KR102235868B1 - 안구 병태의 치료를 위한 vegf 중화 프로드럭 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하나 이상의 안구 병태의 치료 방법에서 사용하기 위한, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제(들), 및 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기를 포함하고 있는 VEGF 중화 프로드럭을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

안구 병태의 치료를 위한 VEGF 중화 프로드럭{VEGF NEUTRALIZING PRODRUGS FOR THE TREATMENT OF OCULAR CONDITIONS}
본 발명은 하나 이상의 안구 병태의 치료 방법에서 사용하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.
실명의 주요 원인은 특정 눈 질환을 충분히 치료할 수 없는 것이다. 주요 한계는 눈에 약물 또는 치료제의 도입 및 그 안에서 필요한 기간 동안 이들 약물 및 치료제를 치료학적으로 효과적인 농도로 유지하는 것에 대한 적합한 선택권 부족이다. 약물의 허용되지 않는 부작용의 증가된 발생과 함께, 종종 효과적인 안내 농도를 달성하기 위하여 허용되지 않을 정도로 높은 전신 투약이 필요하기 때문에, 전신 투여는 이상적인 해결책이 아닐 수 있다. 약물이 눈물-작용에 의해 빠르게 씻길 수 있거나 일반 순환으로 눈 사이에서 고갈되기 때문에 단순한 안구 점적주입 또는 적용은 많은 경우에 허용되는 대안이 아니다. 불량한 흡수, 수일 내지 수년의 기간 동안 빈번한 투약 및/또는 만성 투약의 필요성, 수양액의 빠른 대사회전, 눈물 막의 생성 및 움직임 및 기타 원인으로 요법이 완료되거나 적절한 투약이 전달되기 훨씬 전에 치료제가 효과적으로 제거될 수 있고, 이로 인해 국소적 점안제 요법은 제한된다.
안내 주입은 국소적 전달과 같은 다른 전달 메커니즘에 비해 눈의 표적 위치(예를 들면, 망막)에 강화된 생체이용효율을 제공할 수 있는 잇점을 갖는다. 그러나, 이들은 또한 단점도 갖고 다양한 다른 문제들이 존재할 수 있다. 예를 들면, 유리체내 주입은, 치료제가 상대적으로 가용성인 경우 특히, 표적 위치 또는 다른 곳에 원치않는 고농도의 치료제의 전달을 야기할 수 있다. 게다가, 안내 주입은 환자에게 큰 불쾌함을 준다. 추가로, 안내 주입 그 자체가 내안구염 및 망막 박리와 같은 문제를 야기할 수 있기 때문에, 눈 내에서 약물의 치료학적 수준을 유지하면서 주입 사이 기간을 가장 길게 갖는 것이 매우 바람직하다.
상기 이외에, 유리체내 주입에 의해 전달된 치료제는 제제가 주입 후 종종 눈 내에서 빠르게 분산되기 때문에 작용 기간이 부족하다. 이러한 기간 부족은 더 큰 주입 빈도를 필요로 하기 때문에 특히 바람직하지 않다. 예를 들면, 라니비주맙 및 페갑타닙을 각각 4 및 6주 마다 안내 주입을 통해 환자에게 투여하는데, 이는 환자에게 매우 불쾌한 경험이다.
따라서, 안과학 분야에서는 더 오래 지속되는 제형이 유리하다는 것이 보편화된 인식이다. 이들은 처방된 치료학적 의료 계획에 대한 환자 수용성과 관련된 문제를 최소화하면서 눈에 치료제의 장기간 전달을 제공함으로써 환자 관리 및 안구 건강을 이롭게 할 수 있다.
혈관형성 및 혈관신생을 자극하는 세포에 의해 생성된 단일 단백질인 혈관 내피 성장 인자(VEGF: vascular endothelial growth factor)의 발현은 황반 변성 및 망막증의 특정한 형태와 같은 다양한 안구 병태에서 중요한 역할을 수행한다.
라니비주맙, 아플리베르셉트 및 페갑타닙와 같은 이러한 안구 병태를 치료하는 다양한 약제가 시중에 나와 있다. 환자에 대한 적용은 4 및 8주 마다 안내 주입을 통해 실시된다.
상기를 고려하여, 이러한 문제점들을 적어도 부분적으로 극복하는 투여 형태가 제공될 필요가 존재한다.
당해 목표는 하나 이상의 안구 병태의 치료 방법에서 사용하기 위한 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제(들) 및 VEGF 중화 프로드럭을 포함하는 약제학적 조성물에 의해 달성되고, 여기서 프로드럭은 공유 결합된 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기를 포함한다.
본 발명 내에서 용어는 하기와 같은 의미로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "VEGF 중화 약물"은 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 효과의 중화를 통해 약제학적 효과를 나타내는 약물을 의미한다. VEGF의 효과는 VEGF 수용체에 결합 또는 VEGF 자체에 결합하여 VEGF의 이의 수용체에 대한 효과적인 결합을 차단하거나 감소시키는 약물에 의해 중화될 수 있다. 대안적으로 중화 효과는 VEGF의 발현 및 생성을 억제하거나 방해하거나, VEGF 시그널링을 방해함으로써 수득될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "하이드로겔"은 공유적 화학 가교결합의 존재로 인하여 불용성인, 단중합체 또는 공중합체로 구성된 친수성 또는 양친매성 중합체 네트워크를 의미한다. 가교결합은 네트워크 구조 및 물리적 무결성을 제공한다. 하이드로겔은 수성 매질에서 이들은 팽창하게 하는 물과 열역학적 혼화성을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "시약"은 또 다른 작용기와 반응을 위한 작용기를 포함하는 화학적 화합물을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "골격 시약(backbone reagent)"은 하이드로겔을 형성하기 위한 출발 물질로서 적합한 시약을 의미한다. 본원에서 사용되는 골격 시약은 바람직하게는 생분해성 결합을 포함하지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "가교결합제 시약"은 골격 시약을 가교결합하기 위한 출발 물질로서 적합한 선형 또는 분지형 시약을 의미한다. 바람직하게는, 가교결합제 시약은 선형 화학적 화합물이다. 본원에서 사용되는 가교결합제 시약은 하나 이상의 생분해성 결합을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "잔기(moiety)"는 해당 시약에 비해 하나 이상의 원자(들)가 부족한 분자의 일부분을 의미한다. 예를 들면, 화학식 "H-X-H"의 시약이 또 다른 시약과 반응하고 반응 생성물의 부분이 되는 경우, 반응 생성물의 해당 잔기는 구조 "H-X-" 또는 "-X-"를 갖는 반면, 각각의 "-"는 또 다른 잔기에 대한 결합을 나타낸다.
따라서, 구 "결합된 형태"는 시약의 해당 잔기를 나타내는데 사용되고, 즉, "결합된 형태의 리신"은 리신 시약의 하나 이상의 원자(들)가 부족하고 분자의 부분인 리신 잔기를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "작용기"는 다른 작용기와 반응할 수 있는 원자들의 기를 의미한다. 작용기는 하기 기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다: 카르복실산(-(C=O)OH), 또는 카르복실릭 에스테르 또는 산 할라이드와 같은 이의 활성화된 형태; 1차 또는 2차 아민(-NH2, -NH-); 말레이미드; 티올(-SH); 설폰산(-(O=S=O)OH); 카르보네이트; 카르바메이트(-O(C=O)N<); 하이드록시(-OH); 알데하이드(-(C=O)H); 케톤(-(C=O)-); 하이드라진(>N-N<); 이소시아네이트; 이소티오시아네이트; 인산(-O(P=O)OHOH); 포스폰산(-O(P=O)OHH); 할로아세틸; 알킬 할라이드; 아크릴로일; 아릴 플루오라이드; 하이드록실아민; 디설파이드; 비닐 설폰; 비닐 케톤; 디아조알칸; 옥시란; 및 아지리딘.
작용기가 또 다른 작용기에 커플링되는 경우, 결과 구조는 "연결기"로서 나타내진다. 예를 들면, 아민 기와 카르복실 기의 반응은 아미드 연결기를 야기한다.
본원에서 사용되는 용어 "활성화된 작용기"는 활성화 기에 연결된 작용기를 의미한다. 바람직한 활성화된 작용기는 활성화된 에스테르 기, 활성화된 카르바메이트 기, 활성화된 카르보네이트 기 및 티오카르보네이트 기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "캡핑기"는 작용기에 비가역적으로, 즉 영구적으로 연결되어 작용기가 다른 시약 또는 잔기의 작용기와 반응할 수 없도록 만드는 잔기를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "중합체"는 선형, 환형, 분지형, 가교결합 또는 덴드리머 방식 또는 이의 조합으로 연결된 반복적 구조 단위, 즉, 단량체를 포함하는 분자를 의미하고, 이는 합성 또는 생물학적 기원 또는 둘의 조합일 수 있다. 중합체는, 예를 들면, 또한 작용기 또는 캡핑 잔기를 포함할 수 있다는 것이 이해된다. 바람직하게는, 중합체는 0.5 kDa 이상의 분자량, 예를 들면, 1 kDa 이상의 분자량, 2 kDa 이상의 분자량, 3 kDa 이상의 분자량 또는 5 kDa 이상의 분자량을 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "중합체성"은 하나 이상의 중합체(들)을 포함하는 시약 또는 잔기를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "수평균 분자량"은 개별적인 중합체의 분자량의 통상적인 산술 평균을 의미한다. 당해 분야의 숙련가는 중합 반응으로부터 수득된 중합 생성물이 모두 동일한 분자량을 갖지 않고, 오히려 분자량 분포를 나타낸다는 것을 이해한다. 결과적으로, 본원에 사용되는 중합체에서 분자량 범위, 분자량, 단량체의 수 범위 및 중합체 중의 단량체의 수는 수평균 분자량 및 단량체의 수평균을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "중합"은 하이드로겔을 포함하지만 이에 한정되지 않는 중합체 쇄 또는 네트워크를 형성하는 화학적 반응으로 단량체 또는 매크로 단량체 시약의 반응 공정을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "매크로 단량체"는 단량체 시약의 중합으로부터 수득된 분자를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "축합 중합" 또는 "축합 반응"은 두 시약의 작용기가 반응하여 하나의 단일 분자, 반응 생성물, 및 저분자량 분자, 예를 들면, 물을 방출시키는 화학적 반응을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "현탁 중합"은 단량체 시약을 용매 A에 용해시켜 분산상을 형성하고, 이를 용매 B에 유화시켜 연속상을 형성하는 불균일 및/또는 2상 중합 반응을 의미한다. 본 발명에서, 단량체 시약은 골격 시약 및 가교결합제 시약이다. 용매 A 및 단량체 시약은 둘 다 용매 B에 불용성이다. 이러한 에멀젼은 교반, 진탕, 초음파 노출 또는 마이크로시브(Microsieve)™ 유화, 보다 바람직하게는 교반 또는 마이크로시브™ 유화, 보다 바람직하게는 교반에 의해 형성된다. 당해 에멀젼은 적절한 유화제에 의해 안정화된다. 중합은 용매 A에 가용성인 개시제의 첨가에 의해 개시된다. 적합한 통상적으로 공지된 개시제는 테트라메틸에틸렌디아민(TMEDA)과 같은 3차 염기일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "불활성"은 화학적 반응성이 아닌 잔기, 즉 다른 잔기 또는 시약과 반응하지 않는 잔기를 나타낸다. 당해 분야의 숙련가는 "불활성"이 그 자체로 작용기의 존재를 배제하지 않지만, 불활성 잔기 내에 부분적으로 존재하는 작용기가, 예를 들면, 후속적인 반응에서 불활성 잔기와 접촉으로 야기된 잔기/시약의 작용기와 반응하지 않는다는 것을 이해한다. 특히, 불활성 잔기 Z는, 예를 들면, 본 발명의 하이드로겔에 공유적으로 컨쥬게이션되어 본 발명의 하이드로겔-연결된 프로드럭을 수득할 수 있는 가역적 프로드럭 링커 시약, 약물, 가역적 프로드럭 링커 잔기-생물학적 활성 잔기 컨쥬게이트 시약 또는 스페이서 시약에 존재하는 Ax0 또는 Ax2 또는 작용기와 반응하지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "비혼화성"은 두 성분이 배합되어 균일한 혼합물을 형성할 수 없는 성질을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리아민"은 하나 이상의 아민 기(-NH- 또는 -NH2), 예를 들면, 2 내지 64개의 아민 기, 4 내지 48개의 아민 기, 6 내지 32개의 아민 기, 8 내지 24개 아민 기, 10 내지 16개의 아민 기를 포함하는 시약 또는 잔기를 의미한다. 특히 바람직한 폴리아민은 2 내지 32개의 아민 기를 포함한다.
잔기 또는 시약과 관련되어 본원에서 사용되는 용어 "X% 이상의 PEG를 포함하는 PEG계"는 상기 잔기 또는 시약이 X%(w/w) 이상의 에틸렌 글리콜 단위(-CH2CH2O-)를 포함하는 것을 의미하고, 여기서 에틸렌 글리콜 단위는 블록방식으로 배치될 수 있고, 또는 대안적으로 잔기 또는 시약 사이에 무작위로 분포될 수 있으며, 바람직하게는 상기 잔기 또는 시약의 모든 에틸렌 글리콜 단위는 하나의 블록 내에 존재하고; PEG계 잔기 또는 시약의 남은 중량%는 특히 하기 치환기 및 연결기로부터 선택되는 다른 잔기이다:
ㆍ C1-50 알킬, C2-50 알케닐, C2-50 알키닐, C3-10 사이클로알킬, 4 내지 7원 헤테로사이클릴, 8 내지 11원 헤테로비사이클릴, 페닐; 나프틸; 인데닐; 인다닐; 및 테트랄리닐; 및
ㆍ 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 연결기:
Figure 112015045066876-pct00001
상기 화학식에서,
점선은 분자의 나머지, 잔기 또는 시약에 대한 결합을 나타내고,
R1 및 R1a는 서로 독립적으로 H 및 C1-6 알킬로부터 선택된다.
본원에서 사용되는 용어 "C1-4 알킬"은 단독으로 또는 조합으로 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알킬 기를 의미한다. 분자의 말단에 존재하는 경우, 직쇄 및 측쇄 C1-4 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 2급-부틸 및 3급-부틸이다. 하나의 분자의 2개의 잔기가 C1-4 알킬 기에 의해 연결되는 경우, 이러한 C1-4 알킬 기의 예는 -CH2-, -CH2-CH2-, -CH(CH3)-, -CH2-CH2-CH2-, -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, 및 -CH2-CH2-CH2(CH3)-이다. C1-4 알킬 기의 각각의 수소 원자는 하기 정의된 바와 같은 치환기에 의해 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "C1-6 알킬"은 단독으로 또는 조합으로 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알킬 기를 의미한다. 분자의 말단에 존재하는 경우, 직쇄 및 측쇄 C1-6 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸, n-펜틸, 2-메틸부틸, 2,2-디메틸프로필, n-헥실, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 2,2-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸 및 3,3-디메틸프로필이다. 하나의 분자의 2개의 잔기가 C1-6 알킬 기에 의해 연결되는 경우, 이러한 C1-6 알킬 기의 예는 -CH2-, -CH2-CH2-, -CH(CH3)-, -CH2-CH2-CH2-, -CH(C2H5)- 및 -C(CH3)2-이다. C1-6 알킬 기의 각각의 수소 원자는 하기 정의된 바와 같은 치환기에 의해 치환될 수 있다.
따라서, 본원에서 사용되는 용어 "C1-20 알킬"은 단독으로 또는 조합으로 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알킬 기를 의미한다. 용어 "C8-18 알킬"은 단독으로 또는 조합으로 8 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알킬 기을 의미한다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 "C1-50 알킬"은 단독으로 또는 조합으로 1 내지 50개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알킬 기를 의미한다. C1-20 알킬 기, C8-18 알킬 기 및 C1-50 알킬 기의 각각의 수소 원자는 치환기에 의해 치환될 수 있다. 각각의 경우, 알킬 기는 분자의 말단에 존재할 수 있거나 하나의 분자의 2개의 잔기는 알킬 기에 의해 연결될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "C2-6 알케닐"은 단독으로 또는 조합으로 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖고 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 잔기를 의미한다. 분자의 말단에 존재하는 경우, 예는 -CH=CH2, -CH=CH-CH3, -CH2-CH=CH2, -CH=CHCH2-CH3 및 -CH=CH-CH=CH2이다. 하나의 분자의 2개의 잔기가 C2-6 알케닐 기에 의해 연결되는 경우, 이러한 C2-6 알케닐의 예는 -CH=CH-이다. C2-6 알케닐 기의 각각의 수소 원자는 하기 정의된 바와 같은 치환기에 의해 치환될 수 있다. 임의로, 하나 이상의 삼중 결합(들)이 발생할 수 있다.
따라서, 본원에서 사용되는 용어 "C2-20 알케닐"은 단독으로 또는 조합으로 2 내지 20개의 탄소 원자를 갖고 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 잔기를 의미한다. 용어 "C2-50 알케닐"은 단독으로 또는 조합으로 2 내지 50개의 탄소 원자를 갖고 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 잔기를 의미한다. 분자의 말단에 존재하는 경우, 예는 -CH=CH2, -CH=CH-CH3, -CH2-CH=CH2, -CH=CHCH2-CH3 및 -CH=CH-CH=CH2이다. 하나의 분자의 2개의 잔기가 알케닐 기에 의해 연결되는 경우, 예는, 예를 들면, -CH=CH-이다. C2-20 알케닐 또는 C2-50 알케닐 기의 각각의 수소 원자는 하기 정의된 바와 같은 치환기에 의해 치환될 수 있다. 임의로, 하나 이상의 삼중 결합(들)이 발생할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "C2-6 알키닐"은 단독으로 또는 조합으로 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖고 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 잔기를 의미한다. 분자의 말단에 존재하는 경우, 예는 -C≡CH, -CH2-C≡CH, CH2-CH2-C≡CH 및 CH2-C≡C-CH3이다. 하나의 분자의 2개의 잔기가 알키닐 기에 의해 연결되는 경우, 예는 -C≡C-이다. C2-6 알키닐 기의 각각의 수소 원자는 하기 정의된 바와 같은 치환기에 의해 치환될 수 있다. 임의로, 하나 이상의 이중 결합(들)이 발생할 수 있다.
따라서, 본원에서 사용되는 용어 "C2-20 알키닐"은 단독으로 또는 조합으로 2 내지 20개의 탄소 원자를 갖고 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 잔기를 의미하고, "C2-50 알키닐"은 단독으로 또는 조합으로 2 내지 50개의 탄소 원자를 갖고 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 잔기를 의미한다. 분자의 말단에 존재하는 경우, 예는 -C≡CH, -CH2-C≡CH, CH2-CH2-C≡CH 및 CH2-C≡C-CH3이다. 하나의 분자의 2개의 잔기가 알키닐 기에 의해 연결되는 경우, 예는 -C≡C-이다. C2-20 알키닐 또는 C2-50 알키닐 기의 각각의 수소 원자는 하기 정의된 바와 같은 치환기에 의해 치환될 수 있다. 임의로, 하나 이상의 이중 결합(들)이 발생할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "C3-7 사이클로알킬" 또는 "C3-7 사이클로알킬 고리"는 3 내지 7개의 탄소 원자를 갖는 환형 알킬 쇄를 의미하고, 이는 포화 또는 불포화, 예를 들면, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 사이클로헵틸일 수 있다. 사이클로알킬 탄소의 각각의 수소 원자는 하기 정의된 바와 같은 치환기에 의해 치환될 수 있다. 용어 "C3-7 사이클로알킬" 또는 "C3-7 사이클로알킬 고리"는 또한 노르보난 또는 노르보넨과 같은 브릿지드 비사이클을 포함한다. 따라서, "C3-5 사이클로알킬"은 3 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 사이클로알킬을 의미하고, C3-10 사이클로알킬은 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 사이클로알킬을 의미한다.
따라서, 본원에서 사용되는 용어 "C3-10 사이클로알킬"은 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 카보사이클릭 고리 시스템을 의미하고, 이는 포화 또는 불포화, 예를 들면, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 사이클로노닐, 사이클로데실일 수 있다. 용어 "C3-10 사이클로알킬"은 또한 적어도 부분적으로 포화된 카르보모노- 및 -비사이클을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도를 의미한다. 플루오로 또는 클로로가 특히 바람직하다.
본원에서 사용되는 용어 "4 내지 7원 헤테로사이클릴" 또는 "4 내지 7원 헤테로사이클"은 이중 결합의 최대 수 이하를 함유할 수 있는, 4, 5, 6 또는 7개의 고리 원자를 갖는 고리(완전히 또는 부분적으로 포화되거나 불포화된 방향족 또는 비-방향족 고리)를 의미하고, 여기서 고리 원자 1 내지 4개는 황(-S(O)-, -S(O)2- 포함), 산소 및 질소(=N(O)- 포함)로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤테로 원자에 의해 치환되고, 고리는 탄소 또는 질소 원자를 통해 분자의 나머지에 결합된다. 4 내지 7원 헤테로사이클의 예는 아제티딘, 옥세탄, 티에탄, 푸란, 티오펜, 피롤, 피롤린, 이미다졸, 이미다졸린, 피라졸, 피라졸린, 옥사졸, 옥사졸린, 이속사졸, 이속사졸린, 티아졸, 티아졸린, 이소티아졸, 이소티아졸린, 티아디아졸, 티아디아졸린, 테트라하이드로푸란, 테트라하이드로티오펜, 피롤리딘, 이미다졸리딘, 피라졸리딘, 옥사졸리딘, 이속사졸리딘, 티아졸리딘, 이소티아졸리딘, 티아디아졸리딘, 설폴란, 피란, 디하이드로피란, 테트라하이드로피란, 이미다졸리딘, 피리딘, 피리다진, 피라진, 피리미딘, 피페라진, 피페리딘, 모르폴린, 테트라졸, 트리아졸, 트리아졸리딘, 테트라졸리딘, 디아제판, 아제핀 및 호모피페라진을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 4 내지 7원 헤테로사이클릴 또는 4 내지 7원 헤테로사이클릭 기의 각각의 수소 원자는 하기 정의된 바와 같은 치환기에 의해 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "8 내지 11원 헤테로비사이클릴" 또는 "8 내지 11원 헤테로비사이클"은 하나 이상의 고리 원자가 두 고리에 의해 공유되고 이중 결합의 최대 수 이하를 함유할 수 있는(완전히 또는 부분적으로 포화되거나 불포화된 방향족 또는 비-방향족 고리), 8 내지 11개의 고리 원자를 갖는 2개의 고리의 헤테로사이클릭 시스템을 의미하고, 여기서 고리 원자 1 내지 6개는 황(-S(O)-, -S(O)2- 포함), 산소 및 질소(=N(O)- 포함)로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤테로원자에 의해 치환되고, 고리는 탄소 또는 질소 원자를 통해 분자의 나머지에 결합된다. 8 내지 11원 헤테로비사이클의 예는 인돌, 인돌린, 벤조푸란, 벤조티오펜, 벤족사졸, 벤즈이속사졸, 벤조티아졸, 벤즈이소티아졸, 벤즈이미다졸, 벤즈이미다졸린, 퀴놀린, 퀴나졸린, 디하이드로퀴나졸린, 퀴놀린, 디하이드로퀴놀린, 테트라하이드로퀴놀린, 데카하이드로퀴놀린, 이소퀴놀린, 데카하이드로이소퀴놀린, 테트라하이드로이소퀴놀린, 디하이드로이소퀴놀린, 벤즈아제핀, 푸린 및 프테리딘이다. 용어 8 내지 11원 헤테로비사이클은 또한 1,4-디옥사-8-아자스피로[4.5]데칸과 같은 2개의 고리의 스피로 구조 또는 8-아자-비사이클로[3.2.1]옥탄과 같은 브릿지드 헤테로사이클을 포함한다. 8 내지 11원 헤테로비사이클릴 또는 8 내지 11원 헤테로비사이클 탄소의 각각의 수소 원자는 하기 정의된 바와 같은 치환기에 의해 치환될 수 있다.
용어 "치환된"은 분자의 하나 이상의 -H 원자(들)가 "치환기" 또는 "치환기들"로서 나타낸 상이한 원자 또는 일군의 원자들에 의해 치환되는 것을 의미한다. 적합한 치환기는 할로겐; CN; COOR9; OR9; C(O)R9; C(O)N(R9R9a); S(O)2N(R9R9a); S(O)N(R9R9a); S(O)2R9; S(O)R9; N(R9)S(O)2N(R9aR9b); SR9; N(R9R9a); NO2; OC(O)R9; N(R9)C(O)R9a; N(R9)S(O)2R9a; N(R9)S(O)R9a; N(R9)C(O)OR9a; N(R9)C(O)N(R9aR9b); OC(O)N(R9R9a); T; C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 또는 C2-50 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 T; C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 동일하거나 상이한 하나 이상의 R10에 의해 임의로 치환되고, 여기서 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 T, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; -S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; -N(R11)-; -OC(O)R11; -N(R11)C(O)-; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; -N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; 및 -OC(O)N(R11R11a)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기(들)에 의해 임의로 간섭되고;
여기서, R9, R9a, R9b는 H; T; 및 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 또는 C2-50 알키닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 T; C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 동일하거나 상이한 하나 이상의 R10에 의해 임의로 치환되고, 여기서 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 T, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; -S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; -N(R11)-; -OC(O)R11; -N(R11)C(O)-; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; -N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; 및 -OC(O)N(R11R11a)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기(들)에 의해 임의로 간섭되고;
T는 페닐; 나프틸; 인데닐; 인다닐; 테트랄리닐; C3-10 사이클로알킬; 4 내지 7원 헤테로사이클릴; 또는 8 내지 11원 헤테로비사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 T는 동일하거나 상이한 하나 이상의 R10에 의해 임의로 치환되고;
R10은 할로겐; CN; 옥소(=O); COOR12; OR12; C(O)R12; C(O)N(R12R12a); S(O)2N(R12R12a); S(O)N(R12R12a); S(O)2R12; S(O)R12; N(R12)S(O)2N(R12aR12b); SR12; N(R12R12a); NO2; OC(O)R12; N(R12)C(O)R12a; N(R12)S(O)2R12a; N(R12)S(O)R12a; N(R12)C(O)OR12a; N(R12)C(O)N(R12aR12b); OC(O)N(R12R12a); 또는 C1-6 알킬이고, 여기서 C1-6 알킬은 동일하거나 상이한 하나 이상의 할로겐에 의해 임의로 치환되고;
R11, R11a, R12, R12a, R12b는 H; 또는 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 C1-6 알킬은 동일하거나 상이한 하나 이상의 할로겐에 의해 임의로 치환된다.
하나의 양태에서 R9, R9a, R9b는 서로 독립적으로 H일 수 있다.
하나의 양태에서 R10은 C1-6 알킬이다.
하나의 양태에서 T는 페닐이다.
본원에서 사용되는 용어 "간섭된"은 2개의 탄소 원자 사이에 또는 각각의 탄소 원자와 수소 원자 사이의 탄소 쇄의 말단에 하나 이상의 원자(들)이 삽입되는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "프로드럭"은 이의 약리학적 효과를 나타내기 전에 생체내변화를 겪는 화합물을 의미한다. 프로드럭은 따라서 모 분자에서 원치않는 성질을 변경하거나 제거하는 일시적인 방식으로 사용된 특수화된 비독성 보호기에 연결된 생물학적 활성 잔기로 간주될 수 있다. 이는 또한 약물에서 바람직한 성질의 강화 및 원치않는 성질의 억제를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "담체-연결된 프로드럭"은 개선된 물리화학적 또는 약동학적 성질을 생성하고, 일반적으로 가수분해 절단에 의하여, 생체 내에서 용이하게 제거될 수 있는 일시적인 담체 기와 함께 생물학적 활성 잔기의 임시 연결기를 함유하는 프로드럭을 의미한다. 포유동물, 바람직하게는 인간에게 이러한 담체-연결된 프로드럭 투여되면 약물 분자가 방출된다. 따라서, 담체-연결된 프로드럭은 생물학적 활성 잔기, 가역적 프로드럭 링커 잔기 및 담체 기를 포함하고, 여기서 생물학적 활성 잔기는 가역적 프로드럭 링커를 통해 담체 기에 가역적으로 연결된다. 생물학적 활성 잔기는 가역적 프로드럭 링커에 가역적으로 및 공유적으로 연결되고, 가역적 프로드럭 링커는 담체 기에 공유적으로 연결되는 것으로 이해된다. 바람직하게는, 가역적 프로드럭 링커와 담체 기 사이의 연결기는 안정한 공유적 연결기이다.
본원에서 사용되는 용어 "가역적 프로드럭 링커 잔기"는 이의 하나의 말단에서 가역적 연결기를 통해 생물학적 활성 잔기 D, 즉 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기에 결합되고 또 다른 말단에서 영구적인 결합을 통해 담체에 연결됨으로써 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기를 담체에 연결하는 잔기를 의미한다. 이러한 가역적 프로드럭 링커는, 예를 들면, 1시간 내지 12개월의 반감기 범위로 생리학적 조건(pH 7.4, 37℃에서 수성 버퍼)하에 비효소적으로 가수분해적으로 분해될 수 있고, 즉 절단될 수 있다. 가역적 연결기는, 예를 들면, 아코니틸, 아세탈, 아미드, 무수 아세트산, 에스테르, 이민, 하이드라존, 말레아믹산 아미드, 오르토 에스테르, 포스파미드, 포스포에스테르, 포스포실릴 에스테르, 실릴 에스테르, 설포닉 에스테르, 방향족 카르바메이트, 및 이의 조합이다.
대조적으로, 영구적인 연결기는 12개월 이상의 반감기로 생리학적 조건(pH 7.4, 37℃에서 수성 버퍼)하에 비효소적으로 가수분해적으로 분해될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "흔적이 남지 않는 프로드럭 링커 잔기"는 절단되면 이의 유리 형태로 약물을 방출하는 가역적 프로드럭 링커 잔기를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어, 약물의 "유리 형태"는 개질되지 않은, 약리학적 활성 형태인 약물의 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 단량체의 짧은 중합체를 의미한다. 용어 "폴리펩티드"는 50개 이하의 아미노산 단량체를 포함하는 펩티드를 의미한다. 용어 "단백질"은 50개 이상의 아미노산 단량체의 펩티드를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "약제학적 조성물"은 하나 이상의 활성 성분(들), 및 하나 이상의 불활성 성분(들), 뿐만 아니라 임의의 2개 이상의 성분의 조합, 착물화 또는 응집으로부터, 하나 이상의 성분(들)의 해리로부터, 또는 하나 이상의 성분의 다른 유형의 반응 또는 상호작용으로부터, 직접적으로 또는 간접적으로 기인한 임의의 생성물을 의미한다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 VEGF 중화 프로드럭 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제(들)를 혼합함으로써 제조된 임의의 조성물을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "부형제"는 치료제, VEGF 중화 프로드럭과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 또는 비히클을 나타낸다. 이러한 약제학적 부형제는 물; 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 오일 및 석유; 전분; 글루코스; 락토스; 수크로스; 만니톨; 트레할로스; 겔라틴; 맥아; 쌀; 밀가루; 백악; 실리카겔; 스테아르산나트륨; 글리세롤 모노스테아레이트; 탈크; 염화나트륨; 탈지분유; 글리세롤; 프로필렌; 글리콜; 에탄올; 아세테이트; 석시네이트; 트리스; 카르보네이트; 포스페이트; HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산); MES(2-(N-모르폴리노)에탄설폰산); 트윈(Tween)®; 폴록사머; 폴록사민; CHAPS; 이게팔(Igepal)®; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 리신, 또는 히스티딘; 트리글리세리드; 만니톨; 락토스; 전분; 스테아르산마그네슘; 나트륨 사카린; 셀룰로스; 및 탄산마그네슘일 수 있다. 적합한 약제학적 부형제의 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences", E.W. Martin]에 기재되어 있다. 제형은 투여 방식에 적합하여야 한다.
본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는"은 규제 기관, 예를 들면, EMA(유럽) 및/또는 FDA(US) 및/또는 임의의 다른 국가 규제 기관에 의해 동물에게, 바람직하게는 인간에게 사용이 승인된 분자 또는 시약을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "안내 주입"은 눈의 수양액(전방 또는 후방), 유리체, 수정체 또는 맥락막위 공간으로 주입을 의미한다. 일반적으로 용어 "포함하다" 또는 "포함함"은 또한 "로 이루어지다" 또는 "로 이루어짐"을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "단백질 X의 활성의 조절제"는 단백질 X의 활성의 효능제 또는 길항제이거나 아니면 이를 중화하거나 강화하는 분자를 나타낸다.
본 발명은 하나 이상의 안구 병태의 치료 방법에서 사용하기 위한, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제(들) 및 VEGF 중화 프로드럭을 포함하고, 프로드럭은 공유 결합된 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기를 포함하는 것인 약제학적 조성물에 관한 것이다.
바람직한 양태에서 VEGF 중화 프로드럭을 포함하는 약제학적 조성물은 안내로, 바람직하게는 안내 주입을 통해 투여된다.
바람직한 양태에서 VEGF 중화 프로드럭의 두번 안내 투여 사이의 기간은 1개월 이상이고, 예를 들면, VEGF 중화 프로드럭의 두번 안내 투여 사이의 기간은 1개월 이상, 또는 5주 이상, 또는 6주 이상, 또는 8주 이상, 또는 10주 이상, 또는 12주 이상, 또는 16주 이상, 또는 20주 이상, 또는 24주 이상, 또는 28주 이상, 또는 32주 이상, 또는 36주 이상, 또는 40주 이상, 또는 44주 이상, 또는 48주 이상이다. 두번 안내 투여 사이의 최대 기간은 바람직하게는 4년 이하, 즉 3년 이하, 2년 이하, 또는 1년 이하이다. 바람직하게는, VEGF 중화 프로드럭을 포함하는 약제학적 조성물은 2 내지 12개월 마다, 보다 바람직하게는 4 내지 10개월 마다, 가장 바람직하게는 6개월 마다 투여된다.
따라서, 본 발명의 바람직한 측면은 약제학적 조성물 중에 포함된 프로드럭이 5 내지 200 mg 프로드럭/mL 약제학적 조성물 농도, 예를 들면, 5 내지 180 mg 프로드럭/mL 약제학적 조성물 농도, 10 내지 170 mg 프로드럭/mL 약제학적 조성물 농도, 15 내지 160 mg 프로드럭/mL 약제학적 조성물 농도, 20 내지 150 mg 프로드럭/mL 약제학적 조성물 농도, 25 내지 140 mg 프로드럭/mL 약제학적 조성물 농도, 30 내지 130 mg 프로드럭/mL 약제학적 조성물 농도, 40 내지 120 mg 프로드럭/mL 약제학적 조성물 농도, 50 내지 110 mg 프로드럭/mL 약제학적 조성물 농도 또는 60 내지 100 mg 프로드럭/mL 약제학적 조성물 농도를 갖는 약제학적 조성물이다.
하나의 양태에서 약제학적 조성물은 프로드럭의 총 중량을 기준으로 하여 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기 5 내지 80 중량%, 예를 들면, 프로드럭의 총 중량을 기준으로 하여 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기 10 내지 70 중량%, 프로드럭의 총 중량을 기준으로 하여 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기 15 내지 65 중량%, 프로드럭의 총 중량을 기준으로 하여 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기 20 내지 65 중량% 또는 프로드럭의 총 중량을 기준으로 하여 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기 30 내지 65 중량%를 포함한다.
하나의 양태에서 주입은 10 내지 200 ㎕ 범위, 예를 들면, 15 내지 150 ㎕ 범위, 20 내지 100 ㎕ 범위, 30 내지 80 ㎕ 범위, 또는 40 내지 70 ㎕ 범위의 주입 용적으로 실시된다. 바람직하게는, 주입 용적은 50 ㎕이다.
VEGF 중화 프로드럭은 바람직하게는 담체-연결된 프로드럭이다.
VEGF 중화 프로드럭에 약물 및 담체에 관한 다양한 화학량론이 포함된다.
하나의 양태에서 하나의 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기는 하나의 가역적 프로드럭 링커 잔기를 통해 하나의 담체 잔기에 결합된다. 가역적 프로드럭 링커 잔기에 대한 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기의 결합은 해당 약물의 작용기를 통해 발생한다. 임의로, 담체 잔기와 가역적 프로드럭 링커 잔기 사이의 스페이서 잔기가 존재한다.
또 다른 양태에서, VEGF 중화 생물학적 활성 잔기는 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기의 하나 이상의 작용기를 통해 하나 이상의 가역적 프로드럭 링커 잔기에 결합된다. 각각의 하나 이상의 가역적 프로드럭 링커 잔기는, 임의로 스페이서 잔기를 통해, 상이한 담체 잔기에 결합된다. 따라서, 당해 양태에서 하나의 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기는 하나 이상의 담체 잔기에 결합된다.
또 다른 양태에서, 하나의 담체 잔기는 직접적으로 또는 임의의 스페이서 잔기를 통해 하나 이상의 가역적 프로드럭 링커 잔기에 결합된다. 각각의 가역적 프로드럭 링커 잔기는 하나 이상의, 바람직하게는 하나의 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기/잔기들에 결합된다.
하나의 양태에서 담체는 가용성 담체이다. 바람직하게는, 가용성 담체는 폴리(아크릴산), 폴리(아크릴레이트), 폴리(아크릴아미드), 폴리(알킬옥시) 중합체, 폴리(아미드), 폴리(아미도아민), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(아스파르트아미드), 폴리(부티르산), 폴리(카프롤락톤), 폴리(카르보네이트), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(디메틸아크릴아미드), 폴리(에스테르), 폴리(에틸렌), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸옥사졸린), 폴리(글리콜산), 폴리(하이드록시에틸 아크릴레이트), 폴리(하이드록시에틸옥사졸린), 폴리(하이드록시프로필메타크릴아미드), 폴리(하이드록시프로필 메타크릴레이트), 폴리(하이드록시프로필옥사졸린), 폴리(이미노카르보네이트), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(락트산), 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리(메타크릴아미드), 폴리(메타크릴레이트), 폴리(메틸옥사졸린), 폴리(프로필렌 푸마레이트), 폴리(오가노포스파젠), 폴리(오르토 에스테르), 폴리(옥사졸린), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리(실록산), 폴리(우레탄), 폴리(비닐알코올), 폴리(비닐아민), 폴리(비닐메틸에테르), 폴리(비닐피롤리돈), 실리콘, 리보핵산, 데스옥시핵산, 알부민, 이의 항체 및 단편, 혈장 단백질, 콜라겐, 엘라스틴, 파신, 피브린, 케라틴, 폴리아스파르테이트, 폴리글루타메이트, 프롤라민, 트랜스페린, 시토크롬, 플라보단백질, 당단백질, 헴단백질, 지질단백질, 금속단백질, 피토크롬, 인단백질, 옵신, 아가, 아가로스, 알기네이트, 아라비난, 아라비노갈락탄, 카라기난, 셀룰로스, 카르보메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 및 기타 탄수화물계 중합체, 키토산, 덱스트란, 덱스트린, 겔라틴, 히알루론산 및 유도체, 만난, 펙틴, 람노갈락투로난, 전분, 하이드록시알킬 전분, 크실란, 및 이의 공중합체 및 작용화된 유도체를 포함하는 중합체 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중합체를 포함한다.
또 다른 양태에서 담체는 불용성 담체이고, 보다 바람직하게는 담체-연결된 프로드럭의 담체는 하이드로겔이다.
바람직하게는, VEGF 중화 프로드럭의 하이드로겔은 생분해성 하이드로겔이다.
하이드로겔은 폴리(아크릴산), 폴리(아크릴레이트), 폴리(아크릴아미드), 폴리(알킬옥시) 중합체, 폴리(아미드), 폴리(아미도아민), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(아스파르트아미드), 폴리(부티르산), 폴리(카프롤락톤), 폴리(카르보네이트), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(디메틸아크릴아미드), 폴리(에스테르), 폴리(에틸렌), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸옥사졸린), 폴리(글리콜산), 폴리(하이드록시에틸 아크릴레이트), 폴리(하이드록시에틸옥사졸린), 폴리(하이드록시프로필메타크릴아미드), 폴리(하이드록시프로필 메타크릴레이트), 폴리(하이드록시프로필옥사졸린), 폴리(이미노카르보네이트), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(락트산), 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리(메타크릴아미드), 폴리(메타크릴레이트), 폴리(메틸옥사졸린), 폴리(프로필렌 푸마레이트), 폴리(오가노포스파젠), 폴리(오르토 에스테르), 폴리(옥사졸린), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리(실록산), 폴리(우레탄), 폴리(비닐알코올), 폴리(비닐아민), 폴리(비닐메틸에테르), 폴리(비닐피롤리돈), 실리콘, 리보핵산, 데스옥시핵산, 알부민, 이의 항체 및 단편, 혈장 단백질, 콜라겐, 엘라스틴, 파신, 피브린, 케라틴, 폴리아스파르테이트, 폴리글루타메이트, 프롤라민, 트랜스페린, 시토크롬, 플라보단백질, 당단백질, 헴단백질, 지질단백질, 금속단백질, 피토크롬, 인단백질, 옵신, 아가, 아가로스, 알기네이트, 아라비난, 아라비노갈락탄, 카라기난, 셀룰로스, 카르보메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 및 기타 탄수화물계 중합체, 키토산, 덱스트란, 덱스트린, 겔라틴, 히알루론산 및 유도체, 만난, 펙틴, 람노갈락투로난, 전분, 하이드록시알킬 전분, 크실란, 및 이의 공중합체 및 작용화된 유도체를 포함하는 중합체 군으로부터 바람직하게는 선택되는 하나 이상의 중합체를 포함한다.
바람직하게는 VEGF 중화 프로드럭의 하이드로겔은 10% 이상의 PEG, 보다 바람직하게는 20% 이상의 PEG, 가장 바람직하게는 30% PEG를 포함하는 생분해성 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)계 하이드로겔이다.
VEGF 중화 프로드럭의 하이드로겔은 성형품, 바람직하게는 마이크로입자 형태의 성형품이다. 보다 바람직하게는, 하이드로겔은 마이크로입자형 비드 형태이다. 매우 보다 바람직하게는, 이러한 마이크로입자형 비드는 1 내지 1000 ㎛, 보다 바람직하게는 5 내지 500 ㎛, 보다 바람직하게는 10 내지 100 ㎛, 보다 바람직하게는 20 내지 100 ㎛, 매우 보다 바람직하게는 20 내지 80 ㎛의 직경을 갖는다. 비드 직경은 마이크로입자형 비드가 등장성 수성 버퍼 중에 현탁될 때 측정된다.
VEGF 중화 프로드럭의 하이드로겔은 바람직하게는 이들의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 제WO 2006/003014 A2호 및 제WO 2011/012715 A1호에 기술된 바와 같은 하이드로겔이다.
