgicos para o tratamento de uma doença neovascular ocular.

Por conseguinte, a invenção refere-se a um método de tratamento de um doente diagnosticado com, ou em risco de desenvolver, um distúrbio neovascular. Este método inclui administrar ao doente um agente anti-VEGF e um agente anti-PDGF como um tratamento terapêutico primário ou secundário.

Num aspeto, a invenção proporciona um antagonista de PDGF e um antagonista de VEGF para ser utilizado num método para o tratamento ou prevenção de um distúrbio ocular neovascular, 8 em que o antagonista de PDGF é 4-[(4-metilpiperazin-l-il)metil]-N-[4-metil-3-[(4-piridin-3-ilpirimidin-2-il)amino]fenil]benzamida (imatinib) e o antagonista de VEGF é pegaptanib ou um seu sal, em que o antagonista de PDGF e o antagonista de VEGF são para administração simultânea, separada ou sequencial.

Noutro aspeto, a invenção proporciona um antagonista de PDGF e um antagonista de VEGF para ser utilizado num método para o tratamento ou prevenção de um distúrbio ocular neovascular, em que o antagonista de PDGF é um anticorpo anti-PGDF ou seu fragmento de ligação, e o antagonista de VEGF é pegaptanib ou um seu sal, em que o antagonista de PDGF e o antagonista de VEGF são para administração simultânea, separada ou sequencial.

Num outro aspeto, a invenção proporciona um antagonista de PDGF e um antagonista de VEGF para ser utilizado num método para o tratamento ou prevenção de um distúrbio ocular neovascular, em que o antagonista de PDGF é um aptâmero anti-PDGF peguilado ou não peguilado possuindo a sequência CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT, em que as posições 6, 20 e 30 são 2'-fluoro-2'-desoxiuridina, as posições 8, 21, 28 e 29 são 2'-fluoro-2'-desoxicitidina, as posições 9,15,17 e 31 são 2'-O-Metil-2'-desoxiguanosina, a posição 22 é 2'-O-Metil-2'-desoxiadenosina, "N" nas posições 10 e 23 é de fosforamideto de hexaetileno-glicol e a posição 32 está ligada 3'-3', ou um aptâmero anti-PDGF peguilado ou não peguilado possuindo a sequência CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT, em que a posição 8 é 0-metil-2-desoxicitidina, as posições 9, 17 e 31 são 2-0-metil-2- desoxiguanosina, a posição 22 é 2-0-metil-2-desoxiadenina, a posição 30 é 2-0-metil-2-desoxiuridina, as posições 6 e 20 são 2-f luoro-2-desoxiuridina, as posições 21, 28 e 29 são 2-fluoro-2-desoxicitidina, "N" nas posições 10 e 23 é 9 um espaçador de pentaetileno glicol e a posição 32 está ligada 3'-3', e o antagonista de VEGF é pegaptanib ou um seu sal, em que o antagonista de PDGF e o antagonista de VEGF são para administração simultânea, separada ou sequencial.

Ainda num outro aspeto, a invenção proporciona um antagonista de PDGF e um antagonista de VEGF para ser utilizado num método para o tratamento ou prevenção de um distúrbio neovascular ocular, em que o antagonista de PDGF é um aptâmero anti-PDGF peguilado ou não peguilado possuindo a sequência CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT, em que as posições 6, 20 e 30 são 2'-fluoro-2'-desoxiuridina, as posições 8, 21, 28 e 29 são 2'-fluoro-2'-desoxicitidina, as posições 9, 15, 17 e 31 são 2'-0-Metil-2'-desoxiguanosina, a posição 22 é 2'-O-Metil-2'-desoxiadenosina, "N" nas posições 10 e 23 é de fosforamideto de hexaetileno-glicol e a posição 32 está ligada 3'-3', ou um aptâmero anti-PDGF peguilado ou não peguilado possuindo a sequência CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT, em que a posição 8 é O-metil-2-desoxicitidina, as posições 9, 17 e 31 são 2-0-metil-2-desoxiguanosina, a posição 22 é 2-0-metil-2-desoxiadenina, a posição 30 é 2-0-metil-2-desoxiuridina, as posições 6 e 20 são 2-fluoro-2-desoxiuridina, as posições 21, 28 e 29 são 2-fluoro-2-desoxicitidina, "N" nas posições 10 e 23 é um espaçador de pentaetileno glicol e a posição 32 está ligada 3'-3', e o antagonista de VEGF é um anticorpo ou seu fragmento de ligação, em que o antagonista de PDGF e o antagonista de VEGF são para administração simultânea, separada ou sequencial. A invenção também proporciona num outro aspeto um antagonista de PDGF e um antagonista de VEGF para ser utilizado num método para o tratamento ou prevenção de um 10 distúrbio ocular neovascular, em que o antagonista de PDGF é um aptâmero anti-PDGF peguilado possuindo a sequência CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT, em que as posições 6, 20 e 30 são 2 '-fluoro-2'-desoxiuridina, as posições 8, 21, 28 e 29 são 2'-fluoro-2'-desoxicitidina, as posições 9, 15, 17 e 31 são 2' -O-Metil-2' -desoxiguanosina, a posição 22 é 2'-O-Metil-2'-desoxiadenosina, "N" nas posições 10 e 23 é de fosforamideto de hexaetileno-glicol e a posição 32 está ligada 3'-3' , e o antagonista de VEGF é um anticorpo ou seu fragmento de ligação, em que o antagonista de PDGF e o antagonista de VEGF são para administração simultânea, separada ou sequencial.

Numa forma de realização dos aspetos acima, o antagonista de PDGF e o antagonista de VEGF são formulados separadamente como medicamentos.

Noutra forma de realização dos aspetos acima, o antagonista de PDGF e o antagonista de VEGF são formulados num único medicamento.

Numa outra forma de realização dos aspetos acima, o antagonista de PDGF é um anticorpo anti-PDGF-B ou seu fragmento de ligação.

Ainda numa outra forma de realização do aspeto acima, o antagonista de VEGF é um anticorpo anti-VEGF-A ou seu fragmento de ligação.

Noutra forma de realização, o antagonista de VEGF é pegaptanib de sódio.

Numa outra forma de realização, o distúrbio neovascular ocular é retinopatia isquémica, neovascularização da iris, neovascularização intraocular, degenerescência macular 11 relacionada com a idade, neovascularização da córnea, neovascularização retiniana, neovascularização coroideia, isquemia retiniana diabética ou retinopatia diabética proliferativa.

Num outro aspeto, a invenção proporciona um antagonista de PDGF e um antagonista de VEGF para ser utilizado num método para o tratamento ou prevenção de um distúrbio neovascular ocular, em que o antagonista de PDGF é um anticorpo ou seu fragmento de ligação e o antagonista de VEGF é um anticorpo ou seu fragmento de ligação.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 (A) é uma representação esquemática da sequência de ácido nucleico de um PDGF-B humano (N° de Acesso do GenBank X02811) (SEQ ID NO: 1). A Figura 1 (B) é uma representação esquemática da sequência de aminoácidos de um PDGF-B humano (N° de Acesso do GenBank CAA26579) (SEQ ID NO: 2). A Figura 1 (C) é uma representação esquemática da sequência de ácido nucleico de um PDGF-A humano (N° de Acesso do GenBank X06374) (SEQ ID NO: 11). A Figura 1 (D) é uma representação esquemática da sequência polipeptidica de um PDGF-A humano (N° de Acesso do GenBank CAA29677) (SEQ ID NO: 12). A Figura 2 (A) é uma representação esquemática da sequência de ácido nucleico de um VEGF humano (N° de Acesso do GenBank NM 003376) (SEQ ID NO: 3). 12 A Figura 2 (B) é uma representação esquemática da sequência de aminoácidos de um polipéptido do VEGF humano (N° de Acesso do GenBank NP_003367) (SEQ ID NO: 4). A Figura 3 (A) é uma representação esquemática da sequência de ácido nucleico de um PDGFR-B humano (N° de Acesso do GenBank NM_002609) (SEQ ID NO: 5). A Figura 3 (B) é uma representação esquemática da sequência polipeptidica de um PDGFR-B humano (N° de Acesso do GenBank NP_0 02 60 0) (SEQ ID NO: 6) . A Figura 3 (C) é uma representação esquemática da sequência de ácido nucleico de um PDGFR-A humano (N° de Acesso do GenBank NM_006206) (SEQ ID NO: 13). A Figura 3 (D) é uma representação esquemática da sequência polipeptidica de um PDGFR-A humano (N° de Acesso do GenBank NP_006197) (SEQ ID NO: 14). A Figura 4 (A) é uma representação esquemática da sequência de ácido nucleico de um VEGFR-1 humano (Flt-1) (N° de Acesso do GenBank AF063657) (SEQ ID NO: 7). A Figura 4 (B) é uma representação esquemática da sequência polipeptidica de um VEGFR-1 humano (Flt-1) (N° de Acesso do GenBank) (SEQ ID NO: 8). A Figura 4 (C) é uma representação esquemática da sequência de ácido nucleico de um VEGFR-2 humano (KDR/Flk-1) (N° de Acesso do GenBank AF035121) (SEQ ID NO: 9). A Figura 4 (D) é uma representação esquemática da sequência polipeptidica de um VEGFR-2 humano (KDR/Flk-1) (N° de Acesso do GenBank AAB88005) (SEQ ID NO: 10). 13 A Figura 5 é uma representação gráfica dos resultados de um ensaio de neovascularização da córnea que compara um tratamento de controlo (cont), tratamento com Gleevec (um agente anti-PDGF) e tratamento com Macugen™ (isto é, tratamento com pegaptanib, um agente anti-VEGF), com os resultados de um tratamento de associação com Macugen™ e Gleevec (terapia de associação anti-PDGF/anti-VEGF). A Figura 6 (A) é uma representação fotográfica de uma imagem microscópica fluorescente da neovascularização da córnea que ocorre na córnea de rato de controlo (tratado com PEG). A Figura 6 (B) é uma representação fotográfica de uma imagem microscópica fluorescente da neovascularização da córnea que ocorre na córnea de rato tratado com Gleevec. A Figura 6 (C) é uma representação fotográfica de uma imagem microscópica fluorescente da neovascularização da córnea que ocorre na córnea de rato tratado com Macugen™. A Figura 6 (D) é uma representação fotográfica de uma imagem microscópica fluorescente da neovascularização da córnea que ocorre na córnea de rato tratado com ambos Macugen™ e Gleevec. A Figura 7 (A) é uma representação fotográfica de uma imagem microscópica fluorescente que mostra que a vasculatura normal da córnea não é afetada pela administração de APB5 (anticorpo contra PDGFR, um agente anti-PDGF). A Figura 7 (B) é uma representação fotográfica de uma imagem microscópica fluorescente que mostra que a 14 vasculatura normal da córnea não é afetada pela administração de Gleevec. A Figura 7 (C) é uma representação fotográfica de uma imagem microscópica fluorescente que mostra que a vasculatura normal da córnea não é afetada pela administração de Macugen™ (Mac) e Gleevec em conjunto. A Figura 7 (D) é uma representação fotográfica de uma imagem microscópica fluorescente que mostra que a vasculatura normal da córnea não é afetada pela administração de PEG. A Figura 8 é uma representação gráfica dos resultados de um ensaio de neovascularização coroideia induzido por laser que compara um tratamento de controlo (cont), tratamento com Gleevec (um agente anti-PDGF) e tratamento com Macugen™ (isto é, tratamento com pegaptanib, um agente anti-VEGF), com os resultados de um tratamento de associação com Macugen™ e Gleevec (terapia de associação anti-PDGF/anti-VEGF). A Figura 9 é uma representação gráfica dos resultados de um ensaio de neovascularização coroideia induzido por laser que compara um tratamento de controlo (cont), tratamento com APB5 (um anticorpo anti-PGFR, que atua como um agente anti-PDGF) e tratamento com Macugen (isto é, tratamento com pegaptanib, um aptâmero anti-VEGF), com os resultados de um tratamento de associação com Macugen e APB5 (Mac+APB5). A Figura 10 é uma representação gráfica dos resultados de um modelo de desenvolvimento retiniano que compara um tratamento de controlo (cont), tratamento com ARC-127 (um agente anti-PDGF) e tratamento com Macugen (isto é, tratamento com pegaptanib, um agente anti-VEGF), com os 15 resultados de um tratamento de associação com Macugen e ARC-127 (terapia de associação anti-PDGF/anti-VEGF). A Figura 11 é uma representação gráfica dos resultados de um ensaio de neovascularização da córnea que compara um tratamento de controlo (cont), tratamento com ARC-127 (um agente anti-PDGF) e tratamento com Macugen (isto é, tratamento com pegaptanib, um agente anti-VEGF) , com os resultados de um tratamento de associação com Macugen e ARC-127 (terapia de associação anti-PDGF/anti-VEGF). A Figura 12 (A) é uma representação fotográfica de uma imagem microscópica fluorescente da neovascularização da córnea que ocorre na córnea do rato de controlo. A Figura 12 (B) é uma representação fotográfica de uma imagem microscópica fluorescente da neovascularização da córnea que ocorre na córnea de um rato tratado com ARC-127. A Figura 12 (C) é uma representação fotográfica de uma imagem microscópica fluorescente da neovascularização da córnea que ocorre na córnea de um rato tratado com Macugen. A Figura 12 (D) é uma representação fotográfica de uma imagem microscópica fluorescente da neovascularização da córnea que ocorre na córnea de um rato tratado com ambos Macugen e ARC-127. A Figura 13 é uma representação gráfica dos resultados de um ensaio de neovascularização da córnea que compara um tratamento de controlo (cont), tratamento com APB-5 (um agente anti-PDGF) e tratamento com Macugen (isto é, tratamento com pegaptanib, um agente anti-VEGF), com os resultados de um tratamento de associação com Macugen e APB-5 (terapia de associação anti-PDGF/anti-VEGF). 16 A Figura 14 é uma representação gráfica dos resultados de um ensaio de neovascularização da córnea que compara um tratamento de controlo (cont), tratamento com APB-5 (um agente anti-PDGF) e tratamento com Macugen (isto é, tratamento com pegaptanib, um agente anti-VEGF) , com os resultados de um tratamento de associação com Macugen e APB-5 (terapia de associação anti-PDGF/anti-VEGF).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições

Como aqui utilizados, os seguintes termos e frases deverão ter os significados definidos abaixo. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como geralmente compreendido por um técnico na matéria à qual esta invenção pertence. utilizando ligando (por exemplo

Por "antagonista" pretende-se referir um agente que inibe, quer parcialmente ou completamente, a atividade ou produção de uma molécula alvo. Em particular, o termo "antagonista," como aqui aplicado seletivamente, significa um agente capaz de diminuir os níveis de expressão do gene de PDGF, PDGFR, VEGF ou VEGFR, os níveis de ARNm, os níveis de proteína ou a atividade da proteína. As formas ilustrativas de antagonistas incluem, por exemplo, proteínas, polipéptidos, péptidos (tais como péptidos cíclicos), anticorpos ou fragmentos de anticorpo, miméticos peptídicos, moléculas de ácido nucleico, moléculas antimensageiras, ribozimas, aptâmeros, moléculas de ARNi e moléculas orgânicas pequenas. Os mecanismos ilustrativos, não limitativos da inibição antagonista dos alvos ligando/recetor de VEGF/VEGFR e PDGF/PDGFR incluem a repressão da síntese e/ou estabilidade do 17 composições antimensageiras, de ribozimas ou ARNi que visam o gene/ácido nucleico do ligando), o bloqueio da ligação do ligando ao seu recetor cognato (por exemplo, utilizando aptâmeros anti-ligando, anticorpos ou um recetor cognato engodo, solúvel), a repressão da síntese e/ou estabilidade do recetor (por exemplo, utilizando composições antimensageiras, de ribozimas ou ARNi que visam o gene/ácido nucleico do recetor do ligando), o bloqueio da ligação do recetor ao seu recetor cognato (por exemplo, utilizando anticorpos contra o recetor) e o bloqueio da ativação do recetor pelo seu ligando cognato (por exemplo, utilizando inibidores de tirosina-cinase de recetor). Além disso, o antagonista pode inibir direta ou indiretamente a molécula alvo. 0 termo "anticorpo" como aqui utilizado pretende incluir anticorpos inteiros, por exemplo, de qualquer isotipo (IgG, IgA, IgM, IgE, etc.) e inclui fragmentos dos mesmos que reconhecem e também são especificamente reativos com proteínas, hidratos de carbono, etc. do vertebrado (por exemplo, mamífero). Os anticorpos podem ser fragmentados utilizando técnicas convencionais e os fragmentos rastreados quanto à utilidade do mesmo modo que o descrito acima para os anticorpos inteiros. Assim, o termo inclui segmentos de porções proteoliticamente dissociadas ou preparadas de modo recombinante de uma molécula de anticorpo que são capazes de reagir seletivamente com uma certa proteína. Os exemplos não limitativos de tais fragmentos proteolíticos e/ou recombinantes incluem Fab, F(ab')2, Fab', Fv, e anticorpos de cadeia simples (scFv) contendo um domínio V[L] e/ou V[H] unido por uma unidade de ligação peptídica. Os scFv podem ser covalentemente ou não covalentemente ligados para formar anticorpos possuindo dois ou mais sítios de ligação. A presente invenção inclui 18 preparações policlonais, monoclonais ou outras purificadas de anticorpos e anticorpos recombinantes. 0 termo "aptâmero," aqui utilizado indistintamente com o termo "ligando de ácido nucleico," significa um ácido nucleico que, através da sua capacidade para adotar uma conformação tridimensional especifica, se liga e tem um efeito antagonista (isto é, inibidor) num alvo. 0 alvo da presente invenção é PDGF ou VEGF (ou um dos seus recetores cognatos PDGFR ou VEGFR) e, por esse motivo, é utilizado o termo aptâmero ou ligando de ácido nucleico de PDGF ou aptâmero ou ligando de ácido nucleico de VEGF (ou aptâmero ou ligando de ácido nucleico de PDGFR ou aptâmero ou ligando de ácido nucleico de VEGFR). A inibição do alvo pelo aptâmero pode ocorrer por ligação do alvo, alterando cataliticamente o alvo, reagindo com o alvo de um modo que modifica/altera o alvo ou a atividade funcional do alvo, ligando-se covalentemente ao alvo como num inibidor suicida, facilitando a reação entre o alvo e outra molécula. Os aptâmeros podem ser constituídos por múltiplas unidades de ribonucleótidos, unidades de desoxirribonucleótidos, ou uma mistura de ambos os tipos de resíduos de nucleótidos. Os aptâmeros podem compreender ainda uma ou mais unidades centrais de bases, açúcares ou fosfato modificadas como aqui descritas em mais pormenor.

Por "anticorpo antagonista" pretende-se referir uma molécula de anticorpo como aqui definida que é capaz de bloquear ou reduzir significativamente uma ou mais atividades de um PDGF ou VEGF alvo. Por exemplo, um anticorpo inibidor de VEGF pode inibir ou reduzir a aptidão do VEGF para estimular a angiogénese.

Uma sequência de nucleótidos é "complementar" a outra sequência de nucleótidos se cada uma das bases das duas 19 sequências se associarem, isto é, são capazes de formar pares de bases de Watson Crick. 0 termo "cadeia complementar" é aqui utilizado indistintamente com o termo "complemento." 0 complemento de uma cadeia de ácido nucleico pode ser o complemento de uma cadeia codificadora ou o complemento de uma cadeia não codificadora.

As frases "resíduo conservado" ou "substituição conservadora de aminoácido" referem-se a agrupamentos de aminoácidos com base em certas propriedades comuns. Uma maneira funcional para definir propriedades comuns entre aminoácidos individuais é analisar as frequências normalizadas de alterações de aminoácido entre proteínas correspondentes de organismos homólogos. De acordo com essas análises, podem ser definidos grupos de aminoácidos em que os aminoácidos de um grupo trocam preferencialmente uns com os outros e, por conseguinte, assemelham-se uns aos outros principalmente no que se refere ao seu impacto na estrutura global da proteína (Schulz, G. E. e R. H. Schirmer, Principies of Protein Structure, Springer-Verlag). Os exemplos de grupos de aminoácidos definidos deste modo incluem: (i) um grupo carregado, consistindo de Glu e Asp, Lys, Arg e His, (ii) um grupo carregado positivamente, consistindo de Lys, Arg e His, (iii) um grupo carregado negativamente, consistindo de Glu e Asp, (iv) um grupo aromático, consistindo de Phe, Tyr e Trp, (v) um grupo de anel de azoto, consistindo de His e Trp, (vi) um grupo apoiar alifático grande, consistindo de Vai, Leu e Ile, (vii) um grupo ligeiramente polar, consistindo de Met e Cys, (viii) um grupo de resíduos pequenos, consistindo de Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gin e Pro, 20 (ix) um grupo alifático consistindo de Vai, Leu, Ile, Met e Cys, e (x) um grupo hidroxilo pequeno consistindo de Ser e Thr.

Além dos grupos apresentados acima, cada resíduo de aminoácido pode formar o seu próprio grupo, e o grupo formado por um aminoácido individual pode ser simplesmente referido pela abreviatura de uma e/ou três letras para esse aminoácido geralmente utilizadas na técnica. O termo "interagem" como aqui utilizado destina-se a incluir relações ou associações detetáveis (por exemplo, interações bioquímicas) entre moléculas, tal como a interação entre proteína-proteína, proteína-ácido nucleico, ácido nucleico-ácido nucleico, e proteína-molécula pequena ou ácido nucleico-molécula pequena na natureza. O termo "proteína de interação" refere-se a uma proteína capaz de interagir, ligar e/ou associar-se de outro modo a uma proteína de interesse, tal como por exemplo uma proteína PDGF ou um VEGF, ou seus recetores cognatos correspondentes.

O termo "isolado" como aqui utilizado em relação a ácidos nucleicos, tais como ADN ou ARN, refere-se a moléculas separadas de outros ADNs, ou ARNs, respetivamente que estão presentes na fonte natural da macromolécula. Analogamente, o termo "isolado" como aqui utilizado em relação a polipéptidos refere-se a moléculas de proteína separadas de outras proteínas que estão presentes na fonte do polipéptido. O termo isolado como aqui utilizado também refere-se a um ácido nucleico ou péptido que está substancialmente isento de material celular, material virai ou meio de cultura quando produzido por técnicas de ADN 21 recombinante, ou precursores químicos ou outras substâncias químicas quando sintetizado quimicamente. "Ácido nucleico isolado" destina-se a incluir fragmentos de ácido nucleico, que não ocorrem naturalmente como fragmentos e não seriam encontrados no estado natural. 0 termo "isolado" também é aqui utilizado para referir polipéptidos que são isolados de outras proteínas celulares e pretende abranger polipéptidos purificados e recombinantes.

Como aqui utilizados, os termos "etiqueta" e "etiqueta detetável" referem-se a uma molécula capaz de ser detetada, incluindo, mas não estando limitada a, isótopos radioativos, fluoróforos, unidades quimioluminescentes, enzimas, substratos enzimáticos, cofatores enzimáticos, inibidores de enzimas, corantes, iões de metais, ligandos (por exemplo, biotina ou haptenos) e semelhantes. 0 termo "fluorescer" refere-se a uma substância ou uma porção da mesma, que é capaz de exibir fluorescência na gama detetável. Os exemplos particulares de etiquetas que podem ser utilizadas na invenção incluem fluoresceina, rodamina, dansilo, umbeliferona, vermelho do Texas, luminol, NADPH, alfa - beta -galatosidase e peroxídase de rábano silvestre. 0 "nível de expressão de um gene numa célula" refere-se ao nível de ARNm, bem como transcrito (s) nascente (s) de pré-ARNm, intermediários de processamento de transcritos, ARNm(s) maduro(s) e produtos de degradação, codificados pelo gene na célula, bem como o nível de proteína traduzida a partir desse gene.

