CN104755103A - 用于治疗眼病症的中和vegf的前药 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用在治疗一种或多种眼病症的方法中的药物组合物，其包含一种或多种药学上可接受的赋形剂和中和VEGF的前药，所述中和VEGF的前药包含中和VEGF的生物学活性原子团。
Description
本发明涉及用在治疗一种或多种眼病症的方法中的药物组合物。
失明的主要原因是不能充分地治疗某些眼疾病。主要局限在于缺乏适合的将药物或治疗剂导入眼并且将这些药物或治疗剂在其中维持在治疗有效浓度达必需期限的选择。全身施用可能并不是理想的解决方案，因为达到有效眼内浓度通常需要不可接受的高水平的全身给药，伴有增加的不可接受的药物副作用发生率。简单的眼滴注或应用在许多情况中并非可接受的选择，因为药物可能被眼泪-作用快速洗脱掉或从眼内耗尽进入体循环。局部滴眼液疗法受限于吸收差、需要在数日到数年时间中频繁和/或长期给药、房水快速更新、泪膜产生和运动以及其它原因，它们在疗法完成或递送适合的剂量前很长时间就有效地除去了治疗剂。
眼内注射具有优点：相对于其它递送机制例如局部递送它们提供对眼的靶部位(例如视网膜)提高的生物利用度。然而，它们也具有缺点且可能呈现各种不同的并发症。例如，玻璃体内注射可导致向靶部位或其它部位递送不期望的高浓度的治疗剂，特别是当治疗剂溶解度较好时。此外，眼内注射对于患者而言是非常令人不愉快的。此外，当眼内注射本身可能导致并发症例如眼内炎和视网膜脱离时，在注射之间具有最长可能时间、同时在眼内保持药物的治疗水平是非常符合需要的。
除了上述内容以外，通过玻璃体内注射递送的治疗剂还缺乏作用持续时间，因为这些治疗剂在注射后常常在眼内迅速分散。所述的持续时间的缺乏是特别不期望的，因为它会使得更大的注射频率变得必要。例如，雷珠单抗和培加他尼分别通过每4和6周眼内注射一次被施用于患者，对于患者而言这是非常令人不愉快的经历。
因此，眼科领域将受益于更长效的制剂是广泛公认的。它们通过向眼提供延长递送的治疗剂、同时将与患者对开具的治疗医学方案的依从性相关的问题最小化而有益于患者护理和眼健康。
血管内皮生长因子(VEGF)(细胞产生的一种刺激血管发生和血管生成的信号蛋白)的表达在各种眼病症中、例如在某些形式的黄斑变性和视网膜病变中发挥重要作用。
市场上有治疗这类眼病症的多种药物，例如雷珠单抗、阿柏西普(aflibercept)和培加他尼。通过每4和8周眼内注射一次应用于患者。
鉴于上述情况，对于提供至少部分克服这些缺点的施用形式存在需求。
用在治疗一种或多种眼病症的方法中的包含一种或多种药学上可接受的赋形剂和中和VEGF的前药(VEGF neutralizing prodrug)的药物组合物实现了这一目的，所述前药包含共价结合的中和VEGF的生物学活性原子团(moiety)。
在本发明中，术语以如下含义使用。
本文所用的术语“中和VEGF的药物”意指通过中和血管内皮生长因子(VEGF)的作用显示其药学作用的药物。VEGF的作用可以被与VEGF受体结合或与VEGF本身结合、由此阻断或减少VEGF与其受体的有效结合的药物中和。或者，可以通过抑制或干扰VEGF的表达和产生或者干扰VEGF信号发放获得所述中和作用。
本文所用的术语“水凝胶”意指由均聚物或共聚物构成的亲水性或两亲性聚合网状结构，其是不可溶的，原因在于存在共价化学交联。这些交联提供了网状结构和物理完整性。水凝胶显示与水的热力学相容性，这允许它们在水性介质中溶胀。
本文所用的术语“试剂”意指包含与另一种官能团反应的官能团的化学化合物。
本文所用的术语“骨架试剂”意指适合作为用于形成水凝胶的起始材料的试剂。本文所用的骨架试剂优选不包含生物可降解的键。
本文所用的术语“交联剂试剂”意指适合作为用于交联骨架试剂的起始材料的直链或支链试剂。优选地，交联剂试剂是直链化学化合物。本文所用的交联剂试剂包含至少一个生物可降解的键。
本文所用的术语“原子团”意指分子的一部分，与相应的试剂相比其缺少一个或多个原子。例如，如果式“H-X-H”的试剂与另一种试剂反应，变成了反应产物的一部分，则反应产物的相应原子团具有结构“H–X–”或“–X–”，而每个“–”表示与另一个原子团连接。
因此，措词“结合形式的”用于指试剂的相应原子团，即“结合形式的赖氨酸”是指缺少赖氨酸试剂的一个或多个原子并且是分子的一部分的赖氨酸原子团。
本文所用的术语“官能团”意指能与其它官能团反应的一组原子。官能团包括、但不限于以下基团：羧酸(–(C＝O)OH)或其活化形式，如羧酸酯或酰卤；伯胺或仲胺(–NH2、–NH–)；马来酰亚胺；硫羟基(–SH)；磺酸(–(O＝S＝O)OH)；碳酸酯；氨基甲酸酯(–O(C＝O)N<)；羟基(–OH)；醛(–(C＝O)H)；酮(–(C＝O)–)；肼(>N-N<)；异氰酸酯；异硫氰酸酯；磷酸(–O(P＝O)OHOH)；膦酸(–O(P＝O)OHH)；卤代乙酰基；烷基卤；丙烯酰；芳基氟；羟基胺；二硫化物；乙烯基砜；乙烯基酮；重氮烷；环氧乙烷；和氮丙啶。
如果一个官能团与另一个官能团偶联，则得到的结构称作“键”。例如，胺基团与羧基反应得到酰胺键。
本文所用的术语“活化的官能团”意指与活化基团连接的官能团。优选的活化的官能团包括、但不限于活化的酯基、活化的氨基甲酸酯基、活化的碳酸酯基和硫代碳酸酯基。
本文所用的术语“封端基团”意指不可逆地、即永久地与官能团连接、从而使其不能与其它试剂或原子团的官能团反应的原子团。
本文所用的术语“聚合物”意指包含以线型、环状、支链、交联或树枝状方式或其组合通过化学键连接的重复结构单元(即单体)的分子，其可以具有合成来源或生物来源或这二者的组合。应当理解的是，聚合物也可以例如包含官能团或封端原子团。优选地，聚合物具有至少0.5kDa的分子量，例如至少1kDa的分子量，至少2kDa的分子量，至少3kDa的分子量或至少5kDa的分子量。
本文所用的术语“聚合的”意指包含一种或多种聚合物的试剂或原子团。
本文所用的术语“数均分子量”意指各聚合物的分子量的一般算术平均值。本领域技术人员理解，由聚合反应获得的聚合产物并非全部具有相同的分子量，而是显示分子量分布。因此，本文所用的聚合物的分子量范围、分子量、单体数量范围和聚合物中的单体数量是指数均分子量和单体数量平均值。
本文所用的术语“聚合”意指化学反应中单体或大分子单体(macromonomer)试剂反应形成聚合物链或网状结构(包括、但不限于水凝胶)的过程。
本文所用的术语“大分子单体”意指由单体试剂聚合获得的分子。
本文所用的术语“缩聚”或“缩合反应”意指其中两种试剂的官能团反应形成一种单一分子(即，反应产物)并且释放低分子量分子例如水的化学反应。
本文所用的术语“悬浮聚合”意指非均质和/或双相聚合反应，其中单体试剂被溶于溶剂A，形成分散相，其被乳化在形成连续相的溶剂B中。在本发明中，单体试剂是骨架试剂和交联剂试剂。溶剂A和单体试剂二者均不溶于溶剂B。这类乳剂通过搅拌、振摇、暴露于超声或MicrosieveTM乳化、更优选地通过搅拌或MicrosieveTM乳化、更优选地通过搅拌形成。该乳剂被适宜的乳化剂稳定化。聚合是通过加入在溶剂A中可溶的引发剂来引发的。适合的常见的引发剂可以是叔碱，例如四甲基乙二胺(TMEDA)。
本文所用的术语“惰性的”是指不具有化学反应性的原子团，即，它不与其它原子团或试剂反应。本领域技术人员理解，术语“惰性的”本身不排除官能团的存在，而应理解为惰性原子团中可能存在的官能团不与例如在随后的反应中接触所述惰性原子团的原子团/试剂的官能团反应。特定地，惰性原子团Z不与Ax0或Ax2或与例如可逆前药连接基试剂、药物、可逆前药连接基原子团-生物学活性原子团缀合试剂或间隔基试剂中存在的官能团反应，所述可逆前药连接基试剂、药物、可逆前药连接基原子团-生物学活性原子团缀合试剂或间隔基试剂可以与本发明的水凝胶共价缀合，得到本发明的水凝胶-连接的前药。
本文所用的术语“不混溶的”意指这样的性质，其中两种物质不能合并形成均质的混合物。
本文所用的术语“聚胺”意指包含多于一个胺基团(-NH-或-NH2)、例如2－64个胺基团、4－48个胺基团、6－32个胺基团、8－24个胺基团、10－16个胺基团的试剂或原子团。特别优选的聚胺包含2－32个胺基团。
本文所用的与原子团或试剂有关的术语“基于PEG的，包含至少X％PEG”意指所述的原子团或试剂包含至少X％(w/w)乙二醇单元(–CH2CH2O–)，其中所述乙二醇单元可以分块(blockwise)、交替排列或者可以随机分布在所述原子团或试剂内，优选地所述原子团或试剂的所有乙二醇单元均存在于一个块中；基于PEG的原子团或试剂的其余重量百分比是其它原子团，其尤其选自以下取代基和键：
●C1-50烷基、C2-50烯基、C2-50炔基、C3-10环烷基、4－7元杂环基、8－11元杂二环基、苯基；萘基；茚基；茚满基；和四氢萘基(tetralinyl)；
和
●选自以下的键：
其中
虚线表示与分子、原子团或试剂的其余部分连接，且
R1和R1a彼此独立地选自H和C1-6烷基。
本文所用的单独或组合使用的术语“C1-4烷基”意指具有1－4个碳原子的直链或支链烷基。如果存在于分子的末端，则直链或直链C1-4烷基的实例是甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正-丁基、异丁基、仲-丁基和叔-丁基。当分子的两个原子团通过C1-4烷基连接时，则所述C1-4烷基的实例是-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-、-C(CH3)2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-和-CH2-CH2-CH2(CH3)-。C1-4烷基的每个氢原子可以被下文所定义的取代基替代。
本文所用的单独或组合使用的术语“C1-6烷基”意指具有1－6个碳原子的直链或支链烷基。如果存在于分子的末端，则直链或直链C1-6烷基的实例是甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正-丁基、异丁基、仲-丁基、叔-丁基、正-戊基、2-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、正-己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基和3,3-二甲基丙基。当分子的连个原子团通过C1-6烷基连接时，则所述C1-6烷基的实例是-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-和-C(CH3)2-。C1-6烷基的每个氢原子可以被下文所定义的取代基替代。
因此，本文所用的单独或组合使用的术语“C1-20烷基”意指具有1－20个碳原子的直链或支链烷基。单独或组合使用的术语“C8-18烷基”意指具有8－18个碳原子的直链或支链烷基。因此，本文所用的单独或组合使用的术语“C1-50烷基”意指具有1－50个碳原子的直链或支链烷基。C1-20烷基、C8-18烷基和C1-50烷基的每个氢原子可以被取代基替代。在每种情况中，烷基可以存在于分子末端，或者分子的两个原子团可以通过烷基连接。
本文所用的单独或组合使用的术语“C2-6烯基”意指包含至少一个碳-碳双键的具有2－6个碳原子的直链或支链烃原子团。如果存在于分子末端上，则实例是-CH＝CH2、-CH＝CH-CH3、-CH2-CH＝CH2、-CH＝CHCH2-CH3和-CH＝CH-CH＝CH2。当分子的两个原子团通过C2-6烯基连接时，则所述C2-6烯基的实例是-CH＝CH-。C2-6烯基的每个氢原子可以被下文所定义的取代基替代。任选地，可以存在一个或多个三键。
因此，本文所用的单独或组合使用的术语“C2-20烯基”意指包含至少一个碳-碳双键的具有2－20个碳原子的直链或支链烃基。单独或组合使用的术语“C2-50烯基”意指包含至少一个碳-碳双键的具有2－50个碳原子的直链或支链烃基。如果存在于分子末端，则实例是-CH＝CH2、-CH＝CH-CH3、-CH2-CH＝CH2、-CH＝CHCH2-CH3和-CH＝CH-CH＝CH2。当分子的两个原子团通过烯基连接时，则实例是例如-CH＝CH-。C2-20烯基或C2-50烯基的每个氢原子可以被下文所定义的取代基替代。任选地，可以存在一个或多个三键。
本文所用的单独或组合使用的术语“C2-6炔基”意指包含至少一个碳-碳三键的具有2－6个碳原子的直链或支链烃基。如果存在于分子末端，则实例是-C≡CH、-CH2-C≡CH、CH2-CH2-C≡CH和CH2-C≡C-CH3。当分子的两个原子团通过炔基连接时，则实例是：-C≡C-。C2-6炔基的每个氢原子可以被下文所定义的取代基替代。任选地，可以存在一个或多个双键。
因此，本文所用的单独或组合使用的术语“C2-20炔基”意指包含至少一个碳-碳三键的具有2－20个碳原子的直链或支链烃基，单独或组合使用的术语“C2-50炔基”意指包含至少一个碳-碳三键的具有2－50个碳原子的直链或支链烃基。如果存在于分子末端，则实例是-C≡CH、-CH2-C≡CH、CH2-CH2-C≡CH和CH2-C≡C-CH3。当分子的两个原子团通过炔基连接时，则实例是-C≡C-。C2-20炔基或C2-50炔基的每个氢原子可以被下文所定义的取代基替代。任选地，可以存在一个或多个双键。
本文所用的术语“C3-7环烷基”或“C3-7环烷基环”意指具有3－7个碳原子的环状烷基链，其可以是饱和的或不饱和的，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、环庚基。环烷基碳的每个氢原子可以被下文所定义的取代基替代，术语“C3-7环烷基”或“C3-7环烷基环”还包括桥连二环，如降冰片烷(norbonane)或降冰片烯(norbonene)。因此，“C3-5环烷基”意指具有3－5个碳原子的环烷基，“C3-10环烷基”意指具有3－10个碳原子的环烷基。
因此，本文所用的术语“C3-10环烷基”意指具有3－10个碳原子的碳环环系，其可以是饱和的或不饱和的，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基。术语“C3-10环烷基”还包括至少部分饱和的碳环单环和碳环二环。
本文所用的术语“卤素”意指氟、氯、溴或碘。特别优选的是氟或氯。
本文所用的术语“4－7元杂环基”或“4－7元杂环”意指具有4、5、6或7个环原子的环，其可以含有至多为最大数量的双键(芳族环或者完全饱和的、部分饱和的或不饱和的非芳族环)，其中至少一个环原子至多4个环原子被选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括＝N(O)-)的杂原子替代，且其中所述环通过碳或氮原子与分子的其余部分连接。4－7元杂环的实例包括、但不限于氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、呋喃、噻吩、吡咯、吡咯啉、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、唑、唑啉、异唑、异唑啉、噻唑、噻唑啉、异噻唑、异噻唑啉、噻二唑、噻二唑啉、四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、唑烷、异唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、噻二唑烷、环丁砜、吡喃、二氢吡喃、四氢吡喃、咪唑烷、吡啶、哒嗪、吡嗪、嘧啶、哌嗪、哌啶、吗啉、四唑、三唑、三唑烷、四唑烷、二氮杂环庚烷、氮杂和高哌嗪(homopiperazine)。4－7元杂环基或4－7元杂环基团的每个氢原子可以被下文所定义的取代基替代。
本文所用的术语“8－11元杂二环基”或“8－11元杂二环”意指具有8－11个环原子的两个环的杂环系，其中至少一个环原子被两个环共有，且其可以含有至多为最大数量的双键(芳族环或者完全饱和的、部分饱和的或不饱和的非芳族环)，其中至少一个环原子至多6个环原子被选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括＝N(O)-)的杂原子替代，且其中所述环通过碳或氮原子与分子的其余部分连接。8－11元杂二环的实例是吲哚、二氢吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并唑、苯并异唑、苯并噻唑、苯并异噻唑、苯并咪唑、苯并咪唑啉、喹啉、喹唑啉、二氢喹唑啉、喹啉、二氢喹啉、四氢喹啉、十氢喹啉、异喹啉、十氢异喹啉、四氢异喹啉、二氢异喹啉、苯并氮杂嘌呤和蝶啶。术语8－11元杂二环还包括两个环的螺结构，如1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷，或桥连杂环，如8-氮杂-二环[3.2.1]辛烷。8－11元杂二环基或8－11元杂二环的碳的每个氢原子可以被下文所定义的取代基替代。
术语“取代”意指分子的一个或多个–H原子被不同的原子或一组原子替代，所述的原子或一组原子被称作“取代基”。适合的取代基选自：卤素；CN；COOR9；OR9；C(O)R9；C(O)N(R9R9a)；S(O)2N(R9R9a)；S(O)N(R9R9a)；S(O)2R9；S(O)R9；N(R9)S(O)2N(R9aR9b)；SR9；N(R9R9a)；NO2；OC(O)R9；N(R9)C(O)R9a；N(R9)S(O)2R9a；N(R9)S(O)R9a；N(R9)C(O)OR9a；N(R9)C(O)N(R9aR9b)；OC(O)N(R9R9a)；T；C1-50烷基；C2-50烯基；或C2-50炔基，其中T；C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选地被一个或多个相同或不同的R10取代，且其中C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选地被一个或多个选自以下的基团中断：T、-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(R11)-；-S(O)2N(R11)-；-S(O)N(R11)-；-S(O)2-；-S(O)-；-N(R11)S(O)2N(R11a)-；-S-；-N(R11)-；-OC(O)R11；-N(R11)C(O)-；-N(R11)S(O)2-；-N(R11)S(O)-；-N(R11)C(O)O-；-N(R11)C(O)N(R11a)-；和-OC(O)N(R11R11a)；
其中
R9、R9a、R9b独立地选自H；T；和C1-50烷基；C2-50烯基；或C2-50炔基，其中T；C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选地被一个或多个相同或不同的R10取代，且其中C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选地被一个或多个选自以下的基团中断：T、-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(R11)-；-S(O)2N(R11)-；-S(O)N(R11)-；-S(O)2-；-S(O)-；-N(R11)S(O)2N(R11a)-；-S-；-N(R11)-；-OC(O)R11；-N(R11)C(O)-；-N(R11)S(O)2-；-N(R11)S(O)-；-N(R11)C(O)O-；-N(R11)C(O)N(R11a)-；和-OC(O)N(R11R11a)；
T选自苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢萘基；C3-10环烷基；4－7元杂环基；或8－11元杂二环基，其中T任选地被一个或多个相同或不同的R10取代；
R10是卤素；CN；氧代(＝O)；COOR12；OR12；C(O)R12；C(O)N(R12R12a)；S(O)2N(R12R12a)；S(O)N(R12R12a)；S(O)2R12；S(O)R12；N(R12)S(O)2N(R12aR12b)；SR12；N(R12R12a)；NO2；OC(O)R12；N(R12)C(O)R12a；N(R12)S(O)2R12a；N(R12)S(O)R12a；N(R12)C(O)OR12a；N(R12)C(O)N(R12aR12b)；OC(O)N(R12R12a)；或C1-6烷基，其中C1-6烷基任选地被一个或多个相同或不同的卤素取代；
R11、R11a、R12、R12a、R12b独立地选自H；或C1-6烷基，其中C1-6烷基任选地被一个或多个相同或不同的卤素取代。
在一个实施方案中，R9、R9a、R9b可以彼此独立地是H。
在一个实施方案中，R10是C1-6烷基。
在一个实施方案中，T是苯基。
本文所用的术语“中断”意指在两个碳原子之间或在碳链末端各碳原子与氢原子之间插入一个或多个原子。
本文所用的术语“前药”意指在显示出其药理学作用前进行生物转化的化合物。因此前药可以被视为与专门的无毒性的保护基连接的生物学活性原子团，所述保护基以临时方式用于改变或消除母体分子中不期望的性质。这还包括增强药物的符合需要的性质和抑制不符合需要的特性。
本文所用的术语“载体连接的前药”意指含有生物学活性原子团与临时性载体基团的暂时连接的前药，所述临时性载体基团产生改善的物理化学或药动学性质，且可被容易地在体内除去，通常通过水解裂解在体内被除去。在将这类载体连接的前药施用于哺乳动物、优选人后，药物分子被释放。因此，载体连接的前药包含生物学活性原子团、可逆的前药连接基原子团和载体基团，其中所述的生物学活性原子团通过可逆的前药连接基可逆地连接至载体基团。应当理解的是，生物学活性原子团可逆地共价连接至可逆的前药连接基，该可逆的前药连接基共价连接至载体基团。优选地，可逆的前药连接基与载体基团之间的键是稳定的共价键。
本文所用的术语“可逆的前药连接基原子团”意指这样的原子团，其在其一端通过可逆的键连接至生物学活性原子团D，即中和VEGF的生物学活性原子团，且在另一端通过永久的键连接至载体，由此将中和VEGF的生物学活性原子团连接至载体上。所述的可逆的前药连接基是在生理条件下(pH 7.4的缓冲水溶液，37℃)非酶促水解可降解的、即可裂解的，其半衰期为例如1小时至12个月。可逆的键是例如乌头酰基(aconityl)、缩醛、酰胺、羧酸酐、酯、亚胺、腙、马来酰胺酸酰胺、原酸酯、磷酰胺、磷酸酯、磷酸硅烷基酯(phosphosilyl ester)、硅烷基酯、磺酸酯、芳族氨基甲酸酯及其组合。
相反，永久的键是在生理条件下(pH 7.4的缓冲水溶液，37℃)非酶粗水解不可降解的，其半衰期超过12个月。
本文所用的术语“无痕前药连接基原子团”意指可逆的前药连接基原子团，裂解时其释放游离形式的药物。本文所用的术语“游离形式”的药物意指其未经修饰的药理学活性形式的药物。
本文所用的术语“肽”意指通过肽键连接的氨基酸单体的短聚合物。术语“多肽”意指包含至多50个(且包括50个)氨基酸单体的肽。术语“蛋白质”意指超过50个氨基酸单体的肽。
本文所用的术语“药物组合物”意指一种或多种活性成分和一种或多种惰性成分以及直接或间接由所述成分的任意两种或更多种的混合、复合或聚集所得到的或由所述成分的一种或多种的分离所得到的或由所述成分的一种或多种的其它类型的反应或相互作用所得到的任意产品。因此，本发明的药物组合物包括通过混合中和VEGF的前药和一种或多种药学上可接受的赋形剂制成的任意组合物。
本文所用的术语“赋形剂”是指与治疗剂、即中和VEGF的前药一起施用的稀释剂、佐剂(adjuvant)或介质。所述的药物赋形剂可以是：水；动物、植物或合成来源的油和石油，包括、但不限于花生油、豆油、矿物油、芝麻油等；淀粉；葡萄糖；乳糖；蔗糖；甘露醇；海藻糖；明胶；麦芽；稻；面粉；白垩；硅胶；硬脂酸钠；单硬脂酸甘油酯；滑石粉；氯化钠；脱脂奶粉；甘油；丙二醇；乙醇；乙酸酯或盐；琥珀酸酯或盐；tris；碳酸酯或盐；磷酸酯或盐；HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)；MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)；泊洛沙姆；泊洛沙胺(poloxamine)；CHAPS；氨基酸，例如甘氨酸、赖氨酸或组氨酸；甘油三酯；甘露醇；乳糖；淀粉；硬脂酸镁；糖精钠；纤维素；和碳酸镁。适合的药物赋形剂的实例描述在E.W.Martin的"Remington's Pharmaceutical Sciences"中。制剂应与施用方式相适应。
本文所用的术语“药学上可接受的”意指经管理部门例如EMA(欧洲)和/或FDA(美国)和/或任何其它国家的管理部门批准用于动物、优选用于人的分子或试剂。
本文所用的术语“眼内注射”意指注射入眼的房水(前房或后房)、玻璃体、晶状体或脉络膜周隙。
一般而言，术语“包含”、“含有”或“包括”也涵盖了“由…组成”。
本文所用的术语“蛋白质X活性的调节剂”是指为蛋白质X的激动剂、拮抗剂或者以其它方式中和或增强蛋白质X的活性的分子。
本发明涉及用在治疗一种或多种眼病症的方法中的药物组合物，其包含一种或多种药学上可接受的赋形剂和中和VEGF的前药，所述前药包含共价结合的中和VEGF的生物学活性原子团。
在一个优选的实施方案中，包含中和VEGF的前药的药物组合物被眼内施用，优选地通过眼内注射被眼内施用。
在一个优选的实施方案中，中和VEGF的前药的两次眼内施用之间的时间期限是至少一个月，例如中和VEGF的前药的两次眼内施用之间的时间期限是至少一个月、或至少5周、或至少6周、或至少8周、或至少10周、或至少12周、或至少16周、或至少20周、或至少24周、或至少28周、或至少32周、或至少36周、或至少40周、或至少44周、或至少48周。两次眼内施用之间的最长期限优选地是不超过4年，例如不超过3年、不超过2年或不超过1年。优选地，每2－12个月施用一次、更优选地每4－10个月施用一次、最优选地每6个月施用一次包含中和VEGF的前药的药物组合物。
因此，本发明的一个优选的方面是药物组合物，其中所述药物组合物中包含的前药具有5－200mg前药/ml药物组合物的浓度、例如5－180mg前药/ml药物组合物的浓度、10－170mg前药/ml药物组合物的浓度、15－160mg前药/ml药物组合物的浓度、20－150mg前药/ml药物组合物的浓度、25－140mg前药/ml药物组合物的浓度、30－130mg前药/ml药物组合物的浓度、40－120mg前药/ml药物组合物的浓度、50－110mg前药/ml药物组合物的浓度、或60－100mg前药/ml药物组合物的浓度。
在一个实施方案中，所述药物组合物包含占前药总重量的5－80重量％的中和VEGF的生物学活性原子团，例如占前药总重量的10－70重量％的中和VEGF的生物学活性原子团、占前药总重量的15－65重量％的中和VEGF的生物学活性原子团、占前药总重量的20－65重量％的中和VEGF的生物学活性原子团、或占前药总重量的30－65重量％的中和VEGF的生物学活性原子团。
在一个实施方案中，注射是使用10－200μl、例如15－150μl、20－100μl、30－80μl或40－70μl的注射体积进行的。优选地，注射体积是50μl。
所述的中和VEGF的前药优选地是载体连接的前药。
在所述的中和VEGF的前药中，包括药物和载体的不同化学计量。
在一个实施方案中，一种中和VEGF的生物学活性原子团通过一种可逆的前药连接基原子团与一种载体原子团连接。中和VEGF的生物学活性原子团与可逆的前药连接基原子团的连接通过相应药物的官能团进行。任选地，在载体原子团与可逆的前药连接基原子团之间存在间隔基原子团。
在另一个实施方案中，中和VEGF的生物学活性原子团通过所述的中和VEGF的生物学活性原子团的超过一种的官能团与超过一种的可逆的前药连接基原子团连接。所述的超过一种的可逆的前药连接基原子团中的每一种与不同的载体原子团连接，任选地通过间隔基原子团与不同的载体原子团连接。因此，在该实施方案中，一种中和VEGF的生物学活性原子团与超过一种的载体原子团连接。
在另一个实施方案中，一种载体原子团直接与超过一种的可逆的前药连接基原子团连接或者通过任选的间隔基原子团与超过一种的可逆的前药连接基原子团连接。所述的可逆的前药连接基原子团的每一种与一种或多种、优选一种中和VEGF的生物学活性原子团连接。
在一个实施方案中，所述载体是可溶性载体。优选地，所述可溶性载体包含至少一种聚合物，其选自包括以下聚合物的聚合物组：聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸酯)、聚(丙烯酰胺)、聚(烷氧)聚合物、聚(酰胺)、聚(酰氨基胺)(poly(amidoamines))、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(天冬酰胺)(poly(aspartamides))、聚(丁酸)、聚(己内酯)、聚(碳酸酯)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(二甲基丙烯酰胺)、聚(酯)、聚(乙烯)、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(乙基唑啉)、聚(乙醇酸)、聚(丙烯酸羟乙酯)、聚(羟乙基唑啉)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)(poly(hydroxypropylmethacrylamide))、聚(甲基丙烯酸羟丙酯)、聚(羟丙基唑啉)、聚(亚胺基碳酸酯)(poly(iminocarbonates))、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(poly(N-isopropylacrylamide))、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(poly(lactic-co-glycolic acid))、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基唑啉)、聚(富马酸丙二酯)、聚(有机磷氰)、聚(原酸酯)、聚(唑啉)、聚(丙二醇)、聚(硅氧烷)、聚(氨基甲酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基胺)、聚(乙烯基甲基醚)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、硅氧烷、核糖核酸、脱氧核酸(desoxynucleic acid)、白蛋白、抗体及其片段、血浆蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、成束蛋白(fascin)、纤维蛋白、角蛋白、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、谷醇溶蛋白、转铁蛋白、细胞色素、黄素蛋白、糖蛋白、血红素蛋白、脂蛋白、金属蛋白、植物光敏素、磷蛋白、视蛋白、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖、角叉菜胶、纤维素、羧甲基纤维素(carbomethyl cellulose)、羟丙基甲基纤维素和其它基于碳水化合物的聚合物、脱乙酰壳多糖、葡聚糖、糊精、明胶、透明质酸及其衍生物、甘露聚糖、果胶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖、淀粉、羟烷基淀粉、木聚糖、以及其共聚物和官能化的衍生物。
在另一个实施方案中，所述载体是不溶性载体，更优选地，载体连接的前药的载体是水凝胶。
优选地，中和VEGF的前药的水凝胶是生物可降解的水凝胶。
所述水凝胶包含至少一种聚合物，其优选选自包括以下聚合物的聚合物组：聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸酯)、聚(丙烯酰胺)、聚(烷氧)聚合物、聚(酰胺)、聚(酰氨基胺)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(天冬酰胺)、聚(丁酸)、聚(己内酯)、聚(碳酸酯)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(二甲基丙烯酰胺)、聚(酯)、聚(乙烯)、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(乙基唑啉)、聚(乙醇酸)、聚(丙烯酸羟乙酯)、聚(羟乙基唑啉)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸羟丙酯)、聚(羟丙基唑啉)、聚(亚胺基碳酸酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基唑啉)、聚(富马酸丙二酯)、聚(有机磷氰)、聚(原酸酯)、聚(唑啉)、聚(丙二醇)、聚(硅氧烷)、聚(氨基甲酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基胺)、聚(乙烯基甲基醚)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、硅氧烷、核糖核酸、脱氧核酸、白蛋白、抗体及其片段、血浆蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、成束蛋白、纤维蛋白、角蛋白、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、谷醇溶蛋白、转铁蛋白、细胞色素、黄素蛋白、糖蛋白、血红素蛋白、脂蛋白、金属蛋白、植物光敏素、磷蛋白、视蛋白、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖、角叉菜胶、纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和其它基于碳水化合物的聚合物、脱乙酰壳多糖、葡聚糖、糊精、明胶、透明质酸及其衍生物、甘露聚糖、果胶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖、淀粉、羟烷基淀粉、木聚糖、以及其共聚物和官能化的衍生物。