매우 보다 바람직하게는, VEGF 중화 프로드럭의 하이드로겔은 하기 단계들을 포함하는 공정에 의해 수득될 수 있는 하이드로겔이다:
(a) 1:99 내지 99:1 범위의 1종 이상의 골격 시약 대 1종 이상의 가교결합제 시약의 중량비로 하기를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계;
(a-i) 1 내지 100 kDa의 분자량 범위를 갖고, 3개 이상의 아민(-NH2 및/또는 -NH-)을 포함하는, 1종 이상의 골격 시약;
(a-ii) 6 내지 40 kDa의 분자량 범위를 갖고,
(i) 카르보닐옥시 기(-(C=O)-O- 또는 -O-(C=O)-) 2개 이상, 및 추가로
(ii) 활성화된 에스테르 기, 활성화된 카르바메이트 기, 활성화된 카르보네이트 기 및 활성화된 티오카르보네이트 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성화된 말단 작용기 2개 이상을 포함하며,
70% 이상의 PEG를 포함하는 PEG계인, 1종 이상의 가교결합제 시약;
(a-iii) 제1 용매 및 제1 용매에 비혼화성인 1종 이상의 제2 용매;
(b) 단계(a)의 혼합물을 현탁 중합으로 하이드로겔에 중합하는 단계; 및
(c) 임의로 하이드로겔을 후처리하는 단계.
단계(a)의 혼합물은 제1 용매 및 1종 이상의 제2 용매를 포함한다. 상기 제1 용매는 바람직하게는 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라하이드로푸란, 에틸 아세테이트, 디메틸포름아미드, 아세토니트릴, 디메틸 설폭사이드, 프로필렌 카르보네이트, N-메틸피롤리돈, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 및 물 및 이의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택된다.
1종 이상의 골격 시약 및 1종 이상의 가교결합제 시약은 제1 용매, 즉 현탁 중합의 분산상에 용해된다. 하나의 양태에서 골격 시약 및 가교결합제 시약은 개별적으로, 즉 상이한 용기에서, 동일하거나 상이한 용매를 사용하여, 바람직하게는 두 시약 모두에 대해 동일한 용매를 사용하여 용해된다. 또 다른 양태에서, 골격 시약 및 가교결합제 시약은 함께, 즉 동일한 용기에서 동일한 용매를 사용하여 용해된다.
골격 시약에 적합한 용매는 유기 용매이다. 바람직하게는, 용매는 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라하이드로푸란, 에틸 아세테이트, 디메틸포름아미드, 아세토니트릴, 디메틸 설폭사이드, 프로필렌 카르보네이트, N-메틸피롤리돈, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 및 물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 골격 시약은 아세토니트릴, 디메틸 설폭사이드, 메탄올 또는 이의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되는 용매에 용해된다. 가장 바람직하게는, 골격 시약은 디메틸설폭사이드에 용해된다.
하나의 양태에서 골격 시약은 1 내지 300 mg/mL, 보다 바람직하게는 5 내지 60 mg/mL, 가장 바람직하게는 10 내지 40 mg/mL 범위의 농도로 용매에 용해된다.
가교결합제 시약에 적합한 용매는 유기 용매이다. 바람직하게는, 용매는 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라하이드로푸란, 에틸 아세테이트, 디메틸포름아미드, 아세토니트릴, 디메틸 설폭사이드, 프로필렌 카르보네이트, N-메틸피롤리돈, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 물 또는 이의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 가교결합제 시약은 디메틸포름아미드, 아세토니트릴, 디메틸 설폭사이드, 메탄올 또는 이의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되는 용매에 용해된다. 가장 바람직하게는, 가교결합제 시약은 디메틸설폭사이드에 용해된다.
하나의 양태에서 가교결합제 시약은 5 내지 500 mg/mL, 보다 바람직하게는 25 내지 300 mg/mL, 가장 바람직하게는 50 내지 200 mg/mL 범위의 농도로 용매에 용해된다.
1종 이상의 골격 시약 및 1종 이상의 가교결합제 시약은 1:99 내지 99:1 범위의 중량비, 예를 들면, 2:98 내지 90:10 범위의 중량비, 3:97 내지 88:12 범위의 중량비, 3:96 내지 85:15 범위의 중량비, 2:98 내지 90:10 범위의 중량비 및 5:95 내지 80:20 범위의 중량비, 특히 바람직하게는 5:95 내지 80:20 범위의 중량비로 혼합되고, 여기서 첫번째 숫자는 골격 시약을 나타내고 두번째 숫자는 가교결합제 시약을 나타낸다.
바람직하게는, 비율은 단계(a)의 혼합물이 가교결합제 시약의 활성화된 말단 작용기에 대하여 몰과량인 골격 시약으로부터의 아민기를 포함하도록 선택된다. 결과적으로, 본 발명의 공정으로부터 수득된 하이드로겔은 프로드럭 링커 시약을 하이드로겔에 직접적으로 또는 스페이서 잔기를 통해 커플링하는데 사용될 수 있는 유리 아민기를 갖는다.
1종 이상의 제2 용매, 즉 현탁 중합의 연속상은, 바람직하게는 유기 용매이고, 보다 바람직하게는 선형, 분지형 또는 환형 C5-30 알칸; 선형, 분지형 또는 환형 C5-30 알켄; 선형, 분지형 또는 환형 C5-30 알킨; 선형 또는 환형 폴리(디메틸실록산); 방향족 C6-20 탄화수소; 및 이의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되는 유기 용매이다. 매우 보다 바람직하게는, 1종 이상의 제2 용매는 선형, 분지형 또는 환형 C5-16 알칸; 톨루엔; 크실렌; 메시틸렌; 헥사메틸디실록산; 또는 이의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 1종 이상의 제2 용매는 선형 C7-11 알칸, 예를 들면, 헵탄, 옥탄, 노난, 데칸 및 운데칸을 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 단계(a)의 혼합물은 세정제를 더 포함한다. 바람직한 세정제는 키트롤(Cithrol) DPHS, 하이퍼머(Hypermer) 70A, 하이퍼머 B246, 하이퍼머 1599A, 하이퍼머 2296, 및 하이퍼머 1083이다.
바람직하게는, 세정제는 전체 혼합물, 즉 분산상 및 연속상을 포함한 혼합물 1 L 당 O.1 g 내지 100 g의 농도를 갖는다. 보다 바람직하게는, 세정제는 전체 혼합물 1 L 당 0.5 g 내지 10 g의 농도를 갖고, 가장 바람직하게는, 세정제는 전체 혼합물 1 L 당 0.5 g 내지 5 g의 농도를 갖는다.
바람직하게는, 단계(a)의 혼합물은 에멀젼이다.
단계(b)의 중합은 염기를 첨가함으로써 개시된다. 바람직하게는, 염기는 알칸에 가용성인 비-친핵성 염기이고, 보다 바람직하게는 염기는 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌 디아민(TMEDA), 1,4-디메틸피페라진, 4-메틸모르폴린, 4-에틸모르폴린, 1,4-디아자비사이클로[2.2.2]옥탄, 1,1,4,7,10,10-헥사메틸트리에틸렌테트라민, 1,4,7-트리메틸-1,4,7-트리아자사이클로노난, 트리스[2-(디메틸아미노)에틸]아민, 트리에틸아민, DIPEA, 트리메틸아민, N,N-디메틸에틸아민, N,N,N',N'-테트라메틸-1,6-헥산디아민, N,N,N',N",N"-펜타메틸디에틸렌트리아민, 1,8-디아자비사이클로[5.4.0]운데크-7-엔, 1,5-디아자비사이클로[4.3.0]논-5-엔, 및 헥사메틸렌테트라민으로부터 선택된다. 매우 보다 바람직하게는, 염기는 TMEDA, 1,4-디메틸피페라진, 4-메틸모르폴린, 4-에틸모르폴린, 1,4-디아자비사이클로[2.2.2]옥탄, 1, 1,4,7,10,10-헥사메틸트리에틸렌테트라민, 1,4,7-트리메틸-1,4,7-트리아자사이클로노난, 트리스[2-(디메틸아미노)에틸]아민, 1,8-디아자비사이클로[5.4.0]운데크-7-엔, 1,5-디아자비사이클로[4.3.0]논-5-엔, 및 헥사메틸렌테트라민으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 염기는 TMEDA이다.
염기는 혼합물 중의 활성화된 말단 작용기 당 1 내지 500 당량으로, 바람직하게는 5 내지 50 당량, 보다 바람직하게는 5 내지 25 당량, 가장 바람직하게는 10 당량으로 단계(a)의 혼합물에 가해진다.
공정 단계(b)에서, 본 발명의 하이드로겔의 중합은 바람직하게는 단계(a)의 혼합물의 연속 교반하에 발생하는 축합 반응이다. 바람직하게는, 팁 속도(팁 속도 = π × 교반기 회전 속도 × 교반기 직경)는 초 당 0.2 내지 10 미터(m/s), 보다 바람직하게는 0.5 내지 4 m/s, 가장 바람직하게는 1 내지 2 m/s 범위이다.
단계(b)의 바람직한 양태에서, 중합 반응은 배플이 장착된 원통형 용기에서 수행된다. 용기의 직경 대 높이 비율은 4:1 내지 1:2 범위일 수 있고, 보다 바람직하게는 용기의 직경 대 높이 비율은 2:1 내지 1:1 범위이다.
바람직하게는, 반응 용기에는 피치드 블레이드 교반기, 해양형 프로펠러, 또는 라이트닌(Lightnin) A-310을 포함하는 군으로부터 선택되는 축류 교반기가 장착된다. 보다 바람직하게는, 교반기는 피치드 블레이드 교반기이다.
단계(b)는 넓은 온도 범위, 바람직하게는 -10℃ 내지 100℃의 온도, 보다 바람직하게는 0℃ 내지 80℃의 온도, 매우 보다 바람직하게는 10℃ 내지 50℃의 온도, 가장 바람직하게는 상온에서 수행될 수 있다. "상온"은 전형적인 실험실 환경에 존재하는 온도를 나타내고, 바람직하게는 17 내지 25℃ 범위의 온도를 의미한다.
바람직하게는, 중합으로부터 수득된 하이드로겔은 성형품, 예를 들면, 코팅, 메쉬, 스텐트, 나노입자 또는 마이크로입자이다. 보다 바람직하게는, 하이드로겔은 1 내지 500 마이크로미터의 직경, 보다 바람직하게는 10 내지 300 마이크로미터의 직경, 매우 보다 바람직하게는 20 및 150 마이크로미터의 직경, 가장 바람직하게는 30 내지 130 마이크로미터의 직경을 갖는 마이크로입자형 비드 형태이다. 상기 언급된 직경은 하이드로겔 마이크로입자를 물에 완전하게 수화시킬 때 측정된다.
임의의 단계(c)는 하나 이상의 하기 단계(들)을 포함한다:
(c1) 중합 반응으로부터 과량의 액체를 제거하는 단계,
(c2) 하이드로겔을 세척하여 중합 동안 사용된 용매를 제거하는 단계,
(c3) 하이드로겔을 버퍼 용액으로 옮기는 단계,
(c4) 하이드로겔의 크기 분별/체질 단계,
(c5) 하이드로겔을 용기로 옮기는 단계,
(c6) 하이드로겔을 건조시키는 단계,
(c7) 하이드로겔을 살균에 적합한 특정한 용매로 옮기는 단계, 및
(c8) 하이드로겔을, 바람직하게는 감마선 조사에 의해, 살균하는 단계.
바람직하게는, 임의의 단계(c)는 하기 단계를 모두 포함한다:
(c1) 중합 반응으로부터 과량의 액체를 제거하는 단계,
(c2) 하이드로겔을 세척하여 중합 동안 사용된 용매를 제거하는 단계,
(c3) 하이드로겔을 버퍼 용액으로 옮기는 단계,
(c4) 하이드로겔의 크기 분별/체질 단계,
(c5) 하이드로겔을 용기로 옮기는 단계,
(c7) 하이드로겔을 살균에 적합한 특정한 용매로 옮기는 단계, 및
(c8) 하이드로겔을, 바람직하게는 감마선 조사에 의해, 살균하는 단계.
1종 이상의 골격 시약은 1 내지 100 kDa, 바람직하게는 2 내지 50 kDa, 보다 바람직하게는 5 내지 30 kDa, 매우 보다 바람직하게는 5 내지 25 kDa, 가장 바람직하게는 5 내지 15 kDa 범위의 분자량을 갖는다.
바람직하게는, 골격 시약은 10% 이상의 PEG, 보다 바람직하게는 20% 이상의 PEG, 매우 보다 바람직하게는 30% 이상의 PEG, 가장 바람직하게는 40% 이상의 PEG를 포함하는 PEG계이다.
하나의 양태에서 골격 시약은 산성 염 형태, 바람직하게는 산 부가 염 형태로 존재한다. 적합한 산 부가 염은 비독성 염을 형성하는 산으로부터 형성된다. 예는 아세테이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 베실레이트, 비카르보네이트, 카르보네이트, 비설페이트, 설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 히벤제이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 이세티오네이트, 락테이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 니코티네이트, 니트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트, 수소 포스페이트, 이수소 포스페이트, 사카레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 타르트레이트를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 특히 바람직하게는, 골격 시약은 이의 하이드로클로라이드 염 형태로 존재한다.
하나의 양태에서, 1종 이상의 골격 시약은 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물 및 화학식 (IV)의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
B(-(A0)x1-(SP)x2-A-P-A2-Hyp1)x (I)
상기 화학식에서,
B는 분지 코어(branching core)이고,
SP는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 및 C2-6 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 스페이서 잔기이고,
P는 80% 이상의 PEG, 바람직하게는 85% 이상의 PEG, 보다 바람직하게는 90% 이상의 PEG, 가장 바람직하게는 95% 이상의 PEG를 포함하는 PEG계 중합체 쇄이고,
Hyp1은 아민(-NH2 및/또는 -NH-) 또는 2개 이상의 아민(-NH2 및/또는 -NH-)을 포함하는 폴리아민을 포함하는 잔기이고,
x는 3 내지 16의 정수이고,
x1, x2는 서로 독립적으로 0 또는 1이고, 단 x2가 0인 경우, x1은 0이고,
A0, A1, A2는 서로 독립적으로
Figure 112015045066876-pct00002
로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R1 및 R1a는 서로 독립적으로 H 및 C1-6 알킬로부터 선택된다.
Hyp2-A3-P-A4-Hyp3 (II)
상기 화학식에서,
P는 화학식 (I)의 화합물에서 상기와 같이 정의되고,
Hyp2, Hyp3는 서로 독립적으로 2개 이상의 아민(-NH2 및/또는 -NH-)을 포함하는 폴리아민이고,
A3 및 A4는 독립적으로
Figure 112015045066876-pct00003
로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R1 및 R1a는 서로 독립적으로 H 및 C1-6 알킬로부터 선택된다.
P1-A5-Hyp4 (III)
상기 화학식에서,
P1은 80% 이상의 PEG, 바람직하게는 85% 이상의 PEG, 보다 바람직하게는 90% 이상의 PEG, 가장 바람직하게는 95% 이상의 PEG를 포함하는 PEG계 중합체 쇄이고,
Hyp4는 3개 이상의 아민(-NH2 및/또는 -NH)을 포함하는 폴리아민이고,
A5는
Figure 112015045066876-pct00004
로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R1 및 R1a는 서로 독립적으로 H 및 C1-6 알킬로부터 선택된다.
T1-A6-Hyp5 (IV)
상기 화학식에서,
Hyp5는 3개 이상의 아민(-NH2 및/또는 -NH)을 포함하는 폴리아민이고,
A6은
Figure 112015045066876-pct00005
로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R1 및 R1a는 서로 독립적으로 H 및 C1-6 알킬로부터 선택되고,
T1은 C1-50 알킬, C2-50 알케닐 또는 C2-50 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이의 단편은 임의로 -NH-, -N(C1-4 알킬)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)NH-, -C(O)N(C1-4 알킬)-, -O-C(O)-, -S(O)-, -S(O)2-, 4 내지 7원 헤테로사이클릴, 페닐 또는 나프틸로부터 선택되는 하나 이상의 기(들)에 의해 간섭된다.
하기 부분에서 용어 "Hypx"는 Hyp1, Hyp2, Hyp3, Hyp4 및 Hyp5를 총괄하여 나타낸다.
바람직하게는, 골격 시약은 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 화합물이고, 보다 바람직하게는 골격 시약은 화학식 (I) 또는 (III)의 화합물이고, 가장 바람직하게는 골격 시약은 화학식 (I)의 화합물이다.
바람직한 양태에서, 화학식 (I)의 화합물에서, x는 4, 6 또는 8이다. 바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물에서 x는 4 또는 8이고, 가장 바람직하게는, x는 4이다.
바람직한 양태에서, 화학식 (I) 내지 (IV)의 화합물에서, A0, A1, A2, A3, A4, A5 및 A6은
Figure 112015045066876-pct00006
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물에서, A0는
Figure 112015045066876-pct00007
이다.
바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물에서, A1은
Figure 112015045066876-pct00008
이다.
바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물에서, A2는
Figure 112015045066876-pct00009
이다.
바람직하게는, 화학식 (II)의 화합물에서, A3은
Figure 112015045066876-pct00010
이고,
A4는
Figure 112015045066876-pct00011
이다.
바람직하게는, 화학식 (III)의 화합물에서, A5는
Figure 112015045066876-pct00012
이다.
바람직하게는, 화학식 (IV)의 화합물에서, A6은
Figure 112015045066876-pct00013
이다.
바람직하게는, 화학식 (IV)의 화합물에서, T1은 H 및 C1-6 알킬로부터 선택된다.
하나의 양태에서, 화학식 (I)의 화합물에서, 분지 코어 B는 하기 구조로부터 선택된다:
Figure 112015045066876-pct00014
Figure 112015045066876-pct00015
상기 화학식에서,
점선은 A0에 대한 결합을 나타내거나, x1 및 x2가 둘 다 0인 경우, A1에 대한 결합을 나타내고,
t는 1 또는 2이고; 바람직하게는 t는 1이고,
v는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14이고; 바람직하게는 v는 2, 3, 4, 5, 6이고; 보다 바람직하게는 v는 2, 4 또는 6이고; 가장 바람직하게는 v는 2이다.
바람직한 양태에서, B는 화학식 (a-i), (a-ii), (a-iii), (a-iv), (a-v), (a-vi), (a-vii), (a-viii), (a-ix), (a-x), (a-xiv), (a-xv) 또는 (a-xvi)의 구조를 갖는다. 보다 바람직하게는, B는 화학식 (a-iii), (a-iv), (a-v), (a-vi), (a-vii), (a-viii), (a-ix), (a-x) 또는 (a-iv)의 구조를 갖는다. 가장 바람직하게는, B는 화학식 (a-xiv)의 구조를 갖는다.
바람직한 양태는 B 및 A0의 조합이거나, x1 및 x2가 둘 다 0인 경우, B 및 A1의 조합이 바람직하고, 이는 하기 구조로부터 선택된다:
Figure 112015045066876-pct00016
Figure 112015045066876-pct00017
상기 화학식에서,
점선은 SP에 대한 결합을 나타내거나, x1 및 x2가 둘 다 0인 경우, P에 대한 결합을 나타낸다.
보다 바람직하게는, B 및 A0의 조합 또는, x1 및 x2가 둘 다 0인 경우, B 및 A1의 조합은 화학식 (b-i), (b-iv), (b-vi) 또는 (b-viii)의 구조를 갖고, 가장 바람직하게는 화학식 (b-i)의 구조를 갖는다.
하나의 양태에서, 화학식 (I)의 x1 및 x2는 0이다.
하나의 양태에서, PEG계 중합체 쇄 P는 0.3 kDa 내지 40 kDa; 예를 들면, 0.4 내지 35 kDa, 0.6 내지 38 kDA, 0.8 내지 30 kDa, 1 내지 25 kDa, 1 내지 15 kDa 또는 1 내지 10 kDa의 분자량을 갖는다. 가장 바람직하게는 P는 1 내지 10 kDa의 분자량을 갖는다.
하나의 양태에서, PEG계 중합체 쇄 P1은 0.3 kDa 내지 40 kDa; 예를 들면, 0.4 내지 35 kDa, 0.6 내지 38 kDA, 0.8 내지 30 kDa, 1 내지 25 kDa, 1 내지 15 kDa 또는 1 내지 10 kDa의 분자량을 갖는다. 가장 바람직하게는 P1은 1 내지 10 kDa의 분자량을 갖는다.
하나의 양태에서, 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물에서, P는 화학식 (c-i)의 구조를 갖는다:
Figure 112015045066876-pct00018
상기 화학식에서,
n은 6 내지 900 범위이고, 보다 바람직하게는 n은 20 내지 700 범위이고, 가장 바람직하게는 n은 20 내지 250 범위이다.
하나의 양태에서, 화학식 (III)의 화합물에서, P1은 화학식 (c-ii)의 구조를 갖는다:
Figure 112015045066876-pct00019
상기 화학식에서,
n은 6 내지 900 범위이고, 보다 바람직하게는 n은 20 내지 700 범위이고, 가장 바람직하게는 n은 20 내지 250 범위이고;
T0은 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 및 C2-6 알키닐을 포함하는 군으로부터 선택되고, 이는 임의로 -NH-, -N(C1-4 알킬)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)NH-, -C(O)N(C1-4 알킬)-, -O-C(O)-, -S(O)- 또는 -S(O)2-로부터 선택되는 하나 이상의 기(들)에 의해 간섭된다.
하나의 양태에서, 화학식 (I) 내지 (IV)의 화합물에서, 잔기 Hypx는 폴리아민이고, 바람직하게는 결합된 형태로 및, 해당되는 경우, R- 및/또는 S-배위로 화학식 (d-i), (d-ii), (d-iii) 및/또는 (d-iv)의 잔기를 포함한다.
Figure 112015045066876-pct00020
Figure 112015045066876-pct00021
상기 화학식에서,
zl, z2, z3, z4, z5, z6은 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다.
보다 바람직하게는, Hypx는 결합된 형태 및 R- 및/또는 S-배위로 리신, 오르니틴, 디아미노프로프리온산 및/또는 디아미노부티르산을 포함한다. 가장 바람직하게는, Hypx는 결합된 형태 및 R- 및/또는 S-배위로 리신을 포함한다.
Hypx는 40 Da 내지 30 kDa, 바람직하게는 0.3 kDa 내지 25 kDa, 보다 바람직하게는 0.5 kDa 내지 20 kDa, 매우 보다 바람직하게는 1 kDa 내지 20 kDa, 가장 바람직하게는 2 kDa 내지 15 kDa의 분자량을 갖는다.
Hypx는 바람직하게는 화학식 (e-i)의 잔기, 화학식 (e-ii)의 잔기, 화학식 (e-iii)의 잔기, 화학식 (e-iv)의 잔기, 화학식 (v)의 잔기, 화학식 (e-vi)의 잔기, 화학식 (e-vii)의 잔기, 화학식 (e-viii)의 잔기 및 화학식 (e-ix)의 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 잔기(e-i) 내지 (e-v)은 각각의 카이랄 중심에서 R- 또는 S-배위일 수 있고, 바람직하게는, 잔기(e-i) 내지 (e-v)의 모든 카이랄 중심은 동일한 배위를 갖는다:
Figure 112015045066876-pct00022
상기 화학식에서,
p1은 1 내지 5의 정수이고, 바람직하게는 p1은 4이고,
점선은 골격 시약이 화학식 (I)의 구조를 갖는 경우, A2에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (II)의 구조를 갖는 경우, A3 또는 A4에 대한 결합을 나타낸다.
Figure 112015045066876-pct00023
상기 화학식에서,
p2, p3 및 p4는 동일하거나 상이하고, 각각은 서로 독립적으로 1 내지 5의 정수이고, 바람직하게는 p2, p3 및 p4는 4이고,
점선은 골격 시약이 화학식 (I)의 구조를 갖는 경우, A2에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (II)의 구조를 갖는 경우, A3 또는 A4에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (III)의 구조를 갖는 경우, A5에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (IV)의 구조를 갖는 경우, A6에 대한 결합을 나타낸다.
Figure 112015045066876-pct00024
상기 화학식에서,
p5 내지 p11은 동일하거나 상이하고, 각각은 서로 독립적으로 1 내지 5의 정수이고, 바람직하게는 p5 내지 p11은 4이고,
점선은 골격 시약이 화학식 (I)인 경우, A2에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (II)인 경우, A3 또는 A4에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (III)인 경우, A5에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (IV)인 경우, A6에 대한 결합을 나타낸다.
Figure 112015045066876-pct00025
상기 화학식에서,
p12 내지 p26은 동일하거나 상이하고, 각각은 서로 독립적으로 1 내지 5의 정수이고, 바람직하게는 p12 내지 p26은 4이고,
점선은 골격 시약이 화학식 (I)의 구조를 갖는 경우, A2에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (II)의 구조를 갖는 경우, A3 또는 A4에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (III)의 구조를 갖는 경우, A5에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (IV)의 구조를 갖는 경우, A6에 대한 결합을 나타낸다.
Figure 112015045066876-pct00026
상기 화학식에서,
p27 및 p28은 동일하거나 상이하고, 각각은 서로 독립적으로 1 내지 5의 정수이고, 바람직하게는 p27 및 p28은 4이고,
q는 1 내지 8의 정수이고, 바람직하게는 q는 2 또는 6이고, 가장 바람직하게는 p는 6이고,
점선은 골격 시약이 화학식 (I)의 구조를 갖는 경우, A2에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (II)의 구조를 갖는 경우, A3 또는 A4에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (III)의 구조를 갖는 경우, A5에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (IV)의 구조를 갖는 경우, A6에 대한 결합을 나타낸다.
Figure 112015045066876-pct00027
상기 화학식에서,
p29 및 p30은 동일하거나 상이하고, 각각은 서로 독립적으로 2 내지 5의 정수이고, 바람직하게는 p29 및 p30은 3이고,
점선은 골격 시약이 화학식 (I)의 구조를 갖는 경우, A2에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (II)의 구조를 갖는 경우, A3 또는 A4에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (III)의 구조를 갖는 경우, A5에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (IV)의 구조를 갖는 경우, A6에 대한 결합을 나타낸다.
Figure 112015045066876-pct00028
상기 화학식에서,
p31 내지 p36은 동일하거나 상이하고, 각각은 서로 독립적으로 2 내지 5의 정수이고, 바람직하게는 p31 내지 p36은 3이고,
점선은 골격 시약이 화학식 (I)의 구조를 갖는 경우, A2에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (II)의 구조를 갖는 경우, A3 또는 A4에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (III)의 구조를 갖는 경우, A5에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (IV)의 구조를 갖는 경우, A6에 대한 결합을 나타낸다.
Figure 112015045066876-pct00029
상기 화학식에서,
p37 내지 p50은 동일하거나 상이하고, 각각은 서로 독립적으로 2 내지 5의 정수이고, 바람직하게는 p37 내지 p50은 3이고,
점선은 골격 시약이 화학식 (I)의 구조를 갖는 경우, A2에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (II)의 구조를 갖는 경우, A3 또는 A4에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (III)의 구조를 갖는 경우, A5에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (IV)의 구조를 갖는 경우, A6에 대한 결합을 나타낸다.
Figure 112015045066876-pct00030
상기 화학식에서,
p51 내지 p80은 동일하거나 상이하고, 각각은 서로 독립적으로 2 내지 5의 정수이고, 바람직하게는 p51 내지 p80은 3이고,
점선은 골격 시약이 화학식 (I)의 구조를 갖는 경우, A2에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (II)의 구조를 갖는 경우, A3 또는 A4에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (III)의 구조를 갖는 경우, A5에 대한 결합을 나타내고, 골격 시약이 화학식 (IV)의 구조를 갖는 경우, A6에 대한 결합을 나타낸다.
바람직하게는, Hypx는 화학식 (e-i), (e-ii), (e-iii), (e-iv), (e-vi), (e-vii), (e-viii) 또는 (e-ix)의 구조를 갖는다. 보다 바람직하게는, Hypx는 화학식 (e-ii), (e-iii), (e-iv), (e-vii), (e-viii) 또는 (e-ix)의 구조를 갖고, 매우 보다 바람직하게는 Hypx는 화학식 (e-ii), (e-iii), (e-vii) 또는 (e-viii)의 구조를 갖고, 가장 바람직하게는 Hypx는 화학식 (e-iii)의 구조를 갖는다.
골격 시약이 화학식 (I)의 구조를 갖는 경우, 바람직한 잔기 -A2-Hyp1은 화학식
Figure 112015045066876-pct00031
의 잔기이다.
상기 화학식에서,
점선은 P에 대한 결합을 나타내고;
E1은 화학식 (e-i) 내지 (e-ix)으로부터 선택된다.
골격 시약이 화학식 (II)의 구조를 갖는 경우, 바람직한 잔기 Hyp2-A3-은 화학식
Figure 112015045066876-pct00032
의 잔기이고, 바람직한 잔기 -A4-Hyp3는 화학식
Figure 112015045066876-pct00033
의 잔기이다.
상기 화학식에서,
점선은 P에 대한 결합을 나타내고;
E1은 화학식 (e-i) 내지 (e-ix)으로부터 선택된다.
골격 시약이 화학식 (III)의 구조를 갖는 경우, 바람직한 잔기 -A5-Hyp4는 화학식
Figure 112015045066876-pct00034
의 잔기이다.
상기 화학식에서,
점선은 P1에 대한 결합을 나타내고;
E1은 화학식 (e-i) 내지 (e-ix)으로부터 선택된다.
보다 바람직하게는, 골격 시약은 화학식 (I)의 구조를 갖고, B는 화학식 (a-xiv)의 구조를 갖는다.
매우 보다 바람직하게는, 골격 시약은 화학식 (I)의 구조를 갖고, B는 화학식 (a-xiv)의 구조를 갖고, x1 및 x2는 0이고, A1은 -O-이다.
매우 보다 바람직하게는, 골격 시약은 화학식 (I)의 구조를 갖고, B는 화학식 (a-xiv)의 구조를 갖고, A1은 -O-이고, P는 화학식 (c-i)의 구조를 갖는다.
매우 보다 바람직하게는, 골격 시약은 화학식 (I)의 구조를 갖고, B는 화학식 (a-xiv)의 구조를 갖고, x1 및 x2는 0이고, A1은 -O-이고, P는 화학식 (c-i)이고, A2는 -NH-(C=O)-이고, Hyp1은 화학식 (e-iii)이다.
가장 바람직하게는, 골격 시약은 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112015045066876-pct00035
상기 화학식에서,
n은 10 내지 40, 바람직하게는 10 내지 30, 보다 바람직하게는 10 내지 20 범위이다.
동일하게 바람직하게는, n은 20 내지 30 kDa 범위이고, 가장 바람직하게는 n은 28이다.
SP는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 및 C2-6 알키닐을 포함하는 군으로부터 선택되는 스페이서 잔기이고, 바람직하게는 SP는 -CH2-, -CH2-CH2-, -CH(CH3)-, -CH2-CH2-CH2-, -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-, -CH=CH- 또는 -CH=CH-이고, 가장 바람직하게는 SP는 -CH2-, -CH2-CH2- 또는 -CH=CH-이다.
1종 이상의 가교결합제 시약은 2개 이상의 카르보닐옥시 기(-(C=O)-O- 또는 -O-(C=O)-)를 포함하고, 이는 생분해성 연결기이다. 이들 생분해성 연결기는 하이드로겔을 생분해성으로 만들기 위해 필요하다. 추가로, 1종 이상의 가교결합제 시약은 단계(b)의 중합 동안 1종 이상의 골격 시약의 아민과 반응하는 2개 이상의 활성화된 말단 작용기를 포함한다.
가교결합제 시약은 6 내지 40 kDa 범위, 보다 바람직하게는 6 내지 30 kDa 범위, 매우 보다 바람직하게는 6 내지 20 kDa 범위, 매우 보다 바람직하게는 6 내지 15 kDa 범위, 가장 바람직하게는 6 내지 10 kDa 범위의 분자량을 갖는다.
가교결합제 시약은 활성화된 에스테르 기, 활성화된 카르바메이트 기, 활성화된 카르보네이트 기 및 활성화된 티오카르보네이트 기를 포함하는 군으로부터 선택되는 2개 이상의 활성화된 말단 작용기를 포함하고, 이는 중합 동안 골격 시약의 아민 기와 반응하여 아미드 결합을 형성한다.
하나의 바람직한 양태에서, 가교결합제 시약은 화학식 (V-I)의 화합물이다:
Figure 112015045066876-pct00036
상기 화학식에서,
각각의 D1, D2, D3 및 D4는 동일하거나 상이하고, 각각은 서로 독립적으로 -O-, -NR5-, -S- 및 -CR6R6a-를 포함하는 군으로부터 선택되고;
각각의 R1, R1a, R2, R2a, R3, R3a, R4, R4a, R6 및 R6a는 동일하거나 상이하고, 각각은 서로 독립적으로 -H, -OR7, -NR7R7a, -SR7 및 C1-6 알킬을 포함하는 군으로부터 선택되고; 임의로, 각각의 쌍(들) R1/R2, R3/R4, R1a/R2a, 및 R3a/R4a는 독립적으로 화학적 결합을 형성할 수 있고/있거나 각각의 쌍들 R1/R1a, R2/R2a, R3/R3a, R4/R4a, R6/R6a, R1/R2, R3/R4, R1a/R2a, 및 R3a/R4a는 서로 독립적으로 이들이 결합되는 원자와 함께 결합하여 C3-8 사이클로알킬을 형성하거나 고리 A를 형성하거나, 이들이 결합되는 원자와 함께 결합하여 4 내지 7원 헤테로사이클릴 또는 8 내지 11원 헤테로비사이클릴 또는 아다만틸을 형성하고;
각각의 R5는 독립적으로 -H 및 C1-6 알킬로부터 선택되고; 임의로, 각각의 쌍(들) R1/R5, R2/R5, R3/R5, R4/R5 및 R5/R6은 독립적으로 화학적 결합을 형성할 수 있고/있거나 이들이 결합되는 원자와 함께 결합하여 4 내지 7원 헤테로사이클릴 또는 8 내지 11원 헤테로비사이클릴을 형성하고;
각각의 R7, R7a는 독립적으로 H 및 C1-6 알킬로부터 선택되고;
A는 인데닐, 인다닐 및 테트랄리닐로 이루어진 군으로부터 선택되고;
P2는
Figure 112015045066876-pct00037
이고;
m은 120 내지 920, 바람직하게는 120 내지 460, 보다 바람직하게는 120 내지 230 범위이고;
r1, r2, r7, r8은 독립적으로 0 또는 1이고;
r3, r6은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 또는 4이고;
r4, r5는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고;
s1, s2는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
Y1, Y2는 동일하거나 상이하고, 각각은 서로 독립적으로 화학식 (f-i) 내지 (f-vi)로부터 선택된다:
Figure 112015045066876-pct00038
상기 화학식에서,
점선은 분자의 나머지에 대한 결합을 나타내고,
b는 1, 2, 3 또는 4이고,
XH는 Cl, Br, I, 또는 F이다.
바람직하게는, 가교결합제 시약은 화학식 (V-II)의 화합물이다:
Figure 112015045066876-pct00039
상기 화학식에서,
D1, D2, D3 및 D4는 동일하거나 상이하고, 각각은 서로 독립적으로 O, NR5, S 및 CR5R5a를 포함하는 군으로부터 선택되고;
R1, R1a, R2, R2a, R3, R3a, R4, R4a, R5 및 R5a는 동일하거나 상이하고, 각각은 서로 독립적으로 H 및 C1-6 알킬을 포함하는 군으로부터 선택되고; 임의로, 하나 이상의 쌍(들) R1/R1a, R2/R2a, R3/R3a, R4/R4a, R1/R2, R3/R4, R1a/R2a, 및 R3a/R4a는 화학적 결합을 형성하거나, 이들이 결합된 원자와 C3-8 사이클로알킬을 형성하거나 고리 A를 형성하거나, 이들이 결합되는 원자와 함께 결합하여 4 내지 7원 헤테로사이클릴 또는 8 내지 11원 헤테로비사이클릴 또는 아다만틸을 형성하고;
A는 페닐, 나프틸, 인데닐, 인다닐 및 테트랄리닐로 이루어진 군으로부터 선택되고;
P2는
Figure 112015045066876-pct00040
이고;
m은 120 내지 920, 바람직하게는 120 내지 460, 보다 바람직하게는 120 내지 230 범위이고;
r1, r2, r7, r8은 독립적으로 0 또는 1이고;
r3, r6은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 또는 4이고;
r4, r5는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고;
s1, s2는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
Y1, Y2는 동일하거나 상이하고, 각각은 서로 독립적으로 화학식 (f-i) 내지 (f-vi)로부터 선택된다:
Figure 112015045066876-pct00041
상기 화학식에서,
점선은 분자의 나머지에 대한 결합을 나타내고,
b는 1, 2, 3 또는 4이고,
XH는 Cl, Br, I, 또는 F이다.
잔기
Figure 112015045066876-pct00042
는 2개 이상의 활성화된 말단 작용기를 나타내는 것으로 이해된다.
바람직하게는, 화학식 (V-I) 또는 (V-II)의 Y1 및 Y2는 화학식 (f-i), (f-ii) 또는 (f-v)의 구조를 갖는다. 보다 바람직하게는, Y1 및 Y2는 화학식 (f-i) 또는 (f-ii)의 구조를 갖고, 가장 바람직하게는, Y1 및 Y2는 화학식 (f-i)의 구조를 갖는다.
바람직하게는, 화학식 (V-I) 또는 (V-II)의 두 잔기 Y1 및 Y2는 동일한 구조를 갖는다. 보다 바람직하게는, 두 잔기 Y1 및 Y2는 화학식 (f-i)의 구조를 갖는다.
바람직하게는, 화학식 (V-I) 또는 (V-II)의 r1은 0이다.
바람직하게는, 화학식 (V-I) 또는 (V-II)의 r1 및 s1은 둘 다 0이다.
바람직하게는, 화학식 (V-I) 또는 (V-II)의 하나 이상의 쌍(들) R1/R1a, R2/R2a, R3/R3a, R4/R4a, R1/R2, R3/R4, R1a/R2a, 및 R3a/R4a는 화학적 결합을 형성하거나, 이들이 결합되는 원자와 함께 결합하여 C3-8 사이클로알킬을 형성하거나 고리 A를 형성한다.
바람직하게는, 화학식 (V-I) 또는 (V-II)의 하나 이상의 쌍(들) R1/R2, R1/R2a, R3/R4, R3a/R4a는 이들이 결합되는 원자와 함께 결합하여 4 내지 7원 헤테로사이클릴 또는 8 내지 11원 헤테로비사이클릴을 형성한다.
바람직하게는, 화학식 (V-I) 또는 (V-II)의 가교결합제 시약은 대칭적이고, 즉 잔기
Figure 112015045066876-pct00043
는
잔기
Figure 112015045066876-pct00044
와 동일한 구조를 갖는다.
하나의 바람직한 양태에서 화학식 (V-I) 및 (V-II)의 s1, s2, r1 및 r8은 0이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 화학식 (V-I) 및 (V-II)의 s1, s2, r1 및 r8은 0이고, 화학식 (V-I) 및 (V-II)의 r4 및 r5는 1이다.
바람직한 가교결합제 시약은 화학식 (V-1) 내지 (V-54)의 시약이다:
Figure 112015045066876-pct00045
Figure 112015045066876-pct00046
Figure 112015045066876-pct00047
Figure 112015045066876-pct00048
Figure 112015045066876-pct00049
Figure 112015045066876-pct00050
Figure 112015045066876-pct00051
Figure 112015045066876-pct00052
상기 화학식에서,
각각의 가교결합제 시약은, 해당되는 경우, 이의 라세미 혼합물의 형태일 수 있고;
m, Y1 및 Y2는 상기 정의된 바와 같다.
매우 보다 바람직한 가교결합제 시약은 화학식 (Va-1) 내지 (Va-54)의 시약이다:
Figure 112015045066876-pct00053
Figure 112015045066876-pct00054
Figure 112015045066876-pct00055
Figure 112015045066876-pct00056
Figure 112015045066876-pct00057

Figure 112015045066876-pct00058
Figure 112015045066876-pct00059
Figure 112015045066876-pct00060
상기 화학식에서,
각각의 가교결합제 시약은, 해당되는 경우, 이의 라세미 혼합물의 형태일 수 있고;
m, Y1 및 Y2는 상기 정의된 바와 같다.
놀랍게도 카르보닐옥시 기의 알파 탄소에 분지, 즉 H 이외의 잔기가 있는 가교결합제 시약의 사용은 효소적 분해, 예를 들면, 에스테라제를 통한 분해에 대해 더 큰 내성을 갖는 하이드로겔의 형성을 야기하는 것으로 확인되었다.
유사하게, 놀랍게도 카르보닐옥시 기의 (C=O) 및 인접 활성화된 에스테르, 활성화된 카르바메이트, 활성화된 카르보네이트 또는 활성화된 티오카르바메이트의 (C=O) 사이에 원자가 적게 존재할수록 수득된 하이드로겔은 분해, 예를 들면, 에스테라제를 통한 분해에 대해 큰 내성을 갖는 것으로 확인되었다.
따라서, 가교결합제 시약 (V-11) 내지 (V-54), (V-1), (V-2), (Va-11) 내지 (Va-54), (Va-1) 및 (Va-2)는 바람직한 가교결합제 시약이다. 가교결합제 시약 (Va-11) 내지 (Va-54), (Va-1) 및 (Va-2)는 가장 바람직한 가교결합제 시약이다. 가교결합제 시약 (Va-14)가 가장 바람직하다.
또 다른 양태에서, 가교결합제 시약 (V-1), (V-2), (V-5), (V-6), (V-7), (V-8), (V-9), (V-10), (V-11), (V-12), (V-13), (V-14), (V-15), (V-16), (V-17), (V-18), (V-19), (V-20), (V-21), (V-22), (V-23), (V-24), (V-25), (V-26), (V-27), (V-28), (V-29), (V-30), (V-31), (V-32), (V-33), (V-34), (V-35), (V-36), (V-37), (V-38), (V-39), (V-40), (V-41), (V-42), (V-43), (V-44), (V-45), (V-46), (V-47), (V-48), (V-49), (V-50), (V-51), (V-52), (V-53) 및 (V-54)는 바람직한 가교결합제 시약이다. 보다 바람직하게는, 1종 이상의 가교결합제 시약은 화학식 (V-5), (V-6), (V-7), (V-8), (V-9), (V-10), (V-14), (V-22), (V-23), (V-43), (V-44), (V-45) 또는 (V-46)이고, 가장 바람직하게는, 1종 이상의 가교결합제 시약은 화학식 (V-5), (V-6), (V-9) 또는 (V-14)이다.
또 다른 양태에서, 가교결합제 시약 (Va-1), (Va-2), (Va-5), (Va-6), (Va-7), (Va-8), (Va-9), (Va-10), (Va-11), (Va-12), (Va-13), (Va-14), (Va-15), (Va-16), (Va-17), (Va-18), (Va-19), (Va-20), (Va-21), (Va-22), (Va-23), (Va-24), (Va-25), (Va-26), (Va-27), (Va-28), (Va-29), (Va-30), (Va-31), (Va-32), (Va-33), (Va-34), (Va-35), (Va-36), (Va-37), (Va-38), (Va-39), (Va-40), (Va-41), (Va-42), (Va-43), (Va-44), (Va-45), (Va-46), (Va-47), (Va-48), (Va-49), (Va-50), (Va-51), (Va-52), (Va-53 및 (Va-54)는 매우 보다 바람직한 가교결합제 시약이다. 보다 바람직하게는, 1종 이상의 가교결합제 시약은 화학식 (Va-5), (Va-6), (Va-7), (Va-8), (Va-9), (Va-10), (Va-14), (Va-22), (Va-23), (Va-43), (Va-44), (Va-45) 또는 (Va-46)이고, 가장 바람직하게는, 1종 이상의 가교결합제 시약은 화학식 (Va-5), (Va-6), (Va-9) 또는 (Va-14)이다.
