CN118159295A

CN118159295A - 树枝状体缀合物及其使用方法

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Publication number: CN118159295A
Application number: CN202280055390.5A
Authority: CN
Inventors: J·L·克莱兰德; R·夏尔马
Original assignee: Ashwata Therapeutics Co ltd
Current assignee: Ashwata Therapeutics Co ltd
Priority date: 2021-06-10
Filing date: 2022-06-10
Publication date: 2024-06-07

Abstract

本公开的方面提供了树枝状体缀合物、包含树枝状体缀合物的组合物，以及使用树枝状体缀合物及其组合物的方法。在一些方面，本公开提供了树枝状体缀合物，该树枝状体缀合物包含与至少一种试剂缀合的树枝状体。在一些实施方案中，树枝状体缀合物包含一种或多种可用于疗法、成像、和/或靶向递送的试剂。在一些方面，提供了合成官能化树枝状体的方法，该方法包括使第一树枝状体与一种或多种胺进行反应。

Description

树枝状体缀合物及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2022年4月4日提交的美国临时专利申请No.63/327,301以及于2021年6月10日提交的美国临时专利申请No.63/209,348的优先权，它们各自全文据此以引用方式并入。

背景技术

纳米技术领域的进步导致了具有广泛应用的多种新材料和装置的创建。纳米技术体现在各种各样的材料和颗粒中，如富勒烯和树枝状体。然而，由于纳米粒子与生物系统的相互作用，纳米粒子在体内的应用受到了从循环中快速清除的挑战。纳米粒子开发的替代策略可以允许纳米粒子的有利特性在临床应用、诊断以及生物医学研究的背景下得到更有效地利用。

发明内容

在一些方面，本公开提供了治疗性和/或诊断性化合物，该治疗性和/或诊断性化合物包含通过末端醚或酰胺键与试剂缀合的树枝状体。在一些实施方案中，树枝状体包含任选地被试剂取代的末端羟基。在一些实施方案中，试剂为治疗剂或显像剂。

在一些方面，本公开提供了式(I)的树枝状体缀合物：

其中：D为树枝状体；X为O或NH；Y¹为任选取代的亚烷基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、或共价键；Y²选自仲酰胺、叔酰胺、磺酰胺、仲氨基甲酸酯、叔氨基甲酸酯、碳酸酯、脲、甲醇、二硫化物、腙、酰肼、醚、羰基，以及它们的组合；Z为治疗剂或显像剂；L为连接基；m为16至4096的整数(包括端值在内)；并且n为1至100的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，m与(m+n)的比率为至少0.5。在一些实施方案中，m与(m+n)的比率为约0.50至约0.99。

在一些方面，本公开提供了式(II)的树枝状体缀合物：

其中：D为树枝状体；X的每个实例独立地为O或NH；Y¹的每个实例独立地为任选取代的亚烷基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、或共价键；Y²的每个实例独立地选自仲酰胺、叔酰胺、磺酰胺、仲氨基甲酸酯、叔氨基甲酸酯、碳酸酯、脲、甲醇、二硫化物、腙、酰肼、醚、羰基，以及它们的组合；Z¹和Z²独立地为治疗剂、靶向剂、或显像剂，前提条件是Z¹和Z²是不同的；L¹和L²独立地为连接基；m为16至4096的整数(包括端值在内)；并且n的每个实例独立地为1至100的整数(包括端值在内)。

在一些实施方案中，本公开的治疗性化合物或树枝状体缀合物的树枝状体选自聚(酰氨基胺)(PAMAM)聚合物、聚丙胺(POPAM)聚合物、聚乙烯亚胺聚合物、聚赖氨酸聚合物、聚酯聚合物、蝶烯(iptycene)聚合物、脂族聚(醚)聚合物、芳族聚醚聚合物、2,2-双(羟甲基)丙酸(双-MPA)聚合物，以及它们的组合。