优选地，中和VEGF的前药的水凝胶是基于生物可降解的聚(乙二醇)(PEG)的水凝胶，其包含至少10％PEG，更优选包含至少20％PEG，最优选包含30％PEG。
中和VEGF的前药的水凝胶是成形的制品(shaped article)，优选是微粒形状的。更优选地，水凝胶是微粒珠形状的。甚至更优选地，所述的微粒珠具有1－1000μm的直径、更优选5－500μm的直径、更优选10－100μm的直径、更优选20－100μm的直径、甚至更优选20－80μm的直径。珠直径是在将微粒珠混悬在等张(isotonic)缓冲水溶液中时测定的。
中和VEGF的前药的水凝胶优选是WO2006/003014A2和WO2011/012715A1中公开的水凝胶，通过引用将这两篇文献完整地包括在本文中。
甚至更优选地，中和VEGF的前药的水凝胶是通过包括以下步骤的方法获得的水凝胶：
(a)提供一种混合物，其包含：
(a-i)至少一种骨架试剂，其中所述的至少一种骨架试剂具有1－100 kDa的分子量，且包含至少三个胺(-NH2和/或-NH-)；
(a-ii)至少一种交联剂试剂，其中所述的至少一种交联剂试剂具有6－40kDa的分子量，所述的至少一种交联剂试剂包含：
(i)至少两个羰基氧基(–(C＝O)–O–或–O–(C＝O)–)，并且还有
(ii)至少两个活化的末端官能团，其选自活化的酯基、活化的氨基甲酸酯基、活化的碳酸酯基和活化的硫代碳酸酯基；
并且是基于PEG的，包含至少70％PEG；和
(a-iii)第一溶剂和至少一种第二溶剂，所述的第二溶剂在所述的第一溶剂中不混溶，
所述的至少一种骨架试剂与所述的至少一种交联剂试剂的重量比是1:99－99:1；
(b)在悬浮聚合中将步骤(a)的混合物聚合成水凝胶；和
(c)任选地，对所述水凝胶进行后处理。
步骤(a)的混合物包含第一溶剂和至少一种第二溶剂。所述的第一溶剂优选选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、乙腈、二甲亚砜、异丙二醇碳酸酯(propylene carbonate)、N-甲基吡咯烷酮、甲醇、乙醇、异丙醇和水以及其混合物。
将所述的至少一种骨架试剂和至少一种交联剂试剂溶于所述的第一溶剂，即悬浮聚合的分散相。在一个实施方案中，使用相同或不同的溶剂将骨架试剂和交联剂试剂分别溶解、即在不同的容器中溶解，优选地对两种试剂使用相同的溶剂。在另一个实施方案中，将骨架试剂和交联剂试剂一起溶解，即在同一容器中并且使用相同的溶剂溶解。
用于骨架试剂的适合的溶剂是有机溶剂。优选地，所述溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、乙腈、二甲亚砜、异丙二醇碳酸酯、N-甲基吡咯烷酮、甲醇、乙醇、异丙醇和水以及其混合物。更优选地，将骨架试剂溶于选自乙腈、二甲亚砜、甲醇或其混合物的溶剂。最优选地，将骨架试剂溶于二甲亚砜。
在一个实施方案中，将骨架试剂以1－300mg/ml、更优选5－60mg/ml、最优选10－40mg/ml的浓度溶于溶剂。
用于交联剂试剂的适合的溶剂是有机溶剂。优选地，所述溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、乙腈、二甲亚砜、异丙二醇碳酸酯、N-甲基吡咯烷酮、甲醇、乙醇、异丙醇、水或其混合物。更优选地，将交联剂试剂溶于选自二甲基甲酰胺、乙腈、二甲亚砜、甲醇或其混合物的溶剂。最优选地，将交联剂试剂溶于二甲亚砜。
在一个实施方案中，将交联剂试剂以5－500mg/ml、更优选25－300mg/ml、最优选50－200mg/ml的浓度溶于溶剂。
将所述的至少一种骨架试剂和所述的至少一种交联剂试剂以1:99－99:1的重量比、以2:98－90:10的重量比、以3:97－88:12的重量比、以3:96－85:15的重量比、以2:98－90:10的重量比、以5:95－80:20的重量比、特别优选以5:95－80:20的重量比混合，其中第一个数是指骨架试剂，第二个数是指交联剂试剂。
优选地，对比例进行选择以便步骤(a)的混合物包含与交联剂试剂的活化的末端官能团相比摩尔过量的来自骨架试剂的胺基团。作为结果，由本发明的方法得到的水凝胶具有游离的胺基团，其可用于将前药连接基试剂直接偶联至水凝胶或者通过间隔基原子团偶联至水凝胶。
所述的至少一种第二溶剂、即悬浮聚合的连续相优选是有机溶剂，更优选是选自下组的有机溶剂：线型、支链或环状的C5-30烷；线型、支链或环状的C5-30烯；线型、支链或环状的C5-30炔；线型或环状的聚(二甲基硅氧烷)；芳族C6-20烃；以及其混合物。甚至更优选地，所述的至少一种第二溶剂选自下组：线型、支链或环状的C5-16烷；甲苯；二甲苯；六甲基二硅醚；或其混合物。最优选地，所述的至少一种第二溶剂选自线型的C7-11烷，例如庚烷、辛烷、壬烷、癸烷和十一烷。
优选地，步骤(a)的混合物还包含洗涤剂。优选的洗涤剂是CithrolDPHS、Hypermer 70A、Hypermer B246、Hypermer 1599A、Hypermer 2296和Hypermer 1083。
优选地，洗涤剂具有0.1g－100g/1L总混合物(即分散相和连续相总计)的浓度。更优选地，洗涤剂具有0.5g－10g/1L总混合物的浓度，最优选地，洗涤剂具有0.5g－5g/1L总混合物的浓度。
优选地，步骤(a)的混合物是乳剂。
步骤(b)中的聚合是通过加入碱引发的。优选地，所述碱是可溶于烷的非亲核碱，更优选地，所述碱选自N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TMEDA)、1,4-二甲基哌嗪、4-甲基吗啉、4-乙基吗啉、1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷、1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺(1,1,4,7,10,10-hexamethyltriethylenetetramine)、1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷、三[2-(二甲基氨基)乙基]胺、三乙胺、DIPEA、三甲胺、N,N-二甲基乙胺、N,N,N′,N′-四甲基-1,6-己二胺、N,N,N′,N″,N″-五甲基二亚乙基三胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、1,5-二氮杂二环[4.3.0]壬-5-烯和六亚甲基四胺。甚至更优选地，所述碱选自TMEDA、1,4-二甲基哌嗪、4-甲基吗啉、4-乙基吗啉、1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷、1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺、1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷、三[2-(二甲基氨基)乙基]胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、1,5-二氮杂二环[4.3.0]壬-5-烯和六亚甲基四胺。最优选地，所述碱是TMEDA。
将所述碱以1－500当量/混合物中活化的末端官能团的量、优选以5－50当量的量、更优选以5－25当量的量、最优选以10当量的量加入到步骤(a)的混合物中。
在方法步骤(b)中，本发明的凝胶的聚合是缩合反应，其优选在连续搅拌步骤(a)的混合物的情况下进行。优选地，桨尖速度(tip speed)(桨尖速度＝π×搅拌器转速×搅拌器直径)为0.2－10米/秒(m/s)，更优选地，为0.5－4m/s，最优选地，为1－2m/s。
在步骤(b)的一个优选的实施方案中，缩合反应在装配有挡板的圆柱形容器中进行。容器的直径与高之比可以为4:1－1:2，更优选地，容器的直径与高之比为2:1－1:1。
优选地，反应容器装配有轴向流(axial flow)搅拌器，其选自斜叶式搅拌器(pitched blade stirrer)、船用螺旋桨(marine type propeller)或LightninA-310。更优选地，所述搅拌器是斜叶式搅拌器。
步骤(b)可以在宽温度范围内进行，优选在-10℃－100℃的温度、更优选在0℃－80℃的温度、甚至更优选在10℃－50℃的温度、最优选在环境温度进行。“环境温度”是指典型实验室环境中存在的温度，优选意指17－25℃的温度。
优选地，由聚合获得的水凝胶是成形的制品，例如涂层、网状物、支架、纳米粒或微粒。更优选地，水凝胶是微粒珠的形式，所述微粒珠具有1－500微米的直径、更优选具有10－300微米的直径、甚至更优选具有20－150微米的直径、最优选具有30－130微米的直径。上述直径是在水凝胶微粒在水中被完全水化时测定的。
任选的步骤(c)包括以下步骤中的一个或多个：
(c1)从聚合反应中除去过量的液体；
(c2)洗涤水凝胶以除去聚合过程中使用的溶剂；
(c3)将水凝胶转入缓冲溶液中；
(c4)对水凝胶进行大小分级分离/筛分；
(c5)将水凝胶转入容器中；
(c6)干燥水凝胶；
(c7)将水凝胶转入适合于灭菌的特定溶剂中；和
(c8)将水凝胶灭菌，优选通过γ射线照射将水凝胶灭菌。
优选地，任选的步骤(c)包括所有以下步骤：
(c1)从聚合反应中除去过量的液体；
(c2)洗涤水凝胶以除去聚合过程中使用的溶剂；
(c3)将水凝胶转入缓冲溶液中；
(c4)对水凝胶进行大小分级分离/筛分；
(c5)将水凝胶转入容器中；
(c7)将水凝胶转入适合于灭菌的特定溶剂中；和
(c8)将水凝胶灭菌，优选通过γ射线照射将水凝胶灭菌。
所述的至少一种骨架试剂具有1－100kDa、优选2－50kDa、更优选5－30kDa、甚至更优选5－25kDa、最优选5－15kDa的分子量。
优选地，所述的骨架试剂是基于PEG的，包含至少10％PEG，更优选包含至少20％PEG，甚至更优选包含至少30％PEG，最优选包含至少40％PEG。
在一个实施方案中，所述的骨架试剂以其酸盐(acidic salt)的形式存在，优选以酸加成盐的形式存在。适合的酸加成盐是由形成无毒性的盐的酸形成的。实例包括、但不限于乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐、硫酸氢盐、硫酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、海苯酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、糖二酸盐(sacharate)、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐和甲苯磺酸盐。特别优选地，所述的骨架试剂以其盐酸盐的形式存在。
在一个实施方案中，所述的至少一种骨架试剂选自：
式(I)的化合物
B(-(A0)x1-(SP)x2-A1-P-A2-Hyp1)x (I)，
其中
B是分支核心，
SP是间隔基原子团，其选自C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基，
P是基于PEG的聚合链，包含至少80％PEG、优选至少85％PEG、更优选至少90％PEG、最优选至少95％PEG，
Hyp1是包含胺(-NH2和/或-NH-)的原子团或包含至少两个胺(-NH2和/或-NH-)的聚胺，
x是3－16的整数，
x1、x2彼此独立地是0或1，条件是如果x2是0，则x1是0，A0、A1、A2彼此独立地选自
其中R1和R1a彼此独立地选自H和C1-6烷基；
式(II)的化合物
Hyp2-A3-P-A4-Hyp3 (II)，
其中
P如上文式(I)的化合物中所定义，
Hyp2、Hyp3彼此独立地是包含至少两个胺(-NH2和/或-NH-)的聚胺，且
A3和A4独立地选自
其中R1和R1a彼此独立地选自H和C1-6烷基；
式(III)的化合物
P1-A5-Hyp4 (III)，
其中
P1是基于PEG的聚合链，包含至少80％PEG、优选至少85％PEG、更优选至少90％PEG、最优选至少95％PEG，
Hyp4是包含至少三个胺(-NH2和/或-NH)的聚胺，且
A5选自
其中R1和R1a彼此独立地选自H和C1-6烷基；
和
式(IV)的化合物
Ｔ１－Ａ６－Ｈyp5 (IV)，
其中
Hyp5是包含至少三个胺(-NH2和/或-NH)的聚胺，且
A6选自
其中R1和R1a彼此独立地选自H和C1-6烷基；且
T1选自C1-50烷基、C2-50烯基或C2-50炔基，该片段任选地被一个或多个选自以下的基团中断：-NH-、-N(C1-4烷基)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)N(C1-4烷基)-、-O-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、4－7元杂环基、苯基或萘基。
在下面的部分中，术语“Hypx”集体指Hyp1、Hyp2、Hyp3、Hyp4和Hyp5。
优选地，所述的骨架试剂是式(I)、(II)或(III)的化合物，更优选地，所述的骨架试剂是式(I)或(III)的化合物，最优选地，所述的骨架试剂是式(I)的化合物。
在一个优选的实施方案中，在式(I)的化合物中，x是4、6或8。优选地，在式(I)的化合物中，x是4或8，最优选地，x是4。
在一个优选的实施方案中，在式(I)－(IV)的化合物中，A0、A1、A2、A3、A4、A5和A6选自
优选地，在式(I)的化合物中，A0是
优选地，在式(I)的化合物中，A1是
优选地，在式(I)的化合物中，A2是
优选地，在式(II)的化合物中，A3是
且A4是
优选地，在式(III)的化合物中，A5是
优选地，在式(IV)的化合物中，A6是
优选地，在式(IV)的化合物中，T1选自H和C1-6烷基。
在一个实施方案中，在式(I)的化合物中，分支核心B选自下面的结构：
其中
虚线表示与A0连接，或者如果x1和x2均为0，则表示与A1连接，
t是1或2；优选地，t是1；
v是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14；优选地，v是2、3、4、5、6；更优选地，v是2、4或6；最优
选地，v是2。
在一个优选的实施方案中，B具有式(a-i)、(a-ii)、(a-iii)、(a-iv)、(a-v)、(a-vi)、(a-vii)、(a-viii)、(a-ix)、(a-x)、(a-xiv)、(a-xv)或(a-xvi)的结构。更优选地，B具有式(a-iii)、(a-iv)、(a-v)、(a-vi)、(a-vii)、(a-viii)、(a-ix)、(a-x)或(a-iv)的结构。最优选地，B具有式(a-xiv)的结构。
一个优选的实施方案是B和A0的组合，或者如果x1和x2均为0，则是一个优选的B和A1的组合，其选自以下结构：
其中
虚线表示与SP连接，或者如果x1和x2均为0，则表示与P连接。
更优选地，B和A0的组合、或者如果x1和x2均为0，则B和A1的组合具有式(b-i)、(b-iv)、(b-vi)或(b-viii)的结构式，最优选地，具有式(b-i)的结构式。
在一个实施方案中，式(I)的x1和x2是0。
在一个实施方案中，基于PEG的聚合链P具有0.3kDa－40kDa的分子量；例如0.4－35kDa、0.6－38kDA、0.8－30kDa、1－25kDa、1－15kDa或1－10kDa的分子量。最优选地，P具有1－10kDa的分子量。
在一个实施方案中，基于PEG的聚合链P1具有0.3kDa－40kDa的分子量；例如0.4－35kDa、0.6－38kDa、0.8－30kDa、1－25kDa、1－15kDa或1－10kDa的分子量。最优选地，P1具有1－10kDa的分子量。
在一个实施方案中，在式(I)或(II)的化合物中，P具有式(c-i)的结构：
其中n为6－900，更优选地，n为20－700，最优选地，n为20－250。
在一个实施方案中，在式(III)的化合物中，P1具有式(c-ii)的结构：
其中
n为6－900，更优选地，n为20－700，最优选地，n为20－250；
T0选自C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基，其任选地被一个或多个选自以下的基团中断：-NH-、-N(C1-4烷基)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)N(C1-4烷基)-、-O-C(O)-、-S(O)-或-S(O)2-。
在一个实施方案中，在式(I)－(IV)的化合物中，原子团Hypx是聚胺，并且优选包含结合的形式的、在适合的情况下R-和/或S-构型的式(d-i)、(d-ii)、(d-iii)和/或(d-iv)的原子团：
其中
z1、z2、z3、z4、z5、z6彼此独立地是1、2、3、4、5、6、7或8。
更优选地，Hypx包含结合的形式的以及R-和/或S-构型的赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丙酸和/或二氨基丁酸。最优选地，Hypx包含结合的形式的和R-和/或S-构型的赖氨酸。
Hypx具有40Da－30kDa、优选0.3kDa－25kDa、更优选0.5kDa－20kDa、甚至更优选1kDa－20kDa、最优选2kDa－15kDa的分子量。
Hypx优选选自
式(e-i)的原子团
其中
p1是1－5的整数，优选地，p1是4，且
如果所述的骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示与A2连接，如果所述的骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示与A3或A4连接；
式(e-ii)的原子团
其中
p2、p3和p4相同或不同且各自彼此独立地是1－5的整
数，优选地，p2、p3和p4是4，且
如果所述的骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示与A2连接，如果所述的骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示与A3或A4连接，如果所述的骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示与A5连接，如果所述的骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示与A6连接；
式(e-iii)的原子团
其中
p5－p11相同或不同且各自彼此独立地是1－5的整数，优选地，p5－p11是4，且
如果所述的骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示与A2连接，如果所述的骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示与A3或A4连接，如果所述的骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示与A5连接，如果所述的骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示与A6连接；
式(e-iv)的原子团
其中
p12－p26相同或不同且各自彼此独立地是1－5的整数，
优选地，p12－p26是4，且
如果所述的骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示与A2连接，如果所述的骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示与A3或A4连接，如果所述的骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示与A5连接，如果所述的骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示与A6连接；
式(e-v)的原子团
其中
p27和p28相同或不同且各自彼此独立地是1－5的整数，优选地，p27和p28是4，
q是1－8的整数，优选地，q是2或6，最优选地，1是6，
且
如果所述的骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示与A2连接，如果所述的骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示与A3或A4连接，如果所述的骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示与A5连接，如果所述的骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示与A6连接；
式(e-vi)的原子团
其中
p29和p30相同或不同且各自彼此独立地是2－5的整数，优选地，p29和p30是3，且
如果所述的骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示与A2连接，如果所述的骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示与A3或A4连接，如果所述的骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示与A5连接，如果所述的骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示与A6连接；
式(e-vii)的原子团
其中
p31－p36相同或不同且各自彼此独立地是2－5的整数，
优选地，p31－p36是3，且
如果所述的骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示与A2连接，如果所述的骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示与A3或A4连接，如果所述的骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示与A5连接，如果所述的骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示与A6连接；
式(e-viii)的原子团
其中
p37－p50相同或不同且各自彼此独立地是2－5的整数，优选地，p37－p50是3，且
如果所述的骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示与A2连接，如果所述的骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示与A3或A4连接，如果所述的骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示与A5连接，如果所述的骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示与A6连接；和
式(e-ix)的原子团：
其中
p51－p80相同或不同且各自彼此独立地是2－5的整数，优选地，p51－p80是3，且
如果所述的骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示与A2连接，如果所述的骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示与A3或A4连接，如果所述的骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示与A5连接，如果所述的骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示与A6连接；且
其中原子团(e-i)－(e-v)可以在每个手性中心上为R-或S-构型，优选地，原子团(e-i)－(e-v)的所有手性中心为相同的构型。
优选地，Hypx具有式(e-i)、(e-ii)、(e-iii)、(e-iv)、(e-vi)、(e-vii)、(e-viii)或(e-ix)的结构。更优选地，Hypx具有式(e-ii)、(e-iii)、(e-iv)、(e-vii)、(e-viii)或(e-ix)的结构，甚至更优选地，Hypx具有式(e-ii)、(e-iii)、(e-vii)或(e-viii)的结构，最优选地，Hypx具有式(e-iii)的结构。
如果所述的骨架试剂具有式(I)的结构，则优选的原子团–A2–Hyp1是下式的原子团
其中
虚线表示与P连接；且
E1选自式(e-i)－(e-ix)。
如果所述的骨架试剂具有式(II)的结构，则优选的原子团Hyp2–A3–是下式的原子团
其中
虚线表示与P连接；且
E1选自式(e-i)－(e-ix)；
且优选的原子团–A4–Hyp3是下式的原子团
其中
虚线表示与P连接；且
E1选自式(e-i)－(e-ix)。
如果所述的骨架试剂具有式(III)的结构，则优选的原子团–A5–Hyp4是下式的原子团
其中
虚线表示与P1连接；且
E1选自式(e-i)－(e-ix)。
更优选地，所述的骨架试剂具有式(I)的结构，且B具有式(a-xiv)的结构。
甚至更优选地，所述的骨架试剂具有式(I)的结构，B具有式(a-xiv)的结构，x1和x2是0，且A1是–O–。
甚至更优选地，所述的骨架试剂具有式(I)的结构，B具有式(a-xiv)的结构，A1是–O–，且P具有式(c-i)的结构。
甚至更优选地，所述的骨架试剂是式(I)，B是式(a-xiv)，x1和x2是0，A1是–O-，P是式(c-i)，A2是–NH-(C＝O)-，且Hyp1是式(e-iii)。
最优选地，所述的骨架试剂具有下式：
其中
n为10－40，优选10－30，更优选10－20。
同样优选地，n为20－30kDa，最优选地，n是28。
SP是间隔基原子团，其选自C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基，优选地，SP是-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-、-C(CH3)2-、-CH＝CH-或-CH＝CH-，最优选地，SP是-CH2-、-CH2-CH2-或-CH＝CH-。
所述的至少一种交联剂试剂包含至少两个羰基氧基(-(C＝O)-O-或–O-(C＝O)-)，其是生物可降解的键。这些生物可降解的键是赋予水凝胶生物可降解性所必需的。另外，所述的至少一种交联剂试剂包含至少两个活化的末端官能团，在步骤(b)的聚合过程中其与所述的至少一种骨架试剂的胺反应。
所述的交联剂试剂具有6－40kDa、更优选6－30kDa、甚至更优选6－20kDa、甚至更优选6－15kDa、最优选6－10kDa的分子量。
所述的交联剂试剂包含至少两个活化的末端官能团，其选自活化的酯基、活化的氨基甲酸酯基、活化的碳酸酯基和活化的硫代碳酸酯基，在聚合过程中其与所述的骨架试剂的胺基反应，形成酰胺键。
在一个优选的实施方案中，所述的交联剂试剂是式(V-I)的化合物：
其中
D1、D2、D3和D4各自相同或不同且各自彼此独立地选自-O-、-NR5-、-S-和-CR6R6a-；
R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a、R6和R6a各自相同或不同且各自彼此独立地选自-H、-OR7、-NR7R7a、-SR7和C1-6烷基；任选地，基团对R1/R2、R3/R4、R1a/R2a和R3a/R4a各自可以独立地形成化学键和/或基团对R1/R1a、R2/R2a、R3/R3a、R4/R4a、R6/R6a、R1/R2、R3/R4、R1a/R2a和R3a/R4a各自彼此独立地与它们所连接的原子一起形成C3-8环烷基或形成环A或者与它们所连接的原子一起形成4－7元杂环基或8－11元杂二环基或金刚烷基；
R5各自独立地选自–H和C1-6烷基；任选地基团对R1/R5、R2/R5、R3/R5、R4/R5和R5/R6各自可以独立地形成化学键和/或与它们所连接的原子一起形成4－7元杂环基或8－11元杂二环基；
R7、R7a各自独立地选自H和C1-6烷基；
A选自茚基、茚满基和四氢萘基；
P2是
m为120－920，优选为120－460，更优选为120－230；
r1、r2、r7、r8独立地是0或1；
r3、r6独立地是0、1、2、3或4；
r4、r5独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
s1、s2独立地是1、2、3、4、5或6；
Y1、Y2相同或不同且各自彼此独立地选自式(f-i)－(f-vi)：
其中
虚线表示与分子的其余部分连接，
b是1、2、3或4
XH是Cl、Br、I或F。
优选地，所述的交联剂试剂是式(V-II)的化合物：
其中
D1、D2、D3和D4相同或不同且各自彼此独立地选自O、NR5、S和CR5R5a；
R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a、R5和R5a相同或不同且各自彼此独立地选自H和C1-6烷基；任选地，基团对R1/R1a、R2/R2a、R3/R3a、R4/R4a、R1/R2、R3/R4、R1a/R2a和R3a/R4a中的一对或多对形成化学键或者与它们所连接的原子一起形成C3-8环烷基或形成环A或者与它们所连接的原子一起形成4－7元杂环基或8－11元杂二环基或金刚烷基；
A选自苯基、萘基、茚基、茚满基和四氢萘基；
P2是
m为120－920，优选为120－460，更优选为120－230；
r1、r2、r7、r8独立地是0或1；
r3、r6独立地是0、1、2、3或4；
r4、r5独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
s1、s2独立地是1、2、3、4、5或6；
Y1、Y2相同或不同且各自彼此独立地选自式(f-i)－(f-vi)：
其中
虚线表示与分子的其余部分连接，
b是1、2、3或4
XH是Cl、Br、I或F。
应当理解的是，原子团
表示所述的至少两个活化的末端官能团。
优选地，式(V-I)或(V-II)的Y1和Y2具有式(f-i)、(f-ii)或(f-v)的结构。更优选地，Y1和Y2具有式(f-i)或(f-ii)的结构，最优选地，Y1和Y2具有式(f-i)的结构。
优选地，式(V-I)或(V-II)的原子团Y1和Y2二者具有相同的结构。更优选地，原子团Y1和Y2二者具有式(f-i)的结构。
优选地，式(V-I)或(V-II)的r1是0。
优选地，式(V-I)或(V-II)的r1和s1均是0。
优选地，式(V-I)或(V-II)的基团对R1/R1a、R2/R2a、R3/R3a、R4/R4a、R1/R2、R3/R4、R1a/R2a和R3a/R4a中的一对或多对形成化学键或者与它们所连接的原子一起形成C3-8环烷基或形成环A。
优选地，式(V-I)或(V-II)的基团对R1/R2、R1a/R2a、R3/R4、R3a/R4a中的一对或多对与它们所连接的原子一起形成4－7元杂环基或8－11元杂二环基。
优选地，式(V-I)或(V-II)的交联剂试剂是对称的，即原子团
与原子团
具有相同的结构。
在一个优选的实施方案中，式(V-I)和(V-II)的s1、s2、r1和r8是0。
在另一个优选的实施方案中，式(V-I)和(V-II)的s1、s2、r1和r8是0且式(V-I)和(V-II)的r4和r5是1。
优选的交联剂试剂是式(V-1)－(V-54)：
其中
在合适的情况下，交联剂试剂各自可以是其外消旋混合物的形式；且
m、Y1和Y2如上文所定义。
甚至更优选的交联剂试剂是式(Va-1)－(Va-54)：
其中
在合适的情况下，交联剂试剂各自可以是其外消旋混合物的形式；且
m、Y1和Y2如上文所定义。