상기 언급된 바와 같은 화학식 (V-I) 및 (V-II)의 화합물의 바람직한 양태는 따라서 화학식 (V-1) 내지 (V-53)의 바람직한 화합물에 적용된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 공정으로 수득할 수 있는 하이드로겔에 관한 것이다.
하이드로겔은 1차 아민 기(-NH2) 0.01 내지 1 mmol/g, 보다 바람직하게는, 1차 아민 기 0.02 내지 0.5 mmol/g, 가장 바람직하게는 1차 아민 기 0.05 내지 0.3 mmol/g을 함유한다. 용어 "1차 아민 기 X mmol/g"은 건조 하이드로겔 1 g이 1차 아민 기 X mmol을 포함하는 것을 의미한다. 하이드로겔의 아민 함량의 측정은 문헌 [Gude et al., Letters in Peptide Science, 2002, 9(4): 203-206]에 따라 실시할 수 있고, 이는 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
바람직하게는, 본원에서 사용되는 용어 "건조"는 최대 10%, 바람직하게는 5% 미만, 보다 바람직하게는 2% 미만의 잔여 수분 함량을 갖는 것을 의미한다(카를 피셔(Karl Fischer)법에 따라 측정된다). 바람직한 건조 방법은 동결건조이다.
하나의 양태에서 VEGF 중화 프로드럭의 하이드로겔은 가역적 프로드럭 링커-VEGF 중화 생물학적 활성 잔기가 하이드로겔에 컨쥬게이션되기 전에 추가로 개질된다.
바람직하게는, 하이드로겔은 하기 단계들을 포함하는 공정에 의해 개질된다:
(A) Ax0 기를 갖는 하이드로겔을 제공하는 단계, 여기서 Ax0 기는 동일하거나 상이한, 바람직하게는 동일한 작용기를 나타낸다.
(B) 화학식 (VI)의 스페이서 시약을 단계(A)로부터의 하이드로겔의 Ax0에 임의로 공유적으로 컨쥬게이션하는 단계:
Ax1-SP2-Ax2 (VI)
상기 화학식에서,
SP2는 C1-50 알킬, C2-50 알케닐 또는 C2-50 알키닐이고, C1-50 알킬, C2-50 알케닐 및 C2-50 알키닐은 임의로 -NH-, -N(C1-4 알킬)-, -O-, -S, -C(O)-, -C(O)NH, -C(O)N(C1-4 알킬)-, -O-C(O)-, -S(O)-, -S(O)2-, 4 내지 7원 헤테로사이클릴, 페닐 및 나프틸로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기(들)에 의해 간섭되고;
Ax1은 하이드로겔의 Ax0와의 반응을 위한 작용기이고;
Ax2는 작용기이다.
(C) Ax0 또는 Ax2 99 mol-% 이하가 Ax3과 반응하도록, 단계(A) 또는 단계(B)의 하이드로겔을 화학식 (VII)의 시약과 반응시키는 단계:
Ax3-Z (VII)
상기 화학식에서,
Ax3은 작용기이고;
Z는 10 Da 내지 1000 kDa 범위의 분자량을 갖는 불활성 잔기이다.
바람직하게는, 단계(A)의 Ax0은 말레이미드, 아민(-NH2 또는 -NH-), 하이드록실(-OH), 카르복실(-COOH) 및 활성화된 카르복실(-COY1)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 Y1은 화학식 (f-i) 내지 (f-vi)로부터 선택된다:
Figure 112015045066876-pct00061
상기 화학식에서,
점선은 분자의 나머지에 대한 결합을 나타내고,
b는 1, 2, 3 또는 4이고;
XH는 Cl, Br, I, 또는 F이다.
보다 바람직하게는, 단계(A)의 Ax0는 아민 또는 말레이미드이다.
VEGF 중화 프로드럭의 하이드로겔이 상기 기재된 공정에 따라 수득되는 경우, 단계(A)의 작용기 Ax0은 1종 이상의 골격 시약의 아민에 해당하는 것으로 이해된다.
바람직한 양태에서 단계(A)의 Ax0은 아민이고, 단계(B)의 Ax1은 ClSO2-, R1(C=O)-, I-, Br-, Cl-, SCN-, CN-, O=C=N-, Y1-(C=O)-, Y1-(C=O)-NH-, 또는 Y1-(C=O)-O-이고, 여기서
R1은 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-8 사이클로알킬, 4 내지 7원 헤테로사이클릴, 8 내지 11원 헤테로비사이클릴, 페닐, 나프틸, 인데닐, 인다닐, 또는 테트랄리닐이고;
Y1은 화학식 (f-i) 내지 (f-vi)로부터 선택된다:
Figure 112015045066876-pct00062
상기 화학식에서,
점선은 분자의 나머지에 대한 결합을 나타내고,
b는 1, 2, 3 또는 4이고,
XH는 Cl, Br, I, 또는 F이다.
또 다른 바람직한 양태에서 단계(A)의 Ax0는 하이드록실 기(-OH)이고, 단계(B)의 Ax1은 O=C=N-, I-, Br-, SCN-, 또는 Y1-(C=O)-NH-이고,
여기서 Y1은 화학식 (f-i) 내지 (f-vi)로부터 선택된다:
Figure 112015045066876-pct00063
상기 화학식에서,
점선은 분자의 나머지에 대한 결합을 나타내고,
b는 1, 2, 3 또는 4이고,
XH는 Cl, Br, I, 또는 F이다.
또 다른 바람직한 양태에서 단계(A)의 Ax0은 카르복실산(-(C=O)OH)이고, 단계(B)의 Ax1은 1차 아민 또는 2차 아민이다.
또 다른 바람직한 양태에서 단계(A)의 Ax0은 말레이미드이고, 단계(B)의 Ax1은 티올이다.
보다 바람직하게는, 단계(A)의 Ax0은 아민이고, 단계(B)의 Ax1은 Y1-(C=O)-, Y1-(C=O)-NH-, 또는 Y1-(C=O)-O-이고, 가장 바람직하게는 단계(A)의 Ax0은 아민이고, 단계(B)의 Ax1은 Y1-(C=O)-이다.
단계(B)의 Ax1은 임의로 보호된 형태로 존재할 수 있다.
활성화된 카르복실산 수득에 적합한 활성화 시약은, 예를 들면, N,N'-디사이클로헥실-카르보디이미드(DCC), 1-에틸-3-카르보디이미드(EDC), 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP), 브로모트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBrOP), 1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)디메틸아미노-모르폴리노-카르베늄 헥사플루오로포스페이트(COMU), 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBT), 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸(HO AT), O-(6-클로로벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HCTU), 1-H-벤조트리아졸리움(HBTU), (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우늄 헥사플루오로포스페이트(HATU), 및 O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU)이다. 이들 시약은 시중에서 구입할 수 있고 숙련가에게 잘 알려져 있다.
바람직하게는, 단계(B)의 Ax2는, 임의의 보호기가 있는, -말레이미드, -SH, -NH2, -SeH, -N3, -C≡CH, -CR1=CR1aR1b, -OH, -(CH=X)-R1, -(C=O)-S-R1, -(C=O)-H, -NH-NH2, -O-NH2, -Ar-X0, -Ar-Sn(R1)(R1a)(R1b), -Ar-B(OH)(OH), Br, I, Y1-(C=O)-, Y1-(C=O)-NH-, Y1-(C=O)-O-,
Figure 112015045066876-pct00064
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 화학식에서,
점선은 SP2에 대한 결합을 나타내고;
X는 O, S, 또는 NH이고,
X0은 -OH, -NR1R1a, -SH, 또는 -SeH이고,
XH는 Cl, Br, I 또는 F이고;
Ar은 페닐, 나프틸, 인데닐, 인다닐, 또는 테트랄리닐이고;
R1, R1a, R1b는 서로 독립적으로 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-8 사이클로알킬, 4 내지 7원 헤테로사이클릴, 8 내지 11원 헤테로비사이클릴, 페닐, 나프틸, 인데닐, 인다닐, 또는 테트랄리닐이고;
Y1은 화학식 (f-i) 내지 (f-vi)로부터 선택된다:
Figure 112015045066876-pct00065
상기 화학식에서,
점선은 분자의 나머지에 대한 결합을 나타내고,
b는 1, 2, 3 또는 4이고,
XH는 Cl, Br, I, 또는 F이다.
보다 바람직하게는, 단계(B)의 Ax2는 -NH2, 말레이미드 또는 티올, 가장 바람직하게는 단계(B)의 Ax2는 말레이미드이다. 동일하게 바람직하게는, 단계(B)의 Ax2는 티올이다.
단계(B)의 Ax2는 임의로 보호된 형태로 존재할 수 있다.
단계(A)의 하이드로겔이 스페이서 잔기에 공유적으로 컨쥬게이션되는 경우, 수득된 하이드로겔-스페이서 잔기 컨쥬게이트는 화학식 (VIII)이다:
Figure 112015045066876-pct00066
상기 화학식에서,
점선은 단계(A)의 하이드로겔에 대한 결합을 나타내고;
Ay1은 Ax0과 Ax1 사이에 형성된 연결기이고;
SP2 및 Ax2는 화학식 (VI)에서와 같이 사용된다.
바람직하게는, 화학식 (VIII)의 Ay1은 안정한 연결기이다.
바람직하게는, 화학식 (VIII)의 Ay1은
Figure 112015045066876-pct00067
로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 별표로 표시된 점선은 하이드로겔에 대한 결합을 나타내고; 표시되지 않은 점선은 SP2에 대한 결합을 나타낸다.
적합한 반응 조건은 실시예 부분에 기재되고 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
공정 단계(B)는 염기의 존재하에 수행될 수 있다. 적합한 염기는 통상적인 무기 또는 유기 염기를 포함한다. 이들은 바람직하게는 알칼리 토금속 또는 알칼리 금속 수화물, 수산화물, 아미드, 알콕사이드, 아세테이트, 카르보네이트 또는 비카르보네이트, 예를 들면, 수소화나트륨, 나트륨 아미드, 나트륨 메톡사이드, 나트륨 에톡사이드, 칼륨 3급-부톡사이드, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 아세트산칼슘, 아세트산암모늄, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 중탄산칼륨, 중탄산나트륨 또는 탄산암모늄, 및 3차 아민, 예를 들면, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 트리부틸아민, N,N-디메틸아닐린, N,N-디메틸벤질아민, 피리딘, N-메틸피페리딘, N-메틸모르폴린, N,N-디메틸아미노피리딘, 디아자비사이클로옥탄(DABCO), 디아자비사이클로노넨(DBN), N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA), 디아자비사이클로운데켄(DBU) 또는 콜리딘을 포함한다.
공정 단계(B)는 용매의 존재하에 수행될 수 있다. 본 발명의 공정 단계(B)를 실시하기에 적합한 용매는 유기 용매를 포함한다. 이들은 바람직하게는 물 및 지방족, 지환족 또는 방향족 탄화수소, 예를 들면, 석유 에테르, 헥산, 헵탄, 사이클로헥산, 메틸사이클로헥산, 벤젠, 톨루엔, 크실렌 또는 데칼린; 할로겐화 탄화수소, 예를 들면, 클로로벤젠, 디클로로벤젠, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로에탄 또는 트리클로로에탄; 알코올, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, n- 또는 i-프로판올, n-, i-, 2급- 또는 3급-부탄올, 에탄디올, 프로판-1,2-디올, 에톡시에탄올, 메톡시 에탄올, 디에틸렌 글리콜 모노 메틸 에테르, 디메틸에테르, 디에틸렌 글리콜; 아세토니트릴, N-메틸-2-피롤리돈(NMP), 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸 설폭사이드(DMSO), N,N-디메틸아세트아미드, 니트로메탄, 니트로벤젠, 헥사메틸포스포르아미드(HMPT), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논(DMI), 1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라하이드로-2(1H)-피리미디논(DMPU), 에틸 아세테이트, 아세톤, 부탄온; 에테르, 예를 들면, 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 메틸 t-부틸 에테르, 메틸 t-아밀 에테르, 디옥산, 테트라하이드로푸란, 1,2-디메톡시에탄, 1,2-디에톡시에탄 또는 아니솔; 또는 이의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 용매는 물, 아세토니트릴 및 N-메틸-2-피롤리돈으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 단계(C)의 Ax3은 -SH, -NH2, -SeH, -말레이미드, -C≡CH, -N3, -CR1=CR1aR1b, -(CH=X)-R1, -OH, -(C=O)-S-R1, -NH-NH2, -O-NH2, -Ar-Sn(R1)(R1a)(R1b), -Ar-B(OH)(OH), -Ar-X0,
Figure 112015045066876-pct00068
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 화학식에서,
점선은 Z에 대한 결합을 나타내고;
X는 O, S, 또는 NH이고,
X0은 -OH, -NR1R1a, -SH, 또는 -SeH이고;
R1, R1a, R1b는 서로 독립적으로 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-8 사이클로알킬, 4 내지 7원 헤테로사이클릴, 8 내지 11원 헤테로비사이클릴, 페닐, 나프틸, 인데닐, 인다닐, 또는 테트랄리닐이고;
Ar은 페닐, 나프틸, 인데닐, 인다닐, 또는 테트랄리닐이고;
Y1은 활성화된 카르복실산, 활성화된 카르보네이트 또는 활성화된 카르바메이트이고, 바람직하게는 Y1은 화학식 (f-i) 내지 (f-vi)로부터 선택된다:
Figure 112015045066876-pct00069
상기 화학식에서,
점선은 분자의 나머지에 대한 결합을 나타내고,
b는 1, 2, 3 또는 4이고,
XH는 Cl, Br, I, 또는 F이다.
바람직한 양태에서 Y1은 화학식 (f-i) 내지 (f-vi)로부터 선택된다:
Figure 112015045066876-pct00070
상기 화학식에서,
점선, b 및 XH는 상기와 같이 사용된다.
보다 바람직하게는, 단계(C)의 Ax3은 -SH 또는 -말레이미드이고, 가장 바람직하게는 단계(C)의 Ax3은 -SH이다.
또 다른 바람직한 양태에서 Ax3은 화학식 (aI)이다:
Figure 112015045066876-pct00071
상기 화학식에서,
점선은 화학식 (VII)의 Z에 대한 결합을 나타내고;
PG0은 황-활성화 잔기이고;
S는 황이다.
바람직하게는, PG0은
Figure 112015045066876-pct00072
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 화학식에서,
점선은 화학식 (aI)의 황에 대한 결합을 나타내고;
Ar은 임의로 추가로 치환되는 방향족 잔기이고;
R01, R02, R03, R04는 서로 독립적으로 -H; C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 또는 C2-50 알키닐이고, 여기서 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 동일하거나 상이한 하나 이상의 R3으로 임의로 치환되고, 여기서 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 -Q-, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R4)-; -S(O)2N(R4)-; -S(O)N(R4)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R4)S(O)2N(R4a)-; -S-; -N(R4)-; -OC(O)R4; -N(R4)C(O)-; -N(R4)S(O)2-; -N(R4)S(O)-; -N(R4)C(O)O-; -N(R4)C(O)N(R4a)-; 및 -OC(O)N(R4R4a)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기에 의해 임의로 간섭되고;
Q는 페닐; 나프틸; 인데닐; 인다닐; 테트랄리닐; C3-10 사이클로알킬; 4 내지 7원 헤테로사이클릴; 및 8 내지 11원 헤테로비사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 T는 동일하거나 상이한 하나 이상의 R3으로 임의로 치환되고;
R3은 할로겐; -CN; 옥소(=O); -COOR5; -OR5; -C(O)R5; -C(O)N(R5R5a); -S(O)2N(R5R5a); -S(O)N(R5R5a); -S(O)2R5; -S(O)R5; -N(R5)S(O)2N(R5aR5b); -SR5; -N(R5R5a); -NO2; -OC(O)R5; -N(R5)C(O)R5a; -N(R5)S(O)2R5a; -N(R5)S(O)R5a; -N(R5)C(O)OR5a; -N(R5)C(O)N(R5aR5b); -OC(O)N(R5R5a); 또는 C1-6 알킬이고, 여기서 C1-6 알킬은 동일하거나 상이한 하나 이상의 할로겐으로 임의로 치환되고;
R4, R4a, R5, R5a, R5b는 독립적으로 -H; 또는 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 C1-6 알킬은 동일하거나 상이한 하나 이상의 할로겐으로 임의로 치환된다.
바람직하게는, R01, R03 및 R04는 서로 독립적으로 C1-6 알킬이다.
바람직하게는, R02는 H 및 C1-6 알킬로부터 선택된다.
바람직하게는, Ar은
Figure 112015045066876-pct00073
로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 Ar은 NO2, Cl 및 F로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환기(들)로 임의로 치환된다.
상기 화학식에서,
점선은 화학식 (aI)의 PG0의 나머지에 대한 결합을 나타내고;
W는 서로 독립적으로 O, S, 또는 N이고;
W는 N이다.
보다 바람직하게는, 화학식 (aI)의 PG0은
Figure 112015045066876-pct00074
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 화학식에서,
점선은 화학식 (aI)의 황에 대한 결합을 나타내고;
Ar, R01, R02, R03 및 R04는 상기와 같이 사용된다.
보다 바람직하게는, 화학식 (aI)의 PG0은
Figure 112015045066876-pct00075
이고, 여기서 점선은 화학식 (aI)의 황에 대한 결합을 나타낸다.
단계(C)의 Ax3은 임의로 보호된 형태로 존재할 수 있다.
단계(B)의 Ax2와 단계(C)의 Ax3의 바람직한 조합은 하기와 같다:
Figure 112015045066876-pct00076
Figure 112015045066876-pct00077
Figure 112015045066876-pct00078
상기 화학식에서,
X는 O, S, 또는 NH이고;
X0은 -OH, -NR1R1a, -SH, 또는 -SeH이고;
R1, R1a, R1b는 서로 독립적으로 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-8 사이클로알킬, 4 내지 7원 헤테로사이클릴, 8 내지 11원 헤테로비사이클릴, 페닐, 나프틸, 인데닐, 인다닐, 및 테트랄리닐로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Ar은 페닐, 나프틸, 인데닐, 인다닐, 또는 테트랄리닐이다.
또 다른 바람직한 양태에서 Ax2는 -SH이고 Ax3는 화학식 (aI)이고, 여기서 PG0은 화학식 (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) 또는 (viii)이다. 보다 바람직하게는, 화학식 (aI)의 PG0은 화학식 (i), (ii), (iii), (iv) 또는 (v)이고, 매우 보다 바람직하게는, 화학식 (aI)의 PG0은 화학식 (i)이다. 가장 바람직하게는, 화학식 (aI)의 PG0은 화학식
Figure 112015045066876-pct00079
이고, 여기서 점선은 화학식 (aI)의 황에 대한 결합을 나타낸다.
하나의 바람직한 양태에서, 단계(B)의 Ax2는 아민이고 단계(C)의 Ax3은 Y1-(C=O)-, Y1-(C=O)-NH-, 또는 Y1-(C=O)-O-이고, 가장 바람직하게는 단계(B)의 Ax2는 아민이고 단계(C)의 Ax3은 Y1-(C=O)-이다.
또 다른 바람직한 양태에서 단계(B)의 Ax2는 말레이미드이고 단계(C)의 Ax3은 -SH이다.
임의의 단계(B)가 생략된 하나의 양태에서, 단계(A)의 Ax0은 아민이고 단계(C)의 Ax3은 ClSO2-, R1(C=O)-, I-, Br-, Cl-, SCN-, CN-, O=C=N-, Y1-(C=O)-, Y1-(C=O)-NH-, 또는 Y1-(C=O)-O-이고, 여기서
R1은 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-8 사이클로알킬, 4 내지 7원 헤테로사이클릴, 8 내지 11원 헤테로비사이클릴, 페닐, 나프틸, 인데닐, 인다닐, 또는 테트랄리닐이고;
Y1은 화학식 (f-i) 내지 (f-vi)로부터 선택된다:
Figure 112015045066876-pct00080
상기 화학식에서,
점선은 분자의 나머지에 대한 결합을 나타내고,
b는 1, 2, 3 또는 4이고,
XH는 Cl, Br, I, 또는 F이다.
임의의 단계(B)가 생략된 또 다른 양태에서, 단계(A)의 Ax0은 하이드록실 기(-OH)이고 단계(C)의 Ax3은 O=C=N-, I-, Br-, SCN-, 또는 Y1-(C=O)-NH-이고,
여기서 Y1은 화학식 (f-i) 내지 (f-vi)로부터 선택된다:
Figure 112015045066876-pct00081
상기 화학식에서,
점선은 분자의 나머지에 대한 결합을 나타내고,
b는 1, 2, 3 또는 4이고,
XH는 Cl, Br, I, 또는 F이다.
임의의 단계(B)가 생략된 또 다른 양태에서, 단계(A)의 Ax0은 카르복실산(-(C=O)OH)이고 단계(C)의 Ax3은 1차 아민 또는 2차 아민이다.
임의의 단계(B)가 생략된 또 다른 양태에서, 단계(A)의 Ax0은 아민이고 단계(C)의 Ax3은 Y1-(C=O)-, Y1-(C=O)-NH-, 또는 Y1-(C=O)-O-이다.
임의의 단계(B)가 생략된 또 다른 양태에서, 단계(A)의 Ax0은 말레이미드이고 단계(C)의 Ax3은 티올이다.
임의의 단계(B)가 생략된 바람직한 양태에서, 단계(A)의 Ax0은 아민이고 단계(C)의 Ax3은 Y1-(C=O)-이다.
임의의 단계(B)가 생략된 또 다른 바람직한 양태에서, Ax0는 -SH이고 Ax3은 화학식 (aI)이고, 여기서 PG0는 화학식 (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) 또는 (viii)이다. 보다 바람직하게는, 화학식 (aI)의 PG0은 화학식 (i), (ii), (iii), (iv) 또는 (v)이고, 매우 보다 바람직하게는, 화학식 (aI)의 PG0는 화학식 (i)이다. 가장 바람직하게는, 화학식 (aI)의 PG0는 화학식
Figure 112015045066876-pct00082
이고, 여기서 점선은 화학식 (aI)의 황에 대한 결합을 나타낸다.
단계(C)로부터 수득된 하이드로겔은 화학식 (IXa) 또는 (IXb)의 구조를 갖는다:
Figure 112015045066876-pct00083
상기 화학식에서,
점선은 단계(A)의 하이드로겔에 대한 결합을 나타내고;
Ay0은 Ax0과 Ax3 사이에 형성된 연결기이고;
Ay1은 화학식 (VIII)에서와 같이 사용되고;
Ay2는 Ax2와 Ax3 사이에 형성된 연결기이고;
SP2는 화학식 (VI)에서와 같이 사용되고;
Z는 화학식 (VII)에서와 같이 사용된다.
바람직하게는, 단계(A)의 Ay0 및 화학식 (IXb)의 Ay2는 아미드, 카르바메이트,
Figure 112015045066876-pct00084
로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 별표로 표시된 점선은 각각 하이드로겔 또는 SP2에 대한 결합을 나타내고; 표시되지 않은 점선은 화학식 (VII)의 Z에 대한 결합을 나타낸다.
하나의 양태에서, 단계(C)의 Z는 C1-50 알킬, C2-50 알케닐, C2-50 알키닐, C3-10 사이클로알킬, 4 내지 7원 헤테로사이클릴, 8 내지 11원 헤테로비사이클릴, 페닐; 나프틸; 인데닐; 인다닐; 및 테트랄리닐로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 C1-50 알킬, C2-50 알케닐, C2-50 알키닐, C3-10 사이클로알킬, 4 내지 7원 헤테로사이클릴, 8 내지 11원 헤테로비사이클릴, 페닐; 나프틸; 인데닐; 인다닐; 및 테트랄리닐은 동일하거나 상이한 하나 이상의 R10으로 임의로 치환되고, 여기서 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 T, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R9)-; -S(O)2N(R9)-; -S(O)N(R9)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R9)S(O)2N(R9a)-; -S-; -N(R9)-; -OC(O)R9; -N(R9)C(O)-; -N(R9)S(O)2-; -N(R9)S(O)-; -N(R9)C(O)O-; -N(R9)C(O)N(R9a)-; 및 -OC(O)N(R9R9a)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기(들)에 의해 임의로 간섭되고; 여기서
R9, R9a는 독립적으로 H; T; C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 T; C1-50 알킬; C2-50 알케닐 및 C2-50 알키닐은 동일하거나 상이한 하나 이상의 R10으로 임의로 치환되고, 상기 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 T, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; -S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; -N(R11)-; -OC(O)R11; -N(R11)C(O)-; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; -N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; 및 -OC(O)N(R11R11a)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기(들)에 의해 임의로 간섭되고;
T는 페닐; 나프틸; 인데닐; 인다닐; 테트랄리닐; C3-10 사이클로알킬; 4 내지 7원 헤테로사이클릴; 및 8 내지 11원 헤테로비사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 T는 동일하거나 상이한 하나 이상의 R10으로 임의로 치환되고;
R10은 할로겐; CN; 옥소(=O); COOR12; OR12; C(O)R12; C(O)N(R12R12a); S(O)2N(R12R12a); S(O)N(R12R12a); S(O)2R12; S(O)R12; N(R12)S(O)2N(R12aR12b); SR12; N(R12R12a); NO2; OC(O)R12; N(R12)C(O)R12a; N(R12)S(O)2R12a; N(R12)S(O)R12a, N(R12)C(O)OR12a; N(R12)C(O)N(R12aR12b); OC(O)N(R12R12a); 또는 C1-6 알킬이고, 상기 C1-6 알킬은 동일하거나 상이한 하나 이상의 할로겐으로 임의로 치환되고;
R11, R11a, R12, R12a, R12b는 서로 독립적으로 H; 및 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 C1-6 알킬은 동일하거나 상이한 하나 이상의 할로겐으로 임의로 치환된다.
또 다른 양태에서 단계(C)의 Z는 0.5 kDa 내지 1000 kDa 범위의 분자량, 바람직하게는 0.5 내지 500 kDa 범위의 분자량, 보다 바람직하게는 0.75 내지 250 kDa 범위의 분자량, 매우 보다 바람직하게는 1 내지 100 kDa 범위, 매우 보다 바람직하게는 5 내지 60 kDa 범위, 매우 보다 바람직하게는 10 내지 50 범위의 분자량을 갖는 불활성 중합체이고, 가장 바람직하게는 Z는 40 kDa의 분자량을 갖는다.
바람직하게는, 단계(C)의 Z는 2-메타크릴로일-옥시에틸 포스포일 콜린, 폴리(아크릴산), 폴리(아크릴레이트), 폴리(아크릴아미드), 폴리(알킬옥시) 중합체, 폴리(아미드), 폴리(아미도아민), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(아스파르트아미드), 폴리(부티르산), 폴리(글리콜산), 폴리부틸렌 테레프탈레이트, 폴리(카프롤락톤), 폴리(카르보네이트), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(디메틸아크릴아미드), 폴리(에스테르), 폴리(에틸렌), 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸 포스페이트), 폴리(에틸옥사졸린), 폴리(글리콜산), 폴리(하이드록시에틸 아크릴레이트), 폴리(하이드록시에틸-옥사졸린), 폴리(하이드록시메타크릴레이트), 폴리(하이드록시프로필메타크릴아미드), 폴리(하이드록시프로필 메타크릴레이트), 폴리(하이드록시프로필옥사졸린), 폴리(이미노카르보네이트), 폴리(락트산), 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리(메타크릴아미드), 폴리(메타크릴레이트), 폴리(메틸옥사졸린), 폴리(오가노포스파젠), 폴리(오르토 에스테르), 폴리(옥사졸린), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리(실록산), 폴리(우레탄), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐 아민), 폴리(비닐메틸에테르), 폴리(비닐피롤리돈), 실리콘, 셀룰로스, 카르보메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 키틴, 키토산, 덱스트란, 덱스트린, 겔라틴, 히알루론산 및 유도체, 작용화된 히알루론산, 만난, 펙틴, 람노갈락투로난, 전분, 하이드록시알킬 전분, 하이드록시에틸 전분 및 기타 탄수화물계 중합체, 크실란, 및 이의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 불활성 중합체이다.
바람직한 양태에서 단계(C)의 Z는 70% 이상의 PEG를 포함하는 불활성 선형 또는 분지형 PEG계 중합체 또는 70% 이상의 히알루론산를 포함하는 히알루론산계 중합체이다. 보다 바람직하게는, 단계(C)의 Z는 70% 이상의 PEG, 매우 보다 바람직하게는 80% 이상의 PEG, 가장 바람직하게는 90% 이상의 PEG를 포함하는 불활성 선형 또는 분지형 PEG계 중합체이다.
또 다른 바람직한 양태에서 단계(C)의 Z는 양쪽이온성 중합체이다. 바람직하게는, 이러한 양쪽이온성 중합체는 폴리(아미노산) 및/또는 폴리(아크릴레이트)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "양쪽이온" 및 "양쪽이온성"은 분자 또는 잔기 내에 양전하 및 음전하를 동시에 갖고 있는 중성 분자 또는 잔기를 의미한다.
문헌 [Zhang et al., Nature Biotechnology, 2013, volume 31, number 6, pages 553-557]에 따르면 양쪽이온성 중합체로 만들어진 하이드로겔은 이물질 반응에 내성을 갖는다.
단계(C)는 Ax0 또는 Ax2의 99 mol-% 이하가 Ax3과 반응하는 방식으로 단계(A) 또는 단계(B)의 하이드로겔을 화학식 (VII)의 시약과 반응시키는 것을 포함한다. 이는, 예를 들면, Ax0 또는 Ax2에 대하여 0.99 이하의 화학 당량의 화학식 (VII)의 시약을 단계(A) 또는 (B)의 하이드로겔과 반응시킴으로써 달성될 수 있다.
0.99 이상의 화학 당량의 반응을 방지하기 위하여, 화학식 (VII)의 시약은 Ax0 또는 Ax2에 대하여 0.99 이하의 화학 당량의 양으로 사용될 수 있거나, 대안적으로, 반응 속도를 모니터링하고 Ax0 또는 Ax2에 대하여 0.99 이하의 화학 당량이 반응했을 때, 특히 0.99 이상의 화학 당량이 사용되는 때, 반응을 간섭한다. 또한 입체 장애, 소수성 또는 불활성 잔기 Z의 기타 특성들과 같은 물리적 제약으로 인하여, 0.99 이하의 화학 당량이 Ax0 또는 Ax2와 반응할 수 있고, 심지어 더 많은 화학 당량이 반응에 가해질 수 있는 것으로 이해된다.
바람직하게는, 단계(C)는 Ax0 또는 Ax2의 80 mol-% 이하가 Ax3과 반응하는 방식, 매우 보다 바람직하게는, Ax0 또는 Ax2의 60 mol-% 이하가 Ax3과 반응하는 방식, 매우 보다 바람직하게는, Ax0 또는 Ax2의 40 mol-% 이하가 Ax3과 반응하는 방식, 매우 보다 바람직하게는, Ax0 또는 Ax2의 20 mol-% 이하가 Ax3과 반응하는 방식, 가장 바람직하게는, Ax0 또는 Ax2의 15 mol-% 이하가 Ax3과 반응하는 방식으로 단계(A) 또는 단계(B)의 하이드로겔을 화학식 (VII)의 시약과 반응시키는 것을 포함한다.
이는, 예를 들면, Ax0 또는 Ax2에 대하여 0.8, 0.6, 0.4, 0.2 또는 0.15 이하의 화학 당량의 화학식 (VII)의 시약을 각각 단계(A) 또는 (B)의 하이드로겔과 반응시킴으로써 달성될 수 있다.
더 많은 화학 당량의 반응을 방지하는 방법은 상기 기재된다.
단계(A) 및 단계(C) 후의 Ax0의 성분량 측정을 기반으로 하여, 반응된 Ax0의 성분량을 수학식 1에 따라 계산할 수 있다:
(1) 반응된 Ax0의 성분량(mmol/g) = (Ax0 1 - Ax0 2)/(Ax0 2 × MWZ + 1)
상기 수학식에서,
Ax0 1은 단계(A)의 하이드로겔의 작용기 Ax0의 성분량(mmol/g)이고;
Ax0 2는 단계(C) 후의 하이드로겔의 작용기 Ax0의 성분량(mmol/g)이고;
MWZ는 Z의 분자량(g/mmol)이다.
임의의 스페이서 시약이 단계(A)의 하이드로겔에 공유적으로 컨쥬게이션된 경우, 반응된 Ax2의 수 계산은 이에 따라 수행된다.
단계(A)의 하이드로겔의 작용기 Ax0에 대한 반응된 작용기 Ax0의 백분율은 수학식 2에 따라 계산한다:
(2) 반응된 Ax0의 mol-% = 100 × [(Ax0 1 - Ax0 2)/(Ax0 2 × MWZ + 1)]/Ax0 1
상기 수학식에서, 변수는 상기와 같이 사용된다.
하나의 양태에서 단계(C)의 Z는 하이드로겔의 표면에 컨쥬게이션된다. 이는 하이드로겔의 기공 또는 네트워크로 들어가기에는 너무 크도록 시약 Ax3-Z의 크기 및 구조를 선택함으로써 달성될 수 있다. 따라서, Ax3-Z의 최소 크기는 하이드로겔의 성질에 따라 좌우된다. 그러나 당해 분야의 숙련가는 표준 실험을 사용하여, 예를 들면, 정지상으로서 하이드로겔을 갖는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여, 시약 Ax3-Z가 하이드로겔 내로 들어갈 수 있는지 여부를 시험하는 방법을 알고 있다.
VEGF 중화 프로드럭 중에 포함된 프로드럭 링커 잔기는 당해 분야에 공지된 임의의 프로드럭 링커 잔기의 구조를 갖을 수 있다.
바람직한 프로드럭 링커는 제WO 2005/099768 A2호에 공지되어 있고 이에 기재된 바와 같이 수득될 수 있다. 따라서, 바람직한 가역적 프로드럭 링커-VEGF 중화 생물학적 활성 잔기는 화학식 (A) 또는 (B)의 구조를 갖는다:
Figure 112015045066876-pct00085
상기 화학식에서,
점선은 프로드럭의 나머지, 즉 담체 잔기 또는 임의의 스페이서 잔기에 대한 결합을 나타내고;
D는 해당 VEGF 중화 약물의 아민 기를 통해 잔기의 나머지에 연결되는 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기이고;
X는 R5-Y6와 같은 스페이서 잔기이고;
Y1, Y2는 독립적으로 O, S 또는 NR6이고;
Y3, Y5는 독립적으로 O 또는 S이고;
Y4는 O, NR6 또는 C(R7)(R8)-이고;
Y6은 O, S, NR6, 숙신이미드, 말레이미드, 불포화 탄소-탄소 결합, 또는 자유 전자쌍을 함유하는 임의의 헤테로원자이거나 존재하지 않고;
R2, R3은 서로 독립적으로 하이드로겔, 치환 또는 비치환 선형, 분지형 또는 환형 알킬 또는 헤테로알킬, 아릴, 치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 시아노, 니트로, 할로겐, 카르복시, 카르복실알킬, 알킬카르보닐 또는 카르복스아미도알킬로부터 선택되고;
R4는 수소, 치환 또는 비치환 선형, 분지형 또는 환형 알킬 또는 헤테로알킬, 아릴, 치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 선형, 분지형 또는 환형 알콕시, 치환 또는 비치환 선형, 분지형 또는 환형 헤테로알킬옥시, 아릴옥시 또는 헤테로아릴옥시, 시아노, 할로겐로부터 선택되고;
R5는 치환 또는 비치환 선형, 분지형 또는 환형 알킬 또는 헤테로알킬, 아릴, 치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴로부터 선택되고;
R6은 하이드로겔, 치환 또는 비치환 선형, 분지형 또는 환형 알킬 또는 헤테로알킬, 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴로부터 선택되고;
R7, R8은 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 선형, 분지형 또는 환형 알킬 또는 헤테로알킬, 아릴, 치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 카르복시알킬, 알킬카르보닐, 카르복스아미도알킬, 시아노 또는 할로겐으로부터 선택되고;
W는 치환 또는 비치환 선형, 분지형 또는 환형 알킬, 아릴, 치환 아릴, 치환 또는 비치환 선형, 분지형 또는 환형 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로아릴로부터 선택되고;
Nu는 친핵체이고;
n은 0 또는 양의 정수이고;
Ar은 다치환 방향족 탄화수소 또는 다치환 방향족 헤테로사이클이다.
바람직하게는, 화학식 (A) 및 (B)의 R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 독립적으로 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐 및 C2-6 알키닐로부터 선택된다.
바람직하게는, 화학식 (A) 및 (B)의 Y6은 C1-20 알킬, C2-20 알케닐 또는 C2-20 알키닐이다.
바람직하게는, 화학식 (A) 및 (B)의 Nu는 1차, 2차 및 3차 아미노 기, 티올, 카르복실산, 하이드록실아민, 하이드라진 및 질소 함유 헤테로아릴로 이루어진 친핵체 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 화학식 (A) 및 (B)의 W는 -(CR9R10)b-이고, 여기서 R9 및 R10은 독립적으로 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐 및 C2-6 알키닐로부터 선택되고, 여기서 b는 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
바람직하게는, 화학식 (A) 및 (B)의 n은 0, 1 또는 2이고, 보다 바람직하게는, n은 0 또는 1이고, 가장 바람직하게는 n은 0이다.
바람직하게는, 화학식 (A) 및 (B)의 Ar은
Figure 112015045066876-pct00086
Figure 112015045066876-pct00087
로부터 선택된다.
기타 바람직한 프로드럭 링커는 제WO 2006/136586 A2호에 공지되고 이에 기재된 바와 같이 수득할 수 있다. 따라서, 바람직한 가역적 프로드럭 링커-VEGF 중화 생물학적 활성 잔기는 화학식 (C), (D) 또는 (E)의 구조를 갖는다:
Figure 112015045066876-pct00088
Figure 112015045066876-pct00089
상기 화학식에서,
점선은 프로드럭의 나머지, 즉 담체 잔기 또는 임의의 스페이서 잔기에 대한 결합을 나타내고;
D는 해당 VEGF 중화 약물의 아민 기를 통해 분자의 나머지에 연결되어 아미드 연결기를 형성하는 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기이고;
X는 R13-Y1과 같은 스페이서 잔기이고;
Y1은 O, S, NR6, 숙신이미드, 말레이미드, 불포화 탄소-탄소 결합, 또는 자유 전자쌍을 함유한 임의의 헤테로원자이거나 존재하지 않고;
R13은 치환 또는 비치환 선형, 분지형 또는 환형 알킬 또는 헤테로알킬, 아릴, 치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴로부터 선택되고;
R2 및 R3은 독립적으로 수소, 아실 기, 또는 하이드록실 기를 위한 보호기로부터 선택되고;
R4 내지 R12는 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 선형, 분지형 또는 환형 알킬 또는 헤테로알킬, 아릴, 치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 시아노, 니트로, 할로겐, 카르복시, 카르복스아미드로부터 선택된다.
바람직하게는, 화학식 (C), (D) 및 (E)의 R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 및 R12는 독립적으로 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐 및 C2-6 알키닐로부터 선택된다.
바람직하게는, 화학식 (C), (D) 및 (E)에서 Y1은 C1-20 알킬, C2-20 알케닐 또는 C2-20 알키닐이다.
또 다른 바람직한 프로드럭 링커는 제WO 2009/095479 A2호에 공지되고 이에 기재된 바와 같이 수득할 수 있다. 따라서, 바람직한 가역적 프로드럭 링커-VEGF 중화 생물학적 활성 잔기는 화학식 (F)의 구조를 갖는다:
Figure 112015045066876-pct00090
상기 화학식에서,
점선은 프로드럭의 나머지, 즉 담체 잔기 또는 임의의 스페이서 잔기에 대한 결합을 나타내고;
D는 해당 VEGF 중화 약물의 방향족 아민을 통해 분자의 나머지에 연결되어 아미드 연결기를 형성하는 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기이고;
X는 C(R4R4a); N(R4); O; C(R4R4a)-C(R5R5a); C(R5R5a)-C(R4R4a); C(R4R4a)-N(R6); N(R6)-C(R4R4a); C(R4R4a)-O; 또는 O-C(R4R4a)이고;
X1은 C; 또는 S(O)이고;
X2는 C(R7, R7a); 또는 C(R7, R7a)-C(R8, R8a)이고;
R1, R1a, R2, R2a, R3, R3a, R4, R4a, R5, R5a, R6, R7, R7a, R8, R8a는 독립적으로 H; 및 C1-4 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
임의로, 하나 이상의 쌍(들) R1a/R4a, R1a/R5a, R4a/R5a, R4a/R5a, R7a/R8a는 화학적 결합을 형성하고;
임의로, 하나 이상의 쌍(들) R1/R1a, R2/R2a, R4/R4a, R5/R5a, R7/R7a, R8/R8a는 이들이 결합되는 원자와 함께 결합하여 C3-7 사이클로알킬; 또는 4 내지 7원 헤테로사이클릴을 형성하고;
임의로, 하나 이상의 쌍(들) R1/R4, R1/R5, R1/R6, R4/R5, R7/R8, R2/R3은 이들이 결합되는 원자와 함께 결합하여 고리 A를 형성하고;
임의로, R3/R3a는 이들이 결합되는 질소 원자와 함께 결합하여 4 내지 7원 헤테로사이클을 형성하고;
A는 페닐; 나프틸; 인데닐; 인다닐; 테트랄리닐; C3-10 사이클로알킬; 4 내지 7원 헤테로사이클릴; 및 8 내지 11원 헤테로비사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
단, R1, R1a, R2, R2a, R3, R3a, R4, R4a, R5, R5a, R6, R7, R7a, R8, R8a의 하나의 수소는 화학식 (F)의 잔기를 VEGF 중화 프로드럭의 나머지, 즉 담체 잔기 또는 임의의 스페이서 잔기에 연결시키는 결합으로 치환된다.
임의로, 화학식 (F)의 가역적 프로드럭 링커 잔기는 추가로 치환되고,
단, 잔기
Figure 112015045066876-pct00091
의 질소의 수소는 치환되지 않고, R3 및 R3a는 서로 독립적으로 H이거나 SP3-혼성화 탄소 원자를 통해 N에 결합된다.