在一些实施方案中，治疗性化合物或树枝状体缀合物的连接基包含聚合物。在一些实施方案中，聚合物为聚合物多元醇、多肽、或未取代的烷基链。在一些实施方案中，聚合物为选自聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇，以及聚乙烯醇的聚合物多元醇。在一些实施方案中，聚合物为包含至少2个且多至25个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，聚合物为未取代的C_2-30烷基链。在一些实施方案中，连接基包含至少一个选自1,2,3-三唑基、4,5-二氢-1,2,3-三唑基、异噁唑基、4,5-二氢异噁唑基，以及1,4-二氢哒嗪基(1,4-dihydropyridazyl)的部分。在一些实施方案中，连接基包含聚合物以及至少一个部分。在一些实施方案中，连接基在生理条件下是不可水解的。

在一些实施方案中，治疗性化合物或树枝状体缀合物的治疗剂选自血管紧张素II受体阻断剂、法尼醇X受体激动剂、死亡受体5激动剂、钠葡萄糖协同转运蛋白2型抑制剂、溶血磷脂酸1受体拮抗剂、内皮素-A受体拮抗剂、PPARδ激动剂、AT1受体拮抗剂、CCR5/CCR2拮抗剂、抗纤维化剂、抗炎剂、抗氧化剂、STING激动剂、CSF1R抑制剂、AXL抑制剂、c-Met抑制剂、PARP抑制剂、受体酪氨酸激酶抑制剂、MEK抑制剂、I类p21活化激酶(PAK1)抑制剂、谷氨酰胺酶抑制剂、TIE II拮抗剂、CXCR2抑制剂、CD73抑制剂、精氨酸酶抑制剂、PI3K抑制剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、SHP2抑制剂、化学治疗剂、STING拮抗剂，以及JAK1抑制剂。

在一些实施方案中，治疗性化合物或树枝状体缀合物的治疗剂为MEK抑制剂。在一些实施方案中，MEK抑制剂选自曲美替尼、考比替尼、贝美替尼、司美替尼、PD325901、PD035901、PD032901，以及TAK-733。在一些实施方案中，治疗性化合物或树枝状体缀合物的治疗剂为受体酪氨酸激酶抑制剂。在一些实施方案中，受体酪氨酸激酶抑制剂选自舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、凡德他尼、阿西替尼、西地尼布、瓦他拉尼、达沙替尼、比美替尼(R428)、度博替尼(TP-0903)、尼达尼布、卡博替尼，以及莫特塞尼。在一些实施方案中，治疗性化合物或树枝状体缀合物的治疗剂为PAK1抑制剂。在一些实施方案中，PAK1抑制剂为Frax-1036(6-[2-氯-4-(6-甲基-2-吡嗪基)苯基]-8-乙基-2-[[2-(1-甲基-4-哌啶基)乙基]氨基]-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮)。

在一些实施方案中，治疗性化合物或树枝状体缀合物的显像剂选自染料、荧光染料、近红外染料、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)显像剂、正电子发射断层扫描(PET)显像剂、磁共振成像(MRI)造影剂，以及放射性核素。

在一些实施方案中，本公开的治疗性化合物或树枝状体缀合物包含至少一种与树枝状体缀合的靶向剂。在一些实施方案中，靶向剂为三触角型-N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。

在一些方面，本公开提供了一种组合物，该组合物包含载体以及式(I-A)的官能化树枝状体：

其中：D为选自聚(酰氨基胺)(PAMAM)聚合物、聚丙胺(POPAM)聚合物、聚乙烯亚胺聚合物、聚赖氨酸聚合物、聚酯聚合物、蝶烯聚合物、脂族聚(醚)聚合物、芳族聚醚聚合物、2,2-双(羟甲基)丙酸(双-MPA)聚合物，以及它们的组合的树枝状体；X为NH；Y¹为任选取代的亚烷基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、或共价键；m为16至4096的整数(包括端值在内)；并且n为1至100的整数(包括端值在内)，其中组合物中的官能化树枝状体的多分散度值小于或等于1.10。

在一些方面，本公开提供了合成式(I-A)的官能化树枝状体的方法：

其中：

D为选自聚(酰氨基胺)(PAMAM)聚合物、聚丙胺(POPAM)聚合物、聚乙烯亚胺聚合物、聚赖氨酸聚合物、聚酯聚合物、蝶烯聚合物、脂族聚(醚)聚合物、芳族聚醚聚合物、2,2-双(羟甲基)丙酸(双-MPA)聚合物，以及它们的组合的树枝状体；X为NH；Y¹为任选取代的亚烷基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、或共价键；m为16至4096的整数(包括端值在内)；并且n为1至100的整数(包括端值在内)；该方法包括：使下式(II-A)的树枝状体与一种或多种胺在合适的条件下反应：