Como aqui utilizado, o termo "ácido nucleico" refere-se a polinucleótidos tais como ácido desoxirribonucleico (ADN), e, quando apropriado, ácido ribonucleico (ARN). 0 termo 22 deve ser também entendido para incluir, como equivalentes, análogos de ARN ou ADN feitos de análogos nucleotidicos, e, como aplicável à forma de realização que está a ser descrita, os polinucleótidos de cadeia simples (mensageiros ou antimensageiros) e dupla, ESTs, cromossomas, ADNcs, ARNms e ARNrs são exemplos representativos de moléculas que podem ser referidas como ácidos nucleicos. 0 termo "oligonucleótido" refere-se a um oligómero ou polimero de monómeros nucleotidicos ou nucleosidicos consistindo de bases naturais, açúcares e ligações interaçúcar (cadeia principal). 0 termo também inclui oligómeros modificados ou substituídos compreendendo monómeros não naturais ou porções destes, que funcionam de modo análogo. A incorporação de oligómeros substituídos baseia-se em fatores incluindo captação celular melhorada, ou maior resistência à nuclease e é escolhida como é conhecido na técnica. 0 oligonucleótido completo ou apenas porções deste podem conter os oligómeros substituídos. 0 termo "por cento idêntico" refere-se à identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleótidos. A identidade pode ser determinada comparando uma posição em cada sequência, as quais podem ser alinhadas para efeitos de comparação. Quando uma posição equivalente nas sequências comparadas é ocupada pelo mesma base ou aminoácido, então as moléculas são idênticas nessa posição; quando o sitio equivalente é ocupado pelo mesmo ou por um residuo de aminoácido semelhante (por exemplo, semelhante em termos de natureza estérica e/ou eletrónica), então as moléculas podem ser referidas como homólogas (semelhantes) nessa posição. A expressão como uma percentagem de homologia, semelhança ou identidade refere-se a uma função do número de aminoácidos idênticos ou semelhantes em posições partilhadas pelas 23 sequências comparadas. Podem ser utilizados vários algoritmos e/ou programas de alinhamento, incluindo o Modelo de Hidden Markov (HMM), FASTA e BLAST. Os HNiM, FASTA e BLAST estão disponíveis através do National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, MD e o European Bioinformatic Institute EBI. Numa forma de realização, a percentagem de identidade de duas sequências pode ser determinada por estes programas GCG com uma ponderação de lacuna de 1, por exemplo, cada lacuna de aminoácido é ponderada como se fosse uma disparidade simples de aminoácido ou nucleótido entre as duas sequências. Outras técnicas de alinhamento são descritas em Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., uma divisão de Harcourt Brace & Co., San Diego, Califórnia, EUA. Quando desejável é utilizado um programa de alinhamento que permite lacunas na sequência para alinhar as sequências. 0 Smith-Waterman é um tipo de algoritmo que permite lacunas em alinhamentos de sequência (ver (1997) Meth. Mol. Biol. 70:173-187). Também pode ser utilizado o programa GAP utilizando o método de alinhamento de Needleman e Wunsch para alinhar as sequências. Mais técnicas e algoritmos, incluindo a utilização do HMM são descritos em Sequence, Structure, and Databanks: A Practical Approach (2000), ed. Oxford University Press, Incorporated e em Bioinformatics: Databases and Systems (1999) ed. Kluwer Academic Publishers. Uma estratégia de pesquisa alternativa utiliza o software MPSRCH, o qual corre num computador MASPAR. O MPSRCH utiliza um algoritmo de Smith-Waterman para classificar sequências num computador paralelo em grande escala. Esta abordagem melhora a capacidade de identificar correspondências relacionadas afastadas e é especialmente tolerante a pequenas lacunas e a erros de sequência de nucleótidos. As 24 sequências de aminoácidos codificadas por ácidos nucleicos podem ser utilizadas para pesquisar bases de dados de proteínas e ADN. Bases de dados com sequências individuais são descritas em Methods in Engymology ed. Doolittle, supra. As bases de dados incluem Genbank, EMBL e DNA Database of Japan (DDBJ). "Perfeitamente condizente" relativamente a uma hélice dupla significa que as cadeias poli- ou oligonucleotídicas que constituem a hélice dupla formam uma estrutura de cadeia dupla uma com a outra de tal forma que cada nucleótido em cada cadeia sofre emparelhamento de base de Watson-Crick com um nucleótido na outra cadeia. 0 termo também compreende o emparelhamento de análogos de nucleósidos, tais como desoxiinosina, nucleósidos com bases 2-aminopurina, e semelhantes, que possam ser utilizados. Uma disparidade numa hélice dupla entre um polinucleótido alvo e um oligonucleótido ou polinucleótido significa que um par de nucleótidos na hélice dupla não consegue sofrer emparelhamento de Watson-Crick. Em relação a uma hélice tripla, o termo significa que a hélice tripla consiste de uma hélice dupla perfeitamente condizente e uma terceira cadeia em que cada nucleótido sofre associação de Hoogsteen ou associação inversa de Hoogsteen com um par de bases da hélice dupla perfeitamente condizente.

Os termos "Interferência de ARN," "ARNi" ou "ARNsi" referem-se todos a qualquer método através do qual a expressão de um gene ou produto de gene é diminuída introduzindo numa célula alvo um ou mais ARNs de cadeia dupla, os quais são homólogos ao gene de interesse (em particular ao ARN mensageiro do gene de interesse, por exemplo, PDGF ou VEGF). 25

As variantes polimórficas também podem abranger "polimorfismos de um único nucleótido" (SNPs) em que a sequência de polinucleótidos difere em uma base (por exemplo, uma variação de uma base no PDGF ou VEGF) . A presença de SNPs pode ser indicativa de, por exemplo, uma certa população, um estado patológico ou uma propensão para um estado patológico. 0 "perfil" de um estado biológico aberrante, por exemplo, de células tumorais, refere-se aos niveis de vários constituintes de uma célula que se alteram em resposta ao estado patológico. Os constituintes de uma célula incluem niveis de ARN, niveis de abundância de proteínas ou niveis de atividade de proteínas. 0 termo "proteina" é aqui utilizado indistintamente com os termos "péptido" e "polipéptido." 0 termo "proteina recombinante" refere-se a uma proteina da presente invenção que é produzida por técnicas de ADN recombinante, em que, em geral, o ADN que codifica a proteina ou ARN expressado é inserido num vetor de expressão adequado, o qual é por sua vez utilizado para transformar uma célula hospedeira para produzir a proteina ou ARN heterólogo. Além do mais, a frase "derivado de," em relação a um gene recombinante que codifica a proteina recombinante destina-se a incluir no significado de "proteina recombinante" aquelas proteínas que têm uma sequência de aminoácidos de uma proteina nativa ou uma sequência de aminoácidos semelhante àquela, a qual é gerada por mutações, incluindo substituições e supressões, de uma proteina natural.

Como aqui utilizado, o termo "transgene" significa uma sequência de ácido nucleico (que codifica, por exemplo, um dos ácidos nucleicos alvos, ou um transcrito antimensageiro do mesmo), que foi introduzida numa célula. Um transgene 26 poderia ser parcial ou totalmente heterólogo, isto é, externo, ao animal transgénico ou célula no qual é introduzido, ou, é homólogo a um gene endógeno do animal transgénico ou célula no qual é introduzido, mas o qual é concebido para ser inserido, ou é inserido, no genoma do animal de modo a alterar o genoma da célula no qual é inserido (por exemplo, ele é inserido numa localização diferente daquela do gene natural ou a sua inserção resulta num gene anulado). Um transgene também pode estar presente numa célula na forma de um epissoma. Um transgene pode incluir uma ou mais sequências reguladoras da transcrição e qualquer outro ácido nucleico, tais como intrões, que possam ser necessários para a expressão ótima de um ácido nucleico selecionado.

Por "distúrbio neovascular" pretende-se referir um distúrbio caracterizado por angiogénese alterada ou não regulada que não é uma transformação oncogénica ou neoplásica concomitante, isto é, cancro. Exemplos de distúrbios neovasculares incluem psoríase, artrite reumatoide, e distúrbios neovasculares oculares incluindo retinopatia diabética e degenerescência macular relacionada com a idade.

Como aqui utilizados, os termos "neovascularização" e "angiogénese" são utilizados indistintamente. Neovascularização e angiogénese referem-se à geração de novos vasos sanguíneos nas células, tecido ou órgãos. 0 controlo da angiogénese está tipicamente alterado em certos estados patológicos e, em muitos casos, o dano patológico associado à doença está relacionado com angiogénese alterada, não regulada ou não controlada. A angiogénese não regulada, persistente ocorre numa multiplicidade de estados patológicos, incluindo aqueles caracterizados pelo crescimento anormal de células endoteliais e suporta o dano 27 patológico observado nestas condições incluindo a fuga e permeabilidade de vasos sanguíneos.

Por "distúrbio neovascular ocular" pretende-se referir um distúrbio caracterizado por angiogénese alterada ou não regulada no olho de um doente. Os distúrbios neovasculares oculares ilustrativos incluem neovascularização do disco ótico, neovascularização da iris, neovascularização retiniana, neovascularização coroideia, neovascularização da córnea, neovascularização vitrea, glaucoma, pannus, pterigio, edema macular, retinopatia diabética, edema macular diabético, retinopatia vascular, degenerescência retiniana, uveite, doenças inflamatórias da retina e vitreorretinopatia proliferativa. 0 termo "tratar" uma doença neovascular num indivíduo ou "tratar" um indivíduo possuindo uma doença neovascular refere-se a submeter o indivíduo a um tratamento farmacêutico, por exemplo, à administração de um fármaco, de tal forma que é diminuído pelo menos um sintoma da doença neovascular. Por conseguinte, o termo "tratar" como aqui utilizado destina-se a abranger a cura bem como o melhoramento de pelo menos um sintoma da condição ou doença neovascular. Por conseguinte, "tratar" como aqui utilizado, inclui administrar ou prescrever uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de um distúrbio neovascular ocular.

Por "doente" pretende-se referir qualquer animal. 0 termo "animal" inclui mamíferos, incluindo, mas não estando limitado a, humanos e outros primatas. 0 termo também inclui animais domesticados, tais como vacas, porcos, ovelhas, cavalos, cães e gatos. 28

Por "PDGF" ou "fator de crescimento derivado de plaquetas" pretende-se referir um fator de crescimento derivado de plaquetas mamifero que afeta a angiogénese ou um processo angiogénico. Como aqui utilizado, o termo "PDGF" inclui os vários subtipos de PDGF incluindo PDGF-B (ver Figura 1 (A) e (B)) e PDGF-A (ver Figura 1 (C) e (D)). Além disso, como aqui utilizado, o termo "PDGF" refere-se a fatores angiogénicos relacionados com PDGF tais como PDGF-C e PDGF-D que atuam através de um recetor cognato de PDGF para estimular a angiogénese ou um processo angiogénico. Em particular, o termo "PDGF" significa qualquer membro da classe de fatores de crescimento que (i) se ligam a um recetor de PDGF tal como PDGFR-B (ver Figura 3 (A) e (B)), ou PDGFR-A (ver Figura 3 (C) e (D)); (ii) ativa uma atividade tirosina-cinase associada ao recetor de VEGF; e (iii) afeta, desse modo, a angiogénese ou um processo angiogénico. Como aqui utilizado, o termo "PDGF" refere-se geralmente àqueles membros da classe de fatores de crescimento que induzem a sintese de ADN e mitogénese através da ligação e ativação de um recetor do fator de crescimento derivado de plaquetas da superfície celular (isto é, PDGFR) num tipo de célula reativo. Os PDGFs realizam efeitos biológicos específicos incluindo, por exemplo: migração celular dirigida (quimiotaxia) e ativação celular; ativação de fosfolipase; recirculação de fosfatidilinositol e metabolismo de prostaglandinas aumentados; estimulação da síntese de colagénio e colagenase por células reativas; alteração das atividades metabólicas celulares, incluindo síntese de matriz, produção de citocinas e captação de lipoproteínas; indução, indiretamente, de uma resposta proliferativa em células que carecem de recetores de PDGF; e atividade vasoconstritora potente. 0 termo "PDGF" destina-se a incluir tanto um polipéptido de "PDGF" como o seu gene ou ácido nucleico correspondente que codifica o "PDGF". 29

Por "PDGF-A" pretende-se referir um polipéptido de cadeia A de PDGF e o seu gene ou ácido nucleico codificador correspondente.

Por "PDGF-B" pretende-se referir um polipéptido de cadeia B de PDGF e o seu gene ou ácido nucleico codificador correspondente.

Por "VEGF," ou "fator de crescimento do endotélio vascular," pretende-se referir um fator de crescimento do endotélio vascular mamífero que afeta a angiogénese ou um processo angiogénico. Como aqui utilizado, o termo "VEGF" inclui os vários subtipos de VEGF (também conhecido como fator de permeabilidade vascular (VPF) e VEGF-A) (ver Figura 2 (A) e (B) ) que surgem, por exemplo, por excisão-união alternativa do gene de VEGF-A/VPF incluindo VEGF12i, VEGFies e VEGFi89. Além disso, como aqui utilizado, o termo "VEGF" refere-se a fatores angiogénicos relacionados com VEGF tal como PIGF (fator de crescimento da placenta) , VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e VEGF-E que atuam através de um recetor cognato de VEFG para estimular a angiogénese ou um processo angiogénico. Em particular, o termo "VEGF" significa qualquer membro da classe de fatores de crescimento que (i) se ligam a um recetor de VEGF tal como VEGFR-1 (Flt-1) (ver Figura 4 (A) e (B)), VEGFR-2 (KDR/Flk-I) (ver Figura 4 (C) e (D)), ou VEGFR-3 (FLT-4); (ii) ativa uma atividade tirosina-cinase associada ao recetor de VEGF; e (iii) afeta, desse modo, a angiogénese ou um processo angiogénico. O termo "VEGF" destina-se a incluir tanto um polipéptido de "VEGF" e seu gene ou ácido nucleico correspondente que codifica o "VEGF".

Por "antagonista de PDGF" pretende-se referir um agente que reduz, ou inibe, parcial ou completamente, a atividade ou produção de um PDGF. Um antagonista de PDGF pode reduzir ou 30 inibir, direta ou indiretamente, um PDGF especifico tal como o PDGF-B. Além disso, os "antagonistas de PDGF" coerentes com a definição acima de "antagonista," podem incluir agentes que atuam num ligando de PDGF ou no seu recetor cognato de modo a reduzir ou inibir um sinal recetor associado a PDGF. Os exemplos desses "antagonistas de PDGF" incluem, assim, por exemplo: composições antimensageiras, de ribozimas ou de ARNi que visam um ácido nucleico de PDGF; aptâmeros anti-PDGF, anticorpos anti-PDGF ou engodos recetores de PDGF solúveis que impedem a ligação de um PDGF ao seu recetor cognato; composições antimensageiras, de ribozimas ou de ARNi que visam um ácido nucleico de recetor cognato de PDGF (PDGFR); aptâmeros anti-PDGFR ou anticorpos anti-PDGFR que se ligam a um recetor cognato de PDGFR; e inibidores de tirosina-cinase de PDGFR.

Por "antagonista de VEGF" pretende-se referir um agente que reduz ou inibe, parcial ou completamente, a atividade ou produção de um VEGF. Um antagonista de VEGF pode reduzir ou inibir direta ou indiretamente um VEGF especifico tal como VEGFi65. Além disso, os "antagonistas de VEGF" coerentes com a definição acima de "antagonista," podem incluir agentes que atuam num ligando de VEGF ou seu recetor cognato de modo a reduzir ou inibir um sinal recetor associado a VEGF. Os exemplos de tais "antagonistas de VEGF" incluem, assim, por exemplo: composições antimensageiras, de ribozimas ou de ARNi que visam um ácido nucleico de VEGF; aptâmeros anti-VEGF, anticorpos anti-VEGF ou engodos recetores de VEGF solúveis que impedem a ligação de um VEGF ao seu recetor cognato; composições antimensageiras, de ribozimas ou de ARNi que visam um ácido nucleico do recetor cognato de VEGF (VEGFR); aptâmeros anti-VEGFR ou anticorpos anti-VEGFR que se ligam a um recetor cognato de VEGFR; e inibidores de tirosina-cinase de VEGFR. 31

Por "uma quantidade suficiente para suprimir um distúrbio neovascular" pretende-se referir a quantidade eficaz de um antagonista, numa associação da invenção, necessária para tratar ou prevenir um distúrbio neovascular ou sintoma do mesmo. A "quantidade eficaz" dos antagonistas ativos utilizados na prática da presente invenção para o tratamento terapêutico de condições provocadas ou que contribuem para o distúrbio neovascular varia dependendo do modo de administração, localização anatómica do distúrbio neovascular, da idade, peso corporal e estado de saúde geral do doente. Em última análise, um médico ou veterinário decidirá a quantidade e regímen de dosagem apropriados. Essa quantidade é referida como uma quantidade suficiente para suprimir um distúrbio neovascular.

Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada que se segue e a partir das reivindicações.

Uma "variante" do polipéptido X refere-se a um polipéptido possuindo a sequência de aminoácidos do péptido X que está modificada em um ou mais resíduos de aminoácido. A variante pode ter alterações "conservadoras", em que um aminoácido substituído tem propriedades estruturais ou químicas semelhantes (por exemplo, substituição de leucina por isoleucina). Mais raramente, uma variante pode ter alterações "não conservadoras" (por exemplo, substituição de glicina por triptofano). Variações menores análogas também podem incluir supressões ou inserções de aminoácidos, ou ambas. Orientação sobre a determinação de que resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou suprimidos sem anular a atividade biológica ou imunológico pode ser encontrada utilizando programas de computador bem conhecidos na técnica, por exemplo, software LASERGENE (DNASTAR). 32 0 termo "variante," quando utilizado no contexto de uma sequência de polinucleótidos, pode abranger uma sequência de polinucleótidos relacionada com a do gene ou a sequência de codificação da mesma. Esta definição também pode incluir, por exemplo, variantes "alélicas", "de excisão-união", "de espécie" ou "polimórficas". Uma variante de excisão-união pode ter uma identidade significativa com uma molécula de referência, mas terá geralmente um maior ou menor número de polinucleótidos devido à excisão-união alternativa de exões durante o processamento de ARNm. 0 polipéptido correspondente pode possuir dominios funcionais adicionais ou uma ausência de dominios. As espécies variantes são sequências de polinucleótidos que variam de uma espécie para outra. Os polipéptidos resultantes terão geralmente uma identidade de aminoácidos significativa uns em relação aos outros. Uma variante polimórfica é uma variação na sequência de polinucleótidos de um gene particular entre indivíduos de uma dada espécie. 0 termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor útil é um epissoma, isto é, um ácido nucleico capaz de replicação extra-cromossómica. Os vetores úteis são aqueles capazes de replicação autónoma e/ou expressão de ácidos nucleicos aos quais estão ligados. Os vetores capazes de orientar a expressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados são aqui referidos como "vetores de expressão". Em geral, os vetores de expressão de utilidade nas técnicas de ADN recombinante estão frequentemente na forma de "plasmídeos" os quais se referem geralmente a ansas circulares de ADN de cadeia dupla os quais, na sua forma de vetor não estão ligados ao cromossoma. Na presente especificação, "plasmídeo" e "vetor" são utilizados indistintamente já que o plasmídeo é a forma de vetor mais geralmente utilizada. 33

Terapia de associação A invenção baseia-se, em parte, na inibição especifica de ambas as atividades de VEGF e PDGF utilizando antagonistas de fator de crescimento apropriados como um tratamento potente para doentes possuindo um distúrbio neovascular. A administração de uma associação de um antagonista de PDGF e um antagonista de VEGF proporciona maiores benefícios terapêuticos para o tratamento de um distúrbio neovascular ocular do que quaisquer dos antagonistas administrados sozinhos. A ação combinada de agentes anti-VEGF e anti-PDGF é inesperada à luz de estudos que não evidenciam qualquer cooperação evidente entre os dois fatores na estimulação da angiogénese num sistema de células endoteliais retinianas (ver Castellon et al., (2001) Exp. Eye Res. 74: 523-35) .

Os PDGF e VEGF são estímulos importantes para o crescimento de novos vasos sanguíneos em todo o corpo, especialmente no olho. A terapia de associação dirigida à inibição de ambas as atividades biológicas de PDGF e VEGF proporciona um método de tratamento ou prevenção do distúrbio neovascular.

Por conseguinte, a invenção refere-se a antagonistas de PDGF e antagonistas de VEGF e a composições para suprimir um distúrbio neovascular ocular utilizando terapia de associação. Em particular, a presente invenção utiliza duas vias de sinalização de comunicação intercelular distintas que estão ativas em células vasculares, nomeadamente a sinalização de PDGF e VEGF, como alvos terapêuticos no tratamento de um distúrbio neovascular ocular. Este método de associação é especialmente útil para o tratamento de qualquer número de doenças e distúrbios oftalmológicos caracterizados pelo desenvolvimento de neovascularização ocular, incluindo, mas não estando limitado a, neovascularização do disco ótico, neovascularização da 34 íris, neovascularização retiniana, neovascularização coroideia, neovascularização da córnea, neovascularização vítrea, glaucoma, pannus, pterígio, edema macular, edema macular diabético, retinopatia vascular, degenerescência retiniana, degenerescência macular, uveíte, doenças inflamatórias da retina e vitreorretinopatia proliferativa. A terapia de associação, consistindo de antagonistas que inibem a sinalização de PDGF (tal como PDGF-B) e VEGF (tal como VEGF-A) resulta num aumento da eficácia de tratamento em comparação com a utilização independente de qualquer uma das duas terapias. Embora os exemplos discutidos abaixo descrevam a associação de um único antagonista de PDGF e um único antagonista de VEGF, entende-se que pode ser desejável a associação de múltiplos agentes antagonistas. A terapia de associação anti-PDGF e anti-VEGF de acordo com a invenção pode ser realizada sozinha ou em conjunto com outra terapia e pode ser administrada em casa, no consultório do médico, numa clínica, num departamento ambulatório hospitalar ou num hospital. Em geral, o tratamento começa num hospital para que o médico possa observar de perto os efeitos da terapia e fazer quaisquer ajustes que sejam necessários. A duração da terapia de associação depende do tipo de distúrbio neovascular a ser tratado, da idade e condição do doente, da fase e tipo de doença do doente, e da forma como o doente responde ao tratamento. Além disso, uma pessoa que tenha um maior risco de desenvolver um distúrbio neovascular (por exemplo, um doente diabético) pode receber tratamento para inibir ou atrasar o aparecimento dos sintomas. Uma vantagem significativa proporcionada pela presente invenção é que a associação de um antagonista de PDGF e um antagonista de VEGF para o tratamento de um distúrbio neovascular permite a administração de uma dose baixa de cada antagonista e menos antagonista ativo total, proporcionando desse modo 35 uma eficácia semelhante com menos toxicidade e efeitos secundários, e custos reduzidos. A dosagem e a frequência de administração de cada componente da associação podem ser independentemente controladas. Por exemplo, um antagonista pode ser administrado três vezes por dia, enquanto o segundo antagonista pode ser administrado uma vez por dia. A terapia de associação pode ser dada em ciclos periódicos que incluem períodos de descanso para que o corpo do doente tenha uma hipótese de recuperar de quaisquer efeitos secundários ainda inesperados. Os antagonistas também podem ser formulados em conjunto para que uma administração proporcione ambos os antagonistas.

Alvos do antagonista de PDGF e VEGF 0 PDGF foi originariamente isolado de lisados de plaquetas e identificado como a atividade promotora de crescimento principal presente no soro mas não no plasma. Foi inicialmente demonstrado que a atividade mitogénica de PDGF atuava em células de tecido conjuntivo, tais como fibroblastos e células do músculo liso, e em células gliais em cultura. Foram identificadas duas isoformas homólogas de PDGF, PDGF A e B, as quais são codificadas por genes separados (nos cromossomas 7 e 22). A espécie mais abundante da plaqueta é o heterodímero AB, embora todos os três dímeros possíveis (AA, AB e BB) ocorram naturalmente. Após tradução, os dímeros de PDGF são processados em proteínas segregadas de aproximadamente 30 kDa.

Foram identificadas duas proteínas da superfície celular que ligam o PDGF com afinidade elevada, alfa e beta (Heldin et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 78: 3664;

Williams et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 79: 36 5867). Ambas as espécies contêm cinco domínios extracelulares tipo imunoglobulina, um único domínio transmembranar e um domínio tirosina-cinase intracelular separados por um domínio de inserção de cinase. Nos últimos anos foram elucidadas as especificidades das três isoformas de PDGF para os três dímeros recetores (alfa/alfa, alfa/beta e beta/beta). 0 homodímero recetor alfa liga todas as três isoformas de PDGF com afinidade elevada, o homodímero recetor beta liga apenas o PDGF BB com afinidade elevada e o PDGF AB com aproximadamente 10 vezes menos afinidade e o heterodímero recetor alfa/beta liga os PDGF BB e PDGF AB com afinidade elevada (Westermark & Heldin (1993) Acta Oncológica 32:101). O padrão de especificidade parece resultar da aptidão da cadeia A para se ligar apenas ao recetor alfa e da cadeia B para se ligar a ambas as subunidades de recetor alfa e beta com afinidade elevada.

Em geral, a invenção proporciona agentes que inibem uma ou mais atividades de PDGF. Estes agentes inibidores de PDGF, ou antagonistas de PDGF podem atuar em uma ou mais formas do ligando de PDGF. Os fatores de crescimento derivados de plaquetas incluem homo- ou heterodímeros da cadeia A (PDGF-A) e cadeia B (PDGF-B) que realizam a sua ação através da ligação e dimerização de duas tirosina-cinases de recetor relacionadas, recetores [alfa] (PDGFR-[alfa]) e recetores [beta] (PDGFR-[beta]). Além disso foram identificados os PDGF-C e PDGF-D, dois ligandos ativados por protéase novos para os complexos de PDGFR, (ver Li el al., (2000) Nat. Cell. Biol. 2: 302-9; Bergsten et al., (2001) Nat. Cell. Biol. 3: 512-6; e Uutele et al., (2001) Circulation 103: 2242-47). Devido às diferentes especificidades de ligação a ligando dos PDGFRs sabe-se que o PDGFR-[alfa][alfa] ligas os PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB e PDGF-CC; o PDGFR-[beta] [beta] liga os PDGF-BB e PDGF-DD; enquanto que o PDGFR-[alfa][beta] liga os PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC e 37 PDGF-DD (ver Betsholtz et al., (2001) BioEssays 23: 494- 507) . O VEGF é um homodímero ligado por dissulfureto segregado que estimula seletivamente as células endoteliais para proliferar, migrar e produzir enzimas de degradação da matriz (Conn et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 87:1323-1327); Ferrara e Henzel (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun,161: 851-858; Pepper et al., (1991) Biochem.

Biophys. Res. Commun. 181:902-906; Unemori et al., (1992) J. Cell. Physiol. 153:557-562), os quais são todos processos necessários para a formação de novos vasos. O VEGF ocorre em quatro formas (VEGF-121, VEGF-165, VEGF-189, VEGF-206) em consequência da excisão-união alternativa do gene de VEGF (Houck et al., (1991) Mol. Endocrinol. 5:1806- 1814; Tischer et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:11947- 11954). As duas formas mais pequenas são difusiveis enquanto que as duas formas maiores permanecem predominantemente localizadas na membrana celular como uma consequência da sua afinidade elevada para a heparina. O VEGF-165 também se liga à heparina e é a forma mais abundante. 0 VEGF-121, a única forma que não se liga à heparina, parece ter uma afinidade inferior para os recetores de VEGF (Gitay-Goren et al., (1996) J. Biol.