또 다른 바람직한 프로드럭 링커는 제WO 2011/012721 A1호 및 제WO 2011/012722 A1호에 공지되고 이에 기재된 바와 같이 수득할 수 있다. 따라서, 바람직한 가역적 프로드럭 링커-VEGF 중화 생물학적 활성 잔기는 화학식 (G)의 구조를 갖는다:
Figure 112015045066876-pct00092
상기 화학식에서,
점선은 프로드럭의 나머지, 즉 담체 잔기 또는 임의의 스페이서 잔기에 대한 결합을 나타내고;
D는 해당 VEGF 중화 약물의 방향족 아민을 통해 분자의 나머지에 연결되어 아미드 연결기를 형성하는 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기이고;
X1은 C(R1R1a)이거나, C3-7 사이클로알킬, 4 내지 7원 헤테로사이클릴, 페닐, 나프틸, 인데닐, 인다닐, 테트랄리닐, 또는 8 내지 11원 헤테로비사이클릴로부터 선택되는 환형 단편이고, 여기서 X1이 환형 단편인 경우, 상기 환형 단편은 2개의 인접한 고리 원자를 통해 L1 내로 포함되고 아미드 결합의 탄소 원자에 인접한 X1의 고리 원자는 또한 탄소 원자이고;
X2는 화학적 결합이거나 C(R3R3a), N(R3), O, C(R3R3a)-C(R4R4a), C(R3R3a)-N(R4), N(R3)-C(R4R4a), C(R3R3a)-O, 또는 O-C(R3R3a)로부터 선택되고,여기서 X1이 환형 단편인 경우, X2는 화학적 결합, C(R3R3a), N(R3) 또는 O이고;
임의로, X1이 환형 단편이고 X2가 C(R3R3a)인 경우, L1 내의 X1 단편 및 X2 단편의 순서는 바뀔 수 있고 환형 단편은 2개의 인접 고리 원자를 통해 L1 내로 포함되고;
R1, R3 및 R4는 독립적으로 H, C1-4 알킬 및 -N(R5R5a)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R1a, R2, R3a, R4a 및 R5a는 독립적으로 H, 및 C1-4 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R5는 C(O)R6이고;
R6은 C1-4 알킬이고;
임의로, 하나 이상의 쌍들 R1a/R4a, R3a/R4a 또는 R1a/R3a는 화학적 결합을 형성하고;
단, R1, R1a, R2, R2a, R3, R3a, R4, R4a, R5, R5a 또는 R6의 하나의 수소는 화학식 (G)의 잔기를 VEGF 중화 프로드럭의 나머지, 즉 담체 잔기 또는 임의의 스페이서 잔기에 연결시키는 결합으로 치환된다.
또 다른 바람직한 프로드럭 링커는 제WO 2011/089214 A1호에 공지되고 이에 기재된 바와 같이 수득할 수 있다. 따라서, 바람직한 가역적 프로드럭 링커-VEGF 중화 생물학적 활성 잔기는 화학식 (H)의 구조를 갖는다:
Figure 112015045066876-pct00093
상기 화학식에서,
점선은 프로드럭의 나머지, 즉 담체 잔기 또는 임의의 스페이서 잔기에 대한 결합을 나타내고;
D는 카르바메이트 연결기를 형성함으로써 해당 VEGF 중화 약물의 방향족 하이드록실(-OH)을 통해 분자의 나머지에 연결되는 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기이고;
R1은 C1-4 알킬; 헤테로알킬; C3-7 사이클로알킬; 및
Figure 112015045066876-pct00094
로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2, R2a, R3 및 R3a는 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 선형, 분지형 또는 환형 C1-4 알킬 또는 헤테로알킬로부터 선택되고;
각각의 d는 독립적으로 2, 3 또는 4이고;
단, R1, R2, R2a, R3, 또는 R3a의 하나의 수소는 화학식 (H)의 잔기를 VEGF 중화 프로드럭의 나머지, 즉 담체 잔기 또는 임의의 스페이서 잔기에 연결시키는 결합으로 치환된다.
또 다른 바람직한 프로드럭 링커는 제WO 2011/089216 A1호에 공지되고 이에 기재된 바와 같이 수득할 수 있다. 따라서, 바람직한 가역적 프로드럭 링커-VEGF 중화 생물학적 활성 잔기는 화학식 (J)의 구조를 갖는다:
Figure 112015045066876-pct00095
상기 화학식에서,
점선은 프로드럭의 나머지, 즉, 담체 잔기 또는 임의의 스페이서 잔기에 대한 결합을 나타내고;
D는 아미드 연결기를 형성함으로써 해당 약물의 지방족 아민을 통해 분자의 나머지에 연결되는 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기이고;
X1은 O, S 또는 CH-R1a로부터 선택되고;
R1 및 R1a는 독립적으로 H, OH, CH3로부터 선택되고;
R2, R2a, R4 및 R4a는 독립적으로 H 및 C1-4 알킬로부터 선택되고,
R3 및 R3a는 독립적으로 H, C1-4 알킬, 및 R5로부터 선택되고;
R5는
Figure 112015045066876-pct00096
로부터 선택되고, 여기서 점선은 잔기의 나머지에 대한 결합을 나타내고;
단, R1, R1a, R2, R2a, R3, R3a, R4, R4a 및 R5의 하나의 수소는 화학식 (J)의 잔기를 VEGF 중화 프로드럭의 나머지, 즉 담체 잔기 또는 임의의 스페이서 잔기에 연결시키는 결합으로 치환된다.
바람직하게는, 화학식 (J)의 R3은 H이고 화학식 J의 R3a는 R5이다.
바람직하게는, 화학식 (J)의 하나의 R4/R4a는 H이다.
임의로, 화학식 (J)의 하나 이상의 쌍(들) R3/R3a, R4/R4a, R3/R4는 독립적으로 C3-7 사이클로알킬, 4 내지 7원 헤테로사이클릴, 또는 8 내지 11원 헤테로비사이클릴로부터 선택되는 하나 이상의 환형 단편(들)을 형성할 수 있다.
임의로, 화학식 (J)의 R3, R3a, R4 및 R4a는 추가로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 페닐, 4 내지 7원 헤테로사이클 또는 할로겐으로 치환된다.
또 다른 바람직한 프로드럭 링커는 제WO 2011/089215 A1호에 공지되고 이에 기재된 바와 같이 수득할 수 있다. 따라서, 바람직한 가역적 프로드럭 링커-VEGF 중화 생물학적 활성 잔기는 화학식 (K)의 구조를 갖는다:
Figure 112015045066876-pct00097
상기 화학식에서,
점선은 프로드럭의 나머지, 즉, 담체 잔기 또는 임의의 스페이서 잔기에 대한 결합을 나타내고;
D는 아미드 연결기를 형성함으로써 해당 VEGF 중화 약물의 방향족 아민을 통해 분자의 나머지에 연결되는 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기이고;
R1, R1a, R2, R3, R3a, R4 및 R4a는 독립적으로 H 및 C1-4 알킬로부터 선택되고;
임의로, 임의의 2개의 R1, R1a, R2, R3, R3a, R4 및 R4a는 독립적으로 C3-7 사이클로알킬, 4 내지 7원 헤테로사이클릴, 페닐, 나프틸, 인데닐, 인다닐, 테트랄리닐, 또는 8 내지 11원 헤테로비사이클릴로부터 선택되는 하나 이상의 환형 단편(들)을 형성할 수 있고;
임의로, R1, R1a, R2, R3, R3a, R4 및 R4a는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 사이클로알킬, 4 내지 7원 헤테로사이클릴, 페닐, 나프틸, 인데닐, 인다닐, 테트랄리닐, 또는 8 내지 11원 헤테로비사이클릴을 포함하는 군으로부터 선택되는 치환기로 추가로 치환되고;
단, R1, R1a, R2, R3, R3a, R4 및 R4a의 하나의 수소는 화학식 (J)의 잔기를 VEGF 중화 프로드럭의 나머지, 즉, 담체 잔기 또는 임의의 스페이서 잔기에 연결시키는 결합으로 치환된다.
또 다른 바람직한 프로드럭 링커는 제PCT/EP2012/065748호에 공지되고 이에 기재된 바와 같이 수득할 수 있다. 따라서, 바람직한 가역적 프로드럭 링커-VEGF 중화 생물학적 활성 잔기는 화학식 (L)의 구조를 갖는다:
Figure 112015045066876-pct00098
상기 화학식에서,
점선은 프로드럭의 나머지, 즉, 담체 잔기 또는 임의의 스페이서 잔기에 대한 결합을 나타내고;
D는 카르복실릭 에스테르 연결기를 형성함으로써 해당 VEGF 중화 약물의 카르복실산 기(-(C=O)-OH)를 통해 분자의 나머지에 연결되는 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기이고;
R1은 비치환 알킬; 치환 알킬; 비치환 페닐; 치환 페닐; 비치환 나프틸; 치환 나프틸; 비치환 인데닐; 치환 인데닐; 비치환 인다닐; 치환 인다닐; 비치환 테트랄리닐; 치환 테트랄리닐; 비치환 C3-10 사이클로알킬; 치환 C3-10 사이클로알킬; 비치환 4 내지 7원 헤테로사이클릴; 치환 4 내지 7원 헤테로사이클릴; 비치환 8 내지 11원 헤테로비사이클릴; 및 치환 8 내지 11원 헤테로비사이클릴 군으로부터 선택되고;
R2는 H, 비치환 알킬, 및 치환 알킬로부터 선택되고;
R3 및 R4는 독립적으로 H, 비치환 알킬, 및 치환 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
e는 0 또는 1이고;
임의로, R1 및 R3은 이들이 결합되는 원자와 결합하여 함께 고리 A를 형성하고;
A는 C3-10 사이클로알킬; 4 내지 7원 지방족 헤테로사이클릴; 및 8 내지 11원 지방족 헤테로비사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 A는 비치환되거나 치환되고;
Q는 C1-50 알킬, C2-50 알케닐 또는 C2-50 알키닐을 포함하는 군으로부터 선택되고, 상기 단편은 임의로 -NH-, -N(C1-4 알킬)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)NH-, -C(O)N(C1-4 알킬)-, -O-C(O)-, -S(O)-, -S(O)2-, 4 내지 7원 헤테로사이클릴, 페닐 또는 나프틸로부터 선택되는 하나 이상의 기(들)에 의해 간섭된다.
또 다른 바람직한 프로드럭 링커는 제EP 12165516호에 공지되고 이에 기재된 바와 같이 수득할 수 있다. 따라서, 바람직한 가역적 프로드럭 링커-VEGF 중화 생물학적 활성 잔기는 화학식 (M)의 구조를 갖는다:
Figure 112015045066876-pct00099
상기 화학식에서,
점선은 프로드럭의 나머지, 즉, 담체 잔기 또는 임의의 스페이서 잔기에 대한 결합을 나타내고;
D는 에스테르 또는 카르바메이트 연결기를 형성함으로써 해당 VEGF 중화 약물의 하이드록실 기를 통해 분자의 나머지에 연결되는 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기이고;
Y는 -C(R1)(R1a)-; 또는 -N(R1)-이고;
X는 -C(R4)(R4a)-; -N(R4)-; -O-; -C(R4)(R4a)-C(R5)(R5a)-; -C(R4)(R4a)-N(R6)-; -N(R6)-C(R4)(R4a)-; -C(R4)(R4a)-O-; -O-C(R4)(R4a)-; -C(O)-N(R6)-; 또는 -N(R6)-C(O)-이고;
X1은
Figure 112015045066876-pct00100
또는
Figure 112015045066876-pct00101
이고;
X2는 -C(R7)(R7a)-; 또는 -C(R7)(R7a)-C(R8)(R8a)-이고;
X3은 =O; =S; 또는 =N-CN이고;
R1, R1a, R2, R2a, R3, R3a, R4, R4a, R5, R5a, R6, R7, R7a, R8, R8a는 독립적으로 H; C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-20 헤테로알킬 및 Y1-T로 이루어진 군으로부터 선택되고; 독립적으로, 하나 이상의 쌍(들) R1a/R4a, R1a/R5a, R4a/R5a, R7a/R8a는 존재하지 않고, 이들이 결합된 해당 탄소 원자는 시스 이중 결합을 형성하고;
Y1은 화학적 결합 또는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐이고;
T는 페닐; 나프틸; 인데닐; 인다닐; 테트랄리닐; C3-10 사이클로알킬; 4 내지 7원 헤테로사이클릴; 또는 8 내지 11원 헤테로비사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, T는 동일하거나 상이한 하나 이상의 R9로 임의로 치환되고;
R9는 할로겐; -CN; 옥소(=O); -C(O)OH; -OH; -S(O)2NH2; -S(O)NH2; -S(O)2OH; -S(O)OH; -SH; -NH2; -NO2; C1-6 알킬, 또는 C1-10 헤테로알킬이고;
임의로, 하나 이상의 쌍들 R1/R1a, R1/R4, R1/R6, R1/R5, R2/R2a, R2/R3, R4/R4a, R4/R5, R5/R5a, R7/R7a, R7/R8, R8/R8a는 이들이 결합되는 원자와 함께 결합하여 고리 T를 형성하고;
임의로, R3/R3a는 이들이 결합되는 질소 원자와 함께 결합하여 4 내지 7원 헤테로사이클을 형성하고;
단, R1, R1a, R2, R2a, R3, R3a, R4, R4a, R5, R5a, R6, R7, R7a, R8 또는 R8a의 하나의 수소는 화학식 (M)의 잔기를 VEGF 중화 프로드럭의 나머지, 즉, 담체 잔기 또는 임의의 스페이서 잔기에 연결시키는 결합으로 치환된다.
보다 바람직하게는, VEGF 중화 프로드럭은 화학식 (F)의 가역적 프로드럭 링커 잔기-VEGF 중화 생물학적 활성 잔기를 포함한다.
매우 보다 바람직하게는, VEGF 중화 프로드럭은 화학식 (F)의 가역적 프로드럭 링커 잔기-VEGF 중화 생물학적 활성 잔기를 포함하고, 프로드럭의 나머지, 즉 담체 또는 담체에 연결된 임의의 스페이서에 대한 결합은 X의 R4 또는 화학식 (F)의 R3, 가장 바람직하게는 화학식 (F)의 R4를 통해 발생한다.
매우 보다 바람직하게는, VEGF 중화 프로드럭은 화학식 (F-i)의 잔기를 포함한다:
Figure 112015045066876-pct00102
상기 화학식에서,
점선은 담체 또는 임의의 스페이서 잔기에 대한 결합을 나타내고;
R1, R1a, R2, R2a, R3, R3a, X1, X2 및 D는 화학식 (F)에서와 같이 사용되고;
임의로, 화학식 (F-i)의 잔기는 추가로 치환되고, 단, 화학식 (F-i)에서 별표로 표시된 수소는 치환기에 의해 치환되지 않고, R3 및 R3a는 서로 독립적으로 H이거나 SP3-혼성화 탄소 원자를 통해 N에 결합된다.
바람직하게는, 화학식 (F-i)의 X1은 C이다.
하나의 양태에서, 화학식 (F-i)의 X2는 C(R7R7a)이다.
또 다른 양태에서 화학식 (F-i)의 X2는 C(R7R7a)-C(R8R8a)이다.
바람직하게는, 화학식 (F-i)의 R1은 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-i)의 R1a는 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-i)의 R1 및 R1a는 둘 다 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-i)의 R2는 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-i)의 R2a는 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-i)의 R2 및 R2a는 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-i)의 R3은 H 또는 메틸, 에틸 또는 프로필이다.
바람직하게는, 화학식 (F-i)의 R3a는 H 또는 메틸, 에틸 또는 프로필이다.
하나의 바람직한 양태에서 화학식 (F-i)의 R3 및 R3a는 둘 다 H이다.
또 다른 바람직한 양태에서 화학식 F(-i)의 R3은 H이고, 화학식 (F-i)의 R3a는 메틸이다.
또 다른 바람직한 양태에서 화학식 (F-i)의 R3 및 R3a는 둘 다 메틸이다.
바람직하게는, 화학식 (F-i)의 D는 라니비주맙이다.
바람직하게는, 화학식 (F-i)의 담체는 하이드로겔, 보다 바람직하게는 PEG계 하이드로겔이다.
바람직한 양태에서 VEGF 중화 프로드럭은 화학식 (f-ii)의 잔기를 포함한다:
Figure 112015045066876-pct00103
상기 화학식에서,
점선은 담체에 대한 결합을 나타내고;
R1, R1a, R2, R2a, R3, R3a, X2 및 D는 화학식 (F)에서 정의된 바와 같이 사용되고;
R10은 H 및 C1-6 알킬로부터 선택되고;
SP0은 스페이서 잔기이고;
여기서 화학식 (F-ii)의 잔기는 임의로 추가로 치환되고, 단, 화학식 (F-ii)에서 별표로 표시된 수소는 치환기에 의해 치환되지 않고, R3 및 R3a는 서로 독립적으로 H이거나 SP3-혼성화 탄소 원자를 통해 N에 결합된다.
하나의 양태에서, 화학식 (F-ii)의 X2는 C(R7R7a)이다.
또 다른 양태에서 화학식 (F-ii)의 X2는 C(R7R7a)-C(R8R8a)이다.
바람직하게는, 화학식 (F-ii)의 R1은 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-ii)의 R1a는 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-ii)의 R1 및 R1a는 둘 다 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-ii)의 R2는 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-ii)의 R2a는 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-ii)의 R2 및 R2a는 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-ii)의 R3은 H이거나 메틸, 에틸 또는 프로필이다.
바람직하게는, 화학식 (F-ii)의 R3a는 H이거나 메틸, 에틸 또는 프로필이다.
하나의 바람직한 양태에서 화학식 (F-ii)의 R3 및 R3a는 둘 다 H이다.
또 다른 바람직한 양태에서 화학식 (F-ii)의 R3은 H이고 화학식 (F-ii)의 R3a는 메틸이다.
또 다른 바람직한 양태에서 화학식 (F-ii)의 R3 및 R3a는 둘 다 메틸이다.
하나의 양태에서 화학식 (F-ii)의 R10은 H이다.
또 다른 바람직한 양태에서 화학식 (F-ii)의 R10은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸 또는 3급-부틸이다. 보다 바람직하게는, 화학식 (F-ii)의 R10은 메틸, 에틸, 프로필 또는 이소프로필이다. 매우 보다 바람직하게는, 화학식 (F-ii)의 R10은 메틸 또는 에틸이고, 가장 바람직하게는, 화학식 (F-ii)의 R10은 메틸이다.
바람직하게는, 화학식 (F-ii)의 SP0은 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐로부터 선택되고, 상기 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 동일하거나 상이한 하나 이상의 Ra10으로 임의로 치환되고, 여기서 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 T, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(Ra11)-; -S(O)2N(Ra11)-; -S(O)N(Ra11)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(Ra11)S(O)2N(Ra11a)-; -S-; -N(Ra11)-; -OC(O)Ra11; -N(Ra11)C(O)-; -N(Ra11)S(O)2-; -N(Ra11)S(O)-; -N(Ra11)C(O)O-; -N(Ra11)C(O)N(Ra11a)-; 및 -OC(O)N(Ra11Ra11a)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기(들)에 의해 임의로 간섭되고;
T는 페닐; 나프틸; 인데닐; 인다닐; 테트랄리닐; C3-10 사이클로알킬; 4 내지 7원 헤테로사이클릴; 또는 8 내지 11원 헤테로비사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 T는 동일하거나 상이한 하나 이상의 Ra10으로 임의로 치환되고;
Ra10은 할로겐; CN; 옥소(=O); COORa12; ORa12; C(O)Ra12; C(O)N(Ra12Ra12a); S(O)2N(Ra12Ra12a); S(O)N(Ra12Ra12a); S(O)2Ra12; S(O)Ra12; N(Ra12)S(O)2N(Ra12aRa12b); SRa12; N(Ra12Ra12a); NO2; OC(O)Ra12; N(Ra12)C(O)Ra12a; N(Ra12)S(O)2Ra12a; N(Ra12)S(O)Ra12a; N(Ra12)C(O)ORa12a; N(Ra12)C(O)N(Ra12aRa12b); OC(O)N(Ra12Ra12a); 또는 C1-6 알킬이고, 여기서 C1-6 알킬은 동일하거나 상이한 하나 이상의 할로겐으로 임의로 치환되고;
Ra11, Ra11a, Ra12, Ra12a, Ra12b는 독립적으로 H; 또는 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 C1-6 알킬은 동일하거나 상이한 하나 이상의 할로겐으로 임의로 치환된다.
바람직하게는, 화학식 (F-ii)의 SP0은 C1-20 알킬이고, 상기 C1-20 알킬은 -O-; 및 -C(O)N(R1aa)-로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기에 의해 임의로 간섭되고; 상기 C1-20 알킬 쇄는 OH; 및 -C(O)N(R1aaR1aaa)로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 임의로 치환되고; 여기서 R1aa, R1aaa는 H; 및 C1-4 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
바람직하게는, 화학식 (F-ii)의 SP0은 14 g/mol 내지 750 g/mol 범위의 분자량을 갖는다.
바람직하게는, 화학식 (F-ii)의 SP0은
Figure 112015045066876-pct00104
및
Figure 112015045066876-pct00105
로부터 선택되는 말단기를 통해 담체에 연결된다.
화학식 (F-ii)의 SP0이 이러한 말단기를 갖는 경우, SP0은 이러한 말단기 없이 계산시 14 g/mol 내지 500 g/mol 범위의 분자량을 갖는 것이 추가로 바람직하다.
바람직하게는, 화학식 (F-ii)의 D는 라니비주맙이다.
바람직하게는, 화학식 (F-ii)의 담체는 하이드로겔, 보다 바람직하게는 PEG계 하이드로겔이다.
매우 보다 바람직하게는, VEGF 중화 프로드럭은 화학식 (F-iiia) 또는 (F-iiib)의 잔기를 포함한다:
Figure 112015045066876-pct00106
상기 화학식에서,
점선은 담체에 대한 결합을 나타내고;
R2, R2a, R3, R3a, R7, R7a, R8, R8a, X2 및 D는 화학식 (F)에서 정의된 바와 같이 사용되고;
R10 및 SP0은 화학식 (F-ii)에서 정의된 바와 같이 사용되고;
여기서 화학식 (F-iiia) 또는 (F-iiib)의 잔기는 임의로 추가로 치환되고, 단, 화학식 (F-iiia) 및 (F-iiib)에서 별표로 표시된 수소는 치환기에 의해 치환되지 않고, R3 및 R3a은 서로 독립적으로 H이거나 SP3-혼성화 탄소 원자를 통해 N에 결합된다.
바람직하게는, 화학식 (F-iiia) 또는 (F-iiib)의 SP0은 C1-20 알킬이고, 상기 C1-20 알킬은 -O-; 및 -C(O)N(R1aa)-로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기에 의해 임의로 간섭되고; 상기 C1-20 알킬 쇄는 OH; 및 -C(O)N(R1aaR1aaa)로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 임의로 치환되고; 여기서 R1aa, R1aaa는 H; 및 C1-4 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
바람직하게는, 화학식 (F-iiia) 또는 (F-iiib)의 SP0은 14 g/mol 내지 750 g/mol 범위의 분자량을 갖는다.
바람직하게는, 화학식 (F-iiia) 또는 (F-iiib)의 SP0은
Figure 112015045066876-pct00107
및
Figure 112015045066876-pct00108
로부터 선택되는 말단기를 통해 담체에 연결된다.
화학식 (F-iiia) 또는 (F-iiib)의 SP0이 이러한 말단기를 갖는 경우, 이러한 말단기 없이 계산시 14 g/mol 내지 500 g/mol 범위의 분자량을 갖는 것이 추가로 바람직하다.
바람직하게는, 화학식 (F-iiia) 또는 (F-iiib)의 R2는 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-iiia) 또는 (F-iiib)의 R2a는 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-iiia) 또는 (F-iiib)의 R2 및 R2a는 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-iii)의 R3은 H이거나 메틸, 에틸 또는 프로필이다.
바람직하게는, 화학식 (F-iii)의 R3a는 H이거나 메틸, 에틸 또는 프로필이다.
하나의 바람직한 양태에서 화학식 (F-iii)의 R3 및 R3a는 둘 다 H이다.
또 다른 바람직한 양태에서 화학식 (F-iii)의 R3은 H이고, 화학식 (F-iii)의 R3a는 메틸이다.
또 다른 바람직한 양태에서 화학식 (F-iii)의 R3 및 R3a는 둘 다 메틸이다.
바람직하게는, 화학식 (F-iiia) 또는 (F-iiib)의 R7은 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-iiia) 또는 (F-iiib)의 R7a는 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-iiib)의 R8은 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-iiib)의 R8a는 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-iiib)의 R8 및 R8a는 둘 다 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-iiia)의 R10은 H이다.
바람직하게는, 화학식 (F-iiib)의 R10은 메틸, 에틸 또는 프로필이다. 가장 바람직하게는, 화학식 (F-iiib)의 R10은 메틸이다.
바람직하게는, 화학식 (F-iiia) 또는 (F-iiib)의 D는 라니비주맙이다.
바람직하게는, 화학식 (F-iiia) 또는 (F-iiib)의 담체는 하이드로겔, 보다 바람직하게는 PEG계 하이드로겔이다.
매우 보다 바람직하게는, VEGF 중화 프로드럭은 화학식 (F-iva) 또는 (F-ivb)의 잔기를 포함한다:
Figure 112015045066876-pct00109
상기 화학식에서,
점선은 담체에 대한 결합을 나타내고;
R3 및 R3a는 화학식 (I)에서 정의된 바와 같이 사용되고;
R10b는 C1-6 알킬이고;
여기서 화학식 (F-iva) 또는 (F-ivb)의 잔기는 임의로 추가로 치환되고, 단, 별표로 표시된 수소는 치환기에 의해 치환되지 않고, R3 및 R3a는 서로 독립적으로 H이거나 SP3-혼성화 탄소 원자를 통해 N에 결합된다.
바람직하게는, 화학식 (F-iva) 및 (F-ivb)의 SP0은 C1-20 알킬이고, 상기 C1-20 알킬은 -O-; 및 -C(O)N(R1aa)-로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기에 의해 임의로 간섭되고; 상기 C1-20 알킬 쇄는 OH; 및 -C(O)N(R1aaR1aaa)로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 임의로 치환되고; 여기서 R1aa, R1aaa는 H; 및 C1-4 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
바람직하게는, 화학식 (F-iva) 및 (F-ivb)의 SP0은 14 g/mol 내지 750 g/mol 범위의 분자량을 갖는다.
바람직하게는, 화학식 (F-iva) 및 (F-ivb)의 SP0은
Figure 112015045066876-pct00110
및
Figure 112015045066876-pct00111
로부터 선택되는 말단기를 통해 담체에 연결된다.
화학식 (F-iva) 및 (F-ivb)의 SP0이 이러한 말단기를 갖는 경우, SP0은 이러한 말단기 없이 계산시 14 g/mol 내지 500 g/mol 범위의 분자량을 갖는 것이 추가로 바람직하다.
바람직하게는, 화학식 (F-iva) 또는 (F-ivb)의 R3은 H이거나 메틸, 에틸 또는 프로필이다.
바람직하게는, 화학식 (F-iva) 또는 (F-ivb)의 R3a는 H이거나 메틸, 에틸 또는 프로필이다.
하나의 바람직한 양태에서 화학식 (F-iva) 또는 (F-ivb)의 R3 및 R3a는 둘 다 H이다.
또 다른 바람직한 양태에서 화학식 (F-iva) 또는 (F-ivb)의 R3은 H이고, 화학식 (F-iva) 또는 (F-ivb)의 R3a는 메틸이다.
또 다른 바람직한 양태에서 화학식 (F-iva) 또는 (F-ivb)의 R3 및 R3a는 둘 다 메틸이다.
또 다른 바람직한 양태에서 화학식 (F-iva) 또는 (F-ivb)의 R3은 H이고, 화학식 (F-iva) 또는 (F-ivb)의 R3a는 메틸이다.
바람직하게는 화학식 (F-ivb)의 R10b는 메틸, 에틸 또는 프로필이다. 가장 바람직하게는, R10b는 메틸이다.
바람직하게는, 화학식 (F-iva) 및 (F-ivb)의 D는 라니비주맙이다.
바람직하게는, 화학식 (F-iva) 및 (F-ivb)의 담체는 하이드로겔, 보다 바람직하게는 PEG계 하이드로겔이다.
하나의 양태에서 VEGF 중화 프로드럭은 VEGF 핵산을 표적으로 하는 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 리보자임 또는 RNAi 분자; 동족 수용체에 대한 VEGF의 결합을 방지하는 항-VEGF 앱타머, 항-VEGF 항체, 항-VEGF 항체 단편, DARPin 및 가용성 VEGF 수용체 데코이(receptor decoy); 동족 VEGF 수용체(VEGFR) 핵산을 표적으로 하는 안티센스, 리보자임 및 RNAi 분자; 동족 VEGFR 수용체에 결합하는 항-VEGFR 앱타머 또는 항-VEGFR 항체; 동족 VEGFR 수용체에 결합하는 항-VEGFR 항체 단편; 및 VEGFR 티로신 키나제 억제제로 이루어진 약물 군으로부터 선택되는 생물학적 활성 잔기를 결합된 형태로 포함한다.
바람직한 양태에서 VEGF 중화 프로드럭은 VEGF 핵산을 표적으로 하는 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 리보자임 또는 RNAi 분자; 동족 수용체에 대한 VEGF의 결합을 방지하는 항-VEGF 앱타머, 항-VEGF 항체, DARPin 및 가용성 VEGF 수용체 데코이; 동족 VEGF 수용체(VEGFR) 핵산을 표적으로 하는 안티센스, 리보자임, 및 RNAi 분자; 동족 VEGFR 수용체에 결합하는 항-VEGFR 앱타머 또는 항-VEGFR 항체; 및 VEGFR 티로신 키나제 억제제로 이루어진 약물 군으로부터 선택되는 생물학적 활성 잔기를 결합된 형태로 포함한다.
바람직하게는, VEGF 중화 프로드럭은 라니비주맙, 베바시주맙, 페갑타닙, 아플리베르셉트, MP0112, KH902, ESBA1008, AL 39324, ALG-1001, 및 베바시라닙 및/또는 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 활성 잔기를 결합된 형태로 포함한다.
보다 바람직하게는, VEGF 중화 프로드럭은 라니비주맙, 베바시주맙, 페갑타닙, 아플리베르셉트 및 베바시라닙 및/또는 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
가장 바람직하게는, VEGF 중화 프로드럭은 라니비주맙이다.
하나의 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물로 치료되는 안구 병태는 안구 혈관신생을 특징으로 하는 질환이다.
안내 혈관신생은 바람직하게는 시신경 유두 혈관신생, 홍채 혈관신생, 망막 혈관신생, 맥락막 혈관신생, 각막 혈관신생, 유리체 혈관신생, 녹내장, 판누스, 익상편, 황반 부종, 황반 변성, 노인성 황반 변성, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 망막 허혈, 당뇨병성 황반 부종, 혈관성 망막증, 망막 변성, 수정체후부 섬유증식증, 망막모세포종, 황반 변성의 미숙아 망막증, 각막 이식편 혈관신생, 중심성 망막 정맥 폐색(CRVO), 병리적 근시, 안구 종양, 포도막염, 눈의 염증성 질환, 및 증식성 유리체망막증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 양태에서 약제학적 조성물은 VEGF 핵산을 표적으로 하는 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 리보자임 또는 RNAi 분자; 동족 수용체에 대한 VEGF의 결합을 방지하는 항-VEGF 앱타머, 항-VEGF 항체, 항-VEGF 항체 단편, DARPin, 안티칼린, 리포칼린 및 가용성 VEGF 수용체 데코이; 동족 VEGF 수용체(VEGFR) 핵산을 표적으로 하는 안티센스, 리보자임 및 RNAi 분자; 동족 VEGFR 수용체에 결합하는 항-VEGFR 앱타머 또는 항-VEGFR 항체; 동족 VEGFR 수용체에 결합하는 항-VEGFR 항체 단편; 및 VEGFR 티로신 키나제 억제제를 포함하는 약물류 목록으로부터 선택되는 하나 이상의 약물(들)을 이의/이들의 유리 형태로 더 포함한다.
바람직한 양태에서 약제학적 조성물은 VEGF 핵산을 표적으로 하는 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 리보자임 또는 RNAi 분자; 동족 수용체에 대한 VEGF의 결합을 방지하는 항-VEGF 앱타머, 항-VEGF 항체, DARPin, 안티칼린, 리포칼린 및 가용성 VEGF 수용체 데코이; 동족 VEGF 수용체(VEGFR) 핵산을 표적으로 하는 안티센스, 리보자임 및 RNAi 분자; 동족 VEGFR 수용체에 결합하는 항-VEGFR 앱타머 또는 항-VEGFR 항체; 및 VEGFR 티로신 키나제 억제제를 포함하는 약물류 목록으로부터 선택되는 하나 이상의 약물(들)을 이의/이들의 유리 형태로 더 포함한다.
바람직하게는, 약제학적 조성물은 스테로이드, 항-염증성 화합물, 항생제 및 항바이러스제, 항진균제, 또는 항-혈관신생 화합물일 수 있는 하나 이상의 활성 성분(들)을 더 포함한다. 활성 성분은, 예를 들면, 메토트렉세이트, 레티노산, 아스피린, 디클로페낙, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 케토롤락, 나프록센, 우프로펜, 덱사메타손, 코르티손, 플루오시놀론, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 또는 트리암시놀론일 수 있다.
하나의 바람직한 양태에서 약제학적 조성물은 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 산성 섬유모세포 성장 인자(aFGF), 전환 성장 인자 알파(TGFa), 전환 성장 인자 베타(TGFβ), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 안지오제닌, 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자(PD-ECGF), 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-8(IL-8), 인터류킨-12, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 안지오포이에틴-I, Del-I, 폴리스타틴, 과립구 집락-자극 인자(G-CSF), 간세포 성장 인자(HGF), 렙틴, 미드킨, 태반 성장 인자, 플레이오트로핀(PTN), 프로그라눌린, 프롤리페린, 종양 괴사 인자-알파(TNF-알파), 안지오아레스틴, 안티오스타틴 플라스미노겐 단편, 항혈관형성 항-트롬빈 III, 연골-유래 억제제(CDI), CDS9 상보성 단편, 엔도스타틴 콜라겐 XVIII 단편, 피브로넥틴 단편, 그로-베타, 헤파리나제, 헤파린 육당류 단편, 인간 융모성 성선자극호르몬(hCG), 인터페론 알파/베타/감마, 인터페론 유도성 단백질(IP-IO), 크린글 S 플라스미노겐 단편, 메탈로프로테이나제 억제제(TIMP), 2-메톡시에스트라디올, 태반 리보뉴클레아제 억제제, 플라스미노겐 활성제 억제제, 혈소판 인자-4(PF4), 프로락틴 16 kD 단편, 프롤리페린-관련 단백질(PRP), 레티노이드, 테트라하이드로코르티솔-S, 트롬보스폰딘-I(TSP-I), 바스큘로스타틴, 바소스타틴 칼레티큘린 단편, 프로스타글란딘 수용체, 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-I), 스핑고신-1-포스페이트, 인자 D, RTP801, 상보성 억제제, α2 아드레날린성 작용제, mTOR, 섬모 신경영양 인자(CNTF), 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF), 아교 세포-유래 신경영양 인자(GDNF), 수정체 상피 유래 성장 인자(LEDGF), 간상체-유래 추상체 생존 인자(RdCVF), 색소 상피-유래 인자(PEDF), 호중구-활성 단백질, 단핵구 화학주성 단백질, 대식세포-염증성 단백질, 소 유도성 분비(SIS) 단백질, 혈소판 인자, 혈소판 염기성 단백질, 흑색종 성장 자극 활성, 표피 성장 인자, 신경 성장 인자, 골 형성 단백질, 골 성장 연골-유도 인자, 인터류킨, 인터류킨 억제제, 인터류킨 수용체, 조혈 인자, 과립구 집락 자극 인자, 대식세포 집락 자극 인자, 과립구-대식세포 집락 자극 인자, 인히빈, 및 액티빈을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질(들)의 활성의 하나 이상의 조절제(들)를 이의/이들의 유리 형태로 더 포함한다.
바람직한 상보성 억제제는 C1 억제제, C3 억제제 및 C5 억제제이다.
바람직한 성장 인자 억제제는 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 섬모 신경영양 인자(CNTF), 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF), 아교 세포-유래 신경영양 인자(GDNF), 수정체 상피 유래 성장 인자(LEDGF), 간상체-유래 추상체 생존 인자(RdCVF), 및 색소 상피-유래 인자(PEDF)이다.
바람직한 골 성장 연골-유도 인자는 골 성장 연골-유도 인자 알파 및 골 성장 연골-유도 인자 베타이다.
바람직한 조혈 인자는 에리트로포이에틴이다.
또 다른 양태에서 약제학적 조성물은 하나 이상의 프로드럭(들)이 VEGF 핵산을 표적으로 하는 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 리보자임 또는 RNAi 분자; 동족 수용체에 대한 VEGF의 결합을 방지하는 항-VEGF 앱타머, 항-VEGF 항체, DARPin, 안티칼린, 리포칼린 및 가용성 VEGF 수용체 데코이; 동족 VEGF 수용체(VEGFR) 핵산을 표적으로 하는 안티센스, 리보자임 및 RNAi 분자; 동족 VEGFR 수용체에 결합하는 항-VEGFR 앱타머 또는 항-VEGFR 항체; 및 VEGFR 티로신 키나제 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 활성 잔기를 결합된 형태로 포함한다.
또 다른 바람직한 양태에서 약제학적 조성물은 생물학적 활성 잔기를 결합된 형태로 포함하는 하나 이상의 추가 프로드럭(들)을 더 포함하고, 상기 생물학적 활성 잔기는 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 산성 섬유모세포 성장 인자(aFGF), 전환 성장 인자 알파(TGFa), 전환 성장 인자 베타(TGFβ), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 안지오제닌, 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자(PD-ECGF), 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-8(IL-8), 인터류킨-12, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 안지오포이에틴-I, Del-I, 폴리스타틴, 과립구 집락-자극 인자(G-CSF), 간세포 성장 인자(HGF), 렙틴, 미드킨, 태반 성장 인자, 플레이오트로핀(PTN), 프로그라눌린, 프롤리페린, 종양 괴사 인자-알파(TNF-알파), 안지오아레스틴, 안티오스타틴 플라스미노겐 단편, 항혈관형성 항-트롬빈 III, 연골-유래 억제제(CDI), CDS9 상보성 단편, 엔도스타틴 콜라겐 XVIII 단편, 피브로넥틴 단편, 그로-베타, 헤파리나제, 헤파린 육당류 단편, 인간 융모성 성선자극호르몬(hCG), 인터페론 알파/베타/감마, 인터페론 유도성 단백질(IP-IO), 크린글 S 플라스미노겐 단편, 메탈로프로테이나제 억제제(TIMP), 2-메톡시에스트라디올, 태반 리보뉴클레아제 억제제, 플라스미노겐 활성제 억제제, 혈소판 인자-4(PF4), 프로락틴 16 kD 단편, 프롤리페린-관련 단백질(PRP), 레티노이드, 테트라하이드로코르티솔-S, 트롬보스폰딘-I(TSP-I), 바스큘로스타틴, 바소스타틴 칼레티큘린 단편, 프로스타글란딘 수용체, 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-I), 스핑고신-1-포스페이트, 인자 D, RTP801, 상보성 억제제, α2 아드레날린성 작용제, mTOR, 섬모 신경영양 인자(CNTF), 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF), 아교 세포-유래 신경영양 인자(GDNF), 수정체 상피 유래 성장 인자(LEDGF), 간상체-유래 추상체 생존 인자(RdCVF), 색소 상피-유래 인자(PEDF), 호중구-활성 단백질, 단핵구 화학주성 단백질, 대식세포-염증성 단백질, 소 유도성 분비(SIS) 단백질, 혈소판 인자, 혈소판 염기성 단백질, 흑색종 성장 자극 활성, 표피 성장 인자, 신경 성장 인자, 골 형성 단백질, 골 성장 연골-유도 인자, 인터류킨, 인터류킨 억제제, 인터류킨 수용체, 조혈 인자, 과립구 집락 자극 인자, 대식세포 집락 자극 인자, 과립구-대식세포 집락 자극 인자, 인히빈, 및 액티빈을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질(들)의 활성 조절제이다.
하나의 양태에서, 하나 이상의 추가의 약물(들)은 프로드럭 형태이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 부형제(들)를 포함한다. 부형제는 완충제, 등장성 개질제, 보존제, 안정제, 흡착방지제, 산화방지제, 점증제/점도 강화제, 또는 기타 보조제로 분류될 수 있다. 일부 경우, 이들 성분은 이중 또는 삼중 작용을 갖을 수 있다. 약제학적 조성물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다:
(i) 완충제: pH를 목적하는 범위로 유지시키는 생리학적으로 허용되는 버퍼, 예를 들면, 나트륨 포스페이트, 비카르보네이트, 석시네이트, 히스티딘, 시트레이트 및 아세테이트, 설페이트, 니트레이트, 클로라이드, 피루베이트. 제산제, 예를 들면, Mg(OH)2 또는 ZnC03이 또한 사용될 수 있다. 완충능은 pH 안전성에 가장 민감한 조건과 일치하도록 조절될 수 있다.
(ii) 등장성 개질제: 주입면에서 삼투압 차이로 인한 세포 손상을 야기할 수 있는 통증을 최소화한다. 글리세린 및 염화나트륨이 예이다. 유효 농도는 삼투압측정에 의해 측정할 수 있다.
(iii) 보존제 및/또는 항미생물제: 환자의 주입시 감염 위험을 최소화한다. 전형적인 보존제는 m-크레솔, 페놀, 메틸파라벤, 에틸파라벤, 프로필파라벤, 부틸파라벤, 클로로부탄올, 벤질 알코올, 페닐머큐릭 니트레이트, 티메로솔, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 벤조산, 클로로크레솔, 및 벤즈알코늄 클로라이드를 포함한다.
(iv) 안정제: 안정화는 단백질-안정화력의 보강, 변성 상태의 불안정화, 또는 단백질에 대한 부형제의 직접적인 결합에 의해 달성된다. 안정제는 아미노산, 예를 들면, 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 글리신, 히스티딘, 리신, 프롤린; 당, 예를 들면, 글루코스, 수크로스, 트레할로스; 폴리올, 예를 들면, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨; 염, 예를 들면, 인산칼륨, 황산나트륨; 킬레이트제, 예를 들면, EDTA, 헥사포스페이트; 리간드, 예를 들면, 2가 금속 이온(아연, 칼슘 등); 기타 염 또는 유기 분자, 예를 들면, 페놀 유도체일 수 있다. 추가로, 올리고머 또는 중합체, 예를 들면, 사이클로덱스트린, 덱스트란, 덴드리머, PEG 또는 PVP 또는 프로타민 또는 HSA가 사용될 수 있다.