以形成式(I-A)的官能化树枝状体；

其中：D为选自聚(酰氨基胺)(PAMAM)聚合物、聚丙胺(POPAM)聚合物、聚乙烯亚胺聚合物、聚赖氨酸聚合物、聚酯聚合物、蝶烯聚合物、脂族聚(醚)聚合物、芳族聚醚聚合物、2,2-双(羟甲基)丙酸(双-MPA)聚合物，以及它们的组合的树枝状体；t为16至4096的整数(包括端值在内)；其中每种胺为式H₂NR¹，其中R¹为任选取代的亚烷基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、或共价键。在一些实施方案中，提供了本文所述的官能化树枝状体、或其盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、多晶型物、互变异构体、同位素富集形式(例如，同位素标记的衍生物)。

在一些实施方案中，n为大约3或10(例如3或10)。在一些实施方案中，m为从64减去n的值。在一些实施方案中，n为3且m为61。在一些实施方案中，n为10且m为54。在一些实施方案中，m为大约61或54(例如61或54)。

在一些实施方案中，式(II-A)的树枝状体为下式：

在一些实施方案中，式(I-A)的官能化树枝状体为下式：

在另一方面，本公开提供了由本文所述的方法合成的式(I-A)的官能化树枝状体。在一些方面，提供了下式的式(II-A)的树枝状体：

在一些方面，本公开提供了治疗性化合物的组合物，该组合物包含通过末端醚或酰胺键与治疗剂缀合的树枝状体。在一些实施方案中，树枝状体包含任选地被治疗剂取代的高密度的末端羟基。在一些实施方案中，包含与治疗剂缀合的树枝状体的治疗性化合物为10-20质量％的治疗剂。在一些实施方案中，末端醚或酰胺键通过连接基与治疗剂缀合。

在一些实施方案中，治疗性化合物为约10质量％至约15质量％的治疗剂。在一些实施方案中，治疗性化合物为约15质量％至约20质量％的治疗剂。在一些实施方案中，树枝状体上至少50％的末端位点包含末端羟基。在一些实施方案中，树枝状体上至少50％且多至99％(例如，50-95％、50-90％、50-80％、50-70％、50-60％、60-80％、70-90％)的末端位点包含末端羟基。

在一些实施方案中，治疗剂的水溶性相对于在不存在树枝状体的情况下包含治疗剂的未缀合化合物而言有所增加。在一些实施方案中，水溶性相对于未缀合的化合物而言增加至少10％。在一些实施方案中，水溶性相对于未缀合的化合物而言增加约10％至约100％。在一些实施方案中，水溶性相对于未缀合的化合物而言增加至少约两倍。在一些实施方案中，水溶性相对于未缀合的化合物而言增加约两倍至约十倍。在一些实施方案中，水溶性是生理条件下的溶解度。在一些实施方案中，水溶性是在pH为约7.0至约8.0的水中的溶解度。在一些实施方案中，治疗剂以生理条件下未缀合的化合物不溶解的浓度存在。

在一些方面，本公开提供了在对其有需要的受试者中治疗或成像脑部或中枢神经系统的疾病或障碍的方法，该方法包括：向受试者给药有效地治疗或成像受试者的脑部或中枢神经系统的疾病或障碍的量的包含本文所述的树枝状体缀合物的组合物。

