MX2015003970A - Profarmacos neutralizantes del factor de crecimiento endotelial vascular para el tratamiento de afecciones oculares. - Google Patents

Profarmacos neutralizantes del factor de crecimiento endotelial vascular para el tratamiento de afecciones oculares.

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Abstract

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y un profármaco de neutralización de VEGF, que comprende un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF, para uso en un método para el tratamiento de una o más afecciones oculares.

Description

PROFÁRMACOS NEUTRALIZANTES DEL FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR PARA EL TRATAMIENTO DE AFECCIONES OCULARES Descripción de la Invención La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas para uso en un método para el tratamiento de una o más afecciones oculares.
Una causa principal de la ceguera es la incapacidad para tratar suficientemente ciertas enfermedades de los ojos. Una limitación importante es la falta de opciones apropiadas de introducir fármacos o agentes terapéuticos en el ojo y mantener estos fármacos o agentes en una concentración terapéuticamente eficaz en el mismo para la duración necesaria. La administración sistémica puede no ser una solución ideal porque, frecuentemente, altos niveles inaceptables de dosificación sistémica son necesarios para alcanzar concentraciones intraoculares eficaces, con el aumento de la incidencia de efectos secundarios inaceptables de los fármacos. Instilación ocular simple o aplicación no es una alternativa aceptable en muchos casos porque el medicamento se puede lavar rápidamente por acción de desgarro o se agota desde dentro del ojo en la circulación general. La terapia del ojo tópica está limitada por la mala absorción, una necesidad de una dosificación frecuente y/o crónica Ref . 255138 durante períodos de días a años, rápida rotación de humor acuoso, producción y movimiento de la película lagrimal y otras causas, que puede eliminar eficazmente agentes terapéuticos antes de la terapia se ha completado o la dosis apropiada liberada.
Inyecciones intraoculares tienen la ventaja de que pueden proporcionar una biodisponibilidad incrementada a una ubicación objetivo (por ejemplo, la retina) del ojo en relación con otros mecanismos de liberación, tales como administración tópica. Sin embargo, también tienen inconvenientes y pueden presentar diversas complicaciones diferentes. Por ejemplo, las inyecciones intravítreas pueden resultar en la administración de concentraciones indeseablemente altas de agente terapéutico a una ubicación objetivo o en otro lugar particularmente cuando el agente terapéutico es relativamente soluble. Además, las inyecciones intraoculares son muy desagradables para el paciente. Además, como la propia inyección intraocular puede causar complicaciones, tales como endoftalmitis y desprendimiento de retina, es altamente deseable tener la más larga duración posible entre las inyecciones, mientras que conserva los niveles terapéuticos del fármaco en el ojo.
Además de los agentes terapéuticos anteriores, liberados por inyecciones intravítreas pueden carecer de duración de la acción puesto que los agentes frecuentemente pueden dispersarse rápidamente dentro del ojo después de la inyección. Tal falta de duración es particularmente indeseable puesto que puede requerir una mayor frecuencia de inyección. Ranibizumab y pegaptanib, por ejemplo, se administran a un paciente a través de la inyección intraocular cada 4 y 6 semanas, respectivamente, que es una experiencia muy desagradable para el paciente.
Por lo tanto, hay un reconocimiento generalizado de que el campo de la oftalmología se beneficiaría de formulaciones más duraderas. Ellas beneficiarían el cuidado del paciente y la salud ocular, proporcionando administración prolongada de agentes terapéuticos para el ojo mientras que minimiza los problemas asociados con el cumplimiento del paciente a los regímenes médicos terapéuticos prescritos.
La expresión de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés), una proteína señal producida por las células que estimulan la vasculogénesis y la angiogénesis, desempeña un papel importante en diversas enfermedades oculares, tales como en ciertas formas de degeneración macular y retinopatía.
Varios medicamentos para tratar tales afecciones oculares están en el mercado, tal como ranibizumab, aflibercept y pegaptanib. La aplicación al paciente se produce a través de inyecciones intraoculares cada 4 y 8 semanas .
En vista de lo anterior, existe una necesidad de proporcionar una forma de administración que supera estos inconvenientes, por lo menos parcialmente.
Este objetivo se consigue con una composición farmacéutica que comprende uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y un profármaco neutralizante de VEGF, el profármaco comprende un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF unido covalentemente, para uso en un método para el tratamiento de una o más afecciones oculares.
Dentro de la presente invención, los términos se utilizan con el significado de la siguiente manera.
Como se usa aquí, el término "fármaco neutralizante del VEGF" significa un fármaco que exhibe su efecto farmacéutico a través de neutralizar el efecto del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). El efecto de VEGF se puede neutralizar mediante la unión del fármaco al receptor del VEGF o la unión al VEGF en sí mismo, bloqueando o reduciendo así la unión eficaz de VEGF a su receptor. Alternativamente, el efecto neutralizante se puede obtener mediante la inhibición o interfiriendo con la expresión y la producción de VEGF, o interferir con la señalización de VEGF.
Tal como se utiliza aquí, el término "hidrogel" se refiere a una red polimérica hidrofílica o anfifílica compuesta de homopolímeros o copolímeros, que es insoluble debido a la presencia de reticulaciones químicas covalentes.
Las reticulaciones proporcionan la estructura de red y la integridad física. Los hidrogeles exhiben una compatibilidad termodinámica con agua que les permite que se hinchen en medios acuosos.
Tal como se utiliza aquí, el término "reactivo" significa un compuesto químico que comprende un grupo funcional para la reacción con otro grupo funcional.
Tal como se utiliza aquí, el término "reactivo de esqueleto" significa un reactivo, que es apropiado como material de partida para la formación de hidrogeles. Como se utiliza aquí, un reactivo de esqueleto preferiblemente no comprende enlaces biodegradables.
Tal como se utiliza aquí, el término "reactivo de reticulación" significa un reactivo lineal o ramificado, que es apropiado como un material de partida para reticular reactivos principales. Preferiblemente, el reactivo reticulante es un compuesto químico lineal. Un reactivo reticulante tal como se usa en el presente documento comprende por lo menos un enlace biodegradable.
Tal como se utiliza aquí, el término "resto" significa una parte de una molécula, que carece de uno o más átomos en comparación con el reactivo correspondiente. Si, por ejemplo, un reactivo de la fórmula "H-X-H" reacciona con otro reactivo y se convierte en parte del producto de reacción, el resto correspondiente del producto de reacción tiene la estructura "H-X-" o "-X-", mientras que cada indica la unión a otro resto.
Por lo tanto, la frase "en forma unida" se utiliza para referirse al resto correspondiente de un reactivo, en este caso, "lisina en forma unida" se refiere a un resto de lisina que carece de uno o más átomos del reactivo de lisina y es parte de una molécula.
Tal como se utiliza aquí, el término "grupo funcional" significa un grupo de átomos que pueden reaccionar con otros grupos funcionales. Los grupos funcionales incluyen, pero no se limitan a los siguientes grupos: ácido carboxílico (-(C=0)0H) o una forma activada del mismo, como un éster carboxílico o haluro de ácido; amina primaria o secundaria (-NH2, -NH-); maleimida; tiol(-SH); ácido sulfónico (-(0=S=0)OH); carbonato; carbamato (-0(C=0)N<); hidroxi (-OH); aldehido (-(C=0)H); cetona (-(C=0)-); hidrazina (>N-N<); isocianato; isotiocianato; ácido fosfórico (-O(P=0)OHOH); ácido fosfónico (-0(P=0)OHH); haloacetilo; haluro de alquilo; acriloilo; fluoruro de arilo; hidroxilamina; disulfuro; sulfona de vinilo; vinil cetona; diazoalcano; oxirano; y aziridina.
Si un grupo funcional está acoplado a otro grupo funcional, la estructura resultante es referida como "ligamiento". Por ejemplo, la reacción de un grupo amino con un grupo carboxilo resulta en un enlace amidíco.
Tal como se utiliza aquí, el término "grupo funcional activo" significa un grupo funcional, que está conectado a un grupo de activación. Grupos funcionales activados preferidos incluyen, pero no se limitan a grupos áster activados, grupos carbamato activados, grupos carbonato activados y grupos de tiocarbonato.
Tal como se utiliza aquí, el término "grupo protector" significa un resto que es irreversible, en este caso, de forma permanente, conectado a un grupo funcional que lo convierte incapaz de reaccionar con grupos funcionales de otros reactivos o restos.
Tal como se utiliza aquí, el término "polímero" significa una molécula que comprende unidades estructurales de repetición, en este caso, los monómeros, conectados por enlaces químicos en una forma lineal, circular, ramificada, reticulada o dendrimérica o una combinación de los mismos, que puede ser de origen sintético o biológico o una combinación de ambos. Se entiende que un polímero por ejemplo también puede comprender grupos funcionales o restos protectores. Preferiblemente, un polímero tiene un peso molecular de por lo menos 0.5 kDa, por ejemplo, un peso molecular de por lo menos 1 kDa, un peso molecular de por lo menos 2 kDa, un peso molecular de por lo menos 3 kDa o un peso molecular de por lo menos 5 kDa.
Tal como se utiliza aquí, el término "polimérico" significa un reactivo o un resto que comprende uno o más polímeros.
Tal como se utiliza aquí, el término "peso molecular promedio en número" significa la media aritmética ordinaria de los pesos moleculares de los polímeros individuales. La persona experimentada en la téenica entiende que los productos de polimerización obtenidos de una reacción de polimerización no tienen todos el mismo peso molecular, sino más bien exhibe una distribución de peso molecular. Por lo tanto, los rangos de peso molecular, los pesos moleculares, los rangos de números de monómeros en un polímero y números de monómeros en un polímero tal como se usa en el presente documento, se refieren al peso molecular promedio en número y número promedio de monómeros.
Tal como se utiliza aquí, el término "polimerización" significa el proceso de reaccionar reactivos monómeros o macromonómeros en una reacción química para formar cadenas o redes de polímeros, incluyendo, pero no limitado a hidrogeles.
Tal como se utiliza aquí, el término "macromonómero" significa una molécula que fue obtenida de la polimerización de reactivos de monómeros.
Tal como se utiliza aquí, el término "polimerización por condensación" o "reacción de condensación" significa una reacción química, en la que los grupos funcionales de dos reactivos reaccionan para formar una sola molécula, el producto de reacción, y una molécula de bajo peso molecular, por ejemplo agua, se libera.
Tal como se utiliza aquí, el término "polimerización en suspensión" significa una reacción de polimerización heterogénea y/o bifásica, en donde los reactivos de monómero se disuelven en un solvente A, que forma la fase dispersa que se emulsiona en un solvente B, formando la fase continua. En la presente invención, los reactivos de monómero son el reactivo de esqueleto y el reactivo reticulante.
Ambos el solvente A y los reactivos de monómeros no son solubles en el solvente B. Tal emulsión se forma mediante agitación, sacudido, exposición a ultrasonido o emulsificación con MicroSieve™, más preferiblemente por agitación o emulsificación con MicroSieve™ y más preferiblemente por agitación. Esta emulsión se estabiliza por un emulsionante apropiado. La polimerización se inició mediante la adición de un iniciador que es soluble en el solvente A. Un iniciador comúnmente conocido apropiado puede ser una base terciaria, tal como tetrametiletilenodiamina (TMEDA).
Tal como se utiliza aquí, el término "inerte" se refiere a un resto que no es químicamente reactivo, en este caso, que no reacciona con otros restos o reactivos. La persona experimentada en la téenica entiende que el término "inerte", per se no excluye la presencia de grupos funcionales, pero entiende que los grupos funcionales potencialmente presentes en un resto inerte no son reactivos con los grupos funcionales de restos/reactivos puestos en contacto con la fracción inerte en, por ejemplo, reacciones posteriores. En particular, el resto inerte Z no reacciona con Ax0 o Ax2 o con grupos funcionales presentes, por ejemplo, en los reactivos enlazadores de profármacos reversibles, fármacos, reactivos de conjugado de resto enlazador de profármaco reversible-resto biológicamente activo, reactivos separadores que pueden estar covalentemente conjugados con el hidrogel de la presente invención para obtener el profármaco ligado al hidrogel de la presente invención.
Tal como se utiliza aquí, el término "inmiscible" significa la propiedad en la que dos sustancias que no son capaces de combinarse para formar una mezcla homogénea.
Tal como se utiliza aquí, el término "poliamina" significa un reactivo o resto que comprende más de un grupo amina (-NH- o -NH2), por ejemplo, 2 hasta 64 grupos amina, 4 hasta 48 grupos amina, 6 hasta 32 grupos amina, desde 8 hasta 24 grupos amina, desde 10 hasta 16 grupos amina. Particularmente poliaminas preferidas comprenden desde 2 hasta 32 grupos amina.
Tal como se utiliza aquí, el término "a base de PEG que comprende por lo menos X% de PEG" en relación a un resto o reactivo significa que tal resto o reactivo comprende por lo menos X% (peso/peso) de unidades de etilen glicol (-CH2CH2O-), en donde las unidades de etilen glicol pueden estar dispuestas por bloques, en forma alternada o pueden estar distribuidas aleatorios dentro del resto o reactivo y preferiblemente todas las unidades de etilenglicol del resto o reactivo están presentes en un bloque; el porcentaje en peso restante del resto o reactivo a base de PEG son otros restos especialmente seleccionados de los siguientes sustituyentes y enlaces: • alquilo C1-50, alquenilo C2-50, alquinilo C2-50, cicloalquilo C3-10, heterociclilo de 4 a 7 miembros , heterobiciclilo de 8 a 11 miembros, fenilo; naftilo; indenilo; indanilo; y tetralinilo; y • enlaces seleccionados del grupo que comprende - 1 - en donde las líneas discontinuas indican la unión al resto de la molécula, resto o reactivo, y R1 y Rla son independientemente uno de otro seleccionados de H y alquilo Ci-6.
Tal como se utiliza aquí, el término "alquilo Ci-4", solo o en combinación significa un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. Si está presente en el extremo de una molécula, ejemplos de grupos alquilo Ci-4 de cadena lineal y ramificada son metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo y tere-butilo. Cuando dos restos de una molécula están unidos por el grupo alquilo Ci-4, entonces los ejemplos para tales grupos alquilo Ci-4 son -CH2-, -CH2-CH2-, -CH(CH3)-, -CH2-CH2- CH2-, -CH (C2H5)-, -C(CH3)2-, -CH2-CH-CH2-CH2-, y -CH2-CH2- CH2(CH3)-. Cada átomo de hidrógeno de un grupo alquilo Ci-4 puede estar sustituido por un sustituyente como se define a continuación.
Tal como se utiliza aquí, el término "alquilo Ci-6", solo o en combinación significa un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 6 átomos de carbono. Si está presente en el extremo de una molécula, ejemplos de grupos alquilo Ci-6 de cadena lineal y ramificada son metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, ter-butilo, n-pentilo, 2-metilbutilo, 2,2-dimetilpropilo, n-hexilo, 2 -metilpentilo, 3-metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo, 2,3-dimetilbutilo y 3,3-dimetilpropilo. Cuando dos restos de una molécula están unidos por el grupo alquilo Ci-6, entonces los ejemplos de tales grupos alquilo Ci-6 son -CH2-, -CH2-CH2-, -CH(CH3)-, -CH2-CH2-CH2-, -CH(C2H5)- y -C(CH3)2-. Cada átomo de hidrógeno de un grupo alquilo Ci-s puede estar sustituido por un sustituyente como se define a continuación.
Por lo tanto, como se usa aquí, el término "alquilo Ci-20", solo o en combinación significa un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 20 átomos de carbono. El término "alquilo Ce-ie", solo o en combinación significa un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene de 8 a 18 átomos de carbono. Por lo tanto, como se usa aquí, el término "alquilo C1-50", solo o en combinación significa un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 50 átomos de carbono. Cada átomo de hidrógeno de un grupo alquilo C1-20, un grupo alquilo Cs-ie y grupo alquilo C1-50 pueden ser sustituidos por un sustituyente. En cada caso el grupo alquilo puede estar presente en el extremo de una molécula o dos restos de una molécula pueden estar ligados por el grupo alquilo.
Tal como se utiliza aquí, el término "alquenilo C2-6", solo o en combinación significa un resto de hidrocarburo de cadena lineal o ramificada que comprende por lo menos un doble enlace carbono-carbono tiene de 2 a 6 átomos de carbono. Si está presente en el extremo de una molécula, los ejemplos son -CH= CH2, -CH=CH-CH3, -CH2-CH=CH2, -CH=CHCH2-CH3 y -CH=CH-CH=CH2. Cuando dos restos de una molécula están ligados por el grupo alquenilo C2-6, entonces, un ejemplo para tal alquenilo C2-6 es -CH=CH-. Cada átomo de hidrógeno de un grupo alquenilo C2-6 puede estar sustituido por un sustituyente como se define a continuación. Opcionalmente, se pueden producir uno o más triples enlaces.
Por lo tanto, como se usa aquí, el término "alquenilo C2- 20" , solo o en combinación significa un resto de hidrocarburo de cadena lineal o ramificada que comprende por lo menos un enlace doble carbono-carbono que tiene de 2 a 20 átomos de carbono. El término alquenilo "C2-so", solo o en combinación significa un residuo de hidrocarburo de cadena lineal o ramificada que comprende por lo menos un doble enlace carbono-carbono que tiene de 2 hasta 50 átomos de carbono. Si está presente en el extremo de una molécula, los ejemplos son -CH=CH2, -CH=CH-CH3J -CH2-CH=CH2, -CH=CHCH2-CH3 y -CH=CH-CH=CH2. Cuando dos restos de una molécula están unidos por el grupo alquenilo, a continuación, un ejemplo es, por ejemplo -CH=CH- . Cada átomo de hidrógeno de un grupo alquenilo C2-20 o alquenilo C2-so puede estar sustituido por un sustituyente como se define a continuación. Opcionalmente, se pueden producir uno o más triples enlaces.
Tal como se utiliza aquí, el término "alquinilo C2-6", solo o en combinación significa residuo de hidrocarburo de cadena lineal o ramificada que comprende por lo menos un triple enlace carbono-carbono que tiene 2 a 6 átomos de carbono. Si está presente en el extremo de una molécula, los ejemplos son -CºCH, -CH2-CºCH, CH2-CH2-CºCH y CH2-CºC-CH3. Cuando dos restos de una molécula están unidos por el grupo alquinilo, entonces, un ejemplo es: -CºC-. Cada átomo de hidrógeno de un grupo alquinilo C2-e puede estar sustituido por un sustituyente como se define a continuación. Opcionalmente, se pueden producir uno o más enlaces dobles.
Por lo tanto, como se usa aquí, el término "alquinilo C2- 20" , solo o en combinación significa un residuo de hidrocarburo de cadena lineal o ramificada que comprende por lo menos un triple enlace carbono-carbono que tiene 2 hasta 20 átomos de carbono y "alquinilo C2-so", solo o en combinación significa un residuo de hidrocarburo de cadena lineal o ramificada que comprende por lo menos un triple enlace carbono-carbono que tiene de 2 a 50 átomos de carbono. Si está presente en el extremo de una molécula, los ejemplos son -CºCH, -CH2-CºCH, CH2-CH2-CºCH y CH2-CºC-CH3. Cuando dos restos de una molécula están ligados por el grupo alquinilo, entonces, un ejemplo es -CºC-. Cada átomo de hidrógeno de un grupo alquinilo C2-2o o alquinilo C2-so puede ser sustituido por un sustituyente como se define a continuación. Opcionalmente, se pueden producir uno o más enlaces dobles.
Tal como se utilizan aquí, los términos "cicloalquilo C3- i" o "anillo cicloalquilo C3-7" significan una cadena de alquilo cíclico que tiene de 3 a 7 átomos de carbono, que puede estar saturado o insaturado, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo. Cada átomo de hidrógeno de un carbono cicloalquilo puede estar sustituido por un sustituyente como se define a continuación. El término "cicloalquilo C3-7" o "anillo de cicloalquilo C3-7" también incluye biciclos en puente como norbonano o norboneno. Por lo tanto, "cicloalquilo C3-5" significa un cicloalquilo que tiene de 3 a 5 átomos de carbono y cicloalquilo C3-10 tiene de 3 a 10 átomos de carbono.
Por lo tanto, como se usa aquí, el término "cicloalquilo C3-10" significa un sistema de anillo carbocíclico que tiene 3 a 10 átomos de carbono, que puede estar saturado o insaturado, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo, ciclooctilo, ciclononilo, ciclodecilo. El término "cicloalquilo C3-10" también incluye por lo menos carbomono-y-biciclos parcialmente saturados.
Tal como se utiliza aquí, el término "halógeno" significa fluoro, cloro, bromo o yodo. Particularmente preferido es flúor o cloro.
Tal como se utiliza aquí, el término "heterociclilo de 4 a 7 miembros" o "heterociclo de 4 a 7 miembros" significa un anillo con 4, 5, 6 ó 7 átomos del anillo que pueden contener hasta el número máximo de dobles enlaces (anillo aromático o no aromático que está totalmente, parcialmente o insaturado) en donde por lo menos un átomo de anillo de hasta 4 átomos de anillo están sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de azufre (incluyendo -S(O)-, -S(O)2-), oxígeno y nitrógeno (incluyendo =N(0)-) y en donde el anillo está unido al resto de la molécula mediante un átomo de carbono o nitrógeno. Ejemplos de heterociclos de 4 a 7 miembros incluyen, pero no se limitan a azetidina, oxetano, tietano, furano, tiofeno, pirrol, pirrolina, imidazol, imidazolina, pirazol, pirazolina, oxazol, oxazolina, isoxazol, isoxazolina, tiazol, tiazolina, isotiazol, isotiazolina, tiadiazol, tiadiazolina, tetrahidrofurano, tetrahidrotiofeno, pirrolidina, imidazolidina, pirazolidina, oxazolidina, isoxazolidina, tiazolidina, isotiazolidina, tiadiazolidina, sulfolano, pirano, dihidropirano, tetrahidropirano, imidazolidina, piridina, piridazina, pirazina, pirimidina, piperazina, piperidina, morfolina, tetrazol, triazol, triazolidina, tetrazolidina, diazepan, azepina y homopiperazina. Cada átomo de hidrógeno de un heterociclilo de 4 a 7 miembros o un grupo heterocíclico de 4 a 7 miembros puede ser sustituido por un sustituyente como se define a continuación.
Tal como se utiliza aquí, el término "heterobiciclilo de 8 a 11 miembros" o "heterobiciclo de 8 a 11 miembros" significa un sistema heterocíclico de dos anillos con 8 a 11 átomos en el anillo, en donde se comparte por lo menos un átomo del anillo por ambos anillos y que pueden contener hasta el número máximo de dobles enlaces (anillo aromático o no aromático que está totalmente, parcialmente insaturado) en donde por lo menos un átomo de anillo de hasta 6 átomos del anillo se sustituyen por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de azufre (incluyendo -S(O)-, -S(0)2~), oxígeno y nitrógeno (incluyendo =N(0)-) y en donde el anillo está unido al resto de la molécula mediante un átomo de carbono o nitrógeno. Ejemplos para un heterobiciclo de 8 a 11 miembros son indol, indolina, benzofurano, benzotiofeno, benzoxazol, bencisoxazol, benzotiazol, bencisotiazol , bencimidazol, bencimidazolina, quinolina, quinazolina, dihidroquinazolina, quinolina, dihidroquinolina , tetrahidroquinolina, decahidroquinolina, isoquinolina, decahidroisoquinolina, tetrahidroisoquinolina, dihidroisoquinolina, benzazepina, purina y pteridina. El término heterobiciclo de 8 a 11 miembros también incluye estructuras espiro de dos anillos como 1,4-dioxa-8-azaespiro [4.5]decano o heterociclos en puente como 8-aza-biciclo [3.2.1]octano. Cada átomo de hidrógeno de un heterobiciclilo de 8 a 11 miembros o carbono de heterobiciclo de 8 a 11 miembros puede ser sustituido por un sustituyente como se define a continuación.
El término "sustituido" significa que uno o más átomos de -H de una molécula se sustituyen por un átomo diferente o un grupo de átomos, que se conocen como "sustituyente" o "sustituyentes". Los sustituyentes apropiados son seleccionados del grupo que consiste de halógeno; CN; COOR9; O9; C(O)R9; C(O)N (R9R9a); S(O)2N (R9R9a); S(0)N (R9R9a); S(O)2R9; S(0)R9; N (R9)S(0)2N (R9aR9b); SR9; N (R9R9a); NO2; 0C(O)R9; N(R9)C(O)R9a; N (R9)S(0)2R9a; N (R9)S(O)R9a; N (R9)C(O)0R9a; N(R9)C(O)N (R9aR9b); OC(O)N (R9R9b); T; alquilo Ci-so; alquenilo C2-5o; o alquinilo C2-5o, en donde T; alquilo C1-50; alquenilo C-5o; y alquinilo C2_5o están opcionalmente sustituidos con uno o más R10, que son iguales o diferentes y en donde alquilo Ci-so; alquenilo C2-5o; y alquinilo C2-5o están opcionalmente interrumpidos por uno o más grupos seleccionados del grupo que consiste de T, -C(0)0-; -O-; -C(0)-; -C(0)N (R11)-; S(0)2N(R11) -S(O)N (R11)-; -S(0)2-; -S(0)-; -N (R11)S(0)2N (R11)-; -S-; -N (R11)-; -OCÍOlR11; -N (R11)C(0)-; -N(R )S(0)2-; N {R11) S (0) - ; -N (R11)C(0)O-; -N (R11)C(0)N(Rlla)-; y 0C(0)N (Rl:LRlla); en donde R9, R9a, R 9b se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H; T; y alquilo C1-50; alquenilo C2-50; o alquinilo C2-5o, en donde T; alquilo C1-50; alquenilo C2-50; y alquinilo C2-50 están opcionalmente sustituidos con uno o más R10, que son iguales o diferentes y en donde alquilo Ci-50; alquenilo C2-50; y alquinilo C2-50 están opcionalmente interrumpidos por uno o más grupos seleccionados del grupo que consiste de T, -C(O)0-; -O-; -C(O)-; -C(0)N(R1:L)-; SÍOlsNÍR11) -S (O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N (R11)S(O)2N (Rlla)-; -S-; -N (R11)-; -OCfOlR11; -N (R11)C(0)-; -N (R11)S(0)2-; - N(Ri:i)S(0)-; -N (R11)C(O)O-; -N (R11)C(O)N(Rlla)-; y OCÍOW R^R113); T se selecciona del grupo que consiste de fenilo; naftilo; indenilo; indanilo; tetralinilo; cicloalquilo C3-10; heterociclilo de 4 a 7 miembros; o heterobiciclilo de 8 a 11-miembros, en donde T está opcionalmente sustituido con uno o más R10, que iguales o diferentes; R10 es halógeno; CN; oxo(=0); COOR12; 0R12; C(0)R12; C (O)N (R12R12a); S(0)2N(R12R12a); S(O)N (R12R12a); S(0)2R12; S(0)R12; N (R12)S(0)2N(R12aR12b); SR12; N(R12R12a); NO2; 0C(0)R12; N (R12)C(0)R12a; N(R12)S(0)2R12a; N (R12)S(0)R12a; N(R12)C(0)0R12a; N(R12)C(0)N(R12aR12b); 0C(0)N (R12R12a); o alquilo Ci-6, en donde alquilo C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, que son iguales o diferentes; R11, Rlla, R12, R12a, R12b son seleccionados independientemente del grupo que consiste de H; o alquilo Ci-6, en donde alquilo C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, que son iguales o diferentes .
En una modalidad R9, R9a, R9b puede ser independientemente uno de otro H.
En una modalidad R10 es alquilo Ci-6.
En una modalidad T es fenilo.
Tal como se utiliza aquí, el término "interrumpido" significa que entre dos átomos de carbono o al final de una cadena de carbono entre el átomo de carbono respectivo y el átomo de hidrógeno de uno o más heteroátomo son insertados.
Tal como se utiliza aquí, el término "profármaco" significa un compuesto que sufre biotransformación antes de exhibir sus efectos farmacológicos. Los profármacos de este modo pueden ser vistos como restos biológicamente activos conectados a grupos protectores no tóxicos especializados utilizados de manera transitoria para alterar o eliminar propiedades indeseables en la molécula parental. Esto también incluye la mejora de las propiedades deseables en el fármaco y la supresión de propiedades indeseables.
Tal como se utiliza aquí, el término "profármaco ligado al portador" significa un profármaco que contiene un enlace temporal de un resto biológicamente activo con un grupo portador transitorio que produce propiedades fisicoquímicas o farmacocinéticas mejoradas y que se puede quitar fácilmente in vivo, por lo general por una división hidrolítica. Durante la administración de tales profármacos ligados al portador a un mamífero, preferiblemente a un ser humano, las moléculas del fármaco se liberan. Por lo tanto, un profármaco ligado al portador comprende un resto biológicamente activo, un resto enlazador de profármaco reversible y un grupo portador, en donde el resto biológicamente activo está conectado de manera reversible al grupo portador a través de un enlazador de profármaco reversible. Se entiende que el resto biológicamente activo es reversible y ligado covalentemente al enlazador de profármaco reversible en donde el enlazador de profármaco reversible está ligado covalentemente al grupo portador. Preferiblemente, el enlace entre el enlazador de profármaco reversible y el grupo portador es un enlace covalente estable.
Tal como se utiliza aquí, el término "resto enlazador de profármaco reversible" significa un resto que en uno de sus extremos está unido a un resto biológicamente activo D, en este caso, un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF, a través de un enlace reversible y en otro extremo está unido a través de un enlace permanente a un portador, de este modo ligar el resto biológicamente activo neutralizante de VEGF al portador. Tales enlazadores de profármacos reversibles son hidrolíticamente degradables no enzimáticamente, en este caso, dividibles, bajo condiciones fisiológicas (solución amortiguadora acuosa a pH 7.4, 37°C) con semividas que se encuentran en el intervalo desde, por ejemplo, a una hora a doce meses. Enlaces reversibles son, por ejemplo, aconitilos, acetales, amidas, anhídridos carboxílíeos, ésteres, iminas, hidrazonas, amidas de ácido maleámico, orto ésteres, fosfamidas, fosfoésteres, fosfosilil ésteres, silil ésteres, ésteres sulfónicos, carbamatos aromáticos, y combinaciones de los mismos.
Por el contrario, los enlaces permanentes son no enzimáticamente hidrolíticamente degradables bajo condiciones fisiológicas (solución amortiguadora acuosa a pH 7.4, 37°C), con una vida media de más de doce meses.
Tal como se utiliza aquí, el término "resto enlazador de profármaco sin dejar rastro" significa un resto enlazador profármaco reversible que durante la escisión libera el fármaco en su forma libre. Tal como se utiliza aquí, el término "forma libre" de un fármaco significa el fármaco en su forma farmacológicamente activa no modificada.
Tal como se utiliza aquí, el término "péptido" significa un polímero corto de monómeros de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. El término "polipéptido" significa un péptido que comprende hasta e incluyendo 50 monómeros de amino ácido. El término "proteína" significa un péptido de más de 50 monómeros de amino ácido.
Tal como se utiliza aquí, el término "composición farmacéutica" significa uno o más ingredientes activos, y uno o más ingredientes inertes, así como cualquier producto que resulte, directamente o indirectamente, de la combinación, complejación o agregación de cualquiera dos o más de los ingredientes, o de la disociación de uno o más de los ingredientes, o de otros tipos de reacciones o interacciones de uno o más de los ingredientes. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas de la presente invención abarcan cualquier composición preparada mezclando el profármaco neutralizante de VEGF y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
Tal como se utiliza aquí, el término "excipiente" se refiere a un diluyente, adyuvante, o vehículo con el que el agente terapéutico, en este caso, el profármaco neutralizante de VEGF, es administrado. Tal excipiente farmacéutico puede ser agua; aceites y petróleo de origen animal, vegetal o sintético, incluyendo pero no limitado a aceite de cacahuete, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares; almidón; glucosa; lactosa; sacarosa; manitol; trehalosa; gelatina; malta; arroz; harina; tiza; gel de sílice; estearato de sodio; monoestearato de glicerol; talco; cloruro de sodio; leche descremada en polvo; glicerol; propileno; glicol; etanol; acetato; succinato; tris; carbonato; fosfato; HEPES (ácido 4- (2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico); MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico); Tween ; poloxámeros; poloxaminas; CHAPS; Igepal; aminoácidos como, por ejemplo, glicina, lisina, o histidina; triglicéridos; manitol; lactosa; almidón; estearato de magnesio; sacarina sódica; celulosa; y carbonato de magnesio. Ejemplos de excipientes farmacéuticos apropiados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. La formulación debe adecuarse al modo de administración.
Tal como se utiliza aquí, el término "farmacéuticamente aceptable" significa que una molécula o reactivo es aprobado por una agencia reguladora, tal como la EMA (Europa) y/o la FDA (US) y/o cualquier otra agencia reguladora nacional, para su uso en animales, preferiblemente en seres humanos.
Tal como se utiliza aquí, el término "inyección intraocular" significa una inyección en el humor acuoso (cámara anterior o posterior), el cuerpo vitreo, la lente o el espacio supracoroideo del ojo. En general, el término "comprende" o "que comprende" abarca también "consiste de, o "que consiste de".
Tal como se utiliza aquí, el término "moduladores de la actividad de la proteína X" se refiere a moléculas que son agonistas, antagonistas o de otro modo neutralizan o mejora, la actividad de la proteína X.
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y un profármaco neutralizante de VEGF, el profármaco que comprende un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF unido covalentemente, para uso en un método para el tratamiento de una o más afecciones oculares.
En una modalidad preferida, la composición farmacéutica que comprende un profármaco neutralizante de VEGF se administra por vía intraocular, preferiblemente a través de la inyección intraocular.
En una modalidad preferida, el período de tiempo entre dos administraciones intraoculares del profármaco neutralizante de VEGF es por lo menos un mes, por ejemplo, el período de tiempo entre dos administraciones intraoculares del profármaco neutralizante de VEGF es por lo menos un mes, o por lo menos cinco semanas, o por lo menos seis semanas, o por lo menos ocho semanas, o por lo menos diez semanas, o por lo menos doce semanas, o por lo menos dieciséis semanas, o por lo menos veinte semanas, o por lo menos veinticuatro semanas, o por lo menos veinti ocho semanas, o por lo menos treinta y dos semanas, o por lo menos treinta y seis semanas o por lo menos cuarenta semanas, o por lo menos cuarenta y cuatro semanas, o por lo menos cuarenta y ocho semanas. El periodo máximo entre dos administraciones intraoculares preferiblemente no superior cuatro años, en este caso no superior a tres años, no superior a dos años, o no superior a un año. Preferiblemente, la composición farmacéutica que comprende el profármaco neutralizante de VEGF se administra cada dos a doce meses, más preferiblemente cada cuatro a diez meses y lo más preferiblemente cada seis meses.
Por lo tanto, un aspecto preferido de la invención es la composición farmacéutica, en donde el profármaco comprendido en la composición farmacéutica tiene una concentración de 5 hasta 200 mg de profármaco/ml de composición farmacéutica, por ejemplo, una concentración de 5 a 180 mg de profármaco/ml de composición farmacéutica, una concentración de 10 hasta 170 mg de profármaco/ml de composición farmacéutica, una concentración de 15 hasta 160 mg de profármaco/ml de composición farmacéutica, una concentración de 20 hasta 150 mg de profármaco/ml de composición farmacéutica, una concentración de 25 hasta 140 mg de profármaco/ml de composición farmacéutica, una concentración de 30 hasta 130 mg de profármaco/ml de composición farmacéutica, una concentración de 40 hasta 120 mg de profármaco/ml de composición farmacéutica, una concentración de 50 hasta 110 mg de prof ármaco/ml de composición farmacéutica o una concentración de 60 hasta 100 mg de profármaco/ml de composición farmacéutica.
En una modalidad, la composición farmacéutica comprende 5 hasta 80 por ciento en peso de resto biológicamente activo neutralizante de VEGF con base en el peso total del profármaco, por ejemplo, 10 hasta 70 por ciento en peso de resto biológicamente activo neutralizante de VEGF basado en el peso total del profármaco, 15 hasta 65 por ciento en peso del resto biológicamente activo neutralizante de VEGF con base en el peso total del profármaco, 20 hasta 65 por ciento en peso del resto biológicamente activo neutralizante de VEGF con base en el peso total del profármaco o 30 a 65 por ciento en peso del resto biológicamente activo neutralizante de VEGF con base en el peso total del profármaco.
En una modalidad, la inyección se lleva a cabo con un volumen de inyección que se encuentra en el intervalo desde 10 hasta 200 ml, por ejemplo, que se encuentra en el intervalo desde 15 hasta 150 ml, que se encuentra en el intervalo desde 20 hasta 100 m?, que se encuentra en el intervalo desde 30 hasta 80 m?, o que se encuentra en el intervalo desde 40 hasta 70 m?. Preferiblemente, el volumen de inyección es 50 m?.
El profármaco neutralizante de VEGF es preferiblemente un profármaco ligado al portador.
En los profármacos neutralizantes de VEGF se incluyen diversas estequiometrías con respecto a los fármacos y el portador.
En una modalidad de un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF está conectado a través de un resto enlazador de profármaco reversible a un resto portador. La unión del resto biológicamente activo neutralizante de VEGF al resto enlazador de profármaco reversible se produce a través de un grupo funcional del fármaco correspondiente.
Opcionalmente, hay un resto separador entre el resto portador y el resto enlazador de profármaco reversible.
En otra modalidad, el resto enlazador de profármaco reversible está conectado a más de un resto enlazador de profármaco reversible a través de más de un grupo funcional del resto biológicamente activo neutralizante de VEGF. Cada uno de más de un resto enlazador de profármaco reversible están conectados a un resto portador diferente, opcionalmente a través de un resto separador. Por lo tanto, en esta modalidad un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF está conectado a más de un resto portador.
En otra modalidad, un resto portador está conectado a más de un resto enlazador de profármaco reversible, ya sea directamente o a través de un resto separador opcional. Cada uno de los restos enlazadores de profármaco reversibles está conectado a uno o más, preferiblemente un resto/restos biológicamente activos neutralizantes de VEGF.
En una modalidad, el portador es un portador soluble. Preferiblemente, el portador soluble comprende por lo menos un polímero seleccionado del grupo de polímeros que comprende poli (ácidos acrílicos), poli(acrilatos), poli(acrilamidas), poli (alquiloxi)polímeros, poli(amidas), poli (amidoaminas), poli (aminoácidos), poli (anhídridos), poli (aspartamida), poli (ácido butírico), poli(caprolactona), poli(carbonatos), poli (cianoacrilatos), poli(dimetilacrilamida), poli(ésteres), poli(etileno), poli(etilenglicol), poli(óxido de etileno), poli(etiloxazolina), poli(ácido glicólico), poli(acrilato de hidroxietilo), poli (hidroxietiloxazolina), poli(hidroxipropilmetacrilamida), poli (metacrilato de hidroxipropilo), poli (hidroxipropiloxazolina) poli(iminocarbonatos), poli (N-isopropilacrilamida) poli(ácido láctico) poli(ácido láctico-co-glicólico) poli(metacrilamida), poli (metacrilatos) poli(metiloxazolina), poli(fumarato de propileno) poli(organofosfazenos), poli(orto-ésteres), poli(oxazolinas), poli(propilenglicol) poli(siloxanos), poli (uretanos), poli(vinilalcoholes) poli (vinilaminas), poli(vinilmetiléter) poli(vinilpirrolidona), siliconas, ácidos ribonucleico, ácidos desoxinucleicos, albúminas, anticuerpos y fragmentos de los mismos, proteína de plasma en la sangre, colágenos, elastina, fascina, fibrina, queratinas, poliaspartato, poliglutamato, prolaminas, transíerrinas, citocromos, flavoproteína, glicoproteínas, hemoproteínas, lipoproteínas, metaloproteínas, fitocromos, fosfoproteínas, opsinas, agar, agarosa, alginato, arabinanos, arabinogalactanos, carragenano, celulosa, carbometil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa y otros polímeros a base de carbohidratos, quitosano, dextrano, dextrina, gelatina, ácido hialurónico y derivados, manano, pectinas, ramnogalacturonanos, almidón, almidón hidroxialquilo, xilano, y copolímeros y derivados funcionalizados de los mismos.