(v) 흡착방지제: 주로 이온성 또는 비이온성 계면활성제 또는 기타 단백질 또는 가용성 중합체는 약제학적 조성물의 용기의 내부 표면을 코팅하거나 이에 경쟁적으로 흡착되는데 사용된다. 적합한 계면활성제는, 예를 들면, 알킬 설페이트, 예를 들면, 암모늄 라우릴 설페이트 및 나트륨 라우릴 설페이트; 알킬 에테르 설페이트, 예를 들면, 나트륨 라우레쓰 설페이트 및 나트륨 미레쓰 설페이트; 설포네이트, 예를 들면, 디옥틸 나트륨 설포석시네이트, 퍼플루오로옥탄설포네이트, 퍼플루오로부탄설포네이트, 알킬 벤젠 설포네이트; 포스페이트, 예를 들면, 알킬 아릴 에테르 포스페이트 및 알킬 에테르 포스페이트; 카르복실레이트, 예를 들면, 지방산 염(비누) 또는 스테아르산나트륨, 나트륨 라우로일 사르코시네이트, 퍼플루오로노나노에이트, 퍼플루오로옥타노에이트; 옥테니딘 디하이드로클로라이드; 4차 암모늄 양이온, 예를 들면, 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드, 세틸 트리메틸암모늄 클로라이드, 세틸피리디늄 클로라이드, 폴리에톡시화 탤로우 아민, 벤즈알콕늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 5-브로모-5-니토르-1,3-디옥산, 디메틸디옥타데실암모늄 클로라이드, 디옥타데실디메틸암모늄 브로마이드; 양쪽성이온, 예를 들면, 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트, 코카미도프로필 하이드록시설타인, 아미노산, 이미노산, 코카미도프로필 베타인, 레시틴; 지방 알코올, 예를 들면, 세틸 알코올, 스테아릴 알코올, 세토스테아릴 알코올, 올레일 알코올; 폴리옥시 에틸렌 글리콜 알킬 에테르, 예를 들면, 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 펜타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르; 폴리옥시프로필렌 글리콜 알킬 에테르; 글루코시드 알킬 에테르, 예를 들면, 데실 글루코시드, 라우릴 글루코시드, 옥틸 글루코시드; 폴리옥시에틸렌 글리콜 옥틸페놀 에테르, 예를 들면, 트리톤(Triton) X-100; 폴리옥시 에틸렌 글리콜 알킬페놀 에테르, 예를 들면, 논옥시놀-9; 글리세롤 알킬 에스테르, 예를 들면, 글리세릴 라우레이트; 폴리옥시에틸렌 글리콜 소르비탄 알킬 에스테르, 예를 들면, 폴리소르베이트; 소르비탄 알킬 에스테르; 코카미드 MEA 및 코카미드 DEA; 도데실 디메틸아민 옥사이드; 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 블록 공중합체, 예를 들면, 폴록사머(플루로닉(Pluronic) F-68), PEG 도데실 에테르(브리즈(Brij) 35), 폴리소르베이트 20 및 80이고; 기타 흡착방지제는 덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜, PEG-폴리히스티딘, BSA 및 HSA 및 겔라틴이다. 부형제의 선택된 농도 및 유형은 피해야하는 효과에 따라 좌우되지만, 전형적으로 계면활성제의 단분자층이 CMC 값 바로 위 접점에서 형성된다.
(vi) 동결건조보호제 및/또는 동해방지제: 동결 또는 분무 건조 동안, 부형제는 수소 결합 파괴 및 수분 제거로 인한 불안정화 효과를 상쇄시킬 수 있다. 이러한 목적을 위하여 당 및 폴리올을 사용할 수 있지만, 해당하는 긍정적인 효과가 또한 계면활성제, 아미노산, 비수성 용매, 및 기타 펩티드에 있어서 관찰되었다. 트레할로스는 수분 감소-유도된 응집에 특히 효과적이고 또한 잠재적으로 물에 단백질 소수성 기 노출로 인한 열적 안정성을 개선시킨다. 만니톨 및 수크로스는 또한 단독 동결건조보호제/동해방지제로서 또는 서로 조합으로서 사용될 수 있고, 이 때 만니톨:수크로스의 높은 비율은 동결건조된 케이크의 물리적 안정성을 강화시키는 것으로 알려져 있다. 만니톨은 또한 트레할로스와 조합될 수 있다. 트레할로스는 또한 소르비톨과 조합될 수 있거나 소르비톨은 단독 보호제로서 사용될 수 있다. 전분 또는 전분 유도체가 또한 사용될 수 있다.
(vii) 산화방지제: 항산화제, 예를 들면, 아스코르브산, 엑토인, 메티오닌, 글루타티온, 모노티오글리세롤, 모린, 폴리에틸렌이민(PEI), 프로필 갈레이트, 비타민 E, 킬레이트제, 예를 들면, 시트르산, EDTA, 헥사포스페이트, 티오글리콜산.
(viii) 분산제 또는 확산제: 세포간 공간에서 세포외 기질의 구성원, 예를 들면, 이에 한정되지 않지만 결합 조직의 세포간 공간에서 발견되는 다당류인 히알루론산의 가수분해를 통해 결합 조직의 투과성을 변경한다. 분산제, 예를 들면, 이에 한정되지 않지만, 히알루로니다제는 세포외 기질의 점도를 일시적으로 감소시키고 주입된 약물의 확산을 촉진한다.
(ix) 기타 보조제: 예를 들면, 습윤제, 점도 개질제, 항생제, 히알루로니다제. 산 및 염기, 예를 들면, 염산 및 수산화나트륨은 제조 동안 pH 조절에 필요한 보조제이다.
약제학적 조성물은 건조, 액체 또는 현탁액 약제학적 조성물 형태로 제공될 수 있다.
건조, 액체 또는 현탁액 형태의 약제학적 조성물은 단일 또는 다중 용량 약제학적 조성물로서 제공될 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 건조, 액체 또는 현탁액 약제학적 조성물은 단일 용량으로서 제공되고, 이는 이들이 공급되는 용기가 약제학적 1회량을 함유하는 것을 의미한다.
또 다른 양태에서 건조, 액체 또는 현탁액 약제학적 조성물은 다중 용량 약제학적 조성물이고, 이는 이들이 공급되는 용기가 하나 이상의 치료학적 용량을 함유하는 것, 즉 다중 용량 조성물은 2회량 이상을 함유하는 것을 의미한다. 이러한 다중 용량 약제학적 조성물은 이것이 필요한 상이한 환자들에게 사용될 수 있거나 1명의 환자에게 사용될 수 있고, 여기서 첫번째 용량 적용 후 남은 용량은 필요할 때까지 저장된다.
바람직하게는, 약제학적 조성물은 단일 용량으로서 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에서 약제학적 조성물은 용기 내에 있다. 건조, 액체 또는 현탁액 약제학적 조성물에 적합한 용기는, 예를 들면, 주사기, 바이알, 마개와 밀봉이 있는 바이알, 앰플, 및 카트리지이다. 특히, 건조, 액체 또는 현탁액 약제학적 조성물은 주사기로 제공된다. 약제학적 조성물이 건조 약제학적 조성물인 경우, 용기는 바람직하게는 이중-챔버 주사기이다. 이러한 양태에서, 상기 건조 약제학적 조성물은 이중-챔버 주사기의 제1 챔버 내로 제공되고, 재구성 용액이 이중-챔버의 제2 챔버 내로 제공된다.
건조 약제학적 조성물을 이것이 필요한 환자에게 적용하기 전에, 건조 조성물을 재구성한다. 재구성은 건조 조성물이 제공되는 용기, 예를 들면, 바이알, 주사기, 이중-챔버 주사기, 앰플 및 카트리지 내에서 발생할 수 있다. 재구성은 재구성 용액의 정해진 양을 건조 조성물에 가함으로써 수행된다. 재구성 용액은 추가의 첨가제, 예를 들면, 보존제 및/또는 항미생물제, 예를 들면, 벤질알코올 및 크레솔을 함유할 수 있는 살균 액체, 예를 들면, 물 또는 버퍼이다. 바람직하게는, 재구성 용액은 살균수이다. 건조 약제학적 조성물이 재구성되는 경우, 이는 "재구성된 약제학적 조성물" 또는 "재구성된 약제학적 조성물" 또는 "재구성된 조성물"로서 지칭된다.
바람직하게는, 약제학적 조성물은 액체 또는 현탁액이다.
본 발명의 또 다른 측면은 부분들로 이루어진 키트이다.
투여 장치가 단순하게 피하 주사기인 경우, 키트는 주사기, 바늘, 주사기와 사용하기 위한 건조 약제학적 조성물을 포함한 용기 및 재구성 용액을 포함한 제2 용기를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물이 액체 또는 현탁액 약제학적 조성물인 경우, 키트는 주사기, 바늘, 및 주사기와 사용하기 위한 액체 또는 현탁액 약제학적 조성물을 포함한 용기를 포함할 수 있다.
실시예
물질 및 방법
루센티스 및 라니비주맙은 하기 실시예 전체에서 동의어로 사용된다.
물질:
아미노 4-암(4-arm) PEG5000은 젠켐 테크놀로지(JenKem Technology, Beijing, P. R. China)로부터 수득하였다. 키트롤™ DPHS를 크로다 인터내셔널 픽(Croda International Pic, Cowick Hall, United Kingdom)으로부터 수득하였다.
시스-1,4-사이클로헥산디카르복실산은 TCI 유럽 N.V.(TCI EUROPE N.V., Boerenveldseweg 6-Haven 1063, 2070 Zwijndrecht, Belgium)으로부터 수득하였다.
이소프로필말론산은 ABCR 게엠베하 앤드 코 카게(ABCR GmbH & Co. KG, 76187 Karlsruhe, Germany)로부터 수득하였다.
N-(3-말레이미도프로필)-39-아미노-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-노나트리아콘탄산 펜타플루오로페닐 에스테르(Mal-PEG12-PFE)는 바이오매트리크 인크(Biomatrik Inc., Jiaxing, P. R. China)로부터 수득하였다.
순수 옥시마(Oxyma pure), HATU, HOAt, HOBt, PyBOP, TBTU, COMU, Fmoc-L-Asp(OBzl)-OH, Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Z-His(OTrt)-OH, Fmoc-Ado-OH 및 린크(Rink) 아미드 수지는 머크 바이오사이언시스 게엠베하(Merck Biosciences GmbH, Schwalbach/Ts, Germany)로부터 구입하였다.
Boc-Lys(Boc)-OSu는 젠 케미칼스 아게(Senn chemicals AG, Dielsdorf, Switzerland)로부터 구입하였다. Fmoc-N-Me-L-Asp(OtBu)-OH는 바켐(Bachem, Bubendorf, Switzerland)으로부터 구입하였다. Fmoc-N-Me-L-Asp(OBzl)-OH는 펩티즈 인터내셔널(Peptides International, Louisville, KY, USA)로부터 구입하였다. 1,9-비스-Boc-1,5,9-트리아자노난은 폴리펩티드 라보라토리스 에이에스(PolyPeptide Laboratories A/S, Hillerod, Denmark)로부터 구입하였다.
(5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔-4-일)-메틸 4-니트로페닐 카르보네이트는 켐존 사이언티픽 인크(Chemzon Scientific Inc., Lachine, QC, Canada)로부터 구입하였다.
α-[3-(o-피리딜디설피도)프로파노일아미도]-ω-숙신이미딜 에스테르 도데카(에틸렌 글리콜)(OPSS-PEG12-NHS)는 이리스 바이오테크 게엠베하(Iris Biotech GmbH, Marktredwitz, Germany)로부터 구입하였다.
모든 기타 화학물질은 시그마-알드리히 케미 게엠베하(Sigma-ALDRICH Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany)로부터 수득하였다.
방법:
반응은 시그마-알드리히 케미 게엠베하로부터 구입한 분자체 상에서 저장된 무수 용매(DCM, THF, ACN, DMF, 디옥산, MeOH, 톨루엔)로 수행하였다. 일반적으로, 반응은 실온에서 교반하고 HPLC/MS 또는 TLC로 모니터링하였다.
RP-HPLC는 각각 워터스(Waters) 600 또는 2535 HPLC 시스템 및 워터스 2487 또는 2489 흡광도 검출기에 연결된 100 × 20 mm 또는 100 × 40 mm C18 ReproSil-Pur 300 ODS-3 5μ 컬럼(Dr. Maisch, Ammerbuch, Germany) 또는 XBridge BEH300 C18 OBD Prep 10 ㎛ 30 × 150 mm 또는 5 ㎛ 10 × 150 mm(Waters, Eschborn, Germany) 상에서 수행하였다. 용액 A(H2O 중의 0.1% TFA) 및 용액 B(아세토니트릴 중의 0.1% TFA)의 선형 구배를 사용하였다. 생성물을 함유하는 HPLC 분획을 조합하고 동결건조하였다.
플래쉬 크로마토그래피 정제는 바이오타지 에이비(Biotage AB, Sweden)의 이솔레아 원(Isolera One) 시스템 상에서 바이오타지(Biotage) KP-Sil 실리카 카트리지 및 용리액으로서 n-헵탄, 에틸 아세테이트, 및 메탄올을 사용하여 수행하였다. 생성물은 254 nm에서 검출되었다. 240 nm 이상에서 흡광도를 나타내지 않는 생성물에 대하여, 분획을 LC/MS로 스크리닝하였다.
분석용 초고성능 LC(UPLC)는 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)의 LTQ 오르비트랩 디스커버리(LTQ Orbitrap Discovery) 질량 분석계와 커플링된 워터스 BEH300 C18 컬럼(2.1 × 50 mm, 1.7 ㎛ 입자 크기)이 장착된 워터스 에쿼티(Waters Acquity) 시스템 상에서 수행하였다.
HPLC-전기분무 이온화 질량 분석(HPLC-ESI-MS)은 둘 다 워터스 에쿼티 UPLC BEH300 C18 RP 컬럼(2.1 × 50 mm, 300 Å, 1.7 ㎛, 유속: 0.25 mL/분; 용매 A: UP-H2O + 0.04% TFA, 용매 B: UP-아세토니트릴 + 0.05% TFA)이 장착된 써모 LTQ 오르비트랩 디스커버리 고해상/고정밀 질량 분석계 또는 워터스 마이크로매스 ZQ에 커플링된 에쿼티 PDA 검출기를 사용하여 워터스 에쿼티 UPLC 상에서 수행하였다.
PEG 생성물의 MS 스펙트럼은 PEG 출발 물질의 다분산성으로 인하여 일련의 (CH2CH2O)n 잔기를 나타내었다. 용이한 이해를 위하여, 하나의 단일한 대표적인 m/z 신호만을 실시예에서 제공한다.
버퍼 교환은 아엑타 퓨리파이어(Aekta Purifier) 100 시스템에 연결된 HiTrap 또는 HiPrep 컬럼(GE Healthcare) 상에서 수행하였다.
양이온성 이온 교환 크로마토그래피는 아엑타 퓨리파이어 100 시스템에 연결된 소스(Source) 15 S 6 mL 컬럼 상에서 이동상 A 및 B로서 각각 20 mM MES, pH 5.7 및 20 mM MES, 500 mM NaCl, pH 5.7를 사용하여 수행하였다.
실시예 1
골격 시약 1a 및 1g의 합성:
Figure 112015045066876-pct00112
Boc-LLys(Boc)-OH 대신 Boc-DLys(Boc)-OH를 사용하는 것을 제외하고 제WO 2011/012715 A1호의 실시예 1에 기재된 바와 같이 골격 시약 1a를 합성하였다.
MS: m/z 888.50 = [M+10H+]10+(계산치 = 888.54)
Figure 112015045066876-pct00113
하기 반응식에 따라 골격 시약 1g를 아미노 4-암 PEG5000 1b로부터 합성하였다:
Figure 112015045066876-pct00114
화합물 1b의 합성을 위하여, 아미노 4-암 PEG5000(MW 약 5350 g/mol, 10.7 g, 2.00 mmol, HCl 염) 및 비스(펜타플루오로페닐)카르보네이트(4.73 g, 12.0 mmol)를 DCM(무수) 43 mL 중에 용해시키고, DIPEA(3.10 g, 24.0 mmol, 4.18 mL)를 실온에서 가하였다. 10분 후, 1,9-비스-boc-1,5,9-트리아자노난(5.30 g, 16.0 mmol)을 가하고, 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 그 다음, 추가의 1,9-비스-boc-1,5,9-트리아자노난(0.33 g, 1.0 mmol)을 가하였다. 용해가 완료된 후, 반응 혼합물을 여과하고, 용매를 실온에서 증발시켰다.
잔여물을 iPrOH 40 mL에 용해시키고, MTBE 320 mL로 희석하였다. 생성물을 밤새 -20℃에서 침전시켰다. 침전물을 유리 필터 Por. 3을 통해 여과로 수집하고, 차가운 MTBE(0℃) 200 mL로 세척하였다. 생성물을 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 11.1 g(83%) 백색 고체 1b.
MS: m/z 1112.86 = [M+6H]6+(계산치 =1113.04).
화합물 1c의 합성을 위하여, boc-보호된 화합물 1b(11.1 g, 1.66 mmol)을 MeOH 중의 3M HCl 40 mL에 용해시키고, 20분 동안 45℃에서 교반한 다음, 10분 동안 55℃에서 교반하였다. 침전을 위하여, MeOH 10 mL 및 MTBE 200 mL를 가하고, 혼합물을 16시간 동안 -20℃에서 저장하였다. 침전물을 유리 필터 Por. 3을 통해 여과로 수집하고, 차가운 MTBE(0℃) 200 mL로 세척하였다. 생성물을 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 9.14 g(89%) 백색 분말 1c(HCl 염).
MS: m/z 979.45 = [M+6H]6+(계산치 = 979.55).
화합물 1d의 합성을 위하여, 화합물 1c(9.06 g, 1.47 mmol, HCl 염) 및 비스(펜타플루오로페닐)카르보네이트(6.95 g, 17.6 mmol)를 DCM(무수) 50 mL에 용해시키고, DIPEA(4.56 g, 35.3 mmol, 6.15 mL)를 실온에서 가하였다. 10분 후, 1,9-비스-boc-1,5,9-트리아자노난(7.80 g, 23.5 mmol)을 가하고, 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 그 다음, 추가의 1,9-비스-boc-1,5,9-트리아자노난(0.49 g, 1.5 mmol)을 가하였다. 용해가 완료된 후, 용매를 실온에서 증발시켰다.
잔여물을 iPrOH 35 mL에 40℃에서 용해시키고, MTBE 200 mL로 희석시켰다. 생성물을 밤새 -20℃에서 침전시켰다. 침전물을 유리 필터 Por. 3을 통해 여과로 수집하고, 차가운 MTBE(0℃) 200 mL로 세척하였다. 생성물을 진공하에 밤새 건조시켜 백색 고체로서 1d를 수득하였다.
수율 11.6 g(90%) 백색 고체 1d.
MS: m/z 1248.08 = [M+7H]7+(계산치 = 1248.27).
화합물 1e의 합성을 위하여, boc-보호된 화합물 1d(11.4 g, 1.31 mmol)를 MeOH 중의 3M HCl 40 mL에 용해시키고, 20분 동안 45℃에서 교반한 다음, 10분 동안 55℃에서 교반하였다. 침전을 위하여, MeOH 10 mL 및 MTBE 200 mL를 가하고, 혼합물을 16시간 동안 -20℃에서 저장하였다. 침전물을 유리 필터 Por. 3을 통해 여과로 수집하고, 차가운 MTBE(0℃) 200 mL로 세척하였다. 생성물을 진공하에 밤새 건조시켜 백색 분말 1e를 수득하였다.
수율 7.60 g(75%) 백색 분말 1e(HCl 염).
MS: m/z 891.96 = [M+8H]8+(계산치 = 892.13).
화합물 1f의 합성을 위하여, 화합물 1e(7.56 g, 0.980 mmol, HCl 염) 및 비스(펜타플루오로페닐)카르보네이트(9.27 g, 23.0 mmol)를 DCM(무수) 250 mL에 용해시키고, DIPEA(6.08 g, 47.0 mmol, 8.19 mL)를 35℃에서 가하였다. 10분 후, 1,9-비스-boc-1,5,9-트리아자노난(5.30 g, 16.0 mmol)을 가하고, 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 그 다음, 추가의 1,9-비스-boc-1,5,9-트리아자노난(0.33 g, 1.0 mmol)을 가하였다. 용해가 완료된 후, 용매를 실온에서 증발시켰다.
잔여물을 iPrOH 250 mL에 60℃에서 용해시키고, MTBE 1350 mL로 희석시켰다. 생성물을 밤새 -20℃에서 침전시켰다. 침전물을 유리 필터 Por. 3을 통해 여과로 수집하고, 차가운 MTBE(0℃) 400 mL로 세척하였다. 생성물을 진공하에 밤새 건조시켜 1f를 유리질 고체로서 수득하였다.
수율 11.1 g(83%) 유리질 고체 1f.
MS: m/z 1312.01 =[M+10H]10+(계산치 = 1312.21).
골격 시약 1g의 합성을 위하여, boc-보호된 화합물 1f(7.84 g, 0.610 mmol)를 37℃에서 MeOH 16 mL에 용해시키고, 미리 차갑게 만든 디옥산 중의 4M HCl(4℃) 용액 55 mL를 실온에서 가하였다. 혼합물을 냉각 없이 20분 동안 교반하였다. 20분 후, MeOH 중의 3M HCl 110 mL를 가하였다. 용액을 24 팔콘(Falcon) 튜브(50 mL)에서 분할하고, 차가운 MTBE(-20℃) 40 mL를 각각의 팔콘 튜브에 가함으로써 침전시켰다. 3214 rcf에서 1분 동안 원심분리 후, 상등액을 따라내고, 유리질 고체를 팔콘 튜브 당 MeOH 5 mL에 용해시키고, 차가운 MTBE(-20℃) 40 mL를 각각의 팔콘 튜브에 다시 가함으로써 침전시켰다. 상청액을 제거하고, 잔여 고체를 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 5.74 g(87%) 백색 유리질 고체 1g(HCl 염).
MS: m/z 965.46 = [M+10H]10+(계산치 = 965.45)
실시예 2
가교결합제 시약 2d, 2g, 2k, 및 2o의 합성
하기 반응식에 따라 가교결합제 시약 2e를 아젤라산 모노벤질 에스테르 및 PEG 10000로부터 제조하였다:
Figure 112015045066876-pct00115
아젤라산 모노벤질 에스테르 2a의 합성을 위하여, 아젤라산(37.6 g, 200 mmol), 벤질 알코올(21.6 g, 200 mmol), p-톨루엔설폰산(0.80 g, 4.2 mmol), 및 톨루엔 240 mL의 혼합물을 7시간 동안 딘-스타크(Dean-Stark) 장치에서 환류시켰다. 식힌 다음, 용매를 증발시키고, 포화 수성 NaHCO3 용액 300 mL를 가하였다. 당해 혼합물을 MTBE 200 mL로 3회 추출하였다. 배합된 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 증발시켰다. 용리액으로서 에틸 아세테이트/헵탄(10:90 → 25:75)을 사용하여 생성물을 실리카 340 g 상에서 2회 정제하였다. 용리액을 증발시키고, 잔여물을 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 25.8 g(46%) 무색 오일 2a.
MS: m/z 279.16 = [M+H]+(계산치 = 279.16).
화합물 2b의 합성을 위하여, 아젤라산 모노벤질 에스테르 2a(3.90 g, 14.0 mmol) 및 PEG 10000(40.0 g, 4.00 mmol)를 디클로로메탄 64 mL에 용해시키고, 빙욕으로 냉각시켰다. 디클로로메탄 32 mL 중의 DCC(2.89 g, 14.0 mmol) 및 DMAP(0.024 g, 0.020 mmol)를 가하였다. 빙욕을 제거하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 수득된 현탁액을 0℃로 냉각시키고, 고체를 여과로 제거하였다. 용매를 진공하에 증발시켰다.
잔여물을 디클로로메탄 65 mL에 용해시키고, 실온에서 MTBE 308 mL로 희석하였다. 혼합물을 밤새 -20℃에서 저장하였다. 침전물을 유리 필터 Por. 3을 통해 여과로 수집하고, 차가운 MTBE(-20℃) 250 mL로 세척하였다. 생성물을 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 40.8 g(97%) 백색 분말 2b.
MS: m/z 835.50 = [M+14H]14+(계산치 = 835.56).
화합물 2c의 합성을 위하여, 화합물 2b(40.6 g, 3.86 mmol)를 메틸 아세테이트(250 mL)에 용해시키고, 차콜 상 팔라듐 203 mg을 가하였다. 상온의 수소 대기하에, 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과액을 증발시키고, 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 37.2 g(93%) 유리질 고체 2c.
MS: m/z 882.53 = [M+13H]13+(계산치 = 882.51).
화합물 2d의 합성을 위하여, 화합물 2c(32.0 g, 3.10 mmol) 및 TSTU(3.73 g, 12.4 mmol)를 디클로로메탄 150 mL에 실온에서 용해시켰다. 그 다음, DIPEA(1.60 g, 12.4 mmol)를 가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 수득된 현탁액을 여과하고, 여과액을 디클로로메탄 170 mL로 희석시키고, 물 750 g/NaCl 197 g/NaOH 3 g의 용액 140 mL로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 용매를 진공하에 증발시켰다.
잔여물을 톨루엔 200 mL에 용해시키고, MTBE 180 mL로 실온에서 희석하고, 밤새 -20℃에서 저장하였다. 침전물을 유리 필터 Por. 3을 통해 여과로 수집하고, 차가운 MTBE(-20℃) 100 mL로 세척하였다. 생성물을 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 28.8 g(88%) 백색 분말 2d.
MS: m/z 795.47 = [M+15H]15+(계산치 = 795.54)
하기 반응식에 따라 가교결합제 시약 2g를 아젤라산 모노벤질 에스테르 및 PEG6000로부터 제조하였다:
Figure 112015045066876-pct00116
화합물 2e의 합성을 위하여, 아젤라산 모노벤질 에스테르 2a(6.50 g, 23.3 mmol) 및 PEG 6000(40.0 g, 6.67 mmol)를 디클로로메탄 140 mL에 용해시키고, 빙욕으로 냉각시켰다. 디클로로메탄 40 mL 중의 DCC(4.81 g, 23.3 mmol) 및 DMAP(0.040 g, 0.33 mmol) 용액을 가하였다. 빙욕을 제거하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 수득된 현탁액을 0℃로 냉각시키고, 고체를 여과로 제거하였다. 용매를 진공하에 증발시켰다.
잔여물을 디클로로메탄 70 mL에 용해시키고, MTBE 300 mL로 실온에서 희석하였다. 혼합물을 밤새 -20℃에서 저장하였다. 침전물을 유리 필터 Por. 3을 통해 여과로 수집하고, 차가운 MTBE(-20℃) 500 mL로 세척하였다. 생성물을 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 41.2 g(95%) 백색 분말 2e.
MS: m/z 833.75 = [M+8H]8+(계산치 = 833.74).
화합물 2f의 합성을 위하여, 화합물 2e(41.2 g, 6.32 mmol)를 메틸 아세테이트(238 mL) 및 에탄올(40 mL)에 용해시킨 다음, 차콜 상 팔라듐 400 mg을 가하였다. 상온의 수소 대기하에, 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과액을 증발시키고, 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 38.4 g(96%) 유리질 고체 2f.
MS: m/z 750.46 = [M+9H]9+(계산치 = 750.56).
화합물 2g의 합성을 위하여, 화합물 2f(38.2 g, 6.02 mmol) 및 TSTU(7.25 g, mmol)를 디클로로메탄 130 mL에 실온에서 용해시켰다. 그 다음, DIPEA(3.11 g, 24.1 mmol)를 가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 수득된 현탁액을 여과하고, 여과액을 디클로로메탄 100 mL로 희석하고, 물 750 g/NaCl 197 g/NaOH 3 g의 용액 200 mL로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 용매를 진공하에 증발시켰다.
잔여물을 톨루엔 210 mL에 용해시키고, MTBE 430 mL로 실온에서 희석하고, 밤새 -20℃에서 저장하였다. 침전물을 유리 필터 Por. 3을 통해 여과로 수집하고, 차가운 MTBE(-20℃) 450 mL로 세척하였다. 생성물을 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 35.8 g(91%) 백색 분말 2g.
MS: m/z 857.51 = [M+8H]8+(계산치 = 857.51).
하기 반응식에 따라 가교결합제 시약 2k를 이소프로필말론산 모노벤질 에스테르 및 PEG 10000로부터 제조하였다:
Figure 112015045066876-pct00117
이소프로필말론산 모노벤질 에스테르 rac-2h의 합성을 위하여, 이소프로필말론산(35.0 g, 239 mmol), 벤질 알코올(23.3 g, 216 mmol) 및 DMAP(1.46 g, 12.0 mmol)를 아세토니트릴 100 mL에 용해시켰다. 혼합물을 빙욕으로 0℃로 냉각시켰다. 아세토니트릴 150 mL 중의 DCC(49.4 g, 239 mmol) 용액을 15분 내에 0℃에서 가하였다. 빙욕을 제거하고, 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반한 다음, 고체를 여과로 제거하였다. 여과액을 40℃에서 진공하에 증발시키고, 잔여물을 MTBE 300 mL에 용해시켰다. 당해 용액을 포화 수성 NaHCO3 용액 300 mL로 2회 추출한 다음, 배합된 수성상을 6 N 염산을 사용하여 pH = 1-3로 산성화시켰다. 수득된 에멀젼을 MTBE 300 mL로 2회 추출하고, 용매를 증발시켰다. 배합된 유기상을 포화 수성 NaCl 200 mL로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시켰다. 용리액으로서 에틸 아세테이트/헵탄(10:90 → 20:80)을 사용하여 생성물을 실리카 340 g 상에서 정제하였다. 용리액을 증발시키고, 잔여물을 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 9.62 g(17%) 무색 오일 rac-2h.
MS: m/z 237.11 = [M+H]+(계산치 = 237.11).
화합물 2i의 합성을 위하여, 이소프로필말론산 모노벤질 에스테르 rac-2h(945 mg, 4.00 mmol) 및 PEG 10000(10.0 g, 4.00 mmol)를 디클로로메탄 20 mL에 용해시키고, 빙욕으로 냉각시켰다. 디클로로메탄 10 mL 중의 DCC(825 mg, 4.00 mmol) 및 DMAP(6 mg, 0.05 mmol) 용액을 가하였다. 빙욕을 제거하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 수득된 현탁액을 0℃로 냉각시키고, 고체를 여과로 제거하였다. 용매를 진공하에 증발시켰다.
잔여물을 디클로로메탄 20 mL에 용해시키고, 실온에서 MTBE 150 mL로 희석하였다. 혼합물을 밤새 -20℃에서 저장하였다. 침전물을 유리 필터 Por. 3을 통해 여과로 수집하고, 차가운 MTBE(-20℃) 500 mL로 세척하였다. 생성물을 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 9.63 g(92%) 백색 분말 2i.
MS: m/z 742.50 =[M+16H]16+(계산치 = 742.51).
화합물 2j의 합성을 위하여, 화합물 2i(3.38 g, 0.323 mmol)를 메틸 아세테이트(100 mL)에 용해시키고, 차콜 상 팔라듐 105 mg을 가하였다. 상온의 수소 대기하에, 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과액을 증발시키고, 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 3.25 g(98%) 유리질 고체 2j.
MS: m/z 731.25 =[M+16H]16+(계산치 = 731.25).
화합물 2k의 합성을 위하여, 화합물 2j(3.10 g, 0.302 mmol) 및 TSTU(0.364 g, 1.21 mmol)를 실온에서 디클로로메탄 15 mL에 용해시켰다. 그 다음, DIPEA(0.156 g, 1.21 mmol)를 가하고, 혼합물을 45분 동안 교반하였다. 수득된 현탁액을 여과하고, 여과액을 0.5 M 포스페이트 버퍼(pH = 6.5) 10 mL로 2회 세척하였다. 유기상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔여물을 톨루엔 20 mL에 용해시키고, 실온에서 MTBE 10 mL로 희석하고, 밤새 -20℃에서 저장하였다. 침전물을 유리 필터 Por. 3을 통해 여과로 수집하고, 차가운 MTBE(-20℃) 250 mL로 세척하였다. 생성물을 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 2.66 g(84%) 백색 분말 2k.
MS: m/z 743.37 =[M+16H]16+(계산치 = 743.38).
하기 반응식에 따라 가교결합제 시약 rac-2o를 시스-1,4-사이클로헥산디카르복실산 및 PEG 10000로부터 제조하였다:
Figure 112015045066876-pct00118
시스-1,4-사이클로헥산디카르복실산 모노벤질 에스테르 rac-21의 합성을 위하여, 시스-1,4-사이클로헥산디카르복실산(20.0 g, 1 16 mmol), 벤질 알코올(1 1.3 g, 105 mmol) 및 DMAP(710 mg, 5.81 mmol)를 THF 200 mL에 용해시켰다. 혼합물을 빙욕으로 0℃로 냉각시켰다. THF 100 mL 중의 DCC(49.4 g, 239 mmol) 용액을 15분 내에 0℃에서 가하였다. 빙욕을 제거하고, 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반한 다음, 고체를 여과로 제거하였다. 여과액을 40℃에서 증발시키고, 잔여물을 MTBE 300 mL에 용해시켰다. 당해 용액을 포화 수성 NaHCO3 용액 300 mL로 2회 추출한 다음, 배합된 수성상을 6 N 염산을 사용하여 pH = 1-3로 산성화시켰다. 수득된 에멀젼을 MTBE 300 mL로 2회 추출하고, 용매를 증발시켰다. 배합된 유기상을 포화 수성 NaCl 200 mL로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시켰다. 생성물을 용리액으로서 에틸 아세테이트/헵탄(10:90 → 20:80)을 사용하여 실리카 340 g 상에서 정제하였다. 용리액을 증발시키고, 진공하에 밤새 건조시키는 동안 무색 오일 잔여물이 결정화되었다.
수율 4.82 g(16%) 무색 결정 rac-21.
MS: m/z 263.13 =[M+H]+(계산치 = 263.13).
화합물 2m의 합성을 위하여, 시스-1,4-사이클로헥산디카르복실산 모노벤질 에스테르 rac-21(2.10 g, 8.00 mmol) 및 PEG 10000(20.0 g, 10.0 mmol)를 디클로로메탄 50 mL에 용해시키고, 빙욕으로 냉각시켰다. 디클로로메탄 25 mL 중의 DCC(1.65 g, 8.00 mmol) 및 DMAP(0.012 g, 0.10 mmol) 용액을 가하였다. 빙욕을 제거하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 수득된 현탁액을 0℃로 냉각시키고, 고체를 여과로 제거하였다. 용매를 진공하에 증발시켰다.
잔여물을 디클로로메탄 55 mL에 용해시키고, 실온에서 MTBE 300 mL로 희석하였다. 혼합물을 밤새 -20℃에서 저장하였다. 침전물을 유리 필터 Por. 3을 통해 여과로 수집하고, 차가운 MTBE(-20℃) 250 mL로 세척하였다. 생성물을 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 18.2 g(87%) 백색 분말 2m.
MS: m/z 745.76 =[M+16H]16+(계산치 = 745.77).
화합물 2n의 합성을 위하여, 화합물 2m(9.00 g, 0.857 mmol)을 메틸 아세테이트(100 mL)에 용해시키고, 차콜 상 팔라듐 157 mg을 가하였다. 상온의 수소 대기하에, 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과액을 증발시키고, 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 8.83g(100%) 유리질 고체 2n.
MS: m/z 734.50 =[M+16H]16+(계산치 =734.50).
화합물 2o의 합성을 위하여, 화합물 2n(8.92 g, 0.864 mmol) 및 TSTU(1.04 g, 3.64 mmol)를 실온에서 디클로로메탄 35 mL에 용해시켰다. 그 다음, DIPEA(0.447 g, 3.46 mmol)를 가하고, 혼합물을 45분 동안 교반하였다. 수득된 현탁액을 여과하고, 여과액을 0.5 M 포스페이트 버퍼(pH = 6.5) 10 mL로 2회 세척하였다. 유기상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 용매를 진공하에 증발시켰다.
잔여물을 톨루엔 50 mL에 용해시키고, 실온에서 MTBE 25 mL로 세척하고, 밤새 -20℃에서 저장하였다. 침전물을 유리 필터 Por. 3을 통해 여과로 수집하고, 차가운 MTBE(-20℃) 400 mL로 세척하였다. 생성물을 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 7.62 g(84%) 백색 분말 2o.
MS: m/z 702.60 = [M+16H]16+(계산치 = 702.59).
실시예 3
유리 아미노 기를 함유하는 하이드로겔 비드 3a, 3b, 3c, 및 3d의 제조
배플이 장착된, 직경 60 mm의 하부 유출구가 있는 실린더형 250 mL 반응기에서, 운데칸 100 mL 중의 키트롤™ DPHS 218 mg 에멀젼을 580 rpm으로 상온에서 직경 50 mm의 이소젯 교반기로 교반하였다. DMSO 22.1 g 중의 1a 250 mg 및 2d 2205 mg 용액을 가하고, 10분 동안 실온에서 교반하여 현탁액을 형성하였다. TMEDA 1.1 mL를 가하여 중합을 야기하였다. 혼합물을 16시간 동안 교반하였다. 아세트산 1.7 mL를 가한 다음, 10분 후, 물 중의 염화나트륨 15중량% 용액 100 mL를 가하였다. 10분 후, 교반기를 중단하고, 상이 분리되도록 두었다. 2시간 후, 하이드로겔을 함유하는 수성상을 제거하였다.
비드 크기 분별을 위하여, 물-하이드로겔 현탁액을 에탄올 40 mL로 희석하고, 레츠(Retsch) AS200 컨트롤 체질기를 사용하여 125, 100, 75, 63, 50, 40, 및 32 ㎛ 강철 체에서 15분 동안 습윤-체질하였다. 체질 진폭은 1.5 mm, 수류는 300 mL/분이었다. 63 및 75 ㎛ 체에 보유된 비드 분획을 모으고, 0.1% AcOH로 3회, 에탄올로 10회 세척하고, 16시간 동안 0.1 mbar에서 건조시켜 3a 670 mg을 백색 분말로서 수득하였다.
하이드로겔의 아미노 기 함량은 하이드로겔 상에서 유리 아미노 기에 Fmoc-아미노산의 컨쥬게이션 및 후속적인 Fmoc-측정에 따르면 0.145 mmol/g으로 측정되었다.
1a 350 mg, 2g 2548 mg, DMSO 26.1 g, 키트롤™ DPHS 257 mg, TMEDA 1.5 mL, 및 아세트산 2.4 mL의 사용을 제외하고 3a에 대하여 기재된 바와 같이 3b를 제조하여, 백색 분말로서 3b 550 mg, 유리 아미노 기 0.120 mmol/g을 수득하였다.
1a 250 mg, rac-2k 3019 mg, DMSO 32.7 g, 키트롤™ DPHS 290 mg, TMEDA 1.1 mL, 및 아세트산 1.7 mL의 사용을 제외하고 3a에 대하여 기재된 바와 같이 3c를 제조하여, 백색 분말로서 3c 770 mg, 유리 아미노 기 0.126 mmol/g을 수득하였다.
1a 250 mg, rac-2o 2258 mg, DMSO 22.6 g, 키트롤™ DPHS 222 mg, TMEDA 1.1 mL, 및 아세트산 1.7 mL의 사용을 제외하고 3a에 대하여 기재된 바와 같이 3d를 제조하여, 백색 분말로서 3d 186 mg, 유리 아미노 기 0.153 mmol/g를 수득하였다.
실시예 4
링커 시약 4c의 합성
하기 반응식에 따라 링커 시약 4c를 합성하였다:
Figure 112015045066876-pct00119
4a의 합성:
Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH(1.00 g, 2.43 mmol)를 DCC(0.70 g, 3.33 mmol)와 함께 DCM(25 mL)에 용해시켰다. 순수 옥시마(0.51 g, 3.58 mmol) 및 콜리딘(0.50 mL, 3.58 mmol)을 한번에 가하고, DCM(15 mL) 중의 N-Boc-에틸렌디아민(0.41 g, 2.56 mmol) 용액을 천천히 가하였다. 혼합물을 90분 동안 실온에서 교반한 후, 형성된 침전물을 여과로 제거하고, 여과액을 수성 HCl(0.1 M, 50 mL)로 세척하였다. 수성층을 DCM(2 × 20 mL)으로 추출하고, 배합된 유기 분획을 포화 수성 NaHCO3(3 × 25 mL) 및 염수(1 × 50 mL)로 세척하고, Na2S04 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축시켰다. 조악한 고체를 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다. 중간체 N-boc-N'-(N-fmoc-4-3급-부틸-L-아스파르토일)-에틸렌디아민을 백색 고체(0.98 g, 1.77 mmol, 73%)로서 수득하였다.
MS: m/z 554.29 = [M+H]+, (계산치 = 554.29).
N-boc-N'-(N-fmoc-4-3급-부틸-L-아스파르토일)-에틸렌디아민(0.98 g, 1.77 mmol)을 THF(15 mL)에 용해시키고, DBU(0.31 mL)를 가하고, 용액을 12분 동안 실온에서 교반하였다. 반응을 AcOH(0.5 mL)로 켄칭시키고, 진공하에 농축하고, 잔여물을 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 4a(2 단계에 걸쳐 0.61 g, 1.77 mmol, 73%)를 백색 고체로서 수득하였다.
MS: m/z 332.38 = [M+H]+, (계산치 = 332.22).
4b의 합성:
6-아세틸티오헥산산(0.37 g, 1.95 mmol)을 DCM(19.5 mL)에 용해시키고, 순수 옥시마(0.35 g, 2.48 mmol) 및 DCC(0.40 g, 1.95 mmol)를 한번에 가하였다. 용액을 30분 동안 실온에서 교반하고, 여과하고, 여과액을 DCM(10.5 mL) 중의 4a(0.61 g, 1.77 mmol) 용액에 가하였다. DIPEA(0.46 mL, 2.66 mmol)를 용액에 가하고, 반응을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 용액을 수성 H2SO4(0.1 M, 2 × 30 mL), 포화 수성 NaHCO3(2 × 20 mL) 및 염수(1 × 20 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2S04 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축시켰다. 조악한 물질을 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 N-boc-N'-(N-6-아세틸티오헥실-4-3급-부틸-L-아스파르토일)-에틸렌디아민(2 단계에 걸쳐 0.65 g, 1.30 mmol, 73%)을 백색 고체로서 수득하였다.
MS: m/z 504.27 = [M+H]+, (계산치 = 504.28).
N-boc-N'-(N-6-아세틸티오헥실-4-3급-부틸-L-아스파르토일)-에틸렌디아민(0.60 g, 1.18 mmol)을 TFA(5 mL)에 용해시키고, TES(0.13 mL) 및 물(0.13 mL)을 가하였다. 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반하였다. TFA를 N2 스트림하에 제거하고, 조악한 4b를 H2O/ACN 1:1에 용해시키고, RP-HPLC로 정제하였다.
수율: 0.39 g, 0.85 mmol(TFA 염), 72%.
MS: m/z 348.25 = [M+H]+, (계산치 = 348.16).
4c의 합성:
4b(TFA 염, 0.38 g, 0.80 mmol)를 DMF(5 mL)에 용해시키고, (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔-4-일)-메틸 4-니트로페닐 카르보네이트(0.26 g, 0.88 mmol) 및 DIPEA(0.28 mL, 1.6 mmol)를 가하였다. 수득된 현탁액을 DCM(5 mL)로 희석하고, 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 추가의 DIPEA(0.28 mL 1.6 mmol)를 가하고, 2시간 동안 계속 교반하였다. DCM을 진공하에 농축시키고, 잔여물을 H2O/ACN 3:1로 희석하고, RP-HPLC로 정제하여 N-(5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔-4-일)-메틸-옥소카르보닐-N'-(N-6-아세틸티오헥실-L-아스파르틸)-에틸렌디아민(0.31 g, 0.62 mmol, 77%)을 무색 오일로서 수득하였다.
MS: m/z 504.16 = [M+H]+, (계산치 = 504.17).
N-(5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔-4-일)-메틸 옥소카르보닐-N'-(N-6-아세틸티오헥실-L-아스파르틸)-에틸렌-디아민(150 mg, 0.30 mmol)을 DCM(17.5 mL) 및 NHS(41 mg, 0.36 mmol)에 용해시키고, DCC(74 mg, 0.36 mmol) 및 DMAP(4 mg, 0.03 mmol)를 한번에 가하였다. 반응을 1시간 동안 실온에서 교반하고, 수득된 현탁액을 여과하였다. 침전물을 소량의 DCM로 세척하고, 배합된 여과액을 진공하에 농축시켰다. 4c를 RP-HPLC로 정제하여 무색 오일(144 mg, 0.24 mmol, 80%)을 수득하였다.