在一些实施方案中，树枝状体缀合物被受试者的脑部或中枢神经系统中的活化小胶质细胞和/或活化巨噬细胞选择性地吸收。在一些实施方案中，活化巨噬细胞是中枢神经系统的驻留型巨噬细胞。在一些实施方案中，树枝状体缀合物穿过受试者的血脑屏障。在一些实施方案中，疾病或障碍是脑部或中枢神经系统的肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是与神经纤维瘤病相关联的良性或恶性肿瘤。在一些实施方案中，疾病或障碍是神经纤维瘤病(例如1型神经纤维瘤病(NF1))。因此，在一些实施方案中，受试者患有或怀疑患有神经纤维瘤病(例如NF1)。在一些实施方案中，树枝状体缀合物被受试者中的肿瘤的肿瘤相关巨噬细胞选择性地吸收。在一些实施方案中，肿瘤是脑癌或中枢神经系统癌症。在一些实施方案中，肿瘤是选自瘤形成和增生的脑癌。在一些实施方案中，肿瘤是选自神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经管细胞瘤、神经节瘤以及神经鞘瘤的中枢神经系统癌症。在一些实施方案中，树枝状体缀合物不与靶向部分缀合。在一些实施方案中，将组合物全身、经静脉内、或经口服给药于受试者。在一些实施方案中，树枝状体缀合物包含治疗剂，并且该组合物的治疗指数相对于在不存在树枝状体的情况下包含治疗剂的组合物而言有所增加。在一些实施方案中，治疗剂为MEK抑制剂(例如，曲美替尼、考比替尼、贝美替尼、司美替尼、PD325901、PD035901、PD032901、或TAK-733)。在一些实施方案中，治疗剂为受体酪氨酸激酶抑制剂(例如，舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、凡德他尼、阿西替尼、西地尼布、瓦他拉尼、达沙替尼、比美替尼(R428)、度博替尼(TP-0903)、尼达尼布、卡博替尼、或莫特塞尼)。在一些实施方案中，治疗剂为PAK1抑制剂(例如，Frax-1036(6-[2-氯-4-(6-甲基-2-吡嗪基)苯基]-8-乙基-2-[[2-(1-甲基-4-哌啶基)乙基]氨基]-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮))。

在一些方面，本公开提供了在对其有需要的受试者中治疗或成像眼部疾病或障碍的方法，该方法包括：向受试者给药有效地治疗或成像受试者的眼部疾病或障碍的量的包含本文所述的树枝状体缀合物的组合物。

在一些实施方案中，树枝状体缀合物被受试者的眼部中的活化小胶质细胞和/或活化巨噬细胞选择性地吸收。在一些实施方案中，树枝状体缀合物穿过受试者的血-视网膜屏障。在一些实施方案中，树枝状体缀合物不与靶向部分缀合。在一些实施方案中，将组合物全身、经静脉内、或经口服给药于受试者。在一些实施方案中，树枝状体缀合物包含治疗剂，并且该组合物的治疗指数相对于在不存在树枝状体的情况下包含治疗剂的组合物而言有所增加。

在一些方面，本公开提供了在对其有需要的受试者中治疗或成像增殖性疾病的方法，该方法包括：向受试者给药有效地治疗或成像受试者的增殖性疾病的量的包含本文所述的树枝状体缀合物的组合物。

在一些实施方案中，增殖性疾病为神经纤维瘤病。在一些实施方案中，增殖性疾病选自1型神经纤维瘤病(NF1)、2型神经纤维瘤病(NF2)，以及神经鞘瘤病。在一些实施方案中，增殖性疾病为NF1。在一些实施方案中，树枝状体缀合物不与靶向部分缀合。在一些实施方案中，将组合物全身、经静脉内、或经口服给药于受试者。在一些实施方案中，树枝状体缀合物包含治疗剂，并且该组合物的治疗指数相对于在不存在树枝状体的情况下包含治疗剂的组合物而言有所增加。在一些实施方案中，治疗剂为MEK抑制剂(例如，曲美替尼、考比替尼、贝美替尼、司美替尼、PD325901、PD035901、PD032901、或TAK-733)。在一些实施方案中，治疗剂为受体酪氨酸激酶抑制剂(例如，舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、凡德他尼、阿西替尼、西地尼布、瓦他拉尼、达沙替尼、比美替尼(R428)、度博替尼(TP-0903)、尼达尼布、卡博替尼、或莫特塞尼)。在一些实施方案中，治疗剂为PAK1抑制剂(例如，Frax-1036(6-[2-氯-4-(6-甲基-2-吡嗪基)苯基]-8-乙基-2-[[2-(1-甲基-4-哌啶基)乙基]氨基]-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮))。