Chem. 271:5519-5523) bem como uma potência mitogénica menor (Keyt et al., (1996) J. Biol. Chem. 271:7788-7795). Os efeitos biológicos de VEGF são mediados por dois recetores tirosina-cinase (Flt-1 e Flk-l/KDR) cuja expressão está altamente restringida a células de origem endotelial (de Vries et al., (1992) Science 255:989-991; Millauer et al., (1993) Cell 72:835-846; Terman et al., (1991) Oncogene 6:519-524). Embora a expressão de ambos os recetores funcionais seja necessária para ligação de afinidade elevada, a sinalização quimiotáctica e mitogénica em células endoteliais parece ocorrer principalmente através 38 do recetor KDR (Park et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:25646, 25654; Seetharam et al., (1995) Oncogene 10:135- 147; Waltenberger et al., (1994) J.Bol. Chem. 26988-26995). Foi recentemente demonstrada a importância do VEGF e dos recetores de VEGF para o desenvolvimento de vasos sanguíneos em ratos que carecem de um único alelo para o gene de VEGF (Carmeliet et al., (1996) Nature 380:435-439;

Ferrara et al., (1996) Nature 380:439-442) ou de ambos os alelos dos genes de Flt-1 (Fong et al., (1995) Nature 376:66-70) ou Flk-1 (Shalaby et al., (1995) Nature 376:62- 66) . Em cada um dos casos foram observadas anormalidades distintas na formação dos vasos que resultaram em letalidade embrionária.

Sabe-se agora que a angiogénese de compensação induzida pela hipoxia de tecido é mediada por VEGF (Levy et al., (1996).J Biol. Chem. 2746-2753); Shweiki et al., (1992)

Nature 359:843-845). Estudos em humanos mostraram que concentrações elevadas de VEGF estão presentes no corpo vítreo em distúrbios angiogénicos retinianos mas não em estados patológicos inativos ou sem neovascularização. Tecido coroidal humano extirpado após cirurgia submacular experimental também mostraram níveis elevados de VEGF.

Além de ser o único mitogénio específico de células endoteliais conhecido, o VEGF é único entre os fatores angiogénicos de crescimento quanto à sua capacidade para induzir um aumento transitório na permeabilidade dos vasos sanguíneos às macromoléculas (por isso o seu nome original e alternativo, fator de permeabilidade vascular, VPF) (ver Dvorak et al, (1979) J.Immunol. 122:166-174; Senger et al., (1983) Science 219:983-985; Senger et al., (1986) Câncer

Res, 46:5629-5632). A maior permeabilidade vascular e a deposição resultante de proteínas do plasma no espaço extravascular ajuda à formação do vaso novo proporcionando 39 uma matriz provisória para a migração de células endoteliais (Dvorak et al., (1995) Am. J. Pathol. 146:1029- 1039). A hiperpermeabilidade é na realidade uma particularidade caracteristica dos vasos novos, incluindo aqueles associados a tumores.

Antagonistas de PDGF e VEGF A seguir é discutida um grande variedade de antagonistas de PDGF e VEGF. As reivindicações incluem uma associação de antagonistas especificos de PDGF e VEGF, antagonistas especificos esses que são compreendidos pela grande variedade de antagonistas de PDGF e VEGF como aqui discutidos. Embora muitos dos antagonistas de PDGF e VEGF como referidos abaixo não sejam referidos nas reivindicações, a referência aos mesmos é mantida para fins ilustrativos.

Geral A invenção proporciona antagonistas (isto é, inibidores) de PDGF e VEGF para serem utilizados em conjunto na terapia de associação para distúrbios neovasculares. Antagonistas de PDGF e antagonistas de VEGF especificos são conhecidos na técnica e são descritos resumidamente nas secções que se seguem. Ainda outros antagonistas de PDGF e antagonistas de VEGF que estão agora, ou se tornaram, disponíveis para especialista incluem as composições de anticorpos, aptâmeros, oligómeros antimensageiros, ribozimas e de ARNi que podem ser identificadas e produzidas utilizando práticas que são de rotina na técnica em conjunto com os ensinamentos e orientação da especificação, incluindo as secções adicionalmente proporcionadas que surgem abaixo.

Antagonismos de PDGF 40 A seguir é divulgada uma série de antagonistas de PDGF. Embora muitos dos antagonistas de PDGF como referidos abaixo não sejam referidos nas reivindicações, a referência aos mesmos é mantida para fins ilustrativos. Geralmente, a inibição do PDGF (por exemplo, PDGF-B) pode ser conseguida de uma variedade de maneiras. Por exemplo, uma variedade de antagonistas de PDGF que inibem a atividade ou produção de PDGF encontra-se disponível e pode ser utilizada na presente invenção. Os antagonistas de PDGF ilustrativos incluem ligandos de ácido nucleico ou aptâmeros de PDGF, tais como aqueles descritos abaixo. Alternativamente, o antagonista de PDGF pode ser, por exemplo, um anticorpo anti-PDGF ou fragmento de anticorpo. Deste modo, a molécula de PDGF é tornada inativa inibindo a sua ligação a um recetor. Moléculas de ácido nucleico tais como ARN antimensageiro, ribozimas e moléculas de ARNi que inibem a expressão de PDGF ao nível do ácido nucleico são divulgadas como antagonistas na invenção. Outros antagonistas de PDGF incluem péptidos, proteínas, péptidos cíclicos ou compostos orgânicos pequenos. Além disso, a atividade de sinalização de PDGF pode ser inibida interrompendo a sua sinalização a jusante, por exemplo, utilizando um número de antagonistas inibidores de tirosina-cinase de molécula pequena incluindo aqueles descritos abaixo. A aptidão de um composto ou agente para servir como um antagonista de PDGF pode ser determinada de acordo com os métodos conhecidos na técnica e, além disso, como definidos em, por exemplo, Dai et al., (2001) Genes & Dev. 15: 1913-25; Zippel, et al., (1989) Eur. J. Cell Biol. 50(2):428-34; e Zwiller et al. , (1991) Oncogene 6: 219-21.

Por exemplo, na técnica são conhecidos anticorpos inibidores dirigidos contra PDGF, por exemplo, aqueles descritos nas Patentes U.S. n° 5,976,534, 5,833,986, 5, 817,310, 5, 882, 644, 5, 662, 904, 5, 620, 687, 5,468,468, e 41 PCT WO 2003/025019. Além disso, a invenção inclui derivados de N-fenil-2-pirimidina-amina que são antagonistas de PDGF, tais como aqueles divulgados na Patente U.S. n° 5,521,184, bem como WO2003/013541, W02003/078404, W02003/099771, W02003/015282 e W02004/05282.

Na técnica são conhecidas moléculas pequenas que bloqueiam a ação do PDGF, por exemplo, aquelas descritas nas Patentes U.S. n ° 6, 528,526 (inibidores de tirosina-cinase de PDGFR), 6,524, 347 (inibidores de tirosina-cinase de PDGFR), 6,482, 834 (inibidores de tirosina-cinase de PDGFR), 6,472, 391 (inibidores de tirosina-cinase de PDGFR), 6,696, 434, 6,331,555, 6, 251 , 905, 6,245, 760, 6, 207,667, 5,990,141, 5,700,822, 5,618,837 e 5,731,326.

Na técnica são conhecidas proteínas e polipéptidos que bloqueiam a ação de PDGF, por exemplo, aquelas descritas nas Patentes U.S. n° 6,350,731 (análogos peptídicos de PDGF), 5,952,304.

Na técnica são conhecidos compostos de bis arilo e heteroarilo mono- e bicíclico que inibem o recetor tirosina-cinase de EGF e/ou PDGF, por exemplo, aqueles descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. n° 5,476,851, 5, 480,883, 5, 656, 643, 5, 795, 889 e 6, 057,320.

Na técnica são conhecidos oligonucleótidos antimensageiros para a inibição de PDGF, por exemplo, aqueles descritos nas Patentes U.S. n° 5,869,462 e 5,821,234,

Na técnica são conhecidos aptâmeros (também conhecidos como ligandos de ácido nucleico) para a inibição de PDGF, por exemplo, aqueles descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. n° 6, 582, 918, 6,229, 002, 6,207,816, 5, 668,264, 5, 674,685 e 5,723,594, 42

Outros compostos para inibir o PDGF conhecidos na técnica incluem aqueles descritos nas Patentes U.S. n° 5, 238,950, 5,418,135, 5,674,892, 5,693,610, 5,700,822, 5, 700,823, 5,728,726, 5,795, 910, 5,817,310, 5,872,218, 5, 932,580, 5, 932, 602, 5, 958, 959, 5, 990, 141, 6, 358, 954, 6, 537, 988 e 6, 673,798 .

Antagonistas de VEGF A seguir é divulgada uma série de antagonistas de VEGF. Embora muitos dos antagonistas de VEGF como referidos abaixo não sejam referidos nas reivindicações, a referência aos mesmos é mantida para fins ilustrativos. A inibição de VEGF (por exemplo, VEGF-A) é conseguida de uma variedade de maneiras. Por exemplo, encontra-se disponível uma variedade de antagonistas de VEGF que inibem a atividade ou produção de VEGF, incluindo moléculas de ácido nucleico tais como aptâmeros, ARN antimensageiro, ribozimas, moléculas de ARNi e anticorpos contra VEGF. Os aptâmeros são utilizados na presente invenção. Os antagonistas de VEGF incluem ligandos de ácido nucleico ou aptâmeros de VEGF, tais como aqueles descritos abaixo. Um antagonista para o VEGF-A é ο EYE001 (anteriormente referido como NX1838), o qual é um aptâmero modificado, PEGuilado que se liga com afinidade elevada e especifica à isoforma de VEGF humano solúvel principal (ver, Patentes U.S. n° 6,011,020; 6,051,698; e 6,147,204). O aptâmero liga e inativa o VEGF de um modo semelhante ao de um anticorpo de afinidade elevada dirigido para o VEGF. Outro aptâmero de VEGF é ο EYE001 na sua forma não peguilada. Um antagonista de VEGF como compreendido pela invenção pode ser, por exemplo, um anticorpo anti-VEGF ou fragmento de anticorpo. Deste modo, a molécula de VEGF é tornada inativa inibindo a sua ligação a um recetor. Além disso, as moléculas de ácido nucleico tais como ARN antimensageiro, 43 ribozimas e moléculas de ARNi que inibem a expressão de VEGF ou a estabilidade do ARN ao nivel nucleico são antagonistas. Outros antagonistas de VEGF incluem péptidos, proteínas, péptidos ciclicos e compostos orgânicos pequenos. Por exemplo, as formas truncadas solúveis de VEGF que se ligam ao recetor de VEGF sem atividade de sinalização concomitante também servem como antagonistas. Além disso, a atividade de sinalização do VEGF pode ser inibida interrompendo a sua sinalização a jusante, por exemplo, utilizando um número de antagonistas incluindo inibidores de molécula pequena de uma atividade tirosina-cinase do recetor de VEGF, como descrito em mais pormenor abaixo. A aptidão de um composto ou agente para servir como um antagonista de VEGF pode ser determinada de acordo com qualquer de um número de métodos correntes bem conhecidos na técnica. Por exemplo, uma das atividades biológicas do VEGF consiste em aumentar a permeabilidade vascular através da ligação especifica a recetores em células endoteliais vasculares. A interação resulta no relaxamento das junções endoteliais apertadas com fuga subsequente de liquido vascular. A fuga vascular induzida por VEGF pode ser medida in vivo seguindo a fuga de Corante Azul de Evans da vasculatura do porquinho-da-índia como uma consequência de uma injeção intradérmica de VEGF (Dvorak et al., in Vascular Permeability Factor/Vascular Endothelial Growth Factor, Microvascular Hyperpermeability, and Angiogenesis; and (1995) Am. J. Pathol. 146:1029. Analogamente, o ensaio pode ser utilizado para medir a aptidão de um antagonista para bloquear esta atividade biológica do VEGF.

Num exemplo útil de um ensaio de permeabilidade vascular, o VEGFies (20-30 nM) é pré-misturado ex vivo com EYE001 (30 nM a 1 μΜ) ou um antagonista de VEGF candidato e 44 subsequentemente administrado por injeção intradérmica na pele rapada no dorso de porquinhos-da-índia. Trinta minutos após injeção, a fuga de corante Azul de Evans em torno dos sítios de injeção é quantificada de acordo com métodos correntes utilizando um sistema de análise morfométrica computarizada. Um composto que inibe a fuga induzida por VEGF do corante indicador a partir da vasculatura é considerado como sendo um antagonista útil nos métodos e composições da invenção.

Outro ensaio para determinar se um composto é um antagonista de VEGF é o chamado ensaio de angiogénese da córnea. Neste ensaio, esferas de polímero de metacrilato contendo VEGFi6s (3 pmol) são implantadas no estroma da córnea de ratazanas para induzir o crescimento de vasos sanguíneos para a córnea normalmente avascular. Um antagonista de VEGF candidato é em seguida administrado por via intravenosa às ratazanas a doses de 1 mg/kg, 3 mg/kg e 10 mg/kg, uma vez ou duas vezes por dia durante 5 dias. No final do intervalo de tratamento, todas as córneas individuais são fotomicrografadas. A extensão em que os novos vasos sanguíneos se desenvolvem no tecido da córnea e a sua inibição pelo composto candidato são então quantificadas por análise morfométrica padronizada das fotomicrografias. Um composto que inibe a angiogénese dependente de VEGF na córnea quando comparado com o tratamento com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) é considerado como sendo um antagonista útil nos métodos e composições da invenção.

Os antagonistas de VEGF também são identificados utilizando o modelo de retinopatia da prematuridade em rato. Num exemplo útil, ninhadas de 9, 8, 8, 7 e 7 ratos, respetivamente, são deixadas ao ar da sala ou mantidas hiperóxicas e são tratadas por via intraperitoneal com soro 45 fisiológico tamponado com fosfato (PBS) ou um antagonista de VEGF candidato (por exemplo, a 1 mg/kg, 3 mg/kg ou 10 mg/kg/dia). O critério do ensaio, excrescência de novos capilares através da membrana limitante interna da retina para o humor vitreo, é em seguida avaliado por identificação microscópica e contagem dos gomos neovasculares em 20 secções histológicas de cada olho de todos os ratos tratados e de controlo. Uma redução na neovasculatura retiniana nos ratos tratados relativamente ao controlo não tratado é tida como identificando um antagonista de VEGF útil.

Ainda noutro ensaio de seleção ilustrativo, os antagonistas de VEGF candidatos são identificados utilizando um ensaio de xenoenxerto de tumor humano in vivo. Neste ensaio de seleção, a eficácia in vivo de um antagonista de VEGF candidato é testada em xenoenxertos de tumor humano (rabdomiossarcoma A673 e tumor de Wilms) implantados em ratos glabros. Os ratos são em seguida tratados com o antagonista de VEGF candidato (por exemplo, 10 mg/kg administrados por via intraperitoneal uma vez por dia após desenvolvimento dos tumores estabelecidos (200 mg)). Os grupos de controlo são tratados com um agente de controlo. Os compostos candidatos identificados como inibindo o crescimento de tumor de rabdomiossarcoma A673 e tumor de Wilms relativamente ao controlo são considerados como sendo antagonistas úteis nos métodos e composições da invenção. Métodos de ensaio adicionais para uma atividade antagonista de VEGF são conhecidos na técnica e descritos em mais pormenor abaixo.

Por exemplo, na técnica são conhecidos anticorpos inibidores dirigidos contra VEGF, por exemplo, agueles descritos nas Patentes U.S. n° 6,524,583, 6,451,764 46 (anticorpos contra VRP), 6,448,077, 6,416,758, 6,403,088 (contra VEGF-C), 6,383,484 (contra VEGF-D), 6,342,221 (anticorpos anti-VEGF), 6,342,219,6,331,301 (anticorpos VEGF-B) e 5,730,977, e publicações PCT WO 96/30046, WO 97/44453 e WO 98/45331.

Na técnica também são conhecidos anticorpos contra os recetores de VEGF, tais como aqueles descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. n° 5,840,301, 5,874,542, 5,955,311, 6,365,157, e publicação PCT WO 04/003211.

Na técnica são conhecidas moléculas pequenas que bloqueiam a ação do VEGF, por exemplo, inibindo uma atividade tirosina-cinase associada a VEGFR, por exemplo, aquelas descritas nas Patentes U.S. n° 6,514,971, 6,448,277, 6,414,148, 6, 362,336, 6,291,455, 6,284,751, 6,177,401, 6071,921 e 6001,885 (inibidores retinoides da expressão de VEGF).

Na técnica são conhecidas proteínas e polipéptidos que bloqueiam a ação do VEGF, por exemplo, aqueles descritos nas Patentes U.S. n° 6, 576, 608, 6, 559, 126, 6, 541,008, 6,515,105, 6,383,486 (recetor engodo de VEGF), 6,375,929 (recetor engodo de VEGF), 6,361,946 (inibidores peptídicos análogos de VEGF), 6,348,333 (recetor engodo de VEGF), 6,559,126 (polipéptidos que ligam o VEGF e bloqueiam a ligação ao VEGFR), 6,100,071 (recetor engodo de VEGF) e 5,952,199.

Na técnica são conhecidos ácidos nucleicos de interferência curtos (NAsi), Interferência de ARN curto (ARNsi), ARN de cadeia dupla (ARNds), microARN (miARN) e ARN em grampo curto (ARNsh) capazes de mediar a interferência de ARN (ARNi) contra a expressão do gene e/ou atividade do VEGF 47 e/ou VEGFR, por exemplo, como divulgado na publicação PCT WO 03/074910.

Na técnica são conhecidos oligonucleótidos antimensageiros para a inibição de VEGF, por exemplo, aqueles descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. n° 5,611,135, 5,814,620, 6, 399, 586, 6, 410,322 e 6,291, 667.

Na técnica são conhecidos aptâmeros (também conhecidos como ligandos de ácido nucleico) para a inibição de VEGF, por exemplo, aqueles descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. n° 6, 762,290, 6, 426, 335, 6, 168,778, 6, 051, 698 e 5, 859,228.

Anticorpos Antagonistas A invenção inclui anticorpos antagonistas dirigidos contra PDGF e VEGF bem como os seus recetores cognatos PDGFR e VEGFR. Os anticorpos antagonistas da invenção bloqueiam a ligação de um ligando com o seu recetor cognato. Por conseguinte, um anticorpo antagonista de PDGF da invenção inclui anticorpos dirigidos contra um PDGF bem como um PDGFR alvo.

Os anticorpos antagonistas da invenção incluem anticorpos inibidores monoclonais. Os anticorpos monoclonais, ou seus fragmentos, abrangem todas as classes de imunoglobulina tais como IgM, IgG, IgD, IgE, IgA, ou suas subclasses, tais como as subclasses de IgG ou misturas destas. A IgG e suas subclasses são úteis, tais como as IgGi, IgG2, IgG2a, IgG2b/ IgG3 ou IgGM. Os subtipos de IgG, IgGi/kappa e IqG2b/kaPPa»· são incluídos como formas de realização úteis. Os fragmentos que podem ser mencionados são todos fragmentos de anticorpo truncados ou modificados com um ou dois sítios de ligação complementares de antigénio que exibem atividade de ligação e neutralizante elevada para o PDGP ou VEGF mamífero (ou 48 seus recetores cognatos), tais como partes de anticorpos possuindo um sitio de ligação que corresponde ao anticorpo e é formado por cadeias leves e pesadas, tais como os fragmentos Fv, Fab ou F(ab')2/ ou fragmentos de cadeia simples. Os fragmentos de cadeia dupla truncados tais como Fv, Fab ou F(ab')2 são particularmente úteis. Estes fragmentos podem ser obtidos, por exemplo, por meios enzimáticos eliminando a parte Fc do anticorpo com enzimas tais como papaína ou pepsina, por oxidação química ou por manipulação genética dos genes do anticorpo. Também é possível e vantajoso utilizar fragmentos não truncados, geneticamente manipulados. Os anticorpos anti-PDGF ou VEGF ou fragmentos dos mesmos podem ser utilizados sozinhos ou em misturas.

Os novos anticorpos, fragmentos de anticorpo, misturas ou derivados dos mesmos têm vantajosamente uma afinidade de ligação para o PDGF ou VEGF (ou seus recetores cognatos) numa gama desde lxlO’7 M a lxlO’12 M, ou desde 1x10”8M a lxlO”11 M, ou desde lxlO’9 M a 5xlO’10 M.

Os genes de anticorpo para as manipulações genéticas podem ser isolados, por exemplo a partir de células de hibridoma, de um modo conhecido do especialista. Para este fim, células produtoras de anticorpos são cultivadas e, quando a densidade ótica das células é suficiente, o ARNm é isolado a partir das células de um modo conhecido submetendo as células a lise com tiocianato de guanidínio, acidificando com acetato de sódio, extraindo com fenol, clorofórmio/álcool isoamílico, precipitando com isopropanol e lavando com etanol. 0 ADNc é em seguida sintetizado a partir do ARNm utilizando transcriptase inversa. 0 ADNc sintetizado pode ser inserido, diretamente ou após manipulação genética, por exemplo, por mutagénese 49 específica de um locus, introdução de inserções, inversões, supressões ou trocas de base, em vetores animais, fúngicos, bacterianos ou virais adequados e ser expressado em organismos hospedeiros apropriados. Os vetores bacterianos ou de levedura úteis são os vetores pBR322, pUC18/19, pACYC184, lambda ou mu de levedura para a clonagem de genes e expressão em bactérias tais como E. coli ou em leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae.

As células que sintetizam anticorpos contra PDGF ou VEGF incluem células animais, fúngicas, bacterianas ou células de levedura após transformação como mencionado acima. Elas são vantajosamente células de hibridoma ou células de trioma, tipicamente células de hibridoma. Estas células de hibridoma podem ser produzidas, por exemplo de um modo conhecido a partir de animais imunizados com PDGF ou VEGF (ou seus recetores cognatos) por isolamento das suas células B produtoras de anticorpos, seleção destas células em relação a anticorpos de ligação a PDGF ou VEGF e, subsequentemente, fusão destas células com, por exemplo, células humanas ou animais, por exemplo, células de mieloma de rato, células linfoblastóides humanas ou células de hetero-hibridoma (ver, por exemplo, Koehler et al., (1975) Nature 256: 496) ou infetando estas células com vírus apropriados para produzir linhas celulares imortalizadas. As linhas de células de hibridoma produzidas por fusão são úteis e as linhas de células de hibridoma de rato são particularmente úteis. As linhas de células de hibridoma da invenção segregam anticorpos do tipo IgG úteis. Os anticorpos mAb da invenção ligam-se com afinidade elevada e reduzem ou neutralizam a atividade biológica (por exemplo, angiogénica) de PDGF ou VEGF.

A invenção inclui ainda derivados destes anticorpos anti-PDGF ou VEGF que retêm a sua atividade de inibição de PDGF 50 ou VEGF, ao mesmo tempo que modificam uma ou mais de outras propriedades relacionadas com a sua utilização como um agente farmacêutico, por exemplo, estabilidade no soro ou eficiência de produção. Os exemplos de tais derivados de anticorpos anti-PDGF ou VEGF incluem péptidos, peptidomiméticos derivados das regiões de ligação a antigénio dos anticorpos, e anticorpos, fragmentos de anticorpo ou péptidos ligados a veiculos sólidos ou liquidos tais como polietileno glicol, vidro, polímeros sintéticos tais como poliacrilamida, poliestireno, polipropileno, polietileno ou polímeros naturais tais como celulose, Sepharose ou agarose, ou conjugados com enzimas, toxinas ou marcadores radioativos ou não radioativos tais como 3H 1231 , 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36C1, 57Co 55Fe, 59Fe 90Y, 99mTc, 71Se, ou anticorpos, fragmentos ou péptidos covalentemente ligados a etiquetas fluorescentes/quimioluminescentes tais como rodamina, fluoresceina, isotiocianato, ficoeritrina, ficocianina, fluorescamina, quelatos de metal, avidina, estreptavidina ou biotina.

Os novos anticorpos, fragmentos de anticorpo, misturas e seus derivados podem ser utilizados diretamente, após secagem, por exemplo secagem por congelação, após ligação aos veiculos supramencionados ou após formulação com outro fármaco ativo e substâncias auxiliares para produzir preparações farmacêuticas. Os exemplos de substâncias ativas e auxiliares que podem ser mencionadas são outros anticorpos, substâncias antimicrobianas ativas com uma ação microbiocida ou microbiostática tais como antibióticos em geral ou sulfonamidas, agentes antitumorais, água, tampões, soluções salinas, álcoois, gorduras, ceras, veiculos inertes ou outras substâncias habituais para produtos parentéricos, tais como aminoácidos, espessantes ou açúcares. Estas preparações farmacêuticas são utilizadas 51 para controlar doenças e são úteis para controlar distúrbios neovasculares oculares e doenças incluindo AMD e retinopatia diabética.

Os novos anticorpos, fragmentos de anticorpo, misturas ou seus derivados podem ser utilizados em terapia ou diagnóstico diretamente ou após acoplamento a veiculos sólidos ou liquidos, enzimas, toxinas, etiquetas radioativas ou não radioativas ou a etiquetas fluorescentes/quimioluminescentes como descrito acima.

Os anticorpos monoclonais contra o PDGF ou VEGF humano da presente invenção podem ser obtidos por quaisquer meios conhecidos na técnica. Por exemplo, um mamifero é imunizado com PDGF ou VEGF humano (ou seus recetores cognatos) . Os PDGF e VEGF humanos purificados estão comercialmente disponíveis (por exemplo, de Cell Sciences, Norwood, MA, bem como de outros vendedores comerciais) . Alternativamente, o PDGF ou VEGF humano (ou seus recetores cognatos) podem ser facilmente purificados a partir de tecido placentário humano. O mamifero utilizado para gerar o anticorpo anti-PDGF ou VEGF humano não está restringido e pode ser um primata, um roedor (tal como rato, ratazana ou coelho), bovino, ovelhas, cabra ou cão.

Em seguida, as células produtoras de anticorpos tais como as células do baço são retiradas do animal imunizado e são fundidas com células de mieloma. As células de mieloma são bem conhecidas na técnica (por exemplo, podem ser utilizadas células p3x63-Agõ-653, NS-0, NS-1 ou P3U1). A operação de fusão de células pode ser realizada por qualquer método convencional conhecido na técnica.