MS: m/z 601.18 = [M+H]+, (계산치 = 601.18).
실시예 5
말레이미드 작용화된 하이드로겔 비드 5a의 제조
무수 하이드로겔 비드 3a 259.3 mg을 15분 동안 NMP 중의 1% n-프로필아민 10 mL에서 배양하고, 후속적으로 NMP 중의 1% n-프로필아민으로 2회 세척하고, NMP 중의 2% DIPEA로 2회 세척하였다. 말레이미드-NH-PEG12-PFE 171 mg을 NMP 1 mL에 용해시키고, 세척된 하이드로겔 비드 3a에 가하였다. 하이드로겔 현탁액을 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 수득된 말레이미드 작용화된 하이드로겔 비드 5a를 NMP, 그 다음, 20 mM 석시네이트, 1 mM Na2EDTA, 0.01% 트윈20, pH 3.0, 그 다음, 물, 그 다음, 0.1% 아세트산, 0.01% 트윈20으로 각각 5회 세척하였다.
3b, 3c, 및 3d를 사용하여 이에 따라 말레이미드 작용화된 하이드로겔 비드 5b, 5c, 및 5d를 제조하였다.
실시예 6
일시적인 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 6c의 합성
루센티스(하기 반응식에서 루센티스-NH2로 기재됨)(10 mM 히스티딘, 10중량% α,α-트레할로스, 0.01% 트윈20, pH 5.5 중의 10 mg/mL 루센티스 460 ㎕) 4.6 mg을 10 mM 인산나트륨, 2.7 mM 염화칼륨, 140 mM 염화나트륨, pH 7.4로 버퍼 교환하고, 루센티스의 농도를 16.4 mg/mL로 조절하였다. 링커 시약 4c 6 mg을 DMSO 100㎕에 용해시켜 100 mM의 농도를 수득하였다. 루센티스의 양에 대하여 1 몰당량의 링커 시약 4c를 루센티스 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 조심스럽게 혼합하고, 5분 동안 실온에서 배양하였다. 후속적으로, 추가의 링커 시약 4c 2 몰당량을 단계당 1 몰당량 씩 루센티스 용액에 가하고, 각 당량 첨가 후, 반응 혼합물을 5분 동안 실온에서 배양하여 개질되지 않은 루센티스와 보호된 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 6a의 혼합물을 수득하였다.
1 M 시트르산나트륨, pH 5.0를 가하여 반응 혼합물의 pH를 pH 6.5으로 조절하고, Na2EDTA를 최종 농도 5 mM가 되도록 가하였다. 6a의 보호기를 제거하기 위하여, 0.5 M NH2OH(10 mM 시트르산나트륨, 140 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, pH 6.5에 용해됨)를 최종 농도 45 mM가 되도록 가하고, 탈보호화 반응을 실온에서 4시간 동안 배양하여 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 6b를 수득하였다. 루센티스와 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 6b의 혼합물을 10 mM 인산나트륨, 2.7 mM 염화칼륨, 140 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, 0.01% 트윈20, pH 6.5로 버퍼 교환하고, 2종의 루센티스의 전체 농도를 11.8 mg/mL로 조절하였다. ESI-MS에 의해 측정된 바, 혼합물 중의 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 6b 함량은 20%이었다.
10 mM 인산나트륨, 2.7 mM 염화칼륨, 140 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, 0.01% 트윈20, pH 6.5 중의 루센티스/루센티스-링커 모노컨쥬게이트 6b 혼합물 4 mg을 말레이미드 작용화된 하이드로겔 비드 5a 1 mg에 가하고, 밤새 실온에서 배양하여 일시적인 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 6c를 수득하였다.
Figure 112015045066876-pct00120
실시예 7
시험관내 방출 역학 - 시험관내 반감기 측정
루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 6c(루센티스 약 1 mg 함유)를 60 mM 인산나트륨, 3 mM Na2EDTA, 0.01% 트윈20, pH 7.4로 5회 세척하고, 최종적으로 상기 언급된 버퍼 1 mL에 현탁하였다. 현탁액을 37℃에서 배양하였다. 현탁액의 버퍼를 상이한 시간 간격 후 교환하고, 220 nm에서 HPLC-SEC로 분석하였다. 유리된 루센티스에 해당하는 피크를 통합하고, 유리된 루센티스 전체를 총 배양 시간에 대해 플롯팅하였다. 곡선 맞춤 소프트웨어를 적용하여 1차 쪼개짐률을 측정하였다.
실시예 8
링커 시약 8e의 합성
하기 반응식에 따라 링커 시약 8e를 합성하였다:
Figure 112015045066876-pct00121
MeOH(20 mL, 무수) 중의 N-Boc-에틸렌디아민(2.08 g, 12.98 mmol) 및 NaCNBH3(775 mg, 12.33 mmol) 용액에, 무수 MeOH/DCM(1:1 v/v) 40 mL 중의 2,4,6-트리메톡시벤즈알데하이드(2.29 g, 11.68 mmol) 용액을 2시간 동안 주사기 펌프를 통해 가하였다. 혼합물을 90분 동안 교반하고, 0.4M HCl(60 mL)로 산성화시키고, 15분 동안 추가로 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(5 ×)로 추출하였다. 배합된 유기상을 포화 NaHCO3 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공하에 제거하고, 잔여물을 고진공하에(< 0.1 mbar) 건조시켰다. 조악한 N-Boc-N'-Tmob-에틸렌디아민 8a를 다음 반응 단계에서 추가의 정제 없이 사용하였다. 수율: 무색 고체 3.70 g(10.87 mmol, 84%). MS: m/z 341.21 = [M+H]+, (계산치 = 341.21).
DCM(40 mL, 무수, 분자체) 중의 8a(1.7 g, 4.99 mmol)를 DCM(40 mL, 무수, 분자체) 중의 DCC(1.34 g, 6.50 mmol), 순수 옥시마(995 mg, 7.00 mmol), Fmoc-L-Asp(OBn)-OH(2.22 g, 4.98 mmol) 및 2,4,6-콜리딘(1.24 mL, 9.53 mmol) 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 침전물을 여과로 제거하고, 여과액을 0.1M HCl, 포화 NaHCO3 및 염수로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 진공하에 제거하였다. 조악한 물질을 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 8b(3.19 g, 4.15 mmol, 83%)를 회백색 고체로서 수득하였다. MS: m/z 768.35 = [M+H]+, (계산치 = 768.35).
THF(98 mL) 중의 8b(8.59 g, 11.19 mmol) 용액에 DBU(2 mL)를 가하였다. 용액을 12분 동안 실온에서 교반하고, 용매를 진공하에 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그래피로 8c(8,96 mmol, 80%) 4.89 g을 수득하였다. MS: m/z 546.28 = [M+H]+, (계산치 = 546.28).
6-트리틸머캅토헥산산(2.04 g, 5.22 mmol)을 DCM(20 mL, 무수, 분자체)에 용해시키고, DCC(1.08 g, 5.22 mmol) 및 순수 옥시마(945 mg, 6,65 mmol)를 가하였다. 30분 후, 8c(2.59 g, 4.75 mmol) 및 DIPEA(1.24 mL, 7.12 mmol)를 가하였다. 반응 혼합물을 22시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 1 N H2SO4(2 ×), 포화 NaHCO3(2 ×) 및 염수로 추출하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공하에 농축시키고, 8d를 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다. 수율: 4.10 g(4.47 mmol, 94%). MS: m/z 940.12 = [M+Na]+, (계산치 = 940.43).
i-PrOH(60 mL) 중의 8d(4.10 g, 4.47 mmol) 용액에 물(20 mL) 및 LiOH(322 mg, 13.41 mmol)를 가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 톨루엔(300 mL)을 가하고, 유기상을 0.1 N HCl 및 염수로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축시켰다. 8e를 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다. 수율: 3.53 g(4.26 mmol, 95%). MS: m/z 827.93 = [M+H]+, (계산치 = 828.39).
실시예 9
링커 시약 9c의 합성
하기 반응식에 따라 링커 시약 9c를 합성하였다:
Figure 112015045066876-pct00122
8e(300 mg, 0.36 mmol)를 HFIP/물/TES(39:1:1 v/v/v, 4.1 mL)에 용해시켰다. 교반하에 TFA(0.35 mL)를 가하고, 반응을 75분 동안 교반하였다. 용매를 아르곤 스트림하에 증발시켰다. 잔여물을 물(20 mL) 및 DCM(40 mL)으로 분할하였다. 수성상을 수집하고, DCM 상을 물(5 mL)로 세척하고, 두 수성상을 배합하였다. 수득된 용액의 pH를 pH 7.4 인산나트륨 버퍼(0.5 M, 5 mL)로 조절하고, 2,2'-디티오디피리딘 용액 1 mL를 가하고, 수득된 현탁액을 30분 동안 교반하였다. 혼합물을 동결건조하고, 잔여물을 ACN/물(7:3 v/v, 9 mL)에 현탁시키고, 여과하였다. 여과액을 RP-HPLC로 정제하여 9a를 수득하였다. 수율: 90 mg, 0.17mmol(TFA 염), 47%, MS: m/z 415.25 = [M+H]+, (계산치 = 415.15).
9a(90 mg, 0.17 mmol)를 DCM(1.2 mL) 중에 용해시키고, (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔-4-일)-메틸 4-니트로페닐 카르보네이트(138 mg, 0.47 mmol) 및 2,4,6-콜리딘(129 ㎕, 0.98 mmol)을 교반하에 가하였다. DMF(1 mL)를 가하여 형성된 침전물의 용해를 촉진시켰다. 2시간 및 8시간 후, DIPEA(각각, 19 ㎕, 0.11 mmol)를 가하고, 반응을 48시간 동안 교반하였다. 반응을 AcOH(38 ㎕)로 켄칭시키고, 질소 스트림하에 DCM을 증발시켰다. 잔여물을 ACN/물/TFA(1:1:0.002 v/v/v)로 희석하고, RP-HPLC로 정제하여 9b를 수득하였다. 수율: 64 mg, 0.11 mmol, 65%, MS: m/z 571.09 = [M+H]+, (계산치 = 571.15).
9b(32 mg, 56 μmol)를 DCM에 용해시켰다. 교반하에 NHS(8 mg, 67 μmol), DCC(14 mg, 67 μmol) 및 DMAP(0.7 mg, 6 mmol)를 가하였다. 반응을 교반하고, 1.5시간 및 3.5시간 후, DCC를 가하였다(각각, 3.5 mg, 11 μmol 및 2.3 mg, 7 μmol). 아르곤 스트림하에 용매를 증발시키고, 잔여물을 물/ACN/TFA(1:9:0.01 v/v/v, 3 mL)에 현탁시키고, 여과하였다. 여과액을 RP-HPLC로 정제하여 9c(28 mg, 42 μmol, 75%)를 수득하였다. MS: m/z 668.17= [M+H]+, (계산치 = 668.17).
실시예 10
링커 시약 10f의 합성
하기 반응식에 따라 링커 시약 10f를 합성하였다:
Figure 112015045066876-pct00123
Fmoc-N-Me-L-Asp(OtBu)-OH(1 g, 2.35 mmol)를 DCM(35 mL)에 용해시키고, DCC(0.68 g, 3.29 mmol), 순수 옥시마(0.5 g, 3.53 mmol) 및 2,4,6-콜리딘(0.49 mL, 3.76 mmol)를 가하였다. N-Boc-N-메틸-에틸렌디아민을 DCM(15 mL)에 용해시키고, 주사기로 반응 혼합물에 천천히 가하였다. 반응을 16시간 동안 교반하고, 침전물을 여과로 제거하고, 0.1M HCl(50 mL)로 여과하였다. 수성층을 DCM(20 mL)로 2회 재추출하였다. 유기층을 배합하고, 포화 중탄산나트륨 용액(1 × 50 mL, 2 × 25 mL) 및 염수(1 × 50 mL)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공하에 농축시키고, 10a를 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다. 수율: 1.36 g(2.33 mmol, 99%). MS: m/z 582.32 = [M+H]+, (계산치 = 582.32).
10a(1.36 g, 2.33 mmol)를 THF(20 mL)에 용해시키고, DBU(0.4 mL)를 가하고, 반응을 12분 동안 교반하였다. AcOH(0.5 mL)를 가하고, 혼합물을 진공하에 농축시키고, 10b를 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다. 수율: 0.82 g(2.28 mmol, 98%). MS: m/z 360.25 = [M+H]+, (계산치 = 360.25).
6-아세틸머캅토헥산산(0.49 g, 2.58 mmol)을 DCM(25 mL) 및 DCC(0.53 g, 2.58 mmol)에 용해시키고, 순수 옥시마(0.47 g, 3.19 mmol)를 가하였다. 반응을 45분 동안 교반하고, 프릿이 있는 주사기를 사용하여 DCM(12 mL) 중의 10b(0.82 g, 2.28 mmol) 용액 내로 여과하였다. DIPEA(0.61 mL, 3.42 mmol)를 가하고, 반응을 교반하였다. 불충분한 전환 때문에, 순수 옥시마(0.2 g, 1.4 mmol) 및 DIPEA(0.25 mL, 1.4 mmol)를 가하고, 반응을 16시간 동안 교반하였다. 불충분한 전환 때문에, 6-아세틸머캅토헥산산(0.49 g, 2.58 mmol), DCC(0.53 g, 2.58 mmol) 및 순수 옥시마(0.47 g, 3.19 mmol)를 30분 동안 교반하고, 반응 내로 여과하였다. DIPEA(0.6 mL, 3.42 mmol)를 가하고, 반응을 2.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0.1 M H2SO4(20 mL), 포화 중탄산나트륨 용액(2 × 20 mL) 및 염수(20 mL)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공하에 농축시키고, 10c를 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다. 수율: 0.74 g(1.39 mmol, 60%). MS: m/z 532.30 = [M+H]+, (계산치 = 532.31).
10c(0.74 g, 1.39 mmol)를 TFA/TES/물(95:2.5:2.5 v/v/v, 5.25 mL)에 용해시키고, 30분 동안 교반하였다. 혼합물을 진공하에 농축시키고, RP-HPLC로 정제하여 10d(0.38 g, 0.78 mmol, 56%)를 수득하였다. MS: m/z 376.19= [M+H]+, (계산치 = 376.19).
10d(0.38 g, 0.78 mmol)를 DCM(7 mL)에 용해시키고, (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔-4-일)-메틸 4-니트로페닐 카르보네이트(0.35 g, 1.17 mmol) 및 2,4,6-콜리딘(0.45 mL, 3.51 mmol)을 가하고, 반응을 교반하였다. 1시간 후, 2,4,6-콜리딘(0.2 mL, 1.56 mmol)을 가하고, 반응을 20시간 동안 교반하였다. 반응을 진공하에 농축시키고, RP-HPLC로 정제하여 10e(0.26 g, 0.49 mmol, 63%)를 수득하였다. MS: m/z 532.20= [M+H]+, (계산치 = 532.20).
10e(0.26 g, 0.49 mmol)를 DCM(3.6 mL) 및 DCC(0.12 g, 0.59 mmol)에 용해시키고, NHS(68 mg, 0.59 mmol) 및 DMAP(6 mg, 0.05 mmol)를 가하였다. 반응을 1시간 동안 교반하였다. 수득된 현탁액을 여과하고, 침전물을 DCM(2 mL)으로 세척하였다. 여과액을 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 10f를 백색 폼으로서 수득하였다. 수율: 0.27 g(0.43 mmol, 87%). MS: m/z 629.21 = [M+H]+, (계산치 = 629.21).
실시예 11
링커 시약 11d의 합성
하기 반응식에 따라 링커 시약 11d를 합성하였다:
Figure 112015045066876-pct00124
2-클로로트리틸클로라이드 수지(1.4 mmol/g, 357 mg, 0.5 mmol)를 프릿이 있는 10 mL 주사기로 중량측정하여 넣었다. 수지를 DCM 2 mL로 2회 팽창시켰다. N-Fmoc-N-메틸-L-아스파르테이트(OtBu)-OH(532 mg, 1.25 mmol) 및 DIPEA(305 ㎕, 1.75 mmol)를 DCM(3 mL)에 용해시키고, 주사기로 흡입하였다. 주사기를 1시간 동안 아지테이팅하였다. MeOH(0.5 mL)를 주사기로 흡입하고, 주사기를 30분 동안 아지테이팅하였다. 수지를 DCM(4 mL)으로 5회 세척하고 DMF(4 mL)로 5회 세척하였다. 수지를 DMF:DBU:피페리딘(96:2:2 v/v/v, 4 mL)로 5분 동안 3회 아지테이팅하였다. 수지를 DMF(4 mL)로 5회 세척하였다. 6-트리틸머캅토헥산산(488 mg, 1.25 mmol) 및 HATU(475 mg, 1.25 mmol)를 DMF(3 mL)에 용해시키고, DIPEA(436 ㎕, 2.5 mmol)를 가하였다. 전배양 1분 후, 용액을 주사기로 흡입하고, 주사기를 1분 동안 아지테이팅하였다. 수지를 DMF(4 mL)로 5회 세척하고, DCM(4 mL)로 5회 세척하고, MeOH(4 mL)로 2회 세척하고, 진공하에 건조시켰다. HFIP/TES/아세트산(90/5/5 v/v/v, 각각 3 mL) 용액을 주사기로 흡입하고, 주사기를 30분 동안 2회 아지테이팅하였다. 수집된 여과액의 용매를 질소 스트림하에 증발시켰다. 잔여물을 ACN/물(1:1 v/v, 5 mL)에 현탁시키고, 여과로 제거하였다. ACN(0.5 mL) 중의 2,2'-디티오디피리딘(220 mg, 1 mmol)을 여과액에 가하였다. pH 7.4 인산나트륨 버퍼(0.5 M, 1.2 mL)로 반응 pH를 7로 조절하고, 15분 동안 교반하였다. 생성물을 RP-HPLC로 직접 정제하여 11a(117 mg, 0.27 mmol, 53%)를 수득하였다. MS: m/z 443.30 = [M+H]+, (계산치 = 443.17).
11a(117 mg, 0.27 mmol)를 DCM(2.4 mL)에 용해시켰다. PyBOP(166 mg, 0.32 mmol), DIPEA(185 ㎕, 1.06 mmol) 및 N-Boc-N-메틸에틸렌디아민(57 ㎕, 0.32 mmol)를 가하고, 반응을 45분 동안 교반하였다. 아세트산(185 ㎕)을 가하고, 용매를 질소 스트림하에 제거하였다. 잔여물을 ACN/물/TFA(2:1:0.003 v/v/v)에 용해시키고, RP-HPLC로 정제하여 11b(135 mg, 0.23 mmol, 85%)를 수득하였다. MS: m/z 599.27 = [M+H]+, (계산치 = 599.29).
11b(135 mg, 0.23 mmol)를 TFA/TES/물(95:2.5:2.5 v/v/v, 5 mL)에 용해시켰다. 15분 후, 용매를 질소 스트림하에 증발시켰다. 잔여물을 ACN/물 1:1로 희석하고, 동결건조하였다. 잔여물을 DCM(1.5 mL)에 용해시키고, (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔-4-일)-메틸 4-니트로페닐 카르보네이트(80 mg, 0.27 mmol)를 가하였다. 교반하에 반응이 담황색을 유지할 때까지 DIPEA(78 ㎕, 0.46 mmol)를 천천히 가하였다. 추가의 DIPEA(39 ㎕, 0.23 mmol)를 가하고, 반응을 1시간 동안 교반하였다. DIPEA(20 ㎕, 0.12 mmol) 첨가 후, 반응을 30분 동안 교반하였다. 아세트산(140 ㎕)을 가하고, 용매를 질소 스트림하에 제거하였다. 잔여물을 ACN/물/TFA(1:1:0.002 v/v/v, 3 mL)로 희석하고, RP-HPLC로 정제하여 11c(69 mg, 0.12 mmol, 51%)를 수득하였다. MS: m/z 599.19 = [M+H]+, (계산치 = 599.19).
11c(69 mg, 0.12 mmol)를 DCM 및 NHS(16 mg, 0.14 mmol)에 용해시키고, DCC(29 mg, 0.14 mmol) 및 DMAP(1.4 mg, 0.012 mmol)를 가하고, 반응을 75분 동안 교반하였다. 용매를 질소 스트림하에 증발시키고, 잔여물을 ACN/물/TFA(1:1:0.002 v/v/v, 3.5 mL)에 현탁하고, 여과하였다. 여과액을 RP-HPLC로 정제하여 11d(60 mg, 0.09 mmol, 75%)를 수득하였다. MS: m/z 696.20 = [M+H]+, (계산치 = 696.20).
실시예 12
링커 시약 12e의 합성
하기 반응식에 따라 링커 시약 12e를 합성하였다:
Figure 112015045066876-pct00125
MeOH(20 mL) 중의 N-Boc-N-메틸에틸렌디아민(2 g, 11.48 mmol) 및 NaCNBH3(819 mg, 12.63 mmol) 용액에 2,4,6-트리메톡시벤즈알데하이드(2.08mg, 10.61 mmol)를 나누어 가하였다. 혼합물을 실온에서 90분 동안 교반하고, 3M HCl(4 mL)로 산성화시키고, 15분 동안 추가로 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액(200 mL)에 가하고, CH2Cl2로 5회 추출하였다. 배합된 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 수득된 N-Boc-N-메틸-N'-tmob-에틸렌디아민(12a)을 고진공하에 완전히 건조시키고, 다음 반응 단계에서 추가의 정제 없이 사용하였다. 수율: 3.76 g(11.48 mmol, 89% 순도, 12a: 이중 Tmob 보호된 생성물 = 8:1). MS: m/z 355.22 = [M+H]+, (계산치 = 355.23).
CH2Cl2(24 mL) 중의 12a(2 g, 5.65 mmol) 용액에 COMU(4.84 g, 11.3 mmol), N-Fmoc-N-메틸-L-Asp(OBn)-OH(2.08 g, 4.52 mmol) 및 2,4,6-콜리딘(2.65 mL, 20.34 mmol)을 가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 실온에서 교반하고, CH2Cl2(250 mL)로 희석하고, 0.1 M H2SO4(100 mL)로 3회 세척하고 염수(100 mL)로 3회 세척하였다. 수성상을 CH2Cl2(100 mL)로 재추출하였다. 배합된 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 잔여물을 용적 24 mL로 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 12b를 정제하였다. 수율: 5.31 g(148%, 6.66 mmol) MS: m/z 796.38 = [M+H] , (계산치 = 796.38).
THF(60 mL) 중의 12b[5.31 g, N-Fmoc-N-Me-L-Asp(OBn)-OH를 참조하여 최대 4.51 mmol] 용액에 DBU(1.8 mL, 3% v/v)를 가하였다. 용액을 12분 동안 실온에서 교반하고, CH2Cl2(400 mL)로 희석하고, 0.1 M H2SO4(150 mL)로 3회 세척하고 염수(150 mL)로 3회 세척하였다. 수성상을 CH2Cl2(100 mL)로 재추출하였다. 배합된 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하였다. 용매를 증발시켜 12c를 단리하고, 다음 반응에서 추가의 정제 없이 사용하였다. MS: m/z 574.31 = [M+H]+, (계산치 = 574.31).
12c(5.31 g, 4.51 mmol, 조물질)를 아세토니트릴(26 mL) 및 COMU(3.87 g, 9.04 mmol)에 용해시키고, 6-트리틸머캅토헥산산(2.12 g, 5.42 mmol) 및 2,4,6-콜리딘(2.35 mL, 18.08 mmol)을 가하였다. 반응 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반하고, CH2Cl2(400 mL)로 희석하고, 0.1 M H2SO4(100 mL)로 3회 세척하고 염수(100 mL)로 3회 세척하였다. 수성상을 CH2Cl2(100 mL)로 재추출하였다. 배합된 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 증발시켜 12d를 단리하였다. 생성물 7i를 플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 수율: 2.63 g(62%, 94% 순도) MS: m/z 856.41 = [M+H]+, (계산치 = 856.42).
i-PrOH(33 mL) 및 H2O(11 mL) 중의 12d(2.63 g, 2.78 mmol) 용액에 LiOH(267 mg, 11.12 mmol)를 가하고, 반응 혼합물을 70분 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 CH2Cl2(200 mL)로 희석하고, 0.1 M H2SO4(50 mL)로 3회 세척하고 염수(50 mL)로 3회 세척하였다. 수성상을 CH2Cl2(100 mL)로 재추출하였다. 배합된 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 증발시켜 12e를 단리하였다. 12e를 플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 수율: 2.1 g(88%) MS: m/z 878.4 = [M+Na]+, (계산치 = 878.40).
실시예 13
링커 시약 13g의 합성
하기 반응식에 따라 링커 시약 13g를 합성하였다:
Figure 112015045066876-pct00126
MeOH(21 mL) 중의 N,N-디메틸에틸렌디아민(441 mg, 5 mmol) 및 NaCNBH3(439 mg, 7 mmol) 용액에 DCM 및 MeOH(17 mL each) 중의 2,4,6-트리메톡시벤즈알데하이드(1.34 g, 6.85 mmol) 용액을 주사기로 가하였다. 혼합물을 실온에서 60분 동안 교반하고, 0.5M HCl(50 mL)로 산성화시키고, 15분 동안 추가로 교반하였다. 1 M NaOH를 가하여 반응 혼합물을 pH > 12로 만들고, 에틸 아세테이트(1 × 100 mL, 3 × 50 mL)로 4회 추출하였다. 배합된 유기상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 수득된 N,N-디메틸-N'-tmob-에틸렌디아민(13a)을 고진공하에 완전히 건조시키고, 다음 반응 단계에서 추가의 정제 없이 사용하였다. 수율: 1.63 g(이중 Tmob 보호된 생성물 함유). MS: m/z 269.19 = [M+H]+, (계산치 = 269.19).
13a(268 mg, 약 0.83 mmol)를 THF(5 mL) 및 2,3-피리딘디카르복실 무수물(149 mg, 1 mmol)에 용해시키고, DIPEA(362 ㎕, 2.08 mmol) 및 DMF(1 mL)를 가하였다. 용액을 15분 동안 교반하고, AcOH(362 ㎕)로 켄칭시키고, THF를 질소 스트림하에 제거하였다. 잔여물을 ACN/물/TFA(1:1:0.002 v/v/v, 4 mL)로 희석하고, RP-HPLC로 정제하여 13b(244 mg, 0.46 mmol, 55%)를 수득하였다. MS: m/z 418.20 =2 [M+H]+, (계산치 = 418.20).
12e(500 mg, 0.58 mmol)를 TFA/TES/DTT/물(85:5:5:5 v/v/v/v, 10 mL)에 용해시키고, 4시간 동안 교반하였다. 용매를 질소 스트림하에 제거하고, 잔여물을 ACN/물에 현탁하고, 여과하였다. 여과액을 RP-HPLC로 정제하여 13c(71 mg, 0.21 mmol, 36%)를 수득하였다. MS: m/z 334.43 = [M+H]+, (계산치 = 334.18).
13c(71 mg, 0.21 mmol)를 ACN/물(1:1, 1 mL)에 용해시키고, ACN/물(1:1, 1 mL, 현탁액) 중의 2,2'-디티오디피리딘(93 mg, 0.42 mmol) 및 pH 7.4 인산나트륨 버퍼(0.5 M, 1 mL)를 가하였다. 수득된 용액을 15분 동안 교반하고, RP-HPLC로 직접 정제하여 13d(64 mg, 0.15 mmol, 68%)를 수득하였다. MS: m/z 443.30 = [M+H]+, (계산치 = 443.18).
13b(91 mg, 0.22 mmol)를 DMF(1 mL)에 용해시키고, PyBOP(113 mg, 0.22 mmol)를 가하였다. DIPEA(50 ㎕, 0.29 mmol)를 가하고, 용액을 15분 동안 교반하였다. 13d(64 mg, 0.145 mmol)를 DCM(1.5 mL)에 용해시키고, DMF 용액에 가하였다. 반응을 100분 동안 교반하고, AcOH(50 ㎕)를 가하였다. DCM을 질소 스트림하에 제거하고, 잔여물을 ACN/물/TFA에 용해시키고, RP-HPLC로 정제하여 13e(26 mg, 31 μmol, 21%)를 수득하였다. MS: m/z 842.14 = [M+H]+, (계산치 = 842.36).
13e(26 mg, 31 μmol)를 HFIP/TES/물(39:1:1 v/v/v, 1 mL)에 용해시키고, 교반하에 TFA(83 ㎕)를 가하였다. 90분 후, 용매를 진공하에 증발시키고, 잔여물을 RP-HPLC로 정제하여 13f(11 mg, 17 μmol, 54%)를 수득하였다. MS: m/z 662.28 = [M+H]+, (계산치 = 662.28).
13f(11 mg, 17 μmol)를 DCM(1.5 mL)에 용해시키고, DCC(4.2 mg, 20 μmol), NHS(2.3 mg, 20 μmol) 및 DMAP(0.2 mg, 1 μmol)를 가하고, 현탁액을 교반하였다. 1시간 및 2시간 후, 상기 언급된 양의 DCC 및 NHS를 다시 가하였다. 3시간 후, 용매를 질소 스트림하에 증발시켰다. 잔여물을 ACN/물/TFA(1:1:0.002, 3 mL)에 현탁시키고, 여과하였다. 여과액을 RP-HPLC로 정제하여 13g(14 mg, 16 μmol(TFA 염), 94%)를 수득하였다. MS: m/z 759.30= [M+H]+, (계산치 = 759.30).
실시예 14
링커 시약 14f의 합성
하기 반응식에 따라 링커 시약 14f를 합성하였다:
Figure 112015045066876-pct00127
DCM(10 mL) 중의 p-모노메톡시트리틸 클로라이드(1.54 g, 5 mmol) 용액을 교반하에 DCM(10 mL) 중의 3-(메틸아미노)프로필아민(4.4 g, 50 mmol) 용액에 천천히 가하였다. 2시간 후, 디에틸 에테르(166 mL)를 가하였다. 염수(100 mL)를 NaOH(4 M, 80 ㎕)와 혼합하고, 반응물을 당해 혼합물(3 × 33 mL)로 세척하였다. 유기층을 염수(30 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 진공하에 농축시켰다. 수율(14a):1.79 g(4.95 mmol, 99%).
14a(0.36 g, 1 mmol)를 THF(7 mL)에 용해시키고, DIPEA(0.44 mL, 2.5 mmol), 및 THF(3 mL) 중의 무수 퀴놀린산(0.18 g, 1.2 mmol) 용액을 교반하에 가하였다. 30분 후, DMF(2mL) 중의 13a(0.54 g, 2 mmol) 용액 및 PyBOP(0.78 g, 1.5 mmol)를 가하고, 반응을 1시간 동안 교반하였다. 반응을 에틸 아세테이트(50 mL)로 희석하고, NaOH(1 M, 20 mL)로 세척하였다. 수성상을 에틸 아세테이트(2 × 20 mL)로 재추출하고, 수집된 유기상을 배합하고, 진공하에 농축시키고, 플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 14b(0.4 g, 0.53 mmol, 53%)를 수득하였다. MS: m/z 760.41 = [M+H]+, (계산치 = 760.41).
14b(0.4 g, 0.53 mmol)를 ACN(3 mL)에 용해시키고, HCl(0.4 M, 3 mL)을 가하고, 용액을 4시간 동안 교반하였다. 반응을 NaOH(1 M, 15 mL)로 켄칭시키고, DCM(5 × 30 mL)로 추출하였다. 배합된 유기상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 진공하에 농축시키고, 14c를 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다. 수율: 0.32 g(0.42 mmol, 81%, MMT 염) MS: m/z 488.31 = [M+H]+, (계산치 = 488.29).
11a(49 mg, 0.11 mmol) 및 14c(114 mg, 0.15 mmol)를 DCM(1.4 mL)에 용해시키고, PyBOP(62 mg, 0.12 mmol) 및 DIPEA(38 ㎕, 0.22 mmol)를 교반하에 가하였다. 2시간 후, AcOH(40 ㎕)를 가하고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔여물을 ACN/물/TFA(1:1:0.002 v/v/v, 5 mL)에 용해시키고, RP-HPLC로 정제하여 14d(104 mg, 0.1 mmol TFA 염, 92%)를 수득하였다. MS: m/z 912.19= [M+H]+, (계산치 = 912.44).
14d(104 mg, 0.1 mmol)를 HFIP/TES/물(39:1:1 v/v/v, 3mL)에 용해시키고, TFA(0.25 mL)를 교반하에 가하였다. 2시간 후, TFA(0.25 mL)를 교반하에 가하고, 반응을 20시간 동안 추가로 교반하였다. 혼합물을 진공하에 농축시키고, 잔여물을 ACN/물/TFA(1:1:0.002 v/v/v, 3 mL)에 용해시키고, RP-HPLC로 정제하여 14e(28 mg, 35 μmol TFA 염, 35%)를 수득하였다. MS: m/z 676.13 = [M+H]+, (계산치 = 676.30).
14e(25 mg, 32 μmol)를 DCM(2 mL) 및 DCC(10 mg, 48 μmol)에 용해시키고, NHS(5.5 mg, 48 μmol) 및 DMAP(0.4 mg, 3.2 μmol)를 가하고, 현탁액을 교반하였다. 1.5시간 후, 상기 언급된 양의 DCC 및 NHS를 다시 가하였다. 3시간 후, 용매를 질소 스트림하에 증발시켰다. 잔여물을 ACN/물/TFA(1:1:0.002 v/v/v, 4 mL)에 현탁시키고, 여과하였다. 여과액을 RP-HPLC로 정제하여 14f(28 mg, 31.6 μmol TFA 염, 99%)를 수득하였다. MS: m/z 773.31= [M+H]+, (계산치 = 773.31).
실시예 15
링커 시약 15f의 합성
하기 반응식에 따라 링커 시약 15f를 합성하였다:
Figure 112015045066876-pct00128
ACN(5 mL) 중의 11a(0.29 g, 0.65 mmol) 및 PyBOP(0.34 g, 0.65 mmol) 용액에 DIPEA(0.57 mL, 3.27 mmol)를 가하였다. N,N-디메틸아미노프로판-1,3-디아민(0.12 mL, 0.98 mmol)을 가하기 전에, 당해 혼합물을 실온에서 1분 동안 교반하였다. 30분 후, AcOH(0.7 mL)를 가하여 반응을 켄칭시켰다. 혼합물을 물로 희석하고, RP-HPLC로 정제하였다. 수득된 중간체를 TFA(3 mL)에 용해시키고, TFA를 N2 스트림하에 제거하기 전에 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 잔여물을 진공하에 밤새 건조시켜 15a(0.42 g, 0.61 mmol(2 × TFA 염), 93%)를 무색 오일로서 수득하고, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다. MS: m/z = 471.21 = [M+H]+, (계산치 471.21).
DCM(5 mL) 중의 15a(0.23 mg, 0.33 mmol) 용액에 DMAP(8 mg, 65 μmol), NHS(75 mg, 0.65 mmol) 및 DCC(135 mg, 0.65 mmol)를 가하였다. 3시간 동안 교반 후, AcOH(10 ㎕)를 가하여 반응을 켄칭시켰다. 용매를 N2 스트림하에 제거하고, 잔여물을 H2O/ACN/TFA(1:1:0.002 v/v/v)에 현탁시키고, 여과하였다. 여과액을 RP-HPLC로 정제하여 15b(83 mg, 0.10 mmol(2 × TFA 염), 32%)를 무색 오일로서 수득하였다. MS: m/z = 568.23 = [M+H]+, (계산치 568.23).
실시예 16
정제 태그 16e의 합성
하기 반응식에 따라 정제 태그 16e을 합성하였다:
Figure 112015045066876-pct00129
ACN(20 mL) 중의 6,6'-디티오디니코틴산(0.62 g, 2 mmol) 현탁액에 PyBOP(2.08 g, 4 mmol) 및 DIPEA(1.29 g, 1.74 mL, 10 mmol)를 가하고, 혼합물을 1분 동안 교반하였다. 수득된 갈색 용액을 ACN(20 mL)과 DMF(5 mL)의 혼합물 중의 1,9-비스-Boc-1,5,9-트리아자노난(1.99 g, 6 mmol) 용액에 가하고, 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc(150 mL)로 희석하고, 유기층을 수성 HCl(10 mM, 5 × 100 mL)로 세척하고, 후속적으로 포화 NaHCO3 용액(3 × 100 mL) 및 염수(100 mL)로 세척하였다. MgSO4 상 건조 및 여과 후, 용매를 진공하에 제거하고, 조악한 잔여물을 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 16a(1.92 g, 최대 2 mmol)를 담황색 폼으로서 수득하였다. 생성물은 분리가 가능하지 않은 소량의 트리피롤리딘 포스포라미드를 함유하고, 이를 다음 단계에서 제거한다. MS: m/z = 935.47 = [M+H]+, (계산치 935.47).
16a(1.92 g, 최대 2 mmol)를 TFA(10 mL)에 용해시키고, 용액을 10분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음처럼 차가운 디에틸 에테르(160 mL)에 적가하여 생성물을 침전시켰다. 수득된 현탁액을 7000 × G 및 2℃에서 3분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 침전물을 메탄올(10 mL)에 용해시켰다. 당해 용액을 얼음처럼 차가운 디에틸 에테르(160 mL)에 적가하고, 형성된 현탁액을 7000 × G 및 2℃에서 3분 동안 원심분리하였다. 상청액 제거 후, 침전 과정을 상기 기재된 바와 같이 2회 이상 수행하였다. 잔여 유성 침전물을 진공하에 건조시켜 16b(1.77 g, 1.45 mmol(6 × TFA 염), 73%)를 담갈색의 매우 흡습성인 분말로서 수득하였다. MS: m/z = 535.26 = [M+H]+, (계산치 535.26).
DMF(90 mL) 중의 16b(3.30 g, 2.7 mmol) 용액에 DIPEA(5.4 mL, 31 mmol) 및 Boc-L-Lys(Boc)-OSu(5.62 g, 12.7 mmol)를 가하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트(600 mL)로 희석하기 전에 14시간 동안 교반하였다. 유기층을 수성 HCl(10 mM, 5 × 300 mL), 포화 NaHCO3 용액(3 × 300 mL) 및 염수(300 mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시켰다. 여과 후, 용매를 진공하에 제거하고, 조악한 잔여물을 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 16c(5.52 g, 최대 2.7 mmol)를 90% 순도의 담황색 폼으로서 수득하였다. MS: m/z = 924.54 = [M+2H]2+, (계산치 924.53).
16c(5.52 g, 최대 2.7 mmol)를 TFA(20 mL) 중에 용해시켰다. 15분 동안 교반 후, 반응 혼합물을 얼음처럼 차가운 디에틸 에테르(160 mL)에 적가함으로써 생성물을 침전시켰다. 수득된 현탁액을 7000 × G 및 2℃에서 3분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 침전물을 메탄올(10 mL)에 용해시켰다. 당해 용액을 얼음처럼 차가운 디에틸 에테르(160 mL)에 적가하고, 형성된 현탁액을 7000 × G 및 2℃에서 3분 동안 원심분리하였다. 상청액 제거 후, 침전 과정을 상기 기재된 바와 같이 2회 이상 수행하였다. 잔여 유성 침전물을 진공하에 건조시켜 16d(4.96 g, 2.27 mmol(10 × TFA 염), 84%)를 담갈색의 흡습성 분말로서 수득하였다. MS: m/z = 1046.64 = [M+H]+, (계산치 1046.64).
무수 DMF(20 mL) 중의 16d(1.53 g, 0.7 mmol) 용액에 DMF(35 mL) 중의 N,N-디메틸글리신(1.16 g, 11.2 mmol), PyBOP(5.83 g, 11.2 mmol) 및 DIPEA(3.23 g, 4.36 mL, 25 mmol) 용액을 가하고, 1시간 동안 교반하였다. 그 다음, 혼합물을 진공하에 용적 약 10 mL로 농축시켰다. 당해 잔여물에 총 용적 100 mL가 되도록 물을 가하고, TFA를 가하여 용액을 pH 1-2로 산성화시켰다. 탁한 혼합물을 5000 × G 및 2℃에서 3분 동안 원심분리하였다. 유성 침전물을 제거하고, 상청액을 RP-HPLC로 정제하여 16e(1.05 g, 0.37 mmol(10 × TFA 염), 53%)를 무색 오일로서 수득하였다. MS: m/z = 864.54 = [M+2H]2+, (계산치 864.54).
실시예 17
링커 시약 17g의 합성
하기 반응식에 따라 링커 시약 17g를 합성하였다:
Figure 112015045066876-pct00130
2-클로로트리틸클로라이드 수지(1.4 mmol/g, 1.43 g, 2 mmol)를 프릿이 있는 20 mL 주사기에 중량측정하여 넣었다. 수지를 DCM 10 mL로 2회 팽창시켰다. N-Fmoc-N-메틸-L-Asp(OtBu)-OH(1.06 g, 2.5 mmol)를 DCM(6 mL)에 용해시키고, 주사기로 흡입하였다. DIPEA(436 ㎕, 2.5 mmol)를 DCM(1 mL)에 용해시키고, 주사기로 흡입하였다. 주사기를 5분 동안 아지테이팅하였다. DIPEA(654 ㎕, 3.75 mmol)를 DCM(1 mL)에 용해시키고, 주사기로 흡입하였다. 주사기를 1시간 동안 아지테이팅하였다. MeOH(2 mL)를 주사기로 흡입하고, 주사기를 30분 동안 아지테이팅하였다. 수지를 DMF(10 mL)로 5회 세척하였다. 수지를 DMF:DBU:피페리딘(96:2:2 v/v/v 7 mL)로 5분 동안 3회 아지테이팅하였다. 수지를 DMF(5 mL)로 5회 세척하였다. 6-트리틸머캅토헥산산(1.95 g, 5 mmol) 및 PyBOP(2.6 g, 5 mmol)를 DMF(6 mL)에 용해시키고, DIPEA(3.5 mL, 20 mmol)를 가하였다. 1분 전배양 후, 용액을 주사기로 흡입하고, 주사기를 3시간 동안 아지테이팅하였다. 수지를 DMF(7 mL)로 5회, DCM(7 mL)로 5회 세척하였다. HFIP/DCM(1/4 v/v, 각각 8 mL) 용액을 주사기로 흡입하고, 주사기를 30분 동안 3회 아지테이팅하였다. 수집된 여과액을 진공하에 농축시켰다. 조악한 17a(0.84 g, 1.45 mmol, 73%)를 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. MS: m/z 598.18 = [M+Na]+, (계산치 = 598.26).
17a(1.67 g, 2.9 mmol)를 DCM(20 mL)에 용해시키고, N-Boc-N-메틸에틸렌디아민(0.62 mL, 3.48 mmol) 및 PyBOP(1.81 g, 3.48 mmol)를 가하였다. DIPEA(2.02 mL, 11.6 mmol)를 가하고, 반응을 1시간 동안 교반하였다. AcOH(2 mL)를 가하고, 혼합물을 DCM(40 mL)으로 희석하고, 물(2 × 20 mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 진공하에 농축시키고, 조악한 잔여물을 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 17b(1.74 g, 2.38 mmol, 82%)를 수득하였다. MS: m/z = 754.19 = [M+Na]+, (계산치 754.39).