本公开的特定实施方案的细节在如下所述的具体实施方式中进行了阐述。根据实施例、附图和权利要求书，本公开的其它特征、目的和优点将是显而易见的。

附图说明

构成本说明书的一部分的附图示出了本发明的几个实施方案，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

图1是显示树枝状体缀合物(化合物D-4517.2)的化学结构的示意图。

图2是显示具有酰胺键的N,N-二去乙基舒尼替尼叠氮化物的一种合成策略的反应路线。

图3是显示树枝状体缀合物(D-4517.2)的合成的反应路线，其中N,N-二去乙基舒尼替尼与具有醚键的树枝状体缀合以增强体内稳定性。

图4是显示D-二去乙基舒尼替尼缀合物D-4517.2分别在人类、小鼠和大鼠血浆条件下在4、24和48小时各时间点的药物释放重量百分比(0.0％-0.50％)的柱形图。

图5是显示树枝状体-N-乙酰基-L-半胱氨酸甲酯缀合物的合成的反应路线。

图6是显示用于与树枝状体缀合的β-GalNAc-三触角型-PEG3-叠氮化物结构单元的合成的反应路线。

图7是显示使用方法A执行的示例性积分的色谱图。示例性计算：

图8是显示使用方法A执行的示例性积分的色谱图。示例性计算：H_k+H_l＝3*H_m

图9是FID与乙醇胺(mg/mL)以及FID与PEG-炔烃(mg/mL)的校准数据图。

图10是显示实验DP07-55-1的平均炔烃臂与PEG-炔烃荷载的图。

图11是显示实验AA08-85、AA08-88和DP07-55-1的平均炔烃臂与PEG-炔烃荷载的图。

图12是显示实验DP07-51和DP07-60的平均炔烃臂与PEG-炔烃荷载的图。

图13是FID与乙醇胺(mg/mL)以及FID与PEG-炔烃(mg/mL)的校准数据图。

图14A-14C是PAMAM G3.5树枝状体的ASTRA报告。浓度：7.080mg/mL。

图15A-15C是PAMAM G4的ASTRA报告。浓度：7.080mg/mL。

图16A-16C是PAMAM G3.5的ASTRA报告。浓度：7.080mg/mL。

图17是DP07-51-1的¹H-NMR数据。1H NMR(300MHz,甲醇-d4)δppm 2.38(br t,J＝5.78Hz,248H)3.50-3.74(m,191H)4.20(d,J＝2.49Hz,27H)4.18 -4.20(m,1H).

图18是DP07-51-2的¹H-NMR数据。¹H NMR(300MHz,甲醇-d4)δppm 2.23-2.49(m,248H)3.61(s,194H)4.16-4.24(m,31H).

图19是DP07-51-3的¹H-NMR数据。¹H NMR(300MHz,甲醇-d4)δppm 2.38(br t,J＝5.78Hz,248H)3.50-3.74(m,191H)4.20(d,J＝2.49Hz,27H)4.18 -4.20(m,1H).

图20是DP07-51-4的¹H-NMR数据。1H NMR(300MHz,甲醇-d4)δppm 2.23-2.49(m,248H)3.61(s,194H)4.16-4.24(m,31H).

图21A-21C是DP07-51-1的ASTRA报告。

图22A-22C是DP07-51-2的ASTRA报告。

图23A-23C是DP07-51-3的ASTRA报告。

图24A-24C是DP07-51-4的ASTRA报告。

图25是DP07-60-1的¹H-NMR数据。¹H NMR(300MHz,甲醇-d4)δppm 2.25-2.49(m,248H)3.50-3.74(m,145H)4.20(d,J＝2.34Hz,6H).

图26是DP07-60-2的¹H-NMR数据。¹H NMR(300MHz,甲醇-d4)δppm 2.26-2.50(m,248H)3.61(t,J＝5.63Hz,150H)4.20(d,J＝2.49Hz,6H).

图27是DP07-60-3的¹H-NMR数据。¹H NMR(300MHz,甲醇-d4)δppm 2.26-2.49(m,248H)3.61(t,J＝5.63Hz,143H)4.18-4.22(m,6H).