令人意外地发现，使用在羰基氧基的α碳上带有支链、即非H基团的交联剂试剂导致形成对酶促降解、例如通过酯酶的降解抗性更强的水凝胶。
类似地，令人意外地发现，羰基氧基的(C＝O)与相邻的活化的酯、活化的氨基甲酸酯、活化的碳酸酯或活化的硫代氨基甲酸酯的(C＝O)之间存在的原子越少，得到的水凝胶对降解的抗性越强，例如对通过酯酶的降解的抗性越强。
因此，交联剂试剂V-11－V-54、V-1、V-2、Va-11－Va-54、Va-1和Va-2是优选的交联剂试剂。交联剂试剂Va-11－Va-54、Va-1和Va-2是最优选的交联剂试剂。最优选的是交联剂试剂Va-14。
在另一个实施方案中，交联剂试剂V-1、V-2、V-5、V-6、V-7、V-8、V-9、V-10、V-11、V-12、V-13、V-14、V-15、V-16、V-17、V-18、V-19、V-20、V-21、V-22、V-23、V-24、V-25、V-26、V-27、V-28、V-29、V-30、V-31、V-32、V-33、V-34、V-35、V-36、V-37、V-38、V-39、V-40、V-41、V-42、V-43、V-44、V-45、V-46、V-47、V-48、V-49、V-50、V-51、V-52、V-53和V-54是优选的交联剂试剂。更优选地，所述的至少一种交联剂试剂是式V-5、V-6、V-7、V-8、V-9、V-10、V-14、V-22、V-23、V-43、V-44、V-45或V-46，最优选地，所述的至少一种交联剂试剂是式V-5、V-6、V-9或V-14。
在另一个实施方案中，交联剂试剂Va-1、Va-2、Va-5、Va-6、Va-7、Va-8、Va-9、Va-10、Va-11、Va-12、Va-13、Va-14、Va-15、Va-16、Va-17、Va-18、Va-19、Va-20、Va-21、Va-22、Va-23、Va-24、Va-25、Va-26、Va-27、Va-28、Va-29、Va-30、Va-31、Va-32、Va-33、Va-34、Va-35、Va-36、Va-37、Va-38、Va-39、Va-40、Va-41、Va-42、Va-43、Va-44、Va-45、Va-46、Va-47、Va-48、Va-49、Va-50、Va-51、Va-52、Va-53和Va-54是甚至更优选的交联剂试剂。更优选地，所述的至少一种交联剂试剂是式Va-5、Va-6、Va-7、Va-8、Va-9、Va-10、Va-14、Va-22、Va-23、Va-43、Va-44、Va-45或Va-46，最优选地，所述的至少一种交联剂试剂是式Va-5、Va-6、Va-9或Va-14。
因此，上文所述的式(V-I)和(V-II)的化合物的优选的实施方案适用于式(V-1)－(V-53)的优选的化合物。
在另一个方面，本发明涉及通过上文所定义的本发明的方法获得的水凝胶。
所述水凝胶含有0.01－1mmol/g伯胺基团(-NH2)、更优选0.02－0.5mmol/g伯胺基团、最优选0.05－0.3mmol/g伯胺基团。术语“X mmol/g伯胺基团”意指1g干燥水凝胶包含X mmol伯胺基团。水凝胶的胺含量的测量可以根据Gude等人(Letters in Peptide Science,2002,9(4):203-207，通过引用将该文献完整合并入本文)进行。
优选地，本文所用的术语“干燥的”意指具有最大10％、优选低于5％、更优选低于2％的残留水含量(根据Karl Fischer测定)。优选的干燥方法是冻干。
在一个实施方案中，中和VEGF的前药的水凝胶被进一步修饰，然后可逆的前药连接基-中和VEGF的生物学活性原子团与水凝胶缀合。
优选地，水凝胶通过包括以下步骤的方法修饰：
(A)提供具有基团Ax0的水凝胶，其中基团Ax0表示相同或不同的、优选相同的官能团；
(B)任选地将式(VI)的间隔基试剂
Ax1-SP2-Ax2(VI),
其中
SP2是C1-50烷基、C2-50烯基或C2-50炔基，所述C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选地被一个或多个选自以下的基团中断：-NH-、-N(C1-4烷基)-、-O-、-S、-C(O)-、-C(O)NH、-C(O)N(C1-4烷基)-、-O-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、4－7元杂环基、苯基和萘基；
Ax1是与水凝胶的Ax0反应的官能团；且
Ax2是官能团；
共价缀合至来自步骤(A)的水凝胶的Ax0；和
(C)使步骤(A)或步骤(B)的水凝胶与式(VII)的试剂反应，
Ax3-Z(VII),
其中
Ax3是官能团；且
Z是具有10Da－1000kDa的分子量的惰性原子团；
使得至多99mol-％的Ax0或Ax2与Ax3反应。
优选地，步骤(A)的Ax0选自马来酰亚胺、胺(-NH2或–NH-)、羟基(-OH)、羧基(-COOH)和活化的羧基(-COY1，其中Y1选自式(f-i)－(f-vi)：
其中
虚线表示与分子的其余部分连接，
b是1、2、3或4；
XH是Cl、Br、I或F)。
更优选地，步骤(A)的Ax0是胺或马来酰亚胺。
应当理解的是，如果中和VEGF的前药的水凝胶是通过上述方法获得的，则步骤(A)的官能团Ax0相当于所述的至少一种骨架试剂的胺。
在一个优选的实施方案中，步骤(A)的Ax0是胺，且步骤(B)的Ax1是ClSO2-、R1(C＝O)-、I-、Br-、Cl-、SCN-、CN-、O＝C＝N-、Y1-(C＝O)-、Y1-(C＝O)-NH-或Y1-(C＝O)-O-，
其中
R1是H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、4－7元杂
环基、8－11元杂二环基、苯基、萘基、茚基、茚满基或四氢萘基；
且
Y1选自式(f-i)－(f-vi)：
其中
虚线表示与分子的其余部分连接，
b是1、2、3或4；
XH是Cl、Br、I或F。
在另一个优选的实施方案中，步骤(A)的Ax0是羟基(-OH)且步骤(B)的Ax1是O＝C＝N-、I-、Br-、SCN-或Y1-(C＝O)-NH-，
其中Y1选自式(f-i)－(f-vi)：
其中
虚线表示与分子的其余部分连接，
b是1、2、3或4；
XH是Cl、Br、I或F。
在另一个优选的实施方案中，步骤(A)的Ax0是羧酸(-(C＝O)OH)且步骤(B)的Ax1是伯胺或仲胺。
在另一个优选的实施方案中，步骤(A)的Ax0是马来酰亚胺且步骤(B)的Ax1是硫羟基。
更优选地，步骤(A)的Ax0是胺且步骤(B)的Ax1是Y1-(C＝O)-、Y1-(C＝O)-NH-或Y1-(C＝O)-O-，最优选地，步骤(A)的Ax0是胺且步骤(B)的Ax1是Y1-(C＝O)-。
步骤(B)的Ax1可以任选地以被保护的形式存在。
用于获得活化的羧酸的适合的活化试剂是例如N,N'-二环己基-碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-碳二亚胺(EDC)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基(benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphate)(PyBOP)、六氟磷酸溴三吡咯烷基(bromotripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate)(PyBrOP)、六氟磷酸1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉代-碳(1-cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidenaminooxy)dimethylamino-morpholino-carbenium hexafluorophosphate)(COMU)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、六氟磷酸1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAT)、O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲(HCTU)、1-H-苯并三唑(1-H-benzotriazolium)(HBTU)、六氟磷酸(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲(HATU)和四氟硼酸O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲(TBTU)。这些试剂是可商购获得的并且是本领域技术人员公知的。
优选地，步骤(B)的Ax2选自-马来酰亚胺、-SH、-NH2、-SeH、-N3、-C≡CH、-CR1＝CR1aR1b、-OH、-(CH＝X)–R1、-(C＝O)–S–R1、-(C＝O)-H、-NH-NH2、-O-NH2、-Ar–X0、-Ar–Sn(R1)(R1a)(R1b)、-Ar–B(OH)(OH)、Br、I、Y1-(C＝O)-、Y1-(C＝O)-NH-、Y1-(C＝O)-O-、
具有任选的保护基；
其中
虚线表示与SP2连接；
X是O、S或NH；
X0是-OH、-NR1R1a、-SH或-SeH；
XH是Cl、Br、I或F；
Ar是苯基、萘基、茚基、茚满基或四氢萘基；
R1、R1a、R1b彼此独立地是H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、4－7元杂环基、8－11元杂二环基、苯基、萘基、茚基、茚满基或四氢萘基；且
Y1选自式(f-i)－(f-vi)：
其中
虚线表示与分子的其余部分连接；
b是1、2、3或4；
XH是Cl、Br、I或F。
更优选地，步骤(B)的Ax2是–NH2、马来酰亚胺或硫羟基，最优选地，步骤(B)的Ax2是马来酰亚胺。同样优选地，步骤(B)的Ax2是硫羟基。
步骤(B)的Ax2可以任选地以被保护的形式存在。
如果步骤(A)的水凝胶与间隔基原子团共价缀合，则得到的水凝胶-间隔基原子团缀合物具有式(VIII)：
其中
虚线表示与步骤(A)的水凝胶连接；
Ay1是Ax0与Ax1之间形成的键；且
SP2和Ax2如式(VI)中所用的那样。
优选地，式(VIII)的Ay1是稳定的键。
优选地，式(VIII)的Ay1选自
其中
用星号标记的虚线表示与水凝胶连接；且
未标记的虚线表示与SP2连接。
适合的反应条件描述在实施例部分中且是本领域技术人员公知的。
方法步骤(B)可以在碱的存在下进行。适合的碱包括常用的无机或有机碱。它们优选包括碱金属或碱土金属的氢化物、氢氧化物、氨基化物(amide)、醇盐、乙酸盐、碳酸盐或碳酸氢盐，例如，氢化钠、氨基化钠、甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、乙酸钠、乙酸钾、乙酸钙、乙酸铵、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸氢钠或碳酸铵，以及叔胺，例如三甲胺、三乙胺、三丁胺、N,N-二甲基苯胺、N,N-二甲基苄基胺、吡啶、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、N,N-二甲基氨基吡啶、二氮杂二环辛烷(DABCO)、二氮杂二环壬烯(DBN)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、二氮杂二环十一碳烯(DBU)或三甲基吡啶。
方法步骤(B)可以在溶剂的存在下进行。用于进行本发明的方法步骤(B)的适合的溶剂包括有机溶剂。它们优选地包括水和脂族、脂环族或芳族烃，例如，石油醚、己烷、庚烷、环己烷、甲基环己烷、苯、甲苯、二甲苯或十氢化萘；卤代烃，例如氯苯、二氯苯、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷或三氯乙烷；醇，例如甲醇、乙醇、正-丙醇或异-丙醇、正-丁醇、异-丁醇、仲-丁醇或叔-丁醇、乙二醇、丙-1,2-二醇、乙氧基乙醇、甲氧基乙醇、二甘醇一甲醚、二甲醚、二甘醇；乙腈、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、N,N-二甲基乙酰胺、硝基甲烷、硝基苯、六甲基磷酰胺(HMPT)、1,3-二甲基-2-咪唑烷酮(DMI)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙酸乙酯、丙酮、丁酮；醚，例如乙醚、二异丙醚、甲基叔丁基醚、甲基叔戊基醚(methyl t-amyl ether)、二烷、四氢呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、1,2-二乙氧基乙烷或茴香醚；或其混合物。优选地，所述溶剂选自水、乙腈和N-甲基-2-吡咯烷酮。
优选地，步骤(C)的Ax3选自–SH、-NH2、-SeH、-马来酰亚胺、-C≡CH、-N3、-CR1＝CR1aR1b、-(C＝X)-R1、-OH、-(C＝O)-S-R1、-NH-NH2、-O-NH2、-Ar-Sn(R1)(R1a)(R1b)、-Ar–B(OH)(OH)、–Ar–X0、
其中
虚线表示与Z连接；
X是O、S或NH；
X0是-OH、-NR1R1a、-SH或–SeH；
R1、R1a、R1b彼此独立地是H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、4－7元杂环基、8－11元杂二环基、苯基、萘基、茚基、茚满基或四氢萘基；且
Ar是苯基、萘基、茚基、茚满基或四氢萘基；
Y1是活化的羧酸、活化的碳酸酯或活化的氨基甲酸酯，优选地，Y1选自式(f-i)－(f-vi)：
其中
虚线表示与分子的其余部分连接；
b是1、2、3或4；
XH是Cl、Br、I或F。
在一个优选的实施方案中，Y1选自式(f-i)－(f-vi)：
其中
虚线、b和XH如上文所使用的那样。
更优选地，步骤(C)的Ax3是–SH或–马来酰亚胺，最优选地，步骤(C)的Ax3是–SH。
在另一个优选的实施方案中，Ax3是式(aI)
其中
虚线表示与式(VII)的Z连接；
PG0是活化硫的原子团；且
S是硫。
优选地，式(aI)的PG0选自
其中
虚线表示与式(aI)的硫连接；
Ar是任选进一步被取代的芳族原子团；
R01、R02、R03、R04彼此独立地是-H；C1-50烷基；C2-50烯基；或C2-50炔基，其中C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选被相同或不同的一个或多个R3取代，且其中C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选被一个或多个选自以下的基团中断：-Q-、-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(R4)-；-S(O)2N(R4)-；-S(O)N(R4)-；-S(O)2-；-S(O)-；-N(R4)S(O)2N(R4a)-；-S-；-N(R4)-；-OC(O)R4；-N(R4)C(O)-；-N(R4)S(O)2-；-N(R4)S(O)-；-N(R4)C(O)O-；-N(R4)C(O)N(R4a)-；和-OC(O)N(R4R4a)；
Q选自苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢萘基；C3-10环烷基；4－7元杂环基；和8－11元杂二环基，其中T任选被相同或不同的一个或多个R3取代；
R3是卤素；-CN；氧代(＝O)；-COOR5；-OR5；-C(O)R5；-C(O)N(R5R5a)；-S(O)2N(R5R5a)；-S(O)N(R5R5a)；-S(O)2R5；-S(O)R5；-N(R5)S(O)2N(R5aR5b)；-SR5；-N(R5R5a)；-NO2；-OC(O)R5；-N(R5)C(O)R5a；-N(R5)S(O)2R5a；-N(R5)S(O)R5a；-N(R5)C(O)OR5a；-N(R5)C(O)N(R5aR5b)；-OC(O)N(R5R5a)；或C1-6烷基，其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；且
R4、R4a、R5、R5a、R5b独立地选自-H；或C1-6烷基，其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。
优选地，R01、R03和R04彼此独立地是C1-6烷基。
优选地，R02选自H和C1-6烷基。
优选地，Ar选自
其中
虚线表示与式(aI)的PG0的其余部分连接；
W彼此独立地是O、S或N；
W’是N；且
其中Ar任选被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自NO2、Cl和F。
更优选地，式(aI)的PG0选自
其中
虚线表示与式(aI)的硫连接；且
Ar、R01、R02、R03和R04如上文所使用的那样。
更优选地，式(aI)的PG0是
其中
虚线表示与式(aI)的硫连接。
步骤(C)的Ax3可以任选地以被保护的形式存在。
步骤(B)的Ax2和步骤(C)的Ax3的优选的组合如下：
其中
X是O、S或NH；
X0是-OH、-NR1R1a、-SH或–SeH；
R1、R1a、R1b彼此独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、4－7元杂环基、8－11元杂二环基、苯基、萘基、茚基、茚满基和四氢萘基；且
Ar是苯基、萘基、茚基、茚满基或四氢萘基。
在另一个优选的实施方案中，Ax2是–SH且Ax3是式(aI)，其中PG0是式(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(viii)。更优选地，式(aI)的PG0是式(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)，甚至更优选地，式(aI)的PG0是式(i)。最优选地，式(aI)的PG0是下式：
其中
虚线表示与式(aI)的硫连接。
在一个优选的实施方案中，步骤(B)的Ax2是胺且步骤(C)的Ax3是Y1-(C＝O)-、Y1-(C＝O)-NH-或Y1-(C＝O)-O-，最优选地，步骤(B)的Ax2是胺且步骤(C)的Ax3是Y1-(C＝O)-。
在另一个优选的实施方案中，步骤(B)的Ax2是马来酰亚胺且步骤(C)的Ax3是–SH。
在一个实施方案中，任选的步骤(B)被略去，步骤(A)的Ax0是胺且步骤(C)的Ax3是ClSO2-、R1(C＝O)-、I-、Br-、Cl-、SCN-、CN-、O＝C＝N-、Y1-(C＝O)-、Y1-(C＝O)-NH-或Y1-(C＝O)-O-，
其中
R1是H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、4－7元杂环基、8－11元杂二环基、苯基、萘基、茚基、茚满基或四氢萘基；且
Y1选自式(f-i)－(f-vi)：
其中
虚线表示与分子的其余部分连接；
b是1、2、3或4；
XH是Cl、Br、I或F。
在另一个实施方案中，任选的步骤(B)被略去，步骤(A)的Ax0是羟基(-OH)，且步骤(C)的Ax3是O＝C＝N-、I-、Br-、SCN-或Y1-(C＝O)-NH-，
其中Y1选自式(f-i)－(f-vi)：
其中
虚线表示与分子的其余部分连接；
b是1、2、3或4；
XH是Cl、Br、I或F。
在另一个实施方案中，任选的步骤(B)被略去，步骤(A)的Ax0是羧酸(-(C＝O)OH)且步骤(C)的Ax3是伯胺或仲胺。
在另一个实施方案中，任选的步骤(B)被略去，步骤(A)的Ax0是胺且步骤(C)的Ax3是Y1-(C＝O)-、Y1-(C＝O)-NH-或Y1-(C＝O)-O-。
在另一个实施方案中，任选的步骤(B)被略去，步骤(A)的Ax0是马来酰亚胺且步骤(C)的Ax3是硫羟基。
在一个优选的实施方案中，任选的步骤(B)被略去，步骤(A)的Ax0是胺且步骤(C)的Ax3是Y1-(C＝O)-。
在另一个优选的实施方案中，任选的步骤(B)被略去，Ax0是–SH且Ax3是式(aI)，其中PG0是式(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(viii)。更优选地，式(aI)的PG0是式(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)，甚至更优选地，式(aI)的PG0是式(i)。最优选地，式(aI)的PG0是下式
其中
虚线表示与式(aI)的硫连接。
由步骤(C)获得的水凝胶具有式(IXa)或(IXb)的结构：
其中
虚线表示与步骤(A)的水凝胶连接；
Ay0是Ax0与Ax3之间形成的键；
Ay1如式(VIII)中所使用的那样；
Ay2是Ax2与Ax3之间形成的键；
SP2如式(VI)中所使用的那样；且
Z如式(VII)中所使用的那样。
优选地，步骤(A)的Ay0和式(IXb)的Ay2选自酰胺、氨基甲酸酯、
其中
用星号标记的虚线表示分别与水凝胶或SP2连接；且
未标记的虚线表示与式(VII)的Z连接。
在一个实施方案中，步骤(C)的Z选自C1-50烷基、C2-50烯基、C2-50炔基、C3-10环烷基、4－7元杂环基、8－11元杂二环基、苯基；萘基；茚基；茚满基；和四氢萘基；所述C1-50烷基、C2-50烯基、C2-50炔基、C3-10环烷基、4－7元杂环基、8－11元杂二环基、苯基；萘基；茚基；茚满基；和四氢萘基任选被一个或多个相同或不同的R10取代，且其中C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选被一个或多个选自以下的基团中断：T、-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(R9)-；-S(O)2N(R9)-；-S(O)N(R9)-；-S(O)2-；-S(O)-；-N(R9)S(O)2N(R9a)-；-S-；-N(R9)-；-OC(O)R9；-N(R9)C(O)-；-N(R9)S(O)2-；-N(R9)S(O)-；-N(R9)C(O)O-；-N(R9)C(O)N(R9a)-；和-OC(O)N(R9R9a)；
其中
R9、R9a独立地选自H；T；C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基，所述的T；C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选地被一个或多个相同或不同的R10取代，且所述的C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选地被一个或多个选自以下的基团中断：T、-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(R11)-；-S(O)2N(R11)-；-S(O)N(R11)-；-S(O)2-；-S(O)-；-N(R11)S(O)2N(R11a)-；-S-；-N(R11)-；-OC(O)R11；-N(R11)C(O)-；-N(R11)S(O)2-；-N(R11)S(O)-；-N(R11)C(O)O-；-N(R11)C(O)N(R11a)-；和-OC(O)N(R11R11a)；
T选自苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢萘基；C3-10环烷基；4－7元杂环基；和8－11元杂二环基，其中T任选地被一个或多个相同或不同的R10取代；
R10是卤素；CN；氧代(＝O)；COOR12；OR12；C(O)R12；C(O)N(R12R12a)；S(O)2N(R12R12a)；S(O)N(R12R12a)；S(O)2R12；S(O)R12；N(R12)S(O)2N(R12aR12b)；SR12；N(R12R12a)；NO2；OC(O)R12；N(R12)C(O)R12a；N(R12)S(O)2R12a；N(R12)S(O)R12a；N(R12)C(O)OR12a；N(R12)C(O)N(R12aR12b)；OC(O)N(R12R12a)；或C1-6烷基，所述C1-6烷基任选地被一个或多个相同或不同的卤素取代；
R11、R11a、R12、R12a、R12b彼此独立地选自H；和C1-6烷基，所述C1-6
烷基任选地被一个或多个相同或不同的卤素取代。
在另一个实施方案中，步骤(C)的Z是惰性聚合物，其具有0.5kDa－1000kDa的分子量，优选具有0.5－500kDa的分子量，更优选具有0.75－250kDa的分子量，甚至更优选具有1－100kDa的分子量，甚至更优选具有5－60kDa的分子量，甚至更优选具有10－50kDa的分子量，最优选地，Z具有40kDa的分子量。
优选地，步骤(C)的Z是惰性聚合物，其选自2-甲基丙烯酰基-氧基乙基磷酰胆碱(2-methacryloyl-oxyethyl phosphoyl cholins)、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸酯)、聚(丙烯酰胺)、聚(烷氧)聚合物、聚(酰胺)、聚(酰氨基胺)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(天冬酰胺)、聚(丁酸)、聚(乙醇酸)、聚对苯二甲酸丁二酯、聚(己内酯)、聚(碳酸酯)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(二甲基丙烯酰胺)、聚(酯)、聚(乙烯)、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(磷酸乙酯)(poly(ethylphosphates))、聚(乙基唑啉)、聚(乙醇酸)、聚(丙烯酸羟乙酯)、聚(羟乙基唑啉)、聚(羟基甲基丙烯酸酯)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸羟丙酯)、聚(羟丙基唑啉)、聚(亚胺基碳酸酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基唑啉)、聚(有机磷氰)、聚(原酸酯)、聚(唑啉)、聚(丙二醇)、聚(硅氧烷)、聚(氨基甲酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基胺)、聚(乙烯基甲基醚)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、硅氧烷、纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、壳多糖、脱乙酰壳多糖、葡聚糖、糊精、明胶、透明质酸及其衍生物、官能化的透明质酸、甘露聚糖、果胶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖、淀粉、羟烷基淀粉、羟乙基淀粉和其它基于碳水化合物的聚合物、木聚糖、以及其共聚物。
在一个优选的实施方案中，步骤(C)的Z是惰性的线型或支链的基于PEG的聚合物，包含至少70％PEG，或者是基于透明质酸的聚合物，包含至少70％透明质酸。更优选地，步骤(C)的Z是惰性的线型或支链的基于PEG的聚合物，包含至少70％PEG、甚至更优选包含至少80％PEG、最优选包含至少90％PEG。
在另一个优选的实施方案中，步骤(C)的Z是两性离子聚合物。优选地，所述的两性离子聚合物包含聚(氨基酸)和/或聚(丙烯酸酯)。
本文所用的术语“两性离子”和“两性离子的”是指在分子或原子团内的不同位置同时带有正电荷和负电荷的中性分子或原子团。
根据Zhang等人(Nature Biotechnology,2013,第31卷,第6期,553-557页)，由两性离子聚合物制成的水凝胶对异物响应具有抗性。
步骤(C)包含使步骤(A)或步骤(B)的水凝胶与式(VII)的试剂反应，反应方式使得不超过99mol-％的Ax0或Ax2与Ax3反应。这可以例如通过使相对于Ax0或Ax2而言至多0.99化学当量的式(VII)的试剂与步骤(A)或(B)的水凝胶反应来实现。
为了防止超过0.99化学当量反应，式(VII)的试剂可以以相对于Ax0或Ax2而言至多0.99化学当量的量被使用，或者监测反应速率并且当相对于Ax0或Ax2而言至多0.99化学当量已经反应时(尤其是当使用超过0.99化学当量时)中断反应。应当理解，还由于物理限制，例如惰性原子团Z的位阻、疏水性或其它特性，不超过0.99化学当量能够与Ax0或Ax2反应，即使向反应中加入更多化学当量也是如此。
优选地，步骤(C)包括使步骤(A)或步骤(B)的水凝胶与式(VII)的试剂反应，反应方式使得不超过80mol-％的Ax0或Ax2与Ax3反应，甚至更优选地，使得不超过60mol-％的Ax0或Ax2与Ax3反应，甚至更优选地，使得不超过40mol-％的Ax0或Ax2与Ax3反应，甚至更优选地，使得不超过20mol-％的Ax0或Ax2与Ax3反应，最优选地，使得不超过15mol-％的Ax0或Ax2与Ax3反应。
这可以例如通过使相对于Ax0或Ax2而言至多0.8、0.6、0.4、0.2或0.15化学当量的式(VII)的试剂分别与步骤(A)或(B)的水凝胶反应来实现。
防止更多化学当量反应的方法如上所述。
基于步骤(A)的Ax0的物质的量的测量值并且在步骤(C)之后，反应的Ax0的物质的量可以使用方程(1)计算：
(1)以mmol/g计的反应的Ax0的物质的量＝(Ax0 1–Ax0 2)/(Ax0 2×MWZ+1)，
其中
Ax0 1是以mmol/g计的步骤(A)的水凝胶的官能团Ax0的物质的量；
Ax0 2是以mmol/g计的步骤(C)之后的水凝胶的官能团Ax0的物质的量；且
MWZ是以g/mmol计的Z的分子量。
如果任选的间隔基试剂与步骤(A)的水凝胶共价缀合，相应地进行反应的Ax2的数量的计算。
根据方程(2)计算相对于步骤(A)的水凝胶的官能团Ax0而言反应的官能团Ax0的百分比：
(2)反应的Ax0的mol-％＝100×[(Ax0 1–Ax0 2)/(Ax0 2×MWZ+1)]/Ax0 1
其中的变量如上文所使用的那样。
在一个实施方案中，步骤(C)的Z缀合至水凝胶的表面。这可以通过选择试剂Ax3-Z的大小和结构使得它过大以至于不能进入水凝胶的孔或网状结构来实现。因此，Ax3-Z的最小尺寸取决于水凝胶的性质。然而，本领域技术人员知晓如何使用标准实验、例如通过使用用水凝胶作为固定相的尺寸排阻色谱法测试试剂Ax3-Z是否能进入水凝胶。
中和VEGF的前药中所包含的前药连接基原子团可以具有本领域已知的任意前药连接基原子团的结构。
一种优选的前药连接基公开在WO 2005/099768A2中并且可以如WO2005/099768A2中所述的那样获得。因此，一种优选的可逆的前药连接基–中和VEGF的生物学活性原子团具有式(A)或(B)的结构：
其中
虚线表示与前药的其余部分连接，即，与载体原子团连接或与任选的间隔基原子团连接；
D是中和VEGF的生物学活性原子团，其经由相应的中和VEGF的药物的胺基团与原子团的其余部分连接；
X是间隔基原子团，如R5-Y6；
Y1、Y2独立地是O、S或NR6；
Y3、Y5独立地是O或S；
Y4是O、NR6或C(R7)(R8)-；
Y6是O、S、NR6、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、不饱和的碳-碳键或含有自由电子对的任意杂原子，或者不存在；
R2、R3彼此独立地选自水凝胶、被取代的或未被取代的线型、支链或环状的烷基或杂烷基、芳基、被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、氰基、硝基、卤素、羧基、羧基烷基、烷基羰基或甲酰胺基烷基(carboxamidoalkyl)；
R4选自氢、被取代的或未被取代的线型、支链或环状的烷基或杂烷基、芳基、被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、被取代的或未被取代的线型、支链或环状的烷氧基、被取代的或未被取代的线型、支链或环状的杂烷基氧基、芳基氧基或杂芳基氧基、氰基、卤素；
R5选自被取代的或未被取代的线型、支链或环状的烷基或杂烷基、芳基、被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；
R6选自水凝胶、被取代的或未被取代的线型、支链或环状的烷基或杂烷基、芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；
R7、R8独立地选自氢、被取代的或未被取代的线型、支链或环状的烷基或杂烷基、芳基、被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、羧基烷基、烷基羰基、甲酰胺基烷基、氰基或卤素；
W选自被取代的或未被取代的线型、支链或环状的烷基、芳基、被取代的芳基、被取代的或未被取代的线型、支链或环状的杂烷基、被取代的或未被取代的杂芳基；