17b(1.74 g, 2.38 mmol) 및 트리페닐메탄올(0.62 g, 2.38 mmol)을 DCM(7.2 mL)에 용해시키고, TFA(7.2 mL)를 교반하에 가하였다. 반응을 90분 동안 교반하고, 용매를 질소 스트림하에 45분 동안 제거하였다. 잔여물을 DCM로 공-증발시켰다. 잔여물을 ACN/물/TFA(2:1:0.003 v/v/v, 14 mL)에 현탁시키고, 여과하였다. 여과액을 RP-HPLC로 정제하여 17c(0.9 g, 1.3 mmol TFA 염, 55%)를 수득하였다. MS: m/z 576.20 = [M+H]+, (계산치 = 576.29).
17c(0.9 g, 1.3 mmol)를 DCM(20 mL)에 용해시키고, (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔-4-일)-메틸 4-니트로페닐 카르보네이트(0.46 g, 1.56 mmol)를 가하였다. DIPEA(0.45 mL, 2.6 mmol)를 천천히 가하고, 반응을 30분 동안 교반하였다. DIPEA(0.11 mL, 0.65 mmol)를 가하고, 반응을 30분 동안 교반하였다. 다시, DIPEA(0.11 mL, 0.65 mmol)를 가하고, 반응을 60분 동안 교반하였다. AcOH(0.68 mL)를 가하고, 혼합물을 진공하에 농축시키고, 조악한 잔여물을 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 17d(1.04 g, 최대 1.3 mmol)를 수득하였다. MS: m/z = 754.28 = [M+Na]+, (계산치 754.28).
17d(1.04 g, 최대 1.3 mmol)를 HFIP/TES/물(39:1:1 v/v/v, 8.2 mL)에 용해시키고, TFA(0.66 mL)를 가하고, 15분 교반 후, 반응을 진공하에 농축시키고, 잔여물을 ACN/물/TFA(1:1:0.002 v/v/v 12 mL)에 현탁시키고, 여과하였다. 여과액을 RP-HPLC로 정제하여 17e(0.32 g, 0.65 mmol, 50%)를 수득하였다. MS: m/z 490.19= [M+H]+, (계산치 = 490.19).
17e(181 mg, 0.37 mmol)를 ACN/물/TFA(1:1:0.002 v/v/v, 3 mL)에 용해시켰다. 16e(1.05 g, 0.37 mmol(10 × TFA 염)를 ACN/물(1:1 v/v, 20 mL)에 용해시켰다. 두 용액을 배합하고, pH 7.4 인산나트륨(0.5 M, 4 mL)을 가하고, 혼합물을 30분 동안 교반하였다. ACN/물/TFA(1:1:0.22 v/v/v)를 가하여 용액의 pH를 약 pH 2로 조절하고, ACN을 진공하에 제거하였다. 잔여물을 RP-HPLC로 정제하여 17f(0.47 g, 0.24 mmol 5 × TFA 염, 65%)를 수득하였다. MS: m/z 676.86 = [M+2H]2+, (계산치 = 676.86).
17f(0.18 g, 94 μmol)를 ACN(6 mL)에 용해시키고, NHS(92 mg, 0.8 mmol) 및 DCC(166 mg, 0.8 mmol)를 가하고, 반응을 1시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에 제거하고, 잔여물을 ACN/물/TFA(0.15:0.85:0.001 v/v/v, 6 mL)에 현탁하고, 여과하였다. 여과액을 RP-HPLC로 정제하여 17g(129 mg, 64 μmol 5 × TFA 염, 68%)를 수득하였다. MS: m/z 725.37 = [M+H]+, (계산치 = 725.37).
실시예 18
링커 시약 18i의 합성
하기 반응식에 따라 링커 시약 18i를 합성하였다:
Figure 112015045066876-pct00131
N-Boc-에틸렌디아민(0.77 g, 4.8 mmol)을 DCM(15 mL)에 용해시키고, 6-트리틸머캅토헥산산(2.25 g, 5.76 mmol) 및 PyBOP(3.0 g 5.76 mmol)를 교반하에 가하였다. DIPEA(2.52 mL, 14.4 mmol)를 가하고, 반응을 1시간 동안 교반하였다. 반응을 디에틸 에테르(150 mL)로 희석하고, 약염기성 염수(3 × 30 mL; 염수 100 mL 및 0.1 M 수성 NaOH 3 mL로 제조)로 세척하였다. 유기상을 염수(30 mL)로 1회 이상 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공하에 농축시키고, 플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 18a를 백색 폼으로서 수득하였다. 수율: 2.55 g(4.79 mmol, 99%) MS: m/z 555.24 = [M+Na]+, (계산치 = 555.27).
18a(2.55 g, 4.79 mmol)를 THF(26 mL)에 용해시키고, 오븐-건조시킨 아르곤 충전된 환저 플라스크로 옮겼다. THF(1 M, 17.7 mL, 17.71 mmol) 중의 보란-THF 착물을 가하고, 반응을 15시간 동안 교반하였다. MeOH(5.4 mL)를 천천히 가하고, N,N'-디메틸 에틸렌디아민(3.11 mL, 28.8 mmol)을 가하고, 반응을 2.5시간 동안 환류시켰다. 식힌 후, 반응을 에틸 아세테이트로 희석시키고, 포화 중탄산나트륨 용액(2 × 125 mL) 및 염수(1 × 125 mL)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공하에 농축시켜 18b를 수득하고, 이를 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 수율: 2.38 g(4.59 mmol, 96%) MS: m/z 519.27 = [M+H]+, (계산치 = 519.31).
18b(1.19 g 2.29 mmol)를 DCM에 용해시키고, (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔-4-일)-메틸 4-니트로페닐 카르보네이트(1.02 g, 3.44 mmol) 및 2,4,6-콜리딘(1.36 mL, 10.32 mmol)을 가하고, 반응을 23시간 동안 교반하였다. 반응을 진공하에 농축시키고, 플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 18c를 수득하였다. 수율: 1.19 g(1.77 mmol, 79%) MS: m/z 697.18 = [M+Na]+, (계산치 = 697.29).
18c(0.5 g, 0.74 mmol)를 DCM(2.5 mL)에 용해시키고, 트리페닐메탄올(0.19 g, 0.74 mmol) 및 TFA(2.5 mL)를 가하였다. 반응을 40분 동안 교반하고, 아르곤 스트림하에 농축시키고, 진공하에(< 0.1 mbar) 건조시켰다. 잔여물을 ACN/물(7:3 v/v, 10 mL)에 용해시키고, RP-HPLC로 정제하여 18d(0.50 g, 0.84 mmol, 114%)를 수득하였다. MS: m/z 575.33= [M+H]+, (계산치 = 575.26).
2-클로로트리틸클로라이드 수지(1.22 mmol/g, 0.87 g, 1 mmol)를 프릿이 있는 10 mL 주사기로 중량 측정하여 넣었다. 수지를 DCM 5 mL로 팽창시키고, DCM(5 × 4 mL)로 세척하였다. N-Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH(1.1 g, 2.7 mmol)를 DCM(5 mL)에 용해시키고, DIPEA(0.66 mL, 3.78 mmol)를 가하고, 용액을 주사기로 흡입하였다. 주사기를 1시간 동안 아지테이팅하였다. MeOH(0.5 mL)를 주사기로 흡입하고, 주사기를 15분 동안 아지테이팅하였다. 수지를 DCM(4 mL)로 5회 세척하고 DMF(5 mL)로 5회 세척하였다. 수지를 DMF:DBU:피페리딘(96:2:2 v/v/v 4 mL)로 5분 동안 3회 아지테이팅하였다. 수지를 DMF(4 mL)로 5회 세척하였다. 무수 아세트산(0.51 mL, 5.4 mmol) 및 DIPEA(1.9 mL, 10.8 mmol)를 DMF(6 mL)에 용해시키고, 용액을 주사기로 흡입하고, 주사기를 15분 동안 아지테이팅하였다. 수지를 DMF(4 mL)로 5회 세척하고, DCM(4 mL)로 5회 세척하였다. HFIP/DCM(1/4 v/v, 각각 5 mL) 용액을 주사기로 흡입하고, 주사기를 10분 동안 3회 아지테이팅하였다. 수집된 여과액을 진공하에 농축시켰다. 조악한 18e(0.29 g, 1.23 mmol, 114%)를 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. MS: m/z 254.38 = [M+Na]+, (계산치 = 254.12).
18e(65 mg, 0.28 mmol)를 DCM(3 mL)에 용해시키고, PyBOP(0.18 g, 0.34 mmol) 및 DIPEA(0.15 mL, 0.84 mmol)를 가하였다. 18d(0.18 g, 0.31 mmol)를 DCM(3 mL)에 용해시키고, 반응에 가하였다. 반응을 1시간 동안 교반하고, 진공하에 농축시켰다. 잔여물을 RP-HPLC로 정제하여 18f(97 mg, 0.12 mmol, 44%)를 수득하였다. MS: m/z 810.02 = [M+Na]+, (계산치 = 810.34).
18f(97 mg, 0.12 mmol)를 TFA/TES/물(92:2.5:2.5 v/v/v, 3 mL)에 용해시키고, 용액을 통해 아르곤 스트림을 통과시키면서 반응을 3시간 동안 힘차게 교반하였다. 3시간 후, 아르곤 스트림하에 용매를 제거하고, 잔여물을 RP-HPLC로 정제하여 18g(16 mg, 33 μmol, 27%)를 수득하였다. MS: m/z 490.21 = [M+H]+, (계산치 = 490.19).
18g(16 mg, 33 μmol)을 ACN/물(1:1 v/v, 3 mL)에 용해시키고, ACN(0.1 mL) 중의 2,2'-디티오디피리딘(14 mg, 65 μmol) 용액을 가한 후, pH 7.4 인산나트륨 버퍼(0.5 M, 0.1 mL)를 가하였다. 반응을 4.5시간 동안 교반하고, 생성물을 RP-HPLC로 직접 정제하여 18h(14 mg, 23 μmol, 71%)를 수득하였다. MS: m/z 598.98 = [M+H]+, (계산치 = 599.19).
18h(14 mg, 23 μmol)를 DCM(3 mL) 및 NHS(3 mg, 28 μmol)에 용해시키고, DCC(6.5 mg, 30 μmol) 및 DMAP(0.3 mg, 2 μmol)를 가하였다. 반응을 1.5시간 동안 교반하고, 용매를 아르곤 스트림하에 제거하였다. 잔여물을 ACN/물/TFA(9:1:0.01 v/v/v, 3 mL)에 현탁시키고, 여과하였다. 여과액을 RP-HPLC로 정제하여 18i(17 mg, 23 μmol, 100%)를 수득하였다. MS: m/z 696.20 = [M+H]+, (계산치 = 696.20).
실시예 19
가교결합제 시약 19c, 19g의 합성
하기 반응식에 따라 가교결합제 시약 19c를 수베르산 모노벤질 에스테르 2a 및 PEG6000로부터 제조하였다:
Figure 112015045066876-pct00132
화합물 19a의 합성을 위하여, 아젤라산 모노벤질 에스테르 2a(6.50 g, 23.3 mmol) 및 PEG 6000(40.0 g, 6.67 mmol)을 디클로로메탄 140 mL에 용해시키고, 빙욕으로 냉각시켰다. 디클로로메탄 40 mL 중의 DCC(4.81 g, 23.3 mmol) 및 DMAP(0.040 g, 0.33 mmol) 용액을 가하였다. 빙욕을 제거하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 수득된 현탁액을 0℃로 냉각시키고, 고체를 여과로 제거하였다. 용매를 진공하에 증발시켰다.
잔여물을 디클로로메탄 70 mL에 용해시키고, MTBE 300 mL로 실온에서 희석하였다. 혼합물을 밤새 -20℃에서 저장하였다. 침전물을 유리 필터 Por. 3을 통해 여과로 수집하고, 차가운 MTBE(-20℃) 500 mL로 세척하였다. 생성물을 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 41.2 g(95%) 백색 분말 19a.
MS: m/z 833.75 = [M+8H]8+(계산치 = 833.74).
화합물들을 함유하는 다분산 PEG의 질량 스펙트럼에 있어서, 하나의 단일 질량 피크를 선택하였다.
화합물 19b의 합성을 위하여, 화합물 19a(41.2 g, 6.32 mmol)를 메틸 아세테이트(238 mL) 및 에탄올(40 mL)에 용해시킨 다음, 차콜 상 팔라듐 400 mg을 가하였다. 상온의 수소 대기하에, 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과액을 증발시키고, 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 38.4 g(96%) 유리질 고체 19b.
MS: m/z 750.46 = [M+9H]9+(계산치 = 750.56).
화합물들을 함유하는 다분산 PEG의 질량 스펙트럼에 있어서, 하나의 단일 질량 피크를 선택하였다.
화합물 19c의 합성을 위하여, 화합물 19b(38.2 g, 6.02 mmol) 및 TSTU(7.25 g, mmol)를 디클로로메탄 130 mL에 실온에서 용해시켰다. 그 다음, DIPEA(3.11 g, 24.1 mmol)를 가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 수득된 현탁액을 여과하고, 여과액을 디클로로메탄 100 mL로 희석하고, 물 750 g/NaCl 197 g/NaOH 3 g의 용액 200 mL로 세척하였다. 유기상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔여물을 톨루엔 210 mL에 용해시키고, MTBE 430 mL로 실온에서 희석하고, 밤새 -20℃에서 저장하였다. 침전물을 유리 필터 Por. 3을 통해 여과로 수집하고, 차가운 MTBE(-20℃) 450 mL로 세척하였다. 생성물을 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 35.8 g(91%) 백색 분말 19c.
MS: m/z 857.51 = [M+8H]8+(계산치 = 857.51).
화합물들을 함유하는 다분산 PEG의 질량 스펙트럼에 있어서, 하나의 단일 질량 피크를 선택하였다.
하기 반응식에 따라 가교결합제 시약 19g를 이소프로필말론산 모노벤질 에스테르 및 PEG8000로부터 제조하였다:
Figure 112015045066876-pct00133
이소프로필말론산 모노벤질 에스테르 rac-19d의 합성을 위하여, 이소프로필말론산(35.0 g, 239 mmol), 벤질 알코올(23.3 g, 216 mmol) 및 DMAP(1.46 g, 12.0 mmol)를 아세토니트릴 100 mL에 용해시켰다. 혼합물을 빙욕으로 0℃로 냉각시켰다. 아세토니트릴 150 mL 중의 DCC(49.4 g, 239 mmol) 용액을 15분 동안 0℃에서 가하였다. 빙욕을 제거하고, 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반한 다음, 고체를 여과로 제거하였다. 여과액을 40℃에서 진공하에 증발시키고, 잔여물을 MTBE 300 mL에 용해시켰다. 당해 용액을 포화 수성 NaHCO3 용액 300 mL로 2회 추출한 다음, 6 N 염산을 사용하여 배합된 수성상을 pH = 1-3로 산성화시켰다. 수득된 에멀젼을 MTBE 300 mL로 2회 추출하고, 용매를 증발시켰다. 배합된 유기상을 포화 수성 NaCl 200 mL로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시켰다. 용리액으로서 에틸 아세테이트/헵탄(10:90 → 20:80)을 사용하여 생성물을 실리카 340 g 상에서 정제하였다. 용리액을 증발시키고, 잔여물을 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 9.62 g(17%) 무색 오일 rac-19d.
MS: m/z 237.11 = [M+H]+(계산치 = 237.11).
화합물 rac-19e의 합성을 위하여, 이소프로필말론산 모노벤질 에스테르 rac-19d(2.25 g, 9.50 mmol) 및 PEG 8000(19.0 g, 2.38 mmol)를 디클로로메탄 100 mL에 용해시키고, 빙욕으로 냉각시켰다. 디클로로메탄 10 mL 중의 DCC(1.96 g, 9.50 mmol) 및 DMAP(14 mg, 0.12 mmol) 용액을 가하였다. 빙욕을 제거하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 수득된 현탁액을 0℃로 냉각시키고, 고체를 여과로 제거하였다. 용매를 진공하에 증발시켰다.
잔여물을 디클로로메탄 40 mL에 용해시키고, MTBE 270 mL로 실온에서 희석하였다. 혼합물을 밤새 -20℃에서 저장하였다. 침전물을 유리 필터 Por. 3을 통해 여과로 수집하고, 차가운 MTBE(-20℃) 500 mL로 세척하였다. 생성물을 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 18.5 g(92%) 백색 분말 rac-19e.
MS: m/z 737.43 = [M+13H]13+(계산치 = 737.42).
화합물들을 함유하는 다분산 PEG의 질량 스펙트럼에 있어서, 하나의 단일 질량 피크를 선택하였다.
화합물 rac-19f의 합성을 위하여, 화합물 rac-19e(18.4 g, 2.18 mmol)를 메틸 아세테이트(160 mL)에 용해시키고, 차콜 상 팔라듐 254 mg을 가하였다. 상온의 수소 대기하에, 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과액을 증발시키고, 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 17.7 g(98%) 유리질 고체 rac-19f.
MS: m/z 723.51 =[M+13H]13+(계산치 = 723.55).
화합물들을 함유하는 다분산 PEG의 질량 스펙트럼에 있어서, 하나의 단일 질량 피크를 선택하였다.
화합물 rac-19g의 합성을 위하여, 화합물 rac-19f(13.6 g, 1.65 mmol) 및 TSTU(1.96 g, 6.60 mmol)를 디클로로메탄 60 mL에 실온에서 용해시켰다. 그 다음, DIPEA(852 mg, 6.60 mmol)를 가하고, 혼합물을 45분 동안 교반하였다. 수득된 현탁액을 여과하고, 여과액을 에틸 아세테이트 70 mL로 희석하고, 0.5 M 포스페이트 버퍼(pH = 6.5) 70 mL로 세척하였다. 유기상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔여물을 톨루엔 80 mL에 용해시키고, 잔여 고체를 여과로 제거하고, 톨루엔 20 mL로 세척하였다. 배합된 톨루엔 분획을 MTBE 35 mL로 실온에서 희석하고, 밤새 -20℃에서 저장하였다. 침전물을 유리 필터 Por. 3을 통해 여과로 수집하고, 차가운 MTBE(-20℃) 600 mL로 세척하였다. 생성물을 진공하에 밤새 건조시켰다.
수율 12.1 g(87%) 백색 분말 rac-19g.
MS: m/z 738.51 =[M+13H]13+(계산치 = 738.49).
화합물들을 함유하는 다분산 PEG의 질량 스펙트럼에 있어서, 하나의 단일 질량 피크를 선택하였다.
실시예 20
유리 아미노 기를 함유한 하이드로겔 비드 20a의 제조
교반기 속도 560 rpm의 적용 및 1b 398 mg, 19c 2690 mg, DMSO 27.8 g, 키트롤™ DPHS 274 mg, TMEDA 1.8 mL, 아세트산 2.7 mL의 사용을 제외하고 3c에 기재된 바와 같이 20a를 제조하여, 유리 아미노 기 0.152 mmol/g을 함유한 20a를 백색 분말로서 50 ㎛ 체 상에서 0.22 g, 63 ㎛ 체 상에서 0.33 g, 및 75 ㎛ 체 상에서 0.52 g으로 수득하였다.
유리 아미노 기를 함유한 하이드로겔 비드 20b의 제조
교반기 속도 580 rpm의 적용 및 1b 250 mg, rac-19g 2168 mg, DMSO 21.8 g, 키트롤™ DPHS 215 mg, TMEDA 1.1 mL, 아세트산 1.7 mL의 사용을 제외하고 3c에 기재된 바와 같이 20b를 제조하여, 유리 아미노 기 0.154 mmol/g을 함유한 20b를 백색 분말로서 50 ㎛ 체 상에서 0.09 g, 63 ㎛ 체 상에서 0.17 g, 및 75 ㎛ 체 상에서 0.54 g으로 수득하였다.
실시예 21
히스티딘-태그를 함유한 말레이미드 21의 제조
Figure 112015045066876-pct00134
린크 아미드 MBHA 수지(100-200 메쉬, 0.64 mmol/g 아민) 0.78g을 프릿이 장착된 20 mL 주사기로 옮기고, DCM 10 mL 중에서 팽창시켰다. 용매를 배출하고, 수지를 NMP로 3회 세척하고, 용매를 매회 제거하였다. 수지를 각각 15분 및 5분 동안 DMF 중의 20% 피페리딘 5 mL로 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하고, 용매를 매회 제거하였다. 수지를 NMP로 10회 세척하였다. Fmoc-His(Trt)-OH 775 mg 및 HATU 475 mg을 DMF 중의 0.5M HOAT 3 mL에 용해시키고, DIPEA 850 ㎕를 가하였다. 용액을 주사기로 흡입하고, 3시간 동안 상온에서 부드러운 진탕하에 현탁액을 배양하였다. 용매를 제거하고, 수지를 NMP로 5회 세척하였다. Fmoc-보호기를 상기 기재된 바와 같이 제거하였다. NMP 3 mL 중의 Fmoc-His(Trt)-OH 620 mg, HOBt 77 mg, TBTU 160 mg 및 DIPEA 850 ㎕의 커플링 용액을 사용하여 그 다음 5회 커플링을 각각 수행하였다. 매회 반응을 1시간 동안 상온에서 부드러운 진탕 후, NMP 세척 및 Fmoc-탈보호화를 수행하였다. 그 다음, 수지를 DMF 중의 0.5M HOAt 3 mL 중에 용해된 Fmoc-Ado-OH 385 mg, HATU 475 mg, DIPEA 850 ㎕의 용액으로 1시간 동안 상온에서 처리한 후, NMP 세척 및 Fmoc 탈보호화를 수행하였다. 수지를 DMF 중의 0.5 M HOAt 3 mL에 용해된 말레이미도 프로피온산 169 mg, HATU 475 mg, DIPEA 850 ㎕로 8시간 동안 상온에서 부드러운 진탕하에 처리하였다. 용매를 제거하고, 수지를 NMP로 5회 세척하고 DCM로 10회 세척하였다. 용매를 매회 제거하였다. 최종적으로, 수지를 매회 95% TFA/2.5% TIPS/2.5% 물 용액 5 mL로 30분 동안 2회 처리하고 1시간 동안 2회 처리하였다. 용액을 별개의 50 mL 팔콘 튜브로 배출하고, TFA를 연속 질소 스트림하에 증발시켰다. 잔여물에 얼음처럼 차가운 에테르 45 mL를 가하고, 팔콘 튜브를 원심분리하고, 상청액 제거하였다. 침전물을 50% ACN/물에 혼입시키고, 제조용 HPLC를 통해 정제하고, 동결건조시켜 21을 수득하였다.
수율 0.15 g(26%).
MS: m/z 1136.49 = [M+H]+(계산치 = 1136.49).
실시예 22
DMSO 중의 PEG화 하이드로겔 비드 22의 제조
예를 들면, 3c에 기재된 바와 같은 무수 하이드로겔 비드를 프릿이 장착된 주사기로 옮기고, NMP(5 mL/100 mg 하이드로겔 비드)를 가하였다. 하이드로겔을 10분 동안 상온에서 부드러운 진탕하에 팽창하도록 두었다. 용매를 배출하고, 하이드로겔을 매회 DMSO로 10회 세척한 다음, 매회 1% TMEDA/DMSO(5 mL/100 mg 하이드로겔 비드)로 10회 세척하고, 용매를 매회 제거하였다. PEG-NHS 0.2 당량(하이드로겔 비드의 아민 함량 기준)을 DMSO 중의 TMEDA 2 당량(하이드로겔 비드의 아민 함량 기준)을 함유한 용액에 37℃에서 15분 동안 용해시켰다. 용액을 주사기로 흡입하고, 수득된 하이드로겔 현탁액을 부드러운 진탕하에 배양하였다. 용매를 배출하고, 하이드로겔을 DMSO(5 mL/100 mg 하이드로겔 비드)로 5회 세척 후, 0.1% 아세트산/0.01% 트윈20(5 mL/100 mg 하이드로겔 비드)으로 5회 세척하였다. 신선한 0.1% 아세트산/0.01% 트윈20을 주사기로 흡입하여 초기 중량을 기준으로 10 mg/mL의 하이드로겔 현탁액을 수득하였다. 하이드로겔 비드의 아민 함량을 상기 기재된 바와 같이 측정하였다. 수학식 2를 기준으로 하여, 이는 PEG화의 정도를 나타낸다.
하이드로겔 20a 50 mg 및 40kDA PEG-NHS 60.8 mg을 사용하여 상기 기재된 과정에 따라 실시예 22a를 제조하여 아민 함량이 0.141 mmol/g인 PEG화 하이드로겔 비드를 수득하였다.
하이드로겔 20b 51.3 mg 및 40kDA PEG-NHS 59.5 mg를 사용하여 상기 기재된 과정에 따라 실시예 22b를 제조하여 아민 함량이 0.118 mmol/g인 PEG화 하이드로겔 비드를 수득하였다.
실시예 23
말레이미드 작용화된 하이드로겔 비드 23의 제조
PEG화 전 하이드로겔 비드의 초기 중량을 기준으로 하여 10 mg/mL의 현탁액으로서 PEG화 하이드로겔 비드를 프릿이 장착된 주사기로 옮겼다. 용매를 배출하고, 하이드로겔을 물(5 mL/100 mg 하이드로겔 비드)로 10회 세척하고, 용매를 매회 제거하였다. 그 다음, 하이드로겔 비드를 NMP로 10회 세척하고, NMP 중의 2% DIPEA로 5회 세척하였다. Mal-PEG6-Pfp 5 당량(하이드로겔 비드의 아민 함량 기준)을 NMP(1 mL/50 mg 시약)에 용해시키고, 세척된 하이드로겔 비드에 가하였다. 하이드로겔 현탁액을 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 수득된 말레이미드 작용화된 하이드로겔 비드를 NMP 후, 0.1% 아세트산/0.01% 트윈20으로 각각 5회 세척하였다. 하이드로겔 상의 말레이미드 기에 대한 Fmoc-시스테인의 컨쥬게이션 및 문헌 [Gude, M., J. Ryf, et al.(2002) Letters in Peptide Science 9(4):203-206]에 기재된 바와 같은 후속적인 Fmoc-측정으로 하이드로겔 비드의 말레이미드 함량을 측정하였다.
22a 35 mg(20a의 초기 건조 중량 기준) 및 Mal-PEG6-Pfp 13 mg을 사용하여 상기 기재된 과정에 따라 실시예 23a를 제조하였다.
22b 35 mg(20b의 초기 건조 중량 기준) 및 Mal-PEG6-Pfp 17 mg을 사용하여 상기 기재된 과정에 따라 실시예 23b를 제조하였다.
실시예 24
일시적인 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭의 제조
루센티스(하기 반응식에서 루센티스-NH2로 기재됨)(10 mM 히스티딘, 10중량% α,α-트레할로스, 0.01% 트윈20, pH 5.5 중의 40 mg/mL 루센티스 2000 ㎕) 80 mg을 10 mM 인산나트륨, 2.7 mM 염화칼륨, 140 mM 염화나트륨, pH 7.4로 버퍼 교환하고, 루센티스의 농도를 13.5 mg/mL로 조절하였다. 링커 시약 4c 6 mg을 DMSO 100 ㎕에 용해시켜 100 mM의 농도를 수득하였다. 루센티스 양에 대하여 1 몰당량의 링커 시약 4c를 루센티스 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 조심스럽게 혼합하고, 5분 동안 실온에서 배양하였다. 후속적으로, 추가의 링커 시약 4c 1.3 몰당량을 루센티스 용액에 가하여 개질되지 않은 루센티스와 보호된 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 24a의 혼합물을 수득하였다.
1 M 시트르산나트륨, pH 5.0를 가하여 반응 혼합물의 pH를 pH 6.5로 조절하고, Na2EDTA를 최종 농도 5 mM가 되도록 가하였다. 24a의 보호기를 제거하기 위하여, 0.5 M NH2OH(10 mM 시트르산나트륨, 140 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, pH 6.5에 용해됨)를 최종 농도 45 mM이 되도록 가하고, 탈보호화 반응을 실온에서 4시간 동안 배양하여 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 24b를 수득하였다. 루센티스와 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 24b의 혼합물을 10 mM 인산나트륨, 2.7 mM 염화칼륨, 140 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, 0.01% 트윈20, pH 6.5로 버퍼 교환하고, 2종의 루센티스의 전체 농도를 12.1 mg/mL로 조절하였다.
Figure 112015045066876-pct00135
실시예 25
일시적인 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 25a의 합성
10 mM 인산나트륨, 2.7 mM 염화칼륨, 140 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, 0.01% 트윈20, pH 6.5 중의 루센티스/루센티스-링커 모노컨쥬게이트 24b 혼합물 20 mg을 말레이미드 작용화된 하이드로겔 비드 5a 2.5 mg에 가하고, 밤새 실온에서 배양하여 일시적인 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 25a를 수득하였다.
23a 2.5 mg(20a의 건조 중량 기준)을 사용하여 25a에 기재된 과정에 따라 실시예 25b를 제조하였다.
23b 2.5 mg(20b의 건조 중량 기준)을 사용하여 25b에 기재된 과정에 따라 실시예 25c를 제조하였다.
실시예 26
블록킹된 하이드로겔 비드 26
실시예 3c에 기재된 과정에 따라 하이드로겔 비드를 합성하고, 실시예 5a에 기재된 과정에 따라 말레이미드 기로 작용화하였다. 그 다음, 10 mg/mL의 하이드로겔 현탁액 4 mL를 프릿이 장착된 20 mL 주사기로 옮겼다. 용매를 배출하고, 하이드로겔을 10 mM 히스티딘/10 중량% α,α-트레할로스/0.01% 트윈20/pH 5.5 5 mL로 10회 세척하였다. 용매를 배출하고, 10 mM 히스티딘/10 중량% α,α-트레할로스/0.01% 트윈20/pH 5.5 중의 1 mM β-머캅토에탄올 5 mL를 주사기로 흡입하였다. 수득된 현탁액을 상온에서 부드러운 진탕하에 5분 동안 배양하였다. 용매를 제거하고, 하이드로겔을 10 mM 히스티딘/10 중량% α,α-트레할로스/0.01% 트윈20/pH 5.5 중의 1 mM β-머캅토에탄올 5 mL로 추가 9회 처리하였다. 용매를 매회 제거하였다. 그 다음, 하이드로겔 비드를 매회 10 mM 히스티딘/10 중량% α,α-트레할로스/0.01% 트윈20/pH 5.5 5 mL로 10회 세척하고, 용매를 매회 제거하였다. 그 다음, 하이드로겔 비드를 매회 PBS-T/pH 7.4 5 mL로 10회 세척하고, 용매를 매회 제거하였다. 최종적으로, 신선한 PBS-T/pH 7.4를 주사기로 흡입하고, 현탁액을 팔콘 튜브로 옮겨 26을 수득하였다.
실시예 27
루센티스 하이드로겔 비드 27에 대한 항체 결합
PBS-T 버퍼 중의 하이드로겔 현탁액 25a-c(35 용적%) 20 ㎕를 1% BSA(Sigma, A3059)를 함유하는 PBS-T 중의 제1 항체 용액 400 ㎕와 혼합하고, 1시간 동안 200 rpm에서 에펜도르프(Eppendorf) 튜브 1.5 mL 중에서 배양하였다. 루센티스 하이드로겔 비드을 위하여 항체 ab771(항-인간 IgG Fab 단편 항체 [4A11](ab771)-Abcam, Cambridge, UK)의 1:100 희석물을 사용하였다. 테이블탑 원심분리기에서 100 g에서 1분 동안 원심분리 단계를 통해 하이드로겔 비드를 침전시켰다. 상청액을 피펫을 사용하여 제거하고, 임의의 하이드로겔 비드를 제거하기 위한 처리를 수행하지 않았다. PBS-T 버퍼 1 mL의 첨가를 포함하는 세척 단계 2회를 통해 비드의 세척을 수행하고, 100 g에서 1분 동안 원심분리하고, 피펫을 사용하여 상청액을 조심스럽게 제거하였다. 1% BSA(Sigma, A3059)를 함유하는 PBS-T 중의 2차 항체 400 ㎕를 비드에 가하고, 1시간 동안 200 rpm에서 배양하였다. 루센티스 하이드로겔 비드를 위하여 항체 ab97041(고트 항-마우스 IgG H&L(피코에리트린) 전흡수(ab97041)-Abcam, Cambridge, UK)의 1:50 희석물을 사용하였다. 상청액을 피펫을 사용하여 제거하고, 임의의 하이드로겔 비드를 제거하기 위한 처리를 수행하지 않았다. PBS-T 버퍼 1 mL의 첨가를 포함하는 세척 단계 4회를 통해 비드의 세척을 수행하고, 100 g에서 1분 동안 원심분리하고, 피펫을 사용하여 상청액을 조심스럽게 제거하였다. 세척된 비드를 PBS-T 200 ㎕에 재현탁시키고, 블랙 96-웰 플레이트(블랙, 비-결합, 제품 번호 655900, Greiner bio-one GmbH, 72636 Frickenhausen, Germany)로 완전히 옮겼다. 테칸(Tecan) 인피니트(Infinite) M200 형광 플레이트 리더(여기 495 nm, 방출 575 nm, 플래쉬 수 25, 통합 시간 20 ㎲, 웰 5 × 5(Border 250 ㎛) 당 다중 해독, 최적 게인)로 형광 강도를 측정하였다.
데이타 분석
PEG-개질된 루센티스 하이드로겔 비드에 대한 항체 결합의 측정은 개질되지 않은 루센티스 하이드로겔 비드 25a의 표준 곡선과 비교하여 달성하였다. 개질되지 않은 루센티스 하이드로겔 비드를 플라시보 하이드로겔 비드 26과 상이한 비율로 혼합하였다. 플롯(개질되지 않은 루센티스 하이드로겔 비드의 백분율 대 형광 강도)을 선형 방식으로 핏팅하였다. PEG화 루센티스 하이드로겔 비드에 대한 항체 결합의 백분율을 수득된 교정 곡선에 따라 다시 계산하였다.
결과
Figure 112015045066876-pct00136
정의: DevMean = 평균으로부터의 편차 = |μ - X|, μ = 평균값
실시예 28
시험관내 방출 역학 - 시험관내 반감기 측정 28a
밀도가 높은 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 현탁액 25a(루센티스 약 1.68 mg 함유) 50.3 mg을 60 mM 인산나트륨, 3 mM Na2EDTA, 0.01% 트윈20, pH 7.4로 5회 세척하고, 최종적으로 상기 언급된 버퍼 1 mL에 현탁하였다. 현탁액을 37℃에서 배양하였다. 현탁액의 버퍼를 상이한 시간 간격 후 교환하고 220 nm에서 HPLC-SEC로 분석하였다. 유리된 루센티스에 해당하는 피크를 통합하고 유리된 루센티스 전체를 총 배양 시간에 대해 플롯팅하였다. 곡선 핏팅 소프트웨어를 적용하여 1차 쪼개짐률을 측정하였다.
28a의 방출 역학:
Figure 112015045066876-pct00137
밀도가 높은 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 현탁액 25b(루센티스 약 1.14 mg 함유) 35.0 mg으로 28a에 기재된 과정에 따라 실시예 28b를 제조하였다.
28b의 방출 역학:
Figure 112015045066876-pct00138
밀도가 높은 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 현탁액 25c(루센티스 약 0.73 mg 함유) 25.3 mg으로 28a에 기재된 과정에 따라 실시예 28c를 제조하였다.
28c의 방출 역학:
Figure 112015045066876-pct00139
실시예 29
티올 작용화된 하이드로겔 비드 29의 제조
아민 함량이 0.097 mmol/g인, 3c에 기재된 무수 하이드로겔 비드 100 mg을 프릿이 장착된 20 mL 주사기로 옮겼다. 하이드로겔을 NMP 중에서 팽창시키고, 용매를 제거하였다. 하이드로겔을 매회 NMP 5 mL로 5회 세척하고, 용매를 매회 제거하였다. 하이드로겔 비드를 매회 NMP 중의 2% DIPEA 5 mL로 5회 세척하고, 용매를 매회 제거하였다. 하이드로겔 비드를 DMSO 5 mL로 5회 세척하고, 용매를 매회 제거하였다. OPSS-PEG12-NHS 17.7 mg을 DMSO 1 mL에 용해시키고, 주사기로 흡입하였다. 현탁액을 2시간 동안 부드러운 진탕하에 상온에서 배양하였다. 용매를 배출하고, 하이드로겔 비드를 매회 DMSO 5 mL로 5회 세척하고 매회 15 mM 석시네이트/100 mM NaCl/5 mM EDTA/pH 4.0 5 mL로 5회 세척하고, 용매를 매회 제거하였다. 15 mM 석시네이트/100 mM NaCl/5 mM EDTA/pH 4.0 버퍼 10 mL를 주사기로 흡입하고, 수득된 현탁액을 팔콘 튜브로 옮겼다. 트윈20 10 ㎕를 가하였다. 당해 하이드로겔 현탁액 1 mL를 프릿이 장착된 5 mL 주사기로 옮기고, 용매를 배출하였다. 하이드로겔 비드를 물 중의 50 mM TCEP 용액 1 mL와 함께 10분 동안 상온에서 부드러운 진탕하에 배양하였다. 용매를 배출하고, 하이드로겔 비드를 매회 물 중의 50 mM TCEP 용액 1 mL로 5회 세척하고, 용매를 매회 제거하였다. 하이드로겔 비드를 15 mM 석시네이트/100 mM NaCl/5 mM EDTA/0.01% 트윈20/pH 4.0 1 mL로 10회 세척하고, 용매를 매회 제거하였다. 15 mM 석시네이트/100 mM NaCl/5 mM EDTA/0.01% 트윈20/pH 4.0 1 mL를 주사기로 흡입하여 29를 하이드로겔 비드의 초기 건조 중량을 기준으로 10 mg/mL의 하이드로겔 현탁액으로서 수득하였다.
실시예 30
티올 작용화된 히스티딘 태그 30의 제조
Figure 112015045066876-pct00140
린크 아미드 MBHA 수지(100-200 메쉬, 0.64 mmol/g 아민) 0.2g을 프릿이 장착된 5 mL 주사기에 옮기고, DMF 2 mL 중에서 10분 동안 팽창시켰다. 용매를 배출하고, 수지를 DMF 5 mL로 5회 세척하고, 용매를 매회 제거하였다. 수지를 DMF 중의 20% 피페리딘 5 mL로 15분 동안 2회 처리하고, 용매를 매회 제거하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 수지를 DMF 2 mL로 10회 세척하였다. Fmoc-His(Trt)-OH 198 mg 및 HATU 146 mg을 DMF 중의 0.5M HOAT 1 mL에 용해시키고, DIPEA 223 ㎕를 가하였다. 용액을 주사기로 흡입하고, 현탁액을 부드러운 진탕하에 1.5시간 동안 상온에서 배양하였다. 용매를 제거하고, DMF 중의 0.5M HOAT 1 mL 중의 Fmoc-His(Trt)-OH 198 mg, HATU 146 mg 및 DIPEA 223 ㎕의 용액으로 수지를 1.5시간 동안 다시 처리하였다. 용매를 제거하고, 수지를 매회 DMF 2 mL로 10회 세척하고, 용매를 매회 제거하였다. Fmoc-보호기를 상기 기재된 바와 같이 제거하였다. 다음 5회 커플링을 DMF 중의 0.5M HOAt 1 mL 중의 Fmoc-His(Trt)-OH 198 mg, HATU 146 mg 및 DIPEA 223 ㎕의 커플링 용액을 사용하여 각각 수행하였다. 1.5시간 동안 상온에서 부드러운 진탕하에 반응이 진행되도록 한 후, DMF 세척 및 Fmoc-탈보호화를 수행하였다. 그 다음, 수지를 DMF 중의 0.5M HOAt 1 mL에 용해된 Fmoc-Ado-OH 123 mg, HATU 122 mg, DIPEA 223 ㎕의 용액으로 1.5시간 동안 상온에서 처리한 다음, DMF 세척 및 Fmoc 탈보호화를 수행하였다. 수지를 DMF 중의 0.5M HOAt 1 mL 중의 3-(트리틸티오-)프로피온산 112 mg, HATU 122 mg 및 DIPEA 223 ㎕로 1시간 동안 상온에서 부드러운 진탕하에 처리하였다. 용매를 제거하고, 수지를 DMF를 10회 세척하고, DCM로 10회 세척하였다. 용매를 매회 제거하였다. 수지를 매회 95% TFA/2.5% TIPS/2.5% 물 용액 3 mL로 30분 동안 2회 처리하고 1시간 동안 1회 처리하였다. 용액을 별개의 50 mL 팔콘 튜브로 배출하고, TFA를 연속 질소 스트림하에 증발시켰다. 잔여물에 얼음처럼 차가운 에테르 45 mL를 가하고, 팔콘 튜브를 원심분리하고, 상청액 제거하였다. 침전물을 50% ACN/물에 흡입시키고, 제조용 HPLC를 통해 정제하고, 동결건조시켜 30을 수득하였다.
수율 8.1 mg(6%).
MS: m/z 1073.46 = [M+H]+(계산치 = 1073.46).
실시예 31
2-(2-피리딜디설파닐)에탄올 31의 제조
Figure 112015045066876-pct00141
알드리티올-2 250 mg을 50 mM 포스페이트/ACN pH 7.4 10 mL에 용해시키고, 2-머캅토에탄올 95 ㎕를 가하였다. 용액을 5분 동안 상온에서 교반하였다. 그 다음, 알드리티올-2 추가 50 mg을 가하였다. 용액을 16시간 동안 상온에서 교반하였다. 조악한 생성물을 제조용 HPLC를 통해 정제하고, 동결건조시켜 31을 수득하였다.
수율 140.6 mg(55%).
MS: m/z 188.02 = [M+H]+(계산치 = 188.02).
실시예 32
티올 작용화된 하이드로겔 32의 블록킹
티올 작용화된 하이드로겔 비드 29 4 mg(초기 하이드로겔의 건조 중량 기준)을 15 mM 석시네이트/100 mM NaCl/5 mM EDTA/0.01% 트윈20/pH 4.0 중의 10 mg/mL 현탁액으로서 프릿이 장착된 5 mL 주사기에 옮겼다. 용매를 배출하고, 15 mM 석시네이트/100 mM NaCl/5 mM EDTA/0.01%) 트윈20/pH 4.0 중의 31의 5 mM 용액 322 ㎕를 주사기로 흡입하였다. 현탁액을 상온에서 부드러운 진탕하에 16시간 동안 배양하였다. 용매를 배출하고, 하이드로겔 비드를 15 mM 석시네이트/100 mM NaCl/5 mM EDTA/0.01%) 트윈20/pH 4.0 2 mL로 10회 세척하고, 용매를 매회 제거하였다.
실시예 33
일시적인 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 33d의 합성
루센티스(하기 반응식에서 루센티스-NH2로 기재)(10 mM 히스티딘, 10중량% α,α-트레할로스, 0.01% 트윈20, pH 5.5 중의 40 mg/mL 루센티스 9 mL) 360 mg을 10 mM 인산나트륨, 2.7 mM 염화칼륨, 140 mM 염화나트륨, pH 7.4로 버퍼 교환하고, 루센티스의 농도를 20 mg/mL로 조절하였다. 링커 시약 11d를 DMSO에 용해시켜 100 mM의 농도를 수득하였다. 루센티스의 양에 대하여 5 몰당량의 링커 시약 11d를 2 몰당량, 2 몰당량 및 1 몰당량 단계로 루센티스 용액에 가하였다. 각 링커 시약 첨가 후 반응 혼합물을 조심스럽게 혼합하고, 5분 동안 실온에서 배양하여 개질되지 않은 루센티스와 보호된 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 33a의 혼합물을 수득하였다.