En otra modalidad, el portador es un portador insoluble, más preferiblemente el portador del profármaco ligado al portador es un hidrogel.
Preferiblemente, el hidrogel del profármaco neutralizante de VEGF es un hidrogel biodegradable.
El hidrogel comprende por lo menos un polímero que se selecciona preferiblemente del grupo de polímeros que comprende poli(ácidos acrílicos), poli (acrilatos), poli(acrilamidas), poli(alquiloxi)polímeros, poli (amidas), poli(amidoaminas), poli(aminoácidos), poli (anhídridos), poli(aspartamida), poli(ácido butírico), poli(caprolactona), poli(carbonatos), poli (cianoacrilatos), poli(dimetilacrilamida), poli(ásteres), poli (etileno), poli(etilenglicol), poli(óxido de etileno), poli (etiloxazolina), poli(ácido glicólico), poli(hidroxietil acrilato), poli (hidroxietiloxazolina), poli (hidroxipropilmetacrilamida), poli (hidroxipropil metacrilato), poli (hidroxipropiloxazolina) poli (iminocarbonatos), poli (N-isopropilacrilamida) poli (ácido láctico) poli(ácido láctico-co-glicólico) poli (metacrilamida), poli (metacrilatos) poli (metiloxazolina), poli(fumarato de propileno) poli (organofosfazenos) poli(orto-ásteres), poli(oxazolinas) poli (propilenglicol), poli(siloxanos), poli (uretanos) poli(vinilalcoholes), poli (vinilaminas), poli(vinilmetiléter), poli(vinilpirrolidona), siliconas, ácidos ribonucleicos, ácido desoxinucleico, albúminas, anticuerpos y fragmentos de los mismos, proteína de la plasma en la sangre, colágenos, elastina, fascina, fibrina, queratinas, poliaspartato, poliglutamato, prolaminas, transíerrinas, citocromos, flavoproteína, glicoproteínas, hemoproteínas, lipoproteínas, metalloproteinas, fitocromos, fosfoproteínas, opsinas, agar, agarosa, alginato, arabinanos, arabinogalactanos, carragenano, celulosa, carbometil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa y otros polímeros a base de carbohidratos, quitosano, dextrano, dext ina, gelatina, ácido hialurónico y derivados, manano, pectinas, ramnogalacturonanos, almidón, almidón de hidroxialquilo, xilano, y copolímeros y derivados funeionalizados de los mismos.
Preferiblemente, el hidrogel del profármaco neutralizante de VEGF es un poli hidrogel a base de (etilenglicol) (PEG) biodegradable que comprende por lo menos 10% de PEG, más preferiblemente, que comprende por lo menos 20% de PEG y lo más preferiblemente 30% de PEG.
El hidrogel del profármaco neutralizante de VEGF es un artículo conformado, preferiblemente en la forma de micropartículas. Más preferiblemente, el hidrogel está en la forma de perlas microparticuladas . Incluso más preferiblemente, tales perlas microparticuladas tienen un diámetro de 1 hasta 1000 mm, más preferiblemente de 5 hasta 500 pm, más preferiblemente de 10 hasta 100 pm, más preferiblemente de 20 hasta 100 pm, e incluso más preferiblemente de 20 hasta 80 pm. Los diámetros del gránulo se miden cuando los gránulos de micropartículas se suspenden en una solución amortiguadora isotónica.
El hidrogel del profármaco neutralizante de VEGF es preferiblemente un hidrogel como se describe en W02006/003014A2 y W02011/012715A1, que son incluidos por la presente por referencia en su totalidad.
Incluso más preferiblemente, el hidrogel del profármaco neutralizante de VEGF es un hidrogel obtenible por un procedimiento que comprende los pasos de: (a) proporcionar una mezcla que comprende (a-i) por lo menos un reactivo de esqueleto, en donde por lo menos un reactivo de esqueleto tiene un peso molecular que se encuentra en el intervalo desde 1 hasta 100 kDa, y comprende por lo menos tres aminas (-NH2 y/o -NH-); (a-ii) por lo menos un reactivo de reticulación, en donde por lo menos un reactivo de reticulación tiene un peso molecular que se encuentra en el intervalo desde 6 hasta 40 kDa, por lo menos un reactivo de reticulación que comprende (i) por lo menos dos grupos carboniloxi (-(C=0)-0 o -O- (C=0)-), y, además, (ii) por lo menos dos grupos terminales funcionales activados seleccionados del grupo que consiste de grupos éster activados, grupos carbamato activados, grupos carbonato activados y grupos tiocarbonato activados, y se basan en PEG que comprende por lo menos 70% de PEG; y (a-iii) un primer solvente y por lo menos un segundo solvente, el segundo solvente es miscible en el primer solvente, en una proporción en peso del reactivo de esqueleto de por lo menos un reactivo de esqueleto de por lo menos un reactivo reticulador que se encuentra en el intervalo desde 1:99 hasta 99:1; (b) polimerizar la mezcla del paso (a) en una polimerización en suspensión a un hidrogel; y (c) opcionalmente trabajar el hidrogel.
La mezcla del paso (a) comprende un primer solvente y por lo menos un segundo solvente. El primer solvente se selecciona preferiblemente del grupo que comprende diclorometano, cloroformo, tetrahidrofurano, acetato de etilo, dimetilformamida, acetonitrilo, sulfóxido de dimetilo, carbonato de propileno, N-metilpirrolidona, metanol, etanol, isopropanol y agua y mezclas de los mismos.
Por lo menos un reactivo de esqueleto y por lo menos un reactivo de reticulación se disuelven en el primer solvente, en este caso, la fase dispersa de la polimerización en suspensión. En una modalidad, el reactivo de esqueleto y el reactivo reticulador se disuelven por separado, en este caso, en diferentes recipientes, usando ya sea el mismo o diferente solvente y preferiblemente utilizando el mismo solvente para ambos reactivos. En otra modalidad, el reactivo de esqueleto y el reactivo reticulador se disuelven juntos, en este caso, en el mismo recipiente y utilizando el mismo solvente.
Un solvente apropiado para el reactivo de esqueleto es un solvente orgánico. Preferiblemente, el solvente es seleccionado del grupo que consiste de diclorometano, cloroformo, tetrahidrofurano, acetato de etilo, dimetilformamida, acetonitrilo, sulfóxido de dimetilo, carbonato de propileno, N-metilpirrolidona, metanol, etanol, isopropanol y agua y mezclas de los mismos. Más preferiblemente, el reactivo de esqueleto se disuelve en un solvente seleccionado del grupo que comprende acetonitrilo, sulfóxido de dimetilo, metanol o mezclas de los mismos. Más preferiblemente, el reactivo de esqueleto se disuelve en dimetilsulfóxido.
En una modalidad, el reactivo de esqueleto se disuelve en el solvente en una concentración que se encuentra en el intervalo desde 1 hasta 300 mg/ml, más preferiblemente desde 5 hasta 60 mg/ml y lo más preferiblemente desde 10 hasta 40 mg/ml .
Un solvente apropiado para el reactivo reticulante es un solvente orgánico. Preferiblemente, el solvente se selecciona del grupo que comprende diclorometano, cloroformo, tetrahidrofurano, acetato de etilo, dimetilformamida, acetonitrilo, sulfóxido de dimetilo, carbonato de propileno, N-metilpirrolidona, metanol, etanol, isopropanol, agua o mezclas de los mismos. Más preferiblemente, el reactivo reticulador se disuelve en un solvente seleccionado del grupo que comprende dimetilformamida, acetonitrilo, sulfóxido de dimetilo, metanol o mezclas de los mismos. Más preferiblemente, el reactivo reticulador se disuelve en dimetilsulfóxido.
En una modalidad, el reactivo reticulador se disuelve en el solvente en una concentración que se encuentra en el intervalo desde 5 hasta 500 mg/ml, más preferiblemente desde 25 hasta 300 mg/ml y lo más preferiblemente desde 50 hasta 200 mg/ml.
Por lo menos un reactivo de esqueleto y por lo menos un reactivo reticulador se mezclan en una proporción en peso que se encuentra en el intervalo desde 1:99 hasta 99:1, por ejemplo, en una proporción que se encuentra en el intervalo entre 2:98 a 90:10, en una proporción en peso que se encuentra en el intervalo desde 3:97 hasta 88:12, en una proporción en peso que se encuentra en el intervalo desde 3:96 hasta 85:15, en una proporción en peso que se encuentra en el intervalo desde 2:98 hasta 90:10 y en una proporción en peso que se encuentra en el intervalo desde 5:95 hasta 80:20; particularmente preferido en una proporción en peso desde 5:95 hasta 80:20, en donde el primer número se refiere al reactivo de esqueleto y el segundo número al reactivo reticulador.
Preferiblemente, las proporciones se seleccionan de tal manera que la mezcla del paso (a) comprende un exceso molar de grupos amina del reactivo de esqueleto en comparación con los grupos terminales funcionales activados del reactivo reticulador. En consecuencia, el hidrogel que resulta del proceso de la presente invención tiene grupos amina libres que pueden ser utilizados para acoplar un reactivo enlazador de profármaco al hidrogel, ya sea directamente o a través de un resto separador.
Por lo menos un segundo solvente, es decir, la fase continua de la polimerización en suspensión, es preferiblemente un solvente orgánico, más preferiblemente un solvente orgánico seleccionado del grupo que comprende alcanos Cs-3o lineales, ramificados o cíclicos; alquenos C5-30 lineales, ramificados o cíclicos; alquinos C5-30 lineales ramificados o cíclicos; o poli(dimetilsiloxanos) lineales o cíclicos; hidrocarburos C6-20 aromáticos; y mezclas de los mismos. Incluso más preferiblemente, por lo menos el segundo solvente se selecciona del grupo que comprende alcanos C5-16, lineales, ramificados o cíclicos; tolueno; xileno; mesitileno; hexametildisiloxano; o mezclas de los mismos. Más preferiblemente, por lo menos el segundo solvente seleccionado del grupo que comprende alcanos C7-11 lineales, tales como heptano, octano, nonano, decano y undecano.
Preferiblemente, la mezcla del paso (a) comprende además un detergente. Detergentes preferidos son Cithrol DPHS, Hypermer 70A, Hypermer B246, Hypermer 1599A, Hypermer 2296, e Hypermer 1083.
Preferiblemente, el detergente tiene una concentración de 0.1 g hasta 100 g por 1 L de la mezcla total, en este caso, la fase dispersa y la fase continua juntas. Más preferiblemente, el detergente tiene una concentración de 0.5 g hasta 10 g por 1 L de la mezcla total, y lo más preferiblemente, el detergente tiene una concentración de 0.5 g hasta 5 g por 1 L de la mezcla total.
Preferiblemente, la mezcla del paso (a) es una emulsión.
La polimerización en el paso (b) se inicia por la adición de una base. Preferiblemente, la base es una base no nucleofílica soluble en alcanos, más preferiblemente la base se selecciona de N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina diamina (TMEDA), 1 ,4-dimetilpiperazina, 4-metilmorfolina, 4-etilmorfolina, 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano, 1,1,4,7,10,10-hexametiltrietilentetramina, 1,4,7-trimetil-l,4,7-triazaciclononano, tris[2-(dimetilamino)etil]amina, trietilamina, DIPEA, trimetilamina, N, N-dimetiletilamina, N,N,N',N'-tetrametil-1,6-hexanodiamina, N,N,N' ,N",N" pentametildietilenotriamina, 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno, 1,5-diazabiciclo [4.3.0]non-5-eno, y hexametilentetramina. Incluso más preferiblemente, la base se selecciona de TMEDA, 1,4-dimetilpiperazina, 4-metilmorfolina, 4-etilmorfolina, 1 ,4-diazabiciclo [2.2.2]octano, 1,1,4,7,10,10-hexametiltrietilentetramina, 1,4,7-trimetil-1,4,7-triazaciclononano, tris [2-(dimetilamino)etil]amina, 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno, 1,5-diazabiciclo [4.3.0]non-5-eno, y hexametilentetramina. Más preferiblemente, la base es TMEDA.
La base se agrega a la mezcla del paso (a) en una cantidad de 1 hasta 500 equivalentes por grupo final funcional activado en la mezcla, preferiblemente en una cantidad de 5 hasta 50 equivalentes, más preferiblemente en una cantidad de 5 hasta 25 equivalentes y lo más preferiblemente en una cantidad de 10 equivalentes.
En el paso de proceso (b), la polimerización del hidrogel de la presente invención es una reacción de condensación, que se produce preferiblemente bajo agitación continua de la mezcla del paso (a). Preferiblemente, la velocidad especifica (velocidad especifica = n x velocidad de rotación de agitador x diámetro de agitador) se encuentra en el intervalo desde 0.2 hasta 10 metros por segundo (m/s), más preferiblemente desde 0.5 hasta 4 m/s y lo más preferiblemente desde 1 hasta 2 m/s.
En una modalidad preferida del paso (b), la reacción de polimerización se lleva a cabo en un recipiente cilindrico equipado con deflectores. La proporción de diámetro con respecto a altura del recipiente puede variar desde 4:1 hasta 1:2, más preferiblemente la proporción de diámetro con respecto a altura del recipiente varía desde 2:1 hasta 1:1.
Preferiblemente, el recipiente de reacción se equipó con un agitador de flujo axial seleccionado del grupo que comprende agitador de cuchilla aguda, del tipo propulsor marino, o Lightnin A-310. Más preferiblemente, el agitador es un agitador de cuchilla aguda.
El paso (b) se puede realizar en un amplio intervalo de temperaturas, preferiblemente a una temperatura desde -10°C hasta 100°C, más preferiblemente a una temperatura de 0°C hasta 80°C, incluso más preferiblemente a una temperatura de 10°C hasta 50°C y lo más preferiblemente a temperatura ambiente. "Temperatura ambiente" se refiere a la temperatura presente en un entorno de laboratorio típico y preferiblemente significa una temperatura que se encuentra en el intervalo desde 17 hasta 25°C.
Preferiblemente, el hidrogel obtenido de la polimerización es un artículo conformado, tal como un revestimiento, malla, stent, nanopartícula o una micropartícula . Más preferiblemente, el hidrogel está en la forma de perlas en micropartículas que tienen un diámetro desde 1 hasta 500 micrómetros, más preferiblemente con un diámetro desde 10 hasta 300 micrómetros, incluso más preferiblemente con un diámetro desde 20 y 150 micrómetros y lo más preferiblemente con un diámetro de 30 hasta 130 micrómetros. Los diámetros mencionados anteriormente se miden cuando lass micropartículas de hidrogel están completamente hidratadas en agua.
El paso opcional (c) comprende uno o más de los siguientes pasos: (el) eliminar el exceso de líquido de la reacción de polimerización, (c2) lavar el hidrogel para eliminar los solventes utilizados durante la polimerización, (c3) transferir el hidrogel en una solución amortiguadora, (c4) fraccionamiento/tamizado de tamaño del hidrogel, (c5) transferir el hidrogel en un recipiente, (c6) secar el hidrogel, (c7) transferir el hidrogel en un solvente específico apropiado para la esterilización, y (c8) esterilizar el hidrogel, preferiblemente por la radiación gamma Preferiblemente, el paso opcional (c) comprende todos los siguientes pasos (el) eliminar el exceso de líquido de la reacción de polimerización, (c2) lavar el hidrogel para eliminar los solventes utilizados durante la polimerización, (c3) transferir el hidrogel en una solución amortiguadora, (c4) fraccionamiento/tamizado de tamaño del hidrogel, (c5) transferir el hidrogel en un recipiente, (c7) transferir el hidrogel en un solvente específico apropiado para la esterilización, y (c8) esterilizar el hidrogel, preferiblemente mediante radiación gamma.
Por lo menos un reactivo de esqueleto tiene un peso molecular que se encuentra en el intervalo desde 1 hasta 100 kDa, preferiblemente desde 2 hasta 50 kDa, más preferiblemente desde 5 y 30 kDa, incluso más preferiblemente desde 5 hasta 25 kDa y lo más preferiblemente desde 5 hasta 15 kDa.
Preferiblemente, el reactivo de esqueleto se basa en PEG que comprende por lo menos 10% de PEG, más preferiblemente que comprende por lo menos 20% de PEG, incluso más preferiblemente que comprende por lo menos 30% de PEG y lo más preferiblemente que comprende por lo menos 40% de PEG.
En una modalidad, el reactivo de esqueleto está presente en la forma de su sal ácida, preferiblemente en la forma de una sal de adición de ácido. Sales de adición de ácido apropiadas se forman a partir de ácidos que forman sales no tóxicas. Los ejemplos incluyen pero no se limitan a acetato, aspartato, benzoato, besilato, bicarbonato, carbonato, bisulfato, sulfato, borato, camsilato, citrato, edisilato, esilato, formiato, fumarato, gluceptato, gluconato, glucuronato, hexafluorofosfato, hibenzato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, isetionato, lactato, malato, maleato, malonato, mesilato, metilsulfato, naftilato, nicotinato, nitrato, orotato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato, fosfato de hidrógeno, fosfato de dihidrógeno, sacarato, estearato, succinato, tartrato y tosilato. Particularmente preferido, el reactivo de esqueleto está presente en la forma de su sal de hidrocloruro.
En una modalidad, por lo menos un reactivo de esqueleto se selecciona del grupo que consiste de un compuesto de la fórmula (I) B(-(A°)xi-(SP)x2-A1-P-A2-Hyp1), (I), en donde B es un núcleo de ramificación, SP es un resto separador seleccionado del grupo que consiste de alquilo Ci-6, alquenilo C2-6 y alquinilo C2-6, P es una cadena polimérica a base de PEG que comprende por lo menos 80% de PEG, preferiblemente por lo menos 85% de PEG, más preferiblemente por lo menos 90% de PEG y lo más preferiblemente por lo menos 95% de PEG, Hyp1 es un resto que comprende una amina (-NH2 y/o -NH-) o una pollamina que comprende por lo menos dos aminas (-NH2 y/o -NH-), x es un número entero de 3 a 16, xl, x2 son independientemente uno de otro 0 o 1, siempre que xl sea 0, si x2 es 0, A°, A1, A2 son independientemente uno del otro seleccionados del grupo que consiste de ' ' en donde R1 y Rla son independientemente uno del otro seleccionados de H y alquilo Ci-6; un compuesto de la fórmula (II) Hyp2 - A3 - P - A4 - Hyp3 (II), en donde P es definodo como anteriormente en el compuesto de la fórmula (I), Hyp2, Hyp3 son independientemente uno de otro una poliamina que comprende por lo menos dos aminas (-NH2 y/o - NH-), y A3 y A4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de en donde R1 y Rla son independientemente uno del otro seleccionados entre H y alquilo Ci-6; un compuesto de la fórmula (III) P1- A5 Hyp4 (III), en donde P1 es una cadena polimérica a base de PEG que comprende por lo menos 80% de PEG, preferiblemente por lo menos 85% de PEG, más preferiblemente por lo menos 90% de PEG y lo más preferiblemente por lo menos 95% de PEG, Hyp4 es una poliamina que comprende por lo menos tres aminas (-NH2 y/o -NH), y A5 se selecciona del grupo que consiste de _ en donde R1 y Rla son independientemente uno del otro seleccionados de H y alquilo C1-6; y un compuesto de la fórmula (IV), T1- A6 -Hyp5 (IV), en donde Hyp5 es una poliamina que comprende por lo menos tres aminas (-N¾ y/o -NH), y A6 se selecciona del grupo que consiste de 1 i en donde R1 y Rla son independientemente uno del otro seleccionados de H y alquilo Ci-6; y T1 se selecciona del grupo que consiste de alquilo C1-50, alquenilo C2-50 o alquinilo C2-50, cuyo fragmento está opcionalmente interrumpido por uno o más grupos seleccionados de -NH-, -N (alquilo C1-4)- , -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)NH-, - C(O)N (alquilo C1-4)-, -0C(0)-, -S(O)-, -S(0)2-, heterocielilo de 4 a 7 miembros, fenilo o naftilo.
En los siguientes secciones el término "Hypx" se refiere a Hyp1, Hyp2, Hyp3, Hyp4 y Hyp5 colectivamente.
Preferiblemente, el reactivo de esqueleto es un compuesto de la fórmula (I), (II) o (III) , más preferiblemente el reactivo de esqueleto es un compuesto de la fórmula (I) o (III), y lo más preferiblemente el reactivo de esqueleto es un compuesto de la fórmula (I).
En una modalidad preferida, en un compuesto de la fórmula (I), x es 4, 6 u 8. Preferiblemente, en un compuesto de la fórmula (I) x es 4 u 8, lo más preferiblemente, x es 4.
En una modalidad preferida, en los compuestos de las fórmulas (I) a (IV), A°, A1, A2, A3, A4, A5 y A6 se seleccionan del grupo que comprende Preferiblemente, en un compuesto de la fórmula (I), A° es Preferiblemente, en un compuesto de la fórmula (I), A1 Preferiblemente, en un compuesto de la fórmula (I), A2 es Preferiblemente, en un compuesto de la fórmula (II), A3 Preferiblemente, en un compuesto de la fórmula (III), A5 Preferiblemente, en un compuesto de la fórmula (IV), A6 es Preferiblemente, en un compuesto de la fórmula (IV), T1 se selecciona de H y alquilo Ci-6.
En una modalidad, en un compuesto de la fórmula (I), el núcleo de ramificación B se selecciona de las siguientes estructuras: ( ) ( ) - ( x) en donde las líneas discontinuas indican la unión a A° o, si xl y x2 son ambos 0, a A1, t es 1 ó 2; preferiblemente t es 1, v es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14; preferiblemente, v es 2, 3, 4, 5, 6; más preferiblemente, v es 2, 4 o 6; lo más preferiblemente, v es 2.
En una modalidad preferida, B tiene una estructura de la fórmula (a-i), (a-ii), (a-iii), (a-iv), (av), (a-vi), (a-vii), (a-viii), (a-ix), (ax), (a-xiv), (a-xv) o (a-xvi). Más preferiblemente, B tiene una estructura de la fórmula (a-iii), (a-iv), (a-v), (a-vi), (a-vii), (a-viii), (a-ix), (a-x) o (a-iv). Lo más preferiblemente, B tiene una estructura de la fórmula (a-xiv).
Una modalidad preferida es una combinación de B y A°, o, si xl y x2 son ambos 0 una combinación preferida de B y A1, que se selecciona de las siguientes estructuras: - - (b-vii) en donde las líneas discontinuas indican la unión a SP o, si xl y x2 son ambos 0, a P.
Más preferiblemente, la combinación de B y A° o, si x1 y x2 son ambos 0, la combinación de B y A1, tiene una estructura de la fórmula de la fórmula (b-i), (b-iv), (b-vi) o (b-viii) y lo más preferiblemente tiene una estructura de la fórmula (b-i).
En una modalidad, xl y x2 de la fórmula (I) son 0.
En una modalidad, la cadena polimérica a base de PEG P tiene un peso molecular de 0.3 kDa hasta 40 kDa; por ejemplo, 0.4 hasta 35 kDa, 0.6 hasta 38 kDa, 0.8 hasta 30 kDa, desde 1 hasta 25 kDa, desde 1 hasta 15 kDa o desde 1 hasta 10 kDa. Lo más preferiblemente P tiene un peso molecular desde 1 hasta 10 kDa.
En una modalidad, la cadena polimérica a base de PEG P1 tiene un peso molecular desde 0.3 kDa hasta 40 kDa; por ejemplo, 0.4 hasta 35 kDa, 0.6 hasta 38 kDa, 0.8 hasta 30 kDa, desde 1 hasta 25 kDa, desde 1 hasta 15 kDa o desde 1 hasta 10 kDa. Lo más preferiblemente P1 tiene un peso molecular desde 1 hasta 10 kDa.
En una modalidad, en los compuestos de las fórmulas (I) o (II), P tiene la estructura de la fórmula (c-i): (oi), en donde n se encuentra en el intervalo desde 6 hasta 900, más preferiblemente n se encuentra en el intervalo desde 20 hasta 700 y lo más preferiblemente n se encuentra en el intervalo desde 20 hasta 250.
En una modalidad, en los compuestos de las fórmulas (III), R1 tiene la estructura de la fórmula (c-ii): (c-ii), en donde n se encuentra en el intervalo desde 6 hasta 900, más preferiblemente n se encuentra en el intervalo desde 20 hasta 700 y lo más preferiblemente n se encuentra en el intervalo desde 20 hasta 250; T° se selecciona del grupo que comprende alquilo Ci-6, alquenilo C2-6 y alquinilo C2-6, que está opcionalmente interrumpido por uno o más grupos seleccionado de -NH-, N (alquilo C1-4)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)NH-, -C(0)N (alquilo Ci-4)-, -O-C(O)-, -S(O)- o -S(0)2-.
En una modalidad, en los compuestos de las fórmulas (I) a (IV), el resto Hypx es una poliamina y comprende preferiblemente en forma unida y, en su caso, en la configuración R y/o S de un resto de las fórmulas (d-i), (d-ii), (d-iii) y/o (d-iv): (d-i), (d-iv), en donde zl, z2, z3, z4, z5, Z6 son independientemente uno de otro 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8.
Más preferiblemente, Hypx comprende en forma unida y en la configuración R y/o S de lisina, ornitina, ácido diaminoproprionico y/o ácido diaminobutírico. Lo más preferiblemente, Hypx comprende en forma unida y en una configuración R y/o S de lisina.
Hypx tiene un peso molecular de 40 Da hasta 30 kDa, preferiblemente desde 0.3 kDa hasta 25 kDa, más preferiblemente desde 0.5 kDa hasta 20 kDa, incluso más preferiblemente desde 1 kDa hasta 20 kDa y lo más preferiblemente desde 2 kDa hasta 15 kDa.
Hypx se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de un resto de la fórmula (e-i) en donde ml es un número entero desde 1 hasta 5, preferiblemente pl es 4, y la línea discontinua indica la unión a A2 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (I) y A3 o A4 si el reactivo de esqueleto tiene la estructura de la fórmula (II); un resto de la fórmula (e-ii) en donde p2, p3 y p4 son iguales o diferentes y cada uno es independientemente de los otros un número entero de 1 a 5, preferiblemente p2, p3 y p4 son 4, y la línea discontinua indica la unión a A2 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (I), a A3 o A4 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (II), a A5 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (III) y A6 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (IV); un resto de la fórmula (e-iii) en donde p5 a pll son iguales o diferentes y cada uno es independientemente de los otros un número entero de 1 a 5 , preferiblemente P5 hasta pll son 4 , y la línea discontinua indica la unión a A2 si el reactivo de esqueleto es de la fórmula (I) , a A3 o A4 si el reactivo de esqueleto es de la fórmula (II) , a A5 si el reactivo de esqueleto es de la fórmula ( III ) y a A6 si el reactivo de esqueleto es de la fórmula ( IV) ; un resto de la fórmula (e-iv) en donde pl2 a p26 son iguales o diferentes y cada uno es independientemente de los otros un número entero desde 1 hasta 5, preferiblemente pl2 hasta p26 son 4, y la línea discontinua indica la unión a A2 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (I), a A3 o A4 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (II), a A5 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (III) y A6 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (IV); un resto de la fórmula (e-v) en donde p27 y p28 son iguales o diferentes y cada uno es independientemente del otro un número entero desde 1 hasta 5, preferiblemente p27 y p28 son 4, q es un número entero desde 1 hasta 8, preferiblemente q es 2 o 6 y más preferiblemente 1 es 6, y la línea discontinua indica la unión a A2 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (I), a A3 o A4 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (II), a A5 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (III) y A6 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (IV); un resto de la fórmula (e-vi) en donde p29 y p30 son iguales o diferentes y cada uno es independientemente del otro un número entero de 2 a 5, preferiblemente p29 y p30 son 3, y la línea discontinua indica la unión a A2 si el reactivo de esqueleto tiene la estructura de la fórmula (I), a A3 o A4 si el reactivo de esqueleto tiene la estructura de la fórmula (II), a A5 si el reactivo de esqueleto tiene la estructura de la fórmula (III) y A6 si el reactivo de esqueleto tiene la estructura de la fórmula (IV); un resto de la fórmula (e-vii) en donde p31 a p36 son iguales o diferentes y cada uno es independientemente de los otros un número entero de 2 a 5, preferiblemente de p31 a p36 son 3, y la línea discontinua indica la unión a A2 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (I), a A3 o A4 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (II), a A5 si el reactivo de esqueleto tien una estructura de la fórmula (III) y A6 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (IV); un resto de la fórmula (e-viii) en donde p37 a p50 son iguales o diferentes y cada uno es independientemente de los otros un número entero desde 2 hasta 5, preferiblemente desde p37 hasta p50 son 3, y la línea discontinua indica la unión a A2 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (I), a A3 o A4 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (II), a A5 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (III) y A6 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (IV); y un resto de la fórmula (e-ix): . p51 a p80 son iguales o diferentes y cada uno es independientemente de los otros un número entero de 2 a 5, preferiblemente de p51 a p80 son 3, y la línea discontinua indica la unión a A2 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (I), a A3 o A4 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (II), a A5 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (III) y A6 si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (IV); y en donde los restos (e-i) a (e-v) pueden en cada centro quiral estar en cualquiera de la configuración R o S, preferiblemente, todos los centros quirales de un resto (e-i) a (e-v) están en la misma configuración.
Preferiblemente, Hypx tiene una estructura de la fórmula (e-i), (e-ii), (e-iii), (e-iv), (e-vi), (e-vii), (e-viii) o (e-ix). Más preferiblemente, Hypx tiene una estructura de las fórmulas (e-ii), (e-iii), (e-iv), (e-vii), (e-viii) o (e-ix), incluso más preferiblemente Hypx tiene una estructura de las fórmulas (e-ii), (e-iii), (e-vii) o (e-viii) y lo más preferiblemente Hypx tiene la estructura de la fórmula (e-iii).
Si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (I), un resto preferido -A2 - Hyp1 es un resto de la fórmula en donde la línea discontinua indica la unión a P; y E1 se selecciona de las fórmulas (e-i) a (e-ix) .
Si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (II) un resto preferido Hyp2 -A3- es un resto de la fórmula en donde la línea discontinua indica la unión a P; y E1 se selecciona de las fórmulas (e-i) a (e-ix); un resto preferido -A4-Hyp3 es un resto de la fórmula en donde la línea discontinua indica la unión a P; y E1 se selecciona de las fórmulas (e-i) a (e-ix).
Si el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (III), un resto preferido -A5 -Hyp4 es un resto de la fórmula en donde la línea discontinua indica la unión a P1; y E1 se selecciona de las fórmulas (e-i) a (e-ix).
Más preferiblemente, el reactivo de esqueleto tiene una estructura de la fórmula (I) y B tiene una estructura de la fórmula (a-xiv).
Incluso más preferiblemente, el reactivo de esqueleto tiene la estructura de la fórmula (I), B tiene la estructura de la fórmula (a-xiv), xl y x2 son 0, y A1 es -O-.
Incluso más preferiblemente, el reactivo de esqueleto tiene la estructura de la fórmula (I), B tiene la estructura de la fórmula (a-xiv), A1es -0-,y P tiene una estructura de la fórmula (c-i).
Incluso más preferiblemente, el reactivo de esqueleto es la fórmula (I), B es de la fórmula (a-xiv), xl y x2 son 0, A1 es -0-, P es de la fórmula (c-i), A2 es -NH-(C=0)- y Hyp1 es de la fórmula (e-iii).
Más preferiblemente, el reactivo de esqueleto tiene la siguiente fórmula: en donde n se encuentra en el intervalo desde 10 hasta 40, preferiblemente desde 10 hasta 30, más preferiblemente desde 10 hasta 20.
Igualmente preferiblemente, n se encuentra en el intervalo desde 20 hasta 30 kDa y lo más preferiblemente n es 28.
SP es un resto separador seleccionado del grupo que comprende alquilo Ci-6, alquenilo C2-6 y alquinilo C2-6, preferiblemente SP es -CH2-, -CH2 -CH2-, -CH(CH3)-, -CH2-CH2-CH2-, -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-, -CH=CH- O -CH=CH-, más preferiblemente SP es -CH2- , -CH2-CH2- o -CH=CH-.
Por lo menos un reactivo reticulador comprende por lo menos dos grupos carboniloxi (-(C=0)-O- o -0-(C=0)-)f que son enlaces biodegradables. Estos enlaces biodegradables son necesarios para volver el hidrogel biodegradable. Además, por lo menos un reactivo reticulador comprende por lo menos dos grupos terminales funcionales activados que durante la polimerización del paso (b) reaccionan con las aminas de por lo menos un reactivo de esqueleto.
El reactivo reticulador tiene un peso molecular que se encuentra en el intervalo desde 6 hasta 40 kDa, más preferiblemente se encuentra en el intervalo desde 6 hasta 30 kDa, incluso más preferiblemente se encuentra en el intervalo desde 6 hasta 20 kDa, incluso más preferiblemente se encuentra en el intervalo desde 6 hasta 15 kDa y lo más preferiblemente se encuentra en el intervalo desde 6 hasta 10 kDa.
El reactivo reticulador comprende por lo menos dos grupos terminales funcionales activados seleccionados del grupo que comprende grupos áster activados, grupos carbamato activados, grupos carbonato activados y grupos tiocarbonato activados, que durante la polimerización reaccionan con los grupos amino de los reactivos principales, formando enlaces amida.
En una modalidad preferida, el reactivo reticulador es un compuesto de la fórmula (VI): _ en donde cada D1, D2, D3 y D4 son iguales o diferentes y cada uno es independientemente de los otros seleccionados del grupo que comprende -O-, -NR5-, -S- y -CR6R6a- cada R1, Rla, R2, R2a, R3, R3a, R4, R4a, R6 y R6a son iguales o diferentes y cada uno es independientemente de los otros seleccionados del grupo que comprende -H, -0R7, -NR7R7a, -SR7 y alquilo Ci-6; opcionalmente, cada uno de lo pares R1/R2, R3/R4, Rla/R2a y R3a/R4a puede formar independientemente un enlace químico y/o cada uno de los pares de RVRla, R2/R2a, R3/R3a, R4/R4a, R6/R6a, RVR2, R3/R4, Rla/R2a y R3a/R4a están independientemente uno del otro unidos junto con el átomo al que están unidos para formar un cicloalquilo C3-8 o para formar un anillo A o están unidos junto con el átomo al que están unidos para formar un heterociclilo de 4 a 7 miembros o heterobiciclilo o adamantilo de 8 a 11 miembros; cada R5 se selecciona independientemente de -H y alquilo Ci-6; opcionalmente, cada uno de los pares RVR5, R2/R5, R3/R5, R4/R5 y R5/R6 pueden formar independientemente un enlace químico y/o se unen junto con el átomo al que están unidos para formar un heterociclilo de 4 a 7 miembros o heterobiciclilo de 8 a 11 miembros; cada R7, R7a se selecciona independientemente de H y alquilo Ci-6; A se selecciona del grupo que consiste de indenilo, indanilo y tetralinilo; P2 es m se encuentra en el intervalo desde 120 hasta 920, preferiblemente 120 hasta 460 y más preferiblemente desde 120 hasta 230; rl, r2, r7, r8 son independientemente 0 ó 1; r3, r6 son independientemente 0, 1, 2, 3, o 4; r4, r5 son independientemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; si, s2 son independientemente 1, 2, 3, 4, 5 o 6; Y1, Y2 son iguales o diferentes y cada uno es independientemente del otro, seleccionado de las fórmulas (f-i) a (f-vi): - en donde las líneas discontinuas indican la unión al resto de la molécula, b es 1, 2, 3 o 4 XH es Cl, Br, I o F.
Preferiblemente, el reactivo reticulante es un compuesto de la fórmula (V-II): ' (V-II), en donde D1, D2, D3 y D4 son iguales o diferentes y cada uno es independientemente de los otros seleccionados del grupo que comprende 0, NR5, S y CR5R5a; R1, Rla, R2, R2a, R3, R3a, R\ R4a, R 5 y R 5a son iguales o diferentes y cada uno es independientemente de los otros seleccionados del grupo que comprende H y alquilo Ci-6; opcionalmente, uno o más de los pares RVRla, R2/R2a, R3/R3a, R4/R4a, R1/R2, R3/R4, Rla/R2a, y R3a/R4a forman un enlace químico o se unen junto con el átomo al que están unidos para formar un cicloalquilo C3-8 o para formar un anillo A o se unen junto con el átomo al que están unidos para formar un heterociclilo de 4 a 7 miembros o heterobiciclilo o ada antilo de 8 a 11 miembros o; A se selecciona del grupo que consiste de fenilo, naftilo, indenilo, indanilo y tetralinilo; P2 es m se encuentra en el intervalo desde 120 hasta 920, preferiblemente 120 hasta 460 y más preferiblemente desde 120 hasta 230; rl, r2, r7, r8 son independientemente 0 ó 1; r3, r6 son independientemente 0, 1, 2, 3, o 4; r4, r5 son independientemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; si, s2 son independientemente 1, 2, 3, 4, 5 o 6; Y1, Y2 son iguales o diferentes y cada uno es independientemente del otro, seleccionado de las fórmulas (f-i) a (f-vi): en donde las líneas discontinuas indican unión al resto de la molécula, b es 1, 2, 3 o 4 XH es Cl, Br, I o F.
Se entiende que los restos representan por lo menos dos grupos terminales funcionales activados.
Preferiblemente, Y1 y Y2 de las fórmulas (VI) o (V-II) tienen una estructura de la fórmula (f-i), (f-ii) o (f-v). Más preferiblemente, Y1 y Y2 tienen una estructura de la fórmula (f-i) o (f-ii) y lo más preferiblemente, Y1 y Y2 tienen una estructura de la fórmula (f-i).
Preferiblemente, los dos restos Y1y Y2de las fórmulas (V-I) o (V-II) tienen la misma estructura. Más preferiblemente, ambos restos Y1 y Y2 tienen la estructura de la fórmula (f-i).
Preferiblemente, rl de las fórmulas (VI) o (V-II) es 0.
Preferiblemente, rl y si de las fórmulas (VI) o (V-II) son ambos 0.
Preferiblemente, uno o más de los pars de RVRla, R2/R2a, R3/R3a, R4/R4A, R1/R2, R3/R4, Rla/R2a, y R3a/R4a de las fórmulas (VI) o (V-II) forman un enlace químico o se unen junto con el átomo al que están unidos para formar un cicloalquilo C3-8 o forman un anillo A.
Preferiblemente, uno o más de los pares R1/R2, Rla/R2a, R3/R4, R3a/R4a de las fórmulas (V-I) o (V-II) se unen junto con el átomo al cual están unidos para formar un heterociclilo de 4 a 7 miembros o heterobiciclilo de 8 a 11 miembros.