As células, depois de serem submetidas à operação de fusão de células, são então cultivadas em meio de seleção HAT de 52 modo a selecionar os hibridomas. Os hibridomas que produzem anticorpos monoclonais anti-humanos são em seguida selecionados. Esta seleção pode ser realizada, por exemplo, por ensaio de imunoabsorção enzimática em sanduíche (ELISA) ou semelhantes em que os anticorpos monoclonais produzidos são ligados aos poços nos quais está imobilizado o PDGF ou VEGF humano (ou seu recetor cognato) . Neste caso, como anticorpo secundário pode ser utilizado um anticorpo específico para a imunoglobulina do animal imunizado, o qual está marcado com uma enzima tal como peroxídase, fosfatase alcalina, glucose-oxidase, beta-D-galactosidase, ou semelhantes. A etiqueta pode ser detetada fazendo reagir a enzima de marcação com o seu substrato e medindo a cor gerada. Como substrato pode ser produzido 3,3-diaminobenzidina, 2,2-diaminobis-o-dianisidina, 4-cloronaftol, 4-aminoantipirina, o-fenilenodiamina ou semelhantes.

Através da operação descrita acima podem ser selecionados os hibridomas que produzem anticorpos anti-PDGF ou VEGF humano. Os hibridomas selecionados são em seguida clonados pelo método de diluição limitante convencional ou método de agar mole. Se desejado, os hibridomas clonados podem ser cultivados em grande escala utilizando um meio contendo soro ou isento de soro, ou podem ser inoculados na cavidade abdominal de ratos e recuperados a partir das ascites, podendo desse modo ser obtido um grande número de hibridomas clonados.

Dentre os anticorpos monoclonais anti-PDGF ou VEGF humano selecionados, aqueles que têm uma aptidão para prevenir a ligação e ativação do par ligando/ recetor correspondente (por exemplo, num sistema de ensaio de PDGF ou VEGF baseado em células (ver acima)) são em seguida escolhidos para análise e manipulação posteriores. Se o anticorpo bloqueia 53 a ligação e/ou ativação recetor/ligando, isto significa que o anticorpo monoclonal testado tem uma aptidão para reduzir ou neutralizar a atividade PDGF ou VEGF do PDGF ou VEGF humano. Isto é, o anticorpo monoclonal reconhece e/ou interfere especificamente com o sitio de ligação critico do PDGF ou VEGF humano (ou seus recetores cognatos).

Os anticorpos monoclonais aqui incluem ainda anticorpos hibridos e recombinantes produzidos por excisão-união de um dominio variável (incluindo hipervariável) de um anticorpo anti-PDGF ou VEGF com um dominio constante (por exemplo, anticorpos "humanizados")/ ou de uma cadeia leve com uma cadeia pesada, ou uma cadeia de uma espécie com uma cadeia de outra espécie, ou fusões com proteínas heterólogas, independentemente da espécie de origem ou designação da classe ou subclasse de imunoglobulina, bem como fragmentos de anticorpo [por exemplo, Fab, F(ab)2, e Fv] , desde que eles exibam a atividade biológica desejada. [Ver, por exemplo, Patente U.S. n° 4, 816, 567 e Mage & Lamoyi, em Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.79-97 (Mareei Dekker, Inc.), New York (1987)].

Assim, o termo "monoclonal" indica que o caráter do anticorpo obtido é de uma população substancialmente homogénea de anticorpos, e não é para ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser preparados pelo método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kõhler & Milstein, Nature 256:495 (1975), ou pode ser preparado por métodos de ADN recombinante (Patente U.S. n° 4,816,567). Os "anticorpos monoclonais" também podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos geradas utilizando as técnicas descritas, por exemplo, em McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). 54

As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murideos) são imunoglobulinas quiméricas especificas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos das mesmas (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab)2 ou outras subsequências de ligação a antigénio de anticorpos) que contêm uma sequência minima derivada de imunoglobulina não humana. Na sua maioria, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recetor) nas quais residuos das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do anticorpo recetor estão substituídos por resíduos de CDRs de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como rato, ratazana ou coelho possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Nalguns casos, os resíduos da região estrutural (FR) Fv da imunoglobulina humana estão substituídos pelos resíduos correspondentes da FR não humana. Além disso, o anticorpo humanizado pode compreender resíduos que não estão presentes nem no anticorpo recetor nem nas sequências CDR ou FR importadas. Estas modificações são feitas para refinar e otimizar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que a totalidade ou substancialmente a totalidade das regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e a totalidade ou substancialmente a totalidade dos resíduos da FR são os de uma sequência consenso de imunoglobulina humana. De modo ótimo, o anticorpo humanizado também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana.

Os métodos para humanizar anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos no mesmo a partir de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de 55 aminoácido não humanos são frequentemente referidos como resíduos "importados", os quais são tipicamente retirados de um domínio variável "importado". Δ humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann et al., (1988) Nature 332: 323-327; e Verhoeyen et al., (1988) Science 239: 1534-1536), substituindo sequências de um anticorpo humano pelas CDRs ou sequências de CDR correspondentes de roedor. Por conseguinte, estes anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos, em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos da CDR e possivelmente alguns resíduos da FR estão substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedor. A escolha dos domínios variáveis humanos, tanto leve como pesado, a serem utilizados na preparação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado método de "melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é rastreada contra a biblioteca completa de sequências dos domínios variáveis humanos conhecidos. A sequência humana que é mais próxima daquela do roedor é em seguida aceite como a região estrutural (FR) humana para o anticorpo humanizado (Sims et al., (1993) J. Immunol., 151:2296; e Chotia e Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196:901). Outro método utiliza uma região estrutural particular derivada da sequência consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma região estrutural pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., 56 (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 89: 4285; e Presta et al., (1993) J. Immnol., 151:2623). É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção da afinidade elevada para o antigénio e de outras propriedades biológicas favoráveis. Para conseguir este objetivo, de acordo com um método útil, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências parentais e vários produtos humanizados conceptuais utilizando modelos tridimensionais das sequências parental e humanizada. Os modelos tridimensionais de imunoglobulina estão geralmente disponíveis e são familiares para os especialistas na técnica. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências candidatas de imunoglobulina selecionadas. A inspeção destas visualizações permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise dos resíduos que influenciam a aptidão da imunoglobulina candidata para ligar o seu antigénio. Deste modo pode ser selecionados e combinados resíduos FR das sequências consenso e importada para conseguir as característica de anticorpo desejadas, tais como maior afinidade para o(s) antigénio(s) alvo(s). Em geral, os resíduos de CDR estão diretamente e muito substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antigénio.

Os anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra PDGF ou VEGF também estão incluídos na invenção. Tais anticorpos podem ser preparados pelo método de hibridoma. As linhas celulares de mieloma humano e heteromieloma rato-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas, por exemplo, por Kozbor (1984) J. Immunol., 133, 57 3001; Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp.51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987); e Boerner et al., (1991) J. Iinmunol., 147:86-95. É agora possível produzir animais transgénicos (por exemplo, ratos) que são capazes, após imunização, de produzir um reportório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a supressão homozigótica do gene da região de ligação da cadeia pesada (JH) do anticorpo em ratos quiméricos e mutantes de linha germinal resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência da matriz do gene de imunoglobulina da linha germinal humana para esses ratos mutantes de linha germinal resultará na produção de anticorpos humanos após desafio com antigénio (ver, por exemplo, Jakobovits et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 90: 2551; Jakobovits et al., (1993) Nature, 362:255-258; e Bruggermann et al., (1993) Year in Immuno., 7:33).

Alternativamente, a tecnologia de apresentação de fago (McCafferty et al., (1990) Nature, 348: 552-553) pode ser utilizada para produzir anticorpos e fragmentos de anticorpos humanos in vitro, a partir de reportórios do gene do domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não imunizados (Para revisão ver, por exemplo, Johnson et al., (1993) Current Opinion in Structural Biology, 3:564-571) . Várias fontes de segmentos de gene de V podem ser utilizadas para a apresentação de fago. Por exemplo, Clackson et al., ((1991) Nature, 352: 624-628) isolou uma matriz diversa de anticorpos anti-oxazolona a partir de uma biblioteca combinatória aleatória pequena de genes de V derivados dos baços de ratos imunizados. Pode ser construído um reportório de genes de V de doadores humanos 58 não imunizados e podem ser isolados anticorpos para uma matriz variada de antigénios (incluindo auto-antigénios) seguindo essencialmente as técnicas descritas por Marks et al. , ((1991) J. Mol. Biol., 222:581-597, ou Griffith et al., (1993) EMBO J., 12:725-734).

Numa resposta imunológica natural, os genes de anticorpo acumulam mutações a uma velocidade elevada (hipermutação somática). Algumas das alterações introduzidas conferirão maior afinidade e as células B que apresentam imunoglobulina superficial de afinidade elevada são preferencialmente replicadas e diferenciadas durante o desafio subsequente com antigénio. Este processo natural pode ser imitado utilizando a técnica conhecida como "reorganização da cadeia" (ver Marks et al., (1992) Bio.

Technol., 10:779-783). Neste método, a afinidade de anticorpos humanos "primários" obtidos por apresentação de fago pode ser melhorada substituindo sequencialmente os genes da região V de cadeia pesada e leve por reportórios de variantes naturais (reportórios) dos genes do dominio V obtidos de doadores não imunizados. Esta técnica permite a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos com afinidades na gama dos nM. Uma estratégia para preparar reportórios muito grandes de anticorpos de fagos foi descrita por Waterhouse et al., ((1993) Nucl. Acids Res., 21:2265-2266). A reorganização de gene também pode ser utilizada para obter anticorpos humanos a partir de anticorpos de roedores, em que o anticorpo humano tem afinidades e especificidades semelhantes ao anticorpo de roedor de partida. De acordo com este método, o qual também é referido como "impressão de epitopo", o gene do domínio V de cadeia pesada ou leve dos anticorpos de roedor obtidos pela técnica de apresentação de fago é substituído por um 59 reportório de genes do domínio V humano, criando quimeras roedor-humanas. A seleção no antigénio resulta no isolamento do domínio variável humano capaz de restabelecer um sítio de ligação de antigénio funcional, isto é, o epítopo governa (marca) a escolha do parceiro. Quando o processo é repetido para substituir o domínio V de roedor remanescente é obtido um anticorpo humano (ver PCT WO 93/06213, publicado 1 de Abril de 1993) . Ao contrário da humanização tradicional de anticorpos de roedores por enxerto de CDR, esta técnica proporciona anticorpos completamente humanos, os quais não têm quaisquer resíduos da região estrutural ou CDR de origem em roedor.

Aptâmeros Antagonistas A presente invenção refere-se nas reivindicações a aptâmeros anti-PDGF específicos os quais são utilizados no tratamento de associação com um antagonista de VEGF. O que se segue é uma divulgação geral de aptâmeros anti-PDGF e anti-VEGF para fins ilustrativos. A invenção proporciona aptâmeros antagonistas dirigidos contra PDGF e/ou VEGF (ou seus recetores cognatos) . Os aptâmeros, também conhecidos como ligandos de ácido nucleico, são ácidos nucleicos não naturais que se ligam e, em geral, antagonizam (isto é, inibem) um alvo pré-selecionado.

Os aptâmeros podem ser preparados por qualquer método conhecido de produção de oligómeros ou oligonucleótidos. Na técnica são conhecidos muitos métodos de síntese. Por exemplo, os oligómeros modificados com 2'-0-alilo que contêm ribonucleótidos de purina residuais e têm uma extremidade 3'-terminal adequada tal como um resíduo de timidina invertido (Ortigao et al., Antisense Research and Development 2:129-146 (1992)) ou duas ligações 60 fosforotioato na extremidade 3'-terminal para impedir a eventual degradação por 3'-exonucleases, podem ser sintetizados por química de fosforamideto de beta-cianoetilo em fase sólida (Sinha et al., Nucleic Acids Res., 12:4539-4557 (1984)) em qualquer sintetizador de ADN/ARN comercialmente disponível. Um método é a estratégia de proteção com 2'-O-terc-butildimetilsililo (TBDMS) para os ribonucleótidos (Usman et al., J. Am. Chem. Soc., 109:7845-7854 (1987)) e todos os 3'-O-fosforamidetos necessários estão comercialmente disponíveis. Além disso pode utilizar-se aminometilpoliestireno como material de suporte devido às suas propriedades vantajosas (McCollum e Andrus (1991) Tetrahedron Lett., 32:4069-4072). Pode ser adicionada fluoresceína à extremidade 5' de um ARN substrato durante a síntese utilizando fosforamidetos de fluoresceína comercialmente disponíveis. Em geral, um aptâmero oligómero pode ser sintetizado utilizando um ciclo de ARN padrão. Após conclusão da montagem, todos os grupos de proteção instáveis em base são removidos por um tratamento de oito horas a 55° C com amoníaco aquoso concentrada/etanol (3:1 v/v) num frasco selado. O etanol impede a remoção prematura dos grupos 2'-0-TBDMS que, caso contrário, conduziria a dissociação apreciável da cadeia nas posições ribonucleotídicas resultantes sob as condições básicas da desproteção (Usman et al., (1987) J. Am. Chem. Soc., 109:7845-7854). Após liofilização, o oligómero protegido com TBDMS é tratado com uma mistura de tri-fluoridrato de trietilamina/trietilamina/N-metilpirrolidinona durante 2 horas a 60° C para proporcionar a remoção rápida e eficiente dos grupos sililo de proteção sob condições neutras (ver Wincott et al., (1995) Nucleic Acids Res., 23:2677-2684). O oligómero completamente desprotegido pode ser depois precipitado com butanol de acordo com o procedimento de Cathala e Brunel ((1990) Nucleic Acids Res., 18:201). A purificação pode ser 61 realizada por eletroforese de gel em poliacrilamida desnaturante ou por uma associação de HPLC de troca iónica (Sproat et al., (1995) Nucleosides and Nucleotides, 14:255-273) e HPLC de fase inversa. Para serem utilizados em células, os oligómeros sintetizados são convertidos nos seus sais de sódio por precipitação com perclorato de sódio em acetona. Os vestígios de sais residuais podem ser depois removidos utilizando colunas pequenas descartáveis de filtração em gel que estão comercialmente disponíveis. Como um passo final a autenticidade dos oligómeros isolados pode ser verificada por espetrometria de massa de dessorção a laser assistida por matriz (Pieles et al., (1993) Nucleic Acids Res., 21:3191-3196) e por análise da composição da base de nucleósidos.

Os aptâmeros divulgados também podem ser produzidos através de métodos enzimáticos, quando as subunidades nucleotídicas estão disponíveis para manipulação enzimática. Por exemplo, as moléculas de ARN podem ser preparadas através de reações da ARN-polimerase T7 in vitro. Eles também podem ser preparados por estirpes de bactérias ou linhas celulares que expressam T7, e em seguida subsequentemente isolados a partir destas células. Como discutido abaixo, os aptâmeros divulgados também podem ser diretamente expressados em células utilizando vetores e promotores.

Os aptâmeros, como outras moléculas de ácido nucleico, podem conter ainda nucleótidos quimicamente modificados. Uma questão a ser resolvida na utilização diagnóstica ou terapêutica de ácidos nucleicos é a potencial degradação rápida dos oligonucleótidos na sua forma de fosfodiéster nos fluidos corporais por enzimas intracelulares e extracelulares tais como endonucleases e exonucleases antes do efeito desejado se manifestar. Podem ser feitas certas modificações químicas do ligando de ácido nucleico para 62 aumentar a estabilidade in vivo do ligando de ácido nucleico ou para melhorar ou para mediar a administração do ligando de ácido nucleico (ver, por exemplo, Pedido de Patente U.S. n° 5,660,985, intitulado "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides").

As modificações dos ligandos de ácido nucleico podem incluir, mas não se limitam àquelas que proporcionam outros grupos quimicos que incorporam carga, polarizabilidade, hidrofobicidade, ligação de hidrogénio, interação eletrostática e fluidez adicional às bases do ligando de ácido nucleico ou ao ligando de ácido nucleico como um todo. Tais modificações incluem, mas não se limitam a, modificações de açúcar na posição 2', modificações de pirimidina na posição 5, modificações de purina na posição 8, modificações em aminas exociclicas, substituição de 4-tiouridina, substituição de 5-bromo ou 5-iodo-uracilo; modificações da cadeia principal, modificações com fosforotioato ou alquilfosfato, metilações, associações de emparelhamento de bases invulgares tais como as isobases isocitidina e isoguanidina e semelhantes. As modificações também podem incluir modificações 3' e 5' tais como unidades de terminação ou modificação com açúcar. Nalgumas formas de realização da presente invenção, os ligandos de ácido nucleico são moléculas de ARN que estão modificadas com fluoro na posição 2' (2'-F) da unidade açúcar de residuos de pirimidina. A estabilidade do aptâmero pode ser muito aumentada pela introdução de tais modificações, bem como por modificações e substituições ao longo da cadeia principal de fosfato do ARN. Além disso pode ser feita uma variedade de modificações nas próprias nucleobases as quais inibem a degradação e as quais podem aumentar interações desejadas entre nucleótidos ou diminuir interações indesejadas entre 63 nucleótidos. Por conseguinte, uma vez conhecida a sequência de um aptâmero, podem ser feitas modificações ou substituições pelos procedimentos sintéticos descritos abaixo ou por procedimentos conhecidos dos especialistas na técnica.

Outras modificações incluem a incorporação de bases modificadas (ou nucleósidos modificados ou nucleótidos modificados) que são modificações de estruturas químicas de cadeia principal de bases, açúcares e/ou fosfato padrão que ocorrem em ácidos ribonucleico (isto é, A, C, G e U) e desoxirribonucleico (isto é, A, C, G e T) . Neste âmbito estão incluídos, por exemplo: Gm (ácido 2'-metoxiguanílico), Am (ácido 2 '-metoxiadenílico) , Cf (ácido 2'-fluorocitidílico), Uf (ácido 2'-fluorouridílico), Ar (ácido riboadenílico). Os aptâmeros também podem incluir citosina ou qualquer base relacionada com citosina incluindo 5- metilcitosina, 4-acetilcitosina, 3- metilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, 2-tiocitosina, 5- halocitosina (por exemplo, 5-fluorocitosina, 5- bromocitosina, 5-clorocitosina e 5-iodocitosina), 5- propinilcitosina , 6-azocitosina, 5-trifluorometilcitosina, N4,N4-etanocitosina, fenoxazina citidina, fenotiazina citidina, carbazole citidina ou piridoindole citidina. 0 aptâmero pode incluir ainda guanina ou qualquer base relacionada com guanina incluindo 6-metilguanina, 1-metilguanina, 2,2-dimetilguanina, 2-metilguanina, 7-metilguanina, 2-propilguanina, 6-propilguanina, 8-haloguanina (por exemplo, 8-fluoroguanina, 8-bromoguanina, 8-cloroguanina e 8-iodoguanina), 8-aminoguanina, 8-sulfidrilguanina, 8-tioalquilguanina, 8-hidroxilguanina, 7-metilguanina, 8-azaguanina, 7-desazaguanina ou 3-desazaguanina. 0 aptâmero pode ainda incluir adenina ou qualquer base relacionada com adenina incluindo 6-metiladenina, N6-isopenteniladenina, N6-metiladenina, 1- 64 metiladenina, 2-metiladenina, 2-metiltio-N6- isopenteniladenina, 8-haloadenina (por exemplo, 8- fluoroadenina, 8-bromoadenina, 8-cloroadenina e 8-iodoadenina), 8-aminoadenina, 8-sulfidriladenina, 8-tioalquiladenina, 8-hidroxiladenina, 7-metiladenina, 2-haloadenina (por exemplo, 2-fluoroadenina, 2-bromoadenina, 2-cloroadenina e 2-iodoadenina), 2-aminoadenina, 8- azaadenina, 7-desazaadenina ou 3-desazaadenina. Também estão incluídos o uracilo ou qualquer base relacionada com uracilo incluindo 5-halouracilo (por exemplo, 5- fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5- iodouracilo), 5-(carboxi-hidroxilmetil)uracilo, 5- carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5- carboximetilaminometiluracilo, di-hidrouracilo, 1- metilpseudouracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico do ácido uracilo-5-oxiacético, ácido uracilo-5-oxiacético, pseudouracilo, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, 5-metilaminometiluracilo, 5-propiniluracilo, 6-azouracilo ou 4-tiouracilo.

Os exemplos de outras variantes de bases modificadas conhecidas na técnica incluem, sem limitação, aquelas listadas em 37 C.F.R. §1.822 (p) (1), por exemplo, 4-acetilcitidina, 5-(carboxi-hidroxilmetil)uridina, 2'-metoxicitidina, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluridina, di-hidrouridina, 2'-0-metilpseudouridina, b-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenosina, 1-metiladenosina, 1-metilpseudouridina, 1-metilguanosina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanosina, 2-metiladenosina, 2-metilguanosina, 3-metilcitidina, 5-metiloitidina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 5-metilaminometiluridina, 5- 65 metoxiaminometil-2-tiouridina, b-D-manosilqueosina, 5-metoxicarbonilmetiluridina, 5-metoxiuridina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, N-((9-b-D-ribofuranosil-2- metiltiopurina-6-il)carbamoil)treonina, N-((9-b-D- ribofuranosilpurina-6-il)N-metil-carbamoil)treonina, éster metílico do ácido uridina-5-oxiacético, ácido uridina-5-oxiacético (v) , vibutoxosina, pseudouridina, queosina, 2-tiocitidina, 5-metil-2-tiouridina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, 5-metiluridina, N-( (9-b-D-ribofuranosilpurina-6-il)carbamoil)treonina, 2'-0-metil-5-metiluridina, 2'-0-metiluridina, vibutosina, 3-(3-amino-3- carboxipropil)uridina.

Também estão incluídas as nucleobases modificadas descritas nas Patentes U.S. n° 3,687,808, 4,845,205, 5, 130,302, 5,134,066, 5,175,273, 5,367,066, 5,432,272, 5,457,187, 5,459,255, 5,484,908, 5,502,177, 5,525,711, 5,552,540, 5,587,469, 5,594,121, 5,596,091, 5, 614,617, 5, 645, 985, 5,830,653, 5,763,588, 6, 005, 096 e 5, 681, 941. Exemplos de variantes da cadeia principal de açúcar de nucleósidos e nucleótidos modificadas conhecidas na técnica incluem, sem limitação, aquelas que possuem, por exemplo, substituintes 2'-ribosilo tais como F, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, 0CF3, S0CH3, S02, CH3, ON02, N02, N3, NH2, 0CH2CH20CH3, 0(CH2)20N(CH3)2, 0CH20CH2N(CH3)2, 0(alquilo Cl-10), 0(alcenilo C2-10), 0(alcinilo C2-10), S(alquilo Cl-10), S(alcenilo C2-10), S(alcinilo C2-10), NH(alquilo Cl-10), NH(alcenilo C2-10), NH(alcinilo C2-10) e 0-alquil-0-alquilo. Os substituintes desejáveis de 2' ribosilo incluem 2'-metoxilo (2'-OCH3), 2'-aminopropoxilo (2' OCH2CH2CH2NH2), 2'-alilo (2'-CH2-CH=CH2), 2'-0-alilo (2'-0-CH2-CH=CH2), 2'-amino (2'-NH2) e 2'-fluoro (2'-F). 0 substituinte 2' pode estar na posição arabino (para cima) ou na posição ribo (para baixo). 66

Os aptâmeros podem ser constituídos por nucleótidos e/ou análogos de nucleótidos tais como descritos acima, ou uma associação de ambos, ou são análogos de oligonucleótidos. Os aptâmeros da invenção podem conter análogos de nucleótidos em posições que não afetam a função do oligómero para ligar o PDGF ou VEGF (ou seus recetores cognatos).