Nu是亲核体；
n是0或正整数；且
Ar是多取代的芳族烃或多取代的芳族杂环。
优选地，式(A)和(B)的R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基。
优选地，式(A)和(B)的Y6是C1-20烷基、C2-20烯基或C2-20炔基。
优选地，式(A)和(B)的Nu选自由伯、仲和叔氨基、硫羟基、羧酸、羟基胺、肼和含氮杂芳基组成的一组亲核体。
优选地，式(A)和(B)的W是–(CR9R10)b–，其中R9和R10独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基，且其中b是1、2、3、4或5。
优选地，式(A)和(B)的n是0、1或2，更优选地，n是0或1，最优选地，n是0。
优选地，式(A)和(B)的Ar选自
另一些优选的前药连接基公开在WO 2006/136586 A2中并且可以如WO 2006/136586 A2中所述的那样获得。因此，一种优选的可逆的前药连接基-中和VEGF的生物学活性原子团具有式(C)、(D)或(E)的结构：
其中
虚线表示与前药的其余部分连接，即，与载体原子团连接或与任选的间隔基原子团连接；
D是中和VEGF的生物学活性原子团，其经由相应的中和VEGF的药物的胺基团与分子的其余部分连接，从而形成酰胺键；
X是间隔基原子团，例如R13-Y1；
Y1是O、S、NR6、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、不饱和的碳-碳键或含有自由电子对的任意杂原子，或者不存在；
R13选自被取代的或未被取代的线型、支链或环状的烷基或杂烷基、芳基、被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；
R2和R3独立地选自氢、酰基或羟基保护基；
R4－R12独立地选自氢、被取代的或未被取代的线型、支链或环状的烷基或杂烷基、芳基、被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、氰基、硝基、卤素、羧基、甲酰胺(carboxamide)。
优选地，式(C)、(D)和(E)的R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基。
优选地，在式(C)、(D)和(E)中，Y1是C1-20烷基、C2-20烯基或C2-20炔基。
另一种优选的前药连接基公开在WO 2009/095479A2中并且可以如WO 2009/095479A2中所述的那样获得。因此，一种优选的可逆的前药连接基-中和VEGF的生物学活性原子团具有式(F)的结构：
其中
虚线表示与前药的其余部分连接，即，与载体原子团连接或与任选的间隔基原子团连接；
D是中和VEGF的生物学活性原子团，其经由相应的中和VEGF的药物的芳族胺通过形成酰胺键与分子的其余部分连接；
X是C(R4R4a)；N(R4)；O；C(R4R4a)-C(R5R5a)；C(R5R5a)-C(R4R4a)；C(R4R4a)-N(R6)；N(R6)-C(R4R4a)；C(R4R4a)-O；或O-C(R4R4a)；
X1是C；或S(O)；
X2是C(R7,R7a)；或C(R7,R7a)-C(R8,R8a)；
R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a、R5、R5a、R6、R7、R7a、R8、R8a独立地选自H；和C1-4烷基；
任选地，基团对R1a/R4a、R1a/R5a、R4a/R5a、R4a/R5a、R7a/R8a中的一对或多对形成化学键；
任选地，基团对R1/R1a、R2/R2a、R4/R4a、R5/R5a、R7/R7a、R8/R8a中的一对或多对与它们所连接的原子一起形成C3-7环烷基；或4－7元杂环基；
任选地，基团对R1/R4、R1/R5、R1/R6、R4/R5、R7/R8、R2/R3中的一对或多对与它们所连接的原子一起形成环A；
任选地，R3/R3a与它们所连接的氮原子一起形成4－7元杂环；
A选自苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢萘基；C3-10环烷基；4－7元杂环基；和8－11元杂二环基；
条件是R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a、R5、R5a、R6、R7、R7a、R8或R8a的一个氢原子被键替代，所述键使式(F)的原子团与中和VEGF的前药的其余部分连接，即，与载体原子团连接或与任选的间隔基原子团连接。
任选地，式(F)的可逆的前药连接基原子团进一步被取代，条件是原子团的氮的氢不被替代，并且R3和R3a彼此独立地是H或通过SP3-杂化碳原子与N连接。
另一种优选的前药连接基公开在WO 2011/012721 A1和WO2011/012722 A1中并且可以如WO 2011/012721 A1和WO 2011/012722 A1中所述的那样获得。因此，一种优选的可逆的前药连接基-中和VEGF的生物学活性原子团具有式(G)的结构：
其中
虚线表示与前药的其余部分连接，即，与载体原子团连接或与任选的间隔基原子团连接；
D是中和VEGF的生物学活性原子团，其经由相应的中和VEGF的药物的芳族胺通过形成酰胺键与分子的其余部分连接；
X1是C(R1R1a)或选自以下的环状片段：C3-7环烷基、4－7元杂环基、苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢萘基或8－11元杂二环基，
其中
在X1是环状片段的情况下，所述的环状片段通过两个相邻环原子并入L1中，并且与酰胺键的碳原子相邻的X1的环原子也是碳原子；
X2是化学键或者选自C(R3R3a)、N(R3)、O、C(R3R3a)-C(R4R4a)、C(R3R3a)-N(R4)、N(R3)-C(R4R4a)、C(R3R3a)-O或O-C(R3R3a)，
其中
在X1是环状片段的情况下，X2是化学键、C(R3R3a)、N(R3)或O；
任选地，在X1是环状片段且X2是C(R3R3a)的情况下，L1内的X1片段和X2片段的顺序可以改变并且所述环状片段通过两个相邻的环原子并入L1中；
R1、R3和R4独立地选自H、C1-4烷基和–N(R5R5a)；
R1a、R2、R3a、R4a和R5a独立地选自H和C1-4烷基；
R5是C(O)R6；
R6是C1-4烷基；
任选地，基团对R1a/R4a、R3a/R4a或R1a/R3a之一形成化学键；
条件是R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a、R5、R5a或R6的一个氢原子被键替代，所述键使式(G)的原子团与中和VEGF的前药的其余部分连接，即，与载体原子团连接或与任选的间隔基原子团连接。
另一种优选的前药连接基公开在WO 2011/089214 A1中并且可以如WO 2011/089214 A1中所述的那样获得。因此，一种优选的可逆的前药连接基-中和VEGF的生物学活性原子团具有式(H)的结构：
其中
虚线表示与前药的其余部分连接，即，与载体原子团连接或与任选的间隔基原子团连接；
D是中和VEGF的生物学活性原子团，其经由相应的中和VEGF的药物的芳族羟基(-OH)通过形成氨基甲酸酯键与分子的其余部分连接；
R1选自C1-4烷基；杂烷基；C3-7环烷基；和
R2、R2a、R3和R3a独立地选自氢、被取代的或未被取代的线型、支链或环状C1-4烷基或杂烷基；
d各自独立地是2、3或4；
条件是R1、R2、R2a、R3或R3a的一个氢被键替代，所述键使式(H)的原子团与中和VEGF的前药的其余部分连接，即，与载体原子团连接或与任选的间隔基原子团连接。
另一种优选的前药连接基公开在WO 2011/089216 A1中并且可以如WO 2011/089216 A1中所述的那样获得。因此，一种优选的可逆的前药连接基-中和VEGF的生物学活性原子团具有式(J)的结构：
其中
虚线表示与前药的其余部分连接，即，与载体原子团连接或与任选的间隔基原子团连接；
D是中和VEGF的生物学活性原子团，其经由相应的中和VEGF的药物的脂族胺通过形成酰胺键与分子的其余部分连接；
X1选自O、S或CH-R1a；
R1和R1a独立地选自H、OH、CH3；
R2、R2a、R4和R4a独立地选自H和C1-4烷基；
R3和R3a独立地选自H、C1-4烷基和R5；
R5选自
其中
虚线表示与原子团的其余部分连接；
条件是R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a和R5的一个氢原子被键替代，所述键使式(J)的原子团与中和VEGF的前药的其余部分连接，即，与载体原子团连接或与任选的间隔基原子团连接。
优选地，式(J)的R3是H且式(J)的R3a是R5。
优选地，式(J)的R4/R4a之一是H。
任选地，式(J)的基团对R3/R3a、R4/R4a、R3/R4中的一对或多对可以独立地形成一个或多个环状片段，所述环状片段选自C3-7环烷基、4－7元杂环基或8－11元杂二环基。
任选地，式(J)的R3、R3a、R4和R4a进一步被C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、苯基、4－7元杂环或卤素取代。
另一种优选的前药连接基公开在WO 2011/089215 A1中并且可以如WO 2011/089215 A1中所述的那样获得。因此，一种优选的可逆的前药连接基-中和VEGF的生物学活性原子团具有式(K)的结构：
其中
虚线表示与前药的其余部分连接，即，与载体原子团连接或与任选的间隔基原子团连接；
D是中和VEGF的生物学活性原子团，其经由相应的中和VEGF的药物的芳族胺通过形成酰胺键与分子的其余部分连接；
R1、R1a、R2、R3、R3a、R4和R4a独立地选自H和C1-4烷基；
任选地，R1、R1a、R2、R3、R3a、R4和R4a中任意两个可以独立地形成一个或多个环状片段，所述环状片段选自C3-7环烷基、4－7元杂环基、苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢萘基或8－11元杂二环基；
任选地，R1、R1a、R2、R3、R3a、R4和R4a进一步被选自以下的取代基取代：C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、4－7元杂环基、苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢萘基或8－11元杂二环基；
条件是R1、R1a、R2、R3、R3a、R4和R4a的一个氢原子被键替代，所述键使式(J)的原子团与中和VEGF的前药的其余部分连接，即，与载体原子团连接或与任选的间隔基原子团连接。
另一种优选的前药连接基公开在PCT/EP2012/065748中并且可以如PCT/EP2012/065748中所述的那样获得。因此，一种优选的可逆的前药连接基-中和VEGF的生物学活性原子团具有式(L)的结构：
其中
虚线表示与前药的其余部分连接，即，与载体原子团连接或与任选的间隔基原子团连接；
D是中和VEGF的生物学活性原子团，其经由相应的中和VEGF的药物的羧酸基团(-(C＝O)-OH)通过形成羧酸酯键与分子的其余部分连接；
R1选自未被取代的烷基；被取代的烷基；未被取代的苯基；被取代的苯基；未被取代的萘基；被取代的萘基；未被取代的茚基；被取代的茚基；未被取代的茚满基；被取代的茚满基；未被取代的四氢萘基；被取代的四氢萘基；未被取代的C3-10环烷基；被取代的C3-10环烷基；未被取代的4－7元杂环基；被取代的4－7元杂环基；未被取代的8－11元杂二环基；和被取代的8－11元杂二环基；
R2选自H、未被取代的烷基和被取代的烷基
R3和R4独立地选自H、未被取代的烷基和被取代的烷基；
e是0或1；
任选地，R1和R3与它们所连接的原子一起形成环A；
A选自C3-10环烷基；4－7元脂族杂环基；和8－11元脂族杂二环基，其中A是未被取代的或被取代的；
Q选自C1-50烷基、C2-50烯基或C2-50炔基，所述片段任选地被一个或多个选自以下的基团中断：-NH-、-N(C1-4烷基)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)N(C1-4烷基)-、-O-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、4－7元杂环基、苯基或萘基。
另一种优选的前药连接基公开在EP12165516中并且可以如EP12165516中所述的那样获得。因此，一种优选的可逆的前药连接基-中和VEGF的生物学活性原子团具有式(M)的结构：
其中
虚线表示与前药的其余部分连接，即，与载体原子团连接或与任选的间隔基原子团连接；
D是中和VEGF的生物学活性原子团，其经由相应的中和VEGF的药物的羟基通过形成酯或氨基甲酸酯键与分子的其余部分连接；
Y是-C(R1)(R1a)-；或-N(R1)-；
X是-C(R4)(R4a)-；-N(R4)-；-O-；-C(R4)(R4a)-C(R5)(R5a)-；-C(R4)(R4a)-N(R6)-；-N(R6)-C(R4)(R4a)-；-C(R4)(R4a)-O-；-O-C(R4)(R4a)-；-C(O)-N(R6)-；或-N(R6)-C(O)-；
X1是或
X2是-C(R7)(R7a)-；或-C(R7)(R7a)-C(R8)(R8a)-；
X3是＝O；＝S；或＝N-CN；
R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a、R5、R5a、R6、R7、R7a、R8、R8a独立地选自H；C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-20杂烷基和Y1-T；并且独立地基团对R1a/R4a、R1a/R5a、R4a/R5a、R7a/R8a中没有任何一对、一对或多对不存在且它们所连接的相应的碳原子形成顺式双键；
Y1是化学键或C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基；
T选自苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢萘基；C3-10环烷基；4－7元杂环基；或8－11元杂二环基，其中T任选地被一个或多个相同或不同的R9取代；
R9是卤素；-CN；氧代(＝O)；-C(O)OH；-OH；-S(O)2NH2；-S(O)NH2；-S(O)2OH；-S(O)OH；-SH；-NH2；-NO2；C1-6烷基或C1-10杂烷基；
任选地，基团对R1/R1a、R1/R4、R1/R6、R1/R5、R2/R2a、R2/R3、R4/R4a、R4/R5、R5/R5a、R7/R7a、R7/R8、R8/R8a中的一对或多对与它们所连接的原子一起形成环T；
任选地，R3/R3a与它们所连接的氮原子一起形成4－7元杂环；
条件是R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a、R5、R5a、R6、R7、R7a、R8或R8a的一个氢原子被键替代，所述键使式(M)的原子团与中和VEGF的前药的其余部分连接，即，与载体原子团连接或与任选的间隔基原子团连接。
更优选地，中和VEGF的前药包含式(F)的可逆的前药连接基原子团-中和VEGF的生物学活性原子团。
甚至更优选地，中和VEGF的前药包含式(F)的可逆的前药连接基原子团-中和VEGF的生物学活性原子团，并且与前药的其余部分的连接、即与载体原子团的连接或者与任选的与载体连接的间隔基的连接是通过X的R4或式(F)的R3进行的，最优选是通过式(F)的R4进行的。
甚至更优选地，中和VEGF的前药包含式(F-i)的原子团：
其中
虚线表示与载体连接或与任选的间隔基原子团连接；
R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、X1、X2和D如式(F)中所使用的那样；
任选地，式(F-i)的原子团进一步被取代，条件是式(F-i)中用星号标记的水凝胶不被取代基替代，并且R3和R3a彼此独立地是H或通过SP3-杂化碳原子与N连接。
优选地，式(F-i)的X1是C。
在一个实施方案中，式(F-i)的X2是C(R7R7a)。
在另一个实施方案中，式(F-i)的X2是C(R7R7a)-C(R8R8a)。
优选地，式(F-i)的R1是H。
优选地，式(F-i)的R1a是H。
优选地，式(F-i)的R1和R1a均为H。
优选地，式(F-i)的R2是H。
优选地，式(F-i)的R2a是H。
优选地，式(F-i)的R2和R2a是H。
优选地，式(F-i)的R3是H或甲基、乙基或丙基。
优选地，式(F-i)的R3a是H或甲基、乙基或丙基。
在一个优选的实施方案中，式(F-i)的R3和R3a均为H。
在另一个优选的实施方案中，式(F-i)的R3是H且式(F-i)的R3a是甲基。
在另一个优选的实施方案中，式(F-i)的R3和R3a均为甲基。
优选地，式(F-i)的D是雷珠单抗。
优选地，式(F-i)的载体是水凝胶，更优选是基于PEG的水凝胶。
在一个优选的实施方案中，中和VEGF的前药包含式(f-ii)的原子团
其中
虚线表示与载体连接；
R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、X2和D如式(F)中所定义的那样使用；
R10选自H和C1-6烷基；
SP0是间隔基原子团；
且其中式(F-ii)的原子团任选地进一步被取代，条件是式(F-ii)中用星号标记的水凝胶不被取代基替代，并且R3和R3a彼此独立地是H或通过SP3-杂化碳原子与N连接。
在一个实施方案中，式(F-ii)的X2是C(R7R7a)。
在另一个实施方案中，式(F-ii)的X2是C(R7R7a)-C(R8R8a)。
优选地，式(F-ii)的R1是H。
优选地，式(F-ii)的R1a是H。
优选地，式(F-ii)的R1和R1a均为H。
优选地，式(F-ii)的R2是H。
优选地，式(F-ii)的R2a是H。
优选地，式(F-ii)的R2和R2a是H。
优选地，式(F-ii)的R3是H或甲基、乙基或丙基。
优选地，式(F-ii)的R3a是H或甲基、乙基或丙基。
在一个优选的实施方案中，式(F-ii)的R3和R3a均为H。
在另一个优选的实施方案中，式(F-ii)的R3是H且式(F-ii)的R3a是甲基。
在另一个优选的实施方案中，式(F-ii)的R3和R3a均为甲基。
在一个实施方案中，式(F-ii)的R10是H。
在另一个优选的实施方案中，式(F-ii)的R10是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基。更优选地，式(F-ii)的R10是甲基、乙基、丙基或异丙基。甚至更优选地，式(F-ii)的R10是甲基或乙基，最优选地，式(F-ii)的R10是甲基。
优选地，式(F-ii)的SP0选自C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基，所述C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选地被一个或多个相同或不同的Ra10取代，且其中C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选地被一个或多个选自以下的基团中断：T、-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(Ra11)-；-S(O)2N(Ra11)-；-S(O)N(Ra11)-；-S(O)2-；-S(O)-；-N(Ra11)S(O)2N(Ra11a)-；-S-；-N(Ra11)-；-OC(O)Ra11；-N(Ra11)C(O)-；-N(Ra11)S(O)2-；-N(Ra11)S(O)-；-N(Ra11)C(O)O-；-N(Ra11)C(O)N(Ra11a)-；和-OC(O)N(Ra11Ra11a)；
T选自苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢萘基；C3-10环烷基；4－7元杂环基；或8－11元杂二环基，其中T任选地被一个或多个相同或不同的Ra10取代；
Ra10是卤素；CN；氧代(＝O)；COORa12；ORa12；C(O)Ra12；C(O)N(Ra12Ra12a)；S(O)2N(Ra12Ra12a)；S(O)N(Ra12Ra12a)；S(O)2Ra12；S(O)Ra12；N(Ra12)S(O)2N(Ra12aRa12b)；SRa12；N(Ra12Ra12a)；NO2；OC(O)Ra12；N(Ra12)C(O)Ra12a；N(Ra12)S(O)2Ra12a；N(Ra12)S(O)Ra12a；N(Ra12)C(O)ORa12a；N(Ra12)C(O)N(Ra12aRa12b)；OC(O)N(Ra12Ra12a)；或C1-6烷基，其中C1-6烷基任选地被一个或多个相同或不同的卤素取代；
Ra11、Ra11a、Ra12、Ra12a、Ra12b独立地选自H；或C1-6烷基，其中C1-6烷基任选地被一个或多个相同或不同的卤素取代。
优选地，式(F-ii)的SP0是C1-20烷基，所述C1-20烷基任选被一个或多个独立地选自以下的基团中断：-O-；和-C(O)N(R1aa)-；且所述C1-20烷基链任选地被一个或多个独立地选自以下的基团取代：OH；和-C(O)N(R1aaR1aaa)；其中R1aa、R1aaa独立地选自H；和C1-4烷基。
优选地，式(F-ii)的SP0具有14g/mol－750g/mol的分子量。
优选地，式(F-ii)的SP0通过末端基团与载体连接，所述末端基团选自
在式(F-ii)的SP0具有所述末端基团的情况下，另外优选的是，在不计算所述末端基团的情况下，SP0具有14g/mol－500g/mol的分子量。
优选地，式(F-ii)的D是雷珠单抗。
优选地，式(F-ii)的载体是水凝胶，更优选是基于PEG的水凝胶。
甚至更优选地，中和VEGF的前药包含式(F-iiia)或(F-iiib)的原子团：
其中
虚线表示与载体连接；
R2、R2a、R3、R3a、R7、R7a、R8、R8a、X2和D如式(F)中所定义的那样使用；
R10和SP0如式(F-ii)中所定义的那样使用；
且其中式(F-iiia)或(F-iiib)的原子团任选进一步被取代，条件是式(F-iiia)和(F-iiib)中用星号标记的氢不被取代基替代，并且R3和R3a彼此独立地是H或通过SP3-杂化碳原子与N连接。
优选地，式(F-iiia)或(F-iiib)的SP0是C1-20烷基，所述C1-20烷基任选地被一个或多个独立地选自以下的基团中断：-O-；和-C(O)N(R1aa)-；且所述C1-20烷基链任选地被一个或多个独立地选自以下的基团中断：OH；和-C(O)N(R1aaR1aaa)；其中R1aa、R1aaa独立地选自H；和C1-4烷基。
优选地，式(F-iiia)或(F-iiib)的SP0具有14g/mol－750g/mol的分子量。
优选地，式(F-iiia)或(F-iiib)的SP0通过末端基团与载体连接，所述末端基团选自
在式(F-iiia)或(F-iiib)的SP0具有所述的末端基团的情况下，另外优选的是，在不计算所述末端基团的情况下，SP0具有14g/mol－500g/mol的分子量。
优选地，式(F-iiia)或(F-iiib)的R2是H。
优选地，式(F-iiia)或(F-iiib)的R2a是H。
优选地，式(F-iiia)或(F-iiib)的R2和R2a是H。
优选地，式(F-iii)的R3是H或甲基、乙基或丙基。
优选地，式(F-iii)的R3a是H或甲基、乙基或丙基。
在一个优选的实施方案中，式(F-iii)的R3和R3a均为H。
在另一个优选的实施方案中，式(F-iii)的R3是H且式(F-iii)的R3a是甲基。
在另一个优选的实施方案中，式(F-iii)的R3和R3a均为甲基。
优选地，式(F-iiia)或(F-iiib)的R7是H。
优选地，式(F-iiia)或(F-iiib)的R7a是H。
优选地，式(F-iiib)的R8是H。
优选地，式(F-iiib)的R8a是H。
优选地，式(F-iiib)的R8和R8a均为H。
优选地，式(F-iiia)的R10是H。
优选地，式(F-iiib)的R10是甲基、乙基或丙基。最优选地，式(F-iiib)的R10是甲基。
优选地，式(F-iiia)或(F-iiib)的D是雷珠单抗。
优选地，式(F-iiia)或(F-iiib)的载体是水凝胶，更优选是基于PEG的水凝胶。
甚至更优选地，中和VEGF的前药包含式(F-iva)或(F-ivb)的原子团：
其中
虚线表示与载体连接；
R3和R3a如式(I)中所定义的那样使用；
R10b是C1-6烷基；
且其中式(F-iva)或(F-ivb)的原子团任选地进一步被取代，条件是星号标记的氢不被取代基替代，并且R3和R3a彼此独立地是H或通过SP3-杂化碳原子与N连接。
优选地，式(F-iva)和(F-ivb)的SP0是C1-20烷基，所述C1-20烷基任选地被一个或多个独立地选自以下的基团中断：-O-；和-C(O)N(R1aa)-；且所述C1-20烷基链任选地被一个或多个独立地选自以下的基团取代：OH；和-C(O)N(R1aaR1aaa)；其中R1aa、R1aaa独立地选自H；和C1-4烷基。
优选地，式(F-iva)和(F-ivb)的SP0具有14g/mol－750g/mol的分子量。
优选地，式(F-iva)和(F-ivb)的SP0通过末端基团与载体连接，所述末端基团选自
在式(F-iva)和(F-ivb)的SP0具有所述的末端基团的情况下，另外优选的是，在不计算所述末端基团的情况下，SP0具有14g/mol－500g/mol的分子量。
优选地，式(F-iva)或(F-ivb)的R3是H或甲基、乙基或丙基。
优选地，式(F-iva)或(F-ivb)的R3a是H或甲基、乙基或丙基。
在一个优选的实施方案中，式(F-iva)或(F-ivb)的R3和R3a均为H。
在另一个优选的实施方案中，式(F-iva)或(F-ivb)的R3是H且式(F-iva)或(F-ivb)的R3a是甲基。
在另一个优选的实施方案中，式(F-iva)或(F-ivb)的R3和R3a均为甲基。
在另一个优选的实施方案中，式(F-iva)或(F-ivb)的R3是H且式(F-iva)或(F-ivb)的R3a是甲基。
优选地，式(F-ivb)的R10b是甲基、乙基或丙基。最优选地，R10b是甲基。
优选地，式(F-iva)和(F-ivb)的D是雷珠单抗。
优选地，式(F-iva)和(F-ivb)的载体是水凝胶，更优选是基于PEG的水凝胶。
在一个实施方案中，所述的中和VEGF的前药包含结合的形式的选自以下药物组的生物学活性原子团：靶向于VEGF核酸的反义RNA、反义DNA、核酶或RNAi分子；防止VEGF与其关联(cognate)受体结合的抗-VEGF适配体、抗-VEGF抗体、抗-VEGF抗体片段、DARPins和可溶性VEGF受体诱杀剂；靶向于关联VEGF受体(VEGFR)核酸的反义、核酶和RNAi分子；与关联VEGFR受体结合的抗-VEGFR适配体或抗-VEGFR抗体；与关联VEGFR受体结合的抗-VEGFR抗体片段和VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。
在一个优选的实施方案中，所述的中和VEGF的前药包含结合的形式的选自以下药物组的生物学活性原子团：靶向于VEGF核酸的反义RNA、反义DNA、核酶或RNAi分子；防止VEGF与其关联受体结合的抗-VEGF适配体、抗-VEGF抗体、DARPins和可溶性VEGF受体诱杀剂；靶向于关联VEGF受体(VEGFR)核酸的反义、核酶和RNAi分子；与关联VEGFR受体结合的抗-VEGFR适体配或抗-VEGFR抗体；和VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。
优选地，所述的中和VEGF的前药包含结合的形式的选自以下的生物学活性原子团：雷珠单抗、贝伐珠单抗、培加他尼、阿柏西普、MP0112、KH902、ESBA1008、AL 39324、ALG-1001和bevasiranib和/或其片段。
更优选地，所述的中和VEGF的前药选自雷珠单抗、贝伐珠单抗、培加他尼、阿柏西普和bevasiranib和/或其片段。
最优选地，所述的中和VEGF的前药是雷珠单抗。
在一个实施方案中，用本发明的药物组合物治疗的眼病症是以眼的新血管形成为特征的疾病。
眼内新血管形成优选选自视神经盘新血管形成、虹膜新血管形成、视网膜新血管形成、脉络膜新血管形成、角膜新血管形成、玻璃体新血管形成、青光眼、血管翳、翼状胬肉、黄斑水肿、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性视网膜缺血、糖尿病性黄斑水肿、血管性视网膜病变(vascular retinopathy)、视网膜变性、晶体后纤维组织形成(retrolental fibroplasias)、视网膜母细胞瘤、黄斑变性的早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity of macular degeneration)、角膜移植物新血管形成(corneal graft neovascularization)、视网膜中央静脉阻塞(centralretinal vein occlusion)(CRVO)、病理性近视、眼肿瘤、眼色素层炎、眼的炎性疾病和增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy)。
在一个实施方案中，所述药物组合物还包含一种或多种游离形式的药物，其选自以下药物种类列表：靶向于VEGF核酸的反义RNA、反义DNA、核酶或RNAi分子；防止VEGF与其关联受体结合的抗-VEGF适配体、抗-VEGF抗体、抗-VEGF抗体片段、DARPins、anticalins、脂质运载蛋白(lipocalin)和可溶性VEGF受体诱杀剂；靶向于关联VEGF受体(VEGFR)核酸的反义、核酶和RNAi分子；与关联VEGFR受体结合的抗-VEGFR适配体或抗-VEGFR抗体；与关联VEGFR受体结合的抗-VEGFR抗体片段和VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。
在一个优选的实施方案中，所述药物组合物还包含一种或多种游离形式的药物，其选自以下药物种类列表：靶向于VEGF核酸的反义RNA、反义DNA、核酶或RNAi分子；防止VEGF与其关联受体结合的抗-VEGF适配体、抗-VEGF抗体、DARPins、anticalins、脂质运载蛋白和可溶性VEGF受体诱杀剂；靶向于关联VEGF受体(VEGFR)核酸的反义、核酶和RNAi分子；与关联VEGFR受体结合的抗-VEGFR适配体或抗-VEGFR抗体；和VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。
优选地，所述药物组合物还包含一种或多种活性成分，其可以是类固醇、抗炎化合物、抗生素和抗病毒药、抗真菌药或抗血管生成化合物。例如，所述活性成分可以是甲氨蝶呤、视黄酸、阿司匹林、双氯芬酸、氟比洛芬、布洛芬、酮咯酸、萘普生、uprofen、地塞米松、可的松、氟轻松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松或曲安西龙。