Preferiblemente, el reactivo reticulante de las fórmulas (V-I) o (V-II) es simétrica, en este caso, el resto tiene la misma estructura que el resto En una modalidad preferida si, s2, rl y r8 de las fórmulas (V-I) y (V-II) son 0.
En otra modalidad preferida si, s2, rl y R8 de las fórmulas (V-I) y (V-II) son 0 y r4 de las fórmulas (V- I) y (V-II) y r5 son 1.
Reactivos reticulantes preferidos son de las fórmulas (V-l) a (V-54): (V-4) sz 8) 25) - cis cis (V-40) trans trans trans trans trans trans en donde cada reactivo reticulador puede estar en la forma de su mezcla racémica, cuando proceda; y m, Y1 y Y2 son definidos como anteriormente, reactivos reticulantes aún más preferidos son de las fórmulas (Va-1) a (Va-54): O o o o (Va-6) o o Y' 7 m (Va-7) .
' Q en donde cada reactivo reticulador puede estar en la forma de su mezcla racémica, cuando proceda; y m, Y1 y Y2 se definen como anteriormente.
Se encontró sorprendentemente que el uso de reactivos reticulantes con ramificaciones, en este caso, los residuos distintos de H, en el carbono alfa del grupo carboniloxi conduce a la formación de hidrogeles que son más resistentes frente a la degradación enzimática, como la degradación a través de esterasas.
Del mismo modo, se encontró sorprendentemente que los menos átomos que hay entre el (C=0) de un grupo carboniloxi y el áster activado adyacente (C=0), carbamato activado, carbonato activado o tiocarbamato activado, los más resistentes contra la degradación son los hidrogeles resultantes, como más resistentes contra la degradación a través de esterasas.
Por lo tanto, los reactivos de reticulación V-ll hasta V-54, reactivos reticulantes V-l, V-2, Va-11 hasta Va-54, Va-1 y Va-2 son reactivos reticulantes preferidos. Los reactivos reticulantes Va-11 hasta Va-54, Va-1 y Va-2 son reactivos reticulantes más preferidos. El más preferido es el reactivo reticulante Va-14.
En otra modalidad, los reactivos de reticulación V-l, V-2, V-5, V-6, V-7, V-8, V-9, V-10, Vil, V-12, V-13, V-14, V-15, V-16, V-17, V-18, V-19, V-20, V-21, V-22, V-23, V-24, V-25, V-26, V -27, V-28, V-29, V-30, V-31, V-32, V-33, V-34, V-35, V-36, V-37, V-38, V-39, V-40, V-41, V-42, V-43, V-44, V-45, V-46, V-47, V-48, V-49, V-50, V-51, V-52, V-53 y V-54 son reactivos reticulantes preferidos. Más preferiblemente, por lo menos un reacttivo de reticulación es un reactivo de la fórmula V-5, V-6, V-l , V-8, V-9, V-10, V-14, V-22, V-23, V 43, V-44, V-45 o V- 46, y lo más preferiblemente, por lo menos un reactivo reticulante es de la fórmula V-5, V-6, V-9 o V-14.
En otra modalidad, los reactivos de reticulación Va-1, Va-2, Va-5, Va-6, Va-1 , Va-8, Va-9, Va-10, Va-11, Va-12, Va-13, Va-14, Va-15, Va-16, Va-17, Va-18, Va-19, Va-20, Va-21, Va-22, Va-23, Va-24, Va-25, Va-26, Va-27, Va-28, Va-29, Va-30, Va-31, Va-32, Va-33, Va-34, Va-35, Va-36, Va-21 , Va-38, Va-39, Va-40, Va-41, Va-42, Va-43, Va-44, Va-45, Va-46, Va- 47, Va-48, Va-49, Va-50, Va-51, Va-52, Va-53 y Va-54 son incluso los reactivos más preferidos. Más preferiblemente, por lo menos un reactivo Reticulante es de la fórmula Va-5, Va-6, Va-7, Va-8, Va-9, Va-10, Va-14, Va-22, Va-23, Va-43, Va-44, Va-45 o Va-46, y lo más preferiblemente, por lo menos un reactivo de reticulación es de la fórmula Va-5, V-6, 9 o Va-14.
Las modalidades preferidas del compuesto de la fórmula (VI) y (V-11) como se ha mencionado anteriormente se aplican de acuerdo a los compuestos preferidos de la fórmulas las (VI) a (V-53).
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un hidrogel obtenible por un procedimiento de la presente invención como se definió anteriormente.
El hidrogel contiene desde 0.01 hasta 1 mmol/g de grupos de amina primaria (-NH2), más preferiblemente, desde 0.02 hasta 0.5 mmol/g de grupos amina primaria y más preferiblemente desde 0.05 hasta 0.3mmol/g de grupos de amina primaria. El término "X mmol/g de grupos amina primaria" significa que 1 g de hidrogel seco comprende X mol de grupos amina primaria. La medición del contenido de amina de hidrogel puede llevarse a cabo de acuerdo a Gude et al . (Letters in Peptide Science, 2002, 9(4):203-206, que se incorpora por referencia en su totalidad).
Preferiblemente, el término "seco" como se usa aquí significa tener un contenido de agua residual de un máximo de 10%, preferiblemente menos de 5% y más preferiblemente menos de 2% (determinado de acuerdo con Karl Fischer). El método preferido de secado es liofilización.
En una modalidad, el hidrogel del profármaco neutralizante de VEGF se modifica adicionalmente antes de un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF ligador de profármaco reversible sea conjugado con el hidrogel.
Preferiblemente, el hidrogel se modifica mediante un proceso que comprende los pasos de (A) proporcionar un hidrogel que tiene los grupos Ax0, en donde los grupos Ax0 representan el mismo o diferentes, preferiblemente los mismos grupos funcionales; (B) opcionalmente conjugar covalentemente un reactivo separador de la fórmula (VI) Axl-SP2-Ax2 (VI) en donde SP2 es alquilo Ci-so, alquenilo C2-50 o alquinilo C2-50, en donde alquilo C1-50, alquenilo C2-50 y alquinilo C2-50 está opcionalmente interrumpido por uno o más grupos seleccionados del grupo que consiste de -NH-, -N (alquilo C1-4)-, -O-, -S, - C ( O )-, -C(0)NH, -C(0)N (alquilo Ci-4)-, -0C(O)-, -S(O)-, - S (O)2, heterocielilo, fenilo y naftilo de 4 a 7 miembros; Axl es un grupo funcional para la reacción con Ax0 del hidrogel; y Ax2 es un grupo funcional; a Ax0 del hidrogel del paso (A); y (C) reaccionar el hidrogel del paso (A) o el paso (B) con un reactivo de la fórmula (VII) Ax3 -Z (VII ) , en donde Ax3 es un grupo funcional; y Z es un resto inerte que tiene un peso molecular que se encuentra en el intervalo desde 10 Da kasta 1000 kDa; de tal manera que como máximo 99% en moles de Ax0 o Ax2 reaccionan con Ax3.
Preferiblemente, Ax0 del paso (A) se selecciona del grupo que consiste de maleimida, amina (-NH2 o -NH-), hidroxilo (-OH), carboxilo(-COOH) y carboxilo activado (-COY1, en donde Y1 se selecciona de las fórmulas (f-i) a (f-vi): en donde las líneas discontinuas indican la unión al resto de la molecula, b es 1, 2, 3 o 4; XH es C1, Br, I o F).
Más preferiblemente, Ax0 del paso (A) es una amina o maleimida.
Se entiende que los grupos funcionales Ax0 del paso (A) corresponden a las aminas de por lo menos un reactivo de esqueleto, si el hidrogel del profármaco neutralizante de VEGF se obtiene mediante el proceso descrito anteriormente.
En una modalidad preferida Ax0 del paso (a) es una amina y Axl del paso (B) es C1S02-, ^ (0=0)-, I-, Br-, Cl-, SCN-, CN-, 0=C=N-, Y1-(C=0)-, Y1-C=0)-NH-, o Y1-(C=0)-O-, en donde R1 es H, alquilo Ci-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, cicloalquilo C3-8, heterociclilo de 4 a 7 miembros, heterobiciclilo, fenilo, naftilo, indenilo, indanilo, o tetralinilo de 8 a 11 miembros; y Y1 se selecciona de las fórmulas (f-i) a (f-vi): en donde las líneas discontinuas indican unión al resto de la molécula, b es 1, 2, 3 o 4, XH es Cl, Br, I o F.
En otra modalidad preferida Ax0 del paso (A) es un grupo hidroxilo (-0H) y Axl del paso (B) es 0=C=N-, I-, Br-, SCN-, o Y1-(C=0)-NH-, en donde Y1 se selecciona de las fórmulas (f-i) a (f-vi): - . - iii), en donde las líneas discontinuas indican la unión al resto de la molécula, b es 1, 2, 3 o 4, XH es CI, Br, I o F.
En otra modalidad preferida Ax0 del paso (A) es un ácido carboxílico (-(C=0)0H) y Axl del paso (B) es una amina primaria o amina secundaria.
En otra modalidad preferida Ax0 del paso (A) es una maleimida y Axl del paso (B) es un tiol.
Más preferiblemente, Ax0 del paso (A) es una amina y Axl del paso (B) es Y1-(C=0)-, Y1-(C=0)-NH-, o Y1-(C=0)-O- y lo más preferiblemente Ax0 del paso (A) es una amina y Axl del paso (B) es Y1-(C=0)-.
Axl del paso (B) puede estar presente opcionalmente en forma protegida.
Los reactivos de activación apropiados para obtener el ácido carboxílico activado son por ejemplo N,N'-diciclohexil-carbodiimida (DCC), l-etil-3-carbodiimida (EDC), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio (PyBOP), hexafluorofosfato de bromotripirrolidinofosfonio (PyBrOP), hexafluorofosfato de 1-ciano-2-etoxi-2-oxoetilidenaminooxi)dimetilamino-morfolino-carbenio (COMU), 1-hidroxibenzotriazol (HOBT), l-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAT), hexafluorofosfato de 0- (6-clorobenzotriazol-l-il)-N,N-N',N'-tetrametiluronio (HCTU), 1- H-benzotriazolio (HBTU), hexafluorofosfato de (0-(7-azabenzotriazol-lil)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HATU), y tetrafluoroborato de 0- (benzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TBTU). Estos reactivos están disponibles en el comercio y bien conocido por las personas experimentadas en la téenica.
Preferiblemente, Ax2 del paso (B) se selecciona del grupo que consiste de maleimida, -SH, -NH2, -SeH, -N3, -CºCH, CRl=CRlaRlb, -OH, - (CH=X) -R1, - (CR1=0) -SR1 , - (C=0) -H, -NH-NH2, -O-NH2, -Ar-X°, -Ar-SníR1) (Rla) (Rlb) , -Ar-B (OH) (OH) , Br, I, Y1- (C= 0)-, Y1- (C=0) -NH-, Y1-(C=0)-O-, con grupos de protección opcionales; en donde las líneas discontinuas indican unión a SP2; X es O, S, o NH, Xo es -OH, -NR!R1*, -SH, o -SeH, XH es Cl, Br, I o F; Ar es fenilo, naftilo, indenilo, indanilo, tetralinilo; R1, Rla , Rlb son, independientemente uno de otro H, alquilo Ci-6, alquenilo Ci-6, alquinilo Ci-6, cicloalquilo C - , heterociclilo de 4 a 7 miembros, heterobiciclilo de 8 a 11 miembros, fenilo, naftilo, indenilo, indanilo, o tetralinilo; Y1 se selecciona de las fórmulas (f-i) a (f-vi): en donde las líneas discontinuas indican unión al resto de la molécula, b es 1, 2, 3 o 4, XH es Cl, Br, I o F.
Más preferiblemente, Ax2 del paso (B) es -NH2, maleimida o tiol y lo más preferiblemente Ax2 del paso (B) es maleimida. Igualmente preferible, Ax2 del paso (B) es tiol.
Ax2 del paso (B) puede estar presente opcionalmente en forma protegida.
Si el hidrogel del paso (A) se conjuga covalentemente a un resto separador, el conjugado del resto separador de hidrogel resultante es de la fórmula (VIII): i Ay1-SP2-Ax2 (VIII), en donde la línea discontinua indica la unión al hidrogel del paso (A); A^1 es el enlace formado entre Ax0 y Axl; y SP2 y Ax2 se utilizan como en la fórmula (VI).
Preferiblemente, A^1 de la fórmula (VIII) es un enlace estable.
Preferiblemente, A^1 se selecciona de la fórmula (VIII) del grupo que consiste de en donde las líneas discontinuas marcadas con un asterisco indican la unión al hidrogel; y las líneas discontinuas sin marcar indican la unión a SP2.
Las condiciones de reacción apropiadas se describen en las secciones de ejemplos y son conocidas por la persona experimentada en la téenica.
El paso de proceso (B) se puede llevar a cabo en la presencia de una base. Las bases apropiadas incluyen bases inorgánicas u orgánicas usuales. Estas incluyen, preferiblemente, hidruros de metales alcalinos o de metal alcalinotérreo, hidróxidos, amidas, alcoholatos, acetatos, carbonatos o bicarbonatos, tales como, por ejemplo, hidruro de sodio, amida de sodio, metóxido de sodio, etóxido de sodio, terc-butóxido de potasio, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de amonio, acetato de sodio, acetato de potasio, acetato de calcio, acetato de amonio, carbonato de sodio, carbonato de potasio, bicarbonato de potasio, bicarbonato de sodio o carbonato de amonio, y aminas terciarias tales como trimetilamina, trietilamina, tributilamina, N,N-dimetilanilina, N,N-dimetilbencilamina, piridina, N-metilpiperidina, N-metilmorfolina, N,N-dimetilaminopiridina, diazabiciclooctano (DABCO), diazabiciclononeno (DBN), N,N-diisopropiletilamina (DIPEA), diazabicicloundeceno (DBU) o colidina.
El paso de proceso (B) se puede llevar a cabo en la presencia de un solvente. Los solventes apropiados para llevar a cabo el paso del procedimiento (B) de la invención incluyen solventes orgánicos. Estos incluyen preferiblemente agua e hidrocarburos alifáticos, alicíclicos o aromáticos tales como, por ejemplo, éter de petróleo, hexano, heptano, ciclohexano, metilciclohexano, benceno, tolueno, xileno o decalina; hidrocarburos halogenados tales como, por ejemplo, clorobenceno, diclorobenceno, diclorometano, cloroformo, tetracloruro de carbono, dicloroetano o tricloroetano; alcoholes tales como metanol, etanol, n- o i-propanol, n-, i- , sec- o terc-butanol, etanodiol, propano-1,2-diol, etoxietanol, metoxietanol, dietilenglicol mono glicol metil éter, dimetil éter, dietilenglicol; acetonitrilo, N-metil-2-pirrolidona (NMP), dimetilformamida (DMF), sulfóxido de dimetilo (DMSO), N,N-dimetilacetamida, nitrometano, nitrobenceno, hexametilfosforamida (HMPT), 1,3-dimetil-2-imidazolidinona (DMI), 1 ,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2(1H)irimidinona (DMPU), acetato de etilo, acetona, butanona; éteres tales como dietil éter, diisopropil éter, t-butil metil éter, metil t-amil éter, dioxano, tetrahidrofurano, 1,2-dimetoxietano, 1,2-dietoxietano o anisol; o mezclas de los mismos. Preferiblemente, el solvente se selecciona del grupo constituido por agua, acetonitrilo y N-metil-2-pirrolidona.
Preferiblemente, Ax3 del paso (C) se selecciona del grupo que consiste de -SH, -NH2, -SeH, maleimida, -CºCH, -N3, -OH, -(C=0)-SR1, -NH-NH2, -O-NH2, -AR-SníR1)(Rla)(Rlb), -Ar-B(OH)(OH), -Ar-X°, en donde las líneas discontinuas indican la unión a Z; X es O, S, o NH, Xo es -OH, -NR!R13, -SH, O -SeH; R1, Rla, Rlb son independientemente uno de otro H, alquilo Ci-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, cicloalquilo C3-8, heterociclilo de 4 a 7 miembros, heterobiciclilo de 8 a 11 miembros, fenilo, naftilo, indenilo, indanilo, o tetralinilo; Y Ar es fenilo, naftilo, indenilo, indanilo, o tetralinilo.
Y1 es un ácido carboxílico activado, carbonato activado o carbamato activado, preferiblemente Y1 se selecciona de las fórmulas (f-i) a (f-vi): en donde las líneas discontinuas indican la unión al resto de la molécula, b es 1, 2, 3 o 4, XH es Cl, Br, I o F En una modalidad preferida Y se selecciona de las fórmulas (f-i) a (f-vi) en donde las líneas discontinuas, b y XH son utilizadas como anteriormente.
Más preferiblemente, Ax3 del paso (C) es SH o maleimida y más preferiblemente Ax3 del paso (C) es -SH.
En otra modalidad preferida Ax3 es de la fórmula (al) PG° -S -i (al), en donde la línea discontinua indica la unión a Z de la fórmula (VII); PG° es un resto de activación de azufre; y S es azufre.
Preferiblemente, PG° de la fórmula (al) es seleccionado en donde las líneas discontinuas indican la unión al azufre de la fórmula (l); Ar es un resto aromático que está opcionalmente sustituido adicionalmente; R01, R02, R03, R04 son independientemente uno de otro -H; alquilo Ci-5o; alquenilo C2-50; o alquinilo C2-50, en donde alquilo C1-50; alquenilo C2-50; y alquinilo C2-50 están opcionalmente sustituidos con uno o más R3, que son iguales o diferentes y en donde alquilo C1-50; alquenilo C2-50; y alquinilo C2-50 están opcionalmente interrumpidos por uno o más grupos seleccionados del grupo que consiste de -Q-, -C(0)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R4)-; -S(O)2N (R4)-; S ( O ) N ( R4 ) - ; - S ( 0 ) 2 - ; - S (O) - ; -N (R4 ) S ( O) 2N (R4a) - ; -S - ; N ( R4 ) - ; - OC (O) R4 ; -N (R4) C (O) - ; -N (R4 ) S (O) 2 - ; -N (R 4 ) S (0) - ; - N ( R4 ) C ( 0 ) 0 - ; -N (R4 ) C (O) N (R4a) - ; y -OC (0) N (R4R4a) ; Q es seleccionado del grupo que consiste de fenilo; naftilo; indenilo; indanilo; tetralinilo; cicloalquilo Ca lo; heterociclilo de 4 a 7 miembros; y heterobiciclilo de 8 a 11 miembros, en donde T está opcionalmente sustituido con uno o más R3, que son iguales o diferentes; R3 es halógeno; -CN; oxo(=0); -C00R5; -0R5; -C(O)R5; - C (0)N(R5R5a); -S (0)2N (R5R5a); -S (0)N (R5R5a); -S(O)2R5; 5 (0)R5; -N (R5)S (0)2N (R5aR5b); -SR5; -N (R5R5a); -NO2; 0C ( O ) R5 ; -N ( R5 ) C (O) R5a ; -N (R5 ) S (0) 2R5a ; -N ( R5 ) S ( 0) R5a ; N (R5)C(0)0R5a; -N (R5)C (0)N (R5aR5b); -0C (0)N (R5R5a); o alquilo Ci-6, en donde alquilo Ci-6 está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, que son iguales o diferentes; y R4, R4a, R5, R5a, R5b se seleccionan independientemente del grupo que consiste de -H; o alquilo Ci-6, en donde alquilo Ci-b está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, que son iguales o diferentes.
Preferiblemente, R01, R03 y R04 son independientemente uno de otro alquilo Ci-6.
Preferiblemente, R02 se selecciona de H y alquilo Ci- 6· Preferiblemente, Ar se selecciona del grupo que consiste de en donde las líneas discontinuas indican unión al resto de PG° de la fórmula (al); W es independientemente uno de otro O, S o N; W' es N; y en donde Ar está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionado independientemente del grupo que consiste de NO2, Cl y F.
Más preferiblemente, PG° de la fórmula (al) se selecciona del grupo que consiste de II — — ——— ii — - .. en donde las lineas discontinuas indican unión al azufre de la fórmula (al); y Ar, R01, R02, R03 y R04 se usan como anteriormente.
Más preferiblemente, PG° de la fórmula (al) es en donde la línea discontinua indica la unión al azufre de la fórmula (al).
Ax3 del paso (C) puede estar presente opcionalmente en forma protegida.
Combinaciones preferidas de Ax2 del paso (B) y Ax3 del paso (C) son los siguientes: en donde X es O, S , o NH; Xo es -OH, -NR!R13, -SH, o -SeH; R1, Rla, Rlb son independientemente uno del otro seleccionados del grupo que consiste de H, alquilo Ci-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, cicloalquilo C3-8, heterociclilo de 4 a 7 miembros, heterobiciclilo de 8 a 11 miembros, fenilo, naftilo, indenilo, indanilo, y tetralinilo; y Ar es fenilo, naftilo, indenilo, indanilo, o tetralinilo.
En otra modalidad preferida Ax2 es -SH y Ax3 es de la fórmula (al), en donde PG° es de la fórmula (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) o (viii). Más preferiblemente, PG° de la fórmula (al) es de la fórmula (i), (ii), (iii), (iv) o (v) y aún más preferiblemente, PG° de la fórmula (al) es de la fórmula (i). Más preferiblemente la fórmula (al) es de la fórmula en donde la línea discontinua indica la unión al azufre de la fórmula (al).
En una modalidad preferida, Ax2 del paso (B) es una amina y Ax3 del paso (C) es Y1-(C=0)-, Y1-(C=0)-NH-, o Y1-(C=0)-O- y más preferiblemente Ax2 del paso (B) es una amina y Ax3 del paso (C) es Y1-(C=0)-.
En otra modalidad preferida Ax2 del paso (B) es maleimida y Ax3 del paso (C) es -SH.
En una modalidad, el paso opcional (B) es omitido, Ax0 del paso (A) es una amina y Ax3 del paso (C) es CISO2-, ^ (0=0)-, I-, Br-, Cl-, SCN-, CN-, 0=C=N-, Y1-(C=0)-, Y1-(C=0)-NH-, o Y1-(C=0)-0-, en donde R1 es H, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, cicloalquilo C3-8, heterociclilo de 4 a 7 miembros, heterobiciclilo de 8 a 11 miembros, fenilo, naftilo, indenilo, indanilo, o tetralinilo; y Y1 se selecciona de las fórmulas (f-i) a (f-vi): en donde las líneas discontinuas indican unión al resto de la molécula, b es 1, 2, 3 o 4, XH es Cl, Br, I o F.
En otra modalidad, el paso opcional (B) es omitido, Ax0 del paso (A) es un grupo hidroxilo (-0H) y Ax3 del paso (C) es 0=C=N-, I-, Br-, SCN -, o Y1-(C=0)-NH-, en donde Y1 se selecciona de las fórmulas (f-i) a (f-vi): en donde las líneas discontinuas indican la unión al resto de la molécula, b es 1, 2, 3 o 4, XH es Cl, Br, I o F.
En otra modalidad se omite el paso opcional (B), Ax0 del paso (A) es un ácido carboxílico (-(C=0)0H) y Ax3 del paso (C) es una amina primaria o amina secundaria.
En otra modalidad, el paso opcional (B) es omitido, Ax0 del paso (A) es una amina y Ax3 del paso (C) es Y1-(C=0)-, Y1-C=0)-NH-, o Y1-(C=0)-O-.
En otra modalidad el paso opcional (B) es omitido, Ax0 del paso (A) es una maleimida y Ax3 del paso (C) es tiol.
En una modalidad preferida se omite el paso opcional (B), Ax0 del paso (A) es una amina y Ax3 del paso (C) es Y 1-(C = 0) En otra modalidad preferida, el paso opcional (B) es omitido, Ax0 es -SH y Ax3 es de la fórmula (al), en donde PG° es de la fórmula (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) o (viii).
Más preferiblemente, PG° de la fórmula (al) es de la fórmula (i), (ii), (iii), (iv) o (v) y aún más preferiblemente, PG° de la fórmula (al) es de la fórmula (i). Lo más preferiblemente, PG° de la fórmula (al) es de la fórmula 5 en donde la línea discontinua indica unión al azufre de la fórmula (al).
El hidrogel obtenido en el paso (C) tiene la estructura de la fórmula (IXa) o (IXb): - en donde la línea discontinua indica la unión al hidrogel del paso An° es el enlace formado entre Ax0 y Ax3; A^1 se usa como en la fórmula (VIII); A^2 es el enlace formado entre Ax2 y Ax3; SP2 se utiliza como en la fórmula (VI); y Z se utiliza como en la fórmula (VII).
Preferiblemente, A^0 del paso (A) y A^2 de la fórmula (IXb) se seleccionan del grupo que consiste de amida, carbamato, en donde las líneas discontinuas marcadas con un asterisco indican unión al hidrogel o SP2, respectivamente; y las líneas discontinuas sin marcar indican unión a Z de la fórmula (VII).
En una modalidad, Z del paso (C) se selecciona del grupo que consiste de alquilo Ci-so, alquenilo C2-50, alquinilo C2-50, cicloalquilo C3-10, heterociclilo de 4 a 7 miembros, heterobiciclilo de 8 a 11 miembros, fenilo; naftilo; indenilo; indanilo; y tetralinilo; en donde el alquilo C1-50 o, alquenilo C2-50, alquinilo C2-50, cicloalquilo C3-10, heterociclilo de 4 a 7 miembros, heterobiciclilo de 8 a 11 miembros, fenilo; naftilo; indenilo; indanilo; y tetralinilo están opcionalmente sustituidos con uno o más R10, que son iguales o diferentes y en donde alquilo Ci-5o; alquenilo C2-50; y alquinilo C2-50 están opcionalmente interrumpidos por uno o más grupos seleccionados del grupo que consiste de T, -C(O)0-; -0-; -C(0)-; -C(O)N(R9)-; -S(O)2N (R9)-; -S(O)N(R9)-; -S(0)2-; -S(0)-; -N (R9)S(0)2N (R9a)-; -S-; -N(R9)-; -0C(0)R9; -N(R9)C(0)-; -N (R9)S(0)2-; -N(R9)S(O)-; -N (R9)C(O)0-; -N(R9)C(0)N(R9a)-; y -0C(O)N (R9R9a); en donde R9R9a se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H; T; alquilo C1-50; alquenilo C2-50; y alquinilo C2-50, en donde T; alquilo C1-50; alquenilo Ci-5o; y alquinilo Ci-50 están opcionalmente sustituidos con uno o más R10, que son iguales o diferentes y en donde alquilo C1-50; alquenilo C2-50; y alquinilo C2-50 están opcionalmente interrumpidos por uno o más grupos seleccionados del grupo que consiste de T, -C(0)0-; -O-; -c(0)-; -CÍOÍNÍR11) -S(O)2N (R11)-; -S(O)N (R11)-; - S (0)2-; -S(0)-; -N(R11)S(0)2N(Rlla)-; -S-; -N (R11)-; -OCÍOlR11; -N (R11)C(0)-; -N (R11)S(O)2-; -N (R11)S(0)-; -N (R11)C(O)O-; N (R11)C(0)N(Rlla)-; y -0C(0)N (R^R113); T se selecciona del grupo que consiste de fenilo,-naftilo; indenilo; indanilo; tetralinilo; cicloalquilo C3-10; heterocielilo de 4 a 7 miembros; y heterobiciclilo de 8 a 11 miembros, en donde T está opcionalmente sustituido con uno o más R10, que son iguales o diferentes; R10 es halógeno; CN; oxo (=0); COOR12; OR12; C(0)R12C(O)N (R12R12a); S(0)2N (R12R12a); S(0)N (R12R12a); S(0)2R12S(O)R12; N(R12)S(0)2N(R12aR12b); SR12; N(R12R12a); NO2OC(O)R12; N (R12)C(O)R12a; N (R12)S(0)2R12a; N (R12)S(0)R12a, N(R12)C(O)0R12a; N (R12)C(0)N (R12aR12b); 0C(O)N (R12R12a); o alquilo C1-6, en donde alquilo C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, que son iguales o diferentes,- R11, Rlla, R12, R12a, R12b son independientemente uno del otro seleccionados del grupo que consiste de H; y alquilo Ci-6, en donde alquilo C1-6está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, que son iguales o diferentes.
En otra modalidad Z del paso (C) es un polímero inerte que tiene un peso molecular que se encuentra en el intervalo desde 0.5 kDa hasta 1000 kDa, preferiblemente que tiene un peso molecular en el intervalo de 0.5 hasta 500 kDa, más preferiblemente tiene un peso molecular que se encuentra en el inervalo desde 0.75 hasta 250 kDa, incluso más preferiblemente que se encuentra en el inérvalo desde 1 hasta 100 kDa, incluso más preferiblemente que se encuentra en el inérvalo desde 5 hasta 60 kDa, incluso más preferiblemente desde 10 hasta 50 y lo más preferiblemente Z tiene un peso molecular de 40 kDa.
Preferiblemente, Z del paso (C) es un polímero inerte seleccionado del grupo que consiste de 2-metacriloil-oxi etil fosforil colinas, poli(ácidos acrílicos), poli(acrilatos), poli(acrilamidas), poli(alquiloxi) polímeros, poli(amidas), poli(amidoaminas), poli(amino ácidos), poli (anhídridos), poli(aspartamidas), poli(ácidos butíricos), poli (ácidos glicolicos), polibutileno tereftalatos, poli(caprolactonas), policarbonatos), poli (cianoacrilatos), poli(dimetilacrilamidas), poli(ásteres), poli (etilenos), poli(etilenglicoless), poli(oxidos de etileno), poli (etil fosfatos), poli (etiloxazolinas), poli(ácidos glicolicos), poli(hidroxietil acrilatos), poli (hidroxietil-oxazolinas), poli(hidroximetacrilatos), poli(hidroxipropilmetacrilamidas), poli(hidroxipropil metacrilatos), poli(hidroxipropiloxazolinas), poli(imino carbonatos), poli(ácidos lácticos), poli(ácidos lactico-co-glicolico), poli(metacrilamidas), poli (metacrilatos), poli(metiloxazolinas), poli(organofosfazenos), poli (orto esteres), poli (oxazolinas), poli (propilen glicoles), poli(siloxanos), poli(uretanos), poli (vinil alcoholes), poli(vinil aminas), poli (vinilmetileteres), polivinilpirrolidonas), siliconas, celulosas, carbometil celulosas, hidroxipropil metilcelulosas , quitinas, quitosanos, dextranos, dextrinas, gelatinas, ácidos hialuronicos Y derivados, ácidos hialuronicos funcionalizados mananos, pee tinas, ramnogalacturonanos, almidones, almidones de hidroxialquilo, almidones de hidroxietilo y otros polímeros a base de carbohidratos, xilanos, y copolímeros de los mismos.
En una modalidad preferida Z del paso (C) es un polímero inerte a base de PEG lineal o ramificado que comprende por lo menos 70% de PEG o un polímero a base de ácido hialurónico comprende ácido hialurónico por lo menos 70%. Más preferiblemente, Z del paso (C) es un polímero inerte a base de PEG lineal o ramificado que comprende por lo menos 70% de PEG, que comprende incluso más preferiblemente por lo menos 80% de PEG y que comprende más preferiblemente por lo menos 90% de PEG.
En otra modalidad preferida Z del paso (C) es un polímero zwitteriónico. Preferiblemente, tal polímero zwitteriónico comprende poli(aminoácidos) y/o poli (acrilatos).
Tal como se utiliza aquí, los términos "zwitterión" y "zwitteriónico" se refieren a una molécula neutra o resto con cargas positivas y negativas en diferentes ubicaciones dentro de esa molécula o resto al mismo tiempo.
De acuerdo con Zhang et al. (Nature Biotechnology, 2013, volumen 31, número 6, páginas 553-557) hidrogeles fabricados con polímeros zwitteriónicos resistentes a la respuesta del cuerpo extraño.
El paso (C) comprende la reacción del hidrogel del paso (A) o el paso (B) con un reactivo de la fórmula (VII), de tal manera que no más del 99% en moles de Ax0 o Ax2 reaccione con Ax3. Esto se puede lograr, por ejemplo, por reacción en la mayoría de 0.99 equivalentes químicos del reactivo de la fórmula (VII) con relación a Ax0 o Ax2 con el hidrogel del paso (A) o (B).
Con el fin de evitar la reacción de más de 0.99 equivalentes químicos, el reactivo de la fórmula (VII) se puede utilizar en una cantidad de como máximo 0.99 equivalentes químicos en relación con Ax0 o Ax2 o, alternativamente, la velocidad de reacción es monitoreada y la la reacción se interrumpe cuando como máximo 0.99 equivalentes químicos con relación a Ax0 o Ax2 han reaccionado, especialmente cuando se utilizan más de 0.99 equivalentes químicos. Se entiende que también debido a limitaciones físicas, tales como el impedimento estérico, propiedades hidrofóbicas u otras características de la fracción inerte Z, no más de 0.99 equivalentes químicos pueden ser capaces de reaccionar con Ax0 o Ax2, incluso si más equivalentes químicos son agregados a la reacción.
Preferiblemente, el paso (C) comprende hacer reaccionar el hidrogel del paso (A) o el paso (B) con un reactivo de la fórmula (VII), de tal manera que no más del 80% en moles de Ax0 o Ax2 reacciona con Ax3, incluso más preferiblemente, de tal manera que no más de 60% en moles de Ax0 o Ax2 reacciona con Ax3, incluso más preferiblemente, de tal manera que no más de 40% en moles de Ax0 o Ax2 reacciona con Ax3, aún más preferiblemente, de tal manera que no más de 20% en moles de Ax0 o Ax2 reaccione con Ax3 y lo más preferiblemente, de tal manera que no más de 15% en moles de Ax0 o Ax2 reaccione con Ax3.
Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la reacción de como máximo 0.8, 0.6, 0.4, 0.2 o 0.15 equivalentes químicos del reactivo de la fórmula (VII) con relación a Ax0 o Ax2 con el hidrogel de los pasos (A) o (B), respectivamente.
Los métodos para prevenir la reacción de más equivalentes químicos se han descrito anteriormente.
Con base en las mediciones de la cantidad de sustancia de Ax0 del paso (A) y después del paso (C) la cantidad de sustancia de Ax0 reaccionado puede ser calculada con la ecuación (1): (1) Cantidad de sustancia de Ax0 reaccionada en mmol/g = (Ax0i - AX°2)/(AX02 x MWZ + 1), en donde Ax0i es la cantidad de sustancia de grupos funcionales Ax0 del hidrogel del paso (A) en mmol/g; AX02 es la cantidad de sustancia de grupos funcionales Ax0 del hidrogel después del paso (C) en mmol/g; y MWZ es el peso molecular de Z en g/mmol.
Si el reactivo separador opcional se conjugó de forma covalente al hidrogel del paso (A), se hace en consecuencia el cálculo del número de Ax2 reaccionado.
El porcentaje de grupos funcionales reaccionados Ax0 respecto a los grupos funcionales Ax0 del hidrogel del paso (A) se calcula de acuerdo con la ecuación (2): (2)% en moles de A*0reaccionado = 100x[(AX0I-AX02)/(Ax02MWz+l)]/Ax0i en donde las variables se utilizan como anteriormente.
En una modalidad Z del paso (C) se conjuga con la superficie del hidrogel. Esto se puede lograr mediante la selección del tamaño y la estructura del reactivo Ax3-Z tal que es demasiado grande para entrar en los poros o la red del hidrogel. En consecuencia, el tamaño mínimo de Ax3-Z depende de las propiedades del hidrogel. La persona experimentada en la téenica sin embargo conoce métodos para probar si un reactivo Ax3-Z es capaz de entrar en el hidrogel usando experimentación estándar, por ejemplo utilizando cromatografía de exclusión de tamaño con el hidrogel como fase estacionaria.
Un resto enlazador de profármaco comprendido en el profármaco neutralizante de VEGF puede tener la estructura de cualquier resto enlazador de profármaco conocido en el arte previo.
Un enlazador de profármaco preferido se describe y se puede obtener como se describe en WO 2005/099768 A2. Por lo tanto, un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF enlazador de profármaco reversible preferido tiene la estructura de las fórmulas (A) o (B): en donde la línea discontinua indica unión con el resto del profármaco, en este caso, al resto portador o al resto separador opcional; D es un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF que está conectado al resto del resto a través de un grupo amina del profarmaco neutralizante de VEGF correspondiente; X es un resto separador tal como R5-Y6; Ui, Y son independientemente 0, S o NR ,· Y , Y son independientemente 0 o S ; Y4 es 0, NRS o C (R7) (Re) - ; Y6 es O, S, NR6, succinimida, maleimida, enlaces carbono-carbono insaturados o cualquier heteroátomo que contiene un par de electrones libres o está ausente; R2, R3 son independientemente uno del otro seleccionados del hidrogel, alquilo o heteroalquilo sustituido o no sustituido lineal, ramificado o cícl ico , arilos , ari los sust ituidos , heteroari lo sust ituido o no sust ituido , c iano , nitro , halógeno , carboxi , carboxialqui lo , alquilcarboni lo o carboxamidoal quilo ; R4 se selecciona de hidrógeno, alquilo o heteroalquilo lineal , ramificado cíclico o sustituido o no sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, alcoxi ramificado, cíclico o lineal , sustituido o no sustituido, heteroalquiloxi ramificado, cíclico o lineal sustituido o no sustituido, ariloxi o heteroariloxi , ciano, halógeno; R5 se selecciona de alquilo o he teroalqui lo ramificado, cíclico o lineal sustituido o no sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no sustituidos; R.6 se selecciona del hidrogel, alquilo o heteroalquilo ramificado lineal, o cíclico sustituido, arilos, heteroarilos sustituidos o no sustituidos; R7, R8 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo o heteroalquilo ramificado, cíclico o lineal sustituido o no sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no sustituidos, carboxialquilo , alqui lcarboni lo, carboxamidoalqui lo , ciano o halógeno; W se selecciona del alquilo ramificado, cíclico o lineal sustituido o no sustituido, arilos, arilos sustituidos, he teroalqui lo ramificado, cíclico o lineal sustituido o no sustituido, heteroarilos sustituidos o no sustituidos; Nu es un nucleófilo; n es cero o un número entero positivo; y Ar es un hidrocarburo aromático muít i-sustituido o un heterociclo aromático muíti-sus tituido .
Preferiblemente, R2, R3, R4, R5, Re, R7 y Re de las fórmulas (A) y (B) se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-6, alquenilo C2-6 y alquinilo C2-6.
Preferiblemente, Ye de las fórmulas (A) y (B) es alquilo C1-2, alquenilo C2-6 o alquinilo C2-6· Preferiblemente, Nu de las fórmulas (A) y (B) se selecciona del grupo de nucleófilos que consiste de grupos amino primarios, secundarios y terciarios, tiol, ácido carboxílico, hidroxilamina, hidrazina y heteroarilo que contiene nitrógeno.
Preferiblemente, W de las fórmulas (A) y (B) es (CR9R10)b, en donde Rg y Rio se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-2, alquenilo C2-e y alquinilo C2-6 y en donde b es 1, 2, 3, 4 o 5.
Preferiblemente, n de las fórmulas (A) y (B) es 0, l o 2, más preferiblemente, n es 0 o 1 y lo más preferiblemente n es 0.