图28是DP07-60-4的¹H-NMR数据。¹H NMR(300MHz,甲醇-d4)δppm 2.28-2.48(m,248H)3.61(t,J＝5.63Hz,148H)4.18-4.22(m,7H).

图29A-29C是DP07-60-1的ASTRA报告。

图30A-30C是DP07-60-2的ASTRA报告。

图31A-31C是DP07-60-3的ASTRA报告。

图32A-32C是DP07-60-4的ASTRA报告。

图33A-33C是DP07-74-1的ASTRA报告。

图34是DP07-74-1的¹H-NMR数据。¹H NMR(300MHz,甲醇-d4)δppm 2.27-2.48(m,243H)2.53-2.67(m,121H)2.68-2.95(m,255H)3.31(s,46H)3.61(t,J＝5.71Hz,143H)4.20(d,J＝2.34Hz,6H).

图35A-35B是DP07-74-1的GC数据。

图36A-36B是IPA空白的GC数据。

图37A-37C是DP07-68-1的ASTRA报告。

图38A-38B是DP07-68-1的¹H-NMR数据。¹H NMR(300MHz,甲醇-d4)δppm 2.38(br t,J＝6.07Hz,248H)2.50-2.67(m,138H)2.71-2.87(m,241H)2.94(s,36H)3.18-3.44(m,39H)3.49-3.73(m,178H)4.20(d,J＝2.34Hz,21H).

图39A-39B是DP07-68-1的GC数据。

图40是DP07-82-1的¹H-NMR数据。¹H NMR(300MHz,甲醇-d4)δppm 2.37(br s,248H)3.71-3.74(m,84H)6.05-6.08(m,198H).

图41A-41C是DP07-82-1的ASTRA报告。

图42是DP07-82-1炔烃的¹H-NMR数据。¹H NMR(300MHz,甲醇-d4)δppm 2.25-2.48(m,247H)2.36-2.36(m,5H)3.50-3.71(m,140H)3.60-3.61(m,3H)4.20(d,J＝2.49Hz,5H)4.20-4.20(m,1H).

图43是DP07-82-1的¹³C-NMR数据。¹³C NMR(75MHz,甲醇-d4)δppm 33.32(s,1C)41.61(s,1C)47.87(s,1C)49.80(s,1C)60.23(s,1C)173.75(s,1C).

图44是DP07-85-1的¹H-NMR数据。¹H NMR(300MHz,甲醇-d4)δppm 2.38(br s,242H)6.04-6.08(m,218H).

图45A-45C是DP07-85-1的ASTRA报告。

图46是DP07-85-1炔烃的¹H-NMR数据。¹H NMR(300MHz,甲醇-d4)δppm 2.38(br t,J＝6.14Hz,244H)2.36-2.36(m,9H)3.49-3.73(m,167H)4.16-4.22(m,20H).

图47A-47B是DP07-85-1的¹³C-NMR数据。¹³C NMR(75MHz,甲醇-d4)δppm 33.31(s,1C)41.63(s,1C)47.87(s,1C)60.23(s,1C)173.74(s,1C).

图48是DP07-82-1(批号DP07-82-2)的¹H-NMR数据。¹H NMR(300MHz,甲醇-d4)δppm2.37(br s,248H)3.71-3.74(m,84H)6.05-6.08(m,198H).

图49A-49C是DP07-82-1(批号DP07-82-2)的ASTRA报告。

图50是DP07-82-1(批号DP07-82-2)炔烃的¹H-NMR数据。¹H NMR(300MHz,甲醇-d4)δppm 2.25-2.48(m,247H)2.36-2.36(m,5H)3.50-3.71(m,140H)3.60-3.61(m,3H)4.20(d,J＝2.49Hz,5H)4.20-4.20(m,1H).

图51A-51B是DP07-82-1(批号DP07-82-2)的¹³C-NMR数据。¹³C NMR(75MHz,甲醇-d4)δppm 33.32(s,1C)41.61(s,1C)47.87(s,1C)49.80(s,1C)60.23(s,1C)173.75(s,1C).

图52是DP07-85-1(批号DP07-85-3)的¹H-NMR数据。¹H NMR(300MHz,甲醇-d4)δppm2.38(br s,242H)6.04-6.08(m,218H).