在一个优选的实施方案中，所述药物组合物还包含游离形式的一种或多种蛋白质活性的一种或多种调节剂，所述蛋白质选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、转化生长因子α(TGFa)、转化生长因子β(TGFβ)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管生成素、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、白介素-1(IL-1)、白介素-8(IL-8)、白介素-12、血管内皮生长因子(VEGF)、促血管生成素-I(angiopoietin-I)、Del-I、促滤泡素抑制素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、瘦蛋白、中期因子、胎盘生长因子、多效营养因子(PTN)、颗粒蛋白前体(progranulin)、增殖蛋白、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、促血管生成素休息素(angioarrestin)、制管张素纤溶酶原片段、抗血管生成抗凝血酶III、软骨衍生抑制剂(cartilage-derived inhibitor)(CDI)、CDS9补体片段、内皮抑制素胶原XVIII片段、纤连蛋白片段、gro-β、肝素酶、肝素多聚己糖片段、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、干扰素α/β/γ、干扰素诱导蛋白(interferoninducible protein)(IP-IO)、三环S纤溶酶原(kringle S plasminogen)片段、金属蛋白酶抑制剂(TIMP)、2-甲氧基雌二醇、胎盘核糖核酸酶抑制剂、纤溶酶原激活物抑制剂、血小板因子-4(PF4)、催乳素16kD片段、增殖蛋白-相关蛋白(PRP)、类视黄醇、四氢皮质醇-S、血小板反应蛋白-I(TSP-I)、血管抑制素(vasculostatin)、血管内皮抑制素(vasostatin)钙网蛋白片段、前列腺素受体、生长激素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、1-磷酸鞘氨醇、因子D、RTP801、补体抑制剂、α2肾上腺素能激动剂、mTOR、睫状神经营养因子(CNTF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)、晶状体上皮衍生生长因子(LEDGF)、杆细胞来源视锥细胞活性因子(rod-derived cone viability factor)(RdCVF)、色素上皮衍生因子(PEDF)、嗜中性白细胞活化蛋白、单核细胞趋化蛋白、巨噬细胞炎性蛋白、小诱导分泌(SIS)蛋白(small inducible secreted(SIS)protein)、血小板因子、血小板碱性蛋白、黑素瘤生长刺激活性、表皮生长因子、神经生长因子、骨形态发生蛋白(bone morphogenic protein)、骨生长软骨诱导因子、白介素、白介素抑制剂、白介素受体、造血因子(hematopoietic factor)、粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、抑制素和激活蛋白。
优选的补体抑制剂是C1抑制剂、C3抑制剂和C5抑制剂。
优选的生长因子抑制剂是血小板衍生生长因子(PDGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)、晶状体上皮衍生生长因子(LEDGF)、杆细胞来源视锥细胞活性因子(RdCVF)和色素上皮衍生因子(PEDF)。
优选的骨生长软骨诱导因子是骨生长软骨诱导因子α和骨生长软骨诱导因子β。
优选的造血因子是红细胞生成素。
在另一个实施方案中，所述药物组合物还包含一种或多种前药，所述的一种或多种前药包含结合的形式的选自以下的生物学活性原子团：靶向于VEGF核酸的反义RNA、反义DNA、核酶或RNAi分子；防止VEGF与其关联受体结合的抗-VEGF适配体、抗-VEGF抗体、DARPins、anticalins、脂质运载蛋白和可溶性VEGF受体诱杀剂；靶向于关联VEGF受体(VEGFR)核酸的反义、核酶和RNAi分子；与关联VEGFR受体结合的抗-VEGFR适配体或抗-VEGFR抗体；和VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。
在另一个优选的实施方案中，所述药物组合物还包含一种或多种另外的前药，所述的一种或多种另外的前药包含结合的形式的生物学活性原子团，所述的生物学活性原子团是一种或多种蛋白活性的调节剂，所述蛋白质选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、转化生长因子α(TGFa)、转化生长因子β(TGFβ)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管生成素、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、白介素-1(IL-1)、白介素-8(IL-8)、白介素-12、血管内皮生长因子(VEGF)、促血管生成素-I、Del-I、促滤泡素抑制素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、瘦蛋白、中期因子、胎盘生长因子、多效营养因子(PTN)、颗粒蛋白前体、增殖蛋白、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、促血管生成素休息素、制管张素纤溶酶原片段、抗血管生成抗凝血酶III、软骨衍生抑制剂(CDI)、CDS9补体片段、内皮抑制素胶原XVIII片段、纤连蛋白片段、gro-β、肝素酶、肝素多聚己糖片段、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、干扰素α/β/γ、干扰素诱导蛋白(IP-IO)、三环S纤溶酶原片段、金属蛋白酶抑制剂(TIMP)、2-甲氧基雌二醇、胎盘核糖核酸酶抑制剂、纤溶酶原激活物抑制剂、血小板因子-4(PF4)、催乳素16kD片段、增殖蛋白-相关蛋白(PRP)、类视黄醇、四氢皮质醇-S、血小板反应蛋白-I(TSP-I)、血管抑制素、血管内皮抑制素钙网蛋白片段、前列腺素受体、生长激素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、1-磷酸鞘氨醇、因子D、RTP801、补体抑制剂、α2肾上腺素能激动剂、mTOR、睫状神经营养因子(CNTF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)、晶状体上皮衍生生长因子(LEDGF)、杆细胞来源视锥细胞活性因子(RdCVF)、色素上皮衍生因子(PEDF)、嗜中性白细胞活化蛋白、单核细胞趋化蛋白、巨噬细胞炎性蛋白、小诱导分泌(SIS)蛋白、血小板因子、血小板碱性蛋白、黑素瘤生长刺激活性、表皮生长因子、神经生长因子、骨形态发生蛋白、骨生长软骨诱导因子、白介素、白介素抑制剂、白介素受体、造血因子、粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、抑制素和激活蛋白。
在一个实施方案中，所述的一种或多种另外的药物是前药的形式。
本发明的药物组合物包含一种或多种赋形剂。可以将赋形剂分类为缓冲剂、等张性调节剂、防腐剂、稳定剂、抗吸附剂、氧化保护剂、增粘剂(viscosifier)/粘度增强剂或其它辅助物质。在一些情况下，这些成分可以具有双重或三重功能。所述药物组合物可以包含一种或多种选自以下的赋形剂：
(i)缓冲剂：将pH维持在所需的范围内的生理学上耐受的缓冲剂，例如磷酸钠、碳酸氢盐、琥珀酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和乙酸盐、硫酸盐、硝酸盐、氯化物、丙酮酸盐。还可以使用抗酸剂，例如Mg(OH)2或ZnCO3。可以调整缓冲容量以匹配对pH稳定性最敏感的条件；
(ii)等张性调节剂：用于将因注射侧的渗透压差造成的细胞损伤所导致的疼痛减至最低。实例有甘油和氯化钠。可以通过渗透压测定法测定有效浓度；
(iii)防腐剂和/或抗微生物剂：用于将注射时被感染的患者风险降至最低。典型的防腐剂包括间-甲酚、苯酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、苄醇、硝酸苯汞、硫柳汞(thimerosol)、山梨酸、山梨酸钾、苯甲酸、氯甲酚和苯扎氯铵；
(iv)稳定剂：稳定是通过强化稳定蛋白质的力、使变性状态去稳定化或通过使赋形剂直接结合蛋白质实现的。稳定剂可以是氨基酸例如丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、糖例如葡萄糖、蔗糖、海藻糖、多元醇例如甘油、甘露醇、山梨醇、盐例如磷酸钾、硫酸钠、螯合剂例如EDTA、六磷酸盐、配体例如二价金属离子(锌、钙等)、其它盐或有机分子例如酚衍生物。此外，可以使用寡聚体或聚合物例如环糊精、葡聚糖、树枝状聚合物、PEG或PVP或鱼精蛋白或HAS；
(v)抗吸附剂：主要使用离子型或非离子型表面活性剂或其它蛋白或可溶性聚合物竞争性地包被或吸附至例如药物组合物容器的内表面。适合的表面活性剂是例如烷基硫酸盐，例如十二烷基硫酸铵和十二烷基硫酸钠；烷基醚硫酸盐，例如月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠和肉豆蔻基聚氧乙烯醚硫酸钠(sodium myreth sulfate)；磺酸盐，例如琥珀酸二辛酯磺酸钠、全氟辛烷磺酸盐(perfluorooctanesulfonate)、全氟丁烷磺酸盐(perfluorobutanesulfonate)、烷基苯磺酸盐；磷酸盐，例如烷基芳基醚磷酸盐和烷基醚磷酸盐；羧酸盐，例如脂肪酸盐(皂)或硬脂酸钠、月桂酰基肌氨酸钠、全氟壬酸盐、全氟辛酸盐；奥替尼啶二盐酸盐；季铵阳离子，例如溴化十六烷基三甲基铵、氯化十六烷基三甲基铵、西吡氯铵、聚乙氧基化动物脂胺(polyethoxylatedtallow amine)、苯扎氯铵、氯化苄乙氧铵、5-溴-5-硝基-1,3-二烷、氯化二甲基二十八烷基铵、溴化二十八烷基二甲基铵；两性离子，例如3-[(3-胆酰氨基(cholamido)丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐、椰油酰氨基丙基羟基磺内盐(cocamidopropyl hydroxysultaine)、氨基酸、亚氨酸、椰油酰氨基丙基甜菜碱、卵磷脂；脂肪醇，例如鲸蜡醇、十八烷醇、十八醇十六醇混合物、油醇；聚乙二醇烷基醚，例如八乙二醇单十二烷基醚、五乙二醇单十二烷基醚；聚丙二醇醇烷基醚；糖苷烷基醚，例如癸基糖苷、月桂基糖苷、辛基糖苷；聚乙二醇辛基苯酚醚，例如Triton X-100；聚乙二醇烷基苯酚醚，例如壬苯醇醚-9；甘油烷基酯，例如月桂酸甘油酯；聚乙二醇失水山梨醇烷基酯，例如聚山梨酯；失水山梨醇烷基酯；椰油酰胺MEA和椰油酰胺DEA；十二烷基二甲基胺氧化物；聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物，例如伯洛沙姆(Pluronic F-68)、PEG十二烷基醚(Brij35)、聚山梨酯20和80；其它抗吸附剂是葡聚糖、聚乙二醇、PEG-聚组氨酸、BSA和HSA和明胶。所选择的赋形剂的浓度和类型取决于所要避免的作用，但典型地恰好在CMC值以上的界面形成单层表面活性剂；
(vi)冻干和/或冷冻保护剂：在冷冻-或喷雾-干燥过程中，赋形剂可以抵消氢键断裂和除去水所导致的去稳定化作用。为了实现该目的，可以使用糖和多元醇，但是对表面活性剂、氨基酸、非水性溶剂和其它肽也已经观察到了相应的积极作用。海藻糖特别有效地减少潮湿引起的聚集并且还改善因蛋白质疏水性基团暴露于水而可能导致的热稳定性。也可以使用甘露醇和蔗糖，作为仅有的冻干/冷冻保护剂或彼此组合，其中已知较高比例的甘露醇:蔗糖增强冻干饼的物理稳定性。甘露醇还可以与海藻糖组合使用。海藻糖也可以与山梨醇组合使用或将山梨醇用作仅有的保护剂。也可以使用淀粉或淀粉衍生物；
(vii)氧化保护剂：抗氧化剂，例如抗坏血酸、ectoine、甲硫氨酸、谷胱甘肽、一硫代甘油、桑黄素、聚乙烯亚胺(PEI)、棓酸丙酯、维生素E、螯合剂例如柠檬酸、EDTA、六磷酸盐、巯基乙酸；
(viii)铺展或扩散剂：通过水解细胞内空间中的细胞外基质组分改变结缔组织的渗透性，例如、但不限于透明质酸，即在结缔组织的细胞间隙中发现的多糖。铺展剂(例如、但不限于透明质酸酶)暂时性地降低细胞外基质的粘度并促进注射的药物扩散；
(ix)其它辅助物质：例如湿润剂、粘度调节剂、抗生素、透明质酸酶。酸和碱例如盐酸和氢氧化钠是制备过程中用于pH调节所必需的辅助物质；
药物组合物可以是干燥、液体或混悬剂药物组合物的形式。
干燥、液体或混悬剂形式的药物组合物可以是单剂量或多剂量药物组合物的形式。
在本发明的一个实施方案中，干燥、液体或混悬剂形式的药物组合物以单剂量的形式被提供，意思是提供它的容器含有一个药物剂量。
在另一个实施方案中，干燥、液体或混悬剂药物组合物是多剂量药物组合物，意思是提供它的容器含有多余一个的治疗剂量，即，多剂量组合物含有至少2个剂量。所述的多剂量药物组合物可以用于需要其的不同患者或者可以用于一名患者，其中在施用第一剂量后储存其余剂量备用。
优选地，药物组合物以单剂量的形式被提供。
在本发明的另一个方面，药物组合物在容器中。用于干燥、液体或混悬剂药物组合物的适合的容器是例如注射器、小瓶、带有塞子和密封物的小瓶、安瓿和药筒(cartridge)。特别地，干燥、液体或混悬剂药物组合物在注射器中被提供。如果药物组合物是干燥药物组合物，则容器优选是双室注射器。在这类实施方案中，所述干燥药物组合物在双室注射器的第一个室中被提供，重构溶液在双室注射器的第二个室中被提供。
在给需要其的患者施用干燥药物组合物之前，将干燥组合物重构。重构可以在提供所述干燥组合物的容器中进行，例如在小瓶、注射器、双室注射器、安瓿和药筒中进行。通过向干燥组合物中加入既定量的重构溶液进行重构。重构溶液是无菌液体，例如水或缓冲液，其可以含有另外的添加剂，例如防腐剂和/或抗微生物剂，例如苄醇和甲酚。优选地，重构溶液是无菌水。当重构干燥药物组合物时，其被称作“重构的药物组合物”或“重构的药物组合物”或“重构的组合物”。
优选地，所述药物组合物是液体或混悬剂。
本发明的另一个方面是套药盒(a kit of parts)。
如果施用装置简单地是皮下注射器，则所述药盒可以包含注射器、针头以及包含与注射器一起使用的干燥药物组合物的容器和包含重构溶液的第二容器。
如果药物组合物是液体或混悬剂药物组合物，则所述药盒可以包含注射器、针头以及包含与注射器一起使用的液体或混悬剂药物组合物的容器。
实施例
材料和方法
在下面的实施例中Lucentis和雷珠单抗自始至终作为同义词使用。
材料：
氨基4-臂PEG5000得自JenKem Technology,北京,中华人民共和国。CithrolTM DPHS得自Croda International Pic,Cowick Hall,英国。
顺式-1,4-环己烷二甲酸得自TCI EUROPE N.V.,Boerenveldseweg 6-Haven 1063,2070Zwijndrecht,比利时。
异丙基丙二酸得自ABCR GmbH&Co.KG,76187Karlsruhe,德国。
N-(3-马来酰亚氨基丙基)-39-氨基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-三十九烷酸(nonatriacontanoic acid)五氟苯基酯(Mal-PEG12-PFE)得自Biomatrik Inc.,嘉兴,中华人民共和国。
Oxyma pure、HATU、HOAt、HOBt、PyBOP、TBTU、COMU、Fmoc-L-Asp(OBzl)-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-His(OTrt)-OH、Fmoc-Ado-OH和Rink酰胺树脂购自Merck Biosciences GmbH,Schwalbach/Ts,德国。
Boc-Lys(Boc)-OSu购自Senn chemicals AG,Dielsdorf,瑞士。Fmoc-N-Me-L-Asp(OtBu)-OH购自Bachem,Bubendorf,瑞士。Fmoc-N-Me-L-Asp(OBzl)-OH购自Peptides International,Louisville,KY,美国。1,9-双-Boc-1,5,9-三氮杂壬烷购自PolyPeptide Laboratories A/S,丹麦。
碳酸(5-甲基-2-氧代-1,3-间二氧杂环戊烯-4-基)-甲基酯4-硝基苯基酯购自Chemzon Scientific Inc.,Lachine,QC,加拿大。
α-[3-(o-吡啶基二硫)丙酰基酰氨基]-ω-琥珀酰亚胺基酯十二(乙二醇)(α-[3-(o-pyridyldisulfido)propanoylamido]-ω-succinimidyl esterdodeca(ethylene glycol))(OPSS-PEG12-NHS)购自Iris Biotech GmbH,Marktredwitz,德国。
所有其它化学物质均来自Sigma-ALDRICH Chemie GmbH,Taufkirchen,德国。
方法：
反应是用储存在购自Sigma-ALDRICH Chemie GmbH,Taufkirchen,德国的分子筛上的干燥溶剂(DCM、THF、ACN、DMF、二烷、MeOH、甲苯)进行的。一般而言，将反应在室温下搅拌并且用HPLC/MS或TLC监测。
RP-HPLC分别使用连接至Waters 600或2535 HPLC系统和Waters2487或2489吸光度检测器的100x20mm或100x40mm C18 ReproSil-Pur300 ODS-35μ柱(Dr.Maisch,Ammerbuch,德国)或XBridge BEH300C18OBD Prep 10μm 30x150mm或5μm 10x150mm(Waters,Eschborn,德国)进行。使用溶液A(0.1％TFA的H2O溶液)和溶液B(0.1％TFA的乙腈溶液)的线性梯度。将含有产物的HPLC级分合并并且冻干。
使用来自Biotage AB,瑞典的Isolera One系统、应用Biotage KP-Sil硅胶短柱并且用正-庚烷、乙酸乙酯和甲醇作为洗脱液进行闪式色谱法纯化。在254nm检测产物。对于未显示出高于240nm吸光度的产物，用LC/MS筛选级分。
使用装配有与来自Thermo Scientific的LTQ Orbitrap Discovery质谱仪偶联的Waters BEH300C18柱(2.1x 50mm,1.7μm粒度)的WatersAcquity系统进行分析型超高效LC(UPLC)。
HPLC-电喷雾电离质谱法(HPLC-ESI-MS)是使用带有与ThermoLTQ Orbitrap Discovery高分辨率/高精确度质谱仪偶联的Acquity PDA检测器的Waters Acquity UPLC或者使用Waters Micromass ZQ进行的，所述的Waters Acquity UPLC或Waters Micromass ZQ均装配有WatersACQUITY UPLC BEH300C18RP柱(2.1x 50mm,1.7μm,流速：0.25mL/min；溶剂A：UP-H2O+0.04％TFA,溶剂B：UP-乙腈+0.05％TFA。
PEG产物的MS光谱显示出一系列(CH2CH2O)n原子团，这归因于PEG起始材料的多分散性。为了更容易解释，在实施例中仅给出了一个单代表性m/z信号。
缓冲液交换是使用与Aekta Purifier 100系统连接的HiTrap或HiPrep柱(GE Healthcare)进行的。
阳离子交换色谱法是使用与Aekta Purifier 100系统连接的Source 15S 6mL柱、应用20mM MES,pH 5.7和20mM MES,500mM NaCl,pH 5.7分别作为流动相A和B进行的。
实施例1
骨架试剂1a和1g的合成：
骨架试剂1a是如WO 2011/012715A1的实施例1中所述的那样合成的，不同之处在于使用Boc-DLys(Boc)-OH代替Boc-LLys(Boc)-OH。
MS：m/z 888.50＝[M+10H+]10+(计算值＝888.54)
骨架试剂1g是根据以下方案由氨基4-臂PEG50001b合成的：
为了合成化合物1b，将氨基4-臂PEG5000(MW约5350g/mol,10.7g,2.00mmol,HCl盐)和碳酸双(五氟苯基)酯(4.73g,12.0mmol)溶于43mLDCM(无水的)，在室温加入DIPEA(3.10g,24.0mmol,4.18mL)。10min后，加入1,9-双-boc-1,5,9-三氮杂壬烷(5.30g,16.0mmol)，将该混合物搅拌15min。然后加入另外的1,9-双-boc-1,5,9-三氮杂壬烷(0.33g,1.0mmol)。完全溶解后，过滤该反应混合物，在室温蒸发溶剂。
将残余物溶于40mL iPrOH，用320mL MTBE稀释。使产物在-20℃沉淀过夜。通过用玻璃滤器Por.3过滤收集沉淀，用200mL冷却的MTBE(0℃)洗涤。真空干燥产物过夜。
收率11.1g(83％)白色固体1b。
MS：m/z 1112.86＝[M+6H]6+(计算值＝1113.04).
为了合成化合物1c，将boc-保护的化合物1b(11.1g,1.66mmol)溶于40mL 3M HCl的MeOH溶液，在45℃搅拌20min，然后在55℃搅拌10min。为了进行沉淀，加入10mL MeOH和200mL MTBE，将该混合物在-20℃储存16h。通过用玻璃滤器Por.3过滤收集沉淀，用200mL冷却的MTBE(0℃)洗涤。真空干燥产物过夜。
收率9.14g(89％)白色粉末1c(HCl盐)。
MS：m/z 979.45＝[M+6H]6+(计算值＝979.55)。
为了合成化合物1d，将化合物1c(9.06g,1.47mmol,HCl盐)和碳酸双(五氟苯基)酯(6.95g,17.6mmol)溶于50mL DCM(无水的)，在室温加入DIPEA(4.56g,35.3mmol,6.15mL)。10min后，加入1,9-双-boc-1,5,9-三氮杂壬烷(7.80g,23.5mmol)，将该混合物搅拌15min。然后加入另外的1,9-双-boc-1,5,9-三氮杂壬烷(0.49g,1.5mmol)。完全溶解后，在室温蒸发溶剂。
在40℃将残余物溶于35mL iPrOH，用200mL MTBE稀释。产物在-20℃沉淀过夜。通过用玻璃滤器Por.3过滤收集沉淀，用200mL冷却的MTBE(0℃)洗涤。真空干燥产物过夜，得到1d，为白色固体。
收率11.6g(90％)白色固体1d。
MS：m/z 1248.08＝[M+7H]7+(计算值＝1248.27)。
为了合成化合物1e，将boc-保护的化合物1d(11.4g,1.31mmol)溶于40mL 3M HCl的MeOH溶液，在45℃搅拌20min，然后在55℃搅拌10min。为了沉淀，加入10mL MeOH和200mL MTBE，将该混合物在-20℃储存16h。通过用玻璃滤器Por.3过滤收集沉淀，用200mL冷却的MTBE(0℃)洗涤。真空干燥产物过夜，得到白色粉末1e。
收率7.60g(75％)白色粉末1e(HCl盐)。
MS：m/z 891.96＝[M+8H]8+(计算值＝892.13)。
为了合成化合物1f，将化合物1e(7.56g,0.980mmol,HCl盐)和碳酸双(五氟苯基)酯(9.27g,23.0mmol)溶于250mL DCM(无水的)，在35℃加入DIPEA(6.08g,47.0mmol,8.19mL)。10min后，加入1,9-双-boc-1,5,9-三氮杂壬烷(5.30g,16.0mmol)，将该混合物搅拌15min。然后加入另外的1,9-双-boc-1,5,9-三氮杂壬烷(0.33g,1.0mmol)。完全溶解后，在室温蒸发溶剂。
将残余物在60℃溶于250mL iPrOH，用1350mL MTBE稀释。在-20℃沉淀产物过夜。通过用玻璃滤器Por.3过滤收集沉淀，用400mL冷却的MTBE(0℃)洗涤。真空干燥产物过夜，得到1f，为玻璃状固体。
收率11.1g(83％)玻璃状固体1f。
MS：m/z 1312.01＝[M+10H]10+(计算值＝1312.21)。
为了合成骨架试剂1g，在37℃将boc-保护的化合物1f(7.84g,0.610mmol)溶于16mL MeOH，在室温加入55mL预冷却的4M HCl(4℃)的二烷溶液。在不进行冷却的情况下搅拌该混合物20min。20min后，加入110mL 3M HCl的MeOH溶液。使该溶液在24个Falcon管中分配(50mL)，通过添加40mL冷MTBE(–20℃)沉淀至每支Falcon管。以3214rcf离心1min后，滗析上清液，将玻璃状固体溶于5mL MeOH/Falcon管，再次通过添加40mL冷MTBE(–20℃)沉淀至每支Falcon管。弃去上清液，将剩余的固体真空干燥过夜。
收率5.74g(87％)白色玻璃状固体1g(HCl盐)。
MS：m/z 965.46＝[M+10H]10+(计算值＝965.45)。
实施例2
交联剂试剂2d、2g、2k和2o的合成
根据以下方案由壬二酸一苄基酯和PEG10000制备了交联剂试剂2e：
为了合成壬二酸一苄基酯2a，将壬二酸(37.6g,200mmol)、苄醇(21.6g,200mmol)、对-甲苯磺酸(0.80g,4.2mmol)和240mL甲苯的混合物在迪安-斯达克装置(Dean-Stark apparatus)中回流7h。冷却后，蒸发溶剂，加入300mL饱和NaHCO3水溶液。用3×200mL MTBE萃取该混合物。用Na2SO4干燥合并的有机相，蒸发溶剂。用2×340g二氧化硅纯化产物，使用乙酸乙酯/庚烷(10:90→25:75)作为洗脱液。蒸发洗脱液，将残余物真空干燥过夜。
收率25.8g(46％)无色油状物2a。
MS：m/z 279.16＝[M+H]+(计算值＝279.16)。
为了合成化合物2b，将壬二酸一苄基酯2a(3.90g,14.0mmol)和PEG10000(40.0g,4.00mmol)溶于64mL二氯甲烷，用冰浴冷却。加入DCC(2.89g,14.0mmol)和DMAP(0.024g,0.020mmol)在32mL二氯甲烷中的溶液。除去冰浴，将混合物在室温搅拌过夜。将得到的混悬液冷却至0℃，过滤出固体。真空蒸发溶剂。
将残余物溶于65mL二氯甲烷，在室温用308mL MTBE稀释。将该混合物在–20℃储存过夜。通过用玻璃滤器Por.3过滤收集沉淀，用250mL冷却的MTBE(-20℃)洗涤。真空干燥产物过夜。
收率40.8g(97％)白色粉末2b。
MS：m/z 835.50＝[M+14H]14+(计算值＝835.56)。
为了合成化合物2c，将化合物2b(40.6g,3.86mmol)溶于乙酸甲酯(250mL)，加入203mg披钯炭(palladium on charcoal)。在环境压力的氢气气氛下，将该混合物在室温搅拌过夜。通过celite垫过滤该反应混合物，蒸发滤液，真空干燥过夜。
收率37.2g(93％)玻璃状固体2c。
MS：m/z 882.53＝[M+13H]13+(计算值＝882.51)。
为了合成化合物2d，将化合物2c(32.0g,3.10mmol)和TSTU(3.73g,12.4mmol)在室温溶于150mL二氯甲烷。然后加入DIPEA(1.60g,12.4mmol)，将该混合物搅拌1h。过滤得到的混悬液，用170mL二氯甲烷稀释滤液，用140mL750g水/197g NaCl/3g NaOH溶液洗涤。用MgSO4干燥有机相，真空蒸发溶剂。
将残余物溶于200mL甲苯，用180mL MTBE在室温稀释，在–20℃储存过夜。通过用玻璃滤器Por.3过滤收集沉淀，用100mL冷却的MTBE(-20℃)洗涤。真空干燥产物过夜。
收率28.8g(88％)白色粉末2d。
MS：m/z 795.47＝[M+15H]15+(计算值＝795.54)。
根据以下方案由壬二酸一苄基酯和PEG6000制备了交联剂试剂2g：
为了合成化合物2e，将壬二酸一苄基酯2a(6.50g,23.3mmol)和PEG6000(40.0g,6.67mmol)溶于140mL二氯甲烷，用冰浴冷却。加入DCC(4.81g,23.3mmol)和DMAP(0.040g,0.33mmol)在40mL二氯甲烷中的溶液。除去冰浴，将混合物在室温搅拌过夜。将得到的混悬液冷却至0℃，过滤出固体。真空蒸发溶剂。
将残余物溶于70mL二氯甲烷，用300mL MTBE在室温稀释。将该混合物在–20℃储存过夜。通过用玻璃滤器Por.3过滤收集沉淀，用500mL冷却的MTBE(-20℃)洗涤。真空干燥产物过夜。
收率41.2g(95％)白色粉末2e。
MS：m/z 833.75＝[M+8H]8+(计算值＝833.74).
为了合成化合物2f,，将化合物2e(41.2g,6.32mmol)溶于乙酸甲酯(238mL)和乙醇(40mL)，然后加入400mg披钯炭。在环境压力的氢气气氛下，将该混合物在室温搅拌过夜。通过celite垫过滤该反应混合物，蒸发滤液，真空干燥过夜。
收率38.4g(96％)玻璃状固体2f。
MS：m/z 750.46＝[M+9H]9+(计算值＝750.56)。
为了合成化合物2g，将化合物2f(38.2g,6.02mmol)和TSTU(7.25g,mmol)在室温溶于130mL二氯甲烷，然后加入DIPEA(3.11g,24.1mmol)，将该混合物搅拌1h。过滤得到的混悬液，用100mL二氯甲烷稀释滤液，用200mL 750g水/197g NaCl/3g NaOH溶液洗涤。用MgSO4干燥有机相，真空蒸发溶剂。
将残余物溶于210mL甲苯，用430mL MTBE在室温稀释，在–20℃储存过夜。通过用玻璃滤器Por.3过滤收集沉淀，用450mL冷却的MTBE(0℃)洗涤。真空干燥产物过夜。
收率35.8g(91％)白色粉末2g。
MS：m/z 857.51＝[M+8H]8+(计算值＝857.51)。
根据以下方案由异丙基丙二酸一苄基酯和PEG10000制备了交联剂试剂2k：
为了合成异丙基丙二酸一苄基酯外消旋-2H，将异丙基丙二酸(35.0g,239mmol)、苄醇(23.3g,216mmol)和DMAP(1.46g,12.0mmol)溶于100mL乙腈。用冰浴将混合物冷却至0℃。在0℃在15min内加入DCC(49.4g,239mmol)在150mL乙腈中的溶液。除去冰浴，将该反应混合物在室温搅拌过夜，然后过滤出固体。在40℃真空蒸发滤液，将残余物溶于300mL MTBE。用2×300mL NaHCO3饱和水溶液萃取该溶液，然后使用6N盐酸将合并的水相酸化至pH＝1–3。用2×300mL MTBE萃取得到的乳液，蒸发溶剂。用200mL饱和NaCl水溶液洗涤合并的有机相，用MgSO4干燥。用340g二氧化硅纯化产物，使用乙酸乙酯/庚烷(10：90→20:80)作为洗脱液。蒸发洗脱液，将残余物真空干燥过夜。
收率9.62g(17％)无色油状物外消旋-2h。
MS：m/z 237.11＝[M+H]+(计算值＝237.11)。
为了合成化合物2i，将异丙基丙二酸一苄基酯外消旋-2h(945mg,4.00mmol)和PEG 10000(10.0g,4.00mmol)溶于20mL二氯甲烷，用冰浴冷却。加入DCC(825mg,4.00mmol)和DMAP(6mg,0.05mmol)在10mL二氯甲烷中的溶液。除去冰浴，将混合物在室温搅拌过夜。将得到的混悬液冷却至0℃，过滤出固体。真空蒸发溶剂。
将残余物溶于20mL二氯甲烷，在室温用150mL MTBE稀释。将该混合物在–20℃储存过夜。通过用玻璃滤器Por.3过滤收集沉淀，用500mL冷MTBE(–20℃)洗涤。真空干燥产物过夜。
收率9.63g(92％)白色粉末2i。
MS：m/z 742.50＝[M+16H]16+(计算值＝742.51)。
为了合成化合物2j，将化合物2i(3.38g,0.323mmol)溶于乙酸甲酯(100mL)，加入105mg披钯炭。在环境压力的氢气气氛下，将该混合物在室温搅拌过夜。通过celite垫过滤该反应混合物，蒸发滤液，真空干燥过夜。
收率3.25g(98％)玻璃状固体2j。
MS：m/z 731.25＝[M+16H]16+(计算值＝731.25)。
为了合成化合物2k，在室温将化合物2j(3.10g,0.302mmol)和TSTU(0.364g,1.21mmol)溶于15mL二氯甲烷。然后加入DIPEA(0.156g,1.21mmol)，将该混合物搅拌45min。过滤得到的混悬液，用2×10mL 0.5M磷酸盐缓冲液pH＝6.5洗涤滤液。用MgSO4干燥有机相，真空蒸发溶剂。将残余物溶于20mL甲苯，用10mL MTBE在室温稀释，储存在–20℃过夜。通过用玻璃滤器Por.3过滤收集沉淀，用250mL冷却的MTBE(–20℃)洗涤。真空干燥产物过夜。
收率2.66g(84％)白色粉末2k。
MS：m/z 743.37＝[M+16H]16+(计算值＝743.38)。
根据以下方案由顺式-1,4-环己烷二甲酸和PEG10000制备了交联剂试剂外消旋-2o：
为了合成顺式-1,4-环己烷二甲酸一苄基酯外消旋-2l，将顺式-1,4-环己烷二甲酸(20.0g,116mmol)、苄醇(11.3g,105mmol)和DMAP(710mg,5.81mmol)溶于200mL THF。用冰浴将混合物冷却至0℃。在15min内在0℃加入DCC(49.4g,239mmol)在100mL THF中的溶液。除去冰浴，将该反应混合物在室温搅拌过夜，然后过滤出固体。在40℃蒸发滤液，将残余物溶于300mL MTBE。用2×300mL NaHCO3饱和水溶液萃取该溶液，然后使用6N盐酸将合并的水相酸化至pH＝1–3。用2×300mL MTBE萃取得到的乳液，蒸发溶剂。用200mL饱和NaCl水溶液洗涤合并的有机相，用MgSO4干燥。用340g二氧化硅纯化产物，使用乙酸乙酯/庚烷(10:90→20:80)作为洗脱液。蒸发洗脱液，无色油状残余物在真空干燥过夜过程中结晶。
收率4.82g(16％)无色结晶外消旋-2l。
MS：m/z 263.13＝[M+H]+(计算值＝263.13)。