Preferiblemente, Ar de las fórmulas (A) y (B) se selecciona de Otros enlazadores de profámacos preferidos se describen y se pueden obtener como se describe en WO 2006/136586 A2. Por lo tanto, un resto biológicamente neutralizante de VEGF enlazador profármaco reversible preferido tiene la estructura de las fórmulas (C), (D) o (E): - - - en donde la línea discontinua indica unión con el resto del profármaco, en este caso, al resto portador o al resto separador opcional; D es un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF que está conectado al resto de la molécula a través de un grupo amina del fármaco neutralizante de VEGF correspondiente formando un enlace amida; X es un resto separador tal como R13-Y1; Y1 es O, S, NR6, succinimida, maleimida, enlaces carbono-carbono insaturados o cualquier par de electrones libres que contiene heteroátomos o está ausente; R13 se selecciona del alquilo o heteroalquilo ramificado, cíclico o lineal sustituido o no sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no sustituidos; R2 y R3 se seleccionan independientemente de hidrógeno, grupos acilo o grupos protectores para grupos hidroxilo; R4 a R se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo o heteroalquilo ramificado, cíclico lineal, sustituido o no sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroarilo sustituido o no sustituido, ciano, nitro, halógeno, carboxi, carboxamida.
Preferiblemente, ]¾>, R3, ¾, Rs, R6, R7, Re, R9, Rio, R11 y R12 de las fórmulas (C), (D) y (E) se seleccionan independientemente de H, alquilo Ci-S, alquenilo C2-s y alquinilo C2-6.
Preferiblemente, en las fórmulas (C), (D) y (E) Y1 es alquilo Ci-20, alquenilo C2-20 o alquinilo C2-2o- Otro enlazador de profármaco preferido se describe y se puede obtener como se describe en el documento WO 2009/095479 A2. Por lo tanto, un enlazador de profármaco reversible- resto biológicamente activo neutralizante de VEGF preferido tiene la estructura de la fórmula (F): en donde la línea discontinua indica unión con el resto del profármaco, en este caso, al resto portador o al resto separador opcional; D es un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF que está conectado al resto de la molécula a través de una amina aromática del fármaco neutralizante de VEGF correspondiente mediante la formación de un enlace amida; X es C(R4R4a); N(R4); 0; C (R4R4a)-C(R5R5a); C(R5R5a)-C(R4R4a); C(R4R4a)-N(R6); N(R6) -C(R4R4A); C(R4R4a)-0; o 0-C(R4R4a); XI es C; O S (O); X2 es C (R7, R7a); O C(R7, R7a)-C(R8, R8a); R1, Rla, R2, R2a, R3, R3a, R4, R4a, R5, R5a, R6, R7, R7a, R8, R8a se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H; y alquilo C1-4; opcionalmente, uno o más de los pares Rla/R4a, Rla/R5a, R4a/R5a, R4a/R5a, R7a/R8a forman un enlace químico; opcionalmente, uno o más de los pares de R1/Rla, R2/R2a, R4/R4a, R5/R5a, R7/R7a, R8/R8a están unidos junto con el átomo al que están unidos para formar un cicloalquilo C3-7, o heterociclilo de 4 a 7 miembros; opcionalmente, uno o más de los pares R1/R4, R1/R5, R1/R6, R4/R5, R7/R8, R2/R3 están unidos juntos con los átomos a los que están unidos para formar un anillo A; opcionalmente, R3/R3a se unen junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos para formar un anillo heterociclo de 4 a 7 miembros; A se selecciona del grupo que consiste de fenilo; naftilo; indenilo; indanilo; tetralinilo; cicloalquilo C3-10; heterociclilo de 4 a 7 miembros; y heterobiciclilo de 8 a 11-miembros; siempre que un hidrógeno de R1, R1a, R2, R2a, R3, R3a, R4, R4a, R5, R5A, R6, R7, R7a, R8 o R8a sea sustituido con un enlace para conectar el resto de la fórmula (F) con el resto del profármaco neutralizante de VEGF, en este caso, con el resto portador o con el resto separador opcional.
Opcionalmente, el resto del enlazador de profármaco reversible de la fórmula (F) está sustituido adicionalmente, siempre que el hidrógeno del nitrógeno del resto no se sustituya y que que R3 y R3a sean independientemente uno de otro H o sean conectados a N a través de un átomo de carbono hibridizado con SP3.
Otro enlazador de profármaco preferido se describe y se puede obtener como se describe en WO 2011/012721 Al y WO 2011/012722 Al. Por lo tanto, un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF enlazador de profármaco reversible preferido tiene la estructura de la fórmula (G): en donde la línea discontinua indica unión con el resto del profármaco, en este caso, a la fracción portadora o al resto separador opcional; D es un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF que está conectado al resto de la molécula a través de una amina aromática del profarmaco neutralizante de VEGF correspondiente mediante la formación de un enlace amida; X1 es CCRlR13) o un fragmento cíclico seleccionado de cicloalquilo C3-7, heterociclilo de 4 a 7 miembros, fenilo, naftilo, indenilo, indanilo, tetralinilo, o heterobiciclilo de 8 a 11- miembros, en donde en caso de que X1 sea un fragmento cíclico, tal fragmento cíclico se incorpore en L1 a través de dos átomos adyacentes del anillo y el átomo de anillo de X1, que es adyacente al átomo de carbono del enlace amida, es también un átomo de carbono; X2 es un enlace químico o se selecciona de C(R3R3a), N (R3), 0, C(R3R3a)-C(R4R4a), C(R3R3a)-N (R4), N(R3)-C(R4R4a), C (R3R3a)-O, o 0-C(R3R3a), en donde en caso de que X1 sea un fragmento cíclico, X2 es un enlace químico, C(R3R3a), N(R3) u 0; opcionalmente, en caso de que X1 sea un fragmento cíclico y X2 sea C(R3R3a), el orden del fragmento X1 y el fragmento X2 dentro de L1 puede ser cambiado y el fragmento cíclico se incorpora en L1 a través dos átomos adyacentes del anillo; R1, R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H, alquilo Ci-4 y -N(R5R5a); Rla, R2, R3a, R4a y R5a se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H, y alquilo Ci-4; R5 es C(0)R6; R6 es alquilo Ci-4; opcionalmente, uno de los pares Rla/R4a, R3a/R4a o Rla/R3a forman un enlace químico; siempre que un hidrógeno de R1, Rla, R2, R2a, R3, R3a, R4, R4a, R5, R5a o R6 se sustituya con un enlace para conectar el resto de la fórmula (G) con el resto de profármaco neutralizante de VEGF, en este caso, al resto portador o al resto separador opcional.
Otro enlazador de profármaco preferido se describe y se puede obtener como se describe en el documento O 2011/089214 Al. Por lo tanto, un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF enlazador de profármaco reversible preferido tiene la estructura de la fórmula (H): en donde la línea discontinua indica unión can el resto del profármaco, en este caso, a la fracción portadora o al resto separador opcional; D es un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF que está conectado al resto de la molécula a través de un hidroxilo aromático (-0H) del profármaco neutralizante de VEGF correspondiente mediante la formación de un enlace carbamato; R1 se selecciona del grupo que consiste de alquilo Ci-4; heteroalquilo; cicloalquilo C3-7; y R \ 3a/ N R 5 R2, R2a, R3 y R3a se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo C1-4 o heteroalquilo ramificado, cíclico o lineal sustituido o no sustituido; cada d es independientemente 2, 3 ó 4; siempre que un hidrógeno de R1, R2, R2a, R3, o R3a se sustituye con un enlace para conectar el resto de la fórmula (H) con el resto del profármaco neutralizante de VEGF, en este caso, al resto portador o al resto separador opcional.
Otro enlazador de profármaco preferido se describe y se puede obtener como se describió en el documento WO 2011/089216 Al. Por lo tanto, un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF enlazador de profármaco reversible preferido tiene la estructura de la fórmula (J): en donde la línea discontinua indica unión con el resto del profármaco, en este caso, a la fracción portadora o al resto separador opcional; D es un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF que está conectado al resto de la molécula a través de una amina alifática del profármaco correspondiente mediante la formación de un enlace amida ; Xi se selecciona de 0, S o CH-Rla; RI y Ría se seleccionan independientemente de H, OH, CH3; R2, R2a, R4 y R4a se seleccionan independientemente de H y alquilo C1-4, R3 y R3a se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-4, y R5; R5 se selecciona de en donde las líneas discontinuas indican unión con el resto del resto; siempre que un hidrógeno de R1, Rla, R2, R2a, R3, R3a, R4, R4a y R5 sea sustituido con un enlace para conectar el resto de la fórmula (J) con el resto del profármaco neutralizante de VEGF, en este caso, al resto portador o al resto separador opcional .
Preferiblemente, R3 de la fórmula (J) es H y R3a de la fórmula (J) es R5.
Preferiblemente, uno de R4/R4a de la fórmula (J) es H.
Opcionalmente, uno o más de los pares R3/R3a, R4/R4a, R3/R4 de la fórmula (J) pueden formar independientemente uno o más fragmentos cíclicos seleccionados de cicloalquilo C3-7, heterociclilo de 4 a 7 miembros, o heterobiciclilo de 8 a 11 miembros.
Opcionalmente, R3, R3a, R4 y R4a de la fórmula (J) están sustituidos adicionalmente con alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, fenilo, heterociclo de 4 a 7 miembros o halógeno.
Otro enlazador de profármaco preferido se describe y se puede obtener como se describe en el documento O 201 1/089215 Al. Por lo tanto, un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF enlazador de profármaco reversible preferido tiene la estructura de la fórmula (K): en donde la línea discontinua indica unión con el resto del profármaco, en este caso, al resto portador o al resto separador opcional; D es un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF que está conectado al resto de la molécula a través de una amina aromática del fármaco neutralizante de VEGF correspondiente mediante la formación de un enlace amida; R1, Rla, R2, R3, R3a, R4 y R4a se seleccionan independientemente de H y alquilo C1-4; opcionalmente, cualquiera de dos R1, Rla, R2, R3, R3a, R4 y R4a pueden formar independientemente uno o más fragmentos cíclicos seleccionados de cicloalquilo C3-7, heterociclilo de 4 a 7 miembros, fenilo, naftilo, indenilo, indanilo, tetralinilo, o heterobiciclilo de 8 a 11 miembros; opcionalmente, R1, Rla, R2, R3, R3a, R4 y R4a son sustituidos adicionalmente con un sustituyente seleccionado del grupo que comprende alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-s, cicloalquilo C3-7, heterociclilo de 4 a 7 miembros, fenilo, naftilo, indenilo, indanilo, tetralinilo, o heterobiciclilo de 8 a 11 miembros; siempre que un hidrógeno de R1, Rla, R2, R3, R3a, R4 y R4a esté sustituido con un enlace para conectar el resto de la fórmula (J) con el resto del profármaco neutralizante de VEGF, en este caso, al resto portador o al resto separador opcional.
Otro enlazador profármaco preferido se describe y se puede obtener como se describe en PCT/EP2012/065748. Por lo tanto, un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF enlazador de profármaco reversible preferido tiene la estructura de la fórmula (L): en donde la línea discontinua indica unión con el resto del profármaco, en este caso, a la fracción portadora o al resto separador opcional; D es un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF que está conectado al resto de la molécula mediante un grupo carboxílico (-(C=0)-0H) del fármaco neutralizante de VEGF correspondiente mediante la formación de un enlace éster carboxílico; R1 se selecciona del grupo de alquilo no sustituido; alquilo sustituido; fenilo no sustituido; fenilo sustituido; naftilo no sustituido; naftilo sustituido; indenilo no sustituido; indenilo sustituido; indanilo sustituido; indanilo sustituido; tetralinilo no sustituido; tetralinilo sustituido; cicloalquilo C3-10 no sustituido; cicloalquilo C3-10 sustituido; heterociclilo de 4 a 7 miembros no sustituido; heterociclilo de 4 a 7 miembros sustituido; heterobiciclilo de 8 a 11 miembros no sustituido; y heterobicielilo de 8 a 11 miembros sustituido, R2 se selecciona de H, alquilo no sustituido, y alquilo sustituido R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H, alquilo no sustituido, y alquilo sustituido; e es 0 ó 1; opcionalmente, R1 y R3 se unen juntos con los átomos a los que están unidos para formar un anillo A; A se selecciona del grupo que consiste de cicloalquilo C - o; heterociclilo alif ático de 4 a 7 miembros; y heterobiciclilo alif tico de 8 a 11 miembros, en donde A es no sustituido o sustituido; Q se selecciona del grupo que comprende alquilo C - o , alquenilo C - o alquinilo C - , cuyo fragmento está opcionalmente interrumpido por uno o más grupos seleccionado de -NH-, -N(alquilo C - ) -, -O-, -S-, C(O) -, - C ( 0 ) NH - , -C (0) N (alquilo C - ) -, -0C(O) -, S(O) -, -S (0) - , heterociclilo de 4 a 7 miembros, fenilo o naftilo.
Otro enlazador de profármaco preferido se describe y puede ser obtenido como se describe en EP 12165516. Por lo tanto, un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF enlazador de profármaco reversible preferido tiene la estructura de la f órmul a M en donde la línea discontinua indica unión con el resto del profármaco, en este caso, a la fracción portadora o al resto separador opcional; D es un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF que está conectado al resto de la molécula a través de un grupo hidroxilo del fármaco neutralizante de VEGF correspondiente mediante la formación de un éster o enlace carbamato Y es -C (R1) (Rla) - ; o -N (R1) - ; X es -C (R4) (R4a) - ; -N (R4) - ; -O- ; -C (R4) (R4a) -C (R5) (R5a) - ; - C (R4) (R4a) -N (R6) - ; -N (R6 ) -C (R4 ) (R4a) - ; -C (R4) (R4a) -O- ; -0- X2 es - C ( R7 ) ( R7a ) - ; o -C (R7) (R7a) -C (R8) (R8a) - ; X3 es =0; =S ; o =N-CN; R1, Rla, R2, R2a, R3, R3a, R4, R4a, R5, R5a, R6, R7, R7a, R8, R8a se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H; alquilo Ci-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, heteroalquilo C1-20 y Yi-T; e independientemente ninguno, uno o más de los pares de Rla/R4a, Rla/R5a, R4a/R5a, R7a/R8a están ausentes y los átomos de carbono correspondientes a los que están unidos forman un doble enlace cis; Y1 es un enlace químico o alquilo Ci-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6; T se selecciona del grupo que consiste de fenilo; naftilo; indenilo; indanilo; tetralinilo; cicloalquilo C3-10; heterociclilo de 4 a 7 miembros; o heterobiciclilo de 8 a 11 miembros, en donde T está opcionalmente sustituido con uno o más R9, que son iguales o diferentes; R9 es halógeno; -CN; oxo(=0); -C(O)0H; -OH; -S(O)2NH2; - S (O)NH2; -S(O)20H; -S(O)OH; -SH; -NH2; -NO2; alquilo Ci-6 o heteroalquilo C1-10; opcionalmente, uno o más de los pares de RVRla, RVR4, R3/R6, R1/R5, R2/R2a, R2/R3, R4/R4a, R4/R5, R5/R5a, R7/ 7a, R7/R8, R8/R8a se unen junto con el átomo al que están unidos para formar un anillo T; opcionalmente, R3/R3a se unen junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo de 4 a 7 miembros; siempre que un hidrógeno de R1, Rla, R2, R2a, R3, R3a, R4, R4a, R5, R5a, R6, R7, R7a, R8 o R8a sea sustituido con un enlace para conectar el resto de la fórmula (M) con el resto del profármaco neutralizante de VEGF, en este caso, al resto portador o al resto separador opcional.
Más preferiblemente, el profármaco neutralizante de VEGF comprende un resto enlazador de profármaco reversible-resto biológicamente activo neutralizante de VEGF de la fórmula (F).
Incluso más preferiblemente, el profármaco neutralizante de VEGF comprende un resto enlazador de profármaco reversible-resto biológicamente activo neutralizante de VEGF o fórmula (F) y unión con el resto del profármaco, en este caso, al portador o al separador opcional que está conectado al portador, se produce a través de R4 de X o R3 de la fórmula (F), más preferiblemente a través de R4 de la fórmula (F).
Incluso más preferiblemente, el profármaco neutralizante de VEGF comprende un resto de la fórmula (F-i): en donde la línea discontinua indica la unión al portador o al resto separador opcional; R1, Rla, R2, R2a, R3, R3a, X1, X2 y D se utilizan como en la fórmula (F); opcionalmente, el resto de la fórmula (F-i) que además está sustituido, siempre que el hidrogel marcado con el asterisco en la fórmula (F-i) no sea sustituido por un sustituyente y que R3 y R3a sean independientemente uno de otro H o están conectados a N a través de un átomo de carbono hibridizado SP3.
Preferiblemente, X1 de la fórmula (F-i) es C.
En una modalidad, X2 de la fórmula (F-i) es C(R7R7a).
En otra modalidad X2 de la fórmula (F-i) es C(R7R7a)- C(R8R8a).
Preferiblemente, R1 de la fórmula (F-i) es H.
Preferiblemente, Rla de la fórmula (F-i) es H.
Preferiblemente, R1 y Rla de la fórmula (F-i) son ambos H.
Preferiblemente, R2 de la fórmula (F-i) es H.
Preferiblemente, R2a de la fórmula (F-i) es H.
Preferiblemente, R2 y R2a de la fórmula (F-i) son H.
Preferiblemente, R3 de la fórmula (F-i) es H o metilo, etilo o propilo.
Preferiblemente, R3a de la fórmula (F-i) es H o metilo, etilo o propilo.
En una modalidad preferida R3 y R3a de la fórmula (F-i) son ambos H.
En otra modalidad preferida R3 de la fórmula (F-i) es H y R3a de la fórmula (F-i) es metilo.
En otra modalidad preferida R3 y R3a de la fórmula (F-i) son ambos metilo.
Preferiblemente, D de la fórmula (F-i) es ranibizumab. Preferiblemente, el portador de la fórmula (F-i) es un hidrogel, más preferiblemente un hidrogel a base de PEG.
En una modalidad preferida, el profármaco neutralizante de VEGF comprende un resto de la fórmula (f-ii) en donde la línea discontinua indica unión al portador; R1, Rla, R2, R2a, R3, R3a, X2 y D se utilizan como se define en la fórmula (F); R10 se selecciona de H y alquilo Ci-6; SP° es un resto separador; y en donde el resto de la fórmula (F-ii) está opcionalmente sustituido adicionalmente, siempre que el hidrogel marcado con el asterisco en la fórmula (F-ii) no sea sustituido por un sustituyente y que R3 y R3a sean independientemente uno de otro H o estén conectados N a través de un átomo de carbono hibridizado SP3.
En una modalidad, X2 de la fórmula (F-ii) es C(R7R7a).
En otra modalidad X2 de la fórmula (F-ii) es C(R7R7a)- C (R8R8a).
Preferiblemente, R1 de la fórmula (F-ii) es H.
Preferiblemente, Rla de la fórmula (F-ii) es H.
Preferiblemente, R1 y Rla de la fórmula (F-ii) son ambos H.
Preferiblemente, R2 de la fórmula (F-ii) es H.
Preferiblemente, R2a de la fórmula (F-ii) es H.
Preferiblemente, R2 y R2a de la fórmula (F-ii) son H.
Preferiblemente, R3 de la fórmula (F-ii) es H o metilo, etilo o propilo.
Preferiblemente, R3a de la fórmula (F-ii) es H o metilo, etilo o propilo.
En una modalidad preferida R3 y R3a de la fórmula (F-ii) son ambos H.
En otra modalidad preferida R3 de la fórmula (F-ii) es H y R3a de la fórmula (F-ii) es metilo.
En otra modalidad preferida R3 y R3a de la fórmula (F-ii) son ambos metilo.
En una modalidad R10 de la fórmula (F-ii) es H.
En otra modalidad preferida R10 de la fórmula (F-ii) es metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo o ter-butilo. Más preferiblemente, R10 de la fórmula (F-ii) es metilo, etilo, propilo o isopropilo. Incluso más preferiblemente, R10 de la fórmula (F-ii) es metilo o etilo y más preferiblemente, R10 de la fórmula (F-ii) es metilo.
Preferiblemente, SP° de la fórmula (F-ii) se selecciona de alquilo C1-50; alquenilo C2-50; y alquinilo C2-50 en donde alquilo C1-50; alquenilo C2-50; y alquinilo C2-50 están opcionalmente sustituidos con uno o más Ral°, que son iguales o diferentes y en donde alquilo Ci-5o; alquenilo C2-50; y alquinilo C2-50 están opcionalmente interrumpidos por uno o más grupos seleccionados del grupo que consiste de T, -C(O)0-; -O-; -C(0)-; -C(O)N (Ral1)-; -S(O)2N (Ral1)-; -S(O)N (Ral1)-; - S (0)2-; -S(0)-; -N(Rall)S(O)2N(Ralla) -S-; -N(Ral1)-; OC (O) Ral1 ; -N (Rall) C (0) -N (Ral1) S (O) 2 - ; -N (Ral1) S (0) - ; N (Ral1) C (O) 0 - ; -N (Ral1) C (0) N (Ralla) - ; y -OC (0) N (RallRalla) ; T se selecciona del grupo que consiste de fenilo; naftilo; indenilo; indanilo; tetralinilo; cicloalquilo C3-10; heterociclilo de 4 a 7 miembros; o heterobiciclilo de 8 a 11 miembros, en donde T está opcionalmente sustituido con uno o más Ral°, que son iguales o diferentes; Ral° es halógeno; CN; oxo (=0); C00Ral2; 0a12; C(O)Ral2; C (0)N (Ral2Ral2a); S(0)2N (Ral2Ral2a); S(0)N (Ral2Ral2a); S(0)2Ra12; S (0)Ral2; N(Ral2)S(0)2N(Ral2aRal2b); SRa12; N (Ral2Ral2a); NO2; 0C (0)Ral2; N (Ral2)C(0)Ral2a; N (Ral2)S(O)2Ral2a; N(Ral2)S(0)Ral2a; N (Ral2)C(O)0Ral2a; N (Ral2)C(O)N (Ral2aRal2b); OC(0)N (Ral2Ral2a); O alquilo Ci-6, en donde alquilo C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, que son iguales o diferentes; Ral1, Ralla, Ral2, Ral2a, Ral2b se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H; o alquilo Ci-6, en donde alquilo C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, que son iguales o diferentes.
Preferiblemente, SP° de la fórmula (F-ii) es alquilo C1-20, en donde alquilo C1-20 está opcionalmente interrumpido por uno o más grupos seleccionados independientemente de -O-; y -C (0)N (Rlaa)-; y en donde la cadena de alquilo C - está opcionalmente sustituida con uno o más grupos seleccionados independientemente de OH; y - C ( O ) N ( RlaaRlaaa ) ; en donde Rlaa , R aaa se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H; y alquilo C - .
Preferiblemente, SP° de la fórmula (F-ii) tiene un peso molecular en el intervalo de 14 g/mol hasta 750 g/ ol.
Preferiblemente, SP° de la fórmula (F-ii) se une al portador a traves de un grupo terminal seleccionado de En caso de que SP° de la fórmula (F-ii) tenga tal grupo terminal es además preferido que SP° tenga un peso molecular en el intervalo desde 14 g/mol hasta 500 g/mol calculado sin tal grupo terminal.
Preferiblemente, D de la fórmula (F-ii) es ranibizumab.
Preferiblemente, el portador de la fórmula (F-ii) es un hidrogel, más preferiblemente un hidrogel a base de PEG.
Incluso más preferiblemente, el profármaco neutralizante de VEGF comprende un resto de la fórmula (F-IIIa) o (F-IIIb) b), en donde la línea discontinua indica unión al portador; R2, R2a, R3, R3a, R7, R7a, R8, R8a, X2 y D se utilizan como se define en la fórmula (F); RÍO y SP° se utilizan como se define en la fórmula (F- y en donde el resto de la fórmula (F-iiia) o (F-iiib) está opcionalmente sustituido adicionalmente, siempre que el hidrógeno marcado con el asterisco en la fórmula (F-iiia) y (F-iiib) no sea sustituido por un sustituyente y que R3 y R3a sean independientemente uno de otro H o estén conectados a N través de un átomo de carbono hibridizado a SP3.
Preferiblemente, SP° de la fórmula (F-iiia) o (F-iiib) es alquilo C1-2, en donde alquilo C1-20 está opcionalmente interrumpido por uno o más grupos seleccionados independientemente de -O-; y -C(0)N (Rlaa)-; y en donde la cadena de alquilo C1-20 está opcionalmente sustituida con uno o más grupos seleccionados independientemente de OH; y -C(0)N (RlaaRlaaa); en donde Rlaa, Rlaaa se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H; y alquilo Ci-4· Preferiblemente, SP° de la fórmula (F-iiia) o (F-iiib) tiene un peso molecular en el intervalo de 14 g/mol a 750 g/mol.
Preferiblemente, SP° de la fórmula (F-iiia) o (F-iiib) se une al portador a través de un grupo terminal seleccionado de ;y En caso de que SP° de la fórmula (F-iiia) o (F-iiib) tenga tal grupo terminal es además preferido que SP° tenga un peso molecular en el intervalo de 14 g/mol hasta 500 g/mol calculado sin tal grupo terminal.
Preferiblemente, R2 de la fórmula (F-iiia) o (F-iiib) es H .
Preferiblemente, R2a de la fórmula (F-iiia) o (F-iiib) es H.
Preferiblemente, R2 y R2a de la fórmula (F-iiia) o (F-iiiB) son H.
Preferiblemente, R3 de la fórmula (F-iii) es H o metilo, etilo o propilo.
Preferiblemente, R3a de la fórmula (F-iii) es H o metilo, etilo o propilo.
En una modalidad preferida R3 y R3a de la fórmula (F-iii) son ambos H.
En otra modalidad preferida R3 de la fórmula (F-iii) es H y R3a de la fórmula (F-iii) es metilo.
En otra modalidad preferida R3 y R3a de la fórmula (F-iii) son ambos metilo.
Preferiblemente, R7 de la fórmula (F-iiia) o (F-iiib) es H.
Preferiblemente, R7a de la fórmula (F-iiia) o (F-iiib) es H .
Preferiblemente, R8 de la fórmula (F-iiib) es H.
Preferiblemente, R8a de la fórmula (F-iiib) es H.
Preferiblemente, RS y R8a ia fórmula (F-iiib) son ambos H.
Preferiblemente, R10 de la fórmula (F-iiia) es H.
Preferiblemente, R10 de la fórmula (F-iiib) es metilo, etilo o propilo. Lo más preferiblemente, R10 de la fórmula (F-iiib) es metilo.
Preferiblemente, D de la fórmula (F-iiia) o (F-iiib) es ranibizumab.
Preferiblemente, el portador de la fórmula (F-iiia) o (F-iiib) es un hidrogel, más preferiblemente un hidrogel a base de PEG.
Incluso más preferiblemente, el VEGF neutralizantes profármaco comprende un resto de la fórmula (F-iva) o (F-ivb): vb), en donde la línea discontinua indica unión al portador R3 y R3a se utilizan como se define en la fórmula (I); R10b es alquilo Ci-6; y donde el resto de la fórmula (F-iva) o (F-ivb) está opcionalmente sustituido adicionalmente, siempre que el hidrógeno marcado con el asterisco no sea sustituido por un sustituyente y que R3 y R3a sean independientemente uno de otro H o están conectados a N a través de un átomo de carbono hibrizado SP3.
Preferiblemente, SP° de la fórmula (F-iva) y (F-ivb) es alquilo Ci_2o, en donde alquilo C1-20 está opcionalmente interrumpido por uno o más grupos seleccionados independientemente de -O-; y -C(O)N (Rlaa)-; y en donde la cadena de alquilo Ci-2o está opcionalmente sustituida con uno o más grupos seleccionado independientemente de OH; y C(0)N (RlaaRlaaa); en donde Rlaa, Rlaaa se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H; y alquilo Ci- 4 Preferiblemente, SP° de la fórmula (F-iva) y (F-ivb) tiene un peso molecular en el intervalo de 14 g/mol a 750 g/mol.
Preferiblemente, SP° de la fórmula (F-iva) y (F-ivb) se une al portador a través de un grupo terminal seleccionado de : Y En caso de que SP° de la fórmula (F-iva) y (F-ivb) tenga tal grupo terminal es además preferido que SP° que tenga un peso molecular en el intervalo de 14 g/mol hasta 500 g/mol calculado sin tal grupo terminal.
Preferiblemente, R3 de la fórmula (F-iva) o (F-ivb) es H o metilo, etilo o propilo.
Preferiblemente, R3a de LA fórmula (F-iva) o (F-ivb) es H o metilo, etilo o propilo.
En una modalidad preferida R3 y R3a de la fórmula (F-iva) o (F-ivb) son ambos H.
En otra modalidad preferida R3 de la fórmula (F-iva) o (F-IVb) es H y R3a de la fórmula (F-iva) o (F-ivb) es metilo.
En otra modalidad preferida R3 y R3a de la fórmula (F-iva) o (F-ivb) son ambos metilo.
En otra modalidad preferida R3 de la fórmula (F-iva) o (F-ivb) es H y R3a de la fórmula (F-iva) o (F-ivb) es metilo.
Preferiblemente, R10b de la fórmula (F-IVb) es metilo, etilo o propilo. Lo más preferiblemente, R10b es metilo.
Preferiblemente, D de la fórmula (F-iva) y (F-ivb) es ranibizumab.
Preferiblemente, el portador de la fórmula (F-iva) y (F-ivb) es un hidrogel, más preferiblemente un hidrogel a base de PEG.
En una modalidad, el profármaco neutralizante de VEGF comprende en forma unida un resto biológicamente activo seleccionado del grupo de fármacos que consiste de ARN antisentido, ADN antisentido, ribozimas o moléculas ARNi dirigidas a un ácido nucleico VEGF; aptámeros anti-VEGF, anticuerpos anti-VEGF, fragmentos de anticuerpos anti-VEGF, DARPinas y señuelos de los receptores de VEGF solubles que impiden la unión de un VEGF a su receptor cognado; antisentido, ribozimas, y moléculas de ARNi dirigidas a un receptor de VEGF cognado (VEGFR) de ácido nucleico; aptámeros anti-VEGFR o anticuerpos anti-VEGFR que se unen a un receptor VEGFR cognado; fragmentos de anticuerpos anti-VEGFR que se unen a un receptor VEGFR cognados e inhibidores de tirosina cinasa VEGFR.
En una modalidad preferida, el profármaco neutralizante de VEGF en forma unida comprende un resto biológicamente activo seleccionado del grupo de fármacos que consiste de ARN antisentido, ADN antisentido, ribozimas o moléculas de ARNi dirigidas a un ácido nucleico VEGF; aptámeros anti-VEGF, anticuerpos anti-VEGF, DARPinas y señuelos del receptor de VEGF solubles que impiden la unión de un VEGF a su receptor cognado; antisentido, ribozimas, y moléculas de ARNi que se dirigen a un receptor de VEGF cognado (VEGFR) de ácido nucleico; aptámeros anti-VEGFR o anticuerpos anti-VEGFR que se unen a un receptor VEGFR cognado; e inhibidores de la tirosina cinasa VEGFR.
Preferiblemente, el profármaco neutralizante de VEGF comprende en forma unida un resto biológicamente activo seleccionado del grupo que consiste de ranibizumab, bevacizumab, pegaptanib, aflibercept, MP0112, KH902, ESBA1008, AL 39324, ALG-1001, y bevasiranib y/o fragmentos de los mismos.
Más preferiblemente, el profármaco neutralizante de VEGF se selecciona del grupo que consiste de ranibizumab, bevacizumab, pegaptanib, aflibercept y bevasiranib y/o fragmentos de los mismos.
Lo más preferiblemente, el profármaco neutralizante de VEGF es ranibizumab.
En una modalidad, la afección ocular a ser tratada con la composición farmacéutica de la presente invención es una enfermedad caracterizada por la neovascularización ocular.
La neovascularización intraocular se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de neovascularización del disco óptico, neovascularización del iris, neovascularización retinal, neovascularización coroidea, neovascularización corneal, neovascularización vitrea, glaucoma, pannus, pterigión, edema macular, degeneración macular, degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética, isquemia retinal diabética, edema macular diabético, retinopatía vascular, degeneración retiniana, fibroplasia retrolental, retinoblastoma, retinopatía de la prematuridad de la degeneración macular, neovascularización de injertos de la córnea, oclusión de la vena central de la retina (CRVO, por sus siglas en ingles), miopía patológica, tumores oculares, uveítis, enfermedades inflamatorias del ojo, y vitreorretinopatía proliferativa.
En una modalidad, la composición farmacéutica además comprende uno o más fármacos en su forma libre seleccionada de la lista de clases de fármacos que comprenden ARN antisentido, ADN antisentido, ribozimas o moléculas de ARNi dirigidas a un ácido nucleico VEGF; aptámeros anti-VEGF, anticuerpos anti-VEGF, fragmentos de anticuerpos anti-VEGF, DARPinas, anticalinas, lipocalinas, y señuelos de los receptores de VEGF solubles que impiden la unión de un VEGF a su receptor cognado; moléculas antisentido, ribozimas, y ARNi dirigidas a un ácido nucleico del receptor de VEGF cognado (VEGFR); aptámeros anti-VEGFR o anticuerpos anti-VEGFR que se unen a un receptor VEGFR cognado; fragmentos de anticuerpos anti-VEGFR que se unen a un receptor VEGFR cognado e inhibidores de tirosina cinasa VEGFR.
En una modalidad preferida, la composición farmacéutica además comprende uno o más fármacos en su forma libre seleccionado de la lista de clases de fármacos que comprende ARN antisentido, ADN antisentido, ribozimas o moléculas de ARNi dirigidas a un ácido nucleico de VEGF; aptámeros anti-VEGF, anticuerpos anti-VEGF, DARPinas, anticalinas, lipocalinas, y señuelos de los receptores de VEGF solubles que impiden la unión de un VEGF a su receptor cognado; moléculas antisentido, ribozimas, y de ARNi dirigidas a un ácido nucleico del receptor de VEGF cognado (VEGFR); aptámeros anti-VEGFR o anticuerpos anti-VEGFR que se unen a un receptor VEGFR cognado; e inhibidores de la tirosina cinasa VEGFR.
Preferiblemente, la composición farmacéutica además comprende uno o más ingredientes activos que puede ser un esteroide, un compuesto anti-inflamatorio, un antibiótico, y antiviral, un compuesto antifúngico, o un compuesto anti-angiogénico. El ingrediente activo puede ser, por ejemplo, metotrexato, ácido retinoico, aspirina, diclofenaco, flurbiprofeno, ibuprofeno, ketorolaco, naproxeno, uprofen, dexametasona, cortisona, fluocinolona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, o triamcinolona.
En una modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende además en su forma libre uno o más moduladores de la actividad de una o más proteínas seleccionadas del grupo que comprende factores de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF), factores de crecimiento de fibroblastos ácidos (aFGF), factores de crecimiento de transformación alfa (TGFa), factores de crecimiento de transformación beta (TGFP), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), angiogenina, factor de crecimiento celular endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF), interleucina-1 (IL-1), interleucina-8 (IL-8), interleucina-12, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiopoyetina-I, Del-I, folistatina, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), leptina, midquina, factor de crecimiento placentario, pleiotrofina (PTN), progranulina, proliferina, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), angioarrestina, fragmento de plasminógeno angiostatina, anti-trombina III antiangiogénico, inhibidor derivado de cartílago (CDI), fragmento de complemento CDS9, fragmento de colágeno tipo XVIII endostatina, fragmento de fibronectina, gro-beta, heparinasas, fragmento de hexasacárido heparina, gonadotropina coriónica humana (hCG), interferón alfa/beta/gamma, proteína inducible por interferón (IP-IO), fragmento del plasminógeno de kringle S, inhibidores de metaloproteinasas (TIMPs), 2-metoxiestradiol, inhibidores de ribonucleasa placentaria, inhibidor del activador del plasminógeno, factor plaquetario 4 (PF4), fragmento de prolactina de 16 kD, proteína relacionada a la proliferina (PRP), retinoides, tetrahidrocortisol-S, trombospondina-I (TSP-I), vasculoestatina, fragmento calreticulin vasostatina, receptor de prostaglandinas, hormona de crecimiento, factor de crecimiento similar a insulina (IGF-I), esfingosina-1-fosfato, factor D, RTP801, inhibidores del complemento, agonista adrenérgico o¡2, mTOR, factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), factor de crecimiento derivado del epitelio de la lente (LEDGF), factor de viabilidad de conos derivado de bastones (RdCVF), factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF), proteína activadora de neutrófilos, proteína quimiotáctica de monocitos, proteína inflamatoria de macrófagos, pequeñas proteínas secretadas inducibles (SIS), factor de plaquetas, proteína básica de plaquetas, actividad estimulante del crecimiento de melanoma, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento nervioso, proteínas morfogenéticas óseas, factor que induce el de crecimiento de cartílago óseo, interleucinas, inhibidores de interleuquina, receptores de interleuquina, factores hematopoyéticos, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de macrófagos, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, inhibina, y activina.
Los inhibidores preferidos de complemento son inhibidor de Cl, inhibidor de C3 e inhibidor de C5.
Los inhibidores preferidos de factores de crecimiento son el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), factor de crecimiento derivado del epitelio de la lente (LEDGF), factor de viabilidad de conos derivado de bastones (RdCVF), factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF).
El factor que induce el crecimiento del cartílago oseo preferido son el factor que induce el crecimiento del cartílago oseo alfa y el factor que induce el crecimiento de cartílago óseo beta.
Un factor hematopoyético preferido es eritropoyetina.
En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende además uno o más profármacos, en donde uno o más profármacos comprenden en forma unida un resto biológicamente activo seleccionado del grupo que consiste de ARN antisentido, ADN antisentido, ribozimas o moléculas RNAi dirigidas a un ácido nucleico de VEGF; aptámeros anti-VEGF, anticuerpos anti-VEGF, anticalinas DARPinas, lipocalinas, y señuelos de los receptores de VEGF solubles que impiden la unión de un VEGF a su receptor cognado; moléculas antisentido, ribozimas, y de ARNi dirigidas a un ácido nucleico delreceptor de VEGF cognado (VEGFR); aptámeros anti-VEGFR o anticuerpos anti-VEGFR que se unen a un receptor VEGFR cognado; e inhibidores de la tirosina cinasa VEGFR.
En otra modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende además uno o más profármacos adicionales en donde uno o más profármacos adicionales comprenden en forma unida un resto biológicamente activo, en donde el resto biológicamente activo es un modulador de la actividad de una o más proteínas seleccionadas del grupo que comprende factores de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF), factores de crecimiento de fibroblastos ácidos (aFGF), factores de crecimiento de transformación alfa (TGFa), factores de crecimiento de transformación beta (TGFP), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), angiogenina, factor de crecimiento celular endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF), interleucina-1 (IL-1), interleucina-8 (IL-8), interleucina-12, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiopoyetina-I, Del-I, folistatina, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), leptina, midquina, factor de crecimiento placentario, pleiotropina (PTN), progranulina, proliferina, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), angioarrestina, fragmento de plasminógeno angiostatina, anti-trombina III antiangiogénico, inhibidor derivado del de cartílago (CDI), fragmento del complemento CDS9, fragmento de colágeno tipo XVIII endostatina, fragmento de fibronectina, gro-beta, heparinasas, fragmento de hexasacárido heparina, gonadotropina coriónica humana (hCG), interferón alfa/beta/gamma, proteína inducible por interferón (IP-IO), fragmento del plasminógeno de kringle S, inhibidores de metaloproteinasas (TIMP), 2-metoxiestradiol, inhibidor de la ribonucleasa placentaria. inhibidor activador del plasminógeno, factor de plaquetas 4 (PF4), fragmento de prolactina de 16 kD, proteína relacionada con proliferina (PRP), retinoides, tetrahidrocortisol-S, trombospondina-I (TSP-I), vasculostatina, fragmento calreticulin vasostatina, receptor de prostaglandina, hormona de crecimiento, factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF-I), esfingosina-1-fosfato, factor D, RTP801, inhibidores del complemento, agonista adrenérgico a2, mTOR, factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), factor de crecimiento derivado del epitelio de la lente (LEDGF), factor de viabilidad de conos derivado de bastones (RdCVF), factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF), proteína activadora de neutrófilos, proteína quimiotáctica de monocitos, proteína inflamatoria de macrófagos, pequeñas proteínas secretadas inducibles (SIS), factor de plaquetas, proteína básica de plaquetas, actividad estimulante del crecimiento de melanoma, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento nervioso, proteínas morfogenéticas óseas, factor que induce el de crecimiento de cartílago óseo, interleucinas, inhibidores de interleuquina, receptores de interleuquina, factores hematopoyéticos, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de macrófagos, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, inhibina, y activina.