Existem várias técnicas que podem ser adaptadas para refinar ou fortalecer a ligação dos ligandos de ácido nucleico a uma molécula alvo particular ou a seleção de aptâmeros adicionais. Uma técnica, geralmente referida como "genética in vitro" (ver Szostak (1992) TIBS, 19:89), envolve o isolamento de aptâmeros antagonistas por seleção a partir de um conjunto de sequências aleatórias. 0 conjunto de moléculas de ácido nucleico a partir do qual podem ser isolados os aptâmeros divulgados pode incluir sequências invariantes que flanqueiam um sequência variável de aproximadamente vinte a quarenta nucleótidos. Este método tem sido designado Evolução Seletiva de Ligandos por Enriquecimento EXponencial (SELEX). As composições e métodos para gerar aptâmeros antagonistas da invenção por SELEX e métodos relacionados são conhecidos na técnica e ensinados, por exemplo, na Patente U.S. n° 5,475,096 intitulado " Nucleic Acid Ligands," e Patente U.S. n° 5,270,163, intitulada " Methods for Identifying Nucleic Acid Ligands". O processo SELEX em geral, e os aptâmeros e formulações de VEGF e PDGF em particular, são ainda descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. n° 5,668,264, 5,696,249, 5, 670, 637, 5, 674, 685, 5, 723, 594, 5, 756,291, 5, 811,533, 5, 817,785, 5, 958, 691, 6, 011,020, 6, 051, 698, 6, 147,204, 6, 168,778, 6, 207,816, 6, 229, 002, 6, 426, 335, 6, 582, 918. 67

Resumidamente, o método SELEX envolve a seleção de uma mistura de oligonucleótidos candidatos e iterações por passos de ligação a um alvo selecionado, partição e amplificação, utilizando o mesmo esquema de seleção geral, para alcançar virtualmente qualquer critério de afinidade de ligação e seletividade desejado. Partindo de uma mistura de ácidos nucleicos, compreendendo tipicamente um segmento de sequência aleatória, o método SELEX inclui passos de pôr a mistura em contacto com o alvo sob condições favoráveis para a ligação, separar os ácidos nucleicos não ligados daqueles ácidos nucleicos que se ligaram especificamente a moléculas alvos, dissociar os complexos de ácido nucleico-alvo, amplificar os ácidos nucleicos dissociados dos complexos de ácido nucleico-alvo para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em ligandos, em seguida repetir os passos de ligação, partição, dissociação e amplificação ao longo de tantos ciclos quantos desejados para produzir ligandos de ácido nucleico de afinidade elevada altamente específicos para a molécula alvo. 0 método SELEX básico foi modificado para conseguir um número de objetivos específicos. Por exemplo, a Patente U.S. n° 5,707,796, intitulada "Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure," descreve a utilização do processo SELEX in conjunto com eletroforese em gel para selecionar moléculas de ácido nucleico com caracteristicas estruturais especificas, Tal como ADN dobrado. A Patente U.S. n° 5,763,177 intitulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX" descreve um método baseado em SELEX para selecionar ligandos de ácido nucleico contendo grupos fotorreativos capazes de ligar e/ou fotorreticular e/ou fotoinativar uma molécula alvo. A Patente U.S. n° 5,580,737 intitulada "High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and 68

Caffeine," descreve um método para identificar ligandos de ácido nucleico altamente específicos capazes de discriminar entre moléculas intimamente relacionadas, as quais podem ser não peptidicas, designado Counter-SELEX. A Patente U.S. n° 5,567,588 intitulada "Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment: Solution SELEX," descreve um método baseado em SELEX que consegue uma separação altamente eficiente entre oligonucleótidos possuindo afinidade elevada e baixa para uma molécula alvo. 0 método SELEX abrange a identificação de ligandos de ácido nucleico de afinidade elevada contendo nucleótidos modificados que conferem caracteristicas melhoradas ao ligando, tais como estabilidade in vivo melhorada ou caracteristicas de administração melhoradas. Exemplos de tais modificações incluem substituições quimicas nas posições da ribose e/ou fosfato e/ou base. Ligandos de ácido nucleico contendo nucleótidos modificados identificados pelo processo SELEX são descritos na Patente U.S. n° 5,660,985 intitulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides," que descreve oligonucleótidos contendo derivados nucleotidicos quimicamente modificados nas posições 5 e 2' de pirimidinas. A Patente U.S. n° 5,580,737, supra, descreve ligandos de ácido nucleico altamente específicos contendo um ou mais nucleótidos modificados com 2'-amino (2'-NH2), 2'-fluoro (2'-F) e/ou 2'-0-metilo (2'-OMe). O Pedido de Patente U.S. n° 08/264,029, apresentado em 22 de Junho de 1994, intitulado "Novel Method of Preparation of Known and Novel 2' Modified Nucleosides by Intramolecular Nucleophilic Displacement, " agora abandonado, descreve oligonucleótidos contendo várias pirimidinas modificadas na posição 2'. 69 0 método SELEX abrange combinar oligonucleótidos selecionados com outros oligonucleótidos selecionados e unidades funcionais não nucleotidicas como descritas na Patente U.S. n° 5,637,459 intitulada "Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment: Chimeric SELEX," e Patente U.S. n° 5,683,867 intitulada "Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment: Blended SELEX," respetivamente. Estas patentes permitem a combinação da grande matriz de formas e outras propriedades, e as propriedades de amplificação e replicação eficientes, de oligonucleótidos com as propriedades desejáveis de outras moléculas. 0 método SELEX abrange ainda combinar ligandos de ácido nucleico selecionados com compostos lipófilos ou compostos de alto peso molecular, não imunogénicos, num complexo de diagnóstico ou terapêutico como descrito na Patente U.S. n° 6,011,020, intitulada "Nucleic Acid Ligand Complexes".

Os aptâmeros antagonistas também podem ser refinados através da utilização de técnicas de modelação por computador. Exemplos de sistemas de modelação molecular são os programas CHARMm e QUANTA, Polygen Corporation (Waltham, Massa.). O CHARMm realiza as funções de minimização de energia e dinâmica molecular. O QUANTA realiza a construção, modelação gráfica e análise da estrutura molecular. O QUANTA permite a construção, modificação, visualização e análise interativa do comportamento das moléculas umas com as outras. Estas aplicações podem ser adaptadas para definir e exibir a estrutura secundária de moléculas de ARN e ADN.

Os aptâmeros com estas várias modificações podem ser depois testados em relação à função utilizando qualquer ensaio adequado para a função de interesse do PDGF ou VEGF, tal 70 como um ensaio de atividade de proliferação de PDGF com base em células.

As modificações podem ser modificações pré- ou pós-processo SELEX. As modificações pré-processo SELEX produzem ligandos de ácido nucleico com especificidade para o seu alvo SELEX e estabilidade in vivo melhorada. As modificações pós-processo SELEX feitas em ligandos de ácido nucleico 2' -OH podem resultar em estabilidade in vivo melhorada sem afetar desfavoravelmente a capacidade de ligação do ligando de ácido nucleico.

Outras modificações úteis para produzir aptâmeros são conhecidas de um técnico médio na matéria. Tais modificações podem ser feitas pós-processo SELEX (modificação de ligandos não modificados anteriormente identificados) ou por incorporação no processo SELEX.

Foi observado que os aptâmeros, ou ligandos de ácido nucleico, em geral, e os aptâmeros de VEGF em particular, são mais estáveis e, por conseguinte, eficazes quando terminados nas extremidades 5' e 3' de uma maneira que diminui a suscetibilidade a exonucleases e aumenta a estabilidade global. Por conseguinte, a invenção baseia-se numa forma de realização, na terminação de aptâmeros em geral, e de aptâmeros anti-VEGF em particular, com uma estrutura de terminação de nucleósido invertido 5'-5' na extremidade 5' e uma estrutura de terminação de nucleósido invertido 3'-3' na extremidade 3'. Por conseguinte, a invenção proporciona aptâmeros anti-VEGF e/ou anti-PDGF, isto é, ligandos de ácido nucleico, que estão protegidos na extremidade 5' com uma terminação de nucleósido invertido 5'-5' e na extremidade 3' com uma terminação de nucleósido invertido 3'-3'. 71

Certos aptâmeros particularmente úteis são composições de aptâmero anti-VEGF, incluindo, mas não se limitando àqueles que têm ambas as estruturas de terminação de nucleótido invertido 5'-5' e 3'-3' nas suas extremidades. Tais aptâmeros anti-VEGF terminados podem ser aptâmeros de ARN, aptâmeros de ADN ou aptâmeros possuindo uma composição mista (isto é, tanto ARN como ADN) . As sequências de aptâmero anti-VEGF adequadas da invenção incluem a sequência de nucleótidos GAAGAAUUGG (SEQ ID NO: 15); ou a sequência de nucleótidos UUGGACGC (SEQ ID NO: 16); ou a sequência de nucleótidos GUGAAUGC (SEQ ID NO: 17). São particularmente úteis os aptâmeros anti-VEGF da invenção que têm a sequência: X-5'-5'-CGGAAUCAGUGAAUGCUUAUACAUCCG-3'-3'-X (SEQ IDNO: 18) em que cada C, G, A e U representam, respetivamente, os nucleótidos naturais citidina, guanidina, adenina e uridina, ou nucleótidos modificados correspondentes aos mesmos; X-5'-5' é um nucleótido invertido que termina a extremidade 5' do aptâmero; 3'-3'-X é um nucleótido invertido que termina a extremidade 3' do aptâmero; e os nucleótidos ou nucleótidos modificados remanescentes estão sequencialmente ligados através de ligações fosfodiéster 5'-3'. Nalguns exemplos cada um dos nucleótidos do aptâmero anti-VEGF terminado, têm individualmente uma substituição em 2' do ribosilo, tal como -OH (o qual é padrão para ácidos ribonucleicos (ARNs) ) , ou -H (o qual é padrão para ácido desoxirribonucleicos (ADNs)). Noutros a posição 2' de ribosilo está substituído com um substituinte 0(alquilo Ci-io) , um O(alcenilo Ci_i0) , um F, um N3 ou um NH2.

Ainda num exemplo não limitativo mais particular, o aptâmero anti-VEGF terminado 5'-5' pode ter a estrutura: 72

Td-5 ' - 5 ' -CfGmGmArArUfCrAmGmUfGmAmAmUiGmCmCfUfUfAmUfAmCfAmUfCtCfGm 3'— 3'— Td (SEQ ID NO: 19) em que "Gm" representa ácido 2'-metoxiguanílico, "Am" representa ácido 2'-metoxiadenílico, "Cf" representa ácido 2'-fluorocitidílico, "Uf" representa ácido 2'- fluorouridílico, "Ar, " representa ácido riboadenilico e "Td" representa ácido desoxirribotimidílico.

Antagonistas de Antimensageiro, Ribozimas e Enzima de ADN 0 capitulo que se segue sobre antagonistas de antimensageiro, ribozimas e enzima de ADN antagonistas é mantido para fins ilustrativos.

Os oligonucleótidos antimensageiros e ribozimas que são dirigidos a PDGF e VEGF realizam a inibição de PDGF /VEGF inibindo a tradução da proteína destes ARNs mensageiros ou visando a degradação dos ARNms correspondentes do PDGF ou VEGF, respetivamente. Estes ácidos nucleicos dirigidos a PDGF e VEGF descritos acima proporcionam sequências úteis para a conceção e síntese destas ribozimas e oligonucleótidos antimensageiros para PDGF e VEGF. Os métodos de conceção e síntese de oligonucleótidos antimensageiros e ribozimas são conhecidos na técnica. Aqui é proporcionada orientação adicional.

Um problema na conceção de oligonucleótidos dirigidos a ARNm (ODNs antimensageiros) e ribozimas específicos e eficazes e antimensageiros é o da identificação de sítios acessíveis de emparelhamento antimensageiro no ARNm alvo (o qual está ele mesmo dobrado numa estrutura secundária parcialmente auto-emparelhada). Uma combinação de algoritmos auxiliados por computador para prever a acessibilidade de emparelhamento do ARN e de rastreio molecular permite a criação de ribozimas e/ou 73 oligonucleótidos antimensageiros específicos e eficazes dirigidos contra a maior parte dos alvos de ARNm. De facto foram descritas várias abordagens para determinar a acessibilidade de uma molécula de ARN alvo aos inibidores de tipo antimensageiro ou ribozima. Uma abordagem utiliza um ensaio de seleção in vitro que aplica tantos oligodesoxinucleótidos antimensageiros quanto possíveis (ver Monia et al., (1996) Nature Med., 2:668-675; e Milner et al., (1997) Nature Biotechnol., 15:537-541). Outra utiliza bibliotecas aleatórias de ODNs (Ho et al., (1996) Nucleic Acids Res., 24:1901-1907; Birikh et al., (1997) RNA 3:429-437; e Lima et al., (1997) J. Biol, Chem., 272:626-638) . Os sítios acessíveis podem ser seguidos por dissociação com RNase H (ver Birikh et al., supra; e Ho et al., (1998) Nature Biotechnol., 16:59-63). A RNase H catalisa a dissociação hidrolítica da cadeia principal de fosfodiéster da cadeia de ARN de uma hélice dupla de ADN-ARN.

Outra abordagem, que envolve a utilização de um conjunto de ODNs quiméricos, semi-aleatórios quimicamente sintetizados, é utilizada para identificar sítios acessíveis dissociados por RNase H num alvo de ARN sintetizado in vitro. Em seguida são utilizadas análises de extensão de iniciadores para identificar estes sítios na molécula alvo (ver Lima et al. , supra). Outras abordagens para conceber alvos antimensageiros em ARN baseiam-se em modelos de dobragem de ARN assistidos por computador. Foram publicados vários relatórios sobre a utilização de bibliotecas aleatórias de ribozimas para rastrear a dissociação eficaz (ver Campbell et al., (1995) RNA 1:598-609; Lieber et al., (1995) Mol. Cell Biol., 15: 540-551; e Vaish et al., (1997) Biochem., 36:6459-6501). 74

Outras abordagens in vitro que utilizam bibliotecas aleatórias ou semi-aleatórias de ODNs e RNase H podem ser mais úteis do que as simulações por computador (Lima et al. , supra). No entanto, a utilização de ARN sintetizado in vitro não prevê a acessibilidade dos ODNs antimensageiros in vivo porque observações recentes sugerem que as interações de emparelhamento de polinucleótidos são influenciadas por proteinas de ligação a ARN (ver Tsuchihashi et al., (1993) Science, 267:99-102; Portman et al., (1994) EMBO J., 13:213-221; e Bertrand e Rossi (1994) EMBO J., 13:2904-2912). A Patente U.S. n° 6,562,570 proporciona composições e métodos para determinar os sitios acessíveis num ARNm na presença de um extrato celular, que imita as condições in vivo.

Resumidamente, este método envolve a incubação de ARNs nativos ou sintetizados in vitro com ODNs antimensageiros, ribozimas ou enzimas de ADN definidos, ou com uma biblioteca aleatória ou semi-aleatória de ODN, ribozima ou enzima de ADN, sob condições de hibridização num meio reacional que inclui um extrato celular contendo proteinas de ligação a ARN endógenas, ou que imita um extrato celular devido à presença de uma ou mais proteinas de ligação a ARN. Qualquer ODN antimensageiro, ribozima ou enzima de ADN, que é complementar a um sítio acessível no ARN alvo hibridizará com esse sítio. Quando são utilizados ODNs definidos ou uma biblioteca de ODN, a RNase H está presente durante a hibridização ou é adicionada após hibridização para dissociar o ARN onde ocorreu hibridização. A RNase H pode estar presente quando são utilizadas ribozimas ou enzimas de ADN, mas não é necessária, uma vez que as ribozimas e enzimas de ADN dissociam o ARN em que ocorreu hibridização. Nalguns casos é utilizada uma biblioteca aleatória ou semi-aleatória de ODN em extratos celulares 75 contendo ARNm, proteínas de ligação a ARN e RNase H endógenos. A seguir podem ser utilizados vários métodos para identificar aqueles sítios no ARN alvo aos quais se ligaram ODNs antimensageiros, ribozimas ou enzimas de ADN e em que ocorreu dissociação. Por exemplo, a reação em cadeia da polimerase dependente de desoxinucleotidil-transferase terminal (TDPCR) pode ser utilizada para este fim (ver Komura e Riggs (1998) Nucleic Acids Res., 26:1807-11). Um passo de transcrição inversa é utilizado para converter a cadeia molde de ARN em ADN, seguido de TDPCR. Nesta invenção, a extremidade 3' necessária para o método de TDPCR é criada por transcrição inversa do ARN alvo de interesse com qualquer polimerase de ADN dependente de ARN adequada (por exemplo, transcriptase inversa). Isto é conseguido hibridizando um primeiro iniciador de ODN (Pl) com ARN numa região que está a jusante (isto é, na direção 5' para 3' na molécula de ARN) da porção da molécula de ARN alvo que está sob estudo. A polimerase na presença de dNTPs copia o ARN para ADN a partir da extremidade 3' de Pl e termina de copiar no sítio de dissociação criado por um ODN antimensageiro/RNase H, uma ribozima ou uma enzima de ADN. A nova molécula de ADN (referida como o ADN de primeira cadeia) serve como a primeira cadeia molde para a parte de PCR do método de TDPCR, a qual é utilizada para identificar a sequência alvo acessível correspondente presente no ARN.

Por exemplo, em seguida pode utilizar-se o procedimento de TDPCR, isto é, o ADN transcrito inversamente com trifosfato de guanosina (rGTP) é feito reagir na presença de desoxinucleotidil-transferase terminal (TdT) para adicionar uma cauda (rG)2-4 nas extremidades 3' das moléculas de ADN. A seguir é ligada uma unidade de ligação de ODN de cadeia dupla possuindo uma saliência 3'2-4 numa cadeia que 76 emparelha ao nível das bases com a cauda (rG)2-4. Em seguida são adicionados dois iniciadores de PCR. 0 primeiro é um iniciador da unidade de ligação (LP) que é complementar à cadeia da unidade de ligação de TDPCR que está ligada à cauda (rG)2-4 (por vezes referida como a cadeia inferior) . 0 outro iniciador (P2) pode ser o mesmo que Pl, mas pode ser interno em relação a Pl, isto é, é complementar ao ARN alvo numa região que está pelo menos parcialmente a montante (isto é, na direção 3' para 5' nas moléculas de ARN) da região que é ligada por Pl, mas está a jusante da porção da molécula de ARN alvo que está sob estudo. Isto é, a porção da molécula de ARN alvo que está sob estudo para se determinar se tem sítios de ligação acessíveis é aquela porção que está a montante da região que é complementar a P2. Em seguida é realizada PCR da maneira conhecida em presença de uma polimerase de ADN e dNTPs para amplificar os segmentos de ADN definidos pelos iniciadores LP e P2. 0 produto amplificado pode ser depois capturado por qualquer um de vários métodos conhecidos e subsequentemente sequenciado num sequenciador automatizado de ADN, proporcionando uma identificação exata do sitio de dissociação. Uma vez determinada esta identidade, podem ser sintetizados o ADN antimensageiro ou ribozimas de sequência definida para serem utilizados in vitro ou in vivo. A intervenção de antimensageiro na expressão de genes específicos pode ser conseguida pela utilização de sequências oligonucleotídicas antimensageiras sintéticas (ver, por exemplo, Lefebvre-d'Hellencourt et al., (1995) Eur. Cyokine Netw., 6:7; Agrawal (1996) TIBTECH, 14: 376; e Lev-Lehman et al., (1997) Antisense Therap. Cohen e Smicek, eds. (Plenum Press, New York)). Resumidamente, as sequências oligonucleotídicas antimensageiras podem ser sequências curtas de ADN, tipicamente 15-30mero mas podem ser tão pequenas quanto 7mero (ver Wagner et al., (1994) 77

Nature 372: 333) concebidas para complementar um ARNm alvo de interesse e forma uma hélice dupla ARN:AS. Esta formação de hélice dupla pode impedir o processamento, excisão-união, transporte ou tradução do ARNm relevante. Além do mais, certas sequências de nucleótidos AS podem desencadear atividade celular de RNase H quando hibridizadas com o seu ARNm alvo, resultando na degradação do ARNm (ver Calabretta et al., (1996) Semin. Oncol., 23:78). Nesse caso, a RNase H dissociará a componente de ARN da hélice dupla e pode libertar potencialmente a AS para hibridizar depois com mais moléculas de ARN alvo. Um modo de ação adicional resulta da interação de AS com ADN genómico para formar um hélice tripla que pode ser transcricionalmente inativa.

Num exemplo não limitativo, adicional ou em substituição, de uma sequência antimensageira como discutida acima, podem ser utilizadas ribozimas para suprimir a função do gene. Isto é particularmente necessário nos casos em que a terapia de antimensageiro está limitada por considerações estequiométricas. Podem ser então utilizadas ribozimas que visarão a mesma sequência. As ribozimas são moléculas de ARN que possuem capacidade catalítica de ARN que dissociam um sítio específico num ARN alvo. 0 número de moléculas de ARN que são dissociadas por uma ribozima é maior do que o número previsto para uma estequiometria 1:1 (ver Hampel e Tritz (1989) Biochem., 28: 4929-33; e Uhlenbeck (1987) Nature, 328: 596-600). Por conseguinte, a presente invenção também permite a utilização de sequências de ribozimas direcionadas para um domínio acessível de uma espécie de ARNm de PDGF ou VEGF e que contém o centro catalítico apropriado. As ribozimas são feitas e administradas como conhecido na técnica e discutido em mais pormenor aqui. As ribozimas podem ser utilizadas em associação com as sequências antimensageiras. 78

As ribozimas catalisam a dissociação da ligação fosfodiéster do ARN. Foram identificadas várias famílias estruturais de ribozimas incluindo os intrões do Grupo I, RNase P, a ribozima do vírus delta da hepatite, as ribozimas cabeça de martelo e a ribozima em grampo originariamente derivada da cadeia negativa do ARN satélite do vírus de mosaico anelar do tabaco (sTRSV) (ver Sullivan (1994) Investig. Dermatolog., (Supl.) 103: 95S; e Patente U.S. n° 5,225,347). As duas últimas famílias são derivadas de viróides e virusóides, nos quais se julga que a ribozima separa os monómeros de oligómeros criados durante replicação em círculo contínuo, (ver Symons (1989) TIBS, 14: 445-50; Symons (1992) Ann. Rev. Biochem., 61: 641-71). Os motivos da ribozima de cabeça de martelo e em grampo estão mais geralmente adaptados à trans-dissociação de ARNms para terapia de genes. O tipo de ribozima utilizado na presente invenção é selecionado como é conhecido na técnica. As ribozimas em grampo estão presentemente em ensaio clínico e são um tipo particularmente útil. Em geral, a ribozima tem desde 30-100 nucleótidos de comprimento.

Moléculas de ribozima concebidas para dissociar cataliticamente um transcrito de ARNm alvo são conhecidas na técnica (por exemplo, PDGF (SEQ ID NO:l) ou VEGF (SEQ ID NO:3)) e também podem ser utilizadas para impedir a tradução de ARNm (ver, por exemplo, Publicação Internacional PCT WO90/11364; Sarver et al., (1990) Science, 247:1222-1225 e Patente U.S. n° 5,093,246). Embora possam ser utilizadas ribozimas que dissociam o ARNm em sequências de reconhecimento específicas de um sítio para destruir ARNms particulares, a utilização de ribozimas de cabeça de martelo é particularmente útil. As ribozimas de cabeça de martelo dissociam os ARNms em localizações determinadas por regiões flanqueadoras que formam pares de 79 bases complementares com o ARNm alvo. 0 único requisito é que o ARNm alvo têm a seguinte sequência de duas bases: 5'-UG-3'. A construção e produção de ribozimas de cabeça de martelo são bem conhecidas na técnica e são descritas mais detalhadamente em Haseloff e Gerlach ((1988) Nature, 334: 585) .

As ribozimas também incluem endorribonucleases de ARN (a seguir "ribozimas de tipo Cech") tal como aquela que ocorre naturalmente em Tetrahymena thermophila (conhecida como IVS ou ARN L-19 de IVS) e a qual tem sido extensivamente descrita por Thomas Cech e colaboradores (ver Zaug et al., (1984) Science, 224:574-578; Zaug e Cech (1986) Science, 231:470-475; Zaug, et al., (1986) Nature, 324:429-433; Pedido internacional de patente n° W088/04300; Been e Cech (1986) Cell, 47:207-216). As ribozimas de tipo Cech têm um sitio ativo com oito pares de bases, que hibridiza com uma sequência de ARN alvo, após o que ocorre dissociação do ARN alvo. A invenção abrange aquelas ribozimas de tipo Cech, que visam sequências de sitios ativos com oito pares de bases. Embora a invenção não esteja limitada a uma teoria particular de mecanismo operatório, a utilização de ribozimas de cabeça de martelo na invenção pode ter uma vantagem em relação à utilização de antimensageiros dirigidos para PDGF /VEGF, já que relatórios recentes indicam que as ribozimas de cabeça de martelo atuam bloqueando a tradução de ARN e/ou a dissociação específica do ARNm alvo.

Como na abordagem de antimensageiro, as ribozimas podem ser constituídas por oligonucleótidos modificados (por exemplo, para melhorar a estabilidade, orientação, etc.) e são administradas a células que expressam o ARNm alvo. Um método de administração útil envolve a utilização de uma construção de ADN "que codifica" o ribozima sob o controlo 80 de um promotor pol III ou pol II constitutivo forte, pelo que as células transfetadas produzirão quantidades suficientes do ribozima para destruir as mensagens visadas e inibir a tradução. Uma vez que as ribozimas, ao contrário das moléculas antimensageiras, são catalíticas, é necessária uma concentração intracelular inferior para serem eficientes.

Como descrito acima, a resistência a nucleases, quando necessária, é proporcionada por qualquer método conhecido na técnica que não interfira substancialmente com a atividade biológica dos oligodesoxinucleótidos antimensageiros ou ribozimas conforme necessária para o método de utilização e administração (Iyer et al., (1990) J. Org. Chem., 55: 4693-99; Eckstein (1985) Ann. Rev. Biochem., 54: 367-402; Spitzer e Eckstein (1988) Nucleic

Acids Res., 18 : 11691-704; Woolf et al., (1990) Nucleic Acids Res., 18: 1763-69; e Shaw et al., (1991) Nucleic Acids Res., 18: 11691-704) . Como descrito acima para os aptâmeros, as modificações representativas não limitativas que podem ser feitas em oligonucleótidos antimensageiros ou ribozimas a fim de melhorar a resistência à nuclease incluem a modificação do heteroátomo de fósforo ou oxigénio na cadeia principal de fosfato, ligações interaçúcar de alquilo ou cicloalquilo de cadeia curta ou ligações interaçúcar heteroatómicas ou heterocíclicas de cadeia curta. Estas incluem, por exemplo, a preparação de metilfosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos e oligómeros de morfolino 2'-fluorados, O-metilados. Por exemplo, o oligonucleótido antimensageiro ou ribozima pode ter ligações fosforotioato a ligar entre quatro a seis bases de nucleótidos da extremidade 3'. Alternativamente, as ligações fosforotioato podem ligar todas as bases de nucleótidos. Os oligonucleótidos antimensageiros de fosforotioato não apresentam normalmente toxicidade 81 significativa a concentrações que são eficazes e que exibem semividas farmacodinâmicas suficientes em animais (ver Agarwal et al., (1996) TIBTECH, 14: 376) e são resistentes a nucleases. Alternativamente, a resistência a nuclease para a AS-ODN pode ser proporcionada através de uma sequência que forma uma ansa de 9 nucleótidos na extremidade 3' possuindo a sequência de nucleótidos CGCGAAGCG. A reação de conjugação avidina-biotina também pode ser utilizada para melhorar a proteção de AS-ODNs contra a degradação por nucleases do soro (ver Boado e Pardridge (1992) Bioconj. Chem., 3: 519-23). De acordo com este conceito os agentes AS-ODN são monobiotinilados na sua extremidade 3' . Quando feitos reagir com avidina, eles formam complexos firmes, resistentes a nuclease com uma estabilidade 6 vezes superior às dos ODNs não conjugados.

Outros estudos mostraram extensão in vivo de oligodesoxinucleótidos antimensageiros (Agarwal et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 88: 7595). Este processo, presumivelmente útil como um mecanismo de captação para remover oligonucleótidos de AS estranhos da circulação, depende da existência de extremidades 3' livres nos oligonucleótidos ligados nos quais ocorre extensão. Por conseguinte um fosforotioato parcial, proteção com ansa ou biotina-avidina nesta posição importante deve ser suficiente para garantir a estabilidade destes oligodesoxinucleótidos de AS.