为了合成化合物2m，将顺式-1,4-环己烷二甲酸一苄基酯外消旋-2l(2.10g,8.00mmol)和PEG 10000(20.0g,10.0mmol)溶于50mL二氯甲烷，用冰浴冷却。加入DCC(1.65g,8.00mmol)和DMAP(0.012g,0.10mmol)在25mL二氯甲烷中的溶液。除去冰浴，将混合物在室温搅拌过夜。将得到的混悬液冷却至0℃，过滤出固体。真空蒸发溶剂。
将残余物溶于55mL二氯甲烷，在室温用300mL MTBE稀释。将该混合物储存在–20℃过夜。通过用玻璃滤器Por.3过滤收集沉淀，用250mL冷却的MTBE(–20℃)洗涤。真空干燥产物过夜。
收率18.2g(87％)白色粉末2m。
MS：m/z 745.76＝[M+16H]16+(计算值＝745.77)。
为了合成化合物2n，将化合物2m(9.00g,0.857mmol)溶于乙酸甲酯(100mL)，加入157mg披钯炭。在环境压力的氢气气氛下，将该混合物在室温搅拌过夜。通过celite垫过滤该反应混合物，蒸发滤液，真空干燥过夜。
收率8.83g(100％)玻璃状固体2n。
MS：m/z 734.50＝[M+16H]16+(计算值＝734.50)。
为了合成化合物2o，在室温将化合物2n(8.92g,0.864mmol)和TSTU(1.04g,3.64mmol)溶于35mL二氯甲烷。然后加入DIPEA(0.447g,3.46mmol)，将该混合物搅拌45min。过滤得到的混悬液，用2×10mL 0.5M磷酸盐缓冲液pH＝6.5洗涤滤液。用MgSO4干燥有机相，真空蒸发溶剂。
将残余物溶于50mL甲苯，在室温用25mL MTBE稀释，储存在–20℃过夜。通过用玻璃滤器Por.3过滤收集沉淀，用400mL冷却的MTBE(–20℃)洗涤。真空干燥产物过夜。
收率7.62g(84％)白色粉末2o。
MS：m/z 702.60＝[M+16H]16+(计算值＝702.59)。
实施例3
包含游离氨基的水凝胶珠3a、3b、3c和3d的制备
在装配有挡板的直径60mm的具有底部出口的圆柱状250mL反应器中，在环境温度用直径50mm的isojet搅拌器以580rpm搅拌218mgCithrolTM DPHS在100mL十一烷中的乳液。加入250mg 1a和2205mg 2d在22.1g DMSO中的溶液，在RT搅拌10min以形成混悬液。加入1.1mLTMEDA以进行聚合。将该混合物搅拌16h。加入1.7mL乙酸，然后在10min后加入100mL 15重量％的氯化钠水溶液。10min后，停止搅拌器，允许各相分离。2h后，排出含有水凝胶的水相。
为了进行珠大小分级分离，用40mL乙醇稀释水-水凝胶混悬液，使用Retsch AS200控制筛选机用125、100、75、63、50、40和32μm钢筛湿过筛15min。过筛幅度为1.5mm，水流速300mL/min。收集保留在63和75μm筛上的珠级分，用0.1％AcOH洗涤3次，用乙醇洗涤10次，在0.1mbar干燥16h，得到670mg 3a，为白色粉末。
通过使Fmoc-氨基酸与水凝胶上的游离氨基缀合且随后进行Fmoc-测定将水凝胶的氨基含量测定为0.145mmol/g。
如针对3a所述的那样制备了3b，不同之处在于使用350mg 1a、2548mg2g、26.1g DMSO、257mg CithrolTM DPHS、1.5mL TMEDA和2.4mL乙酸，得到550mg 3b，为白色粉末，游离氨基0.120mmol/g。
如针对3a所述的那样制备了3c，不同之处在于使用250mg 1a、3019mg外消旋-2k、32.7g DMSO、290mg CithrolTM DPHS、1.1mL ml TMEDA和1.7mL乙酸，得到770mg 3c，为白色粉末，游离氨基0.126mmol/g。
如针对3a所述的那样制备了3d，不同之处在于使用250mg 1a、2258mg外消旋-2o、22.6g DMSO、222mg CithrolTM DPHS、1.1mL ml TMEDA和1.7mL乙酸，得到186mg 3d，为白色粉末，游离氨基0.153mmol/g。
实施例4
连接基试剂4c的合成
根据以下方案合成了连接基试剂4c：
4a的合成：
用在DCM(25mL)中的DCC(0.70g,3.33mmol)溶解Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH(1.00g,2.43mmol)。一次性加入Oxyma pure(0.51g,3.58mmol)和三甲基吡啶(0.50mL,3.58mmol)，缓慢地加入N-Boc-乙二胺(0.41g,2.56mmol)在DCM(15mL)中的溶液。搅拌后，将该混合物在RT搅拌90min，过滤出形成的沉淀，用HCl水溶液(0.1M,50mL)洗涤滤液。用DCM(2×20mL)萃取水层，用饱和NaHCO3水溶液(3×25mL)和盐水(1×50mL)洗涤合并的有机级分，用Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩。通过快速色谱法纯化粗固体。得到中间体N-boc-N’-(N-fmoc-4-叔丁基-L-天冬氨酰基)-乙二胺，为白色固体(0.98g,1.77mmol,73％)。
MS：m/z 554.29＝[M+H]+,(计算值＝554.29)。
将N-boc-N’-(N-fmoc-4-叔丁基-L-天冬氨酰基)-乙二胺(0.98g,1.77mmol)溶于THF(15mL)，加入DBU(0.31mL)，将该溶液在RT搅拌12min。用AcOH(0.5ml)猝灭反应，真空浓缩，通过闪式色谱法纯化残余物，得到4a(0.61g,1.77mmol,2步的收率为73％)，为白色固体。
MS：m/z 332.38＝[M+H]+,(计算值＝332.22)。
4b的合成：
将6-乙酰基硫基己酸(0.37g,1.95mmol)溶于DCM(19.5mL)，一次性加入Oxyma pure(0.35g,2.48mmol)和DCC(0.40g,1.95mmol)。将该溶液在RT搅拌30min，过滤，将滤液加入到4a(0.61g,1.77mmol)在DCM(10.5mL)中的溶液中。将DIPEA(0.46mL,2.66mmol)加入到溶液中，将反应在RT搅拌2h。用H2SO4水溶液(0.1M,2×30mL)、饱和NaHCO3水溶液(2×20mL)和盐水(1×20mL)洗涤该溶液。用Na2SO4干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过闪式色谱法纯化粗物质，得到N-boc-N’-(N-6-乙酰基硫基己基-4-叔丁基-L-天冬氨酰基)-乙二胺(0.65g,1.30mmol,2步的收率为73％)，为白色固体。
MS：m/z 504.27＝[M+H]+,(计算值＝504.28)。
将N-boc-N’-(N-6-乙酰基硫基己基-4-叔丁基-L-天冬氨酰基)-乙二胺(0.60g,1.18mmol)溶于TFA(5mL)，加入TES(0.13mL)和水(0.13ml)。将该混合物在RT搅拌30min。在N2气流中除去TFA，将4b粗品溶于H2O/ACN 1:1，通过RP-HPLC纯化。
收率：0.39g,0.85mmol(TFA盐),72％。
MS：m/z 348.25＝[M+H]+,(计算值＝348.16)。
4c的合成：
将4b(TFA盐,0.38g,0.80mmol)溶于DMF(5mL)，加入碳酸(5-甲基-2-氧代-1,3-间二氧杂环戊烯-4-基)-甲基酯4-硝基苯基酯(0.26g,0.88mmol)和DIPEA(0.28mL,1.6mmol)。用DCM(5mL)稀释得到的混悬液，在RT搅拌3h。加入另外的DIPEA(0.28mL 1.6mmol)，持续搅拌2h。真空浓缩DCM，用H2O/ACN 3:1稀释残余物，通过RP-HPLC纯化，得到N-(5-甲基-2-氧代-1,3-间二氧杂环戊烯-4-基)-甲基-氧代羰基-N’-(N-6-乙酰基硫基己基-L-天冬酰氨基)-乙二胺(0.31g,0.62mmol,77％)，为无色油状物。
MS：m/z 504.16＝[M+H]+,(计算值＝504.17)。
将N-(5-甲基-2-氧代-1,3-间二氧杂环戊烯-4-基)-甲基氧代羰基-N’-(N-6-乙酰基硫基己基-L-天冬酰氨基)-乙-二胺(150mg,0.30mmol)溶于DCM(17.5mL)，一次性加入NHS(41mg,0.36mmol)、DCC(74mg,0.36mmol)和DMAP(4mg,0.03mmol)。将反应在RT搅拌1h，过滤得到的混悬液。用少量DCM洗涤沉淀，真空浓缩合并的滤液。通过RP-HPLC纯化4c，得到无色油状物(144mg,0.24mmol,80％)。
MS：m/z 601.18＝[M+H]+,(计算值＝601.18)。
实施例5
马来酰亚胺官能化的水凝胶珠5a的制备
将259.3mg干燥水凝胶珠3a在10mL 1％正-丙基胺的NMP溶液中温育15min，随后用1％正-丙基胺的NMP溶液洗涤2次，用2％DIPEA的NMP溶液洗涤2次。将171mg马来酰亚胺-NH-PEG12-PFE溶于1mLNMP，加入到洗涤的水凝胶珠3a中。将水凝胶混悬液在室温温育2h。用NMP、随后用20mM琥珀酸盐、1mM Na2EDTA、0.01％Tween20,pH 3.0、随后用水、然后用0.1％乙酸、0.01％Tween20各自将得到的马来酰亚胺官能化的水凝胶珠5a洗涤5次。
使用3b、3c和3d相应地制备了马来酰亚胺官能化的水凝胶珠5b、5c和5d。
实施例6
临时性Lucentis-连接基-水凝胶前药6c的合成
将4.6mg Lucentis(在下面的方案中描述为Lucentis-NH2)(460μL 10mg/mL Lucentis在10mM组氨酸、10重量％α,α-海藻糖、0.01％Tween20,pH 5.5中的溶液)的缓冲液交换成10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、140mM氯化钠、pH 7.4，并且将Lucentis的浓度调整至16.4mg/mL。将6mg连接基试剂4c溶于100μL DMSO，得到100mM的浓度。将相对于Lucentis的量而言1摩尔当量的连接基试剂4c加入到Lucentis溶液中。小心地混合反应混合物，在室温温育5min。随后，将另外2摩尔当量的连接基试剂4c加入到1摩尔当量步骤中的Lucentis溶液中，在添加每个当量后，将反应混合物在室温温育5min，得到未修饰的Lucentis混合物和被保护的Lucentis-连接基一缀合物6a。
通过添加1M柠檬酸钠,pH 5.0将反应混合物的pH调整至pH 6.5，加入Na2EDTA至终浓度为5mM。为了除去保护基，加入6a 0.5M NH2OH(溶于10mM柠檬酸钠、140mM氯化钠、5mM Na2EDTA,pH 6.5)至终浓度为45mM，将脱保护反应在室温温育4h，得到Lucentis-连接基一缀合物6b。将Lucentis和Lucentis-连接基一缀合物6b的混合物的缓冲液交换成10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、140mM氯化钠、5mM Na2EDTA,0.01％Tween 20,pH 6.5，将2种Lucentis种类的总浓度调整至11.8mg/mL。如通过ESI-MS所测定的那样，该混合物中的Lucentis-连接基一缀合物6b的含量为20％。
将在10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、140mM氯化钠、5mMNa2EDTA、0.01％Tween 20,pH 6.5中的4mg Lucentis/Lucentis-连接基一缀合物6b混合物加入到1mg马来酰亚胺官能化的水凝胶珠5a中，在室温温育过夜，得到临时性Lucentis-连接基-水凝胶前药6c。
实施例7
体外释放动力学–体外半衰期的测定
用60mM磷酸钠、3mM Na2EDTA、0.01％Tween20,pH 7.4将Lucentis-连接基-水凝胶前药6c(含有约1mg Lucentis)洗涤5次，最终混悬在1mL上述缓冲液中。将该混悬液在37℃温育。在不同时间间隔后交换该混悬液的缓冲液，通过HPLC-SEC在220nm分析。将相当于释放的Lucentis的峰进行积分，将释放的Lucentis总量对总温育时间作图。使用曲线拟合软件测定一级裂解速率。
实施例8
连接基试剂8e的合成
根据以下方案合成了连接基试剂8e：
历经2h通过注射泵向N-Boc-乙二胺(2.08g,12.98mmol)和NaCNBH3(775mg,12.33mmol)在MeOH(20mL,无水的)中的溶液中加入2,4,6-三甲氧基苯甲醛(2.29g,11.68mmol)在40mL无水MeOH/DCM(1:1v/v)中的溶液。将该混合物搅拌90min，用0.4M HCl(60mL)酸化，再搅拌15min。用乙酸乙酯(5x)萃取反应混合物。用饱和NaHCO3和盐水洗涤合并的有机相，用Na2SO4干燥。真空除去溶剂，在高度真空(<0.1mbar)下干燥残余物。将粗品N-Boc-N’-Tmob-乙二胺8a不经进一步纯化即用于下一步反应。收率：3.70g(10.87mmol,84％)无色固体。MS：m/z 341.21＝[M+H]+,(计算值＝341.21)。
将8a(1.7g,4.99mmol)在DCM(40ml,无水,分子筛)中的溶液加入到DCC(1.34g,6.50mmol)、Oxyma pure(995mg,7.00mmol)、Fmoc-L-Asp(OBn)-OH(2.22g,4.98mmol)和2,4,6-三甲基吡啶(1.24mL,9.53mmol)在DCM(40ml,无水,分子筛)中的溶液中。将反应混合物在RT搅拌3h。过滤出沉淀，用0.1M HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤滤液，用Na2SO4干燥有机相，真空除去溶剂。通过闪式色谱法纯化粗物质，得到8b(3.19g,4.15mmol,83％)，为灰白色固体。MS：m/z 768.35＝[M+H]+,(计算值＝768.35)。
向8b(8.59g,11.19mmol)在THF(98mL)中的溶液中加入DBU(2mL)。将该溶液在RT搅拌12min，真空浓缩溶剂。进行闪式色谱法，得到4.89g 8c(8,96mmol,80％)。MS：m/z 546.28＝[M+H]+,(计算值＝546.28)。
将6-三苯甲基巯基己酸(2.04g,5.22mmol)溶于DCM(20mL,无水,分子筛)，加入DCC(1.08g,5.22mmol)和Oxyma pure(945mg,6,65mmol)。30min后，加入8c(2.59g,4.75mmol)和DIPEA(1.24mL,7.12mmol)。将反应混合物在RT搅拌22h。用1N H2SO4(2x)、饱和NaHCO3(2x)和盐水萃取该混合物。用Na2SO4干燥有机相，真空浓缩，通过闪式色谱法纯化8d。收率：4.10g(4.47mmol,94％)。MS：m/z 940.12＝[M+Na]+,(计算值＝940.43)。
向8d(4.10g,4.47mmol)在i-PrOH(60mL)中的溶液中加入水(20mL)和LiOH(322mg,13.41mmol)，将反应混合物在RT搅拌1h。加入甲苯(300mL)，用0.1N HCl和盐水洗涤有机相。用Na2SO4干燥有机相，过滤，真空浓缩。通过闪式色谱法纯化8e。收率：3.53g(4.26mmol,95％)。MS：m/z 827.93＝[M+H]+,(计算值＝828.39)。
实施例9
连接基试剂9c的合成
根据以下方案合成了连接基试剂9c：
将8e(300mg,0.36mmol)溶于HFIP/水/TES(39：1:1v/v/v,4.1mL)。在搅拌下加入TFA(0.35mL)，将反应搅拌75min。在氩气流中蒸发溶剂。将残余物在水(20mL)与DCM(40mL)之间分配。收集水相，用水(5mL)洗涤DCM相，合并水相。用pH 7.4磷酸钠缓冲液(0.5M,5mL)调整得到的溶液的pH，加入2,2’-二硫代吡啶的1mL溶液，将得到的混悬液搅拌30min。冻干该混合物，将残余物混悬于ACN/水(7:3v/v,9mL)，过滤。通过RP-HPLC纯化滤液，得到9a。收率：90mg,0.17mmol(TFA盐),47％,MS：m/z 415.25＝[M+H]+,(计算值＝415.15)。
将9a(90mg,0.17mmol)溶于DCM(1.2mL)，在搅拌下加入碳酸(5-甲基-2-氧代-1,3-间二氧杂环戊烯-4-基)-甲基酯4-硝基苯基酯(138mg,0.47mmol)和2,4,6-三甲基吡啶(129μL,0.98mmol)。加入DMF(1mL)以促进形成的沉淀溶解。2h和8h后，加入DIPEA(19μL,0.11mmol,各次)，将反应搅拌48h。用AcOH(38μL)淬灭反应，在氩气流中蒸发DCM。用ACN/水/TFA(1:1:0.002v/v/v)稀释残余物，通过RP-HPLC纯化，得到9b。收率：64mg,0.11mmol,65％,MS：m/z 571.09＝[M+H]+,(计算值＝571.15)。
将9b(32mg,56μmol)溶于DCM。在搅拌下加入NHS(8mg,67μmol)、DCC(14mg,67μmol)和DMAP(0.7mg,6mmol)。搅拌反应，1.5h和3.5h后，加入DCC(分别3.5mg,11μmol和2.3mg,7μmol)。在氩气流中蒸发溶剂，将残余物混悬于水/ACN/TFA(1:9:0.01v/v/v,3mL)，过滤。通过RP-HPLC纯化滤液，得到9c(28mg,42μmol,75％)。MS：m/z 668.17＝[M+H]+,(计算值＝668.17)。
实施例10
连接基试剂10f的合成
根据以下方案合成了连接基试剂10f：
将Fmoc-N-Me-L-Asp(OtBu)-OH(1g,2.35mmol)溶于DCM(35mL)，加入DCC(0.68g,3.29mmol)、Oxyma pure(0.5g,3.53mmol)和2,4,6-三甲基吡啶(0.49mL,3.76mmol)。将N-Boc-N-甲基-乙二胺溶于DCM(15mL)，通过注射器缓慢地加入到反应混合物中。将反应搅拌16h，过滤出沉淀，用0.1M HCl(50mL)洗涤滤液。用DCM(20mL)将水层再萃取2次。合并有机层，用饱和碳酸氢钠溶液(1x50mL,2x25mL)和盐水(1x50mL)洗涤。用Na2SO4干燥有机相，真空浓缩，通过闪式色谱法纯化10a。收率：1.36g(2.33mmol,99％)。MS：m/z 582.32＝[M+H]+,(计算值＝582.32)。
将10a(1.36g,2.33mmol)溶于THF(20mL)，加入DBU(0.4mL)，将反应搅拌12min。加入AcOH(0.5mL)，真空浓缩混合物，通过闪式色谱法纯化10b。收率：0.82g(2.28mmol,98％)。MS：m/z 360.25＝[M+H]+,(计算值＝360.25)。
将6-乙酰基巯基己酸(0.49g,2.58mmol)溶于DCM(25mL)，加入DCC(0.53g,2.58mmol)、Oxyma pure(0.47g,3.19mmol)。将反应搅拌45min，使用带有釉料的注射器过滤入10b(0.82g,2.28mmol)在DCM(12mL)中的溶液中。加入DIPEA(0.61mL,3.42mmol)，搅拌反应。由于转化不充分，所以加入Oxyma pure(0.2g,1.4mmol)和DIPEA(0.25mL,1.4mmol)，将反应搅拌16h。由于转化不充分，将6-乙酰基巯基己酸(0.49g,2.58mmol)、DCC(0.53g,2.58mmol)和Oxyma pure(0.47g,3.19mmol)搅拌30min，过滤入反应中。加入DIPEA(0.6mL,3.42mmol)，将反应搅拌2.5h。用0.1M H2SO4(20mL)、饱和碳酸氢钠溶液(2x20mL)和盐水(20mL)洗涤反应混合物。用Na2SO4干燥有机相，真空浓缩，通过闪式色谱法纯化10c。收率：0.74g(1.39mmol,60％)。MS：m/z 532.30＝[M+H]+,(计算值＝532.31)。
将10c(0.74g,1.39mmol)溶于TFA/TES/水(95:2.5:2.5v/v/v,5.25mL)，搅拌30min。真空浓缩混合物，通过RP-HPLC纯化，得到10d(0.38g,0.78mmol,56％)MS：m/z 376.19＝[M+H]+,(计算值＝376.19)。
将10d(0.38g,0.78mmol)溶于DCM(7mL)，加入碳酸(5-甲基-2-氧代-1,3-间二氧杂环戊烯-4-基)-甲基酯4-硝基苯基酯(0.35g,1.17mmol)和2,4,6-三甲基吡啶(0.45mL,3.51mmol)，搅拌反应。1h后，加入2,4,6-三甲基吡啶(0.2mL,1.56mmol)，将反应搅拌20h。真空浓缩反应，通过RP-HPLC纯化，得到10e(0.26g,0.49mmol,63％)MS：m/z 532.20＝[M+H]+,(计算值＝532.20)。
将10e(0.26g,0.49mmol)溶于DCM(3.6mL)，加入DCC(0.12g,0.59mmol)、NHS(68mg,0.59mmol)和DMAP(6mg,0.05mmol)。将反应搅拌1h。过滤得到的混悬液，用DCM(2mL)洗涤沉淀。通过闪式色谱法纯化滤液，得到10f，为白色泡沫。收率：0.27g(0.43mmol,87％)。MS：m/z 629.21＝[M+H]+,(计算值＝629.21)。
实施例11
连接基试剂11d的合成
根据以下方案合成了连接基试剂11d：
将2-氯三苯甲基氯树脂(1.4mmol/g,357mg,0.5mmol)称重入带有釉料的10mL注射器。用2mL DCM将树脂溶胀2次。将N-Fmoc-N-甲基-L-天冬氨酸(OtBu)-OH(532mg,1.25mmol和DIPEA(305μL,1.75mmol)溶于DCM(3mL)，抽入注射器。将注射器摇动1h。将MeOH(0.5mL)抽入注射器，将注射器摇动30min。用DCM(4mL)将树脂洗涤5次，用DMF(4mL)洗涤5次。将树脂与DMF:DBU:哌啶(96:2:2v/v/v,4mL)一起搅拌3次5min。用DMF(4mL)将树脂洗涤5次。将6-三苯甲基巯基己酸(488mg,1.25mmol)和HATU(475mg,1.25mmol)溶于DMF(3mL)，加入DIPEA(436μL,2.5mmol)。1min预温育后，将溶液抽入注射器，将注射器摇动1h。将树脂用DMF(4mL)洗涤5次，用DCM(4mL)洗涤5次，用MeOH(4mL)洗涤2次，真空干燥。将HFIP/TES/乙酸(90/5/5v/v/v,各3mL)的溶液抽入注射器，将注射器摇动2次30min。在氮气流中蒸发收集的滤液的溶剂。将残余物混悬于CN/水(1:1v/v,5mL)，过滤。将在ACN(0.5mL)中的2,2’-二硫代吡啶(220mg,1mmol)加入到滤液中。用pH 7.4的磷酸钠缓冲液(0.5M,1.2mL)将反应的pH调整至7，搅拌15min。直接通过RP-HPLC纯化产物，得到11a(117mg,0.27mmol,53％)MS：m/z 443.30＝[M+H]+,(计算值＝443.17)。
将11a(117mg,0.27mmol)溶于DCM(2.4mL)。加入PyBOP(166mg,0.32mmol)、DIPEA(185μL,1.06mmol)和N-Boc-N-甲基乙二胺(57μL,0.32mmol)，将反应搅拌45min。加入乙酸(185μL)，在氮气流中除去溶剂。用ACN/水/TFA(2:1:0.003v/v/v)溶解残余物，通过RP-HPLC纯化，得到11b(135mg,0.23mmol,85％)MS：m/z 599.27＝[M+H]+,(计算值＝599.29)。
将11b(135mg,0.23mmol)溶于TFA/TES/水(95：2.5：2.5v/v/v,5mL)。15min后，在氮气流中蒸发溶剂。用ACN/水1:1稀释残余物，冻干。将残余物溶于DCM(1.5mL)，加入碳酸(5-甲基-2-氧代-1,3-间二氧杂环戊烯-4-基)-甲基酯4-硝基苯基酯(80mg,0.27mmol)。在搅拌下缓慢地加入DIPEA(78μL,0.46mmol)，直到反应保持淡黄色。加入另外的DIPEA(39μL,0.23mmol)，将反应搅拌1h。在添加DIPEA(20μL,0.12mmol)后，将反应搅拌30min。加入乙酸(140μL)，在氮气流中蒸发溶剂。用ACN/水/TFA(1:1:0.002v/v/v,3mL)稀释残余物，通过RP-HPLC纯化，得到11c(69mg,0.12mmol,51％)。MS：m/z 599.19＝[M+H]+,(计算值＝599.19)。
将11c(69mg,0.12mmol)溶于DCM，加入NHS(16mg,0.14mmol)、DCC(29mg,0.14mmol)和DMAP(1.4mg,0.012mmol)，将反应搅拌75min。在氮气气流中蒸发溶剂，将残余物混悬于ACN/水/TFA(1:1:0.002v/v/v,3.5mL)，过滤。通过RP-HPLC纯化滤液，得到11d(60mg,0.09mmol,75％)。MS：m/z 696.20＝[M+H]+,(计算值＝696.20)。
实施例12
连接基试剂12e的合成
根据以下方案合成了连接基试剂12e：
向N-Boc-N-甲基乙二胺(2g,11.48mmol)和NaCNBH3(819mg,12.63mmol)在MeOH(20mL)中的溶液中分份加入2,4,6-三甲氧基苯甲醛(2.08mg,10.61mmol)。将混合物在RT搅拌90min，用3M HCl(4mL)酸化，再搅拌15min。将反应混合物加入到饱和NaHCO3溶液(200mL)中，用CH2Cl2萃取5x。用Na2SO4干燥合并的有机相，真空蒸发溶剂。在高度真空中完全干燥得到的N-Boc-N-甲基-N’-tmob-乙二胺(12a)，将其不经进一步纯化即用于下一反应步骤。收率：3.76g(11.48mmol,89％纯度,12a：双Tmob保护的产物＝8:1)。MS：m/z 355.22＝[M+H]+,(计算值＝355.23)。
向12a(2g,5.65mmol)在CH2Cl2(24ml)中的溶液中加入COMU(4.84g,11.3mmol)、N-Fmoc-N-甲基-L-Asp(OBn)-OH(2.08g,4.52mmol)和2,4,6-三甲基吡啶(2.65mL,20.34mmol)。将反应混合物在RT搅拌3h，用CH2Cl2(250mL)稀释，用0.1M H2SO4(100mL)洗涤3x，用盐水(100mL)洗涤3x。再用CH2Cl2(100mL)萃取水相。用Na2SO4干燥合并的有机相，过滤，将残余物浓缩至24mL体积。使用闪式色谱法纯化12b。收率：5.31g(148％,6.66mmol)MS：m/z 796.38＝[M+H]+,(计算值＝796.38)。
向12b[5.31g,相对于N-Fmoc-N-Me-L-Asp(OBn)-OH最大值为4.51mmol]在THF(60mL)中的溶液中加入DBU(1.8mL,3％v/v)。将该溶液在RT搅拌12min，用CH2Cl2(400mL)稀释，用0.1M H2SO4(150mL)洗涤3x，用盐水(150mL)洗涤3x。再用CH2Cl2(100ml)萃取水相。用Na2SO4干燥合并的有机相，过滤。经蒸发溶剂分离得到12c，将其不经进一步纯化即用于下一步反应。MS：m/z 574.31＝[M+H]+,(计算值＝574.31)。
将12c(5.31g,4.51mmol,粗品)溶于乙腈(26mL)，加入COMU(3.87g,9.04mmol)、6-三苯甲基巯基己酸(2.12g,5.42mmol)和2,4,6-三甲基吡啶(2.35mL,18.08mmol)。将反应混合物在RT搅拌4h，用CH2Cl2(400mL)稀释，用0.1M H2SO4(100mL)洗涤3x，用盐水(100mL)洗涤3x。再用CH2Cl2(100mL)萃取水相。用Na2SO4干燥合并的有机相，过滤，经蒸发溶剂分离得到12d。通过闪式色谱法纯化产物7i。收率：2.63g(62％,94％纯度)MS：m/z 856.41＝[M+H]+,(计算值＝856.42)。
向12d(2.63g,2.78mmol)在i-PrOH(33mL)和H2O(11mL)中的溶液中加入LiOH(267mg,11.12mmol)，将反应混合物在RT搅拌70min。用CH2Cl2(200mL)稀释该混合物，用0.1M H2SO4(50mL)洗涤3x，用盐水(50mL)洗涤3x。再用CH2Cl2(100mL)萃取水相。用Na2SO4干燥合并的有机相，过滤，经蒸发溶剂分离得到12e。使用闪式色谱法纯化12e。收率：2.1g(88％)MS：m/z 878.4＝[M+Na]+,(计算值＝878.40)。
实施例13
连接基试剂13g的合成
根据以下方案合成了连接基试剂13g：
使用注射器向N,N-二甲基乙二胺(441mg,5mmol)和NaCNBH3(439mg,7mmol)在MeOH(21mL)中的溶液中加入2,4,6-三甲氧基苯甲醛(1.34g,6.85mmol)在DCM和MeOH(各17mL)中的溶液。将该混合物在RT搅拌60min，用0.5M HCl(50mL)酸化，再搅拌15min。通过添加1MNaOH使反应混合物达到pH>12，用乙酸乙酯(1x 100mL,3x 50mL)萃取4次。用MgSO4干燥合并的有机相，真空蒸发溶剂。在高度真空中完全干燥得到的N,N-二甲基-N’-tmob-乙二胺(13a)，将其不经进一步纯化即用于下一步反应步骤。收率：1.63g(含有双Tmob保护的产物)。MS：m/z 269.19＝[M+H]+,(计算值＝269.19)。
将13a(268mg,约0.83mmol)溶于THF(5mL)，加入2,3-吡啶二甲酸酐(149mg,1mmol)、DIPEA(362μL,2.08mmol)和DMF(1mL)。将该溶液搅拌15min，用AcOH(362μL)淬灭反应，在氮气流中除去THF。用ACN/水/TFA(1:1:0.002v/v/v,4mL)稀释残余物，通过RP-HPLC纯化，得到13b(244mg,0.46mmol,55％)。MS：m/z 418.20＝[M+H]+,(计算值＝418.20)。
将12e(500mg,0.58mmol)溶于TFA/TES/DTT/水(85:5:5:5v/v/v/v,10mL)，搅拌4h。在氮气流中除去溶剂，将残余物混悬于ACN/水，过滤。通过RP-HPLC纯化滤液，得到13c(71mg,0.21mmol,36％)。MS：m/z334.43＝[M+H]+,(计算值＝334.18)。
将13c(71mg,0.21mmol)溶于ACN/水(1:1,1mL)，加入在ACN/水(1:1,1mL,混悬液)中的2,2′-二硫代吡啶(93mg,0.42mmol)和pH 7.4的磷酸钠缓冲液(0.5M,1mL)。将得到的溶液搅拌15min，直接通过RP-HPLC纯化，得到13d(64mg,0.15mmol,68％)。MS：m/z 443.30＝[M+H]+,(计算值＝443.18)。
将13b(91mg,0.22mmol)溶于DMF(1mL)，加入PyBOP(113mg,0.22mmol)。加入DIPEA(50μL,0.29mmol)，将该溶液搅拌15min。将13d(64mg,0.145mmol)溶于DCM(1.5mL)，加入到DMF溶液中。将反应搅拌100min，加入AcOH(50μL)。在氮气流中除去DCM，将残余物溶于ACN/水/TFA，通过RP-HPLC纯化，得到13e(26mg,31μmol,21％)。MS：m/z 842.14＝[M+H]+,(计算值＝842.36)。
将13e(26mg,31μmol)溶于HFIP/TES/水(39:1:1v/v/v,1mL)，在搅拌下加入TFA(83μL)。90min后，真空蒸发溶剂，通过RP-HPLC纯化残余物，得到13f(11mg,17μmol,54％)。MS：m/z 662.28＝[M+H]+,(计算值＝662.28)。
将13f(11mg,17μmol)溶于DCM(1.5mL)，加入DCC(4.2mg,20μmol)、NHS(2.3mg,20μmol)和DMAP(0.2mg,1μmol)，搅拌该混悬液。1h和2h后，再次加入上述量的DCC和NHS。3h后，在氮气流中蒸发溶剂。将残余物混悬于ACN/水/TFA(1:1:0.002,3mL)，过滤。通过RP-HPLC纯化滤液，得到13g(14mg,16μmol(TFA盐),94％)。MS：m/z759.30＝[M+H]+,(计算值＝759.30)。
实施例14
连接基试剂14f的合成
根据以下方案合成了连接基试剂14f：
在搅拌下将对-一甲氧基三苯甲基氯(1.54g,5mmol)在DCM(10mL)中的溶液缓慢地加入到3-(甲基氨基)丙基胺(4.4g,50mmol)在DCM(10mL)中的溶液中。2h后，加入乙醚(166mL)。将盐水(100mL)与NaOH(4M,80μL)混合，用该混合物(3x33mL)洗涤反应。用盐水(30mL)洗涤有机层，用MgSO4干燥，真空浓缩。收率(14a)：1.79g(4.95mmol,99％)。