En una modalidad, uno o más fármacos están en la forma de un profármaco.
La composición farmacéutica de la presente invención comprende uno o más excipientes. Los excipientes pueden ser categorizados como agentes amortiguadores, modificadores de isotonicidad, conservadores, estabilizantes, agentes anti adsorción, agentes de protección contra la oxidación, viscosificadores/agentes potenciadores de viscosidad, u otros agentes auxiliares. En algunos casos, estos ingredientes pueden tener funciones duales o triples. La composición farmacéutica puede comprender uno o más excipientes seleccionados de los grupos que consisten de: (i) Agentes amortiguadores: soluciones amortiguadoras fisiológicamente toleradas para mantener el pH en un intervalo deseado, tales como fosfato de sodio, bicarbonato, succinato, histidina, citrato y acetato, sulfato, nitrato, cloruro, piruvato. Los antiácidos tales como Mg(OH)2 o ZnCC>3 también pueden usarse. La capacidad amortiguadora se puede ajustar para que coincida con las condiciones más sensibles a la estabilidad del pH; (ii) modificadores de Isotonicidad: para minimizar el dolor que puede resultar del daño celular debido a las diferencias de presión osmótica en el lado de la inyección. Glicerina y cloruro de sodio son ejemplos. Las concentraciones eficaces pueden ser determinadas por osmometría; (iii) Conservadores y/o antimicrobianos: para minimizar el riesgo de los pacientes se infectan con la inyección.
Conservadores típicos incluyen m-cresol, fenol, metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, butilparabeno, clorobutanol, alcohol bencílico, nitrato fenilmercúrico, timerosal, ácido sórbico, sorbato de potasio, ácido benzoico, clorocresol, y cloruro de benzalconio; (iv) Estabilizadores: La estabilización se logra mediante el fortalecimiento de las fuerzas de estabilización de proteínas, mediante la desestabilización del estado desnaturalizado, o por unión directa de excipientes a la proteína. Los estabilizadores pueden ser aminoácidos, tales como alanina, arginina, ácido aspártico, glicina, histidina, lisina, prolina, azúcares tales como glucosa, sacarosa, trehalosa, polioles tales como glicerol, manitol, sorbitol, sales tales como fosfato de potasio, sulfato de sodio, agentes quelantes tales como EDTA, hexafosfato, ligandos tales como iones metálicos divalentes (zinc, calcio, etc.), otras sales o moléculas orgánicas tales como derivados fenólicos. Además, se pueden utilizar oligómeros o polímeros tales como ciclodextrinas, dextrano, dendrímeros, PEG o PVP o protamina o HSA; (v) agentes anti-adsorción: tensioactivos principalmente iónicos o no iónicos u otras proteínas o polímeros solubles se utilizan para cubrir o adsorber competitivamente a, por ejemplo, la superficie interior del recipiente de la composición farmacéutica. Los tensioactivos apropiados son, por ejemplo, sulfatos de alquilo, tales como lauril sulfato de amonio y lauril sulfato de sodio; alquil éter sulfatos, tales como éter laureth sulfato de sodio y myreth sulfato de sodio; sulfonatos tales como dioctil sulfosuccinatos de sodio, perfluorooctanesulfonatos, perfluorobutanosulfonatos, sulfonatos de alquil benceno; fosfatos, tales como fosfatos de alquil aril éter y fosfatos de alquil éter; carboxilatos, tales como sales de ácidos grasos (jabones) o estearato de sodio, lauroil sarcosinato de sodio, perfluorononanoate , perfluorooctanoato; dihidrocloruro de octenidina; cationes de amonio cuaternario tales como bromuro de cetil trimetilamonio, cloruro de cetil trimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio, amina de sebo polietoxilada, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, 5-bromo-5-nitor-l,3-dioxano, cloruro de dimetildioctadecilamonio, bromuro de dioctadecildimetilamonio; zwitteriónicos, tales como 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato, cocamidopropil hidroxisultaína, aminoácidos, iminoácidos, cocamidopropil betaína, lecitina; alcoholes grasos, tales como alcohol cetilico, alcohol estearílico, alcohol cetoestearílico, alcohol oleílico; polioxietilen glicol alquil éteres, tales como octaetilenglicol monododecil éter, pentaetilen glicol monododecil éter; polioxipropilen glicol alquil éteres; éteres de glucósido alquilo, tales como decil glucósido, lauril glucósido, octil glucósido; polioxietileno glicol octilfenol éteres, tales como Tritón X-100; polioxietileno glicol alquilfenol éteres, tales como nonoxinol-9; glicerol alquil ásteres tales como laurato de glicerilo; polioxietileno glicol sorbitán alquil ásteres tales como polisorbatos; sorbitán alquil ésteres; cocamida MEA y cocamida DEA; dodecil dimetilamina óxido; copolímeros en bloque de polietilenglicol y polipropilenglicol, tales como poloxámeros (Pluronic F-68), PEG dodecil éter (Brij 35), polisorbato 20 y 80; otros agentes anti-absorción son dextrano, polietilenglicol, PEG-polihistidina, BSA y HSA y gelatinas. Concentración elegida y el tipo de excipiente depende del efecto que debe ser evitado, pero típicamente se forma una monocapa de tensioactivo en la interfase justo por encima del valor CMC; (vi) Lio- y/o crioprotectores: Durante el liofilizado o secado por pulverización, los excipientes pueden contrarrestar los efectos desestabilizadores causados por rotura de enlaces de hidrógeno y la eliminación de agua. Para este propósito pueden ser usados azúcares y polioles, pero efectos positivos correspondientes también se han observado para los tensioactivos, aminoácidos, solventes no acuosos, y otros péptidos. La trehalosa es particularmente eficiente en la reducción de la agregación inducida por la humedad y también mejora la estabilidad térmica potencialmente causada por la exposición de los grupos hidrofóbicos de la proteína al agua. También se pueden utilizar manitol y sacarosa, ya sea como lio/crioprotector solo o en combinación uno con otro en donde se conoce una mayor proporción de manitol:sacarosa para mejorar la estabilidad física de una torta liofilizada. El manitol también puede ser combinado con trehalosa. La trehalosa también se puede combinar con sorbitol o sorbitol utilizado como el único protector. Almidón o derivados de almidón también se pueden usar; (vii) Agentes de protección contra la oxidación: antioxidantes tales como ácido ascórbico, ectoína, metionina, glutationa, monotioglicerol, morin, polietilenimina (PEI), galato de propilo, vitamina E, agentes quelantes de ácido cítrico aus, EDTA, hexafosfato, ácido tioglicólico; (viii) agente de expansión o difusión: modifica la permeabilidad del tejido conectivo a través de la hidrólisis de componentes de la matriz extracelular en el espacio intrastitial tal como, pero no limitado a, ácido hialurónico, un polisacárido que se encuentra en el espacio intercelular del tejido conectivo. Un agente expansión tal como, pero no limitado a hialuronidasa disminuye temporalmente la viscosidad de la matriz extracelular y promueve la difusión de fármacos inyectados; (ix) otros agentes auxiliares: tales como agentes humectantes, modificadores de viscosidad, antibióticos, hialuronidasa. Ácidos y bases tales como ácido clorhídrico e hidróxido de sodio son agentes auxiliares necesarios para el ajuste del pH durante la fabricación; La composición farmacéutica puede ser proporcionada en la forma de una composición farmacéutica líquida o suspensión seca.
La composición farmacéutica, ya sea forma líquida o suspensión seca, o puede ser proporcionada como una sola dosis o múltiples dosis de composición farmacéutica.
En una modalidad de la presente invención, la composición farmacéutica líquida o suspensión seca, se proporciona como una sola dosis, lo que significa que el recipiente en el que se suministra contiene una dosis farmacéutica.
En otra modalidad la composición farmacéutica líquida o suspensión seca es una composición farmacéutica de múltiples dosis, lo que significa que el recipiente en el que se suministra contiene más de una dosis terapéutica, en este caso, una composición de múltiples dosis contiene por lo menos 2 dosis. Tal composición farmacéutica de múltiples dosis o bien se puede utilizar para diferentes pacientes en necesidad de la misma o se puede utilizar para un paciente, en donde las dosis restantes se almacenan después de la aplicación de la primera dosis hasta que se necesite.
Preferiblemente, la composición farmacéutica se proporciona como una sola dosis.
En otro aspecto de la presente invención, la composición farmacéutica está en un recipiente. Los recipientes apropiados para composiciones líquidas o suspensión farmacéuticas secas, son, por ejemplo, jeringas, viales, viales con tapón y sello, ampollas y cartuchos. En particular, la composición farmacéutica líquida o en suspensión seca se proporciona en una jeringa. Si la composición farmacéutica es una composición farmacéutica seca el recipiente preferiblemente es una jeringa de doble cámara. En tal modalidad, la composición farmacéutica seca se proporciona en una primera cámara de la jeringa de doble cámara y la solución de reconstitución se proporciona en la segunda cámara de la jeringa de doble cámara.
Antes de aplicar la composición farmacéutica seca a un paciente en necesidad de la misma, la composición seca es reconstituida. La reconstitución puede ocurrir en el recipiente en el que se proporciona la composición seca, tal como en un vial, jeringa, jeringa de doble cámara, ampolla, y cartucho. La reconstitución se realiza mediante la adición de una cantidad predefinida de solución de reconstitución a la composición seca. Soluciones de reconstitución son líquidos estériles, tales como agua o solución amortiguadora, que puede contener aditivos adicionales, tales como agentes conservadores y/o antimicrobianos, tales como, por ejemplo, alcohol bencílico y cresol. Preferiblemente, la solución de reconstitución es agua estéril. Cuando una composición farmacéutica seca se reconstituye, se conoce como una "composición farmacéutica reconstituida" o "composición farmacéutica reconstituida" o "composición reconstituida".
Preferiblemente, la composición farmacéutica es un líquido o suspensión.
Otro aspecto de la presente invención es un kit de partes.
Si el dispositivo de administración es simplemente una jeringa hipodérmica entonces, el kit puede comprender la jeringa, una aguja y un recipiente que comprende la composición farmacéutica seca para su uso con la jeringa y un segundo recipiente que comprende la solución de reconstitución.
Si la composición farmacéutica es una composición farmacéutica líquida o suspensión entonces el kit puede comprender la jeringa, una aguja y un recipiente que comprende la composición farmacéutica líquida o en suspensión para su uso con la jeringa.
E emplos Materiales y métodos Lucentis y ranibizumab se utilizan como sinónimos a lo largo de los siguientes ejemplos.
Materiales: Amino 4 -arm PEG5000 se obtuvo de Jenkem Tecnología Beijing, República Popular de China. Cithrol™ DPHS se obtuvo de Croda Internacional Pie, Cowick Hall, Reino Unido.
Acido cis-1,4-ciclohexanpdicaboxílico se obtuvo de TCI EUROPE N.V., Boerenveldseweg 6 - Haven 1063, 2070 Zwijndrecht, Bélgica. Ácido isopropilmalónico se obtuvo de ABCR GmbH & Co. KG, 76187 Karlsruhe, Alemania.
Pentafluorofenil áster del ácido N-(3-maleimidopropil)-39-amino-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-dodecaoxa-nonatriacontanoico (Mal-PEG12-PFE) era obtenida de Biomatrik Inc., Jiaxing, PR China.
Oxima pura, HATU, HOAt, HOBt, PyBOP, TBTU, COMU, Fmoc-L-Asp (OBzl)-OH, Fmoc-L-Asp (OtBu)-OH, Fmoc-L-His (OTRT)-OH, FmocAdo-OH y resina de amida de Rink se compraron de Merck Biosciences GmbH, Schwalbach/Ts, Alemania.
Boc-Lys(Boc)-OSu se adquirió de Senn Chemicals AG, Dielsdorf, Suiza. Fmoc-N-Me-L-Asp (OtBu)-OH se adquirió de Bachem, Bubendorf, Suiza. Fmoc-N-Me-L-Asp (OBzl)-OH se adquirió de Peptides International, Louisville, KY, USA.1,9-bis-Boc-1,5,9-triazanonan se adquirió de Polypeptide Laboratories A/S, Hillerod, Dinamarca.
Carbonato de (5-metil-2-oxo-l,3-dioxol-4-il)-metil 4-nitrofenil se adquirió de Chemzon Scientific Inc., Lachine, QC, Canadá. a- [3-(o-piridildisulfido)propanoilamido]-co-succinimidil éster dodeca (etilenglicol) (OPSS-PEG12NHS) se adquirió de Iris Biotech GmbH, Marktredwitz, Alemania.
Todos los demás productos químicos eran de Sigma-ALDRICH Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania.
Métodos: Las reacciones se realizaron con solventes secos (DCM, THF, ACN, DMF , dioxano, MeOH, tolueno) almacenados sobre tamiz molecular adquirido de Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania. Generalmente, las reacciones se agitaron a temperatura ambiente y se controló por HPLC/MS o TLC.
RP-HPLC se realizó en una columna de 100x20 mm o 100x40 mm C18 Reprosil-Pur 300 ODS-3 5m (Dr. Maisch, Ammerbuch, Alemania) o XBridge BEH300 C18 OBD Prep 10 mm 30x150 mm o 5 mm 10x150 mm (Waters, Eschborn, Alemania) conectada a un sistema Waters 600 o 2535 HPLC y Waters 2487 o 2489 detector absorbancia, respectivamente. Se utilizaron gradientes lineales de la solución A (0.1% de TFA en H2O) y solución B (0.1% TFA en acetoni trilo) . Fracciones de HPLC que contenían el producto se combinaron y se 1 iof i 1 izaron .
Las purificaciones de cromatografía flash se realizaron en un sistema Isolera One de Biotage AB, Suecia, utilizando cartuchos de sílice Biotage KP-Sil y n-heptano, acetato de etilo y metanol como eluyentes. Los productos se detectaron a 254 nm. Para los productos que no muestran absorbancia por encima de 240 nm las fracciones fueron seleccionadas por LC/MS.
CL de ultra eficacia Analítica (UPLC) se realizó en un sistema Waters Acquity equipado con una columna Waters BEH300 C18 (tamaño de partícula 2.1 x 50 thth, 1.7 m) acoplada a un espectrómetro de masas LTQ Orbitrap Discovery de Thermo Scientific.
HPLC-Espectrometría de masas de ionización por electrospray (HPLC-ESI-MS) se realizó en un UPLC Waters Acquity con un detector de Acquity PDA acoplado a un Thermo LTQ Orbitrap Discovery de alta resolución/espectrómetro de masas de alta precisión o Waters Micromass ZQ ambos equipados con una columna C18 RP de Waters ACQUITY UPLC BEH300 (2.1 x 50 mm, 300 Á, 1.7 m, flujo: 0.25 ml/min; solvente A: UP-H2O + 0.04% de TFA, solvente B: UP-acetonitrilo + 0.05% TFA.
Espectros S de los productos de PEG mostró una serie de restos (CH2CH2O)n debido a la polidispersidad de materiales de partida de PEG. Para facilitar la interpretación solamente se da una señal m/z representativa en los ejemplos.
El cambio de solución amortiguadora se realizó en una columna HiTrap o HiPrep (GE Healthcare) conectada a un sistema Aekta Purifier 100.
Cromatografía de intercambio iónico catiónico se realizó ya sea la columna de 6 mi Source 15 S conectada a un sistema purificador Aekta 100 utilizando MES 20 mM, pH 5.7 y MES 20 mM, NaCl 500 mM, pH 5.7 como fase móvil A y B, respectivamente.
Ejemplo 1 Síntesis de reactivo de esqueleto la y lg: jpEG1250 - DLys-DLys2-DLys4(NH2)8 1a El reactivo de esqueleto Ia. se sintetizó como se describe en el ejemplo 1 de WO 2011/012715 Al excepto por el uso de Boc-DLys (Boc)-OH en lugar de Boc-LLys (Boc)-OH .
MS : m/z = 888.50 [M + 10H+]10+ (calculado = 888.54) PEG1250 - TAN-TAN2-TAN4(NH2)8J ig , I E1 reactivo de esqueleto lg se sintetizó de amino 4-arm PEG5000 Ib de acuerdo con el siguiente esquema de reacción: Carbonato de PFP, DI PEA, DCM; HCIenMeOH [ 1 b Carbonato de PFP, DI PEA, DCM; l,9-bis-boc-l,5,9-triazanonano [ PEG1250 - TAN(NH2)2 1c 1d Carbonato de PFP, DIPEA, DCM; HCl en MeOH PEG1250 - TAN-TAN2(NH2)4 l,9-bis-boc-1,5,9-triazanonano 4 1e HCI en Dioxano/MeOH PEG1250 - TAN-TAN2-TAN4(Boc)8 PEG1250- TAN-TAN2-TAN4(NH2)8 [4 1f Para la síntesis del compuesto Ib, amino 4-arm PEG5000 (MW ca. 5350 g/mol, 10.7 g, 2.00 mmol, sal de HCl) y bis(pentafluorofenil)carbonato (4.73 g, 12.0 mmol) se disolvieron en 43 mi de DCM (anhidro) y DIPEA (3.10 g, 24.0 mmol, 4.18 mi) se agregó a temperatura ambiente. Después de 10 min, se agregó 1,9-bis-BOC-l,5,9-triazanonano (5.30 g, 16.0 mmol) y la mezcla se agitó durante 15 min. Después se agregó 1,9-bis-boc-1,5,9-triazanonano (0.33 g, 1.0 mmol) adicional. Después de la disolución completa, la mezcla de reacción se filtró y el solvente se evaporó a temperatura ambiente.
El residuo se disolvió en 40 mi de iPrOH y se diluyó con 320 mi de MTBE. El producto se precipitó durante la noche a -20°C. El precipitado se recogió por filtración a través de un filtro de vidrio Por. 3, y se lavó con 200 mi de MTBE enfriado (0°C). El producto se secó a vacío durante la noche. Rendimiento 11.1 g (83%) de sólido blanco Ib.
MS: m / z = 1112.86 [M + 6H]6+ (calculado = 1113.04).
Para la síntesis del compuesto le, el compuesto Ib boc-protegido con (11.1 g, 1.66 mmol) se disolvió en 40 mi de HCl 3 H en MeOH y se agitó durante 20 min a 45°C, a continuación durante 10 min a 55°C. Para la precipitación, se agregaron 10 mi de MeOH y 200 mi de MTBE y la mezcla se almacenó durante 16 horas a -20°C. El precipitado se recogió por filtración a través de un filtro de vidrio Por.3 y se lavó con 200 mi de MTBE enfriado (0°C). El producto se secó a vacío durante la noche.
Rendimiento 9.14 g (89%) de polvo blanco le (sal de HCl).
MS : m/ z = 979.45 [M + 6H] 6 (calculado = 979.55) .
Para la síntesis del compuesto Id, elcompuesto le (9.06 g, 1.47 mmol, sal de HCl) y bis(pentafluorofenil)carbonato (6.95 g, 17.6 mmol) se disolvieron en 50 mi de DCM (anhidro) y DIPEA (4.56 g, 35.3 mmol, 6.15 mi) se agregó a temperatura ambiente. Después de 10 min, se agregó 1,9-bis-Boc-1,5,9-triazanonano (7.80 g, 23.5 mmol) y la mezcla se agitó durante 15 min. Después se agregó 1 ,9-bis-Boc-l,5,9-triazanonano adicional (0.49 g, 1.5 mmol). Después de la disolución completa, se evaporó el solvente a temperatura ambiente.
El residuo se disolvió en 35 mi de iPrOH a 40°C y se diluyó con 200 mi de MTBE. El producto se precipitó durante la noche a -20°C. El precipitado se recogió por filtración a través de un filtro de vidrio Por.3, y se lavó con 200 mi de MTBE enfriado (0°C). El producto se secó a vacío durante la noche para dar Id como un sólido blanco.
Rendimiento 11.6 g (90%) sólido blanco Id.
MS: m/z = 1248.08 [M + 7H]7+ (calculado = 1248.27).
Para la síntesis del compuesto le, el compuesto Id boc-protegido (11.4 g, 1.31 mmol) se disolvió en 40 mi de HCl 3 M en MeOH y se agitó durante 20 min a 45°C, a continuación durante 10 min a 55°C. Para la precipitación, se agregaron 10 mi de MeOH y 200 mi de MTBE y la mezcla se almacenó durante 16 horas a -20°C. El precipitado se recogió por filtración a través de un filtro de vidrio Por.3 y se lavó con 200 mi de MTBE enfriado (0°C). El producto se secó a vacío durante la noche para dar un polvo blanco le.
Rendimiento 7.60 g (75%) de polvo blanco le (HCl sal).
MS : m / z = 891.96 [M + 8H] 8+ (calculado = 892 .13) .
Para la síntesis del compuesto lf, compuesto le (7.56 g, 0.980 mmol, sal de HCl) y bis(pentafluorofenil)carbonato (9.27 g, 23.0 mmol) se disolvieron en 250 mi de DCM (anhidro) y DIPEA (6.08 g, 47.0 mmol, 8.19 mi) se agregó a 35°C. Después de 10 min, se agregó 1,9-bis-BOC-l,5,9-triazanonano (5.30 g, 16.0 mmol) y la mezcla se agitó durante 15 min. Después se agregó 1,9-bis-boc-l,5,9-triazanonano adicional (0.33 g, 1.0 mmol). Después de la disolución completa, el solvente se evaporó a temperatura ambiente.
El residuo se disolvió en 250 mi de iPrOH a 60°C y se diluyó con 1350 mi de MTBE. El producto se precipitó durante la noche a -20°C. El precipitado se recogió por filtración a través de un filtro de vidrio Por.3, y se lavó con 400 mi de MTBE enfriado (0°C). El producto se secó a vacío durante la noche para dar if como un sólido vitreo.
Rendimiento 11.1 g (83%) sólido vitreo if.
MS: m/z 1312.01 = [M +10H]10+ (calculado = 1312.21).
Para la síntesis de reactivo de esqueleto lg, el compuesto boc-protegido if se disolvió (7.84 g, 0.610 mmol) en 16 mi de MeOH a 37°C y 55 mi de una solución preenfriada de HCl 4 M (4°C) en dioxano se agregaron a temperatura ambiente. La mezcla se agitó sin enfriar durante 20 min. Después de 20 min se agregaron 110 mi de HCl 3M en MeOH. La solución se dividió en 24 tubos Falcon (50 mi) y se precipitó mediante la adición de 40 mi de MTBE frío (-20°C) a cada tubo Falcon. Después de centrifugación a 3214 rcf durante 1 min, el sobrenadante se decantó y el sólido vitreo se disolvió en 5 mi de MeOH por tubo Falcon y se precipitó mediante la adición de 40 mi de MTBE frío (-20°C) a cada tubo Falcon otra vez. El sobrenadante se desechó y el sólido restante se secó en vacío durante la noche.
Rendimiento 5.74 g (87%) de sólido blanco vitreo lg (sal de HCl).
MS : m / z = 965.46 [M + 10H] 10+ (calculado 965.45) .
Ejemplo 2 Síntesis de reactivos reticulantes 2d, 2g, 2k, y 2o El reactivo reticulante 2e se preparó a partir de monobencil éster de ácido azelaico y PEG 10000 de acuerdo con el siguiente esquema de reacción Para la síntesis de monobencil áster de ácido azelaico 2a, una mezcla de ácido azelaico (37.6 g, 200 mmol), alcohol bencílico (21.6 g, 200 mmol), p-toluenosulfónico (0.80 g, 4.2 mmol), y 240 mi de tolueno se calentó a reflujo durante 7 h en un aparato Dean-Stark. Después de enfriar, el solvente se evaporó y se agregaron 300 mi de solución de NaHO¾ acuosa sat.
Esta mezcla se extrajo con 3 x 200 mi de MTBE . Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y el solvente se evaporó . El producto se purificó sobre 2 x 340 g de sílice usando acetato de etilo/heptano (10 : 90 25 : 75) como eluyente . El eluyente se evaporó y el residuo se secó a vacío durante la noche . Rendimiento 25.8 g (46%) de aceite incoloro 2a .
MS: m/z = 279.16 [M + H]+ (calculado = 279.16).
Para la síntesis del compuesto 2b, monobencil áster del ácido azelaico 2a (3.90 g, 14.0 mmol) y PEG 10000 (40.0 g, 4.00 mmol) se disolvieron en 64 mi de diclorometano y se enfrió con un baño de hielo. Se agregó una solución de DCC (2.89 g, 14.0 mmol) y DMAP (0.024 g, 0.020 mmol) en 32 mi de diclorometano. El baño de hielo se retiró y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La suspensión resultante se enfrió a 0°C y el sólido se separó por filtración. El solvente se evaporó al vacío.
El residuo se disolvió en 65 mi de diclorometano y se diluyó con 308 mi de MTBE a temperatura ambiente. La mezcla se almacenó durante la noche a -20°C. El precipitado se recogió por filtración a través de un filtro de vidrio Por. 3, y se lavó con 250 mi de MTBE enfriado (-20°C). El producto se secó a vacío durante la noche.
Rendimiento 40.8 g (97%) de polvo blanco 2b.
MS : m/z = 835.50 [M + 14H] 14+ (calculado = 835.56) .
Para la síntesis de compuesto 2c, el compuesto 2b (40.6 g, 3.86 mmol) se disolvió en acetato de metilo (250 mi) y se agregaron 203 mg de paladio sobre carbón. Bajo una atmósfera de hidrógeno de presión ambiente, la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de celita y el filtrado se evaporó y se secó en vacío durante la noche.
Rendimiento 37.2 g (93%) de sólido vitreo 2c.
MS : m/z 882 .53 = [13H M +] 13+ (calculado = 882 .51) .
Para la síntesis del compuesto 2d, el compuesto 2c (32.0 g, 3.10 mmol) y TSTU (3.73 g, 12.4 mmol) se disolvieron en 150 mi de diclorometano a temperatura ambiente. A continuación, se agregó DIPEA (1.60 g, 12.4 mmol) y la mezcla se agitó durante 1 h. La suspensión resultante se filtró y el filtrado se diluyó con 170 mi de diclorometano, se lavó con 140 mi de una solución de 750 g de agua/197 g de NaCl/3 g de NaOH. La fase orgánica se secó sobre MgSO4 y el solvente se evaporó a vacío.
El residuo se disolvió en 200 mi de tolueno, se diluyó con 180 mi de MTBE a temperatura ambiente y se almacenó durante la noche a -20°C. El precipitado se recogió por filtración a través de un filtro de vidrio Por.3, y se lavó con 100 mi de MTBE enfriado (-20°C). El producto se secó a vacío durante la noche.
Rendimiento 28.8 g (88%) de polvo blanco 2d.
MS : m / z = 795.47 [M + 15H] 15+ (calculado 795.54).
Reactivo reticulante 2g se preparó a partir monobencil áster de ácido azelaico y PEG6000 de acuerdo con el siguiente esquema de reacción: Para la síntesis del compuesto 2e, monobencil áster del ácido azelaico 2a (6.50 g, 23.3 mmol) y PEG 6000 (40.0 g, 6.67 mmol) se disolvieron en 140 mi de diclorometano y se enfrió con un baño de hielo. Se agregó una solución de DCC (4.81 g, 23.3 mmol) y DMAP (0.040 g, 0.33 mmol) en 40 mi de diclorometano. El baño de hielo se retiró y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La suspensión resultante se enfrió a 0°C y el sólido se separó por filtración. El solvente se evaporó al vacío.
El residuo se disolvió en 70 mi de diclorometano y se diluyó con 300 mi de MIBE a temperatura ambiente. La mezcla se almacenó durante la noche a -20°C. El precipitado se recogió por filtración a través de un filtro de vidrio Por.3, y se lavó con 500 mi de MGBE enfriado (-20°C). El producto se secó a vacío durante la noche.
Rendimiento 41.2 g (95%) de polvo blanco 2e.
MS: m/z = 833.75 [M + 8H]8+ (calculado = 833.74).
Para la síntesis del compuesto 2f , el compuesto 2e (41.2 g, 6.32 mmol) se disolvió en acetato de metilo (238 mi) y etanol (40 mi) , después se agregó 400 mg de paladio sobre carbón vegetal. Bajo una atmósfera de hidrógeno de presión ambiente, la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente . La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de celita y el filtrado se evaporó y se secó en vacío durante la noche . Rendimiento 38.4 g (96%) de sólido vitreo 2f .
MS: m/z = 750.46 [M + 9H]9+ (calculado = 750.56).
Para la síntesis del compuesto 2g, el compuesto 2f (38.2 g, 6.02 mmol) y TSTU (7.25 g, mmol) se disolvieron en 130 mi de diclorometano a temperatura ambiente. A continuación, se agregó DIPEA (3.11 g, 24.1 mmol) y la mezcla se agitó durante 1 hora. La suspensión resultante se filtró, el filtrado se diluyó con 100 mi de diclorometano y se lavó con 200 mi de una solución de 750 g de agua/197 g de NaCl/3 g de NaOH. La fase orgánica se secó sobre MgSC y el solvente se evaporó a vacío .
El residuo se disolvió en 210 mi de tolueno, se diluyó con 430 mi de MTBE a temperatura ambiente y se almacenó durante la noche a -20°C. El precipitado se recogió por filtración a través de un filtro de vidrio Por.3, y se lavó con 450 mi de MTBE enfriado (-20°C). El producto se secó a vacío durante la noche.
Rendimiento 35.8 g (91%) de polvo blanco 2 g.
MS : MZ 857 .51 = [M + 8H] 8 (calculado = 857 .51) .
El reactivo reticulante 2k se preparó a partir de monobencil éster de ácido isopropilmalónico y PEG 10000 de acuerdo con el siguiente esquema de reacción: - rac2k Para la síntesis de monobencil éster del ácido isopropilmalónico rac-2h, ácido isopropilmalónico (35.0 g, 239 mmol), alcohol bencílico (23.3 g, 216 mmol) y DMAP (1.46 g, 12.0 mmol) se disolvieron en 100 mi de acetonitrilo. La mezcla se enfrió a 0°C con un baño de hielo. Una solución de DCC (49.4 g, 239 mmol) en 150 mi de acetonitrilo se agregó en 15 min a 0°C. El baño de hielo se retiró y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente, entonces el sólido se filtró. El filtrado se evaporó a 40°C en vacío y el residuo se disolvió en 300 mi de MTBE. Esta solución se extrajo con 2 x 300 mi solución acuosa sat. de NaHCC>3, después las fases acuosas combinadas se acidificaron a pH = 1-3 con ácido clorhídrico 6 N. La emulsión resultante se extrajo con 2 x 300 mi de MTBE y el solvente se evaporó. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con 200 mi de NaCl acuoso sat. y se secaron sobre MgS04. El producto se purificó sobre 340 g de sílice usando acetato de etilo/heptano (10:90 20:80) como eluyente. El eluyente se evaporó y el residuo se secó a vacío durante la noche.
Rendimiento 9.62 g (17%) de aceite incoloro rac-2h.
MS: m/z = 237.11 [M + H]+ (calculado = 237.11).
Para la síntesis del compuesto 2i, monobencil éster del ácido isopropilmalónico rac-2H (945 mg, 4.00 mmol) y PEG 10000 (10.0 g, 4.00 mmol) se disolvieron en 20 mi de diclorometano y se enfrió con un baño de hielo. Se agregó una solución de DCC (825 mg, 4.00 mmol) y DMAP (6 mg, 0.05 mmol) en 10 mi de diclorometano. El baño de hielo se retiró y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La suspensión resultante se enfrió a 0°C y el sólido se separó por filtración. El solvente se evaporó al vacío.
El residuo se disolvió en 20 mi de diclorometano y se diluyó con 150 mi de MTBE a temperatura ambiente. La mezcla se almacenó durante la noche a -20°C. El precipitado se recogió por filtración a través de un filtro de vidrio Por. 3, y se lavó con 500 mi de MTBE enfriado (-20°C). El producto se secó a vacío durante la noche.
Rendimiento 9.63 g (92%) de polvo blanco 2i.
MS : m/z = 742. 50 [M + 16H] 16+ (calculado = 742 .51) .
Para la síntesis de compuesto 2j, el compuesto 2i (3.38 g, 0.323 mmol) se disolvió en acetato de metilo (100 mi) y se agregaron 105 g de paladio sobre carbón. Bajo una atmósfera de hidrógeno de presión ambiente, la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de celita y el filtrado se evaporó y se secó en vacío durante la noche.
Rendimiento 3.25 g (98%) de sólido vitreo 2j.
MS : MZ 731 .25 = [16H M +] 16+ (calculado = 731 .25) .
Para la síntesis del compuesto 2k, el compuesto 2j (3.10 g, 0.302 mmol) y TSTU (0.364 g, 1.21 mmol) se disolvieron en 15 mi de diclorometano a temperatura ambiente. A continuación, se agregó DIPEA (0.156 g, 1.21 mmol) y la mezcla se agitó durante 45 min. La suspensión resultante se filtró y el filtrado se lavó con 2 x 10 mi de una solución amortiguadora de fosfato pH 0.5 M = 6.5. La fase orgánica se secó sobre MgSO4 y el solvente se evaporó a vacío. El residuo se disolvió en 20 mi de tolueno, se diluyó con 10 mi de MTBE a temperatura ambiente y se almacenó durante la noche a -20°C. El precipitado se recogió por filtración a través de un filtro de vidrio Por.3, y se lavó con 250 mi de MTBE enfriado (-20°C). El producto se secó a vacío durante la noche.
Rendimiento 2.66 g (84%) de polvo blanco 2k.
MS : m/z = 743.37 [M + 16H] 16+ (calculado = 743 .38) .
Reactivo reticulante rac-2o se preparó de ácido cis-1,4-ciclohexanodicarboxílico y PEG 10000 de acuerdo con el siguiente esquema de reacción: rac-2n O O Para la síntesis de monobencil del éster de ácido cis-1,4 -ciclohexanodicarboxí lico rac-21, ácido cis-1,4-ciclohexanodicarboxí lico (20.0 g, 116 mmol), alcohol bencílico (11.3 g, 105 mmol) y DMAP (710 mg, 5.81 mmol) se disolvieron en 200 mi de THF. La mezcla se enfrió a 0°C con un baño de hielo. Una solución de DCC (49.4 g, 239 mmol) en 100 mi de THF se agregó en 15 min a 0°C. El baño de hielo se retiró y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente, entonces el sólido se filtró. El filtrado se evaporó a 40°C y el residuo se disolvió en 300 mi de MTBE. Esta solución se extrajo con 2 x 300 mi de solución acuosa sat. de NaHCCh, a continuación, las fases acuosas combinadas se acidificaron a pH = 1-3 con ácido clorhídrico 6 N. La emulsión resultante se extrajo con 2 x 300 mi de MTBE y el solvente se evaporó. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con 200 mi NaCl acuoso sat. y se secaron sobre MgSO4. El producto se purificó sobre 340 g de sílice usando acetato de etilo/heptano (10:90 20:80) como eluyente . El eluyente se evaporó y el residuo aceitoso incoloro cristalizó durante el secado a vacío durante la noche .
Rendimiento 4.82 g (16%) de cristales incoloros rac-21.
MS: m/z = 263.13 [M + H]+ (calculado = 263.13).
Para la síntesis del compuesto 2m, monobencil éster del ácido cis-1 ,4-ciclohexanodicarboxí lico rac-21 (2.10 g, 8.00 mmol) y PEG 10000 (20.0 g, 10.0 mmol) se disolvieron en 50 mi de diclorometano y se enfrió con un baño de hielo. Se agregó una solución de DCC (1.65 g, 8.00 mmol) y DMAP (0.012 g, 0.10 mmol) en 25 mi de diclorometano. El baño de hielo se retiró y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La suspensión resultante se enfrió a 0°C y el sólido se separó por filtración. El solvente se evaporó al vacío.
El residuo se disolvió en 55 mi de diclorometano y se diluyó con 300 mi de MTBX a temperatura ambiente. La mezcla se almacenó durante la noche a -20°C. El precipitado se recogió por filtración a través de un filtro de vidrio Por. 3, y se lavó con 250 mi de MTBE enfriado (-20°C) . El producto se secó a vacío durante la noche .
Rendimiento 18.2 g (87%) de polvo blanco 2m.
MS : m/ z = 745 . 76 [M + 16H] 16+ ( calculado = 745 . 77 ) .
Para la síntesis del compuesto 2n, el compuesto 2m (9.00 g, 0.857 mmol) se disolvió en acetato de metilo (100 mi) y se agregaron 157 mg de paladio sobre carbón. Bajo una atmósfera de hidrógeno de presión ambiente, la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se filtró a traves de una almohadilla de celita y el filtrado se evaporó y se secó en vacío durante la noche.
Rendimiento 8.83g (100%) de sólido vitreo 2n.
MS : MZ 734 . 50 = [16H M +] 16+ (calculado = 734 . 50 ) .
Para la síntesis del compuesto 2o, el compuesto 2n (8.92 g, 0.864 mmol) y TSTU (1.04 g, 3.64 mmol) se disolvieron en 35 mi de diclorometano a temperatura ambiente. A continuación, se agregó DIPEA (0.447 g, 3.46 mmol) y la mezcla se agitó durante 45 min. La suspensión resultante se filtró y el filtrado se lavó con 2 x 10 mi de una solución amortiguadora de fosfato pH 0.5 M = 6.5. La fase orgánica se secó sobre MgSO4 y el solvente se evaporó a vacío.
El residuo se disolvió en 50 mi de tolueno, se diluyó con 25 mi de MTBE a temperatura ambiente y se almacenó durante la noche a -20°C. El precipitado se recogió por filtración a través de un filtro de vidrio Por. 3, y se lavó con 400 mi de MTBE enfriado (-20°C). El producto se secó a vacío durante la noche.
Rendimiento 7.62 g (84%) de polvo blanco 2o.
MS : m / z = 702 . 60 [M + 16H] 16 + (calculado 702 . 59 ) .
Ejemplo 3 Preparación de perlas de hidrogel 3a, 3b, 3c, y 3d que contienen grupos amino libres.