1 M 시트르산나트륨, pH 5.0를 첨가하여 반응 혼합물의 4분의 1의 pH를 pH 6.5로 조절하고, Na2EDTA를 최종 농도 5 mM가 되도록 가하였다. 33a의 (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔-일)-메틸 옥소카르보닐 보호기를 제거하기 위하여, 0.5 M NH2OH(10 mM 시트르산나트륨, 140 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, pH 6.5에 용해됨)를 최종 농도 45 mM가 되도록 가하고, 탈보호화 반응을 실온에서 135분 동안 배양하여 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 33b를 수득하였다. 루센티스와 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 33b의 혼합물을 15 mM 숙신산, 100 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, pH 4.0으로 버퍼 교환하고, 후속적으로 농도 15 mg/mL로 농축시켰다. 단백질 용액을 4℃로 식히고, 총 루센티스 함량에 대하여 15 mM 숙신산, 100 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, pH 4.0 중의 25 mM DTT 1 몰당량을 가하여 Pys 보호기를 제거함으로써 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 33c를 수득하였다. 개질되지 않은 루센티스와 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 33c의 혼합물을 15 mM 숙신산, 100 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, pH 4.0로 버퍼 교환하고, 후속적으로 농도 28.7 mg/mL로 농축시켰다. 엘만 검정(Ellman's assay)에 의해 측정된 바, 혼합물 중의 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 33c 함량은 15%이었다.
15 mM 숙신산, 100 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, pH 4.0 중의 루센티스/루센티스-링커 모노컨쥬게이트 33c의 혼합물 79.7 mg을 말레이미드 작용화된 하이드로겔 비드 5c 5.1 mg에 가하고, 0.5 M 숙신산, pH 6.0를 가하여 pH를 pH 5로 조절하고, 밤새 실온에서 배양하여 일시적인 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 33d를 수득하였다. 15분 동안 실온에서 15 mM 숙신산, 100 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, pH 4.0 중의 1 mM 2-머캅토에탄올 1 몰당량(말레이미드 작용화된 하이드로겔 비드 5c의 말레이미드의 함량에 대하여)으로 8개의 배양 단계로 과량의 말레이미드를 차단하였다. 33d의 시험관내 반감기를 측정하기 위한 시험관내 방출 역학 분석을 실시예 7에 따라 수행하였다.
Figure 112015045066876-pct00142
실시예 34
일시적인 루센티스-링커-히스티딘-태그 컨쥬게이트 34d의 합성
루센티스(하기 반응식에서 루센티스-NH2로 기재됨)(10 mM 히스티딘, 10중량% α,α-트레할로스, 0.01% 트윈20, pH 5.5 중의 40 mg/mL 루센티스 3 mL) 120 mg을 60 mM 인산나트륨, 100 mM 염화나트륨, pH 7.4로 버퍼 교환하고, 루센티스의 농도를 20 mg/mL로 조절하였다. 링커 시약 14f(오직 하나의 레지오이소머(regioisomer)만이 하기 반응식에 기재됨)를 DMSO에 용해시켜 농도 100 mM을 수득하였다. 루센티스의 양에 대하여 2 몰당량의 링커 시약 14f를 루센티스 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 조심스럽게 혼합하고, 5분 동안 실온에서 배양하였다. 후속적으로, 링커 시약 14f의 추가 1 몰당량을 가하였다.
실온에서 5분 추가 배양으로 개질되지 않은 루센티스와 보호된 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 34a의 혼합물을 수득하였다. 실온에서 4시간 동안 배양하여 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 34a의 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 34b로의 정량적 전환을 야기하였다.
루센티스와 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 34b의 혼합물을 15 mM 숙신산, 100 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, pH 4.0로 버퍼 교환하고, 단백질 농도를 11.8 mg/mL로 조절하였다. 단백질 용액을 4℃로 식히고, 총 루센티스의 함량에 대하여 15 mM 숙신산, 100 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, pH 4.0 중의 25 mM DTT 1 몰당량을 가하여 Pys 보호기를 제거함으로써 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 34c를 수득하였다. 개질되지 않은 루센티스와 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 34c의 혼합물을 15 mM 숙신산, 100 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, pH 4.0로 버퍼 교환하고, 후속적으로 농도 17.2 mg/mL로 농축시켰다.
15 mM 숙신산, 100 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, pH 4.0 중의 루센티스/루센티스-링커 모노컨쥬게이트 34c 혼합물 106.5 mg에, 총 루센티스 함량에 대하여, 21을 함유한 말레이미드 1 몰당량을 가하고, 0.5 M 숙신산, pH 6.0을 가하여 pH를 pH 5로 조절하였다. 실온에서 4.5시간 배양으로 루센티스-링커-히스티딘-태그 컨쥬게이트 34d를 수득하고, 이를 루센티스 및 히스티딘-태그를 함유한 과량의 말레이미드 21로부터 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다.
Figure 112015045066876-pct00143
실시예 35
일시적인 히스티딘-태그 컨쥬게이트의 시험관내 방출 역학 - 시험관내 반감기 측정
양이온 교환 크로마토그래피로 정제된 루센티스-링커-히스티딘-태그 컨쥬게이트 34d를 60 mM 인산나트륨, 3 mM Na2EDTA, 0.01% 트윈20, pH 7.4로 버퍼 교환하고, 농도를 1 mg/mL로 조절하였다. 37℃에서 상이한 시간 간격으로 배양 후, 단백질 시료 200 μg을 양이온 교환 크로마토그래피로 분석하였다. 방출된 루센티스의 양을 방출된 루센티스 및 루센티스-링커-히스티딘-태그 컨쥬게이트 34d의 피크 면적을 비교하여 측정하고 배양 시간에 대하여 플롯팅하였다. 곡선 핏팅 소프트웨어를 적용하여 1차 쪼개짐률을 측정하였다.
실시예 36
일시적인 태그가 달린 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 36b의 합성 및 정제
루센티스(하기 반응식에서 루센티스-NH2로 기재됨)(10 mM 히스티딘, 10중량% α,α-트레할로스, 0.01% 트윈20, pH 5.5 중의 40 mg/mL 루센티스 10 mL) 400 mg을 60 mM 인산나트륨, 100 mM 염화나트륨, pH 7.4로 버퍼 교환하고, 루센티스의 농도를 20.8 mg/mL로 조절하였다. 링커 시약 17g을 DMSO에 용해시켜 농도 100 mM을 수득하였다. 루센티스의 양에 대하여 4.5 몰당량의 링커 시약 17g를 루센티스 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 조심스럽게 혼합하고, 5분 동안 실온에서 배양하여 개질되지 않은 루센티스와 보호된, 태그가 달린 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 36a의 혼합물을 수득하였다.
루센티스와 보호된, 태그가 달린 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 36a의 혼합물을 60 mM 인산나트륨, 100 mM 염화나트륨, pH 6.5로 버퍼 교환하였다. 36a의 (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔-일)-메틸 옥소카르보닐 보호기를 제거하기 위하여, 0.5 M NH2OH(10 mM 시트르산나트륨, 140 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, pH 6.5에 용해됨)를 최종 농도가 45 mM가 되도록 가하고, 탈보호화 반응을 실온에서 2.5시간 동안 배양하여 태그가 달린 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 36b를 수득하고, 이를 양이온 교환 크로마토그래피로 개질되지 않은 루센티스로부터 분리하였다.
Figure 112015045066876-pct00144
Figure 112015045066876-pct00145
실시예 37
티올/활성화된 디설파이드 컨쥬게이션 화학을 사용하는 일시적인 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 37a의 합성
15 mM 숙신산, 100 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, pH 4.0 중의 루센티스/루센티스-링커 모노컨쥬게이트 33b의 혼합물(c = 41 mg/mL) 61.5 mg을 티올 작용화된 하이드로겔 비드 29 6.6 mg에 가하였다. 하이드로겔 로딩 반응을 60시간 동안 4℃에서 배양한 후, 16시간 동안 실온에서 배양하여 일시적인 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 37a를 수득하였다.
Figure 112015045066876-pct00146
실시예 38
티올/말레이미드 컨쥬게이션 화학을 사용하는 일시적인 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 38a의 합성
20 mg/mL 농도의 루센티스-링커 모노컨쥬게이트 34c 10 mg을 말레이미드 작용화된 하이드로겔 5c 5 mg에 가하고, 반응 혼합물을 pH 5에서 실온에서 밤새 배양하여 일시적인 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 38a를 수득하였다. 과량의 말레이미드를 15분 동안 실온에서 15 mM 숙신산, 100 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, pH 4.0 중의 1 mM 2-머캅토에탄올 1 몰당량(말레이미드 작용화된 하이드로겔 비드 5c의 말레이미드 함량에 대하여)으로 8개의 배양 단계로 블록킹하였다.
Figure 112015045066876-pct00147
실시예 39
티올/활성화된 디설파이드 컨쥬게이션 화학을 사용하는 일시적인 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 39a의 합성
15 mM 숙신산, 100 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, pH 4.0 중의, 총 루센티스 농도 40 mg/mL의 루센티스/루센티스-링커 모노컨쥬게이트 34b의 혼합물 50 mg을 티올 작용화된 하이드로겔 비드 29 5 mg에 가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 배양하여 일시적인 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 39a를 수득하였다. 하이드로겔 상의 과량의 티올 기를 16시간 동안 실온에서 15 mM 숙신산, 100 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, pH 4.0 중의 31의 1 mM 용액 5 몰당량(티올 작용화된 하이드로겔 비드 29의 티올 함량에 대하여)과 배양하여 블록킹하였다.
Figure 112015045066876-pct00148
실시예 40
일시적인 루센티스-링커-히스티딘-태그 컨쥬게이트 40a의 합성
링커 시약 9c를 사용하여 실시예 33에 따라 일시적인 루센티스-링커-히스티딘-태그 컨쥬게이트 40a를 제조하였다. 말레이미드 작용화된 하이드로겔 5c 대신에, 총 루센티스 양에 대하여 1 몰당량의 말레이미드 작용화된 히스티딘-태그 21을 사용하였다.
Figure 112015045066876-pct00149
실시예 41
일시적인 루센티스-링커-히스티딘-태그 컨쥬게이트 41a의 합성
링커 시약 13g를 사용하여 실시예 34에 따라 일시적인 루센티스-링커-히스티딘-태그 컨쥬게이트 41a를 제조하였다.
Figure 112015045066876-pct00150
실시예 42
일시적인 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 42a의 합성
링커 시약 15b를 사용하여 실시예 33에 따라 일시적인 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 42a를 제조하였다. (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔-일)-메틸 옥소카르보닐 보호기의 부재로 인하여, 하이드록실아민에 의해 보조된 탈보호화 단계가 수행되지 않았다.
Figure 112015045066876-pct00151
실시예 43
일시적인 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 43a의 합성
링커 시약 18i를 사용하여 실시예 33에 따라 일시적인 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 43a를 제조하였다.
Figure 112015045066876-pct00152
표 1: 합성된 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 및 루센티스-링커-히스티딘 태그 컨쥬게이트의 반감기
Figure 112015045066876-pct00153
실시예 44
일시적인 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 44a의 합성
10 mM 인산나트륨, 2.7 mM 인산칼륨, 140 mM 염화나트륨, 5 mM Na2EDTA, 0.01% 트윈20, pH 6.5 중의 루센티스/루센티스-링커 모노컨쥬게이트 6b 혼합물 1147 mg을 말레이미드 작용화된 하이드로겔 비드 5c 153 mg에 가하고, 밤새 실온에서 배양하여 일시적인 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 44a를 수득하였다.
Figure 112015045066876-pct00154
실시예 45
루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 44a로부터 방출된 루센티스의 결합 친화력 평가
루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 44a로부터 방출된 루센티스의 활성 VEGF 결합 농도를 비아코어(Biacore) 표면 플라스몬 공명 시스템(비아코어 T200, Pharmacia, Piscataway, NJ) 상에서 측정하였다. 아민 커플링 키트(GE Healthcare)를 사용하여 VEGF를 카르복실화 덱스트란 센서 칩(CM5)에 공유결합적으로 고정하였다. 180s 동안 주입 전 후에 공명 단위의 변화를 모니터링함으로써 루센티스의 VEGF에 대한 결합을 측정하였다. 5 ㎍/mL 내지 0.156 ㎍/mL의 참조 물질의 연속 희석으로부터 제조된 표준 교정 곡선을 사용하여 활성 VEGF 결합 농도를 측정하였다. 브래드포드 검정(Bradford assay) 또는 UV-Vis 흡광도에 의해 측정된 총 단백질 농도에 대한 당해 활성 결합 농도의 비율은 결합%를 제공한다. 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 44a에 있어서, 28일 후 및 120일 이상 후 방출된 루센티스는 80±10% 결합을 나타내었다.
실시예 46
라니비주맙 측정 및 분석
두 그룹에 있어서, 정성적 리간드-결합 검정을 설계하여 래빗 유리질 매트릭스에서 라니비주맙의 농도를 측정하였다. 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 44a 정성확인에 있어서, 하이드로겔은 모든 시험된 농도에서 라니비주맙 정성확인을 방해하지 않는 것으로 측정되었다. 검정은 래빗 유리질 시료에서 라니비주맙을 캡쳐하는 재조합 인간 VEGF-A를 사용하였다. 겨자무 과산화효소(HRP)에 컨쥬게이션된 항-인간 F(ab')2를 사용하여 결합된 라니비주맙을 검출하고, 과산화효소 기질(TMB)을 발색 현상에 사용하였다. 마이크로플레이트 리더를 사용하는 흡광도 분광분석법을 사용하여 약물 수준을 정성확인하였다. 연구 시료 중의 라니비주맙의 농도는 표준 곡선을 사용하여 계산하고, 래빗 유리질 매트릭스에서 최소 정성확인 농도(MQC)는 1.5 ng/mL이었다. 유리질 농도를 플롯팅하고 MATLAB 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
표 2: 라니비주맙의 유리체내 투여량 0.5 mg/눈 후, 유리액 중에 측정된 라니비주맙 농도(ng/mL)
Figure 112015045066876-pct00155
aL = 왼쪽 눈, R = 오른쪽 눈
표 3: 루센티스-링커-하이드로겔 프로드럭 44a의 유리체내 투여량 1.7 mg/눈 후, 유리액 중에 측정된 라니비주맙 농도(ng/mL)
Figure 112015045066876-pct00156
aL = 왼쪽 눈, R = 오른쪽 눈
b튜브 내에 시료 없음
LTR = 보고가능한 것 보다 낮음
ND = 측정되지 않음
약어:
aq. 수성
Asp 아스파르테이트
Boc 3급-부틸옥시카르보닐
CIEC 양이온 교환 크로마토그래피
COMU (1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)디메틸아미노-모르폴리노-카르베늄 헥사플루오로포스페이트
DBU 1,8-디아자비사이클로(5.4.0)운데크-7-엔
DCC 디사이클로헥실카르보이미드
DCM 디클로로메탄
DIPEA 디이소프로필에틸아민
DMAP 디메틸아미노피리딘
DMF 디메틸포름아미드
DMSO 디메틸설폭사이드
DTT 디티오트레이톨
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
Fmoc 플루오레닐메틸옥시카르보닐
HATU 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트
HFIP 헥사플루오로이소프로판올
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
iPrOH 이소프로판올
Lys 리신
max. 최대
말레이미드-NH-PEG12-PEE N-(3-말레이미도프로필)-39-아미노-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-노나트리콘탄산 펜타플루오로페닐 에스테르
Me 메틸
MeOAc 메틸 아세테이트
MeOH 메탄올
MES 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산
MMT 4-메톡시트리페닐메틸
MS 질량 분석법
MTBE 메틸-3급-부틸 에테르
NHS N-하이드록시숙신이미드
순수 옥시마 에틸 2-시아노-2-(하이드록시이미노)아세테이트
PEG 폴리에틸렌글리콜
Pys 2-피리딘설페닐
PyBOP 벤조트라이졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트
RP-HPLC 역상-고성능 액체 크로마토그래피
RT 실온
sat. 포화
Su N-하이드록시숙신이미딜
tBu 및 t-Bu 3급-부틸
TAN 1,5,9-트리아자노난
TES 트리에틸실란
TFA 트리플루오로아세트산
THF 테트라하이드로푸란
TLC 박막 크로마토그래피
TMEDA N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌 디아민
Tmob 2,4,6-트리메톡시벤질
Trt 트리틸
TSTU O-(N-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트

Claims (26)

  1. 안내 혈관신생을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위한, 약제학적으로 허용되는 부형제 및 담체-연결된 VEGF 중화 프로드럭(VEGF neutralizing prodrug)을 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 담체-연결된 프로드럭은 공유 결합된 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기(covalently bound VEGF neutralizing biologically active moiety)를 포함하고,
    상기 질환은 시신경 유두 혈관신생, 홍채 혈관신생, 망막 혈관신생, 맥락막 혈관신생, 각막 혈관신생, 유리체 혈관신생, 녹내장, 판누스, 익상편, 황반 부종, 황반 변성, 노인성 황반 변성, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 망막 허혈, 당뇨병성 황반 부종, 혈관성 망막증, 망막 변성, 수정체후부 섬유증식증, 망막모세포종, 황반 변성의 미숙아 망막증, 각막 이식편 혈관신생, 중심성 망막 정맥 폐색, 병리적 근시, 안구 종양, 포도막염, 눈의 염증성 질환, 및 증식성 유리체망막증으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 치료는 안내 주입을 통한 프로드럭의 안내 투여를 포함하고,
    담체-연결된 프로드럭은 공유 결합된 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기, 가역적 프로드럭 링커 잔기 및 담체 기를 포함하고,
    상기 공유 결합된 VEGF 중화 생물학적 활성 잔기는 라니비주맙이고,
    상기 담체 기는 PEG계 하이드로겔 및 히알루론산계 하이드로겔로 이루어진 군으로부터 선택되는 생분해성 하이드로겔이고,
    상기 라니비주맙은 가역적 프로드럭 링커 잔기를 통해 상기 하이드로겔에 가역적으로 연결되고,
    상기 하이드로겔 잔기 및 상기 가역적인 프로드럭 링커 사이에 스페이서 잔기가 존재할 수 있고,
    상기 가역적인 프로드럭 링커는 하기 화학식 (F-i)인,
    약제학적 조성물:
    Figure 112020138202079-pct00161

    상기 화학식에서,
    D는 라니비주맙이고;
    점선은 하이드로겔 또는 스페이서 잔기에 대한 결합을 나타내고;
    X1은 C; 또는 S(O)이고;
    X2는 C(R7R7a); 또는 C(R7R7a)-C(R8R8a)이고;
    R1, R1a, R2, R2a, R3, R3a, R7, R7a, R8, R8a는 독립적으로 H; 및 C1-4 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R7a/R8a는 화학적 결합을 형성할 수 있고;
    하나 이상의 쌍(들) R1/R1a, R2/R2a, R7/R7a, R8/R8a는 이들이 결합되는 원자와 함께 결합하여 C3-7 사이클로알킬; 또는 4 내지 7원 헤테로사이클릴을 형성할 수 있고;
    하나 이상의 쌍(들) R7/R8, R2/R3은 이들이 결합되는 원자와 함께 결합하여 고리 A를 형성할 수 있고;
    R3/R3a는 이들이 결합되는 질소 원자와 함께 결합하여 4 내지 7원 헤테로사이클을 형성할 수 있고;
    A는 페닐; 나프틸; 인데닐; 인다닐; 테트랄리닐; C3-10 사이클로알킬; 4 내지 7원 헤테로사이클릴; 및 8 내지 11원 헤테로비사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    여기서, 4 내지 7원 헤테로사이클 및 4 내지 7원 헤테로사이클릴은 4, 5, 6 또는 7개의 고리 원자를 갖는 고리이고, 여기서 고리 원자 1 내지 4개는 황, 산소 및 질소로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤테로 원자에 의해 치환되고,
    여기서, 8 내지 11원 헤테로비사이클릴은 8 내지 11개의 고리 원자를 갖는 2개의 고리의 헤테로사이클릭 시스템이고, 여기서 하나 이상의 고리 원자가 두개의 고리에 의해서 공유되고, 고리 원자 1 내지 6개는 황, 산소 및 질소로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤테로원자에 의해 치환되고,
    화학식 (F-i)의 잔기는 추가의 치환기로 치환될 수 있고, 단, 화학식 (F-i)에서 별표로 표시된 수소는 치환기에 의해 치환되지 않으며, R3 및 R3a는 서로 독립적으로 H이거나 sp3-혼성화 탄소 원자를 통해 N에 결합되고,
    상기 추가의 치환기는 할로겐; CN; COOR9; OR9; C(O)R9; C(O)N(R9R9a); S(O)2N(R9R9a); S(O)N(R9R9a); S(O)2R9; S(O)R9; N(R9)S(O)2N(R9aR9b); SR9; N(R9R9a); NO2; OC(O)R9; N(R9)C(O)R9a; N(R9)S(O)2R9a; N(R9)S(O)R9a; N(R9)C(O)OR9a; N(R9)C(O)N(R9aR9b); OC(O)N(R9R9a); T; C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 또는 C2-50 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 T; C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 동일하거나 상이한 하나 이상의 R10에 의해 치환될 수 있고, 여기서 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 T, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; -S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; -N(R11)-; -OC(O)R11; -N(R11)C(O)-; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; -N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; 및 -OC(O)N(R11R11a)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기에 의해 간섭될 수 있고;
    여기서, R9, R9a, R9b는 H; T; 및 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 또는 C2-50 알키닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 T; C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 동일하거나 상이한 하나 이상의 R10에 의해 치환될 수 있고, 여기서 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 T, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; -S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; -N(R11)-; -OC(O)R11; -N(R11)C(O)-; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; -N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; 및 -OC(O)N(R11R11a)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기에 의해 간섭될 수 있고;
    T는 페닐; 나프틸; 인데닐; 인다닐; 테트랄리닐; C3-10 사이클로알킬; 4 내지 7원 헤테로사이클릴; 또는 8 내지 11원 헤테로비사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 T는 동일하거나 상이한 하나 이상의 R10에 의해 치환될 수 있고;
    R10은 할로겐; CN; 옥소(=O); COOR12; OR12; C(O)R12; C(O)N(R12R12a); S(O)2N(R12R12a); S(O)N(R12R12a); S(O)2R12; S(O)R12; N(R12)S(O)2N(R12aR12b); SR12; N(R12R12a); NO2; OC(O)R12; N(R12)C(O)R12a; N(R12)S(O)2R12a; N(R12)S(O)R12a; N(R12)C(O)OR12a; N(R12)C(O)N(R12aR12b); OC(O)N(R12R12a); 또는 C1-6 알킬이고, 여기서 C1-6 알킬은 동일하거나 상이한 하나 이상의 할로겐에 의해 치환될 수 있고;
    R11, R11a, R12, R12a, R12b는 H; 또는 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 C1-6 알킬은 동일하거나 상이한 하나 이상의 할로겐에 의해 치환될 수 있다.
  2. 제1항에 있어서, 약제학적 조성물에 포함된 프로드럭이 약제학적 조성물 1mL 당 5 내지 200 mg 프로드럭의 농도를 갖는 것인 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 조성물이 프로드럭의 총 중량을 기준으로 하여 라니비주맙 8 내지 80 중량%를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 주입이 주입 당 10 내지 200 ㎕ 범위의 주입 용적으로 수행되는 것인 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, VEGF 중화 프로드럭의 두번 안내 투여 사이의 기간이 1개월 이상인 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, X1이 C인 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, VEGF 중화 프로드럭이 화학식 (F-ii)의 잔기를 포함하는 것인 약제학적 조성물:
    Figure 112020138202079-pct00158

    상기 화학식에서,
    점선은 하이드로겔 잔기에 대한 결합을 나타내고;
    R1, R1a, R2, R2a, R3, R3a, X2 및 D는 제1항에서 정의된 바와 같이 사용되고;
    R10은 H 및 C1-6 알킬로부터 선택되고;
    SP0은 스페이서 잔기이고;
    화학식 (F-ii)의 잔기는 추가의 치환기로 치환될 수 있고, 단, 화학식 (F-ii)에서 별표로 표시된 수소는 치환기에 의해 치환되지 않으며, R3 및 R3a는 서로 독립적으로 H이거나 sp3-혼성화 탄소 원자를 통해 N에 결합되고,
    상기 추가의 치환기는 할로겐; CN; COOR9; OR9; C(O)R9; C(O)N(R9R9a); S(O)2N(R9R9a); S(O)N(R9R9a); S(O)2R9; S(O)R9; N(R9)S(O)2N(R9aR9b); SR9; N(R9R9a); NO2; OC(O)R9; N(R9)C(O)R9a; N(R9)S(O)2R9a; N(R9)S(O)R9a; N(R9)C(O)OR9a; N(R9)C(O)N(R9aR9b); OC(O)N(R9R9a); T; C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 또는 C2-50 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 T; C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 동일하거나 상이한 하나 이상의 R'10에 의해 치환될 수 있고, 여기서 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 T, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; -S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; -N(R11)-; -OC(O)R11; -N(R11)C(O)-; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; -N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; 및 -OC(O)N(R11R11a)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기에 의해 간섭될 수 있고;
    여기서, R9, R9a, R9b는 H; T; 및 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 또는 C2-50 알키닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 T; C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 동일하거나 상이한 하나 이상의 R'10에 의해 치환될 수 있고, 여기서 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 T, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; -S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; -N(R11)-; -OC(O)R11; -N(R11)C(O)-; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; -N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; 및 -OC(O)N(R11R11a)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기에 의해 간섭될 수 있고;
    T는 페닐; 나프틸; 인데닐; 인다닐; 테트랄리닐; C3-10 사이클로알킬; 4 내지 7원 헤테로사이클릴; 또는 8 내지 11원 헤테로비사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 T는 동일하거나 상이한 하나 이상의 R'10에 의해 치환될 수 있고;
    R'10은 할로겐; CN; 옥소(=O); COOR12; OR12; C(O)R12; C(O)N(R12R12a); S(O)2N(R12R12a); S(O)N(R12R12a); S(O)2R12; S(O)R12; N(R12)S(O)2N(R12aR12b); SR12; N(R12R12a); NO2; OC(O)R12; N(R12)C(O)R12a; N(R12)S(O)2R12a; N(R12)S(O)R12a; N(R12)C(O)OR12a; N(R12)C(O)N(R12aR12b); OC(O)N(R12R12a); 또는 C1-6 알킬이고, 여기서 C1-6 알킬은 동일하거나 상이한 하나 이상의 할로겐에 의해 치환될 수 있고;
    R11, R11a, R12, R12a, R12b는 H; 또는 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 C1-6 알킬은 동일하거나 상이한 하나 이상의 할로겐에 의해 치환될 수 있다.
  8. 제1항에 있어서, R1 및 R1a가 둘 다 H인 약제학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, VEGF 중화 프로드럭이 하기 화학식 (F-iiia) 또는 (F-iiib)의 잔기를 포함하는 것인 약제학적 조성물:
    Figure 112020138202079-pct00159

    상기 화학식에서,
    점선은 하이드로겔 잔기에 대한 결합을 나타내고;
    R2, R2a, R3, R3a, R7, R7a, R8, R8a, X2 및 D는 제1항에서 정의된 바와 같이 사용되고;
    R10은 H 및 C1-6 알킬로부터 선택되고;
    SP0은 스페이서 잔기이고;
    화학식 (F-iiia) 또는 (F-iiib)의 잔기는 추가의 치환기로 치환될 수 있고, 단, 화학식 (F-iiia) 또는 (F-iiib)에서 별표로 표시된 수소는 치환기에 의해 치환되지 않으며, R3 및 R3a는 서로 독립적으로 H이거나 sp3-혼성화 탄소 원자를 통해 N에 결합되며,
    상기 추가의 치환기는 할로겐; CN; COOR9; OR9; C(O)R9; C(O)N(R9R9a); S(O)2N(R9R9a); S(O)N(R9R9a); S(O)2R9; S(O)R9; N(R9)S(O)2N(R9aR9b); SR9; N(R9R9a); NO2; OC(O)R9; N(R9)C(O)R9a; N(R9)S(O)2R9a; N(R9)S(O)R9a; N(R9)C(O)OR9a; N(R9)C(O)N(R9aR9b); OC(O)N(R9R9a); T; C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 또는 C2-50 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 T; C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 동일하거나 상이한 하나 이상의 R'10에 의해 치환될 수 있고, 여기서 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 T, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; -S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; -N(R11)-; -OC(O)R11; -N(R11)C(O)-; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; -N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; 및 -OC(O)N(R11R11a)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기에 의해 간섭될 수 있고;
    여기서, R9, R9a, R9b는 H; T; 및 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 또는 C2-50 알키닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 T; C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 동일하거나 상이한 하나 이상의 R'10에 의해 치환될 수 있고, 여기서 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 T, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; -S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; -N(R11)-; -OC(O)R11; -N(R11)C(O)-; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; -N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; 및 -OC(O)N(R11R11a)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기에 의해 간섭될 수 있고;
    T는 페닐; 나프틸; 인데닐; 인다닐; 테트랄리닐; C3-10 사이클로알킬; 4 내지 7원 헤테로사이클릴; 또는 8 내지 11원 헤테로비사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 T는 동일하거나 상이한 하나 이상의 R'10에 의해 치환될 수 있고;
    R'10은 할로겐; CN; 옥소(=O); COOR12; OR12; C(O)R12; C(O)N(R12R12a); S(O)2N(R12R12a); S(O)N(R12R12a); S(O)2R12; S(O)R12; N(R12)S(O)2N(R12aR12b); SR12; N(R12R12a); NO2; OC(O)R12; N(R12)C(O)R12a; N(R12)S(O)2R12a; N(R12)S(O)R12a; N(R12)C(O)OR12a; N(R12)C(O)N(R12aR12b); OC(O)N(R12R12a); 또는 C1-6 알킬이고, 여기서 C1-6 알킬은 동일하거나 상이한 하나 이상의 할로겐에 의해 치환될 수 있고;
    R11, R11a, R12, R12a, R12b는 H; 또는 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 C1-6 알킬은 동일하거나 상이한 하나 이상의 할로겐에 의해 치환될 수 있다.
  10. 제1항에 있어서, VEGF 중화 프로드럭이 화학식 (F-iva) 또는 (F-ivb)의 잔기를 포함하는 것인 약제학적 조성물:
    Figure 112020138202079-pct00160

    상기 화학식에서,
    점선은 하이드로겔 잔기에 대한 결합을 나타내고;
    R3 및 R3a는 제1항에서 정의된 바와 같이 사용되고;
    R10b는 C1-6 알킬이고;
    화학식 (F-iva) 또는 (F-ivb)의 잔기는 추가의 치환기로 치환될 수 있고, 단, 별표로 표시된 수소는 치환기에 의해 치환되지 않으며, R3 및 R3a는 서로 독립적으로 H이거나 sp3-혼성화 탄소 원자를 통해 N에 결합되고,
    상기 추가의 치환기는 할로겐; CN; COOR9; OR9; C(O)R9; C(O)N(R9R9a); S(O)2N(R9R9a); S(O)N(R9R9a); S(O)2R9; S(O)R9; N(R9)S(O)2N(R9aR9b); SR9; N(R9R9a); NO2; OC(O)R9; N(R9)C(O)R9a; N(R9)S(O)2R9a; N(R9)S(O)R9a; N(R9)C(O)OR9a; N(R9)C(O)N(R9aR9b); OC(O)N(R9R9a); T; C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 또는 C2-50 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 T; C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 동일하거나 상이한 하나 이상의 R10에 의해 치환될 수 있고, 여기서 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 T, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; -S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; -N(R11)-; -OC(O)R11; -N(R11)C(O)-; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; -N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; 및 -OC(O)N(R11R11a)로 이루어진 군으로부터 선택는 하나 이상의 기에 의해 간섭될 수 있고;
    여기서, R9, R9a, R9b는 H; T; 및 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 또는 C2-50 알키닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 T; C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 동일하거나 상이한 하나 이상의 R10에 의해 치환될 수 있고, 여기서 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 T, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; -S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; -N(R11)-; -OC(O)R11; -N(R11)C(O)-; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; -N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; 및 -OC(O)N(R11R11a)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기에 의해 간섭될 수 있고;
    T는 페닐; 나프틸; 인데닐; 인다닐; 테트랄리닐; C3-10 사이클로알킬; 4 내지 7원 헤테로사이클릴; 또는 8 내지 11원 헤테로비사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 T는 동일하거나 상이한 하나 이상의 R10에 의해 치환될 수 있고;
    R10은 할로겐; CN; 옥소(=O); COOR12; OR12; C(O)R12; C(O)N(R12R12a); S(O)2N(R12R12a); S(O)N(R12R12a); S(O)2R12; S(O)R12; N(R12)S(O)2N(R12aR12b); SR12; N(R12R12a); NO2; OC(O)R12; N(R12)C(O)R12a; N(R12)S(O)2R12a; N(R12)S(O)R12a; N(R12)C(O)OR12a; N(R12)C(O)N(R12aR12b); OC(O)N(R12R12a); 또는 C1-6 알킬이고, 여기서 C1-6 알킬은 동일하거나 상이한 하나 이상의 할로겐에 의해 치환될 수 있고;
    R11, R11a, R12, R12a, R12b는 H; 또는 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 C1-6 알킬은 동일하거나 상이한 하나 이상의 할로겐에 의해 치환될 수 있다.
  11. 제1항에 있어서, R3이 H이고, R3a가 메틸인 약제학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서, R3 및 R3a가 둘 다 H인 약제학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서, R3 및 R3a가 둘 다 메틸인 약제학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물이 VEGF 핵산을 표적으로 하는 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 리보자임 또는 RNAi 분자; 동족 수용체에 대한 VEGF의 결합을 방지하는 항-VEGF 앱타머, 항-VEGF 항체, 항-VEGF 항체 단편, DARPin, 안티칼린, 리포칼린 및 가용성 VEGF 수용체 데코이; 동족 VEGF 수용체(VEGFR) 핵산을 표적으로 하는 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 리보자임 및 RNAi 분자; 동족 VEGFR 수용체에 결합하는 항-VEGFR 앱타머 또는 항-VEGFR 항체; 동족 VEGFR 수용체에 결합하는 항-VEGFR 항체 단편; 및 VEGFR 티로신 키나제 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 약물을 이의 유리 형태로 더 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물이 VEGF 핵산을 표적으로 하는 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 리보자임 또는 RNAi 분자; 동족 수용체에 대한 VEGF의 결합을 방지하는 항-VEGF 앱타머, 항-VEGF 항체, 항-VEGF 항체 단편, DARPin, 안티칼린, 리포칼린 및 가용성 VEGF 수용체 데코이; 동족 VEGF 수용체(VEGFR) 핵산을 표적으로 하는 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 리보자임 및 RNAi 분자; 동족 VEGFR 수용체에 결합하는 항-VEGFR 앱타머 또는 항-VEGFR 항체; 동족 VEGFR 수용체에 결합하는 항-VEGFR 항체 단편; 및 VEGFR 티로신 키나제 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 활성 잔기를 결합된 형태로 포함하고 있는 프로드럭을 더 포함하는 것인 약제학적 조성물.
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Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2008012991A (es) 2006-04-07 2008-10-17 Procter & Gamble Anticuerpos que ligan proteina tirosina fosfatasa humana beta (hptpbeta) y los usos de estos.
US7622593B2 (en) 2006-06-27 2009-11-24 The Procter & Gamble Company Human protein tyrosine phosphatase inhibitors and methods of use
KR101426125B1 (ko) 2009-07-06 2014-08-06 에르피오 세러퓨틱스 인코포레이티드 암 세포의 전이 예방을 위한 화합물, 조성물 및 방법
US20130095065A1 (en) 2011-10-13 2013-04-18 Aerpio Therapeutics, Inc. Methods for Treating Vascular Leak Syndrome and Cancer
EP2968239B1 (en) 2013-03-14 2019-04-24 The University of Massachusetts Methods of inhibiting cataracts and presbyopia
US20150050277A1 (en) 2013-03-15 2015-02-19 Aerpio Therapeutics Inc. Compositions and methods for treating ocular diseases
JP6311008B2 (ja) * 2013-04-22 2018-04-11 アセンディス ファーマ エー／エス 修飾されたヒドロゲル
US10040850B2 (en) * 2013-10-08 2018-08-07 Ascendis Pharma A/S Protecting group comprising a purification tag
ES2875878T3 (es) * 2013-11-18 2021-11-11 Formycon Ag Composición farmacéutica de un anticuerpo anti-VEGF
WO2015138882A1 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Aerpio Therapeutics, Inc. Hptp-beta inhibitors
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
JP6946182B2 (ja) 2014-10-22 2021-10-06 エクステンド バイオサイエンシズ インコーポレーテッドＥｘｔｅｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ 治療用ビタミンｄコンジュゲート
WO2016073894A1 (en) * 2014-11-07 2016-05-12 Eleven Biotherapeutics, Inc. Therapeutic agents with increased ocular retention
BR112018005737A2 (pt) 2015-09-23 2018-10-09 Genentech Inc anticorpos, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método para produzir o anticorpo, para reduzir ou inibir a angiogênese, para tratar um distúrbio associado à angiogênese, para inibir a permeabilidade vascular, composição, conjugado de anticorpo, proteína de fusão, para identificar uma alteração de resíduos, utilização do anticorpo, utilização do conjugado e utilização da proteína
US10952992B2 (en) 2015-09-23 2021-03-23 Aerpio Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating intraocular pressure with activators of Tie-2
EA035402B1 (ru) 2015-11-13 2020-06-08 Зе Юниверсити Оф Массачусеттс Бифункциональные молекулы, содержащие полиэтиленгликоль, для подавления катаракт и пресбиопии
CA3010056A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Kodiak Sciences Inc. Antibodies and conjugates thereof
US20200276276A1 (en) 2016-03-01 2020-09-03 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S PTH Prodrugs
MX2019003182A (es) * 2016-09-29 2019-08-05 Ascendis Pharma Bone Diseases As Compuestos de hormona paratiroidea con bajas relaciones pico - valle.
FI3518960T3 (fi) 2016-09-29 2023-10-04 Ascendis Pharma Bone Diseases As Annostusohjelma kontrolloidusti vapautuvalle PTH-yhdisteelle
CA3055985A1 (en) 2017-03-22 2018-09-27 Genentech, Inc. Hydrogel cross-linked hyaluronic acid prodrug compositions and methods
JOP20190245A1 (ar) * 2017-04-20 2019-10-15 Novartis Ag أنظمة توصيل إطلاق مستدام تتضمن روابط بلا أثر لنقطة الربط
CN107233570B (zh) * 2017-07-04 2021-11-23 沈阳化工大学 一种载vegf抗体的眼用温敏水凝胶植入剂及其制备方法
EP3773680A1 (en) 2018-03-28 2021-02-17 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Il-2 conjugates
WO2019221576A1 (ko) * 2018-05-17 2019-11-21 광주과학기술원 Ccn5를 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
TW202027794A (zh) * 2018-10-03 2020-08-01 瑞士商諾華公司 血管生成素樣３多肽之持續遞送
JP2022530657A (ja) 2019-04-29 2022-06-30 アイポイント ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド シュレム管を標的とするＴｉｅ－２活性化物質
WO2020254602A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Ascendis Pharma A/S Conjugates of an electron-donating nitrogen or tertiary amine comprising compounds
EP4041312A4 (en) 2019-10-10 2023-12-20 Kodiak Sciences Inc. METHOD FOR TREATING AN EYE DISORDER
TW202210502A (zh) 2020-06-03 2022-03-16 丹麥商阿森迪斯腫瘤製藥有限公司 新穎il-2序列及其用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007130134A2 (en) * 2005-12-02 2007-11-15 (Osi) Eyetech, Inc. Controlled release microparticles
WO2009095479A2 (en) * 2008-02-01 2009-08-06 Ascendis Pharma As Prodrug comprising a self-cleavable linker

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003092665A2 (en) * 2002-05-02 2003-11-13 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Ocular drug delivery systems and use thereof
US20050074497A1 (en) * 2003-04-09 2005-04-07 Schultz Clyde L. Hydrogels used to deliver medicaments to the eye for the treatment of posterior segment diseases
KR101501870B1 (ko) 2003-08-27 2015-03-12 옵쏘테크 코포레이션 안구의 혈관신생성 장애를 치료하기 위한 조합 치료법
US8377917B2 (en) 2004-03-23 2013-02-19 Complex Biosystems Gmbh Polymeric prodrug with a self-immolative linker
JP2007532662A (ja) 2004-04-13 2007-11-15 （オーエスアイ）アイテツク・インコーポレーテツド 高分子量の立体的な基へ抱合された核酸アプタマー
US7968085B2 (en) 2004-07-05 2011-06-28 Ascendis Pharma A/S Hydrogel formulations
GB2427360A (en) 2005-06-22 2006-12-27 Complex Biosystems Gmbh Aliphatic prodrug linker
JP2009510182A (ja) 2005-07-28 2009-03-12 （オーエスアイ）アイテツク・インコーポレーテツド シクリトールリンカーポリマー抱合体
WO2008013913A2 (en) * 2006-07-26 2008-01-31 Aciont, Inc. Method and device for minimally invasive site specific ocular drug delivery
ES2351919B8 (es) 2009-07-28 2012-05-30 Abengoa Solar New Technologies, S.A. Seguidor solar para módulos solares fotovoltáicos de alta concentración de tipo giratorio para cubierta y huertos solares.
WO2011012715A1 (en) * 2009-07-31 2011-02-03 Ascendis Pharma As Biodegradable polyethylene glycol based water-insoluble hydrogels
EP2459227B1 (en) 2009-07-31 2021-03-17 Ascendis Pharma A/S Prodrugs containing an aromatic amine connected by an amide bond to a carrier
US20120191039A1 (en) 2009-07-31 2012-07-26 Ascendis Pharma A/S Carrier linked pramipexole prodrugs
US20130030359A1 (en) 2010-01-22 2013-01-31 Ascendis Pharma A/S Dipeptide-based prodrug linkers for aromatic amine-containing drugs
US9561285B2 (en) 2010-01-22 2017-02-07 Ascendis Pharma As Carrier-linked carbamate prodrug linkers
US9062094B2 (en) 2010-01-22 2015-06-23 Ascendis Pharma As Dipeptide-based prodrug linkers for aliphatic amine-containing drugs
EP2552458A4 (en) 2010-03-31 2014-08-27 Univ Wayne State HYDROGEL NANOPARTICLES OF INJECTABLE DENDRIMER
EP3643306A3 (en) 2011-08-12 2020-08-26 Ascendis Pharma A/S Carrier-linked prodrugs having reversible carboxylic ester linkages
US20150087688A1 (en) 2012-04-25 2015-03-26 Ascendis Pharma A/S Prodrugs of hydroxyl-comprising drugs

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007130134A2 (en) * 2005-12-02 2007-11-15 (Osi) Eyetech, Inc. Controlled release microparticles
WO2009095479A2 (en) * 2008-02-01 2009-08-06 Ascendis Pharma As Prodrug comprising a self-cleavable linker

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