Além da utilização de bases modificadas como descritas acima, podem ser preparados análogos de nucleótidos em que a estrutura do nucleótido está fundamentalmente modificada e que são melhor adequados como reagentes terapêuticos ou experimentais. Um exemplo de um análogo de nucleótido é um ácido nucleico peptídico (PNA) em que a cadeia principal de desoxirribose (ou ribose) fosfato no ADN (ou ARN) está 82 substituída por uma cadeia principal de poliamida, que é semelhante à encontrada em péptidos. Foi demonstrado que os análogos de PNA são resistentes à degradação por enzimas e têm vidas prolongadas in vivo e in vitro. Além disso, foi demonstrado que os PNAs se ligam mais fortemente a uma sequência de ADN complementar do que uma molécula de ADN. Esta observação é atribuída à carência de repulsão de carga entre a cadeia de PNA e a cadeia de ADN. Outras modificações que podem ser feitas a oligonucleótidos incluem cadeias principais poliméricas, cadeias principais de polímeros de morfolino (ver, por exemplo, Patente U.S. n° 5,034,506) cadeias principais cíclicas ou cadeias principais acíclica, miméticos de açúcar ou qualquer outra modificação incluindo aquela que pode melhorar as propriedades farmacodinâmicas do oligonucleótido.

As enzimas de ADN podem ser utilizadas para diminuir a expressão do ARNm alvo como, por exemplo, PDGF ou VEGF. As enzimas de ADN incorporam algumas das características mecanísticas de ambas as tecnologias de antimensageiro e ribozima. As enzimas de ADN são concebidas de modo a reconhecerem uma sequência de ácido nucleico alvo particular, de modo muito semelhante a um oligonucleótido antimensageiro, contudo de modo muito semelhante a uma ribozima elas são catalíticas e dissociam especificamente o ácido nucleico alvo.

Existe atualmente dois tipos básicos de enzimas de ADN, e ambos estes tipos foram identificados por Santoro e Joyce (ver, por exemplo, Patente U.S. n° 6,110,462). A enzima de ADN 10-23 compreende uma estrutura de ansa que liga dois braços. Os dois braços proporcionam especificidade reconhecendo a sequência de ácido nucleico alvo particular enquanto a estrutura em ansa proporciona uma função catalítica em condições fisiológicas. 83

Resumidamente, para conceber a enzima de ADN que reconhece e dissocia especificamente um ácido nucleico alvo, um especialista na técnica tem de identificar primeiro a sequência alvo única. Isto pode ser feito utilizando a mesma abordagem que a delineada para oligonucleótidos antimensageiros. Em certos casos, a sequência única ou substancialmente única é uma rica em G/C com aproximadamente 18 a 22 nucleótidos. Um teor de G/C elevado ajuda a garantir uma interação mais forte entre a enzima de ADN e a sequência alvo.

Quando se sintetiza a enzima de ADN, a sequência de reconhecimento antimensageira especifica que direciona a enzima para a mensagem está dividida de modo a compreender os dois braços da enzima de ADN, e a ansa da enzima de ADN é colocada entre os dois braços específicos.

Os métodos de preparação e administração de enzimas de ADN podem ser encontrados, por exemplo, em U.S. 6110462. Analogamente, os métodos de administração de ribozimas de ADN in vitro ou in vivo incluem métodos de administração de ribozima de ARN, como aqui delineados. Além disso, um especialista na técnica reconhecerá que, como os oligonucleótidos antimensageiros, as enzimas de ADN podem ser opcionalmente modificadas para melhorar a estabilidade e melhorar a resistência à degradação. ARNi antagonistas O capítulo que se segue sobre ARNi antagonistas é mantido para fins ilustrativos.

Algumas formas de realização da invenção fazem uso de materiais e métodos para efetuar a repressão de VEGF e PDGF por meio de interferência de ARN (ARNi) . A ARNi é um 84 processo de repressão genética pós-transcrição específica em relação à sequência que pode ocorrer em células eucarióticas. Em geral, este processo envolve a degradação de um ARNm com uma sequência particular induzida por ARN de cadeia dupla (ARNds) que é homólogo a essa sequência. Por exemplo, a expressão de um ARNds comprido correspondente à sequência de um ARNm de cadeia simples particular (ARNm ss) tornará essa mensagem instável, "interferindo" desse modo com a expressão do gene correspondente. Assim sendo, qualquer gene selecionado pode ser reprimido introduzindo um ARNds que corresponda à totalidade ou a uma parte substancial do ARNm para esse gene. Parece que quando um ARNds comprido é expressado, ele é inicialmente processado por uma ribonuclease III em oligonucleótidos de ARNds mais curtos com tão poucos quantos 21 a 22 pares de bases de comprimento. Por conseguinte, o ARNi pode ser efetuado através da introdução ou expressão de ARNds homólogos relativamente curtos. Na realidade, a utilização de ARNds homólogos relativamente curtos pode ter certas vantagens como discutidas abaixo.

As células de mamíferos têm pelo menos duas vias que são afetadas pelo ARN de cadeia dupla (ARNds) . Na via ARNi (específica para a sequência) , o ARNds inicial é primeiro quebrado em ARNs interferentes (si) curtos, como descrito acima. Os ARNsi têm cadeias mensageira e antimensageira com cerca de 21 nucleótidos que formam si ARNs com aproximadamente 19 nucleótidos com saliências de dois nucleótidos em cada extremidade 3'. Julga-se que os ARN de interferência curtos proporcionam a informação de sequência que permite que um ARN mensageiro específico seja visado para degradação. Em contraste, a via não específica é desencadeada por ARNds de qualquer sequência, desde que tenha pelo menos cerca de 30 pares de bases de comprimento. Os efeitos não específicos ocorrem porque os ARNds ativam 85 duas enzimas: PKR (Proteína-cinase ativada por ARN de cadeia dupla), a qual na sua forma ativa fosforila o fator de iniciação da tradução eIF2 para encerrar toda a síntese de proteínas, e a 2', 5' oligoadenilato-sintetase (2', 5'-was) , a qual sintetiza uma molécula que ativa a KNase L, uma enzima não específica que visa todos os ARNms. A via não específica pode representar uma resposta do hospedeiro ao stress ou infeção virai, e, em geral, os efeitos da via não específica são minimizados, em particular, pelos métodos úteis da presente invenção. Significativamente, parecem ser necessários ARNds mais compridos para induzir a via não específica e, por conseguinte, os ARNds mais curtos do que cerca de 30 pares de bases são particularmente úteis para efetuar a repressão de genes por ARNi (ver, por exemplo, Hunter et al., (1975) J. Biol. Chem., 250: 409-17; Manche et al. , (1992) Mol. Cell Biol., 12: 5239-48; Minks et al., (1979) J. Biol. Chem., 254: 10180-3; e Elbashir et al., (2001) Nature 411: 494-8).

Certos oligonucleótidos de cadeia dupla utilizados para efetuar ARNi têm menos de 30 pares de bases de comprimento e podem compreender cerca de 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18 ou 17 pares de bases de ácido ribonucleico. Opcionalmente, os oligonucleótidos de ARNds da invenção podem incluir extremidades salientes 3'. Saliências 3' 2-nucleotídicas ilustrativas, não limitativas podem ser constituídas por resíduos ribonucleotídicos de qualquer tipo e podem ser mesmo constituídas por resíduos de 2'-desoxitimidina, os quais reduzem o custo de síntese do ARN e podem melhorar a resistência à nuclease dos ARNsi no meio de cultura de células e nas células transfetadas (ver Elbasir et al., (2001) Nature, 411: 494-8).

Os ARNds mais compridos de 50, 75, 100 ou mesmo 500 pares de bases ou mais também pode ser utilizados em certas 86 formas de realização da invenção. As concentrações ilustrativas de ARNds para efetuar ARNi são cerca de 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 1,5 nM, 25 nM ou 100 nM, embora possam ser utilizadas outras concentrações dependendo da natureza das células tratadas, do gene alvo e de outros fatores facilmente discerniveis para o especialista. Os ARNds ilustrativos podem ser sintetizados quimicamente ou produzidos in vitro ou in vivo utilizando vetores de expressão apropriados. Os ARNs sintéticos ilustrativos incluem ARNs com 21 nucleótidos sintetizados quimicamente utilizando métodos conhecidos na técnica (por exemplo, fosforamidetos de ARN Expedite e fosforamideto de timidina (Proligo, Alemanha)). Os oligonucleótidos sintéticos podem ser desprotegidos e purificados em gel utilizando métodos conhecido na técnica (ver por exemplo, Elbashir et al., (2001) Genes Dev., 15: 188-200). Os ARNs mais compridos podem ser transcritos a partir de promotores, tais como promotores de ARN-polimerase T7, conhecidos na técnica. Um único alvo de ARN, colocado em ambas as orientações possíveis a jusante de um promotor in vitro, transcreverá ambas as cadeias do alvo para criar um oligonucleótido de ARNds da sequência alvo desejada. A sequência específica utilizada na conceção dos oligonucleótidos pode ser qualquer sequência contígua de nucleótidos contida na mensagem genética expressada do alvo (por exemplo, de PDGF (por exemplo, SEQ ID NO: 2) ou VEGF (por exemplo, SEQ ID NO: 4)). Os programas e algoritmos conhecidos na técnica podem ser utilizados para selecionar sequências alvo apropriadas. Além disso, podem ser selecionadas sequências ótimas, como adicionalmente descritas acima, utilizando programas concebidos para prever a estrutura secundária de uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples especificada e permitir 87 selecionar aquelas sequências com probabilidade de ocorrer em regiões de cadeia simples expostas de um ARNm dobrado. Os métodos e as composições para conceber oligonucleótidos apropriados podem ser encontradas, por exemplo, na Patente U.S. n° 6, 251,588. 0 ARNm é geralmente visto como uma molécula linear que contém a informação para orientar a sintese de proteínas numa sequência de ribonucleótidos. No entanto, estudos revelaram que existe um número de estruturas secundárias e terciárias na maioria dos ARNms. Os elementos da estrutura secundária em ARN são formados, em grande medida, por interações de tipo Watson-Crick entre regiões diferentes da mesma molécula de ARN. Os elementos estruturais secundários importantes incluem regiões intramoleculares de cadeia dupla, ansas em grampo, protuberâncias no ARN de hélice dupla e ansas internas. Os elementos estruturais terciários são formados quando os elementos estruturais secundários entram em contacto uns com os outros ou com regiões de cadeia simples para produzir uma estrutura tridimensional mais complexa. Um número de investigadores tem medido as energias de ligação de um grande número de estruturas de ARN de hélice dupla e têm estabelecido um conjunto de regras que podem ser utilizadas para prever a estrutura secundária de ARN (ver por exemplo, Jaeger et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 86:7706, e Turner et al., (1988) Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 17:167). As regras são úteis na identificação de elementos estruturais no ARN e, em particular, para identificar regiões de ARN de cadeia simples, que podem representar segmentos particularmente úteis do ARNm a serem visados pelas tecnologias de ARNi de silenciamento, ribozima ou antimensageiro. Por conseguinte, podem ser identificados segmentos particulares do ARNm alvo para conceber os oligonucleótidos de ARNds mediadores de ARNi, bem como para conceber as composições de ribozima e ribozima de cabeça de martelo apropriadas da invenção. 88

Os oligonucleótidos de ARNds podem ser introduzidos na célula por transfeção com um gene alvo heterólogo utilizando composições de veiculo tais como lipossomas, que são conhecidos na técnica, por exemplo, Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Rockville MD) como descrito pelo fabricante para linhas de células aderentes. A transfeção de oligonucleótidos de ARNds para visar genes endógenos pode ser realizada utilizando Oligofectamina (Life Technologies). A eficiência de transição pode ser verificada utilizando microscopia de fluorescência para linhas de células de mamíferos após co-transfeção de pAD3 que codifica hGFP (Kehlenback et al., (1998) J. Cell. Biol.,141: 863-74). A eficácia do ARNi pode ser avaliada por qualquer um de um número de ensaios que seguem a introdução dos ARNds. Estes incluem, mas não se limitam a, análise por transferência de Western utilizando anticorpos que reconhecem o produto de gene alvo após tempo suficiente para recirculação do conjunto endógeno depois de a síntese de novas proteínas ter sido reprimida, e a análise por transferência de Northern para determinar o nível de ARNm alvo existente.

Ainda outras composições, métodos e aplicações da tecnologia de ARNi a serem utilizados são proporcionados nas Patentes U.S. n° 6,278,039,5,723,750 e 5,244,805.

Antagonistas Inibidores do Recetor Tirosina-Cinase A presente invenção refere-se nas reivindicações a um antagonista de PDGF que é um antagonista inibidor específico do recetor tirosina-cinase que é utilizado no tratamento de associação com um antagonista de VEGF. 0 que se segue é uma divulgação geral dos antagonistas inibidores específicos do recetor tirosina-cinase para fins ilustrativos. 89

Na invenção encontra-se incluído o antagonista de tirosina-cinase imatinib (Gleevec®). Outros antagonistas de tirosina-cinase conhecidos na técnica e variantes e alternativas aos mesmos podem ser obtidas utilizando a perícia de rotina na técnica e os ensinamentos da técnica. 0 sinal extracelular de PDGF (e VEGF) é comunicado a outras partes da célula através de um evento de fosforilação mediado por tirosina-cinase efetuado pelo recetor de PDGF (e recetor de VEGF) e que afeta proteínas substrato a jusante do complexo de sinalização ligado à membrana celular. Por conseguinte, os antagonistas que atuam na fase do recetor cinase da sinalização de PDGF (e/ou VEGF) também são eficazes no método da invenção. É conhecido um número de tipos de inibidores de tirosina-cinase que são seletivos para as enzimas do recetor tirosina-cinase tais como PDGFR ou VEGFR (ver, por exemplo, Spada e Myers ((1995) Exp Opin. Ther. Patents, 5: 805) e Bridges ((1995) Exp. Opin. Ther. Patents, 5:1245). Além disso, Law e Lydon resumiram o potencial anticancerígeno de inibidores de tirosina-cinase ((1996) Emerging Drugs: The Prospect For Improved Medicines, 241-260). Por exemplo, a Patente U.S. n° 6,528,526 descreve compostos de quinoxalina substituídos que exibem inibição seletiva da atividade tirosina-cinase do recetor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR). Os inibidores conhecidos da atividade tirosina-cinase de PDGFR incluem os inibidores baseados em quinouna descritos por Maguire et al., ((1994) J. Med. Chem., 37: 2129) e por Dolle et al. , ((1994) J. Med. Chem., 37: 2627). Uma classe de inibidores baseados em fenilamino-pirimidina foi recentemente descrita por Traxler et al., em EP 564409 e por Zimmerman et al., ((1996) Biorg. Med. Chem. Lett., 6:1221-1226) e por Buchdunger et al., ((1995) Proc. Nat. Acad. Sei. (USA), 92: 2558). Os derivados de quinazolina que são úteis na inibição da atividade 90 tirosina-cinase do recetor de PDGF incluem compostos de arilo e compostos de heteroarilo bismono- e biciclico (ver, por exemplo, WO 92/20642), derivados de quinoxalina (ver (1994) Câncer Res., 54: 6106-6114), derivados de pirimidina (Pedido de Patente Japonesa Publicado n° 87834/94) e derivados de dimetoxiquinolina (ver Resumos do 116th Annual Meeting of the Pharmaceutical Society of Japan (Kanazawa), (1996), 2, p. 275, 29(C2) 15-2).

Os exemplos de inibidores de tirosina-cinase de VEGFR incluem derivados cinolina, por exemplo, aqueles descritos na Patente U.S. n° 6,514,971,

Também são conhecidos outros derivados de cinolina desse tipo. Por exemplo, (1995) J. Med Chem., 38: 3482,7 divulga 4-(3-bromoanilino)cinolina; (1968) J. Chem. Soc. C, (9):1152-5 divulga 6-cloro-4-fenoxicinolina; (1984) J. Kamatak Univ., Sei., 29: 82-6 divulga certas 4-anilinocinolinas; e (1973) Indian J. Chem., 11: 211-13 divulga certas 4-feniltiocinolinas. Além disso, (1973) J. Kamatak Univ., 18: 25-30 divulga certas 4-fenoxicinolinas, (1984) J. Karnatak Univ. Sei., 29: 82-6 divulga dois compostos: 4-(4-metoxianilino)-6,7-dimetoxicinolina e 4 —(3 — cloroanilino)-6,7-dimetoxicinolina. Além disso, certas cinolinas com um anel de fenilo ligado através de um grupo selecionado de -O-, -S-, - NH- e -CH2 - na posição 4 são descritas na Patente U.S. n° 5,017,579, Patente U.S. n° 4, 957, 925, Patente U.S. n° 4, 994,474 e EP 0302793 A2.

Ainda estão disponiveis outros compostos relacionados para inibição de VEGFR e/ou PDGFR rastreando novos compostos quanto ao seu efeito na atividade do recetor tirosina-cinase de interesse utilizando um ensaio convencional. A inibição eficaz por um inibidor orgânico de molécula pequena de PDGFR ou VEGFR candidato pode ser seguida 91 utilizando um sistema de ensaio baseado em células bem como outros sistemas de ensaio conhecidos na técnica.

Por exemplo, um teste para a atividade contra o recetor tirosina-cinase de VEGF é como se segue. 0 teste é realizado utilizando o recetor tirosina-cinase de VEGF ΠΕΙ. 0 procedimento detalhado é como se segue: 30 yL de solução de cinase (10 ng do dominio cinase de Flt-1 (ver Shibuya, et al., (1990) Oncogene, 5: 519-24) em Tris.HCl 20 mM, pH 7,5, dicloreto de manganês mM (MnCl2) , cloreto de magnésio 3 mM (MgCl) , vanadato de sódio 10 uM, 0,25 mg/mL de polietilenoglicol (PEG) 20000, ditiotreitol 1 mM e 3 ug/.mu.L de poli(Glu,Tyr) 4:1 (Sigma, Buchs, Suíça), [33P]- ATP 8 uM (0,2 uCi), 1% de dimetilsulfóxido, e 0 a 100 μΜ do composto a ser testado são incubados em conjunto durante 10 minutos à temperatura ambiente. A reação é em seguida terminada pela adição de 10 yL de etilenodiaminotetraacetato (EDTA) 0,25 M, pH 7. Utilizando um distribuidor multicanal (LAB SYSTEMS, EUA), uma alíquota de 2 0 yL é aplicada numa membrana Immobilon P de PVDF (=poli(difluoreto de vinilo)) (Millipore, EUA), através de um tubo de filtro microtítulo e ligado a vácuo. Após eliminação total do líquido, a membrana é sucessivamente lavada 4 vezes num banho contendo ácido fosfórico a 0,5% (H3PO4) e uma vez com etanol, incubada durante 10 minutos de cada vez enquanto é agitada, em seguida montada num Distribuidor TopCount da Hewlett Packard e a radioatividade medida após adição de 10 yL de Microscint.RTM. (líquido do contador de cintilação beta). Os valores de IC50 são determinado por análise de regressão linear das percentagens de inibição de cada composto a três concentrações (como uma regra 0,01 ymol, 0,1 ymol e 1 ymol). Os valores de IC50 dos compostos ativos inibidores de tirosina podem estar na gama de 0,01 yM a 100 yM. 92

Além disso, a inibição de uma atividade de tirosina-cinase/ autofosforilação de VEGFR induzida por VEGF pode ser confirmada com uma outra experiência em células. Resumidamente, células CHO transfetadas, que expressam permanentemente recetor VEGF humano (VEGFR/KDR), são aplicadas em meio de cultura completo (com 10% de soro fetal de vitelo (FCS)) em placas de culturas de células com 6 poços e incubadas a 37°C sob 5% de C02 até exibirem cerca de 80% de confluência. Os compostos a serem testados são em seguida diluidos em meio de cultura (sem FCS, com 0,1% de albumina de soro bovino) e adicionados às células. (Os controlos compreendem meio sem compostos de ensaio). Após uma incubação de duas horas a 37 °C é adicionado VEGF recombinante; a concentração final de VEGF é 20 ng/mL). Após uma incubação de mais cinco minutos a 37°C, as células são lavadas duas vezes com PBS gelado e imediatamente submetidas a lise em 100 yL de tampão de lise por poço. Os lisados são em seguida centrifugados para remover os núcleos das células e as concentrações de proteina dos sobrenadantes são determinadas utilizando um ensaio de proteina comercial (BIORAD). Os lisados podem ser depois imediatamente utilizados ou, se for necessário, conservados a -200 °C.

Em seguida é realizado um ELISA em sanduíche para medir a fosforilação do recetor KDR: um anticorpo monoclonal para KDR é imobilizado em placas EUSA pretas (OptiPlaten™, HTRF-96 da Packard) . As placas são em seguida lavadas e os sítios de ligação sem proteína remanescentes são saturados com BSA a 1% em PBS. Os lisados celulares (20 yg de proteína por poço) são em seguida incubados nestas placas de um dia para o outro a 4°C em conjunto com um anticorpo antifosfotirosina acoplado com fosfatase alcalina (por exemplo, PY20:AP de Transduction Laboratories, Lexington, KY). As placas são novamente lavadas e a ligação do 93 anticorpo antifosfotirosina ao recetor fosforilado capturado é depois confirmada utilizando um substrato AP luminescente (CDP-Star, pronto para ser utilizado, com Emerald II; Applied-Biosystems TROPIX Bedford, MA). A luminescência é medida num Contador de Cintilação de Microplascas Top Count da Packard. A diferença entre o sinal do controlo positivo (estimulado com VEGF ou PDGF) e o do controlo negativo (não estimulado com VEGF ou PDGF) corresponde à fosforilação do recetor KDR induzida por VEGF (=100%). A atividade das substâncias testadas é calculada como a % de inibição da fosforilação do recetor KDR induzida por VEGF, em que a concentração de substância que induz metade da inibição máxima é definida como a ED50 (dose eficaz para 50% de inibição) . Os compostos ativos inibidores de tirosina têm valores de ED50 na gama de 0,001 μΜ a 6 μΜ, tipicamente 0,005 μΜ a 0,5 μΜ.

Formulações Farmacêuticas e Administração Terapêutica

Os agentes anti-VEGF e anti-PDGF são úteis para serem utilizados no tratamento de um distúrbio neovascular ocular tal como degenerescência macular ou retinopatia diabética. Deste modo, assim que um doente é diagnosticado como estando em risco de desenvolver ou possuir um distúrbio neovascular, o doente é tratado por administração de um antagonista de PDGF em associação com um antagonista de VEGF a fim de bloquear respetivamente os efeitos negativos de PDGF e VEGF, suprimindo desse modo o desenvolvimento de um distúrbio neovascular e aliviando os efeitos prejudiciais associados à neovascularização. A utilização de acordo com a presente invenção não resulta em edema da córnea. A terapia de associação anti-PDGF e anti-VEGF de acordo com a invenção pode ser realizada sozinha ou em conjunto com outra terapia e pode ser administrada em casa, no 94 consultório do médico, numa clínica, num departamento ambulatório de um hospital ou num hospital. 0 tratamento começa geralmente num hospital para que o médico possa observar de perto os efeitos da terapia e fazer quaisquer ajustes que sejam necessários. A duração da terapia de associação depende do tipo de distúrbio neovascular a ser tratado, da idade e condição do doente, da fase e tipo de doença do doente, e do modo como o doente responde ao tratamento. Além disso, uma pessoa que tenha um maior risco de desenvolver um distúrbio neovascular (por exemplo, um doente diabético) pode receber tratamento para inibir ou atrasar o início dos sintomas. Uma vantagem significativa proporcionada pela presente invenção é que a associação de um antagonista de PDGF e um antagonista de VEGF para o tratamento de um distúrbio neovascular permite a administração de uma dose baixa de cada antagonista e menos antagonista ativo total, proporcionando desse modo uma eficácia semelhante com menos toxicidade e efeitos secundários, e custos reduzidos. A administração de cada antagonista da terapia de associação pode ser por qualquer meio adequado que resulte numa concentração de antagonista que, combinado com o outro antagonista, é eficaz para o tratamento de um distúrbio neovascular. Por exemplo, cada antagonista pode ser misturado com um veículo adequado e está geralmente presente numa quantidade de 1-95% em peso do peso total da composição. A composição pode ser proporcionada numa forma de dosagem que é adequada para administração oftálmica, oral, parentérica (por exemplo, intravenosa, intramuscular, subcutânea), retal, transdérmica, nasal ou inalante. Por conseguinte, a composição pode estar na forma de, por exemplo, comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, granulados, suspensões, emulsões, soluções, geles incluindo hidrogeles, pastas, pomadas, cremes, emplastros, dispositivos de 95 administração, supositórios, enemas, injetáveis, implantes, formulações p+ara pulverização ou aerossoles. As composições farmacêuticas contendo um antagonista simples ou dois ou mais antagonistas podem ser formuladas de acordo com a prática farmacêutica convencional (ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (20th ed.) ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA. e Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds., J. Swarbrick e J. C. Boilan, 1988-2002, Mareei Dekker, New York).

Num aspeto útil, as associações de antagonistas de PDGF e VEGF são administrada por via parentérica (por exemplo, por injeção intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intraocular, intravitrea, retrobulbar, subconjuntival, subtenoniana ou subcutânea ou implante) ou por via sistémica. As formulações para administração parentérica ou sistémica incluem soluções suspensões ou emulsões aquosas ou não aquosas estéreis. Pode ser utilizada uma variedade de veiculos aquosos, por exemplo, água, água tamponada, soro fisiológico e semelhantes. Os exemplos de outros veiculos adequados incluem polipropileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais, gelatina, hidrogeles, naftalenos hidrogenados e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etilo. Tais formulações também podem conter substâncias auxiliares, tais como conservantes, humectantes, tampões, emulsionantes e/ou dispersantes. Podem ser utilizados polímeros de ácido láctico, copolimeros de ácido láctico/ácido glicólico ou copolimeros de polioxietileno-polioxipropileno biocompativeis, biodegradáveis para controlar a libertação dos ingredientes ativos.