En un reactor cilindrico de 250 mi con salida en el fondo, diámetro 60 mm, equipado con def lectores, una emulsión de 218 mg de Cithrol™ DPHS en 100 mi de undecano se agitó con un agitador isojet, diámetro de 50 mm a 580 rpm, a temperatura ambiente. Se agregó una solución de 250 mg de la y 2205 mg de 2d en 22.1 g de DMSO y se agitó durante 10 min a temperatura ambiente para formar una suspensión. 1.1 mi de TMEDA se agregaré para efectuar la polimerización. La mezcla se agitó durante 16 horas. Se agregaron 1.7 mi de ácido acético y después, después de 10 min se agregaron 100 mi de una solución 15% en peso de cloruro de sodio en agua. Después de 10 min, el agitador se detuvo y las fases se dejaron separar. Después de 2 horas se drenó la fase acuosa que contiene el hidrogel.
Para el tamaño de perla de fraccionamiento, la suspensión de agua-hidrogel se diluyó con 40 mi de etanol y se tamizó en húmedo en 125, 100, 75, 63, 50, 40, y 32 mm de tamices de acero utilizando una máquina de tamizado de control Retsch AS200 durante 15 min. La amplitud del tamizado fue de 1.5 mm, el flujo de agua 300 ml/min. Fracciones de las perlas que fueron retenidas en los tamices de 63 y 75 mm se agruparon y se lavaron 3 veces con AcOH al 0.1%, 10 veces con etanol y se secaron durante 16 horas a 0.1 mbar para dar 670 mg de 3a como un polvo blanco.
El contenido del grupo amino del hidrogel se determinó que era 0.145 mmol/g por la conjugación de un amino ácido Fmoc a los grupos amino libres en el hidrogel y la determinación de Fmoc posterior. 3b se preparó como se describió para 3a excepto por el uso de 350 mg de la, 2548 mg de 2g, 26.1 g de DMSO, 257 mg de Cithrol™ DPHS, 1.5 mi de TMEDA, y 2.4 mi de ácido acético, produciendo 550 mg de 3b como un polvo blanco, 0.120 mmol/g de grupos amino libres. 3c se preparó como se describe para 3a excepto por el uso de 250 mg de la, 3019 mg rac-2k, 32.7 g de DMSO, 290 mg de Cithrol™ DPHS, 1.1 mi de TMEDA, y 1.7 mi de ácido acético, obteniéndose 770 mg de 3c como un polvo blanco, 0.126 mmol/g de los grupos amino libres. 3d se preparó como se describió para 3a excepto por el uso de 250 mg de la, 2258 mg de rac-2o, 22.6 g de DMSO, 222 mg de Cithrol™ DPHS, 1.1 mi de TMEDA, y 1.7 mi de ácido acético, produciendo 186 mg de 3d como un polvo blanco, 0.153 mmol/g de grupos amino libres.
Ejemplo 4 Síntesis de reactivo enlazador 4c El reactivo enlazador 4c se sintetizó de acuerdo con el siguiente esquema de reacción . l . - - l . , - il- - - - - -i l - i i Síntesis de 4a: Fmoc-L-Asp (OtBu)-OH (1.00 g, 2.43 mmol) se disolvió con DCC (0.70 g, 3.33 mmol) en DCM (25 mi). Se agregaron oxima pura (0.51 g, 3.58 mmol) y colidina (0.50 mi, 3.58 mmol) en una porción y una solución de N-Boc-etilenodiamina (0.41 g, 2.56 mmol) en DCM (15 mi) se agregó lentamente. Después de agitar la mezcla durante 90 min a temperatura ambiente el precipitado formado se separó por filtración y el filtrado se lavó con HCl acuoso (0.1 M, 50 mi). La capa acuosa se extrajo con DCM (2 x 20 mi) y las fracciones orgánicas combinadas se lavaron con solución NaHCC acuosa sat. (3 x 25 mi) y salmuera (1 x 50 mi), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a vacío. El sólido crudo se purificó por cromatografía flash. El intermediario N-Boc-N'-(N-Fmoc-4-ter- butil-L-aspartoílo)-etilenodiamina se obtuvo como un sólido blanco (0.98 g, 1.77 mmol, 73%).
MS: m / z = 554.29 [M + H]+, (calculado = 554.29).
Se disolvió N-Boc-N'-(N-Fmoc-4-ter-butil-L-aspartoílo)-etilenodiamina (0.98 g, 1.77 mmol) en THF (15 mi), se agregó DBU (0.31 mi) y la solución se agitó durante 12 min a temperatura ambiente. La reacción se inactivó con AcOH (0.5 mi), se concentró a vacío y el residuo se purificó por cromatografía flash para dar 4a (0.61 g, 1.77 mmol, 73% en 2 pasos) como un sólido blanco.
MS: m/z = 332.38 [M + H]+, (calculado = 332.22).
Síntesis de 4b: Ácido 6-Acetiltiohexanoico (0.37 g, 1.95 mmol) se disolvió en DCM (19.5 mi) y oxima pura (0.35 g, 2.48 mmol) y DCC (0.40 g, 1.95 mmol) en una porción. La solución se agitó durante 30 min a temperatura ambiente, se filtró, y el filtrado se agregó a una solución de 4a (0.61 g, 1.77 mmol) en DCM (10.5 mi) . DIPEA (0.46 mi, 2.66 mmol) se agregó a la solución y la reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. La solución se lavó con H2SO4 acuoso (0.1 M, 2 x 30 mi) , NaHCC> acuoso sat . (2 x 20 mi) y salmuera (1 x 20 mi) . La capa orgánica se secó sobre Na SO4, se filtró y se concentró a vacío. El material crudo se purificó por cromatografía flash para dar N-Boc-N' - (N-6-acetiltiohexil -4 -ter-butil -L-aspartoí lo) -etilenodiamina (0.65 g, 1.30 mmol, 73% en 2 pasos) como un sólido blanco.
MS: m/z = 504.27 [M + H]+, (calculado = 504.28).
N-boc-N'-(N-6-Acetiltiohexil-4-ter-butil-L-aspartoilo)-etilenodiamina (0.60 g, 1.18 mmol) se disolvió en TFA (5 ml) y TES (0.13 ml) y agua se agregaron (0.13 ml). La mezcla se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. TFA se retiró en una corriente de N2/ y 4b crudo se disolvió en H2O/ACN 1:1 y se purificó por RP-HPLC.
Rendimiento: 0.39 g, 0.85 mmol (sal de TFA), 72%.
MS: m/z = 348.25 [M + H]+, (calculado = 348.16).
Síntesis de 4c: 4b (sal de TFA, 0.38 g, 0.80 mmol) se disolvió en DMF (5 ml) y carbonato de (5-meti1-2-oxo-1 ,3-dioxol-4 -il)-metil 4-nitrof enilo (0.26 g, 0.88 mmol) y DIPEA (0.28 ml , 1.6 mmol) se agregaron. La suspensión resultante se diluyó con DCM (5 ml) y se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. Se agregó más DIPEA (0.28 ml 1.6 mmol) y la agitación continuó durante 2 horas. DCM se concentró a vacío, el residuo se diluyó con H2O/ACN 3:1 y se purificó por RP-HPLC para dar N-(5-met i1-2-oxo- 1,3-dioxol -4-i1)-metí 1-oxocarbonil -N'-(N-6-acetiltiohexil-L-aspartil) -etilenodiamina (0.31 g, 0.62 mmol, 77%) como un aceite incoloro.
MS : Mz = 504.16 [M + H]+, (calculado = 504.17).
N- (5-metil-2 -oxo-1,3-dioxol -4-il) -metil oxocarboni 1 -N'-(N-6-acet i1thiohexi 1-L-aspart il)- etileno-diamina (150 mg, 0.30 mmol) se disolvió en DCM (17.5 mi) y se agregaron NHS (41 mg, 0.36 mmol), DCC (74 mg, 0.36 mmol) y DMAP (4 mg, 0.03 mmol) en una porción. La reacción se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente y la suspensión resultante se filtró. El precipitado se lavó con una pequeña cantidad de DCM y los filtrados combinados se concentraron a vacío. 4c se purificó por RP-HPLC para dar un aceite incoloro (144 mg, 0.24 mmol, 80%). MS: m/z = 601.18 [M + H]+, (calculado = 601.18).
Ejemp lo 5 Preparación de perlas de hidrogel funcionalizadas con maleimida 5a 259.3 mg de perlas de hidrogel seco 3a se incubaron durante 15 min en 10 mi de n-propilamina al 1% en NMP y posteriormente se lavó dos veces con n-propilamina al 1% en NMP y dos veces con DIPEA al 2% en NMP.171 mg de maleimida-NH- PEG12-PFE se disolvió en 1 mi de NMP y se agrega a las perlas de hidrogel lavadas 3a. La suspensión de hidrogel se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Perlas de hidrogel resultantes funcional izadas con maleimida 5a se lavaron cinco veces cada una con NMP, seguido de succinato 20 mM, Na2EDTAl mM, Tween 20 al 0.01%, H 3.0, seguido de agua, seguido de ácido acético al 0.1%, Tween 20 al 0.01%.
Perlas de hidrogel funcionalizadas con maleimida 5b, 5c, y 5d se prepararon en consecuencia utilizando 3b, 3c, y 3d.
Ejemplo 6 Síntesis de profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis transitorio 6c 4.6 mg de Lucentis (representado en el siguiente esquema de reacción como Lucentis-NH2) (460 ml de 10 mg/ml de Lucentis en histidina 10 mM, 10% en peso de a,a -trehalosa , Tween 20 al 0.01%, pH 5.5) fue cambiado de solución amortiguadora a fosfato de sodio 10 mM, cloruro de potasio 2.7 m , cloruro de sodio 140 mM, pH 7.4 y la concentración de Lucentis se ajustó a 16.4 mg/ml. 6 mg de reactivo enlazador 4c se disolvió en 100 ml de DMSO para producir una concentración de 100 mM .1 equivalente molar de reactivo enlazador 4c con respecto a la cantidad de Lucentis se agregó a la solución de Lucentis. La mezcla de reacción se mezcló cuidadosamente y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se agregaron 2 equivalentes molares adicionales de reactivo enlazador 4c a la solución Lucentis en pasos de 1 equivalente molar y después de la adición de cada equivalente de la mezcla de reacción se incubó durante 5 min a temperatura ambiente produciendo una mezcla de Lucentis no modificado y el monocon jugado enlazador a Lucentis protegido 6a.
El pH de la mezcla de reacción se ajustó a pH 6.5 mediante la adición de citrato de sodio 1 M, pH 5.0 y Na2EDTA se agregó a una concentración final de 5 mM. Para eliminar los grupos protectores de 6a NH2OH 0.5 M (disuelto en citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 140 mM, Na2EDTA 5 mM, pH 6.5) se agregó a una concentración final de 45 mM y la reacción de desprotección se incubó a temperatura ambiente durante 4 horas produciendo el monocon jugado enlazador de Lucentis 6b. La mezcla de Lucentis y el monoconjugado enlazador de Lucentis 6b fue cambiada de solución amortiguadora a fosfato de sodio 10 mM, cloruro de potasio 2.7 mM, cloruro de sodio 140 mM, Na2EDTA 5 mM, Tween 20 al 0.01%, pH 6.5 y la concentración global de las dos especies de Lucentis se ajustó a 11.8 mg/ml. El contenido de monoconjugado enlazador de Lucentis 6b en la mezcla era 20% como se determinó por ESI-MS. 4 mg de la mezcla de Lucent is/monoconjugado enlazador de Lucentis 6b en fosfato de sodio 10 mM, cloruro de potasio 2.7 mM, cloruro de sodio 140 mM, Na2EDTA5 mM, Tween 20 al 0.01%, pH 6.5 se agregaron a 1 mg de perlas de hidrogel funcionalizadas con maleimida 5a y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente produciendo profármaco enlazador de hidrogel Lucentis transitorio 6c.
Solución amortiguadora acuosa .
NH 6c Lucentis'' Ej emplo 7 Cinética de liberación in vit ro - determinación de la vida media in vitro Prof ármaco de hidrogel enlazador de Lucentis 6c (que contiene aproximadamente 1 mg de Lucentis) se lavó cinco veces con fosfato de sodio 60 mM, Na2EDTA 3 mM , Tween 20 al 0.01%, pH 7.4 y finalmente se suspendió en 1 mi de la solución amortiguadora antes mencionada. La suspensión se incubó a 37°C. La solución amortiguadora de la suspensión se intercambió después de diferentes intervalos de tiempo y se analizó por HPLC-SEC a 220 nm . Picos correspondientes a Lucentis liberado fueron integrados y el total de Lucentis liberado se gr fico frente al tiempo de incubación total. El software de ajuste de curva se aplicó para determinar las tasas de división de primer orden.
Ejemplo 8 Síntesis de reactivo enlazador 8e El reactivo enlazador 8e se sintetizó de acuerdo con el siguiente esquema de reacción: O H 8e A una solución de N-Boc-etilenodiamina (2.08 g, 12.98 mmol) y NaCNBH3 (775 mg, 12.33 mmol) en MeOH (20 ml, anhidro) se agregó una solución de 2,4,6-trimetoxibenzaldehído (2.29 g, 11.68 mmol) en 40 ml de MeOH/DCM anhidro (1:1 v/v) durante 2 horas mediante una bomba de jeringa. La mezcla se agitó durante 90 min, se acidificó con HCl 0.4 M (60 ml) y se agitó otros 15 min. La mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo (5 x). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con NaHCCb saturado y salmuera y se secaron sobre Na2S04. Los solventes se retiraron al vacío y el residuo se secó en alto vacío (<0.1 mbar). La N-Boc-N'-Tmdb-etilenodiaina cruda se utilizó en el siguiente paso de reacción sin purificación adicional. Rendimiento: 3.70 g (10.87 mmol, 84%) de un sólido incoloro. MS: m/z = 341.21 [M + H]+, (calculado = 341.21).
Una solución de 8a (1.7 g, 4.99 mmol) en DCM (40 mi, anhidro, tamiz Mol.) se agregó a una solución de DCC (1.34 g, 6.50 mmol), oxima pura (995 mg, 7.00 mol), Fmoc-L-Asp (OBn)-OH (2.22 g, 4.98 mmol) y 2,4,6-colidina (1.24 mi, 9.53 mmol) en DCM (40 mi, anhidro, tamiz mol.). La mezcla de reacción se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. El precipitado se separó por filtración y el filtrado se lavó con HCl 0.1 M, NaHCÜ3 sat. y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na2S04 y los solventes se eliminaron a vacío. El material crudo se purificó por cromatografía flash para dar 8b (3.19 g, 4.15 mmol, 83%) como sólido blanco. MS: m/z = 768.35 [M + H]+, (calculado = 768.35).
A una solución de 8b (8.59 g, 11.19 mmol) en THF (98 mi) se agregó DBU (2 mi). La solución se agitó durante 12 min a temperatura ambiente, y el solvente se concentró a vacío. La cromatografía flash proporcionó 4.89 g de 8c (8.96 mmol, 80%). MS: m/z = 546.28 [M + H]+, (calculado = 546.28). Ácido 6-Tritilmercaptohexanoico (2.04 g, 5.22 mmol) se disolvió en DCM (20 mi, anhidro, tamiz mol.) y DCC (1.08 g, 5.22 mmol) y oxima pura (945 mg, 6.65 mmol). Después de 30 min, se agregaron 8c (2.59 g, 4.75 mmol) y DIPEA (1.24 mi, 7.12 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 22 horas a temperatura ambiente. La mezcla se extrajo con H2SO41 N (2x), NaHCC sat. (2 x) y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na2SC>4, se concentró a vacío y 8d se purificó por cromatografía flash. Rendimiento: 4.10 g (4.47 mmol, 94%).
MS: m/z = 940.12 [M + Na]+, (calculado = 940.43).
A una solución de 8d (4.10 g, 4.47 mmol) en i-PrOH (60 mi), se agregregaron agua (20 mi) y LiOH (322 mg, 13.41 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. Se agregó tolueno (300 mi) y la fase orgánica era con HCl 0.1 N y con salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró y se concentró a vacío. 8e se purificó mediante cromatografía flash. Rendimiento: 3.53 g (4.26 mmol, 95%). MS: m/z = 827.93 [M + H]+, (calculado = 828.39).
Ejemplo 9 Síntesis de reactivo enlazador 9c Reactivo enlazador 9c se sintetizó de acuerdo con el siguiente esquema de reacción: 9a P _ ' ys 8e (300 mg, 0.36 mmol) se disolvió en HFIP/agua/TES (39:1:1 v/v/v, 4.1 mi). Bajo agitación se agregó TFA (0.35 mi) y la reacción se agitó durante 75 min. Los solventes se evaporaron en una corriente de argón. El residuo se repartió entre agua (20 mi) y DCM (40 mi). Se recogió la fase acuosa, la fase de DCM se lavó con agua (5 mi) y las dos fases acuosas combinadas. El pH de la solución resultante se ajustó con solución amortiguadora de fosfato pH 7.4 de sodio (0.5 M, 5 mi) y se agregó una solución de 2,2'-ditiodipiridina en 1 mi y la suspensión resultante se agitó durante 30 min. La mezcla se liofilizó y el residuo se suspendió en ACN/agua (7:3 v/v, 9 mi) y se filtró. El filtrado se purificó por RP-HPLC para dar 9a. Rendimiento: 90 mg, 0.17 mmoles (sal de TFA), 47%, MS: m/z = 415.25 [M + H]+, (calculado = 415.15). 9a (90 mg, 0.17 mmol) se disolvió en DCM (1.2 mi) y carbonato de (5-metil-2-oxo-l,3-dioxol-4-il)-etil 4-nitrofenilo (138 mg, 0.47 mmol) y 2,4,6-colidina (129 ml, 0.98 mmol) se agregó con agitación. Se agregó DMF (1 mi) para facilitar la disolución del precipitado formado. Después de 2 h y 8 h se agregó DIPEA (19 ml, 0.11 mmol, cada uno) y la reacción se agitó durante 48 horas. La reacción se inactivó con AcOH (38 m?) y DCM se evaporó en una corriente de nitrógeno. El residuo se diluyó con ACN/agua/TFA (1:1:0.002 v/v/v) y se purificó por RP-HPLC para dar 9b. Rendimiento: 64 mg, 0.11 mmol, 65%, MS: m/z = 571.09 [M + H]+, (calculado = 571.15). 9b (32 mg, 56 mmo?) se disolvió en DCM. Con agitación se agregaron NHS (8 mg, 67 mmo?), DCC (14 mg, 67 pmol) y DMAP (0.7 mg, 6 mmol) . La reacción se agitó y despues de 1.5 h y 3.5 h se agregó DCC (3.5 mg, 11 pmol y 2.3 mg, 7 pinol, respectivamente) . El solvente se evaporó en una corriente de argón y el residuo se suspendió en agua/ACN/TFA (1 : 9 : 0.01 v/v/v, 3 mi) y se filtró. El filtrado se purificó por RP-HPLC para dar 9c (28 mg, 42 pmol , 75%) .
MS : m/ z = 668.17 [M + H] +, (calculado = 668.17) .
Ejemplo 10 Síntesis del reactivo enlazador lOf Reactivo enlazador 1 se sintetizó de acuerdo con el siguiente esquema de reacción: Fmoc-N- e-L-Asp (OtBu) -OH (1 g, 2 .35 mmol) se disolvió en DCM (35 mi) y se agregaron DCC (0.68 g, 3.29 mmol), oxima pura (0.5 g, 3.53 mmol) y 2,4,6-colidina (0.49 mi, 3.76 mmol). N-Boc-N-metil-etilenodiamina se disolvió en DCM (15 mi) y se agregó lentamente mediante una jeringa a la mezcla de reacción. La reacción se agitó durante 16 horas, el precipitado se separó por filtración y el filtrado se lavó con 0.1 M HCl (50 mi). La capa acuosa se volvió a extraer dos veces con DCM (20 mi). Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron con solución de bicarbonato de sodio sat. (1x50 mi, 2x25 mi) y salmuera (1x50 mi). La fase orgánica se secó sobre a2SO4, se concentró a vacío y 10a se purificó por cromatografía flash. Rendimiento: 1.36 g (2.33 mmol, 99%).
MS: m/z = 582.32 [M + H]+, (calculado = 582.32). 10a (1.36 g, 2.33 mmol) se disolvió en THF (20 mi) y DBU (0.4 mi) se agregó y la reacción se agitó durante 12 min. Se agregó AcOH (0.5 mi) y la mezcla se concentró a vacío y 10b se purificó por cromatografía flash. Rendimiento: 0.82 g (2.28 mmol, 98%). MS: m/z = 360.25 [M + H]+, (calculado = 360.25) . Ácido 6-Acetilmercaptohexanoico (0.49 g, 2.58 mmol) se disolvió en DCM (25 mi) y DCC (0.53 g, 2.58 mmól), oxima pura (0.47 g, 3.19 mmol). La reacción se agitó durante 45 min y se filtró usando una jeringa con frita en una solución de 10b (0.82 g, 2.28 mmol) en DCM (12 mi). Se agregó DIPEA (0.61 mi, 3.42 mmol) y la reacción se agitó. Debido a la conversión insuficiente se agregaron oxima pura (0.2 g, 1.4 mmol) y DIPEA (0.25 mi, 1.4 mmol) y la reacción se agitó durante 16 horas. Debido a la conversión insuficiente de ácido 6-acetilmercaptohexanoico (0.49 g, 2.58 mmol), DCC (0.53 g, 2.58 mmol) y oxima pura (0.47 g, 3.19 mmol) se agitó durante 30 minutos y se filtró en la reacción. Se agregó DIPEA (0.6 mi, 3.42 mmol) y la reacción se agitó durante 2.5 horas. La mezcla de reacción se lavó con 0.1 MH2SO4 (20 mi), solución de bicarbonato de sodio saturado (2x20 mi) y salmuera (20 mi). La fase orgánica se secó sobre Na2SC>4, se concentró a vacío y 10c se purificó por cromatografía flash. Rendimiento: 0.74 g (1.39 mmol, 60%). MS: m/z = 532.30 [M + H]+, (calculado = 532.31). 10c (0.74 g, 1.39 mmol) se disolvió en TFA/TES/agua (95:2.5:2.5 v/v/v, 5.25 mi) y se agitó durante 30 min. La mezcla se concentró a vacío y se purificó por RP-HPLC para dar lOd (0.38 g, 0.78 mmol, 56%) MS: m/z = 376.19 [M + H]+, (calculado = 376.19). lOd (0.38 g, 0.78 mmol) se disolvió en DCM (7 mi) y carbonato de (5-metil-2-oxo-l,3-dioxol-4-il)-metil 4-nitrofenilo (0.35 g, 1.17 mmol) y se agregaron 2,4,6-colidina (0.45 mi, 3.51 mmol) y la reacción se agitó. Después de 1 hora se agregó 2,4,6-colidina (0.2 mi, 1.56 mmol) y la reacción se agitó durante 20 horas. La reacción se concentró a vacío y se purificó por RP-HPLC para dar lOe (0.26 g, 0.49 mmol, 63%) MS: m/z = 532.20 [M + H]+, (calculado = 532.20). lOe (0.26 g, 0.49 mmol) se disolvió en DCM (3.6 i) y DCC (0.12 g, 0.59 mmol), NHS (68 mg, 0.59 mmol) y DMAP (6 mg, 0.05 mmol). La reacción se agitó durante 1 hora. La suspensión resultante se filtró y el precipitado se lavó con DCM (2 mi). El filtrado se purificó mediante cromatografía flash para dar lOf como espuma blanca. Rendimiento: 0.27 g (0.43 mmol, 87%). MS: m/z = 629.21 [M + H]+, (calculado = 629.21).
Ejemplo 11 Síntesis de reactivo enlazador lid Reactivo enlazador lid se sintetizó de acuerdo con el siguiente esquema de reacción: Resina de 2-clorotritilcloruro (1.4 mmol/g, 357 mg, 0.5 mmol) se pesó en una jeringa de 10 mi con frita. La resina se hinchó dos veces con 2 mi de DCM. N-Fmoc-N-metil-L- aspartato(OtBu)-OH (532 mg, 1.25 mmol y DIPEA (305 ml, 1.75 mmol) se disolvieron en DCM (3 mi) y se introdujeron en la jeringa. La jeringa se agitó durante 1 hora. MeOH (0.5 mi) se introdujo en la jeringa y la jeringa se agitó durante 30 min. La resina se lavó 5 veces con DCM (4 mi) y 5 veces con DMF (4 mi). Se agitó la resina 3 veces durante 5 min con DMF:DBU:piperidina (96:2:2 v/v/v, 4 mi). La resina se lavó 5 veces con DMF (4 mi), ácido 6-tritilmercaptohexanoico (488 mg, 1.25 mmol) y HATU (475 mg, 1.25 mmol) se disolvieron en DMF (3 mi) y DIPEA (436 ml, 2.5 mmol). Después de 1 min de preincubación, la solución se introdujo en la jeringa y la jeringa se agitó durante 1 hora. La resina se lavó 5 veces con DMF (4 mi), 5 veces con DCM (4 mi) y dos veces con MeOH (4 mi) y se secó a vacío. Una solución de ácido HFIP/TES/acético (90/5/5 v/v/v, 3 mi de cada uno) se introdujeron en la jeringa y la jeringa se agitó dos veces durante 30 min. El solvente de los filtrados recogidos se evaporó en una corriente de nitrógeno. El residuo se suspendió en ACN/agua (1:1 v/v, 5 mi) y se filtró. 2,2'-Ditiodipiridina (220 mg, 1 mmol) en ACN (0.5 mi) se agregó al filtrado. El pH de la reacción se ajustó a 7 con solución amortiguadora de fosfato de sodio pH 7.4 (0.5 M, 1.2 mi) y se agitó durante 15 min. El producto se purificó directamente por RP-HPLC para dar lia (117 mg, 0.27 mmol, 53%) MS: m/z = 443.30 [M + H]+, (calculado = 443.17). lia (117 mg, 0.27 mmol) se disolvió en DCM (2.4 mi). Se agregaron PyBOP (166 mg, 0.32 mmol), DIPEA (185 ml, 1.06 mmol) y N-Boc-N-metiletilenodiamina (57 ml, 0.32 mmol), y la reacción se agitó durante 45 min. Se agregó ácido acético (185 m?) y los solventes se eliminaron en una corriente de nitrógeno. El residuo se disolvió con ACN/agua/TFA (2:1:0.003 v/v/v) y se purificó por RP-HPLC para dar 11b (135 mg, 0.23 mmol, 85%) MS: m/z = 599.21 [M + H]+, (calculado = 599.29). 11b (135 mg, 0.23 mmol) se disolvió en TFA/TES/agua (95:2.5: 2.5 v/v/v, 5 mi). Después de 15 min se evaporaron los solventes en una corriente de nitrógeno. El residuo se diluyó con ACN/agua 1:1 y se liofilizó. El residuo se disolvió en DCM (1.5 mi), y se agregó carbonato de (5-metil-2-oxo-l,3-dioxol-4-il)-metil 4-nitrofenilo (80 mg, 0.27 mmol) . Con agitación se agregó DIPEA (78 m?, 0.46 mmol) lentamente hasta que la reacción quedó de color amarillo claro. Se agregó más DIPEA (39 m?, 0.23 mmol) y la reacción se agitó durante 1 hora. Después de la adición de DIPEA (20 m?, 0.12 mmol), la reacción se agitó durante 30 min. Se agregó ácido acético (140 m?) y los solventes se eliminaron en una corriente de nitrógeno. El residuo se diluyó con ACN/agua/TFA (1:1: 0.002 v/v/v, 3 mi) y se purificó por RP- HPLC para dar 11c (69 mg, 0.12 mmol, 51%). MS: m/z = 599.19 [M + H]+, (calculado = 599.19). 11c (69 mg, 0.12 mmol) se disolvió en DCM y se agregaron NHS (16 mg, 0.14 mmol), DCC (29 mg, 0.14 mmol) y DMAP (1.4 mg, 0.012 mmol) y la reacción se agitó durante 75 min. El solvente se evaporó en una corriente de nitrógeno y el residuo se suspendió en ACN/agua/TFA (1:1:0.002 v/v/v, 3.5 mi) y se filtró. El filtrado se purificó por RP-HPLC para dar lid (60 mg, 0.09 mmol, 75%). MS: m/z = 696.20 [M + H]+, (calculado = 696.20).
Ejemplo 12 Síntesis de reactivo enlazador 12e Enlazador reactivo 12e se sintetizó de acuerdo con el siguiente esquema de reacción: A una solución de N-Boc-N-metiletilenodiamina (2 g, 11.48 mmol) y NaCNBE (819 mg, 12.63 mmol) en MeOH (20ml) se agregó 2,4,6-trimetoxibenzaldehído (2.08mg, 10.61 mmol) en porciones. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 90 min, se acidificó con HCl 3 M (4 mi) y se agitó otros 15 min. La mezcla de reacción se agregó a solución saturada de NaHCÜ3 (200 mi) y se extrajo 5x con CH2CI2. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y los solventes se evaporaron al vacío. La N-Boc-N-metil-N'-tmob-etilenodiamina resultante (12a) se secó completamente en alto vacío y se usó en la siguiente etapa de reacción sin purificación adicional. Rendimiento: 3.76 g (11.48 mmol, 89% de pureza, 12a: doble producto protegido Tmob = 8:1). MS: m/z = 355.22 [M + H]+, (calculado = 355.23).
A una solución de 12a (2 g, 5.65 mmol) en CH2CI2 (24 mi) se agregaron COMU (4.84 g, 11.3 mmol), N-Fmoc-N-metil-Asp(OBn)-OH (2.08 g, 4.52 mmol) y 2,4,6-colidina (2.65 mi, 20.34 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 3 horas a temperatua ambiente, se diluyó con CH2CI2 (250 mi) y se lavó 3 x con HSO40.1 M (100 mi) y 3 x con salmuera (100 mi). Las fases acuosas se volvieron a extraer con CH2CI2 (100 mi). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2S04, se filtraron y el residuo se concentraó hasta un volumen de 24 mi. 12b se purificó mediante cromatografía flash. Rendimiento: 5.31 g (148%, 6.66 mmol) MS: m/z = 796.38 [M + H] , (calculado = 796.38).
A una solución de 12b [5.31 g, max.4.51 mmol ref. para N-Fmoc-N-Me-L-Asp (OBn)-OH] en THF (60 mi) se agregó DBU (1.8 mi, 3% v/v). La solución se agitó durante 12 min a temperatua ambiente, se diluyó con CH2CI2 (400 mi) y se lavó 3 x con H2SO4 0.1 M (150 mi) y 3 x con salmuera (150 mi). Las fases acuosas se volvieron a extraer con CH2CI2 (100 mi). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2S04 y se filtraron. 12c se aisló durante la evaporación del solvente y se utilizó en la siguiente reacción sin purificación adicional. MS: m/z = 574.31 [M + H]+, (calculado = 574.31). 12c (5.31 g, 4.51 mmol, crudo) se disolvió en acetonitrilo (26 mi) y COMU (3.87 g, 9.04 mmol), ácido 6-tritilmercaptohexanoico (2.12 g, 5.42 mmol) y se agregaron 2,4 ,6-colidina (2.35 mi, 18.08 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 4 horas a temperatura ambiente, se diluyó con CH2CI2 (400 mi) y se lavó 3 x con H2SO40.1 M (100 mi) y 3 x con salmuera (100 mi). Las fases acuosas se volvieron a extraer con CH2CI2 (100 mi). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2S04, se filtraron y 12d se aisló durante la evaporación del solvente. El producto 7i se purificó mediante cromatografía flash. Rendimiento: 2.63 g (62%, 94% de pureza) MS: m/z = 856.41 [M + H]+, (calculado = 856.42).
A una solución de 12d (2.63 g, 2.78 mmol) en i-PrOH (33 mi) y H2O (11 mi) se agregó LiOH (267 mg, 11.12 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 70 min a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con CH2CI2 (200 mi) y se lavó 3 x con H2SO40.1 M (50 mi) y 3x con salmuera (50 mi). Las fases acuosas se volvieron a extraer con CH2Cl2 (100 mi). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4/ se filtraron y 12e fue aislado después de la evaporación del solvente. 12e se purificó mediante cromatografía flash. Rendimiento: 2.1 g (88%) MS: m/z 878.4 = [M + Na]+, (calculado = 878.40).
Ejemplo 13 Síntesis de reactivo enlazador 13g Enlazador reactivo 13g se sintetizó de acuerdo con el siguiente esquema de reacciónde reacción: OH 13d A una solución de N,N-dimetiletilenodiamina (441 mg, 5 mmol) y NaCNBH3 (439 mg, 7 mmol) en MeOH (21 mi) se agregó una solución de 2,4,6-trimetoxibenzaldehído (1.34 g, 6.85 mmol) en DCM y MeOH (17 mi de cada uno) con una jeringa. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 60 min, se acidificó con HCl 0.5 M (50 mi) y se agitó otros 15 min. La mezcla de reacción se llevó a pH > 12 agregando NaOH 1 M y se extrajo 4 veces con acetato de etilo (lx 100 mi, 3 x 50 mi). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4 y los solventes se evaporaron al vacío. La N,N-dimetil-N'-tmob-etilenodiamina resultante, (13a) se secó completamente en alto vacío y se usó en el siguiente paso de reacción sin purificación adicional. Rendimiento: 1.63 g (contiene doble producto protegido Tmob). MS: m/z = 269.19 [M + H]+, (calculado = 269.19). 13a (268 mg, ca 0.83 mmol) se disolvió en THF (5 mi) y se agregaron anhídrido 2,3-piridindicarboxílico (149 mg, 1 mmol), DIPEA (362 ml, 2.08 mmol) y DMF (1 mi). La solución se agitó durante 15 min, se inactivó con AcOH (362 ml) y el THF fue eliminado en una corriente de nitrógeno. El residuo se diluyó con ACN/agua/TFA (1:1:0.002 v/v/v, 4 mi) y se purificó por RP-HPLC para dar 13b (244 mg, 0.46 mmol, 55%). MS: m/z = 418.20 [M + H]+, (calculado = 418.20). 12e (500 mg, 0.58 mmol) se disolvió en TFA/TES DTT/agua (85:5:5:5 v/v/v/v, 10 mi) y se agitó durante 4 horas. Los solventes se eliminaron en una corriente de nitrógeno y el residuo se suspendió en ACN/agua y se filtró. El filtrado se purificó por RP-HPLC para dar 13c (71 mg, 0.21 mmol, 36%).
MS: m/z = 334.43 [M + H]+, (calculado = 334.18). 13c (71 mg, 0.21 mmol) se disolvió en ACN/agua (1:1, 1 mi) y se agregaron 2,2'-ditiodipiridina (93 mg, 0.42 mmol) en ACN/agua (1:1, 1 mi, suspensión) y solución amortiguadora de fosfato de sodio pH 7.4 (0.5 M, 1 mi). La solución resultante se agitó durante 15 min y se purificó directamente por RP-HPLC para dar 13d (64 mg, 0.15 mmol, 68%). MS: m/z = 443.30 [M + H]+, (Calculado = 443.18). 13b (91 mg, 0.22 mmol) se disolvió en DMF (1 mi) y se agregó PyBOP (113 mg, 0.22 mmol). Se agregó DIPEA (50 ml, 0.29 mmol) y la solución se agitó durante 15 min.13d (64 mg, 0.145 mmol) se disolvió en DCM (1.5 mi) y se agregó a la solución de DMF. La reacción se agitó durante 100 min y se agregó AcOH (50 ml). DCM se eliminó en una corriente de nitrógeno y el residuo se disolvió en ACN/agua/TFA y se purificó por RP-HPLC para dar 13e (26 mg, 31 pmol, 21%). MS: m/z = 842.14 [M + H]+, (calculado = 842.36). 13e (26 mg, 31 mmo?) se disolvió en HFIP/TES/agua (39:1:1 v/v/v, 1 mi) y se agregó TFA (83 ml) con agitación. Después de 90 min se evaporaron los solventes a vacío y el residuo se purificó por RP-HPLC para dar 13f (11 mg, 17 mmo?, 54%). MS: m/z = 662.28 [M + H]+, (calculado = 662.28). 13f (11 mg, 17 miho?) se disolvió en DCM (1.5 mi), se agregaron DCC (4.2 mg, 20 mmo?), NHS (2.3 mg, 20 mpio?) y DMAP (0.2 mg, 1 mpio?) y la suspensión se agitó. Después de 1 hora y 2 horas, la cantidad citada de DCC y NHS se agregaron de nuevo. Después de 3 horas el solvente se evaporó en una corriente de nitrógeno. El residuo se suspendió en ACN/agua/TFA (1:1:0.002, 3 mi) y se filtró. El filtrado se purificó por RP-HPLC para dar 13 g (14 mg, 16 pmol (sal de TFA), 94%). MS: m/z = 759.30 [M + H]+, (calculado = 759.30).
Ejemplo 14 Síntesis de reactivo enlazador 14£ Enlazador reactivo 14f se sintetizó de acuerdo con el siguiente esquema de reacción: Tmob i Una solución de cloruro de p-monometoxitritilo (1.54 g, 5 mmol) en DCM (10 mi) se agregó lentamente con agitación a una solución de 3-(metilamino)propilamina (4.4 g, 50 mmol) en DCM (10 mi). Después de 2 horas se agregó dietil éter (166 mi). Salmuera (100 mi) se mezcló con NaOH (4 M, 80 ml) y la reacción se lavó con esta mezcla (3x33 mi). La capa orgánica se lavó con salmuera (30 mi), se secó con MgSO4 y se concentró a vacío. Rendimiento (14a): 1.79 g (4.95 mmol, 99%). 14a (0.36 g, 1 mmol) se disolvió en THF (7 mi) y DIPEA (0.44 mi, 2.5 mmol) y se agregó una solución de anhídrido quinolínico (0.18 g, 1.2 mmol) en THF (3 mi) con agitación. Después de 30 min se agregaron una solución de 13a (0.54 g, 2 mmol) en DMF (2 mi) y PyBOP (0.78 g, 1.5 mmol) y la reacción se agitó durante 1 hora. La reacción se diluyó con acetato de etilo (50 mi) y se lavó con NaOH (1 M, 20 mi). La fase acuosa se volvió a extraer con acetato de etilo (2x20 mi) y las fases orgánicas recogidas combinaron y se concentraron en vacío y se purificaron mediante cromatografía flash para dar 14b (0.4 g, 0.53 mmol, 53%) MS: m/z = 760.41 [M + H]+, (calculado = 760.41). 14b (0.4 g, 0.53 mmol) se disolvió en ACN (3 mi) y se agregó HCl (0.4 M, 3 mi) y la solución se agitó durante 4 horas. La reacción se inactivó con NaOH (1 M, 15 mi) y se extrajo con DCM (5x30 mi). La fase orgánica combinada se secó sobre MgS04, se concentró a vacío y 14c se purificó por cromatografía flash. Rendimiento: 0.32 g (0.42 mmol, 81%, sal de MMT) MS: m/z = 488.31 [M + H]+, (calculado = 488.29). lia (49 mg, 0.11 mmol) y 14c (114 mg, 0.15 mmol) se disolvieron en DCM (1.4 mi) y PyBOP (62 mg, 0.12 mmol) y DIPEA (38 ml, 0.22 mmol) se agregaron con agitación. Después de 2 horas se agregó AcOH (40 ml) y los solventes se evaporaron al vacío. El residuo se disolvió en ACN/agua/TFA (1:1: 0.002 v/v/v, 5 mi) y se purificó por RP-HPLC para dar 14d (104 mg, 0.1 mmoles de sal de TFA, 92%). MS: m/z = 912.19 [M + H]+, (calculado = 912.44). 14d (104 mg, 0.1 mmol) se disolvió en HFIP/TES/agua (39:1:1 v/v/v, 3 mi) y TFA (0.25 mi) se agregó con agitación. Después de 2 horas se agregó TFA (0.25 mi) con agitación y la reacción se agitó adicionalmente durante 20 horas. La mezcla se concentró a vacío y el residuo se disolvió en ACN/agua/TFA (1:1: 0.002 v/v/v, 3 mi) y se purificó por RP-HPLC para dar 14e (28 mg, 35 pinoles de sal de TFA, 35 %). MS: m/z = 676.13 [M+H]+, (calculado = 676.30). 14e (25 mg, 32 mmo?) se disolvió en DCM (2 mi) y DCC (10 mg, 48 miho?), NHS (5.5 mg, 48 pmol) y DMAP (0.4 mg, 3.2 pmol) se agregaron y la suspensión se agitó. Después de 1.5 horas, la cantidad citada de DCC y NHS se agregó de nuevo. Después de 3 horas el solvente se evaporó en una corriente de nitrógeno. El residuo se suspendió en ACN/agua/TFA (1:1:0.002 v/v/v, 4 mi) y se filtró. El filtrado se purificó por RP-HPLC para dar 14f (28 mg, 31.6 poles de sal de TFA, 99%). MS: m/z = 773.31 [M + H]+, (calculado = 773.31).