将14a(0.36g,1mmol)溶于THF(7mL)和DIPEA(0.44ml,2.5mmol)，在搅拌下加入喹啉酸酐(0.18g,1.2mmol)在THF(3mL)中的溶液。30min后，加入13a(0.54g,2mmol)在DMF(2mL)和PyBOP(0.78g,1.5mmol)中的溶液，将反应搅拌1h。用乙酸乙酯(50mL)稀释反应，用NaOH(1M,20mL)洗涤。再用乙酸乙酯(2x20mL)萃取水相。合并收集的有机相，真空浓缩，使用闪式色谱法纯化，得到14b(0.4g,0.53mmol,53％)MS：m/z 760.41＝[M+H]+,(计算值＝760.41)。
将14b(0.4g,0.53mmol)溶于ACN(3mL)，加入HCl(0.4M,3mL)，将该溶液搅拌4h。用NaOH(1M,15mL)淬灭反应，用DCM(5x30mL)萃取。用MgSO4干燥合并的有机相，真空浓缩，通过闪式色谱法纯化14c。收率：0.32g(0.42mmol,81％,MMT盐)MS：m/z 488.31＝[M+H]+,(计算值＝488.29)。
将11a(49mg,0.11mmol)和14c(114mg,0.15mmol)溶于DCM(1.4mL)，在搅拌下加入PyBOP(62mg,0.12mmol)和DIPEA(38μL,0.22mmol)。2h后，加入AcOH(40μL)，真空蒸发溶剂。将残余物溶于ACN/水/TFA(1:1:0.002v/v/v,5mL)，通过RP-HPLC纯化，得到14d(104mg,0.1mmol TFA盐,92％)。MS：m/z 912.19＝[M+H]+,(计算值＝912.44)。
将14d(104mg,0.1mmol)溶于HFIP/TES/水(39:1:1v/v/v,3mL)，在搅拌下加入TFA(0.25mL)。2h后，在搅拌下加入TFA(0.25mL)，将反应再搅拌20h。真空浓缩该混合物，将残余物溶于ACN/水/TFA(1:1:0.002v/v/v,3mL)，通过RP-HPLC纯化，得到14e(28mg,35μmol TFA盐,35％)。MS：m/z 676.13＝[M+H]+,(计算值＝676.30)。
将14e(25mg,32μmol)溶于DCM(2mL)，加入DCC(10mg,48μmol)、NHS(5.5mg,48μmol)和DMAP(0.4mg,3.2μmol)，搅拌该混悬液。1.5h后，再次加入上述量的DCC和NHS。3h后，在氮气流中蒸发溶剂。将残余物混悬于ACN/水/TFA(1:1:0.002v/v/v,4mL)，过滤。通过RP-HPLC纯化滤液，得到14f(28mg,31.6μmol TFA盐,99％)。MS：m/z773.31＝[M+H]+,(计算值＝773.31)。
实施例15
连接基试剂15f的合成
根据以下方案合成了连接基试剂15f：
向11a(0.29g,0.65mmol)和PyBOP(0.34g,0.65mmol)在ACN(5mL)中的溶液中加入DIPEA(0.57mL,3.27mmol)。将该混合物在室温搅拌1分钟，然后加入N,N-二甲基氨基丙烷-1,3-二胺(0.12mL,0.98mmol)。30min后，加入AcOH(0.7mL)以淬灭反应。用水稀释该混合物，通过RP-HPLC纯化。将得到的中间体溶于TFA(3mL)，将该混合物搅拌30min，然后用N2气流除去TFA。真空干燥残余物过夜，得到15a(0.42g,0.61mmol(2xTFA盐),93％)，为无色油状物，将其不经进一步纯化即使用。MS：m/z＝471.21＝[M+H]+,(计算值471.21)。
向15a(0.23mg,0.33mmol)在DCM(5mL)中的溶液中加入DMAP(8mg,65μmol)、NHS(75mg,0.65mmol)和DCC(135mg,0.65mmol)。搅拌3h后，通过添加AcOH(10μL)淬灭反应。用N2气流除去溶剂，将残余物混悬于H2O/ACN/TFA(1:1:0.002v/v/v)，过滤。通过RP-HPLC纯化滤液，得到15b(83mg,0.10mmol(2x TFA盐),32％)，为无色油状物。MS：m/z＝568.23＝[M+H]+,(计算值568.23)。
实施例16
纯化标记物16e的合成
根据以下方案合成了纯化标记物16e：
向6,6’-二硫代二烟酸(0.62g,2mmol)在ACN(20mL)中的混悬液中加入PyBOP(2.08g,4mmol)和DIPEA(1.29g,1.74mL,10mmol)，将该混合物搅拌1min。将得到的棕色溶液加入到1,9-双-Boc-1,5,9-三氮杂壬烷(1.99g,6mmol)在ACN(20mL)和DMF(5mL)混合物中的溶液中，搅拌2h。用EtOAc(150mL)稀释该反应混合物，用HCl水溶液(10mM,5x100mL)、饱和NaHCO3溶液(3x100mL)和盐水(100mL)洗涤有机层。用MgSO4干燥并过滤后，真空除去溶剂，通过闪式色谱法纯化粗残余物，得到16a(1.92g,最大值2mmol)，为淡黄色泡沫。产物含有少量不能分离的三吡咯烷磷酰胺，其将在下一步中被除去。MS：m/z＝935.47＝[M+H]+,(计算值935.47)。
将16a(1.92g,最大值2mmol)溶于TFA(10mL)，将该溶液搅拌10min。将反应混合物滴加到冰冷的乙醚(160mL)中以沉淀出产物。将得到的混悬液在7000x G和2℃下离心3min。弃去上清液，将沉淀溶于甲醇(10mL)。将该溶液滴加到冰冷的乙醚(160mL)中，将形成的混悬液在7000x G和2℃下离心3min。弃去上清液后，如上所述再进行2次沉淀操作。真空干燥剩余的油状沉淀，得到16b(1.77g,1.45mmol(6x TFA盐),73％)，为淡棕色的非常具有吸湿性的粉末。MS：m/z＝535.26＝[M+H]+,(计算值535.26)。
向16b(3.30g,2.7mmol)在DMF(90mL)中的溶液中加入DIPEA(5.4mL,31mmol)和Boc-L-Lys(Boc)-OSu(5.62g,12.7mmol)。将混合物搅拌14h，然后用乙酸乙酯(600mL)稀释。用HCl水溶液(10mM,5x 300mL)、饱和NaHCO3溶液(3x 300mL)和盐水(300mL)洗涤有机层，用MgSO4干燥。过滤后，真空除去溶剂，通过闪式色谱法纯化粗残余物，得到16c(5.52g,最大值2.7mmol)，为淡黄色泡沫，具有90％纯度。MS：m/z＝924.54＝[M+2H]2+,(计算值924.53)。
将16c(5.52g,最大值2.7mmol)溶于TFA(20mL)。搅拌15min后，通过将反应混合物滴加到冰冷的乙醚(160mL)中沉淀出产物。将得到的混悬液在7000x G和2℃下离心3min。弃去上清液，将沉淀溶于甲醇(10mL)。将该溶液滴加到冰冷的乙醚(160mL)中，将形成的混悬液在7000x G和2℃下离心3min。弃去上清液后，如上所述再进行两次沉淀操作。真空干燥剩余的油状沉淀，得到16d(4.96g,2.27mmol(10x TFA盐),84％)，为淡棕色的非常具有吸湿性的粉末。MS：m/z＝1046.64＝[M+H]+,(计算值1046.64)。
向16d(1.53g,0.7mmol)在干燥DMF(20mL)中的溶液中加入N,N-二甲基甘氨酸(1.16g,11.2mmol)、PyBOP(5.83g,11.2mmol)和DIPEA(3.23g,4.36mL,25mmol)在DMF(35mL)中的溶液，搅拌1h。然后真空浓缩该混合物至约10mL体积。向该残余物中加入水至总体积为100mL，通过添加TFA将该溶液酸化至pH 1–2。将该混合物在5000x G和2℃下离心3分钟。弃去油状沉淀，通过RP-HPLC纯化上清液，得到16e(1.05g,0.37mmol(10x TFA盐),53％)，为无色油状物。MS：m/z＝864.54＝[M+2H]2+,(计算值864.54)。
实施例17
连接基试剂17g的合成
根据以下方案合成了连接基试剂17g：
将2-氯三苯甲基氯树脂(1.4mmol/g,1.43g,2mmol)称重入具有釉料的20ml注射器。用10mL DCM将树脂溶胀2次。将N-Fmoc-N-甲基-L-Asp(OtBu)-OH(1.06g,2.5mmol)溶于DCM(6mL)，抽入注射器。将DIPEA(436μL,2.5mmol)溶于DCM(1mL)，抽入注射器。将注射器摇动5min。将DIPEA(654μL,3.75mmol)溶于DCM(1mL)，抽入注射器。将注射器摇动1h。将MeOH(2mL)抽入注射器，将注射器摇动30min。用DMF(10mL)将树脂洗涤5次。将树脂与DMF:DBU:哌啶(96:2:2v/v/v 7mL)一起搅拌3次5min。用DMF(5mL)将树脂洗涤5次。将6-三苯甲基巯基己酸(1.95g,5mmol)和PyBOP(2.6g,5mmol)溶于DMF(6mL)，加入DIPEA(3.5mL,20mmol)。1min预温育后，将溶液抽入注射器，将注射器摇动3h。将树脂用DMF(7mL)洗涤5次，用DCM(7mL)洗涤5次。将HFIP/DCM溶液(1/4v/v,各8mL)抽入注射器，将注射器摇动3次30min。真空浓缩收集的滤液。将粗品17a(0.84g,1.45mmol,73％)不经进一步纯化即用于下一步。MS：m/z 598.18＝[M+Na]+,(计算值＝598.26)。
将17a(1.67g,2.9mmol)溶于DCM(20mL)，加入N-Boc-N-甲基乙二胺(0.62mL,3.48mmol)和PyBOP(1.81g,3.48mmol)。加入DIPEA(2.02mL,11.6mmol)，将反应搅拌1h。加入AcOH(2mL)，将该混合物用DCM(40mL)稀释，用水(2x20mL)洗涤。用MgSO4干燥有机层，真空浓缩，通过闪式色谱法纯化粗残余物，得到17b(1.74g,2.38mmol,82％)。MS：m/z＝754.19＝[M+Na]+,(计算值754.39)。
将17b(1.74g,2.38mmol)和三苯基甲醇(0.62g,2.38mmol)溶于DCM(7.2mL)，在搅拌下加入TFA(7.2mL)。将反应搅拌90min，历经45min在氮气流中除去溶剂。将残余物与DCM一起共蒸发。将残余物混悬于ACN/水/TFA(2:1:0.003v/v/v,14mL)，过滤。通过RP-HPLC纯化滤液，得到17c(0.9g,1.3mmol TFA盐,55％)。MS：m/z 576.20＝[M+H]+,(计算值＝576.29)。
将17c(0.9g,1.3mmol)溶于DCM(20mL)，加入碳酸(5-甲基-2-氧代-1,3-间二氧杂环戊烯-4-基)-甲基酯4-硝基苯基酯(0.46g,1.56mmol)。缓慢地加入DIPEA(0.45mL,2.6mmol)，将反应搅拌30min。加入DIPEA(0.11mL,0.65mmol)，将反应搅拌30min。再次加入DIPEA(0.11mL,0.65mmol)并将反应搅拌60min。加入AcOH(0.68mL)，真空浓缩混合物，通过闪式色谱法纯化粗残余物，得到17d(1.04g,最大值1.3mmol)。MS：m/z＝754.28＝[M+Na]+,(计算值754.28)。
将17d(1.04g,最大值1.3mmol)溶于HFIP/TES/水(39:1:1v/v/v,8.2mL)，加入TFA(0.66mL)。搅拌15min后，真空浓缩反应，将残余物混悬于ACN/水/TFA(1:1:0.002v/v/v 12mL)，过滤。通过RP-HPLC纯化滤液，得到17e(0.32g,0.65mmol,50％)。MS：m/z 490.19＝[M+H]+,(计算值＝490.19)。
将17e(181mg,0.37mmol)溶于ACN/水/TFA(1:1:0.002v/v/v,3mL)。将16e(1.05g,0.37mmol(10x TFA盐)溶于ACN/水(1:1v/v,20mL)。合并两个溶液，加入pH 7.4磷酸钠(0.5M,4mL)，将该混合物搅拌30min。通过添加ACN/水/TFA(1:1:0.22v/v/v)将该溶液的pH调整至约pH 2，真空除去CAN。通过RP-HPLC纯化残余物，得到17f(0.47g,0.24mmol 5xTFA盐,65％)。MS：m/z 676.86＝[M+2H]2+,(计算值＝676.86)。
将17f(0.18g,94μmol)溶于ACN(6mL)，加入NHS(92mg,0.8mmol)和DCC(166mg,0.8mmol)，将反应搅拌1h。真空除去溶剂，将残余物混悬于ACN/水/TFA(0.15:0.85:0.001v/v/v,6mL)，过滤。通过RP-HPLC纯化滤液，得到17g(129mg,64μmol 5xTFA盐,68％)。MS：m/z 725.37＝[M+H]+,(计算值＝725.37)。
实施例18
连接基试剂18i的合成
根据以下方案合成了连接基试剂18i：
将N-Boc-乙二胺(0.77g,4.8mmol)溶于DCM(15mL)，在搅拌下加入6-三苯甲基巯基己酸(2.25g,5.76mmol)和PyBOP(3.0g 5.76mmol)。加入DIPEA(2.52ml,14.4mmol)，将反应搅拌1h。用乙醚(150mL)稀释反应，用略微碱性的盐水(3x30mL,由100mL盐水和3mL 0.1M NaOH水溶液制备的)洗涤。用盐水(30mL)将有机相再洗涤1次，用Na2SO4干燥，真空浓缩，使用闪式色谱法纯化，得到18a，为白色泡沫。收率：2.55g(4.79mmol,99％)MS：m/z 555.24＝[M+Na]+,(计算值＝555.27)。
将18a(2.55g,4.79mmol)溶于THF(26mL)，转入烘干的充氩气的圆底烧瓶。加入硼烷–THF复合物的THF溶液(1M,17.7mL,17.71mmol)，将反应搅拌15h。缓慢地加入MeOH(5.4mL)，加入N,N’-二甲基乙二胺(3.11mL,28.8mmol)，将反应回流2.5h。冷却后，用乙酸乙酯稀释反应，用饱和碳酸氢钠溶液(2x125mL)和盐水(1x125mL)洗涤。用Na2SO4干燥有机相，真空浓缩，得到18b，将其不经进一步纯化即使用。收率：2.38g(4.59mmol,96％)MS：m/z 519.27＝[M+H]+,(计算值＝519.31)。
将18b(1.19g 2.29mmol)溶于DCM，加入碳酸(5-甲基-2-氧代-1,3-间二氧杂环戊烯-4-基)-甲基酯4-硝基苯基酯(1.02g,3.44mmol)和2,4,6-三甲基吡啶(1.36mL,10.32mmol)，将反应搅拌23h。真空浓缩反应，使用闪式色谱法纯化，得到18c.收率：1.19g(1.77mmol,79％)MS：m/z 697.18＝[M+Na]+,(计算值＝697.29)。
将18c(0.5g,0.74mmol)溶于DCM(2.5mL)，加入三苯基甲醇(0.19g,0.74mmol)和TFA(2.5mL)。将反应搅拌40min，在氩气流中浓缩，真空(<0.1mbar)干燥。将残余物溶于ACN/水(7:3v/v,10mL)，通过RP-HPLC纯化，得到18d(0.50g,0.84mmol,114％)。MS：m/z 575.33＝[M+H]+,(计算值＝575.26)。
将2-氯三苯甲基氯树脂(1.22mmol/g,0.87g,1mmol)称重入具有釉料的10ml注射器。将树脂用5mL DCM溶胀，用DCM(5x4mL)洗涤。将N-Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH(1.1g,2.7mmol)溶于DCM(5mL)，加入DIPEA(0.66mL,3.78mmol)，将溶液抽入注射器。将注射器摇动1h。将MeOH(0.5mL)抽入注射器，将注射器摇动15min。将树脂用DCM(4mL)洗涤5次，用DMF(5mL)洗涤5次。将树脂与DMF：DBU：哌啶(96：2：2v/v/v 4mL)一起搅拌3次5min。用DMF(4mL)将树脂洗涤5次。将乙酸酐(0.51mL,5.4mmol)和DIPEA(1.9mL,10.8mmol)溶于DMF(6mL)，将该溶液抽入注射器，将注射器摇动15min。将树脂用DMF(4mL)洗涤5次，用DCM(4mL)洗涤5次。将HFIP/DCM溶液(1/4v/v,各5mL)抽入注射器，将注射器摇动3次10min。真空浓缩收集的滤液。将粗品18e(0.29g,1.23mmol,114％)不经进一步纯化即用于下一步。MS：m/z 254.38＝[M+Na]+,(计算值＝254.12)。
将18e(65mg,0.28mmol)溶于DCM(3mL)，加入PyBOP(0.18g,0.34mmol)和DIPEA(0.15mL,0.84mmol)。将18d(0.18g,0.31mmol)溶于DCM(3mL)，加入到反应中。将反应搅拌1h，真空浓缩。通过RP-HPLC纯化残余物，得到18f(97mg,0.12mmol,44％)。MS：m/z 810.02＝[M+Na]+,(计算值＝810.34)。
将18f(97mg,0.12mmol)溶于TFA/TES/水(92:2.5:2.5v/v/v,3mL)，将反应剧烈搅拌3h，同时使氩气流通过该溶液。3h后，在氩气流中除去溶剂，通过RP-HPLC纯化残余物，得到18g(16mg,33μmol,27％)。MS：m/z 490.21＝[M+H]+,(计算值＝490.19)。
将18g(16mg,33μmol)溶于ACN/水(1:1v/v,3mL)，加入2,2’-二硫代二吡啶(14mg,65μmol)在ACN(0.1mL)中的溶液，然后加入pH 7.4磷酸钠缓冲液(0.5M,0.1mL)。将反应搅拌4.5h，通过RP-HPLC直接纯化产物，得到18h(14mg,23μmol,71％)。MS：m/z 598.98＝[M+H]+,(计算值＝599.19)。
将18h(14mg,23μmol)溶于DCM(3mL)，加入NHS(3mg,28μmol)，DCC(6.5mg,30μmol)和DMAP(0.3mg,2μmol)。将反应搅拌1.5h，在氩气流中除去溶剂。将残余物混悬于ACN/水/TFA(9:1:0.01v/v/v,3mL)，过滤。通过RP-HPLC纯化滤液，得到18i(17mg,23μmol,100％)。MS：m/z 696.20＝[M+H]+,(计算值＝696.20)。
实施例19
交联剂试剂19c、19g的合成
根据以下方案由辛二酸一苄基酯2a和PEG6000制备了交联剂试剂19c：
为了合成化合物19a，将壬二酸一苄基酯2a(6.50g,23.3mmol)和PEG6000(40.0g,6.67mmol)溶于140mL二氯甲烷，用冰浴冷却。加入DCC(4.81g,23.3mmol)和DMAP(0.040g,0.33mmol)在40mL二氯甲烷中的溶液。除去冰浴，将混合物在室温搅拌过夜。将得到的混悬液冷却至0℃，过滤出固体，真空蒸发溶剂。
将残余物溶于70mL二氯甲烷，在室温用300mL MTBE稀释。将该混合物储存在–20℃过夜。通过用玻璃滤器Por.3过滤收集沉淀，用500mL冷却的MTBE(–20℃)洗涤。真空干燥产物过夜。
收率41.2g(95％)白色粉末19a。
MS：m/z 833.75＝[M+8H]8+(计算值＝833.74)。
对于含有多分散性PEG的化合物的质谱，选择一个单质量峰。
为了合成化合物19b，将化合物19a(41.2g,6.32mmol)溶于乙酸甲酯(238mL)和乙醇(40mL)，然后加入400mg披钯炭。在环境压力的氢气气氛下，将该混合物在室温搅拌过夜。通过celite垫过滤反应混合物，蒸发滤液，真空干燥过夜。
收率38.4g(96％)玻璃状固体19b。
MS：m/z 750.46＝[M+9H]9+(计算值＝750.56)。
对于含有多分散性PEG的化合物的质谱，选择一个单质量峰。
为了合成化合物19c，在室温将化合物19b(38.2g,6.02mmol)和TSTU(7.25g,mmol)溶于130mL二氯甲烷。然后加入DIPEA(3.11g,24.1mmol)，将该混合物搅拌1h。过滤得到的混悬液，用100mL二氯甲烷稀释滤液，用200mL 750g水/197g NaCl/3g NaOH溶液洗涤。用MgSO4干燥有机相，真空蒸发溶剂。
将残余物溶于210mL甲苯，在室温用430mL MTBE稀释，储存在–20℃过夜。通过用玻璃滤器Por.3过滤收集沉淀，用450mL冷却的MTBE(–20℃)洗涤。真空干燥产物过夜。
收率35.8g(91％)白色粉末19c。
MS：m/z 857.51＝[M+8H]8+(计算值＝857.51)。
对于含有多分散性PEG的化合物的质谱，选择一个单质量峰。
根据以下方案由异丙基丙二酸一苄基酯和PEG8000制备了交联剂试剂19g：
为了合成异丙基丙二酸一苄基酯外消旋-19d，将异丙基丙二酸(35.0g,239mmol)、苄醇(23.3g,216mmol)和DMAP(1.46g,12.0mmol)溶于100mL乙腈。用冰浴将混合物冷却至0℃。于0℃在15min内加入DCC(49.4g,239mmol)在150mL乙腈中的溶液。除去冰浴，将反应混合物在室温搅拌过夜，然后过滤出固体。在40℃真空蒸发滤液，将残余物溶于300mL MTBE。用2×300mL饱和NaHCO3水溶液萃取该溶液，然后使用6N盐酸将合并的水相酸化至pH＝1–3。用2×300mL MTBE萃取得到的乳液，蒸发溶剂。用200mL饱和NaCl水溶液洗涤合并的有机相，用MgSO4干燥。用340g二氧化硅纯化产物，使用乙酸乙酯/庚烷(10:90→20:80)作为洗脱液。蒸发洗脱液，将残余物真空干燥过夜。
收率9.62g(17％)无色油状物外消旋-19d。
MS：m/z 237.11＝[M+H]+(计算值＝237.11)。
为了合成化合物外消旋-19e，将异丙基丙二酸一苄基酯外消旋-19d(2.25g,9.50mmol)和PEG 8000(19.0g,2.38mmol)溶于100mL二氯甲烷，用冰浴冷却。加入DCC(1.96g,9.50mmol)和DMAP(14mg,0.12mmol)在10mL二氯甲烷中的溶液。除去冰浴，将混合物在室温搅拌过夜。将得到的混悬液冷却至0℃，过滤出固体。真空蒸发溶剂。
将残余物溶于40mL二氯甲烷，在室温用270mL MTBE稀释。将该混合物储存在–20℃过夜。通过用玻璃滤器Por.3过滤收集沉淀，用500mL冷却的MTBE(–20℃)洗涤。真空干燥产物过夜。
收率18.5g(92％)白色粉末外消旋-19e。
MS：m/z 737.43＝[M+13H]13+(计算值＝737.42)。
对于含有多分散性PEG的化合物的质谱，选择一个单质量峰。
为了合成化合物外消旋-19f，将化合物外消旋-19e(18.4g,2.18mmol)溶于乙酸甲酯(160mL)，加入254mg披钯炭。在环境压力的氢气气氛下，将该混合物在室温搅拌过夜。通过celite垫过滤反应混合物，蒸发滤液，真空干燥过夜。
收率17.7g(98％)玻璃状固体外消旋-19f。
MS：m/z 723.51＝[M+13H]13+(计算值＝723.55)。
对于含有多分散性PEG的化合物的质谱，选择一个单质量峰。
为了合成化合物外消旋-19g，在室温将化合物外消旋-19f(13.6g,1.65mmol)和TSTU(1.96g,6.60mmol)溶于60mL二氯甲烷。然后加入DIPEA(852mg,6.60mmol)，将该混合物搅拌45min。过滤得到的混悬液，用70mL乙酸乙酯稀释滤液，用70mL 0.5M磷酸盐缓冲液pH＝6.5洗涤。用MgSO4干燥有机相，真空蒸发溶剂。将残余物溶于80mL甲苯，过滤出剩余的固体，用20mL甲苯洗涤。在室温用35mL MTBE稀释合并的甲苯级分，储存在–20℃过夜。通过用玻璃滤器Por.3过滤收集沉淀，用600mL冷却的MTBE(–20℃)洗涤。真空干燥产物过夜。
收率12.1g(87％)白色粉末外消旋-19g。
MS：m/z 738.51＝[M+13H]13+(计算值＝738.49)。
对于含有多分散性PEG的化合物的质谱，选择一个单质量峰。
实施例20
含有游离氨基的水凝胶珠20a的制备
如针对3c所述的那样制备了20a，不同之处在于应用560rpm的搅拌器速度，使用398mg 1b、2690mg 19c、27.8g DMSO、274mg CithrolTMDPHS、1.8mL TMEDA、2.7mL乙酸，在50μm筛上得到0.22g 20a，在63μm筛上得到0.33g 20a，在75μm筛上得到0.52g 20a，为白色粉末，游离氨基0.152mmol/g。
含有游离氨基的水凝胶珠20b的制备
如针对3c所述的那样制备了20b，不同之处在于应用580rpm的搅拌器速度，使用250mg 1b、2168mg外消旋-19g、21.8g DMSO、215mgCithrolTM DPHS、1.1mL TMEDA、1.7mL乙酸，在50μm筛上得到0.09g20b，在63μm筛上得到0.17g 20b，在75μm筛上得到0.54g 20b，为白色粉末，游离氨基0.154mmol/g。
实施例21
含有组氨酸-标记物的马来酰亚胺21的制备
将0.78g RINK酰胺MBHA树脂(100-200目，0.64mmol/g胺)转入具有釉料的20mL注射器，在10mL DCM中溶胀。排出溶剂，用NMP将树脂洗涤3次，每次弃去溶剂。将树脂分别用5mL 20％哌啶的DMF溶液处理15分钟和5min，以除去Fmoc保护基，每次弃去溶剂。用NMP将树脂洗涤10次。将775mg Fmoc-His(Trt)-OH和475mg HATU溶于3mL0.5M HOAT的DMF溶液，加入850μL DIPEA。将该溶液抽入注射器，将混悬液于环境温度在温和振摇下温育3h。弃去溶剂，用NMP将树脂洗涤5次。如上所述除去Fmoc-保护基。接下来的5次偶联使用620mgFmoc-His(Trt)-OH、77mg HOBt、160mg TBTU和850μL DIPEA在3mLNMP中的偶联溶液各自进行。使反应每次于环境温度在温和振摇下进行1小时，然后用NMP洗涤，进行Fmoc-脱保护。此后，在环境温度用385mgFmoc-Ado-OH、475mg HATU、850μL DIPEA溶于3mL 0.5M HOAt的DMF溶液中的溶液将树脂处理1h，然后用NMP洗涤，进行Fmoc脱保护。于环境温度在温和振摇下用在3mL 0.5M HOAt的DMF溶液中的169mg马来酰亚氨基丙酸、475mg HATU、850μL DIPEA将树脂处理8小时。弃去溶剂，用NMP将树脂洗涤5次，用DCM洗涤10次。每次弃去溶剂。最后，每次用5mL 95％TFA/2.5％TIPS/2.5％水的溶液将树脂处理2次30min和2次1小时。将溶液排入分开的50mL Falcon管中，在连续的氮气流中蒸发TFA。向残余物中加入45mL冰冷乙醚，离心Falcon试管，弃去上清液。将沉淀用50％ACN/水吸收，通过制备型HPLC纯化，冻干，得到21。
收率0.15g(26％)。
MS：m/z 1136.49＝[M+H]+(计算值＝1136.49)。
实施例22
在DMSO中的聚乙二醇化水凝胶珠22的制备
将干燥水凝胶珠、例如3c中所述的干燥水凝胶珠转入装配有釉料的注射器，加入NMP(5mL/100mg水凝胶珠)。使水凝胶在环境温度在温和振摇下溶胀10min。排出溶剂，将水凝胶每次用DMSO洗涤10次，然后每次用1％TMEDA/DMSO(5mL/100mg水凝胶珠)洗涤10次，每次弃去溶剂。在37℃将0.2eq(基于水凝胶珠的胺含量)PEG-NHS溶于含有2eq(基于水凝胶珠的胺含量)TMEDA的DMSO溶液的溶液15min。将该溶液抽入注射器，将得到的水凝胶混悬液在温和振摇下温育。排出溶剂，将水凝胶用DMSO(5mL/100mg水凝胶珠)洗涤5次，然后用0.1％乙酸/0.01％Tween 20(5mL/100mg水凝胶珠)进行5个洗涤循环。将新鲜的0.1％乙酸/0.01％Tween 20抽入注射器，得到基于起始重量10mg/mL的水凝胶混悬液。如上所述测定水凝胶珠的胺含量。基于方程(2)，这是指聚乙二醇化的程度。
根据上述操作使用50mg水凝胶20a和60.8mg 40kDA PEG-NHS制备了实施例22a，得到具有0.141mmol/g胺含量的聚乙二醇化的水凝胶珠。
根据上述操作使用51.3mg水凝胶20b和59.5mg 40kDA PEG-NHS制备了实施例22b，得到具有0.118mmol/g胺含量的聚乙二醇化的水凝胶珠。
实施例23
马来酰亚胺官能化的水凝胶珠23的制备
将基于聚乙二醇化前水凝胶珠的起始重量10mg/mL的混悬液形式的聚乙二醇化的水凝胶珠转入装配有釉料的注射器。排出溶剂，用水(5mL/100mg水凝胶珠)将水凝胶洗涤10次，每次弃去溶剂。然后将水凝胶珠用NMP洗涤10次，用2％DIPEA的NMP溶液洗涤5次。将5eqMal-PEG6-Pfp(基于水凝胶珠的胺含量)溶于NMP(1mL/50mg试剂)，加入到洗涤的水凝胶珠中。将水凝胶混悬液在室温温育2h。将得到的马来酰亚胺官能化的水凝胶珠用NMP、然后用0.1％乙酸/0.01％Tween20各自洗涤5次。
通过水凝胶上Fmoc-半胱氨酸与马来酰亚胺基团的缀合、随后如Gude,M.,J.Ryf等人(2002)Letters in Peptide Science 9(4)：203-206所述进行Fmoc-测定来测定水凝胶珠的马来酰亚胺含量。
根据上述操作使用35mg 22a(基于20a的干燥重量)和13mgMal-PEG6-Pfp制备了实施例23a。
根据上述操作使用35mg 22b(基于20b的干燥重量)和17mgMal-PEG6-Pfp制备了实施例23b。
实施例24
临时性Lucentis-连接基-水凝胶前药的合成
将80mg Lucentis(在下面的方案中描述为Lucentis-NH2)(2000μL 40mg/mL的Lucentis在10mM组氨酸、10wt％α,α-海藻糖、0.01％Tween20,pH 5.5中的溶液)的缓冲液交换成10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、140mM氯化钠,pH 7.4，将Lucentis的浓度调整至13.5mg/mL。将6mg连接基试剂4c溶于100μL DMSO，得到100mM的浓度。将相对于Lucentis的量而言1摩尔当量的连接基试剂4c加入到Lucentis溶液中。小心地混合该反应混合物，在室温温育5min。随后，将另外1.3摩尔当量的连接基试剂4c加入到Lucentis溶液中，得到未修饰的Lucentis和被保护的Lucentis-连接基一缀合物24a的混合物。
通过添加1M柠檬酸钠,pH 5.0将反应混合物的pH调整至pH 6.5，加入Na2EDTA至终浓度为5mM。为了除去24a的保护基，加入0.5MNH2OH(溶于10mM柠檬酸钠、140mM氯化钠、5mM Na2EDTA,pH 6.5)至终浓度为45mM，将脱保护反应在室温温育4h，得到Lucentis-连接基一缀合物24b。将Lucentis和Lucentis-连接基一缀合物24b的混合物的缓冲液交换成10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、140mM氯化钠、5mMNa2EDTA、0.01％Tween 20,pH 6.5，将2个Lucentis种类的总浓度调整至12.1mg/mL。
实施例25
临时性Lucentis-连接基-水凝胶前药25a的合成
将在10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、140mM氯化钠、5mM Na2EDTA,0.01％Tween 20,pH 6.5中的20mg Lucentis/Lucentis-连接基一缀合物24b混合物加入到2.5mg马来酰亚胺官能化的水凝胶珠5a中，在室温温育过夜，得到临时性Lucentis-连接基-水凝胶前药25a。
根据针对25a所述的操作使用2.5mg(基于20a的干燥重量)23a制备了实施例25b。
根据针对25b所述的操作使用2.5mg(基于20b的干燥重量)23b制备了实施例25c。
实施例26
封闭的水凝胶珠26
根据实施例3c中所述的操作合成了水凝胶珠，根据实施例5a中所述的操作用马来酰亚胺基团将其官能化。此后，将4mL 10mg/mL水凝胶混悬液转入装配有釉料的20mL注射器。排出溶剂，用5mL 10mM组氨酸/10重量％α,α-海藻糖/0.01％Tween20/pH 5.5将水凝胶洗涤10次。排出溶剂，将5mL在10mM组氨酸/10重量％α,α-海藻糖/0.01％Tween20/pH5.5中的1mMβ-巯基乙醇抽入注射器。将得到的混悬液在环境温度在温和振摇下温育5min。弃去溶剂，用5mL在10mM组氨酸/10重量％α,α-海藻糖/0.01％Tween20/pH 5.5中的1mMβ-巯基乙醇将水凝胶再处理9次。每次弃去溶剂。然后每次用5mL 10mM组氨酸/10重量％α,α-海藻糖/0.01％Tween20/pH 5.5将水凝胶珠洗涤10次，每次弃去溶剂。然后每次用5mL PBS-T/pH 7.4将水凝胶珠洗涤10次，每次弃去溶剂。最后，将新鲜的PBS-T/pH 7.4抽入注射器，将混悬液转入Falcon管，得到26。
实施例27