Alternativamente, podem ser administradas associações de antagonistas de PDGF e VEGF por ingestão oral. As 96 composições destinadas a utilização oral podem ser preparadas em formas sólidas ou líquidas, de acordo com qualquer método conhecido na técnica para o fabrico de composições farmacêuticas.

As formas de dosagem sólidas para administração oral incluem cápsulas, comprimidos, pílulas, pós e granulados. Em geral, estas preparações farmacêuticas contêm ingredientes ativos (tais como um antagonista de PDGF de molécula orgânica pequena e um antagonista de VEGF de molécula orgânica pequena) misturados com excipientes não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem incluir, por exemplo, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato de sódio, lactose, sacarose, glucose, manitol, celulose, amido, fosfato de cálcio, fosfato de sódio, caulino e semelhantes. Também podem ser utilizados aglutinantes, agentes tamponizantes e/ou lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio). Os comprimidos e pílulas podem ser adicionalmente preparados com revestimentos entéricos. As composições podem conter opcionalmente edulcorantes, agentes de paladar, corantes, aromatizantes, e conservantes a fim de proporcionar uma preparação mais agradável ao paladar.

Por exemplo, os antagonistas de PDGF e VEGF podem ser administrados por via intraocular por injeção intravítrea no olho, bem como por injeções subconjuntival e subtenoniana. Outras vias de administração incluem transescleral; retrobulbar, intraperitoneal, intramuscular e intravenosa. Alternativamente, uma associação de antagonistas pode ser administrada utilizando um dispositivo de administração de fármaco ou um implante intraocular (ver abaixo). 97

As formas de dosagem líquidas para administração oral incluem emulsões, soluções, suspensões, xaropes e cápsulas de gelatina mole farmaceuticamente aceitáveis. Estas formas contêm diluentes inertes geralmente utilizados na técnica, tais como água ou um meio oleoso, e também podem incluir adjuvantes, tais como humectantes, emulsionantes e agentes de suspensão.

Nalguns casos, a associação de antagonistas de PDGF e VEGF também pode ser administrada por via tópica, por exemplo, através de adesivo ou por aplicação direta numa região, tal como a epiderme ou o olho, suscetível ou afetada por um distúrbio neovascular, ou por iontoforese.

As formulações para utilização oftálmica incluem comprimidos contendo o(s) ingrediente(s) ativo(s) numa mistura com excipientes não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis. Estes excipientes podem ser, por exemplo, diluentes inertes ou enchimentos (por exemplo, sacarose e sorbitol), lubrificantes, deslizantes e antiaderentes (por exemplo, estearato de magnésio, estearato de zinco, ácido esteárico, sílicas, óleos vegetais hidrogenados ou talco).

Os antagonistas de PDGF e VEGF podem ser misturados em conjunto num comprimido ou outro veículo, ou podem estar separados. Num exemplo, o primeiro antagonista está contido no interior do comprimido e o segundo antagonista está no exterior, de tal forma que uma porção substancial do segundo antagonista é libertada antes da libertação do primeiro antagonista. Se desejado, os antagonistas na forma de comprimido podem ser administrados utilizando um dispositivo de administração de fármacos (ver abaixo).

Em geral, cada um dos antagonistas deve ser administrado numa quantidade suficiente para suprimir ou reduzir ou 98 eliminar um efeito prejudicial ou um sintoma de um distúrbio neovascular. A quantidade de um ingrediente antagonista ativo que é combinada com os veículos para produzir uma única dosagem variará dependendo do indivíduo a ser tratado e do modo de administração particular. A dosagem de cada antagonista das associações reivindicadas depende de vários fatores incluindo a gravidade da condição, se a condição é para ser tratada ou prevenida, e da idade, peso e estado de saúde da pessoa a ser tratada. Além disso, a informação farmacogenómica (o efeito do genótipo na farmacocinética, farmacodinâmica ou perfil de eficácia de uma substância terapêutica) sobre um doente particular pode afetar a dosagem utilizada. Além disso, um especialista na técnica aperceber-se-á que as dosagens individuais exatas podem ser um pouco ajustadas dependendo de uma variedade de fatores, incluindo a associação específica de antagonistas de PDGF e VEGF a ser administrada, o tempo de administração, a via de administração, a natureza da formulação, a taxa de excreção, o distúrbio neovascular particular a ser tratado, a gravidade do distúrbio e a localização anatómica do distúrbio neovascular (por exemplo, o olho versus a cavidade do corpo). São esperadas grandes variações na dosagem necessária face às diferentes eficiências das várias vias de administração. Por exemplo, seria geralmente esperado que a administração oral exija níveis de dosagem mais elevados do que a administração por injeção intravenosa ou intravítrea. As variações nestes níveis de dosagem podem ser ajustadas utilizando rotinas empíricas correntes para otimização, as quais são bem conhecidas na técnica. Os níveis e padrões de dosagem terapeuticamente eficazes exatos são tipicamente determinados pelo médico assistente, tal como um oftalmologista, tendo em consideração os fatores acima identificados. 99

Geralmente, quando administrado por via oral a um humano, a dosagem do antagonista de PDGF ou antagonista de VEGF é normalmente de cerca de 0,001 mg até cerca de 200 mg por dia, de modo desejável de cerca de 1 mg até 100 mg por dia, e de modo mais desejável de cerca de 5 mg até cerca de 50 mg por dia. Podem ser necessárias dosagens até cerca de 200 mg por dia. Para administração do antagonista de PDGF ou antagonista de VEGF por injeção, a dosagem é normalmente de cerca de 0,1 mg até cerca de 250 mg por dia, de modo desejável de cerca de 1 mg até cerca de 20 mg por dia, ou de cerca de 3 mg até cerca de 5 mg por dia. As injeções podem ser dadas até cerca de quatro vezes por dia. Geralmente, quando administrado por via parentérica ou sistémica a um humano, a dosagem do antagonista de VEGF a ser utilizado em associação com o antagonista de PDGF é normalmente de cerca de 0,1 mg até cerca de 1500 mg por dia, ou de cerca de 0,5 mg até cerca de 10 mg por dia, ou de cerca de 0,5 mg até cerca de 5 mg por dia. Podem ser necessárias dosagens até cerca de 3000 mg por dia.

Quando administrado oftalmologicamente a um humano, a dosagem do antagonista de VEGF a ser utilizado em associação com o antagonista de PDGF é normalmente de cerca de 0,15 mg até cerca de 3,0 mg por dia, ou de cerca de 0,3 mg até cerca de 3,0 mg por dia, ou de cerca de 0,1 mg até 1,0 mg por dia.

Por exemplo, para utilizações oftálmicas, as substâncias farmacológicas de aptâmero de PDGF-B e VEGF-A são formuladas em soro fisiológico tamponado com fosfato a pH 5-7. Pode ser adicionado hidróxido de sódio ou ácido clorídrico para adaptação do pH. Numa formulação de trabalho, um aptâmero de PDGF-B e um aptâmero de VEGF-A, tal como EYE001, são individualmente formulados a três concentrações diferentes: 3 mg/100 yL, 2 mg/100 pL e 100 1 mg/100 yL embalados numa seringa de vidro graduada de Tipo I USP, de 1 mL estéril munida com uma agulha de calibre 27 estéril. O produto farmacológico de associação está isento de conservantes e destina-se a uma única utilização apenas para injeção intravitrea. O ingrediente ativo é as substâncias farmacológicas PDGF-B e VEGF-A, a concentrações de 30 mg/mL, 20 mg/mL e 10 mg/mL. Os excipientes são Cloreto de Sódio, USP; Fosfato de Sódio Monobásico, Mono-hidratado, USP; Fosfato de Sódio Dibásico, Hepta-hidratado, USP; Hidróxido de Sódio, USP; Ácido Clorídrico, USP; e Água para preparação injetável, USP. Nesta forma, o produtos farmacológicos aptâmeros de PDGF-B e de VEGF-A estão numa solução estéril pronta a utilizar proporcionada numa seringa de vidro de utilização única. A seringa é retirada da armazenagem refrigerada pelo menos 30 minutos (mas não mais do que 4 horas) antes da utilização para permitir que a solução atinja a temperatura ambiente. A administração do conteúdo da seringa envolve a fixação da haste do êmbolo plástico com rosca à rolha de borracha no interior do tambor da seringa. A tampa da extremidade de borracha é em seguida retirada para permitir a administração do produto. Os aptâmeros de PDGF-B e VEGF-A são administrados como injeções intravítreas de 100 yL em três ocasiões com intervalos de 28 dias. Os doentes recebem 3 mg/injeção por visita. A dose é reduzida para 2 mg ou 1 mg, e ainda para 0,1 mg, se for necessário.

As quantidades específicas de fármacos administradas dependem da associação específica de componentes. Numa associação de dose desejada, a proporção de antagonista de PDGF em relação ao antagonista de VEGF é de cerca de 50:1 em peso, cerca de 20:1 em peso, cerca de 10:1 em peso ou cerca de 4:1, cerca de 2:1, ou cerca de 1:1 em peso. 101

Uma terapia de associação útil inclui um aptâmero antagonista de PDGF-B e um aptâmero antagonista de VEGF-A. Os antagonistas são utilizados em associação numa gama de proporção em peso desde cerca de 0,1 até cerca de 5,0 até cerca de 5,0 para 0,1 do aptâmero antagonista de PDGF-B em relação ao aptâmero antagonista de VEGF-A. Uma gama útil destes dois antagonistas (antagonista PDGF-B em relação a VEGF-A) é desde cerca de 0,5 até cerca de 2,0, ou desde cerca de 2,0 a 0,5, enquanto outra proporção útil é desde cerca de 1,0 até cerca de 1,0, dependendo, em última análise, da escolha do aptâmero antagonista de PDGF-B e do aptâmero antagonista de VEGF-A. A administração de cada fármaco na terapia de associação pode ser, independentemente, uma a quatro vezes por dia durante um dia até um ano, e pode ser mesmo durante a vida do doente. A administração crónica, de longo prazo será indicada em muitos casos. A dosagem pode ser administrada como uma única dose ou dividida em doses múltiplas. Em geral, a dosagem desejada deve ser administrada em intervalos fixos durante um periodo prolongado, geralmente pelo menos ao longo de várias semanas, embora possam ser necessários periodos de administração mais longos de vários meses ou mais.

Além do tratamento de distúrbios neovasculares preexistente, a terapia de associação que inclui um antagonista de PDGF e um antagonista de VEGF pode ser administrada profilaticamente a fim de prevenir ou abrandar o inicio destes distúrbios. Nas aplicações profiláticas, os antagonistas de PDGF e VEGF são administrados a um doente suscetivel ou, de outro modo, em risco de um distúrbio neovascular particular. Mais uma vez, o planeamento exato da administração e das quantidades que são administradas 102 depende de vários fatores tais como o estado de saúde do doente, peso, etc.

Num exemplo de trabalho, a associação do antagonista de PDGF e do antagonista de VEGP é administrada a um mamifero necessitado de tratamento com aquela, tipicamente na forma de uma composição farmacêutica injetável. Por exemplo, no aspeto de associação, um aptâmero de PDGF-B e um aptâmero de VEGF-A podem ser administrados separadamente ou na composição farmacêutica compreendendo ambos. É geralmente preferido que essa administração seja por injeção ou utilizando um dispositivo de administração de fármacos. Também é aceitável a administração parentérica, sistémica ou transdérmica.

Como discutido acima, quando o antagonista de PDGF e o antagonista de VEGF são administrados em conjunto, essa administração pode ser sequencial no tempo ou simultânea, sendo o método sequencial um modo de administração. Quando os antagonistas de PDGF e VEGF são administrados sequencialmente, a administração de cada um pode ser por métodos iguais ou diferentes. No entanto, para administração sequencial é útil que o método utilize a administração do antagonista de PDGF ao longo de cerca de cinco segundos (até cerca de três injeções) seguida de administração prolongada a cada seis semanas durante até cerca de nove injeções por ano de um antagonista de VEGF. O antagonista de PDGF pode ser administrado na altura da injeção de cada antagonista de VEGF ou pode ser dado menos frequentemente, como determinado pelo médico. A administração sequencial também inclui uma associação em que os antagonistas individuais podem ser administrados em alturas diferentes ou por vias diferente ou ambas, mas os quais atuam em associação para proporcionar um efeito benéfico, por exemplo, para suprimir um distúrbio 103 neovascular. Refere-se também que a administração por injeção é particularmente útil.

As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser formuladas para libertar os antagonistas ativos de PDGF e VEGF substancialmente logo após administração durante qualquer intervalo de tempo predeterminado após administração, utilizando formulações de libertação controlada. Por exemplo, uma composição farmacêutica que inclui pelo menos um de um antagonista de PDGF e um antagonista de VEGF pode ser proporcionada em composições de libertação prolongada. A utilização de composições de libertação imediata ou prolongada depende da natureza da condição a ser tratada. Se a condição consiste de um distúrbio agudo ou sobre-agudo será tipicamente utilizado o tratamento com uma forma de libertação imediata em vez de uma composição de libertação prolongada. Para certos tratamentos profiláticos ou de longo prazo, também pode ser apropriada uma composição de libertação prolongada. A administração de cada um dos antagonistas em formulações de libertação controlada é útil quando o antagonista, quer sozinho ou em associação, tem (i) um indice terapêutico estreito (por exemplo, a diferença entre a concentração no plasma que leva a efeitos secundários prejudiciais ou reações tóxicas e a concentração no plasma que leva a um efeito terapêutico é pequena; geralmente, o indice terapêutico, TI, é definido como a razão da dose letal mediana (LD50) pela dose eficaz mediana (ED50) ) ; (ii) uma janela de absorção estreita no aparelho gastrointestinal; ou (iii) uma semivida biológica curta, pelo que é necessária uma dosagem frequente durante um dia a fim de manter o nivel no plasma num nivel terapêutico. 104

Podem ser seguidas muitas estratégias para obter uma libertação controlada em que a velocidade de libertação prevalece sobre a velocidade de degradação ou metabolismo do antagonista terapêutico. Por exemplo, uma libertação controlada pode ser obtida pelo escolha apropriada de parâmetros e ingredientes de formulação, incluindo, por exemplo, composições e revestimentos de libertação controlada apropriados. Os exemplos incluem composições de comprimidos ou cápsulas de unidades simples ou múltiplas, soluções oleosas, suspensões, emulsões, microcápsulas, microesferas, nanopartículas, adesivos e lipossomas. Os métodos para preparar tais formulações de libertação prolongada ou controlada são bem conhecidos na técnica.

As composições farmacêuticas que incluem um antagonista de PDGF e/ou um antagonista de VEGF ou ambos também podem ser administradas utilizando um dispositivo de administração de fármacos tal como um implante. Tais implantes podem ser implantes biodegradáveis e/ou biocompatíveis, ou podem ser implantes não biodegradáveis. Os implantes podem ser permeáveis ou impermeáveis ao agente ativo. Os dispositivos de administração farmacológica oftálmica podem ser inseridos numa câmara do olho, tais como as câmaras anterior ou posterior ou podem ser implantados dentro ou sobre a esclera, espaço coroidal ou numa região não vascularizada exterior ao corpo vitreo. Numa forma de realização, o implante pode ser posicionado sobre uma região avascular, tal como sobre a esclera, de modo a permitir a difusão transescleral do fármaco para o sitio de tratamento desejado, por exemplo, o espaço intraocular e a mácula do olho. Além disso, o sitio de difusão transescleral pode ser próximo de um sitio de neovascularização tal como um sitio próximo da mácula. 105

Como assinalado acima, a invenção divulga a combinação de composições farmacêuticas separadas numa embalagem farmacêutica. A associação da invenção pode ser proporcionada como componentes de uma embalagem farmacêutica. Pelo menos dois antagonistas podem ser formulados em conjunto ou separadamente e em quantidades de administração individual. Os antagonistas da invenção também são úteis quando formulados como sais.

Em geral, a embalagem farmacêutica inclui (1) uma quantidade de um antagonista de PDGF, e um transportador, veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável numa primeira forma de dosagem unitária; (2) uma quantidade de um antagonista de VEGF, e um transportador, veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável numa segunda forma de dosagem unitária; e (3) um recipiente. O recipiente é utilizado para separar os componentes e pode incluir, por exemplo, um frasco dividido ou uma embalagem de folha metálica dividida. Se for desejado, as composições antagonistas separadas também podem estar contidas num único recipiente não dividido. A embalagem farmacêutica também pode incluir instruções para a administração dos antagonistas de PDGF e VEGF separados. A embalagem farmacêutica é particularmente vantajosa quando os componentes separados são administrados em formas de dosagem diferentes, são administrados em níveis de dosagem diferentes ou quando é desejada uma titulação dos componentes individuais da associação pelo médico prescritor. Numa forma de realização, a embalagem farmacêutica é concebida para fornecer doses dos antagonistas de PDGF e VEGF, um de cada vez pela ordem da sua utilização pretendida. Noutro exemplo, uma embalagem farmacêutica é concebida para conter filas de um antagonista de PDGF e um antagonista de VEGF colocados lado a lado na embalagem, com instruções na embalagem a 106 comunicar ao utilizador que é para ser administrado um par de antagonistas. Uma embalagem farmacêutica ilustrativa é a chamada embalagem de blister que é bem conhecida na indústria de embalagem farmacêutica. A invenção proporciona um antagonista de PDGF e VEGF para ser utilizado num método de tratamento de um doente necessitado do mesmo, diagnosticado com, ou em risco de desenvolver, um distúrbio neovascular ocular, administrando ao doente um antagonista de PDGF e um antagonista de VEGF, simultaneamente ou em menos de 90 dias um do outro, em quantidades suficientes para tratar o doente. A invenção envolve a administração do antagonista de PDGF e do antagonista de VEGF em menos de cerca de 10 dias um do outro. O antagonista de PDGF e o antagonista de VEGF podem ser administrados em menos de 5 dias um do outro. O antagonista de PDGF e o antagonista de VEGF podem ser administrados em menos de cerca de 24 horas um do outro. O antagonista de PDGF e o referido antagonista de VEGF podem ser administrados simultaneamente.

Eficácia A supressão de um distúrbio neovascular é avaliada por qualquer método aceite para medir se a angiogénese é abrandada ou diminuída. Isto inclui a observação direta e avaliação indireta tal como por avaliação de sintomas subjetivos ou indicadores fisiológicos objetivos. Por exemplo, a eficácia do tratamento pode ser avaliada com base na prevenção ou inversão da neovascularização, microangiopatia, fuga vascular ou edema vascular ou qualquer associação destes. A eficácia de tratamento para avaliar a supressão de um distúrbio neovascular ocular também pode ser definida em termos de estabilização ou melhoramento da acuidade visual. 107

Na determinação da eficácia de uma terapia de associação particular no tratamento ou prevenção de um distúrbio neovascular ocular, os doentes também podem ser clinicamente avaliados por um oftalmologista vários dias após injeção e pelo menos um mês mais tarde, imediatamente antes da injeção seguinte. As acuidades visuais de ETDRS, fotografia com kodachrome e angiografia com fluoresceina também são realizadas mensalmente durante os primeiros 4 meses, consoante necessário pelo oftalmologista.

Por exemplo, a fim de avaliar a eficácia da terapia de associação de antagonista de PDGF e antagonista de VEGF para tratar a neovascularização ocular são realizados estudos envolvendo a administração de injeções intravitreas simples ou múltiplas de um aptâmero de PDGF-B em associação com um aptâmero de VEGF-A em doentes que sofrem de neovascularização coroideia subfoveal secundária a degenerescência macular relacionada com a idade de acordo com métodos correntes bem conhecidos nas técnicas oftalmológicas. Num estudo de trabalho, doentes com neovascularização coroideia subfoveal (CNV) secundária a degenerescência macular relacionada com a idade (AMD) receberam uma única injeção intravitrea de um aptâmero de PDGF-B e um aptâmero de VEGF-A. A eficácia da associação é seguida, por exemplo, por avaliação oftálmica. Os doentes que exibem visão estável ou melhorada três meses após tratamento, por exemplo, que apresentam uma melhoria de 3 linhas ou mais na visão num gráfico de ETDRS, são considerados terem recebido uma associação de dosagem eficaz do aptâmero de PDGF-B e do aptâmero de VEGF-A que suprime um distúrbio neovascular ocular.

Num exemplo de estudo de trabalho, doentes com CNV subfoveal secundária a degenerescência macular relacionada com a idade e com uma acuidade visual pior do que 20/200 no 108 gráfico de ETDRS receberam uma única injeção intravitrea do aptâmero de PDGF-B e do aptâmero de VEGF-A. A dose de partida é de 0,25 mg de cada antagonista injetada intravitreamente uma vez. Também são testadas dosagens de 0,5 mg, 1, 2 mg e 3 mg de cada antagonista. Também é realizado um exame oftálmico completo com fotografia do fundo e angiografia com fluoresceina. O produto farmacológico de associação é uma solução estéril pronta a usar constituída pelo aptâmero de PDGF-B e aptâmero de VEGF-A dissolvidos em tampão de injeção de fosfato de sódio 10 mM e cloreto de sódio a 0,9% num tambor de seringa com corpo de vidro de 1 cc estéril e apirogénico, com uma rolha revestida ligada a um êmbolo plástico e uma tampa de extremidade em borracha na agulha de calibre 27 pré-fixada. Os aptâmeros de PDGF-B e VEGF-A são fornecidos a concentrações farmacológicas de 1 mg/mL, 2,5 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL ou 30 mg/mL para cada aptâmero (exprimidas como teor de oligonucleótido) para proporcionar um volume de administração de 100 pL. Aproximadamente 3 meses após a injeção dos aptâmeros de PDGF-B e VEGF-A são realizados estudos de acuidade para avaliar a eficácia do tratamento. Os doentes que apresentam visão estável ou melhorada após tratamento, por exemplo, aqueles que exibem um aumento de 3 linhas, ou mais, da visão no gráfico de ETDRS, são considerados terem recebido uma associação de dosagem eficaz dos aptâmeros de PDGF-B e VEGF-A que suprime um distúrbio neovascular ocular.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos ilustram certos modos de preparar e praticar a presente invenção.

Exemplo 1: Neovascularização da córnea (NV da córnea) 109 A neovascularização da córnea é um modelo animal muito utilizado que permite a visualização clara de crescimento vascular anormal no olho. Os vasos que crescem para o interior da córnea normalmente avascular, podem tornar-se bem estabelecidos, fazendo com que este se j a um modelo atrativo para estudar a regressão de vasos. A fim de induzir NV experimental da córnea, ratos C57BL/6 machos (18-20 g; Charles River, Wilmington, MA) foram anestesiados com cloridrato de cetamina (25 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) intramuscular. Foi aplicado NaOH (2 yL de 0,2 mM) por via tópica. Os epitélios da córnea e limbo foram removidos aplicando um movimento rotativo paralelo ao limbo utilizando uma lâmina #21 (Feather. Osaka, Japão). Após 7 dias, os ratos foram tratados com injeções intraperitoneais de 25 mg/kg de pegaptanib de sódio (Macugen™ (Eyetech Pharmaceuticals. New York, NY) , um agente aptâmero anti-VEGF também conhecido como EYE001) duas vezes por dia ou por administração oral de 50 mg/kg de Gleevec®/4-[(4-metilpiperazin-l-il)metil]-N-[4-metil-3-[(4-piridin-3-ilpirimidin-2-il)amino]fenil]-benzamida (imatinib) ((também conhecido como CGP57148B) um agente anti-PDGF inibidor de tirosina-cinase, relacionado com 2-fenilaminopirimidina, da Novartis Pharma AG, Basel, Suiça) por sonda gástrica duas vezes por dia ou ambos durante 7 dias. Ao dia 14 após indução de NV da córnea, os ratos receberam 20 ug/g de lectina de concanavalina A acoplada a isotiocianato de fluoresceina (Vector Laboratories, Burlingame, CA) por via intravenosa enquanto estavam profundamente anestesiados com cloridrato de xilazina e cloridrato de cetamina. Trinta minutos depois, os olhos dos ratos foram enucleados e as córneas montadas planas. A NV da córnea foi visualizada utilizando microscopia de fluorescência e quantificada utilizando o software Openlab. A percentagem de córnea coberta pelos vasos foi calculada como uma percentagem da área total da córnea. 110

Foram investigados os efeitos do pegaptanib de sódio e Gleevec na neovascularização da córnea após aplicação de NaOH e na lesão dos epitélios do limbo e da córnea. Os animais tratados com pegaptanib de sódio (Macugen) exibiram uma diminuição de 19,6% (p=0,0014) no crescimento de vasos em comparação com olhos não tratados e tratados com Gleevec (Figura 5) . Os animais tratados com pegaptanib de sódio e Gleevec (Mac+Glee) exibiram um crescimento neovascular significativamente menor na córnea (35,6% p<0,0001) em comparação com os controlos e animais tratados apenas com Gleevec (Figura 5) . O tratamento de associação também foi mais eficaz do que o pegaptanib de sódio (Macugen) sozinho na redução do crescimento de vasos (16% p<0,0145).