Ejemplo 15 Síntesis de reactivo enlazador 15f Reactivo enlazador 15f se sintetizó de acuerdo con el siguiente esquema de reacción A una solución de lia (0.29 g, 0.65 mmol) y PyBOP (0.34 g, 0.65 mmol) en ACN (5 mi) se agregó DIPEA (0 .57 mi , 3.27 mmol) . Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante un minuto, antes de que se agregara N,N-dimetilaminopropano-l, 3 -diamina ( 0.12 mi , 0. 98 mmol) . Después de 30 min se agregó AcOH (0.7 mi) para apagar la reacción. Esta mezcla se diluyó con agua y se purificó por RP-HPLC. El intermediario obtenido se disolvió en TFA (3 mi) y la mezcla se agitó durante 30 min antes de que TFA se elimine mediante una corriente de N2. El residuo se secó a vacío durante la noche para dar 15a (0 .42 g, 0.61 mmol de sal (2 x TFA) , 93%) como un aceite incoloro, que se usó sin purificación adicional. MS: m/z = 471.21 = [M + H]+, (calculado 471.21).
A una solución de 15a (0.23 mg, 0.33 mmol) en DCM (5 ml) se agregaron DMAP (8 mg, 65 mmo?), NHS (75 mg, 0.65 mmol) y DCC (135 mg, 0.65 mmol). Después de agitar durante 3 horas, la reacción se inactivó mediante la adición de AcOH (10 ml). El solvente se eliminó mediante una corriente de N2 y el residuo se suspendió en H2O/ACN/TFA (1:1:0.002 v/v/v) y se filtró. El filtrado se purificó por RP-HPLC para dar 15b (83 mg, 0.10 mmoles de sal (2 x TFA), 32%) como un aceite incoloro. MS: m/z = 568.23 = [M + H]+, (calculado 568.23). Ejemplo 16 Síntesis de etiqueta de purificación 16e La etiqueta de purificación 16e se sintetizó de acuerdo con el siguiente esquema de reacción: ' Boc H A una suspensión de ácido 6 , 6 ' -ditiodinicot inico (0.62 g, 2 mmol) en ACN (20 mi) se agregaron PyBOP (2,08 g, 4 mmol) y DIPEA (1.29 g, 1.74 mi, 10 mmol) y la mezcla se se agitó durante 1 min. La solución marrón obtenida se agregó a una solución de 1, 9-bis-Boc-l, 5, 9-tr iazanonano (1.99 g, 6 mmol) en una mezcla de ACN (20 mi) y DMF (5 mi) y se agitó durante 2 horas. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (150 mi) y la capa orgánica se lavó con HCl ac. (10 mM, 5 x 100 mi) , solución saturada de NaHCC>3 (3 x 100 mi) y salmuera (100 mi) , posteriormente.
Después de secar sobre MgSO4 y la filtración, el solvente se eliminó al vacío y el residuo crudo se purificó por cromatografía flash para dar 16a (1.92 g, máx.2 mmol) como una espuma de color amarillo claro. El producto contiene una pequeña cantidad no separable de tripirrolidina fosforamida, que se retira en el paso siguiente. MS: m/z = 935.47 = [M + H]+, (calculado 935.47). 16a (1.92 g, máx. 2 mmol) se disolvió en TFA (10 mi) y la solución se agitó durante 10 min. Se agregó la mezcla de reacción gota a gota a dietil éter enfriado con hielo (160 mi) para precipitar el producto. La suspensión resultante se centrifugó a 7000 x G y 2°C durante 3 min. Se desechó el sobrenadante y el precipitado se disolvió en metanol (10 mi). Se agregó gota a gota a dietil éter enfriado con hielo (160 mi) y la suspensión formada se centrifugó a 7000 x G y 2°C durante 3 minutos. Después de desechar el sobrenadante el procedimiento de precipitación se llevó a cabo dos veces más como se ha descrito anteriormente. El precipitado oleoso restante se secó al vacío para dar 16b (1.77 g, 1.45 mmol (6 x de sal de TFA), 73%) como un color marrón claro, polvo muy higroscópico. MS: m/z = 535.26 = [M + H]+, (calculado 535 .26).
A una solución de 16b (3.30 g, 2.7 mmol) en DMF (90 mi) se agregaron DIPEA (5.4 mi, 31 mmol) y Boc-L-Lys(Boc)-OSu (5.62 g, 12.7 mmol). La mezcla se agitó durante 14 horas antes de que se diluyera con acetato de etilo (600 mi). La capa orgánica se lavó con HCl ac. (10 mM, 5 x 300 mi), solución de NaHCO3 sat. (3 x 300 mi) y salmuera (300 mi) y se secó sobre MgSO4. Después de la filtración el solvente se eliminó a vacío y el residuo crudo se purificó por cromatografía flash para dar 16c (5.52 g, máx. 2.7 mmol) en forma de espuma de color amarillo claro con 90% de pureza. MS: m/z = 924.54 = [M + 2H]2+, (calculado 924.53). 16c (5.52 g, máx. 2.7 mmol) se disolvió en TFA (20 mi). Después de agitar durante 15 min el producto se precipitó mediante la adición de la mezcla de reacción gota a gota a dietil éter enfriado con hielo (160 mi). La suspensión resultante se centrifugó a 7000 x G y 2°C durante 3 min. Se desechó el sobrenadante y el precipitado se disolvió en metanol (10 mi). Se agregó gota a gota a dietil éter enfriado con hielo (160 mi) y la suspensión formada se centrifugó a 7000 x G y 2°C durante 3 min. Después de desechar el sobrenadante el procedimiento de precipitación se llevó a cabo dos veces más como se ha descrito anteriormente. El precipitado oleoso restante se secó a vacío para dar 16d (4.96 g, 2.27 mmol (10 x sal de TFA), 84%) como un polvo higroscópico color marrón claro. MS: m/z = 1046.64 = [M + H]+, (calculado 1046.64).
A una solución de 16d (1.53 g, 0.7 mmol) en DMF seco (20 mi) se agregó una solución de N,N-dimetilglicina (1.16 g, 11.2 mmol) , PyBOP (5.83 g, 11.2 mmol) y DI PEA (3.23 g, 4.36 mi, 25 mmol) en DMF (35 mi) y se agitó durante 1 hora. Despues, la mezcla se concentró a vacío hasta un volumen aproximado de 10 mi. A este residuo se agregó agua hasta un volumen total de 100 mi y la solución se acidificó a pH 1 - 2 mediante la adición de TFA . La mezcla turbia se centrifugó a 5000 x G y 2°C durante 3 minutos. El precipitado oleoso se desechó y el sobrenadante se purificó por RP-HPLC para dar 16e (1.05 g, 0.37 mmol (10 x sal de TFA), 53%) como un aceite incoloro. MS : m / z = 864.54 = [M + 2H]2+, (calculado 864.54) .
Ejemplo 17 Síntesis de reactivo enlazador 17g El reactivo enlazador 17g se sintetizó de acuerdo con el siguiente esquema de reacción: — Resina de 2-clorotritilcloruro (1.4 mmol/g, 1.43 g, 2 mmol) se pesó en una jeringa de 20 mi con frita. La resina se hinchó dos veces con 10 mi de DCM. N-Fmoc-N-metil-L-Asp(OtBu)-OH (1.06 g, 2.5 mmol) se disolvió en DCM (6 mi) y se introdujo en la jeringa. DIPEA (436 ml, 2.5 mmol) se disolvió en DCM (1 mi) y se introdujo en la jeringa. La jeringa se agitó durante 5 min. DIPEA (654 ml, 3.75 mmol) se disolvió en DCM (1 mi) y se extrajo dentro de la jeringa. La jeringa se agitó durante 1 hora. MeOH (2 mi) se introdujo en la jeringa y la jeringa se agitó durante 30 min. La resina se lavó 5 veces con DMF (10 mi). Se agitó la resina 3 veces durante 5 min con DMF:DBU:piperidina (96:2:2 v/v/v 7 mi). La resina se lavó 5 veces con DMF (5 mi). Ácido 6-tritilmercaptohexanoico (1.95 g, 5 mmol) y PyBOP (2.6 g, 5 mmol) se disolvieron en DMF (6 mi) y DIPEA (3.5 mi, 20 mmol). Después de 1 min de preincubación, la solución se introdujo en la jeringa y la jeringa se agitó durante 3 horas. La resina se lavó 5 veces con DMF (7 mi), 5 veces con DCM (7 mi). Una solución de HFIP/DCM (1/4 v/v, 8 mi cada uno) se introdujo en la jeringa y la jeringa se agitó 3 veces durante 30 min. Los filtrados recogidos se concentraron al vacío.17a crudo (0.84 g, 1.45 mmol, 73%) se usó sin purificación adicional en el siguiente paso. MS: m/z = 598.18 [M + Na]+, (calculado = 598.26). 17a (1.67 g, 2.9 mmol) se disolvió en DCM (20 mi) y N- Boc-N-metiletilenodiamina (0.62 mi, 3.48 mmol) y PyBOP (1.81 g, 3.48 mmol). Se agregó DIPEA (2.02 mi, 11.6 mmol) y la reacción se agitó durante 1 hora. Se agregó AcOH (2 mi), la mezcla se diluyó con DCM (40 mi) y se lavó con agua (2x20 mi). La capa orgánica se secó sobre MgSQiy se concentró a vacío y el residuo crudo se purificó por cromatografía flash para dar 17b (1.74 g, 2.38 mmol, 82%). MS: m/z = 754.19 = [M + Na]+, (calculado 754.39) . 17b (1.74 g, 2.38 mmol) y trifenilmetanol (0.62 g, 2.38 mmol) se disolvieron en DCM (7.2 mi) y se agregó TFA (7.2 mi) con agitación. La reacción se agitó durante 90 min y los solventes se eliminaron en una corriente de nitrógeno durante 45 min. El residuo se co-evaporó con DCM. El residuo se suspendió en ACN/agua/TFA (2:1:0.003 v/v/v, 14 mi) y se filtró. El filtrado se purificó por RP-HPLC para dar 17c (0.9 g, 1.3 inmoles de sal de TFA, 55%). MS: m/z = 576.20 [M + H]+, (calculado = 576.29). 17c (0.9 g, 1.3 mmol) se disolvió en DCM (20 mi) y se agregó carbonato de (5-metil-2-oxo-l,3-dioxol-4-il)-metil 4-nitrofenilo (0.46 g, 1.56 mmol). DIPEA (0.45 i, 2.6 mmol) se agregó lentamente y la reacción se agitó durante 30 min. Se agregó DIPEA (0.11 mi, 0.65 mmol) y la reacción se agitó durante 30 min. Una vez más, se agregó DIPEA (0.11 mi, 0.65 mmol) y la reacción se agitó durante 60 min. Se agregó AcOH (0.68 mi) y la mezcla se concentró a vacío y el residuo crudo se purificó por cromatografía flash para dar 17d (1.04 g, máx. 1.3 mmol). MS: m/z = 754.28 = [M + Na]+, (calculado 754.28). 17d (1.04 g, max 1.3 mmol) se disolvió en HFIP/TES/agua (39:1:1 v/v/v, 8.2 mi) y se agregó TFA (0.66 mi). Después de agitar durante 15 min la reacción se concentró a vacío, el residuo se suspendió en ACN/agua/TFA (1:1:0.002 v/v/v 12 mi) y se filtró. El filtrado se purificó por RP-HPLC para dar 17e (0.32 g, 0.65 mmol, 50%). MS: m/z = 490.19 [M + H]+, (calculado = 490.19). 17e (181 mg, 0.37 mmol) se disolvió en ACN/agua/TFA (1:1:0.002 v/v/v, 3 mi). 16e (1.05 g, 0.37 mmol (10 x sal de TFA) se disolvió en ACN/agua (1:1 v/v, 20 mi.) Ambas soluciones se combinaron y se agregó fosfato de sodio pH 7.4 (0.5 M, 4 mi) y la mezcla se agitó durante 30 min. El pH de la solución se ajustó a ca. pH 2 mediante la adición de ACN/agua/TFA (1:1: 0.22 v/v/v) y ACN se retiró al vacío. El residuo se purificó por RP-HPLC para dar 17f (0.47 g, 0.24 mmol 5x sal de TFA, 65%). MS: m/z = 676.86 [M + 2H]2+, (calculado = 676.86). 17f ( 0 . 18 g, 94 miho?) se disolvió en ACN (6 mi ) y NHS (92 mg, 0.8 mmol) y DCC (166 mg, 0.8 mmol) y la reacción se agitó durante 1 hora. El solvente se eliminó a vacío y el residuo se suspendió en ACN/agua/TFA (0.15:0.85:0.001 v/v/v, 6 mi) y se filtró. El filtrado se purificó por RP-HPLC para dar 17 g (129 mg, 64 mmo? 5x sal de TFA, 68%). MS: m/z = 725.37 [M + H]+, (calculado = 725.37).
Ejemplo 18 Síntesis del reactivo enlazador 18i Reactivo enlazador 18i se sintetizó de acuerdo con el siguiente esquema de reacción N-Boc-etilenodiamina (0.77 g, 4.8 mmol) se disolvió en DCM (15 mi) y ácido 6-tritilmercaptohexanoico (2.25 g, 5.76 mmol) y PyBOP (3.0 g 5.76 mmol) se agregaron con agitación. Se agregó DIPEA (2.52 mi, 14.4 mmol) y la reacción se agitó durante 1 hora. La reacción se diluyó con dietil éter (150 mi) y se lavó con salmuera ligeramente básica (3x30 mi, preparado a partir de 100 mi de salmuera y 3 mi de NaOH ac. 0.1 M). La fase orgánica se lavó una vez más con salmuera (30 mi), se secó sobre Na2SO4 y se concentró en vacío y se purificó mediante cromatografía flash para dar 18a como una espuma blanca. Rendimiento: 2.55 g (4.79 mmol, 99%) MS: m/z = 555.24 [M + Na]+, (calculado = 555.27). 18a (2.55 g, 4.79 mmol) se disolvió en THF (26 mi) y se transfirió a un matraz de fondo redondo lleno con argón secado al horno. Se agregó complejo de Borano-THF en THF (1 M, 17.7 mi, 17.71 mmol) y la reacción se agitó durante 15 horas. MeOH (5.4 mi) se agregó lentamente y se agregó N,N'-dimetil etilenodiamina (3.11 mi, 28.8 mmol) y la reacción se calentó a reflujo durante 2.5 horas. Después de enfriar la reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con solución sat. de bicarbonato de sodio (2x125 mi) y salmuera (1x125 mi). La fase orgánica se secó sobre Na2S04, se concentró a vacío para dar 18b que se usó sin purificación adicional en el siguiente paso. Rendimiento: 2.38 g (4.59 mmol, 96%) MS: m/z = 519.27 [M + H]+, (calculado = 519.31). 18b (1.19 g 2.29 mmol) se disolvió en DCM y carbonato de (5-metil-2-oxo-1,3-dioxol-4-il)-metil 4-nitrofenilo (1.02 g, 3.44 mmol) y 2,4,6-colidina (1.36 mi, 10.32 mmol) y la reacción se agitó durante 23 horas. La reacción se concentró al vacío y se purificó mediante cromatografía flash para dar 18c. Rendimiento: 1.19 g (1.77 mmol, 79%) MS: m/z = 697.18 [M + Na]+, (calculado = 697.29). 18c (0.5 g, 0.74 mmol) se disolvió en DCM (2.5 mi) y se agregaron trifenilmetanol (0.19 g, 0.74 mmol) y TFA (2.5 mi). La reacción se agitó durante 40 min, se concentró en una corriente de argón y se secó en vacío (<0.1 mbar). El residuo se disolvió en ACN/agua (7:3 v/v, 10 mi) y se purificó por RP-HPLC para dar 18d (0.50 g, 0.84 mmol, 114%). MS: m/z = 575.33 [M + H]+, (calculado = 575.26).
Resina de 2-clorotritilcloruro (1.22 mmol/g, 0.87 g, 1 mmol) se pesó en una jeringa de 10 mi con frita. La resina fue hinchada con 5 i de DCM y se lavó con DCM (5x4 mi). N-Fmoc-L-Asp (OtBu)-OH (1.1 g, 2.7 mmol) se disolvió en DCM (5 mi) y se agregó DIPEA (0.66 mi, 3.78 mmol) y la solución se introdujo en la jeringa. La jeringa se agitó durante 1 hora. MeOH (0.5 mi) se introdujo en la jeringa y la jeringa se agitó durante 15 min. La resina se lavó 5 veces con DCM (4 mi) y 5 veces con DMF (5 mi). La resina se agitó 3 veces durante 5 min con DMF:DBU:piperidina (96:2: 2 v/v/v 4 mi). La resina se lavó 5 veces con DMF (4 mi). El anhídrido acético (0.51 mi, 5.4 mmol) y DIPEA (1.9 mi, 10.8 mmol) se disolvieron en DMF (6 mi) y la solución se introdujo en la jeringa y la jeringa se agitó durante 15 min. La resina se lavó 5 veces con DMF (4 mi), 5 veces con DCM (4 mi). Una solución de HFIP/DCM (1/4 v/v, 5 mi de cada uno) se introdujo en la jeringa y la jeringa se agita 3 veces durante 10 min. Los filtrados recogidos se concentraron al vacío.18e crudo (0.29 g, 1.23 mmol, 114%) se usó sin purificación adicional en el siguiente paso. MS: m/z = 254.38 [M + Na]+, (calculado = 254.12). 18e (65 mg, 0.28 mmol) se disolvió en DCM (3 mi) y PyBOP (0.18 g, 0.34 mmol) y DIPEA (0.15 mi, 0.84 mmol).18d (0.18 g, 0.31 mmol) se disolvió en DCM (3 mi) y se agregó a la reacción. La reacción se agitó durante 1 hora y se concentró a vacío. El residuo se purificó por RP-HPLC para dar 18f (97 mg, 0.12 mmol, 44%). MS: m/z = 810.02 [M + Na]+, (calculado = 810.34). 18f (97 mg, 0.12 mmol) se disolvió en TFA/TES/agua (92:2.5:2.5 v/v/v, 3 mi) y la reacción se agitó vigorosamente durante 3 horas mientras que una corriente de argón se pasa a través de la solución. Después de 3 horas se eliminaron los solventes en una corriente de argón y el residuo se purificó por RP-HPLC para dar 18 g (16 mg, 33 pinol, 27%). MS: m/z = 490.21 [M + H]+, (calculado = 490.19). 18g (16 mg, 33 mmo?) se disolvió en ACN/agua (1:1 v/v, 3 mi) y se agregó una solución de 2,2'-ditiodipiridina (14 mg, 65 pmol) en ACN (0.1 mi) seguido por solución amortiguadora de fosfato de sodio de pH 7.4 (0.5 M, 0.1 mi). La reacción se agitó durante 4.5 horas y el producto se purificó directamente por RP-HPLC para dar 18h (14 mg, 23 pmol, 71%). MS: m/z = 598.98 [M + H]+, (calculado = 599.19). 18h (14 mg, 23 pmol) se disolvió en DCM (3 mi) y se agregaron NHS (3 mg, 28 mmo?), DCC (6.5 mg, 30 pmol) y DMAP (0.3 mg, 2 ol) . La reacción se agitó durante 1.5 horas y el solvente se retiró en una corriente de argón. El residuo se suspendió en ACN/agua/TFA (9:1: 0.01 v/v/v, 3 mi) y se filtró. El filtrado se purificó por RP-HPLC para dar 18i (17 mg, 23 miho? , 100%) . MS : m/z = 696.20 [M + H]+, (calculado = 696.20) .
Ejemplo 19 Síntesis de reactivos reticulantes 19c, 19g El reactivo reticulante 19c se preparó a partir de monobencil éster de ácido subérico 2a y PEG6000 en consecuencia con el siguiente esquema de reacción: Para la síntesis del compuesto 19a, monobencil éster del ácido azelaico 2a (6.50 g, 23..3 mmol) y PEG 6000 (40.0 g, 6.67 mmol) se disolvieron en 140 mi de diclorometano y se enfriaron con un baño de hielo. Se agregó una solución de DCC (4.81 g, 23.3 mmol) y DMAP (0.040 g, 0.33 mmol) en 40 mi de diclorometano. El baño de hielo se retiró y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La suspensión resultante se enfrió a 0°C y el sólido se separó por filtración. El solvente se evaporó al vacío.
El residuo se disolvió en 70 mi de diclorometano y se diluyó con 300 mi de MTBE a temperatura ambiente. La mezcla se almacenó durante la noche a -20°C. El precipitado se recogió por filtración a través de un filtro de vidrio Por. 3, y se lavó con 500 mi de MTBE enfriado (-20°C). El producto se secó a vacío durante la noche.
Rendimiento 41.2 g (95%) de polvo blanco 19a.
MS: m / z = 833.75 [M + 8H]8+ (calculado = 833.74).
Para los espectros de masa de compuestos que contienen PEG polidisperso, se seleccionó un solo pico de masa.
Para la síntesis del compuesto 19b, el compuesto 19a (41.2 g, 6.32 mmol) se disolvió en acetato de metilo (238 mi) y etanol (40 mi), después se agregaron 400 mg de paladio sobre carbón vegetal. Bajo una atmósfera de hidrógeno de presión ambiente, la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de celita y el filtrado se evaporó y se secó en vacío durante la noche.
Rendimiento 38.4 g (96%) de sólido vitreo 19b.
MS: m/z = 750.46 [M + 9H]9+ (calculado = 750.56).
Para los espectros masa de de compuestos que contienen PEG polidispersa, se seleccionó un solo pico de masa.
Para la síntesis del compuesto 19c, el compuesto 19b (38.2 g, 6.02 mmol) y TSTU (7.25 g, mmol) se disolvieron en 130 mi de diclorometano a temperatura ambiente. Después se agregó DIPEA (3.11 g, 24.1 mmol) y la mezcla se agitó durante 1 hora. La suspensión resultante se filtró, el filtrado se diluyó con 100 mi de diclorometano y se lavó con 200 mi de una solución de 750 g de agua/197 g de NaCl/3 g de NaOH. La fase orgánica se secó sobre MGSC y el solvente se evaporó a vacío.
El residuo se disolvió en 210 mi de tolueno, se diluyó con 430 mi de MTBE a temperatura ambiente y se almacenó durante la noche a -20°C. El precipitado se recogió por filtración a través de un filtro de vidrio Por.3, y se lavó con 450 mi de MTBE enfriado (-20°C). El producto se secó a vacío durante la noche.
Rendimiento 35.8 g (91%) de polvo blanco 19c.
MS : m/z = 857.51 [M + 8H] 8+ (calculado = 857.51) .
Para los espectros de masa de compuestos que contiene PEG polidisperso, se seleccionó un solo pico de masa.
Reactivo reticulante 19g se preparó del ácido monobencil áster isopropilmalónico y PEG8000 de acuerdo con el siguiente esquema de reacción: rac-19g Para la síntesis de monobencil áster del ácido isopropilmalónico rac-19d, ácido isopropilmalónico (35.0 g, 239 mmol), alcohol bencílico (23.3 g, 216 mmol) y DMAP (1.46 g, 12.0 mmol) se disolvieron en 100 mi de acetonitrilo. La mezcla se enfrió a 0°C con un baño de hielo. Una solución de DCC (49.4 g, 239 mmol) en 150 mi de acetonitrilo se agregó en 15 min a 0°C. El baño de hielo se retiró y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente, después el sólido se filtró. El filtrado se evaporó a 40°C en vacío y el residuo se disolvió en 300 mi de MTBE. Esta solución se extrajo con 2 x 300 mi solución de NaHCO3 sat. acuoso, después las fases acuosas combinadas se acidificaron a pH = 1-3 con ácido clorhídrico 6 N. La emulsión resultante se extrajo con 2 x 300 mi de MTBE y el solvente se evaporó. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con 200 mi de NaCl acuoso sat. y se secaron sobre MgS04. El producto se purificó sobre 340 g de sílice usando acetato de etilo/heptano (10:90 20:80) como eluyente. El eluyente se evaporó y el residuo se secó a vacío durante la noche.
Rendimiento 9.62 g (17%) de aceite incoloro rac-19d.
MS: m / z = 237.11 [M + H]+ (calculado = 237.11).
Para la síntesis del compuesto rac-19e, monobencil éster del ácido isopropilmalónico rac-19d (2.25 g, 9.50 mmol) y PEG 8000 (19.0 g, 2.38 mmol) se disolvieron en 100 mi de diclorometano y se enfrió con un baño de hielo. Se agregó una solución de DCC (1.96 g, 9.50 mmol) y DMAP (14 mg, 0.12 mmol) en 10 mi de diclorometano. El baño de hielo se retiró y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La suspensión resultante se enfrió a 0°C y el sólido se separó por filtración. El solvente se evaporó al vacío.
El residuo se disolvió en 40 mi de diclorometano y se diluyó con 270 mi de MTBE a temperatura ambiente. La mezcla se almacenó durante la noche a -20°C. El precipitado se recogió por filtración a través de un filtro de vidrio Por. 3, y se lavó con 500 mi de MTBE enfriado (-20°C). El producto se secó a vacío durante la noche.
Rendimiento 18.5 g (92%) de polvo blanco rac-19e.
MS : m/z = 737 .43 [M 13H] 13+ (calculado = 737 .42 ) .
Para los espectros de masa de compuestos que contienen PEG polidispersos, se seleccionó un solo pico de masa.
Para la síntesis del compuesto rac-19f, el compuesto rac-19e (18.4 g, 2.18 mmol) se disolvió en acetato de metilo (160 mi) y se agregaron 254 mg de paladio sobre carbón. Bajo una atmósfera de hidrógeno a presión ambiente, la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de celita y el filtrado se evaporó y se secó en vacío durante la noche. Rendimiento 17.7 g (98%) sólido vitreo rac-19F.
MS: MZ 723.51 = [13H M 4]13+ (calculado = 723.55).
Para los espectros de masa de compuestos que contienen PEG polidisperso, se seleccionó un solo pico de masa.
Para la síntesis del compuesto rac-19g, el compuesto rac-19f (13.6 g, 1.65 mmol) y TSTU (1.96 g, 6.60 mmol) se disolvieron en 60 mi de diclorometano a temperatura ambiente. A continuación, se agregó DIPEA (852 mg, 6.60 mmol) y la mezcla se agitó durante 45 min. La suspensión resultante se filtró, el filtrado se diluyó con 70 mi de acetato de etilo y se lavó con 70 mi de una solución amortiguadora de fosfato pH 0.5 M = 6.5. La fase orgánica se secó sobre MgSCp y el solvente se evaporó a vacío. El residuo se disolvió en 80 mi de tolueno, el sólido restante se separó por filtración y se lavó con 20 mi de tolueno. Las fracciones de tolueno combinadas se diluyeron con 35 mi de MTBE a temperatura ambiente y se almacenó durante la noche a -20°C. El precipitado se recogió por filtración a través de un filtro de vidrio Por.3, y se lavó con 600 mi de MTBE enfriado (-20°C). El producto se secó a vacío durante la noche. Rendimiento 12.1 g (87%) de polvo blanco rac-19g.
MS : m / z = 738.51 [M + 13H] 13+ (calculado = 738.49) .
Para los espectros de masa de compuestos que contienen PEG polidisperso, se seleccionó un solo pico de masa.
Ejemplo 20 Preparación de perlas de hidrogel 20a que contienen grupos amino libres. 20a se preparó como se describe para 3c, excepto la aplicación de una velocidad de agitación de 560 rpm, el uso de 398 mg de Ib, 2.690 mg de 19c, 27.8 g de DMSO, 274 mg de Cithrol™ DPHS, 1.8 mi de TMEDA, 2.7 mi de ácido acético, produciendo 0.22 g en el tamiz de 50 mm, 0.33 g en el tamiz de 63 pm, y 0.52 g en el tamiz de 75 mm de 20a como un polvo blanco, grupos amino libres 0.152 mmol/g.
Preparación de perlas de hidrogel 20b que contienen grupos amino libres. 20b se preparó como se describe para 3c, excepto la aplicación de una velocidad de agitación de 580 rpm, el uso de 250 mg de Ib, 2.168 mg de rac-19g, 21.8 g de DMSO, 215 mg de Cithrol™DPHS, 1.1 mi de TMEDA, 1.7 mi de ácido acético, produciendo 0.09 g en el tamiz de 50 mm, 0.17 g en el tamiz de 63 mm, y 0.54 g en el tamiz de 75 mth de 20b como un polvo blanco, grupos amino libres 0.154 mmol/g.
Ejemplo 21 Preparación de maleimida que contiene cola de histidina 21 0.78 g de resina MBHA de amida de Rink (malla 100-200, 0.64 mmol/g aminas) se transfirieron en una jeringa de 20 mi equipada con una frita y se hincharon en 10 i de DCM. El solvente fue expulsado y la resina se lavó tres veces con NMP, el solvente se desechó cada vez. La resina se trató durante 15 minutos y 5 minutos, respectivamente, con 5 mi de piperidina al 20% en DMF para eliminar el grupo de protección Fmoc, el solvente se desechó cada vez. La resina se lavó diez veces con NMP.775 mg de Fmoc-His (Trt) -OH y 475 mg de HATU se disolvieron en 3 mi de HOAT 0.5 M en DMF y se agregaron 850 ml de DIPEA. La solución se introdujo en la jeringa y la suspensión se dejó incubar bajo agitación suave durante 3 h a temperatura ambiente. El solvente se desechó y la resina se lavó cinco veces con NMP. El grupo de protección Fmoc se eliminó como se describió anteriormente. Los próximos cinco acoplamientos fueron cada uno realizados usando una solución de acoplamiento de 620 mg de Fmoc-His(Trt)-OH, 77 mg de HOBt, 160 mg de TBTU y 850 de ml de DIPEA en 3 mi de NMP. A la reacción se le permitió cada vez ir durante 1 hora a temperatura ambiente bajo agitación suave seguido de lavado con NMP y desprotección de Fmoc. Después, la resina se trató con una solución de 385 mg de Fmoc-Ado-OH, 475 mg de HATU, 850 m? de DIPEA disuelto en 3 mi de HOAt 0.5 M en DMF durante 1 hora a temperatura ambiente seguido de lavado con NMP y desprotección de Fmoc. La resina se trató con 169 mg de ácido maleimido propiónico, 475 mg de HATU, 850 m? de DIPEA en 3 mi de HOAt 0.5 M en DMF durante ocho horas a temperatura ambiente bajo agitación suave. El solvente se desechó y la resina se lavó cinco veces con NMP y diez veces con DCM. El solvente se desechó cada vez. Finalmente, la resina se trató con cada vez 5 mi de una solución de 95% de TFA/2.5% de TIPS/2.5% de agua durante dos veces 30 min y dos veces de una hora. La solución fue expulsada en tubos de Falcon de 50 mi separados y el TFA evaporado bajo una corriente continua de nitrógeno. Al residuo, se agregaron 45 mi de éter enfriado con hielo y el tubo Falcon se centrifugó y el sobrenadante se desechó. El precipitado se recogió en 50% de ACN/agua y se purificó mediante HPLC prep. y se liofilizó para dar 21. Rendimiento 0.15 g (26%).
MS: m/z = 1136.49 [M + H]+ (calculado = 1136.49).
Ejemplo 22 Preparación de perlas de hidrogel PEGiladas en DMSO 22 Perlas de hidrogel secas como se describen por ejemplo en 3c se transfirieron a una jeringa equipada con una frita y se agregó NMP (5 ml/100 mg de perlas de hidrogel). El hidrogel se dejó hinchar durante 10 min a temperatura ambiente bajo agitación suave. El solvente fue expulsado y el hidrogel se lavó diez veces cada vez con DMSO, seguido por diez lavados cada vez con TMEDA al 1%/DMSO (5 ml/100 mg de perlas de hidrogel), el solvente fue desechado cada vez. 0.2 eq (basados en el contenido de amina de las perlas de hidrogel) de PEG-NHS se disolvieron en una solución que contiene 2 eq. (basados en el contenido de amina de las perlas de hidrogel) de TMEDA en DMSO a 37°C durante 15 min. La solución se introdujo en la jeringa y la suspensión de hidrogel resultante se dejó incubar bajo agitación suave. El solvente fue expulsado y el hidrogel se lavó cinco veces con DMSO (5 ml/100 mg de perlas de hidrogel), seguido por cinco ciclos de lavado con ácido acético al 0.1%/Tween 20 al 0.01% (5 ml/100 mg de perlas de hidrogel). Acido acético al 0.1%/Tween 20 al 0.01% recién preparado fue sacado en la jeringa para dar una suspensión de 10 mg/ml de hidrogel basado en el peso inicial. El contenido de amina de las perlas de hidrogel se determinó como se ha descrito anteriormente. Con base en la ecuación (2) esta se refiere al grado de PEGilación.
El ejemplo 22a se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente utilizando 50 mg de hidrogel 20a y 60.8 mg de PEG-NHS 40 kDa para dar perlas de hidrogel PEGiladas con un contenido de amina de 0.141 mmol/g.
El ejemplo 22b se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, utilizando 51.3 mg de hidrogel 20b y 59.5 mg de PEG-NHS 40 kDa para dar perlas de hidrogel PEGiladas con un contenido de amina de 0.118 mmol/g. Ejemplo 23 Preparación de perlas de hidrogel funcionalizadas con maleimida 23 Perlas de hidrogel PEGiladas como una suspensión de 10 mg/ml con base en el peso inicial de perlas de hidrogel antes de la PEGilación se transfirieron en una jeringa equipada con una frita. El solvente fue expulsado y el hidrogel se lavó diez veces con agua (5 ml/100 mg de perlas de hidrogel), el solvente se desechó cada vez. Las perlas de hidrogel se lavaron después diez veces con NMP y cinco veces con DIPEA al 2% en NMP. 5 eq de Mal-PEG6-Pfp (con base en el contenido de amina de las perlas de hidrogel) se disolvieron en NMP (1 ml/50 mg de reactivo) y se agregó a las perlas de hidrogel lavadas. La suspensión de hidrogel se incubó durante 2 h a temperatura ambiente. Perlas de hidrogel funcionalizadas con maleimida resultantes se lavaron cinco veces cada una con NMP y después con ácido acético al 0.1%/Tween 20 al 0.01%.
El contenido de maleimida de perlas de hidrogel se determinó mediante conjugación de una Fmoc-cisteína a los grupos maleimida en el hidrogel y la determinación Fmoc posterior como se describe por Gude, M., J. Ryf, et al. (2002) Letters in Peptide Science 9 (4): 203-206.
El ejemplo 23a se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente utilizando 35 mg de 22a (con base en el peso seco inicial de 20a) y 13 mg de Mal-PEGe-PFP.
El ejemplo 23b se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente utilizando 35 mg de 22b (con base en el peso seco inicial de 20b) y 17 mg de Mal-PEGe-PFP.
Ejemplo 24 Síntesis de profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis transitorio A 80 mg de Lucentis (representado en el siguiente esquema de reacción como Lucentis-NH2) (2000 ml de 40 mg/mL de Lucentis en histidina 10 mM, 10% en peso de a,a-trehalosa, 0.01% de Tween 20, pH 5.5) se cambió la solución amortiguadora a fosfato de sodio 10 mM, cloruro de potasio 2.7 mM, cloruro de sodio 140 M, pH 7.4 y la concentración de Lucentis se ajustó a 13.5 mg/mL.6 mg de reactivo enlazador 4c se disolvió en IOOmI de DMSO para dar una concentración de 100 mM. 1 equivalente molar de reactivo enlazador 4c con respecto a la cantidad de Lucentis se agregó a la solución de Lucentis. La mezcla de reacción se mezcló cuidadosamente y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se agregaron 1.3 equivalentes molares adicionales de reactivo enlazador 4c a la solución Lucentis produciendo una mezcla de Lucentis no modificado y el monoconjugado enlazador de Lucentis protegido 24a.
El pH de la mezcla de reacción se ajustó a pH 6.5 mediante la adición de citrato de sodio 1 M, pH 5.0 y se agregó Na2EDTA a una concentración final de 5 mM. Para eliminar los grupos protectores de 24a se agregaron NH2OH 0.5 M (disuelto en citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 140 mM, Na2EDTA 5 mM, pH 6.5) a una concentración final de 45 mM y la reacción de desprotección se incubó a temperatura ambiente durante 4 horas produciendo el monoconjugado enlazador de Lucentis 24b. A la mezcla de Lucentis y monoconjugado enlazador de Lucentis 24b se le cambió la solución amortiguadora a fosfato de sodio 10 mM, cloruro de potasio 2.7 mM, cloruro de sodio 140 mM, Na2EDTA 5 mM, Tween 20 al 0.01%, pH 6.5 y la concentración global de las dos especies de Lucentis se ajustó a 12.1 mg/ml. l Ejemplo 25 Síntesis de profánnaco de hidrogel enlazador de Lucentis transitorio 25a 20 mg de la mezcla de Lucentis/monoconjugado enlazador de Lucentis 24b en fosfato de sodio 10 mM, cloruro de potasio 2.7 mM, cloruro de sodio 140 mM, Na2EDTA 5 mM, Tween 20 al 0.01%, pH 6.5 se agregaron a 2.5 mg de perlas de hidrogel funcionalizadas con maleimida 5a y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente produciendo profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis transitorio 25a.
El ejemplo 25b se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito para 25a usando 2.5 mg de (con base en el peso seco de 20a) 23a.
El Ejemplo 25c se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito para 25b usando 2.5 mg (con base en el peso seco de 20b) de 23b.
Ejemplo 26 Perlas de hidrogel bloqueadas 26 Perlas de hidrogel se sintetizaron de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 3c y funcionalizadas con grupos maleimida de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 5a. Posteriormente, 4 mi de la suspensión de hidrogel en 10 mg/ml se transfirieron a una jeringa de 20 mi equipada con una frita. El solvente fue expulsado y el hidrogel se lavó 10 veces con 5 mi de histidina 10 mM/10% en peso de a,a-trehalosa/Tween 20 al 0.01%/pH 5.5. El solvente fue expulsado y 5 mi de b-mercaptoetanol 1 mM en histidina 10 mM/10% en peso de a,a-trehalosa/Tween20 al 0.01%/pH 5.5 se introduce en la jeringa. La suspensión resultante se dejó incubar a temperatura ambiente bajo agitación suave durante 5 min. El solvente se desechó y el hidrogel tratado 9 veces más con 5 mi de b-mercaptoetanol 1 mM en histidina 10 mM/10% en peso de a,a-trehalosa/Tween20 al 0.01%/pH 5.5. El solvente fue desechado cada vez. Las perlas de hidrogel se lavaron entonces 10 veces cada vez con 5 mi de histidina 10 mM/10% en peso de a,a-trehalosa/Tween20 al 0.01%/pH 5.5, el solvente se desechó cada vez. Las perlas de hidrogel se lavaron a continuación diez veces cada vez con 5 mi de PBS-T/pH 7.4, el solvente se desechó cada vez. Finalmente, PBS-T/pH recién preparado 7.4 fue introducido en la jeringa y la suspensión se transfirió a un tubo Falcon para dar 26.