抗体与Lucentis水凝胶珠27的结合
将20μL在PBS-T缓冲液中的水凝胶混悬液25a-c(35体积-％)与400μL在具有1％BSA(Sigma,A3059)的PBS-T中的第一抗体溶液混合，在1.5mL Eppendorf管中以200rpm温育1h。对于Lucentis水凝胶珠，使用抗体ab771(抗-人IgG Fab片段抗体[4A11](ab771)-Abcam,Cambridge,UK)的1：100稀释液。通过在台式离心机中以100g离心1min的步骤沉降水凝胶珠。通过移液除去上清液，小心吸取以便不除去任何水凝胶珠。通过2个循环的洗涤步骤对珠进行洗涤，包括添加1mL PBS-T缓冲液，以100g离心1min和通过移液小心除去上清液。将400μL在具有1％BSA(Sigma,A3059)的PBS-T中的第二抗体加入到珠中，以200rpm温育1h。对于Lucentis水凝胶珠，使用抗体ab97041(山羊抗-小鼠IgGH&L(藻红蛋白)预吸附的(ab97041)-Abcam,Cambridge,UK)的1:50稀释液。通过移液除去上清液，小心吸取以便不除去任何水凝胶珠。通过4个循环的洗涤步骤对珠进行洗涤，包括添加1mL PBS-T缓冲液、以100g离心1min和通过移液小心除去上清液。将洗涤的珠重新混悬于200μLPBS-T，完全转入黑色96-孔培养板(黑色，未结合，Art.no.655900，Greinerbio-one GmbH，72636Frickenhausen，德国)。用Tecan Infinite M200荧光培养板读数仪测定荧光强度(激发波长495nm,发射波长575nm,闪烁次数25，积分时间20μs,多次读数/孔5x5(Border 250μm)，最佳增益)。数据分析
与未修饰的Lucentis水凝胶珠25a的标准曲线比较进行了抗体结合PEG-修饰的Lucentis水凝胶珠的测定。将未修饰的Lucentis水凝胶珠与安慰剂水凝胶珠26以不同比例混合。以线性方式绘图(未修饰的Lucentis水凝胶珠百分比对荧光强度绘图)。根据获得的校准曲线反向计算抗体结合聚乙二醇化Lucentis水凝胶珠的百分比。
结果
定义：DevMean＝来自平均值的偏差＝|μ-X|,μ＝平均值
实施例28
体外释放动力学–28a体外半衰期的测定
用60mM磷酸钠、3mM Na2EDTA、0.01％Tween20,pH 7.4将50.3mg浓稠的Lucentis-连接基-水凝胶前药混悬液25a(含有约1.68mgLucentis)洗涤5次，最后混悬于1mL上述缓冲液中。在37℃温育该混悬液。在不同时间间隔后交换混悬液的缓冲液，通过HPLC-SEC在220nm分析。将对应于释放的Lucentis的峰积分，将释放的Lucentis总量对总温育时间绘图。应用曲线拟合软件测定一级裂解速率。
28a的释放动力学：
| t[d] | Lucentis释放[μg] | Lucentis释放[％] |
| 0 | 0 | 0 |
| 4.85 | 141.0 | 8.4 |
| 12.9 | 262.2 | 15.6 |
根据28a中所述的操作制备了实施例28b，但是使用35.0mg浓稠的Lucentis-连接基-水凝胶前药混悬液25b(含有约1.14mg Lucentis)。
28b的释放动力学：
| t[d] | Lucentis释放[μg] | Lucentis释放[％] |
| 0 | 0 | 0 |
| 4.85 | 96.9 | 8.5 |
| 12.9 | 172.7 | 15.1 |
根据28a中所述的操作制备了实施例28c，但是使用25.3mg浓稠的Lucentis-连接基-水凝胶前药混悬液25c(含有约0.73mg Lucentis)。
28c的释放动力学：
| t[d] | Lucentis释放[μg] | Lucentis释放[％] |
| 0 | 0 | 0 |
| 4.85 | 51.8 | 7.3 |
| 12.9 | 96.5 | 13.5 |
实施例29
硫羟基官能化的水凝胶珠29的制备
将3c中所述的具有0.097mmol/g胺含量的100mg干燥水凝胶珠转入装配有釉料的20mL注射器。使水凝胶在NMP中溶胀，弃去溶剂。每次用5mL NMP将水凝胶洗涤5次，每次弃去溶剂。每次用5mL 2％DIPEA的NMP溶液将水凝胶珠洗涤5次，每次弃去溶剂。用5mL DMSO将水凝胶珠洗涤5次，每次弃去溶剂。将17.7mg OPSS-PEG12-NHS溶于1mLDMSO，抽入注射器。将混悬液于环境温度在温和振摇下温育2小时。排出溶剂，每次用5mL DMSO将水凝胶珠洗涤5次，每次用5mL 15mM琥珀酸盐/100mM NaCl/5mM EDTA/pH 4.0洗涤5次，每次弃去溶剂。将10mL 15mM琥珀酸盐/100mM NaCl/5mM EDTA/pH 4.0缓冲液抽入注射器，将得到的混悬液转入Falcon管。加入10μL Tween20。将1mL该水凝胶混悬液转入装配有釉料的5mL注射器，排出溶剂。将水凝胶珠与1mL 50mM TCEP水溶液一起于环境温度在温和振摇下温育10min。排出溶剂，每次用1mL 50mM TCEP水溶液将水凝胶珠洗涤5次，每次弃去溶剂。用1mL 15mM琥珀酸盐/100mM NaCl/5mM EDTA/0.01％Tween20/pH 4.0将水凝胶珠洗涤10次，每次弃去溶剂。将1mL 15mM琥珀酸盐/100mM NaCl/5mM EDTA/0.01％Tween20/pH 4.0抽入注射器，得到29，基于水凝胶珠的初始干燥重量为10mg/mL的水凝胶混悬液的形式。
实施例30
硫羟基官能化的组氨酸标记物30的制备
将0.2g Rink酰胺MBHA树脂(100-200目,0.64mmol/g胺)转入装配有釉料的5mL注射器，在2mL DMF中溶胀10min。排出溶剂，用5mL DMF将树脂洗涤5次，每次弃去溶剂。用5mL 20％哌啶的DMF溶液将树脂处理2次15分钟，每次弃去溶剂，以除去Fmoc保护基。用2mL DMF将树脂洗涤10次。将198mg Fmoc-His(Trt)-OH和146mg HATU溶于1mL0.5M HOAT的DMF溶液，加入223μL DIPEA。将该溶液抽入注射器，将该混悬液于环境温度在温和振摇下温育1.5小时。弃去溶剂，再次用198mg Fmoc-His(Trt)-OH、146mg HATU和223μL DIPEA在1mL 0.5MHOAT的DMF溶液中的溶液将树脂处理1.5小时。弃去溶剂，每次用2mLDMF洗涤树脂10次，每次弃去溶剂。如上所述除去Fmoc-保护基。使用198mg Fmoc-His(Trt)-OH、146mg HATU和223μL DIPEA在1mL 0.5MHOAt的DMF溶液中的偶联溶液进行接下来的5次偶联。每次使反应于环境温度在温和振摇下进行1.5小时，然后用DMF洗涤并进行Fmoc-脱保护。此后，用溶于1mL 0.5M HOAt的DMF溶液的123mg Fmoc-Ado-OH、122mg HATU、223μL DIPEA的溶液于环境温度将树脂处理1.5小时，然后用DMF洗涤并进行Fmoc脱保护。于环境温度在温和振摇下用在1mL0.5M HOAt的DMF溶液中的112mg 3-(三苯甲基硫基-)丙酸、122mgHATU和223μL DIPEA将树脂处理1小时。弃去溶剂，将树脂用DMF洗涤10次，用DCM洗涤10次。每次弃去溶剂。将树脂每次用3mL 95％TFA/2.5％TIPS/2.5％水处理2次，一次30min，一次1小时。将溶液排入分开的50mL Falcon管，在连续氮气流中蒸发TFA。向残余物中加入45mL冰冷的乙醚，离心Falcon管，弃去上清液。将沉淀用50％ACN/水吸收，通过制备型HPLC纯化，冻干，得到30。
收率8.1mg(6％)。
MS：m/z 1073.46＝[M+H]+(计算值＝1073.46)。
实施例31
2-(2-吡啶基二硫基)乙醇31的制备
将250mg aldrithiol-2溶于10mL 50mM磷酸盐/ACN pH 7.4，加入95μL 2-巯基乙醇。将该溶液在环境温度搅拌5min。然后，加入另外的50mg aldrithiol-2。将该溶液在环境温度搅拌16h。通过制备型HPLC纯化粗产物，冻干，得到31。
收率140.6mg(55％)。
MS：m/z 188.02＝[M+H]+(计算值＝188.02)。
实施例32
硫羟基官能化的水凝胶32的封闭
将4mg(基于初始水凝胶的干燥重量)硫羟基官能化的水凝胶珠29以在15mM琥珀酸盐/100mM NaCl/5mM EDTA/0.01％Tween20/pH 4.0中的10mg/mL混悬液转入装配有釉料的5mL注射器。排出溶剂，将322μL31在15mM琥珀酸盐/100mM NaCl/5mM EDTA/0.01％Tween20/pH 4.0中的5mM溶液抽入注射器。将该混悬液于环境温度在温和振摇下温育16h。排出溶剂，用2mL 15mM琥珀酸盐/100mM NaCl/5mMEDTA/0.01％Tween20/pH 4.0将水凝胶珠洗涤10次，每次弃去溶剂。
实施例33
临时性Lucentis-连接基-水凝胶前药33d的合成
将360mg Lucentis(在下面的方案中描述为Lucentis-NH2)(9mL在10mM组氨酸、10重量％α,α-海藻糖、0.01％Tween20,pH 5.5中40mg/mLLucentis)的缓冲液交换成10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、140mM氯化钠,pH 7.4，将Lucentis的浓度调整至20mg/mL。将连接基试剂11d溶于DMSO，得到100mM的浓度。将相对于Lucentis的量而言5摩尔当量的连接基试剂11d加入到2、2和1摩尔当量步骤中的Lucentis溶液中。在每次添加连接基试剂后小心地混合该反应混合物并在室温温育5min，得到未修饰的Lucentis和被保护的Lucentis-连接基一缀合物33a的混合物。
通过添加1M柠檬酸钠,pH 5.0将四分之一反应混合物的pH调整至pH 6.5，加入Na2EDTA至终浓度为5mM。为了除去33a的(5-甲基-2-氧代-1,3-间二氧杂环戊烯-基)-甲基氧代羰基保护基，加入0.5M NH2OH(溶于10mM柠檬酸钠、140mM氯化钠、5mM Na2EDTA,pH 6.5)至45mM的终浓度，将脱保护反应在室温温育135min，得到Lucentis-连接基一缀合物33b。将Lucentis和Lucentis-连接基一缀合物33b的混合物的缓冲液交换成15mM琥珀酸、100mM氯化钠、5mM Na2EDTA,pH 4.0，随后浓缩至浓度为15mg/mL。将蛋白质溶液冷却至4℃，相对于Lucentis总含量而言加入1摩尔当量的在15mM琥珀酸、100mM氯化钠、5mMNa2EDTA,pH 4.0中的25mM DTT以除去Pys保护基，得到Lucentis-连接基一缀合物33c。将未修饰的Lucentis和Lucentis-连接基一缀合物33c的混合物的缓冲液交换成15mM琥珀酸、100mM氯化钠、5mM Na2EDTA,pH 4.0，随后浓缩至浓度为28.7mg/mL。如通过Ellman测定法所测得的，混合物中Lucentis-连接基一缀合物33c的含量为15％。
将在15mM琥珀酸、100mM氯化钠、5mM Na2EDTA,pH 4.0中的79.7mg Lucentis/Lucentis-连接基一缀合物33c混合物加入到5.1mg马来酰亚胺官能化的水凝胶珠5c中，通过添加0.5M琥珀酸,pH 6.0将pH调整至pH 5，在室温温育过夜，得到临时性Lucentis-连接基-水凝胶前药33d。通过在室温与1摩尔当量(相对于马来酰亚胺官能化的水凝胶珠5c的马来酰亚胺含量而言)在15mM琥珀酸、100mM氯化钠、5mM Na2EDTA,pH4.0中的1mM 2-巯基乙醇一起进行8个15min的温育步骤封闭过量的马来酰亚胺。根据实施例7进行体外释放动力学分析以测定33d的体外半衰期。
实施例34
临时性Lucentis-连接基-组氨酸-标记物缀合物34d的合成
将120mg Lucentis(在下面的方案中描述为Lucentis-NH2)(3mL在10mM组氨酸、10重量％α,α-海藻糖、0.01％Tween20,pH 5.5中的40mg/mL Lucentis)的缓冲液交换成60mM磷酸钠、100mM氯化钠,pH 7.4，将Lucentis的浓度调整至20mg/mL。将连接基试剂14f(在下面的方案中仅描述了1个区域异构体)溶于DMSO，得到100mM的终浓度。将相对于Lucentis的量而言2摩尔当量的连接基试剂14f加入到Lucentis溶液中。小心地混合该反应混合物，在室温温育5min。随后，加入另外1摩尔当量的连接基试剂14f。在室温再温育5min，得到未修饰的Lucentis和被保护的Lucentis-连接基一缀合物34a的混合物。在室温温育4h，导致Lucentis-连接基一缀合物34a定量转化成Lucentis-连接基一缀合物34b。
将Lucentis和Lucentis-连接基一缀合物34b的混合物的缓冲液交换成15mM琥珀酸、100mM氯化钠、5mM Na2EDTA,pH 4.0，将蛋白质浓度调整至11.8mg/mL。将蛋白质溶液冷却至4℃，加入相对于Lucentis总含量而言1摩尔当量的在15mM琥珀酸、100mM氯化钠、5mM Na2EDTA,pH 4.0中的25mM DTT以除去Pys保护基，得到Lucentis-连接基一缀合物34c。将未修饰的Lucentis和Lucentis-连接基一缀合物34c的混合物的缓冲液交换成15mM琥珀酸、100mM氯化钠、5mM Na2EDTA,pH 4.0，随后浓缩至浓度为17.2mg/mL。
向在15mM琥珀酸、100mM氯化钠、5mM Na2EDTA,pH 4.0中的106.5mg Lucentis/Lucentis-连接基一缀合物34c混合物中加入相对于Lucentis总含量而言1摩尔当量的含有组氨酸-标记物的马来酰亚胺21，通过添加0.5M琥珀酸,pH 6.0将pH调整至pH 5。在室温温育4.5h，得到Lucentis-连接基-组氨酸-标记物缀合物34d，通过阳离子交换色谱法将其从Lucentis和过量的含有组氨酸-标记物的马来酰亚胺21中纯化出来。
实施例35
体外释放动力学–临时性组氨酸-标记物缀合物的体外半衰期的测定
将阳离子交换色谱法纯化的Lucentis-连接基-组氨酸-标记物缀合物34d的缓冲液交换成60mM磷酸钠、3mM Na2EDTA、0.01％Tween20,pH7.4，将浓度调整至1mg/mL。在37℃温育不同的时间间隔后，通过阳离子交换色谱法分析200μg蛋白质样品。通过比较释放的Lucentis和Lucentis-连接基-组氨酸-标记物缀合物34d的峰面积确定释放的Lucentis的量并且对温育时间绘图。应用曲线拟合软件测定一级裂解速率。
实施例36
临时性的标记的Lucentis-连接基一缀合物36b的合成和纯化
将400mg Lucentis(在下面的方案中描述为Lucentis-NH2)(10mL在10mM组氨酸、10重量％α,α-海藻糖、0.01％Tween20,pH 5.5中的40mg/mL Lucentis)的缓冲液交换成60mM磷酸钠、100mM氯化钠,pH 7.4，将Lucentis的浓度调整至20.8mg/mL。将连接基试剂17g溶于DMSO，得到100mM的浓度。向Lucentis溶液中加入相对于Lucentis的量而言4.5摩尔当量的连接基试剂17g。小心地混合该反应混合物，在室温温育5min，得到未修饰的Lucentis和被保护的标记的Lucentis-连接基一缀合物36a的混合物。
将Lucentis和被保护的标记的Lucentis-连接基一缀合物36a的混合物的缓冲液交换成60mM磷酸钠、100mM氯化钠,pH 6.5。为了除去36a的(5-甲基-2-氧代-1,3-间二氧杂环戊烯-基)-甲基氧代羰基保护基，加入0.5M NH2OH(溶于10mM柠檬酸钠、140mM氯化钠、5mM Na2EDTA,pH6.5)至终浓度为45mM，将脱保护反应在室温温育2.5h，得到标记的Lucentis-连接基一缀合物36b，通过阳离子交换色谱法将其从未修饰的Lucentis中分离出来。
实施例37
使用硫羟/活化的二硫化物缀合化学合成临时性Lucentis-连接基-水凝胶前药37a
将在15mM琥珀酸、100mM氯化钠、5mM Na2EDTA,pH 4.0中的61.5mg Lucentis/Lucentis-连接基一缀合物33b混合物(c＝41mg/mL)加入到6.6mg硫羟基官能化的水凝胶珠29中。将水凝胶荷载反应在4℃温育60h，然后在室温温育16h，得到临时性Lucentis-连接基-水凝胶前药37a。
实施例38
使用硫羟基/马来酰亚胺缀合化学合成临时性Lucentis-连接基-水凝胶前药38a
将10mg Lucentis-连接基一缀合物34c以20mg/mL浓度加入到5mg马来酰亚胺官能化的水凝胶5c中，将反应混合物在pH 5和室温下温育过夜，得到临时性Lucentis-连接基-水凝胶前药38a。通过在室温下与1摩尔当量(相对于马来酰亚胺官能化的水凝胶珠5c的马来酰亚胺含量而言)的1mM 2-巯基乙醇在15mM琥珀酸、100mM氯化钠、5mM Na2EDTA,pH4.0中的溶液一起进行8个15min的温育步骤封闭过量的马来酰亚胺。
实施例39
使用硫羟基/活化的二硫化物缀合化学合成临时性Lucentis-连接基-水凝胶前药39a
将50mg Lucentis/Lucentis-连接基一缀合物34b混合物在15mM琥珀酸、100mM氯化钠、5mM Na2EDTA,pH 4.0中以40mg/mL的总Lucentis浓度加入到5mg硫羟基官能化的水凝胶珠29中，将反应混合物在室温温育过夜，得到临时性Lucentis-连接基-水凝胶前药39a。通过在室温下与5摩尔当量(相对于硫羟基官能化的水凝胶珠29的硫羟基含量而言)的1mM 31在15mM琥珀酸、100mM氯化钠、5mM Na2EDTA,pH 4.0中的溶液一起温育16h封闭水凝胶上过量的硫羟基。
实施例40
临时性Lucentis-连接基-组氨酸-标记物缀合物40a的合成
根据实施例33使用连接基试剂9c制备了临时性Lucentis-连接基-组氨酸-标记物缀合物40a。不使用马来酰亚胺官能化的水凝胶5c，而是使用相对于马来酰亚胺官能化的组氨酸-标记物21的Lucentis总含量而言1摩尔当量。
实施例41
临时性Lucentis-连接基-组氨酸-标记物缀合物41a的合成
根据实施例34使用连接基试剂13g制备了临时性Lucentis-连接基-组氨酸-标记物缀合物41a。
实施例42
临时性Lucentis-连接基-水凝胶前药42a的合成
根据实施例33使用连接基试剂15b制备了临时性Lucentis-连接基-水凝胶前药42a。由于不存在(5-甲基-2-氧代-1,3-间二氧杂环戊烯-基)-甲基氧代羰基保护基，所以不进行羟基胺辅助的脱保护步骤。
实施例43
临时性Lucentis-连接基-水凝胶前药43a的合成
根据实施例33使用连接基试剂18i制备了临时性Lucentis-连接基-水凝胶前药43a。
表1：合成的Lucentis-连接基-水凝胶前药和Lucentis-连接基-组氨酸标记物缀合物的半衰期
| 前药/缀合物 | 在pH 7.4和37℃下的半衰期/天 |
| 6c | 37 |
| 40a | 37 |
| 33d | 6 |
| 41a | 5 |
| 34d | 30 |
| 42a | 28 |
| 43a | 17 |
实施例44
临时性Lucentis-连接基-水凝胶前药44a的合成
将在10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、140mM氯化钠、5mMNa2EDTA、0.01％Tween 20,pH 6.5中的1147mg Lucentis/Lucentis-连接基一缀合物6b混合物加入到153mg马来酰亚胺官能化的水凝胶珠5c中，在室温温育过夜，得到临时性Lucentis-连接基-水凝胶前药44a。
实施例45
从Lucentis-连接基-水凝胶前药44a中释放的Lucentis的结合亲和性的评价
使用Biacore表面胞质基因共振系统(Biacore T200,Pharmacia,Piscataway,NJ)测定了从Lucentis-连接基-水凝胶前药44a中释放的Lucentis的活性VEGF结合浓度。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)使VEGF共价固定至羧甲基化的葡聚糖传感器芯片(CM5)上。通过监测注射前和注射后180s的共振单元的改变测定了Lucentis对VEGF的结合。使用由5μg/ml-0.156μg/ml的参比材料的连续稀释液制备的标准校正曲线测定了活性VEGF结合浓度。通过Bradford测定法或UV-Vis吸光度测定的该活性结合浓度与总蛋白质浓度之比给出了结合百分比。
对于Lucentis-连接基-水凝胶前药44a，已经证实28天后以及超过120天后释放的Lucentis显示80±10％结合。
实施例46
雷珠单抗测定和分析
对于两个组，均设计定性配体结合测定法以测定雷珠单抗在兔玻璃体基质中的浓度。为了进行Lucentis-连接基-水凝胶前药44a定性，确定水凝胶在所有测试浓度下均不干扰雷珠单抗定量。该测定法使用重组人VEGF-A俘获家兔玻璃体样品中的雷珠单抗。使用与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗-人F(ab')2检测结合的雷珠单抗并且用过氧化物酶底物(TMB)进行显色。使用吸光度分光光度法、应用微量培养板读数仪对药物水平进行定量。根据标准曲线计算本研究样品中雷珠单抗的浓度，且兔玻璃体基质中的最小可定量浓度(MQC)为1.5ng/mL。将玻璃体浓度使用MATLAB软件绘图并分析。
表2：在0.5mg/眼玻璃体内剂量的雷珠单抗后测定的玻璃体液中的雷珠单抗浓度(ng/mL)
aL＝左眼,R＝右眼
表3：在1.7mg/眼的玻璃体内剂量的Lucentis-连接基-水凝胶前药44a后测定的玻璃体液中的雷珠单抗浓度(ng/mL)
aL＝左眼,R＝右眼
b管中无样品
LTR＝低于可报告的限度
ND＝未测定
缩写：
aq. 含水的，水性的
Asp 天冬氨酸
Boc 叔丁氧基羰基
CIEC 阳离子交换色谱法
COMU 六氟磷酸(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉代-碳
DBU 1,8-二氮杂二环(5.4.0)十一碳-7-烯
DCC 二环己基碳二亚胺
DCM 二氯甲烷
DIPEA 二异丙基乙基胺
DMAP 二甲基氨基吡啶
DMF 二甲基甲酰胺
DMSO 二甲亚砜
DTT 二硫苏糖醇
EDTA 乙二胺四乙酸
Fmoc 芴基甲基氧基羰基
HATU 六氟磷酸1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物
HFIP 六氟异丙醇
HPLC 高效液相色谱法
iPrOH 异丙醇
Lys 赖氨酸
max. 最大
马来酰亚胺-NH-PEG12-PFEN-(3-马来酰亚氨基丙基)-39-氨基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-三十九酸五氟苯基酯
Me 甲基
MeOAc 乙酸甲酯
MeOH 甲醇
MES 2-(N-吗啉代)乙磺酸
MMT 4-甲氧基三苯基甲基
MS 质谱法
MTBE 甲基-叔丁基醚
NHS N-羟基琥珀酰亚胺
Oxyma Pure 2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯
PEG 聚乙二醇
Pys 2-吡啶亚磺酰基
PyBOP 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷子基
RP-HPLC 反相–高效液相色谱法
RT 室温
sat. 饱和的
Su N-羟基琥珀酰亚胺基
tBu和t-Bu 叔丁基
TAN 1,5,9-三氮杂壬烷
TES 三乙基硅烷
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
TLC 薄层色谱法
TMEDA N,N,N',N'-四甲基乙二胺
Tmob 2,4,6-三甲氧基苄基
Trt 三苯甲基
TSTU 四氟硼酸O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N′,N′-四甲基脲
Claims (26)
1.用在治疗一种或多种眼病症的方法中的药物组合物，其包含一种或多种药学上可接受的赋形剂和中和VEGF的前药，所述前药包含共价结合的中和VEGF的生物学活性原子团。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述的中和VEGF的前药是载体连接的前药。
3.权利要求2的药物组合物，其中所述的载体连接的前药的载体是水凝胶。
4.权利要求1－3中任意一项的药物组合物，其中所述的载体是基于PEG的水凝胶。
5.权利要求1－4中任意一项的药物组合物，其中所述的治疗包括眼内施用所述前药。
6.权利要求5的药物组合物，其中所述的眼内施用是通过眼内注射进行的。
7.权利要求1－6中任意一项的药物组合物，其中所述药物组合物中包含的所述前药具有5－200mg前药/ml药物组合物的浓度。
8.权利要求1－7中任意一项的药物组合物，其中所述组合物包含占前药总重量的8－80重量％的中和VEGF的生物学活性原子团。
9.权利要求6－8中任意一项的药物组合物，其中所述注射是使用10－200μl/注射的注射体积进行的。
10.权利要求5－9中任意一项的药物组合物，其中两次眼内施用中和VEGF的前药之间的时间期限是至少1个月。
11.权利要求1－10中任意一项的药物组合物，其中所述的中和VEGF的前药包含结合的形式的选自以下药物组的生物学活性原子团：靶向于VEGF核酸的反义RNA、反义DNA、核酶或RNAi分子；防止VEGF与其关联受体结合的抗-VEGF适配体、抗-VEGF抗体、抗-VEGF抗体片段、DARPins和可溶性VEGF受体诱杀剂；靶向于关联VEGF受体(VEGFR)核酸的反义、核酶和RNAi分子；与关联VEGFR受体结合的抗-VEGFR适配体或抗-VEGFR抗体；与关联VEGFR受体结合的抗-VEGFR抗体片段和VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。
12.权利要求1－11中任意一项的药物组合物，其中所述的中和VEGF的前药包含结合的形式的选自以下的生物学活性原子团：雷珠单抗、贝伐珠单抗、培加他尼、阿柏西普、MP0112、KH902、ESBA1008、AL 39324、ALG-1001和bevasiranib和/或其片段。
13.权利要求1－12中任意一项的药物组合物，其中所述的中和VEGF的前药包含结合的形式的雷珠单抗。
14.权利要求1－13中任意一项的药物组合物，其中所述的中和VEGF的前药包含式(F-i)的原子团：
其中
D是雷珠单抗；
虚线表示与载体连接或与任选的间隔基原子团连接；
X是C(R4R4a)；N(R4)；O；C(R4R4a)-C(R5R5a)；C(R5R5a)-C(R4R4a)；C(R4R4a)-N(R6)；N(R6)-C(R4R4a)；C(R4R4a)-O；或O-C(R4R4a)；
X1是C；或S(O)；
X2是C(R7,R7a)；或C(R7,R7a)-C(R8,R8a)；
R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a、R5、R5a、R6、R7、R7a、R8、R8a独立地选自H；和C1-4烷基；
任选地，基团对R1a/R4a、R1a/R5a、R4a/R5a、R4a/R5a、R7a/R8a中的一对或多对形成化学键；
任选地，基团对R1/R1a、R2/R2a、R4/R4a、R5/R5a、R7/R7a、R8/R8a中的一对或多对与它们所连接的原子一起形成C3-7环烷基；或4－7元杂环基；
任选地，基团对R1/R4、R1/R5、R1/R6、R4/R5、R7/R8、R2/R3中的一对或多对与它们所连接的原子一起形成环A；
任选地，R3/R3a与它们所连接的氮原子一起形成4－7元杂环；
A选自苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢萘基；C3-10环烷基；4－7元杂环基；和8－11元杂二环基；
任选地，式(F-i)的原子团进一步被取代，条件是式(F-i)中用星号标记的水凝胶不被取代基替代，并且R3和R3a彼此独立地是H或通过SP3-杂化碳原子与N连接。
15.权利要求14的药物组合物，其中X1是C。
16.权利要求14或15的药物组合物，其中所述的中和VEGF的前药包含式(f-ii)的原子团：
其中
虚线表示与载体连接；
R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、X2和D如权利要求14中所定义的那样使用；
R10选自H和C1-6烷基；
SP0是间隔基原子团；
且其中式(F-ii)的原子团任选地进一步被取代，条件是式(F-ii)中用星号标记的水凝胶不被取代基替代，并且R3和R3a彼此独立地是H或通过SP3-杂化碳原子与N连接。
17.权利要求14－16中任意一项的药物组合物，其中优选地R1和R1a均为H。
18.权利要求14－17中任意一项的药物组合物，其中所述的中和VEGF的前药包含式(F-iiia)或(F-iiib)的原子团：
其中
虚线表示与载体连接；
R2、R2a、R3、R3a、R7、R7a、R8、R8a、X2和D如权利要求14中所定义的那样使用；
R10和SP0如权利要求16中所定义的那样使用；
且其中式(F-iiia)或(F-iiib)的原子团任选地进一步被取代，条件是式(F-iiia)和(F-iiib)中用星号标记的氢不被取代基替代，并且R3和R3a彼此独立地是H或通过SP3-杂化碳原子与N连接。
19.权利要求14－18中任意一项的药物组合物，其中所述的中和VEGF的前药包含式(F-iva)或(F-ivb)的原子团：
其中
虚线表示与载体连接；
R3和R3a如权利要求14中所定义的那样使用；
R10b是C1-6烷基；
且其中式(F-iva)或(F-ivb)的原子团任选地进一步被取代，条件是用星号标记的氢不被取代基替代，并且R3和R3a彼此独立地是H或通过SP3-杂化碳原子与N连接。
20.权利要求14－19中任意一项的药物组合物，其中R3是H且R3a是甲基。
21.权利要求14－19中任意一项的药物组合物，其中R3和R3a均为H。
22.权利要求14－19中任意一项的药物组合物，其中R3是H且R3a是甲基。
23.权利要求1－22中任意一项的药物组合物，其中所述的眼病症是以眼新血管形成为特征的疾病。
24.权利要求23的药物组合物，其中所述的眼内新血管形成是选自以下的眼疾病：视神经盘新血管形成、虹膜新血管形成、视网膜新血管形成、脉络膜新血管形成、角膜新血管形成、玻璃体新血管形成、青光眼、血管翳、翼状胬肉、黄斑水肿、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性视网膜缺血、糖尿病性黄斑水肿、血管性视网膜病变、视网膜变性、晶体后纤维组织形成、视网膜母细胞瘤、黄斑变性的早产儿视网膜病变、角膜移植物新血管形成、视网膜中央静脉阻塞、病理性近视、眼肿瘤、眼色素层炎、眼的炎性疾病和增殖性玻璃体视网膜病变。
25.权利要求1－24中任意一项的药物组合物，其中所述的药物组合物还包含一种或多种游离形式的药物，所述药物选自靶向于VEGF核酸的反义RNA、反义DNA、核酶或RNAi分子；防止VEGF与其关联受体结合的抗-VEGF适配体、抗-VEGF抗体、抗-VEGF抗体片段、DARPins、anticalins、脂质运载蛋白和可溶性VEGF受体诱杀剂；靶向于关联VEGF受体(VEGFR)核酸的反义、核酶和RNAi分子；与关联VEGFR受体结合的抗-VEGFR适配体或抗-VEGFR抗体；与关联VEGFR受体结合的抗-VEGFR抗体片段和VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。
26.权利要求1－25中任意一项的药物组合物，其中所述的药物组合物还包含一种或多种前药，所述一种或多种前药包含结合的形式的选自以下的生物学活性原子团：靶向于VEGF核酸的反义RNA、反义DNA、核酶或RNAi分子；防止VEGF与其关联受体结合的抗-VEGF适配体、抗-VEGF抗体、抗-VEGF抗体片段、DARPins、anticalins、脂质运载蛋白和可溶性VEGF受体诱杀剂；靶向于关联VEGF受体(VEGFR)核酸的反义、核酶和RNAi分子；与关联VEGFR受体结合的抗-VEGFR适配体或抗-VEGFR抗体；与关联VEGFR受体结合的抗-VEGFR抗体片段和VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。
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