Os resultados de experiências representativas de neovascularização da córnea também são mostrados nas Figuras 6 e 7. A Figura 6 (D) é uma representação fotográfica de uma imagem microscópica fluorescente que mostra a inibição eficaz da formação de novos vasos sanguíneos em córneas tratadas com uma associação (Mac+Gleevec), em comparação com os tratamentos individuais com Macugen (Figura 6 (C) ) ou Gleevec (Figura 6 (B) ) . A Figura 6 (A) é uma representação fotográfica de uma imagem microscópica fluorescente que mostra a extensão de neovascularização numa córnea de controlo (tratada com PEG) . A Figura 7 é uma representação fotográfica de uma imagem microscópica fluorescente que mostra que os tratamentos individuais (Figura 7 (A) (tratados com APBS) e Figura 7 (B) (tratados com Gleevec)) e combinado (Figura 7 (C) ) inibiram apenas o crescimento de novos vasos e não afetaram vasos sanguíneos estabelecidos. A Figura 7 (D) é uma representação fotográfica de uma imagem microscópica fluorescente que mostra a extensão de neovascularização numa córnea de controlo (tratada com PEG). 111

Exemplo 2: Neovascularização coroideia (CNV) A CNV experimental é frequentemente utilizada como um modelo da degenerescência macular relacionada com a idade (AMD). Neste modelo, os vasos da coroide crescem através de ruturas na membrana de Bruch e para o interior da retina, à semelhança do que é observado em doentes com AMD. Para induzir CNV experimental, ratos C57BL/6 machos (18-20 g; Charles River, Wilmington, MA) foram anestesiados com cloridrato de cetamina (25 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) intramuscular e as pupilas foram dilatadas com tropicamida a 1%. Foram gerados quatro manchas utilizando fotocoagulaçao com laser de diodo (75 ym de tamanho da mancha, 0,1 segundos de duração, 90 mW, laser Oculight SL, IRIDEX, Mountain View, CA) e um lamela de cobertura segura pela mão como uma lente de contacto. As manchas estavam localizadas nas posições das 3, 6, 9 e 12 horas do polo posterior da retina. A produção de um bolha na altura do laser, a qual indica rutura da membrana de Bruch, é um fator importante na obtenção de neovascularização coroideia, pelo que apenas foram incluídos no estudo os ratos em que foi produzida uma bolha em todas as quatro manchas. Após 7 dias, os ratos foram tratados com injeções intraperitoneais de 25 mg/kg de pegaptanib de sódio duas vezes por dia ou 50 mg/kg de Gleevec®/STI57 (Novartis Pharma AG, Basel, Suíça) por sonda gástrica duas vezes por dia ou ambos durante 7 dias. Nas experiências que utilizam APB5 (um anticorpo anti-PDGFRb de rato (CD140b) (agente anti-PDGF) de eBioscience, San Diego, CA) foram administrados 5 mg/kg de anticorpo utilizando injeções intraperitoneais duas vezes por dia. A área das lesões NV da coroide foram medidas em coroides montadas planas reveladas com PECAM. As montagens planas foram examinadas por microscopia de fluorescência e quantificadas utilizando o software Openlab. 112

Os olhos tratados com pegaptanib de sódio (Macugen™) exibiram uma diminuição de 24% (p=0,007) na área de CNV em comparação com controlos não tratados (Figura 8). Em contraste, os olhos tratados com APBS não foram significativamente diferentes dos controlos (diminuição de 6,5% na área de CNV em comparação com o controlo). Os olhos tratados com pegaptanib de sódio e APB5 exibiram significativamente menos (46% p=0,001) área de CNV em comparação com os olhos de controlo ou os olhos tratados apenas com pegaptanib de sódio (22% p=0,0011) ou APB5 (39,5% p<0,0001) (Figura 8).

Foi observada uma tendência semelhante quando se utilizou o inibidor de PDGFRP. Os olhos tratados com Gleevec® não exibiram qualquer diferença significativa em relação aos olhos de controlo (4,2%) (Figura 9). No entanto, a área de CNV nos olhos tratados com pegaptanib de sódio (Macugen™) foi significativamente diferente daquela dos controlos (27% menos p=0,0034). É importante dizer que, os animais tratados com pegaptanib de sódio e Gleevec (Macugen+Gleevec) exibiram a menor quantidade de CNV (46% p<0,0001) em comparação com os olhos de controlo e uma diminuição de 19% na área de CNV em comparação com os olhos tratados apenas com pegaptanib de sódio (p=0,0407) (Figura 9) .

Exemplo 3: Modelo de rato neonatal

Foi investigado o efeito da administração de pegaptanib de sódio (Macugen™) e ARC-127 (Archemix Corp., Cambridge, MA), um aptâmero anti-PDGF PEGuilado possuindo a sequência CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT (SEQ ID NO: 23, a qual corresponde à SEQ ID NO: 146 da Patente U.S. n° 6,582,918) possuindo 2'-fluoro-2'-desoxiuridina nas posições 6, 20 e 30, 2'-fluoro-2'-desoxicitidina nas posições 8, 21, 28 e 29, 2'-O-Metil-2'-desoxiguanosina nas posições 9, 15, 17 e 113 31, 2'-O-Metil-2'-desoxiadenosina na posição 22, "N" nas posições 10 e 23 de um fosforamideto de hexaetileno-glicol, e uma T com orientação invertida (isto é, ligada 3'-3') na posição 32, ou de ambos em vasos da retina em desenvolvimento. Os ratos C57BL/6 neonatais foram injetados diariamente (na cavidade intraperitoneal) com 100 yg de ARC-127 ou 100 yg de Macugen ou ambos, começando no dia 0 pós-natal (PO). Os olhos dos ratos foram enucleados em P4. A vasculatura retiniana foi visualizada em retinas montadas planas por imunorrevelação com PECAM e NG-2 ou por perfusão com ConA-FITC e analisada por microscopia de fluorescência. A injeção de ARC-127 bloqueou completamente o recrutamento de células murais para os vasos da retina em desenvolvimento. Além disso, foi observado menos crescimento de vasos em P4 em comparação com as retina de controlo não tratada. Em contraste, o Macugen não interferiu com o desenvolvimento normal dos vasos sanguíneos. No entanto, os ratos tratados com Macugen e ARC-127 exibiram defeitos semelhantes mas significativamente mais graves do que os ratos tratados apenas com ARC-127.

Estes resultados, representados na Figura 10, mostram que o Macugen não tem qualquer efeito nos vasos sanguíneos da retina em desenvolvimento. O antagonista de PDGFR-B ARC-127 afeta a excrescência e morfologia dos vasos. No entanto, o Macugen em associação com ARC-127 afeta os vasos sanguíneos mais gravemente do que qualquer um deles sozinho.

Exemplo 4: Terapia de Associação com aptâmero anti-PDGF e anticorpo anti-VEGF.

Neste exemplo é demonstrada a eficácia de uma terapia de associação utilizando aptâmeros anti-PDGF e um anticorpo 114 anti-VEGF utilizando o modelo de neovascularização da córnea descrito acima. Para induzir NV experimental da córnea, ratos C57BL/6 machos (18-20 g; Charles River, Wilmington, ΜΔ) são anestesiados com cloridrato de cetamina (25 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) intramuscular, e é aplicado NaOH (2 yL de 0,2 mM) por via tópica. Os epitélios da córnea e limbo são retirados aplicando um movimento rotativo paralelo ao limbo utilizando uma lâmina #21 (Feather, Osaka, Japão). Após 7 dias, os ratos são tratados com injeções intraperitoneais de 25 mg/kg de um aptâmero anti-PDGF possuindo a estrutura de 40Kd PEG-5'-CAGGCTACGCGTAG-AGCATCATGATCCTG(iT)-3' (em que iT representa que o nucleótido final está na orientação invertida (ligado 3'-3')) em associação com 100 yg do anticorpo anti-VEGF 2C3 descrito na U.S. 6,342,221. No dia 14 após indução de NV da córnea, os ratos receberam 20 yg/g de lectina de concanavalina A acoplada a isotiocianato de fluoresceina (Vector Laboratories, Burlingame, CA) por via intravenosa enquanto estavam profundamente anestesiados com cloridrato de xilazina e cloridrato de cetamina. Trinta minutos depois, os olhos dos ratos são enucleados e as córneas montadas planas. A NV da córnea é visualizada utilizando microscopia de fluorescência e quantificada utilizando o software Openlab. A percentagem de córnea coberta por vasos é calculada como uma percentagem da área total da córnea. Os resultados demonstram a eficácia da terapia de associação em relação aos tratamentos individuais apenas com o aptâmero anti-PDGF ou o anticorpo anti-VEGF.

Em experiências separadas, são testados os efeitos de dois aptâmeros anti-PDGF relacionados em associação com 100 yg do anticorpo anti-VEGF 2C3 descrito na U.S. 6,342,221. São testadas versões PEGuiladas e não PEGuiladas dos seguintes dois aptâmeros anti-PDGF: (i) CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT (SEQ ID NO: 23, a qual corresponde à SEQ ID 115 NO: 146 da U.S. 6,562,918) possuindo 2'-fluoro-2'-desoxiuridina nas posições 6, 20 e 30, 2'-fluoro-2 ' -desoxicitidina nas posições 8, 21, 28 e 29, 2'-O-Metil-2'-desoxiguanosina nas posições 9, 15, 17 e 31, 2'-O-Metil-2'-desoxiadenosina na posição 22, "N" nas posições 10 e 23 de um fosforamideto de hexaetileno-glicol, e uma T de orientação invertida (isto é, ligada 3'-3') na posição 32; e (ii) CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT (ver SEQ ID NO: 87 da U.S. 5,723,594) possuindo O-metil-2-desoxicitidina em C na posição 8, 2-0-metil-2-desoxiguanosina nas Gs nas posições 9, 17 e 31, 2-0-metil-2-desoxiadenina em A na posição 22, 2-0-metil-2-desoxiuridina na posição 30, 2-fluoro-2-desoxiuridina em U nas posições 6 e 20, 2- fluoro-2-desoxicitidina em C nas posições 21, 28 e 29, um espaçador de fosforamideto de pentaetilenoglicol em N nas posições 10 e 23, e uma T de orientação invertida (isto é, ligada 3'-3') na posição 32. São proporcionados controlos apropriados para detetar o efeito anti-neovascular melhorado da terapia de associação em relação aos tratamentos individuais com aptâmero anti-PDGF ou anticorpo anti-VEGF. Os resultados demonstram a eficácia da terapia de associação em relação aos tratamentos individuais apenas com o aptâmero anti-PDGF ou o anticorpo anti-VEGF.

Exemplo 5: Associação de aptâmero anti-PDGF e aptâmero anti-VEGF bloqueia a Neovascularização Coroideia (CNV)

Neste exemplo é demonstrada a eficácia de uma terapia de associação utilizando aptâmeros anti-PDGF e aptâmeros anti-VEGF no bloqueio da neovascularização coroideia utilizando o modelo de neovascularização coroideia descrito acima. A CNV experimental é frequentemente utilizada como um modelo para a Degenerescência macular relacionada com a idade (AMD). Neste modelo, os vasos da coroide crescem através de ruturas na membrana de Bruch e par o interior da retina, à 116 semelhança do que é observado em doentes com AMD. Para induzir CNV experimental, ratos C37BL/6 machos (18-20 g; Charles River, Wilmington, MA) são anestesiados com cloridrato de cetamina (25 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) intramuscular e as pupilas são dilatadas com tropicamida a 1%. São geradas quatro manchas utilizando fotocoagulação com laser de díodo (75 um de tamanho de mancha, 0,1 segundos de duração, 90 mW, laser Oculight SL, IRIDEX, Mountain View, CA) e uma lamela de cobertura segura pela mão como um lente de contacto. As manchas foram localizadas nas posições às 3, 6, 9 e 12 horas do pólo posterior da retina. A produção de uma bolha na altura do laser, a qual indica rutura da membrana de Bruch, é um fator importante na obtenção de neovascularização coroideia, pelo que apenas foram incluídos no estudo os ratos em que foi produzida uma bolha em todas as quatro manchas. Após 7 dias, os ratos são tratados com injeções intraperitoneais de 25 mg/kg e pegaptanib de sódio duas vezes por dia. Nas experiências que utilizam o aptâmero anti-PDGF, 25 mg/kg de um aptâmero anti-PDGF possuindo a estrutura de 40Kd PEG-5'-CAGGCTACGCGTAGAGCATCATGATCCTG(iT)-3' (em que iT representa que o nucleótido final está na orientação invertida (ligado 3'-3')) é coadministrado com pegaptanib de sódio. A área de lesões NV da coroide é medida em coroides montadas planas, reveladas com PECAM. As montagens planas são examinadas por microscopia de fluorescência e quantificadas utilizando o software Openlab. Os resultados demonstram que os olhos tratados com a terapia de associação exibem significativamente menos área de CNV em comparação com os olhos de controlo ou os olhos tratados apenas com pegaptanib de sódio ou o aptâmero anti-PDGF.

Em experiências separadas, são testados os efeitos de dois aptâmeros anti-PDGF relacionados em associação com o tratamento anti-VEGF por injeções intraperitoneais de 25 117 mg/kg de pegaptanib de sódio duas vezes por dia. São testadas versões PEGuiladas e não PEGuiladas dos seguintes dois aptâmeros anti-PDGF: (i) CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT (SEQ ID NO: 23, a qual corresponde à SEQ ID NO: 146 da Patente U.S. n° 6,582,918) possuindo 2'-fluoro- 2'-desoxiuridina nas posições 6, 20 e 30, 2 ' -fluoro-2'- desoxicitidina nas posições 8, 21, 28 e 29, 2'-O-Metil-2'- desoxiguanosina nas posições 9, 15, 17 e 31, 2'-O-Metil-2'- desoxiadenosina na posição 22, "N" nas posições 10 e 23 de um fosforamideto de hexaetileno-glicol, e uma T de orientação invertida (isto é, ligada 3'-3') na posição 32; e (ii) CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT (ver SEQ ID NO: 87 da Patente U.S. n° 5,723,594) possuindo 0-metil-2-desoxicitidina em C na posição 8, 2-0-metil-2-desoxiguanosina nas Gs nas posições 9, 17 e 31, 2-0-metil-2-desoxiadenina em A na posição 22, 2-0-metil-2-desoxiuridina na posição 30, 2-fluoro-2-desoxiuridina em U nas posições 6 e 20, 2-f luoro-2-desoxicitidina em C nas posições 21, 28 e 29, um espaçador de fosforamideto de pentaetilenoglicol em N nas posições 10 e 23, e uma T de orientação invertida (isto é, ligada 3'-3') na posição 32. São proporcionados os controlos apropriados para detetar o efeito anti-neovascular melhorado da terapia de associação em relação aos tratamentos individuais com aptâmero anti-PDGF ou aptâmero anti-VEGF. Os resultados demonstram a eficácia da terapia de associação no bloqueio da neovascularização coroideia em relação aos tratamentos individuais apenas com qualquer um dos aptâmeros anti-PDGF ou o aptâmero anti-VEGF.

Exemplo 6: Neovascularização da Córnea (NV da Córnea) Regressão O modelo de NV da córnea do Exemplo 1 foi utilizado para investigar a associação de um aptâmero anti-VEGF e um 118 aptâmero anti-PDGF. Após 10 dias, os ratos foram tratados com injeções intraperitoneais de 25 mg/kg de pegaptanib de sódio (Macugen™, Eyetech Pharmaceuticals, New York, NY), um agente aptâmero anti-VEGF, duas vezes por dia e/ou de 50 mg/kg de ARC-127 (Archemix Corp., Cambridge, MA) um aptâmero anti-PDGF possuindo a estrutura de 40Kd PEG-5'-CAGGCTACGCGTAGAGCATCATGA-TCCTG(iT)-3' (em que iT representa que o nucleótido final está na orientação invertida (ligado 3'-3')) uma vez por dia durante 10 dias. No dia 20 após indução de NV da córnea, os olhos foram enucleados e as córneas montadas planas. A NV da córnea foi visualizada utilizando revelação com CD31 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) e quantificada utilizando o software Metamorph. A percentagem de córnea coberta por vasos foi calculada como uma percentagem da área total da córnea.

Os efeitos de pegaptanib de sódio e/ou ARC-127 na regressão da neovascularização da córnea após aplicação de NaOH e lesão dos epitélios do limbo e córnea estão representados nas Figuras 11 e 12. Os animais tratados com ARC-127 não mostraram uma diminuição significativa no crescimento de vasos em comparação com o controlo no dia 20. Os controlos no dia 20 exibiram um aumento de 12,92% na neovascularização da córnea quando comparados com os controlos no dia 10. Os animais tratados apenas com pegaptanib de sódio (Macugen) mostraram uma diminuição de 13,81 % (p^,016) no crescimento de vasos em comparação com os controlos no dia 20. Os animais tratados com pegaptanib de sódio e ARC-127 exibiram significativamente menos crescimento neovascular na córnea (26,85%, p^,002) em comparação com o controlo.

Exemplo 7; Neovascularização da Córnea (NV da Córnea) Regressão 119 0 modelo de NV da córnea do Exemplo 1 foi utilizado para investigar a associação de um aptâmero anti-VEGF e um anticorpo contra o recetor de PDGFB. Após 14 dias, os ratos foram tratados com injeções intraperitoneais de 25 mg/kg de pegaptanib de sódio (Macugen, um agente aptâmero anti-VEGF) duas vezes por dia e/ou por administração oral de 50 mg/kg de APB5 (um anticorpo policlonal contra o recetor de PDGFB) por sonda gástrica duas vezes por dia durante 14 dias. No dia 28 após indução de NV da córnea, os ratos receberam 20 yg/g de lectina de concanavalina A acoplada a isotiocianato de fluoresceina (Vector Laboratories, Burlingame, CA) por via intravenosa enquanto estavam profundamente anestesiados com cloridrato de xilazina e cloridrato de cetamina. Trinta minutos depois, os olhos dos ratos foram enucleados e as córneas montadas planas. A NV da córnea foi visualizada utilizando microscopia de fluorescência e quantificada utilizando o software Openlab. A percentagem de córnea coberta por vasos foi calculada como uma percentagem da área total da córnea.

Os efeitos de pegaptanib de sódio e/ou APB5 na regressão da neovascularização da córnea após aplicação de NaOH e lesão dos epitélios do limbo e córnea estão representados na Figura 13. Os animais tratados com pegaptanib de sódio (Macugen) exibiram uma diminuição de 8,3% no crescimento de vasos em comparação com o controlo. Os animais tratados com pegaptanib de sódio e APB5 exibiram significativamente menos crescimento neovascular na córnea (21,4%) em comparação com o controlo.

Exemplo 8: Neovascularização da Córnea (NV da Córnea) -Regressão (Ordem de Adição do Agente Terapêutico) O modelo de NV da córnea do Exemplo I foi utilizado para investigar o efeito da ordem de adição da terapia de 120 associação utilizando um aptâmero anti-VEGF e um anticorpo contra o recetor de PDGFB. Após 14 dias, os ratos foram tratados com injeções intraperitoneais de 25 mg/kg de pegaptanib de sódio (Macugen, um agente aptâmero anti-VEGF) duas vezes por dia e/ou por administração oral de 50 mg/kg de APB5 (eBioscience, San Diego, CA) , um anticorpo policlonal contra o recetor de PDGFB, por sonda gástrica duas vezes por dia durante 7 dias em pontos no tempo diferentes. No dia 28 após indução de NV da córnea, os ratos receberam 20 yg/g de lectina de concanavalina A acoplada a isotiocianato de fluoresceina (Vector Laboratories, Burlingame, CA) por via intravenosa enquanto estavam profundamente anestesiados com cloridrato de xilazina e cloridrato de cetamina. Trinta minutos depois, os olhos dos ratos foram enucleados e as córneas montadas planas. A NV da córnea foi visualizada utilizando microscopia de fluorescência e quantificada utilizando o software Openlab. A percentagem de córnea coberta por vasos foi calculada como uma percentagem da área total da córnea e os resultados estão representados na Figura 14.

Os efeitos de pegaptanib de sódio sozinho desde o dia 21-28 ou de APB5 sozinho desde o dia 14-21 seguido de nenhum tratamento mostrou um efeito pequeno em comparação com o controlo na regressão da neovascularização da córnea após aplicação de NaOH e lesão dos epitélios do limbo e córnea. Os animais tratados com APB5 desde o dia 14-21 e pegaptanib de sódio desde o dia 21-28 exibiram menos crescimento neovascular na córnea (13,4%) em comparação com o controlo.

Lisboa, 26 de Julho de 2012

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Associação de um antagonista de PDGF e um antagonista de VEGF para ser utilizado num método para o tratamento ou prevenção de um distúrbio neovascular ocular, em que o antagonista de PDGF é 4 — [ (4 — metilpiperazin-l-il)metil]-N-[4-metil-3-[(4-piridin-3-ilpirimidin-2-il)amino]fenil]benzamida (imatinib) e o antagonista de VEGF é pegaptanib ou um seu sal, em que o antagonista de PDGF e o antagonista de VEGF são para administração simultânea, separada ou sequencial.

2. Associação de um antagonista de PDGF e um antagonista de VEGF para ser utilizado num método para o tratamento ou prevenção de um distúrbio neovascular ocular, em que o antagonista de PDGF é um anticorpo anti-PGDF ou seu fragmento de ligação, e o antagonista de VEGF é pegaptanib ou um seu sal, em que o antagonista de PDGF e o antagonista de VEGF são para administração simultânea, separada ou sequencial.

3. Associação de um antagonista de PDGF e um antagonista de VEGF para ser utilizado num método para o tratamento ou prevenção de um distúrbio neovascular ocular, em que o antagonista de PDGF é um aptâmero anti-PDGF peguilado ou não peguilado possuindo a sequência CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT, em que as posições 6, 20 e 30 são 2'-fluoro-2'-desoxiuridina, as posições 8, 21, 28 e 29 são 2'-fluoro-2'- desoxicitidina, as posições 9, 15, 17, e 31 são 2' -0-Metil-2'-desoxiguanosina, a posição 22 é 2'-0-Metil-2'-desoxiadenosina, "N" nas posições 10 e 23 é de fosforamideto de hexaetileno-glicol e a posição 32 está ligada 3'-3', ou um aptâmero anti-PDGF peguilado ou não peguilado possuindo a sequência CAGGCUACGN 2 CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT, em que a posição 8 é 0-metil-2-desoxicitidina, as posições 9, 17 e 31 são 2- 0-metil-2-desoxiguanosina, a posição 22 é 2-0-metil-2-desoxiadenina, a posição 30 é 2-0-metil-2- desoxiuridina, as posições 6 e 20 são 2-fluoro-2-desoxiuridina, as posições 21, 28 e 29 são 2-fluoro-2-desoxicitidina, "N" nas posições 10 e 23 é um espaçador de pentaetileno glicol e a posição 32 está ligada 3'-3', e o antagonista de VEGF é pegaptanib ou um seu sal, em que o antagonista de PDGF e o antagonista de VEGF são para administração simultânea, separada ou sequencial.

4. Associação de um antagonista de PDGF e um antagonista de VEGF para ser utilizado num método para o tratamento ou prevenção de um distúrbio neovascular ocular, em que o antagonista de PDGF é um aptâmero anti-PDGF peguilado ou não peguilado possuindo a sequência CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT, em que as posições 6, 20 e 30 são 2'-fluoro-2'-desoxiuridina, as posições 8, 21, 28 e 29 são 2'-fluoro-2'- desoxicitidina, as posições 9, 15, 17 e 31 são 2 '-0- Metil-2'-desoxiguanosina, a posição 22 é 2'-0-Metil-2'-desoxiadenosina, "N" nas posições 10 e 23 é de fosforamideto de hexaetileno-glicol e a posição 32 está ligada 3'-3', ou um aptâmero anti-PDGF peguilado ou não peguilado possuindo a sequência CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT, em que a posição 8 é 0-metil-2-desoxicitidina, as posições 9, 17 e 31 são 2- 0-metil-2-desoxiguanosina, a posição 22 é 2-0-metil-2-desoxiadenina, a posição 30 é 2-0-metil-2- desoxiuridina, as posições 6 e 20 são 2-fluoro-2-desoxiuridina, as posições 21, 28 e 29 são 2-fluoro-2-desoxicitidina, "N" nas posições 10 e 23 é um espaçador de pentaetileno glicol e a posição 32 está 3 ligada 3'-3', e o antagonista de VEGF é um anticorpo ou seu fragmento de ligação, em que o antagonista de PDGF e o antagonista de VEGF são para administração simultânea, separada ou sequencial.

5. Associação de um antagonista de PDGF e um antagonista de VEGF para ser utilizado num método para o tratamento ou prevenção de um distúrbio neovascular ocular, em que o antagonista de PDGF é um aptâmero anti-PDGF peguilado possuindo a sequência CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT, em que as posições 6, 2 0 e 30 são 2 '-fluoro-2'-desoxiuridina, as posições 8, 21, 28 e 29 são 2'-fluoro-2'-desoxicitidina, as posições 9, 15, 17 e 31 são 2'-O-Metil-2'-desoxiguanosina, a posição 22 é 2'-O-Metil-2'-desoxiadenosina, "N" nas posições 10 e 23 é de fosforamideto de hexaetileno-glicol e a posição 32 está ligada 3'-3', e o antagonista de VEGF é um anticorpo ou seu fragmento de ligação, em que o antagonista de PDGF e o antagonista de VEGF são para administração simultânea, separada ou sequencial.

6. Associação do antagonista de PDGF e do antagonista de VEGF para ser utilizada num método de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, os quais são formulados separadamente como medicamentos, em que os antagonistas são definidos como em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

7. Associação do antagonista de PDGF e do antagonista de VEGF para ser utilizada num método de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, os quais são formulados num único medicamento, em que os antagonistas são definidos como em qualquer uma das reivindicações 1 a 5. 4

8. Associação do antagonista de PDGF e do antagonista de VEGF para ser utilizada num método de qualquer uma das reivindicações 2, 6 ou 7, em que o antagonista de PDGF é um anticorpo anti-PDGF-B ou seu fragmento de ligação.

9. Associação do antagonista de PDGF e do antagonista de VEGF para ser utilizada num método de qualquer uma das reivindicações 4 a 7, em que o antagonista de VEGF é um anticorpo anti-VEGF-A ou seu fragmento de ligação.

10. Associação do antagonista de PDGF e do antagonista de VEGF para ser utilizada num método de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou 6 a 8, em que o antagonista de VEGF é pegaptanib de sódio.

11. Associação do antagonista de PDGF e do antagonista de VEGF para ser utilizada num método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o distúrbio neovascular ocular é retinopatia isquémica, neovascularização da íris, neovascularização intraocular, degenerescência macular relacionada com a idade, neovascularização da córnea, neovascularização retiniana, neovascularização coroideia, isquemia retiniana diabética ou retinopatia diabética proliferativa.

12. Associação de um antagonista de PDGF e um antagonista de VEGF para ser utilizada num método para o tratamento ou prevenção de um distúrbio neovascular ocular, em que o antagonista de PDGF é um anticorpo ou seu fragmento de ligação e o antagonista de VEGF é um anticorpo ou seu fragmento de ligação. Lisboa, 26 de Julho de 2012