Ejemplo 27 Unión del anticuerpo a perlas de hidrogel de Lucentis 27 20 ml de suspensiones de hidrogel 25a-c (35% en volumen) en solución amortiguadora de PBS-T se mezclaron con 400 ml de la primera solución de anticuerpo en PBS-T con BSA al 1% (Sigma, A3059) y se incubaron durante 1 hora a 200 rpm en 1.5 mi de tubos Eppendorf. Para las perlas de hidrogel Lucentis se utilizó una dilución 1:100 de ab771 anticuerpo (anticuerpo de fragmento Fab de IgG anti-humana [4A11] (ab771) - Abcam, Cambridge, Reino Unido). Perlas de hidrogel se sedimentaron a través de un paso de centrifugación a 100 g durante 1 min en una centrífuga de mesa. El sobrenadante se retiró mediante pipeteo y se tuvo cuidado de no eliminar cualquier perla de hidrogel. El lavado de las perlas se llevó a cabo a través de dos rondas de los pasos de lavado, que incluían la adición de 1 mi de solución amortiguadora de PBS-T, centrifugación a 100 g durante 1 min y la eliminación cuidadosa del sobrenadante mediante pipeteo. 400 m? del anticuerpo secundario en PBS-T con BSA al 1% (Sigma, A3059) se agregaron a las perlas y se incubaron durante 1 hora a 200 rpm. Para perlas de hidrogel de Lucentis se utilizó una dilución de 1:50 de anticuerpo ab97041 (IgG de cabra anti-ratón H&L (ficoeritrina) preadsorbida (ab97041) - Abcara, Cambridge, Reino Unido). El sobrenadante se retiró mediante pipeteo y se tuvo cuidado de no eliminar cualquier perla de hidrogel. El lavado de las perlas se llevó a cabo a través de cuatro rondas de los pasos de lavado, que incluían la adición de 1 mi de solución amortiguadora de PBS-T, centrifugación a 100 g durante 1 min y la eliminación cuidadosa del sobrenadante mediante pipeteo. Las perlas lavadas se resuspendieron en 200 ml de PBS-T y fueron transferidas por completo en placas de 96 pozos de color negro (black, non binding, Art. No. 655900, Greiner bio-one GmbH, 72636 Frickenhausen, Alemania). La intensidad de fluorescencia se determinó con un lector de placas fluorescente Tecan Infinite M200 (excitación 495 nm, emisión 575 nm, Número de destellos 25, Tiempo de integración 20 ps, múltiples lecturas por pozo 5x5 (Border 250 mm), ganancia óptima) .
Análisis de datos Se logró la determinación de la unión de anticuerpos a perlas de hidrogel Lucentis modificado con PEG en comparación con una curva estándar de perlas de hidrogel de Lucentis no modificadas 25a. Las perlas de hidrogel de Lucentis no modificado se mezclaron con perlas de hidrogel Lucentis 26 en diferentes proporciones. La gráfica (porcentaje de perlas de hidrogel de Lucentis no modificado frente a la intensidad de fluorescencia) se ajustó de manera lineal. El porcentaje de unión del anticuerpo a perlas de hidrogel de Lucentis PEGilado fue calculado nuevamente de acuerdo con la curva de calibración obtenida.
Resultados Definiciones: Desv promedio = desviación de la media = |m -X |, m = valor promedio Ejemplo 28 Cinética de liberación in vitro - determinación de la vida media in vi tro 28a 50.3 mg de suspensión de profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis densa 25a (que contiene aproximadamente 1.68 mg de Lucentis) se lavó cinco veces con fosfato de sodio 60 mM, 3 mM de Na2EDTA, Tween 20 al 0.01%, pH 7.4 y finalmente se suspendió en 1 mi de la solución amortiguadora mencionada. La suspensión se incubó a 37°C. La solución amortiguadora de la suspensión se intercambió después de diferentes intervalos de tiempo y se analizó por HPLC-SEC a 220 nm. Picos correspondientes a Lucentis liberado fueron integrados y el total de Lucentis liberado fue graficado frente al tiempo de incubación total. El software de ajuste de Curva fue aplicado para determinar las tasas de división de primer orden.
Cinética de liberación de 28a: El ejemplo 28b se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en 28a pero con 35.0 mg de suspensión de profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis densa 25b (que contiene aproximadamente 1.14 mg de Lucentis).
Cinética de liberación de 28b: El ejemplo 28c se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en 28a pero con 25.3 mg de suspensión de profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis denso 25c (que contiene aproximadamente 0.73 mg de Lucentis).
Cinética de liberación de 28c: Ejemplo 29 Preparación perlas de hidrogel fuñeionalizadas con tiol 29 100 mg de perlas de hidrogel secas como se describe en 3c con un contenido de amina de 0.097 mmol/g se transfirieron a una jeringa de 20 mi equipada con una frita. El hidrogel se hinchó en NMP y el solvente se desechó. El hidrogel se lavó cinco veces cada vez con 5 mi de NMP, el solvente se desechó cada vez. Las perlas de hidrogel se lavaron cinco veces cada vez con 5 mi de DIPEA al 2% en NMP, el solvente se desechó cada vez. Las perlas de hidrogel se lavaron cinco veces con 5 mi de DMSO, el solvente se desechó cada vez.17.7 mg de OPSS-PEG12-NHS se disolvieron en 1 mi de DMSO y se introdujeron en la jeringa. La suspensión se dejó incubar durante 2 horas bajo agitación suave a temperatura ambiente. El solvente fue expulsado y las perlas de hidrogel se lavaron cinco veces cada vez con 5 mi de DMSO y cinco veces cada vez con 5 mi de succinato 15 mM/NaCl 100 mM/EDTA 5 mM/pH 4.0, el solvente se desechó cada vez. 10 mi de succinato 15mM/NaCl 100 mM/solución amortiguadora de pH 4.0/EDTA 5mM se introdujo en la jeringa y la suspensión resultante se transfirió a un tubo Falcon. Se agregaron 10 ml de Tween 20. 1 mi de esta suspensión de hidrogel se transfirió a una jeringa de 5 mi equipada con una frita y el solvente fue expulsado. Las perlas de hidrogel se incubaron con 1 mi de una solución de TCEP 50 mM en agua durante 10 min a temperatura ambiente bajo agitación suave. El solvente fue expulsado y las perlas de hidrogel se lavaron cinco veces cada vez con 1 mi de una solución de TCEP 50 mM en agua, el solvente se desechó cada vez. Las perlas de hidrogel se lavaron diez veces con 1 mi de succinato 15 mM/NaCl 100 mM/EDTA 5 mM/Tween 20 al 0.01%/pH 4.0, el solvente fue cada vez desechado.1 mi de succinato 15mM/NaCl 100 mM/EDTA 5 mM/Tween20 al 0.01%/ pH 4.0 se introdujo en la jeringa para dar 29 como una suspensión de hidrogel de 10 mg/mL con base en el peso inicial seco de las perlas de hidrogel.
Ejemplo 30 Preparación de una cola de histidina funcionalizada con tiol 30 0.2 g de resina MBHA de amida de Rink (malla 100-200, 0.64 mmol/g aminas) se transfirieron en una jeringa de 5 mi equipada con una frita y se hinchó en 2 mi de DMF durante 10 min. El solvente fue expulsado y la resina se lavó cinco veces con 5 mi de DMF, el solvente se desechó cada vez. La resina se trató durante dos veces 15 minutos con 5 mi de piperidina al 20% en DMF, el solvente se desechó cada vez para eliminar el grupo protector Fmoc. La resina se lavó diez veces con 2 mi de DMF. 198 mg de Fmoc-His(Trt)-OH y 146 mg de HATU se disolvieron en 1 mi de HOAT 0.5 M en DMF y se agregaron 223 ml de DIPEA. La solución se introduce en la jeringa y la suspensión se dejó incubar bajo agitación suave durante 1.5 horas a temperatura ambiente. El solvente se desechó y la resina se trató de nuevo durante 1.5 horas con una solución de 198 mg de Fmoc-His(Trt)-OH, 146 mg de HATU y 223 ml de DIPEA en 1 mi de HOAT 0.5 M en DMF. El solvente se desechó y la resina se lavó diez veces con 2 mi de DMF cada vez, el solvente fue desechado cada vez. El grupo protector de Fmoc se eliminó como se describió anteriormente. Los próximos cinco acoplamientos fueron realizados cada uno utilizando una solución de acoplamiento de 198 mg de Fmoc-His(Trt)-OH, 146 mg de HATU y 223 m? de DIPEA en 1 mi de HOAt 0.5 M en DMF. A la reacción se le permitió cada vez ir durante 1.5 horas a temperatura ambiente bajo agitación suave seguido de lavado con DMF y desprotección de Fmoc. Después, la resina se trató con una solución de 123 mg de Fmoc-Ado-OH, 122 mg de HATU, 223 m? de DIPEA disuelta en 1 mi de HOAt 0.5 M en DMF durante 1.5 horas a temperatura ambiente seguido de lavado con DMF y desprotección de Fmoc. La resina se trató con 112 mg de ácido 3-(tritiltio-)propiónico, 122 mg de HATU y 223 ml de DIPEA en 1 i de HOAt 0.5 M en DMF durante una hora a temperatura ambiente bajo agitación suave. El solvente se desechó y la resina se lavó diez veces con DMF y diez veces con DCM. El solvente se desechó cada vez. La resina se trató cada vez con 3 mi de una solución de 95% de TFA/2.5% de TIPS/2.5% de agua durante dos veces 30 min y una vez durante una hora. La solución fue expulsada en tubos Falcon separados de 50 mi y el TFA se evaporó bajo una corriente continua de nitrógeno. Al residuo, se agregaron 45 mi de éter helado y el tubo Falcon se centrifugó y el sobrenadante fue desechado. El precipitado se recogió en 50% de ACN/agua y se purificó mediante HPLC prep. y se liofilizó para dar 30.
Rendimiento 8.1 mg (6%).
MS: m / z = 1073.46 [M + H]+ (calculado = 1073.46).
Ejemplo 31 Preparación de 2-(2-piridildisulfanil)etanol 31 250 mg de aldritiol-2 se disolvieron en 10 i de fosfato 50 mM/ACN pH 7.4 y se agregaron 95 ml de 2-mercaptoetanol. La solución se dejó en agitación durante 5 min a temperatura ambiente. Después, se agregaron 50 mg adicionales de aldritiol-2. La solución se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. El producto crudo se purificó por HPLC prep. y se liofilizó para dar 31.
Rendimiento 140.6 mg (55%).
MS: m / z = 188.02 [M + H]+ (calculado = 188.02).
Ejemplo 32 Bloqueo de hidrogel funcionalizado con tiol 32 4 mg (con base en el peso seco del hidrogel inicial) de perlas de hidrogel funcionalizadas con tiol 29 se transfieren como una suspensión de 10 mg/ml de succinato 15 mM/NaCl 100 mM/EDTA 5 mM/Tween 20 al 0.01%/pH 4.0 en una jeringa de 5 mi equipada con una frita. El solvente fue expulsado y 322 ml de una solución 5 mM de 31 en succinato 15 mM/NaCl 100 mM/EDTA 5 mM/Tween20 al 0.01%)/pH 4.0 se introduce en la jeringa. La suspensión se dejó incubar a temperatura ambiente bajo agitación suave durante 16 horas. El solvente fue expulsado y las perlas de hidrogel se lavaron diez veces con 2 mi de succinato 15 mM/NaCl 100 mM/EDTA 5 mM/Tween 20 al 0.01%/pH 4.0, el solvente se desecha cada vez.
Ejemplo 33 Síntesis de profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis transitorio 33d 360 mg de Lucentis (representado en el siguiente esquema de reacción dereacción como Lucentis-NH2) (9 mi de Lucentis de 40 mg/ml en histidina 10 mM, 10% en peso de a,a-trehalosa, 0.01% de Tween 20, pH 5.5) se cambió de solución amortiguadora a fosfato de sodio 10 mM, cloruro de potasio 2.7 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 7.4 y la concentración de Lucentis se ajustó a 20 mg/ml. Reactivo enlazador lid se disolvió en DMSO para producir una concentración de 100 mM.5 equivalentes molares de reactivo enlazador 11 d con relación a la cantidad de Lucentis se agregaron a la solución de Lucentis en 2, 2, 1 y pasos equivalentes molares. La mezcla de reacción se mezcló cuidadosamente después de cada adición de reactivo enlazador y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente produciendo una mezcla de monoconjugado de Lucentis no modificado y enlazador de Lucentis protegido 33a.
El pH de un cuarto de la mezcla de reacción se ajustó a un pH 6.5 mediante la adición de citrato de sodiol M, un pH 5.0 y Na2 EDTA se agregó a una concentración final de 5 mM. Para extraer el grupo protector de oxocarbonilo de (5-metil-2-oxo-l,3-dioxol-il)-metil de 33a 0.5 M NH2OH (disuelto en 10 mM de citrato de sodio, 140 mM de cloruro de sodio, 5 mM de Na2EDTA, pH 6.5) se agregó a una concentración final de 45 mM y la reacción de desprotección se incubó a temperatura ambiente durante 135 minutos, produciendo el monoconjugado enlazador Lucentis 33b. La mezcla de Lucentis y monoconjugado de enlazador Lucentis 33b fue intercambiada a solución amortiguadora a 15 mM de ácido succínico, 100 mM de cloruro de sodio, 5 mM Na2EDTA, pH 4.0 y posteriormente concentrada a una concentración de 15 mg/mL. La solución de proteína se enfrió a 4°C y se agregó 1 molar equivalente de 25 mM de DTT en 15 mM de ácido succínico, 100 mM de cloruro de sodio, 5 mM de Na2EDTA, pH 4.0 con respecto al contenido total de Lucentis para extraer el protector Pys produciendo el monoconjugado de enlazador Lucentis 33c. La mezcla de Lucentis no modificado y el monoconjugado de enlazador Lucentis 33c fue cambiada de solución amortiguadora a ácido succínico 15 mM, cloruro de sodio 100 mM, Na2EDTA 5 M, pH 4.0 y posteriormente se concentró a una concentración de 28.7 mg/ml. El contenido de monoconjugado de enlazador Lucentis 33c en la mezcla fue de 15% de acuerdo a lo determinado mediante el ensayo de Ellman. 79.7 mg de la mezcla de Lucentis/monoconjugado de enlazador Lucentis 33c en ácido succínico 15 mM, cloruro de sodiolOO mM, Na2EDTA 5 mM, pH 4.0, se agregaron a 5.1 mg de perlas de hidrogel funcionalizadas con maleimida 5c, el pH se ajustó a pH 5 mediante la adición de ácido succínico 0.5 M, H 6.0 y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente produciendo un profármaco de hidrogel de enlazador Lucentis transitorio 33d. Los excesos de maleimidas fueron bloqueados mediante ocho pasos de incubación con 1 equivalente molar (con respecto al contenido de male imida de perlas de hidrogel funcionalizadas con maleimida 5c) 2-mercaptoetanol 1 mM en de ácido succínicol5 mM, cloruro de sodiolOO mM, Na2EDTA 5 mM, pH 4.0 por 15 min a temperatura ambiente. En el análisis de cinética de liberación in vitro para determinar la vida media in vitro de 33d se realizó de acuerdo con el Ejemplo 7. . . i Ejemplo 34 Síntesis del conjugado de cola de histidina de enlazador de Lucentis transitorio 34d 120 mg Lucentis (representado en el esquema de reacción siguiente como Lucentis-NH2) (3 mL de 40 mg/mL de Lucentis en histidina 10 mM, 10% en peso de a,a-trehalosa, Tween20 al 0.01%, pH 5.5) se cambió de solución amortiguadora a fosfato de sodio 60 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 7.4 y la concentración de Lucentis se ajustó a 20 mg/mL. El reactivo enlazador 14f (sólo se representó 1 regioisómero en el esquema de reacción siguiente) se disolvió en DMSO para producir una concentración de 100 mM. 2 equivalentes molares de reactivo enlazador 14f en relación con la cantidad de Lucentis se agregaron a la solución Lucentis. La mezcla de reacción se mezcló cuidadosamente y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se agregó 1 equivalente molar adicional del reactivo enlazador 14f.
La incubación adicional por 5 minutos a temperatura ambiente proporcionó una mezcla de Lucentis no modificado y el monoconj ugado de enlazador Lucentis protegido 34a. La incubación a temperatura ambiente durante 4 horas condujo a una conversión cuantitativa de monoconjugado de enlazador Lucentis 34a a monoconjugado de enlazador Lucentis 34b.
La mezcla de monoconjugado de Lucentis y enlazador Lucentis 34b se cambió de solución amortiguadora a ácido succínicol5 mM, cloruro de sodio 100 mM, Na2EDTA 5 mM, pH 4.0 y la concentración de proteína se ajustó a 11.8 mg/mL. La solución de proteína se enfrió a 4°C y se agregó 1 equivalente molar de DTT 25 mM en ácido succínico 15 mM, cloruro de sodio 100 mM, Na2EDTA 5 mM, pH 4.0 con respecto al contenido total de Lucentis para extraer el grupo protector Pys produciendo el monoconjugado de enlazador de Lucentis 34c. La mezcla de Lucentis no modificado y el monoconjugado de enlazador de Lucentis 34c se cambió de solución amortiguadora a ácido succínico 15 mM, cloruro de sodio 100 mM, Na2EDTA 5 mM, pH 4.0 y posteriormente se concentró a una concentración de 17.2 mg/mL.
A 106.5 mg de la mezcla de Lucentis/monoconjugado de enlazador de Lucentis 34c en ácido succínico 15 mM, cloruro de sodio 100 mM, Na2EDTA5 mM, pH 4.0, se le agregó 1 equivalente molar con respecto al contenido de Lucentis total de maleimida que contiene cola de histidina 21 y el pH se ajustó a un pH 5 mediante la adición de ácido succínico 0.5 M, pH 6.0. La incubación a temperatura ambiente durante 4.5 horas produjo el conjugado de cola de histidina enlazador de Lucentis 34d, el cual se purificó mediante cromatografía de intercambio catiónico del Lucentis y el exceso de maleimida que contiene cola de histidina 21 . l i - , i · Ej emplo 35 Determinación de cinética de liberación in vi tro de la vida media in vitro de los conjugados de cola de histidina transitorios El conjugado de cola de histidina de enlazador de Lucentis purificado por cromatografía de intercambio catiónico 34d se cambió de solución amortiguadora a fosfato de sodio 60 mM, Na2EDTA3 mM, Tween 20 al 0.01%, pH 7.4 y la concentración se ajustó a 1 mg/ml. Después de la incubación a 37°C por diferentes intervalos de tiempo, 200 mg de muestra de proteína se analizó mediante cromatografía de intercambio catiónico. La cantidad de Lucentis liberado se determinó mediante la comparación de las áreas pico del Lucentis liberado y conjugado de cola de histidina enlazador de Lucentis 34d y graficado contra el tiempo de incubación. Un softwate de ajuste de curva se aplicó para determinar los índices de división de primer orden.
Ejemplo 36 Síntesis y purificación del monocon jugado enlazador de Lucentis marcado transitorio 36b 400 mg de Lucentis (representado en el esquema de reacción siguiente como Lucent is-NH2 ) (10 mi de 40 mg/mL de Lucentis en 10 mM de histidina, 10% en peso de a,a-trehalosa , Tween 20 al 0.01%, pH 5.5) se cambió de solución amortiguadora a fosfato de sodio 60 mM, cloruro de sodio 100 mM , pH 7.4 y la concentración de Lucentis se ajustó a 20.8 mg/mL. El reactivo enlazador 17g se disolvió en DMSO para producir una concentración de 100 mM. Se agregaron 4.5 equivalentes molares de reactivo enlazador 17g con respecto a la cantidad de Lucentis, a la solución Lucentis. La mezcla de reacción se mezcló cuidadosamente y se incubó por 5 minutos a temperatura ambiente produciendo una mezcla de Lucentis no modificado y el monocon jugado enlazador de Lucentis marcado protegido 36a.
La mezcla del Lucentis y monocon jugado enlazador de Lucentis marcado protegido 36a se cambió de solución amortiguadora a fosfato de sodio60 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 6.5. Para extraer el grupo protector de oxocarbonilo de (5-meti1-2 -oxo-1 ,3-dioxol -i1)meti lo de 36a, se agregó NH2OH 0.5 M (disuelto en citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodiol40 mM, Na2EDTA5 mM , pH 6.5) a una concentración final de 45 mM y la reacción de desprotección se incubó a temperatura ambiente por 2.5 horas produciendo el monocon jugado enlazador de Lucentis marcado 36b el cual fue separado del Lucentis no modificado por cromatografía de intercambio cat iónico . . . - i . 36a Ej emplo 37 Síntesis del profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis 37a con el uso de procesos químicos de conjugación de tiol/disulfuro activado 61.5 mg de la mezcla de Lucent is/monoconj ugado enlazador de Lucentis 33b (c = 41 mg/mL) en ácido succínico 15 mM, cloruro de sodio 100 mM , Na2EDTA 5 mM, pH 4.0 se agregaron a 6.6 mg de perlas de hidrogel funcional izadas con tiol 29. La reacción de carga de hidrogel se incubó por 60 horas a 4°C seguido por 16 horas a temperatura ambiente produciendo el profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis transitorio 37a.
NH Lucentis Ej emplo 38 Síntesis del profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis 38a con el uso del proceso químico de conjugación de tiol/maleimida 10 mg de monoconjugado enlazador de Lucentis 34c en una concentración de 20 mg/mL se agregaron a 5 mg de hidrogel funeiona 1izado con maleimida 5c y la mezcla de reacción se incubo en un pH 5 y temperatura ambiente durante la noche produciendo el profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis transitorio 38a. Los excesos de maleimidas son bloqueados por ocho etapas de incubación con 1 equivalente molar (con respecto al contenido de maleimida de perlas de hidrogel funeional izadas con maleimida 5c) 2-mercaptoet anol 1 M en ácido succínico 15 mM , cloruro de sodio 100 mM, Na2EDTA5 mM , pH 4.0 por 15 min a temperatura ambiente Ejemplo 39 Síntesis de profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis transitorio 39a con el uso de un proceso químico de conjungación de tiol/disulfuro activado 50 mg de la mezcla de Lucentis/monoconjugado enlazador de Lucentis 34b en una concentración de Lucentis total de 40 mg/mL en ácido succínico 15 mM, cloruro de sodio 100 mM, NaaEDTA 5 mM, H 4.0 se agregaron a 5 mg de perlas de hidrogel funcionalizadas con tiol 29 y la mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante la noche produciendo el profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis transitorio 39a. El exceso de grupos tiol en el hidrogel se bloquean por incubación con 5 equivalentes molares (con respecto al contenido de tiol de perlas de hidrogel funcionalizado con tiol 29) solución de 31 1 mM en ácido succínico 15 mM, cloruro de sodio 100 mM, Na2EDTA 5 mM, pH 4.0 por 16 horas a temperatura ambiente. 39 NH Lucentis-^ Ej emplo 40 Síntesis del conjugado de cola de histidina enlazador de Lucentis transitorio 40a El conjugado de cola de histidina enlazador de Lucentis transitorio 40a se preparó de acuerdo con el Ejemplo 33 con el uso del reactivo enlazador 9c. En lugar del hidrogel funcionalizado con maleimida 5c se utilizó 1 equivalente molar con respecto al contenido de Lucentis total de la cola de histidina funcionalizada con maleimida 21.
, - Ejemplo 41 Síntesis del conjugado de cola de histidina enlazador de Lucentis transitorio 41a El conjugado de cola de histidina enlazador de Lucentis histidina transitorio 41a se preparó de acuerdo con el Ejemplo 34 con el uso del react i vo enlazador 13g Lucentis-'"'^ 41a Ejemplo 42 Sxntesos del profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis transitorio 42a El profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis transitorio se preparó de conformidad con el ejemplo 33 con el uso del reactivo enlazador 15b. Debido a la ausencia del grupo protector de oxocarbonilo del (5-me ti1-2-oxo -1,3-dioxol -i 1)-meti 10 no se realizó en un paso de desprotección de hidroxilamina asistida o A 42a Lucentis-'·''^ Ej emplo 43 Síntesis del profármaco de hidrogel de enlazador de Lucentis transitorio 43a El profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis transitorio 43a fue preparado de acuerdo con el Ejemplo 33 con el uso del reactivo enlazador 18i. hidrogel Tabla 1: Semividas de los profármacos de hidrogel enlazador de Lucentis sintetizados y conjugados de cola de histidina enlazador de Lucentis .
Ejemplo 44 Síntesis del profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis transitorio 44a 1147 mg de la mezcla de Lucent is/conj ugado enlazador de Lucentis 6b en fosfato de sodio 10 mM , cloruro de potasio2 .7 mM, cloruro de sodio 140 mM, Na2EDTA 5 mM, Tween 20 al 0.01%, pH 6.5 se agregaron a 153 mg de perlas de hidrogel funcional izadas con maleimida 5c y se incubó durante la noche a temperatura ambiente produciendo el prof ármaco de hidrogel enlazador de Lucent is t rans itorio 44a . , i Ej emplo 45 Evaluación de la afinidad de unión del Lucentis liberado del profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis 44a La concentración de unión de VEGF activo del Lucentis liberado del profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis 44a se midió en un sistema de resonancia de plasmón de superficie Biacore (Biacore T200, Farmacia, Piscataway, NJ). El VEGF se inmovilizó covalentemente sobre el chip de sensor dextran carboximetilatado (CM5) utilizando el kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare). La unión del Lucentis al VEGF se determinó mediante el monitoreo del cambio en las unidades de resonancia antes y después de la inyección por 180s. La concentración de unión de VEGF activo se determinó usando una curva de calibración estándar preparada a partir de una dilución serial del material de referencia de 5 mg/ml a 0.156 pg/ml . La proporción de esta concentración de unión activa por la concentración de proteína total se determinó mediante el ensayo Bradford o absorbancia UV-Vis proporciona la unión porcentual. Para el profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis 44a se mostró que el Lucentis liberado después de 28 días y después de más de 120 días mostró una unión de 80±10%.
Ejemplo 46 Medición y análisis de ranibizumab Para ambos grupos, un ensayo de unión de ligando calificado se diseño para medir las concentraciones de ranibizumab en una matriz vitrea de conejo. Para la calificación del profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis 44a, el hidrogel se determinó que no interfiere con la cuantificación de ranibizumab en todas las concentraciones probadas. El ensayo utilizó el VEGF-A humano recombinante para capturar el ranibizumab en muestras vitreas de conejo. El ranibizumab unido se detectó con el uso del F(ab')2 anti humano conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP), y se utilizó un sustrato de peroxidasa (TMB) para desarrollo de color. El nivel de fármaco se cuantificó con el uso de espectrofotomería de absorbancia utilizando un lector de microplacas. La concentración de ranibizumab en las muestras de estudio se calculó a partir de la curva estándar, y la concentración cuantificable mínima (MQC) en la matriz vitrea de conejo fue de 1.5 ng/ml. Las concentraciones vitreas fueron graficadas y analizadas utilizando en software MATLAB. Tabla 2: Concentraciones de ranibizumab (ng/mL) medidas en humor vitreo después de una dosis intravitreal de 0.5 mg/ojo Ranibizumab ojo izquierdo, R= ojo derecho 3: Concentraciones de ranibizumab (ng/mL) medidas en el humor vitreo seguido de una dosis intravitreal de mg/ojo del profármaco de hidrogel enlazador de Lucentis 44a.
L=ojo izquierdo, R= ojo derecho sin muestra en tubo LTR = más bajo que lo reportable ND=no determinado Abreviaciones Aq. Acuoso Asp aspartato Boc Terc-butiloxicarbonilo CIEC Cromatografía de intercambio de iones catióinico COMU 1-Ciano-2-etoxi-2-oxoetiledenaminooxi)dimetilamino morfolino-carbenio-hexafluorofosfato DBU l,8-diazabiciclo(5.4.0)undec-7-eno DCC diciclohexilcarbodiimida DCM diclorometano DIPEA diisopropiletilamine DMAP dimetilaminopiridina DMF dimetilformamida DMSO dimetilsulfoxido DTT ditiotreitol EDTA Ácido etilendiaminatetraacético Fmoc fluorenilmetiloxicarbonil HATU 1H-1,2,3-triazolo [4,5-b]piridinio-3-oxido hexafluorofosfato de 1-[Bis(dimetilamino)metileno] HFIP hexafluoroisopropanol HPLC Cromatografía líquida de alto rendimiento iPrOH isopropanol Lys lisina max . máximo Maleimide-NH-PEG 12-PFE pentafluorofenil ester del ácido N-(3-maleimidopropil)-39-amino-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-dodecaoxa-nonatriacontanoico Me metilo MeOAc acetate de metilo MeOH metanol MES ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico MMT 4-metoxitrifenilmetil MS espectrometría de masa MTBE metil-tert-butil eter NHS N-hidroxisuccinimida Oxima Pura 2-ciano-2-(hidroxiimino)acetato de etilo PEG polietilenglicol Pys 2-piridinasulfenilo PyBOP hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio RP-HPLC fase inversa - Cromatografía líquida de alto rendimiento RT tempeeratura ambiente sat. saturado Su N-hidroxusuccinimidilo tBu y t-Bu ter-butilo TAN 1,5,9-triazanonana TES trietilsilano TFA acido trifluoroacético THF tetrahidrofurano TLC Cromatografía de capa fina TMEDA N,N,N',N'-tetrametiletileno diamina Tmob 2,4,6-trimetoxibencilo Trt tritilo TSTU tetrafluoroborato de 0- (N-succinimidol ) -N, N, N' , N' -tetrametiluronio Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (26)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y un profármaco neutralizante de VEGF, el profármaco comprende un resto biológicamente activo neutralizante de VEGF unido covalentemente, para uso en un método para el tratamiento de una o más afecciones oculares.
2. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el profármaco neutralizante de VEGF es un profármaco ligado al portador.
3. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el portador del profármaco ligado al portador es un hidrogel.
4. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, caracterizada porque el portador es un hidrogel a base de PEG.
5. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el tratamiento comprende la administración intraocular del profármaco.
6. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la administración intraocular es a través de la inyección intraocular.
7. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el profármaco comprendido en la composición farmacéutica tiene una concentración de 5 hasta 200 mg de profármaco/ml de composición farmacéutica.
8. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque la composición comprende 8 hasta 80 por ciento en peso de VEGF neutralizantes resto biológicamente activo basado en el peso total del profármaco.
9. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizada porque la inyección se lleva a cabo con un volumen de inyección que se encuentra en el intervalo desde 10 hasta 200 ml por inyección.
10. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, caracterizada porque el período de tiempo entre dos administraciones intraoculares del profármaco neutralizante de VEGF es de por lo menos 1 mes.
11. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque el profármaco neutralizante de VEGF comprende en forma unida un resto biológicamente activo seleccionado del grupo de fármacos que consiste de ARN antisentido, ADN antisentido, ribozimas o moléculas de ARNi dirigidas a un ácido nucleico de VEGF; aptámeros anti-VEGF, anticuerpos anti-VEGF, fragmentos de anticuerpos anti-VEGF, DARPinas y señuelos de los receptores de VEGF solubles que impiden la unión de un VEGF a su receptor cognado; moléculas antisentido, ribozimas, y de ARNi dirigidas a un ácido nucleico del receptor de VEGF cognado (VEGFR); aptámeros anti-VEGFR o anticuerpos anti-VEGFR que se unen a un receptor VEGFR cognado; fragmentos de anticuerpos anti-VEGFR que se unen a un receptor de VEGFR cognado e inhibidores de tirosina cinasa de VEGFR.
12. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque el profármaco neutralizante de VEGF comprende en forma unida un resto biológicamente activo seleccionado del grupo que consiste de ranibizumab, bevacizumab, pegaptanib, aflibercept, MP0112, KH902, ESBA1008, AL 39324, ALG-1001, y bevasiranib y/o fragmentos de los mismos.
13. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque el profármaco neutralizante de VEGF comprende en forma unida ranibizumab.
14. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque el profármaco neutralizante de VEGF comprende un resto de la fórmula (F-i) en donde D es ranibizumad; la línea discontinua indica unión al portador o al portador separador opcional; X es C(R4R4a); N(R4); O; C(R4R4a)-C(R5R5a); C(R5R5a)- C(R4R4a); C(R4R4a)-N (R6); N(R6) -C(R4R4a); C(R4R4a)-0; o 0- C(R4R4a); X1 es C; O S (O); X2 es C(R7, R7a); O C(R7, R7a)-C(R8, R8a); R1, Rla, R2, R2a, R3, R3a, R4, R4a, R5, R5a, R6, R7, R7a, R8, R8a se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H; y alquilo Ci-4; opcionalmente, uno o más de los pares Rla/R4a, Rla/R5a, R4a/R5a, R4a/R5a, R7a/R8a forman un enlace químico; opcionalmente, uno o más de los pares de R1/Rla, R2/R2a, R4/R4a, R5/R5a, R7/R7a, R8/R8a están unidos junto con el átomo al que están unidos para formar un cicloalquilo C3-7, o heterociclilo de 4 a 7 miembros; opcionalmente, uno o más de los pares R1/R4, RVR5, R1/R6, R4/R5, R7/R8, R2/R3 están unidos juntos con los átomos a los que están unidos para formar un anillo A; opcionalmente, R3/R3a se unen junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos para formar un anillo heterociclo de 4 a 7 miembros; A se selecciona del grupo que consiste de fenilo; naftilo; indenilo; indanilo; tetralinilo; cicloalquilo C3-10; heterociclilo de 4 a 7 miembros; y heterobiciclilo de 8 a 11 miembros; opcionalmente el resto de la fórmula (F-i) está además sustituido, siempre que el hidrogel marcado con el asterisco en la fórmula (F-i) no sea sustituido por un sustituyente y que R3 y R3a sean independientemente uno de otro H o estén conectados a través de un átomo de carbono hibridizado SPN3.
15. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque X1 es C.
16. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, caracterizada porque el profármaco neutralizante de VEGF comprende un resto de la fórmula (F-ii): en donde la línea discontinua indica unión al portador R1, R1a, R2, R2a, R3, R3a, X2 y D se utilizan de conformidad con la reivindicación 14; R10 se selecciona de H y alquilo Ci-6,· SP° es un resto separador; y en donde el resto de la fórmula (F-ii) está opcionalmente sustituido adicionalmente, siempre que el hidrogel marcado con el asterisco en la fórmula (F-ii) no sea sustituido por un sustituyente y que R3 y R3a sean independientemente uno de otro H o estén conectados a N a través de un átomo de carbono hibridizado SP3.
17. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizada porque preferiblemente, R1 y Rla son ambos H.
18. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizada porque el profármaco neutralizante de VEGF comprende un resto de la fórmula (F-iiia) o (F-iiib): b), en donde la línea discontinua indica unión al portador; R2, R2a, R3, R3a, R7, R7a, R8, R8a, X2 y D se utilizan como se define en la reivindicación 14; R10 y SP° se utilizan como se define en la reivindicación 16; y en donde el resto de las fórmulas (F-iiia) o (F-iiiB) está opcionalmente sustituido adicionalmente, siempre que el hidrógeno marcado con el asterisco en las fórmulas (F-iiia) y (F-iiiB) no sea sustituido por un sustituyente y que R3 y R3a seann independientemente uno de otro H o están conectados a N través de un átomo de carbono SP3 hibridizado.
19. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizada porque el profármaco neutralizante de VEGF comprende un resto de la fórmula (F-iva) o (F-IVb): donde la línea discontinua indica unión al portador; R3 y R3a se utilizan como se define en la reivindicación R10b es alquilo Ci-6; y en donde el resto de la fórmula (F-iva) o (F-ivb) está opcionalmente sustituido adicionalmente, siempre que el hidrógeno marcado con el asterisco no sea sustituido por un sustituyente y y que R3 y R3a sean independientemente uno de otro H o están conectados a N través de un átomo de carbono SP3 hibridizado.
20. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, caracterizada porque R3 es H y R3a es metilo.
21. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, caracterizada porque R3 y R3a son ambos H.
22. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, caracterizada porque R3 es H y R3a es metilo.
23. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizada porque la afección ocular es una enfermedad caracterizada por la neovascularización ocular.
24. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la neovascularización intraocular es una enfermedad ocular seleccionada del grupo que consiste de neovascularización del disco óptico, neovascularización del iris, neovascularización retinal, neovascularización coroidea, neovascularización corneal, neovascularización vitrea, glaucoma, pannus, pterigión, edema macular, degeneración macular, degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética, isquemia retinal diabética, edema macular diabético, retinopatía vascular, degeneración retiniana, fibroplasia retrolental, retinoblastoma, retinopatía de la pre aturidad de la degeneración macular, neovascularización de injertos de la córnea, oclusión de la vena central de la retina (, miopía patológica, tumores oculares, uveítis, enfermedades inflamatorias del ojo, y vitreorretinopatía proliferativa.
25. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizada porque la composición farmacéutica comprende además uno o más fármacos en su forma libre seleccionada del grupo que consiste de ARN antisentido, ADN antisentido, ribozimas o moléculas de ARNi dirigidas a un ácido nucleico de VEGF; aptámeros anti-VEGF, anticuerpos anti-VEGF, fragmentos de anticuerpos anti-VEGF, DARPinas, anticalinas, lipocalinas, y señuelos de los receptores de VEGF solubles que impiden la unión de un VEGF a su receptor cognado; moléculas antisentido, ribozimas, y de ARNi dirigidas a un ácido nucleico del receptor de VEGF cognado (VEGFR); aptámeros anti-VEGFR o anticuerpos anti-VEGFR que se unen a un receptor VEGFR cognado; fragmentos de anticuerpos anti-VEGFR que se unen a un receptor VEGFR cognado e inhibidores de tirosina cinasa VEGFR.
26. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizada porque comprende además uno o más profármacos, en donde uno o más profármacos comprenden en forma unida un resto biológicamente activo seleccionado del grupo que consiste de ARN antisentido, ADN antisentido, ribozimas o moléculas de ARNi dirigidas a un ácido nucleico de VEGF; aptámeros anti-VEGF, anticuerpos anti-VEGF, fragmentos de anticuerpos anti-VEGF, DARPinas, anticalinas, lipocalinas, y señuelos de los receptores de VEGF solubles que impiden la unión de un VEGF a su receptor cognado; moléculas antisentido, ribozimas, y de ARNi dirigidas a un ácido nucleico del receptor de VEGF cognado (VEGFR); aptámeros anti-VEGFR o anticuerpos anti-VEGFR que se unen a un receptor VEGFR cognado; fragmentos de anticuerpos anti-VEGFR que se unen a un receptor VEGFR cognado e inhibidores de tirosina cinasa VEGFR.
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