图53A-53C是DP07-85-1(批号DP07-85-3)的ASTRA报告。

图54是DP07-85-1(批号DP07-85-3)炔烃的¹H-NMR数据。¹H NMR(300MHz,甲醇-d4)δppm 2.38(br t,J＝6.14Hz,244H)2.36-2.36(m,9H)3.49-3.73(m,167H)4.16-4.22(m,20H).

图55A-55B是DP07-85-1(批号DP07-85-3)的¹³C-NMR数据。¹³C NMR(75MHz,甲醇-d4)δppm 33.31(s,1C)41.63(s,1C)47.87(s,1C)60.23(s,1C)173.74(s,1C).

图56A-56C显示与以下PAK1抑制剂缀合的树枝状体的合成和表征的结果：Frax-1036。

图57A-57T显示与以下MEK抑制剂缀合的树枝状体的合成和表征的结果：司美替尼(图57A-57D)、曲美替尼(图57E-57P)，以及考比替尼(图57Q-57T)。

图58A-58T显示与以下受体酪氨酸激酶抑制剂缀合的树枝状体的合成和表征的结果：达沙替尼(图58A-58H)、比美替尼(图58I-58N)、度博替尼(图58O-58P)，以及卡博替尼(图58Q-58T)。

具体实施方式

在其他方面，本公开提供了树枝状体缀合物、包含树枝状体缀合物的组合物，以及使用树枝状体缀合物及其组合物的方法。在一些实施方案中，树枝状体缀合物包含与至少一种试剂缀合的树枝状体。在一些实施方案中，树枝状体缀合物包含一种或多种可用于疗法、成像、和/或靶向递送的试剂。

在一些方面，本公开涉及治疗性化合物，该治疗性化合物包含与治疗剂缀合的树枝状体。本发明人已认识到并意识到，具有不利的体内特征的某些治疗剂可以通过与树枝状体缀合而修饰，以提供显示出降低的脱靶毒性、更高度的选择性吸收以及持续的细胞内效应的治疗性化合物。本发明人已进一步认识到并意识到，这样的治疗性化合物在树枝状体部分中是高度可调的，使得治疗性化合物的亲水性可被定制成允许特定治疗剂靶向递送至生物靶标，否则这些生物靶标很难被治疗剂接近。在其它方面，提供了合成式(I-A)的官能化树枝状体的方法，该方法包括：使式(II-A)的树枝状体与一种或多种胺(其中每种胺为式H₂NR¹)在合适的条件下反应，以形成式(I-A)的官能化树枝状体。在其它方面，提供了由本文所述的方法合成的式(I-A)的官能化树枝状体。

在一些方面，本公开提供了在对其有需要的受试者中治疗或成像疾病或障碍的方法，该方法包括：向受试者给药包含本文所述的树枝状体缀合物的组合物。在一些实施方案中，本公开的树枝状体缀合物能够在不存在任何靶向部分的情况下靶向反应性免疫细胞。例如，在一些实施方案中，本文所述的树枝状体缀合物能够穿过受试者的中枢神经系统中的血脑屏障，其中树枝状体缀合物被活化小胶质细胞和/或活化巨噬细胞选择性地吸收。在一些实施方案中，本文所述的树枝状体缀合物能够穿过受试者的眼部中的血-视网膜屏障，其中树枝状体缀合物被活化小胶质细胞和/或活化巨噬细胞选择性地吸收。

树枝状体缀合物

在一些实施方案中，树枝状体缀合物是指与如本文所述的至少一种试剂缀合的树枝状体。在一些实施方案中，树枝状体与至少一种试剂共价缀合(例如共价连接)。在一些实施方案中，树枝状体缀合物包含可被描述为具有如下分子构造的树枝状体：该分子构造具有内核以及连接到该内核上并从该内核延伸的重复单元的层(或“世代”)，每层具有一个或多个分支点，并且最外侧世代具有末端官能团。

在一些实施方案中，树枝状体的末端官能团包括一个或多个羟基、一个或多个胺基、和/或一个或多个羧基。在一些实施方案中，树枝状体的末端官能团提供连接位点，至少一种试剂通过该连接位点缀合以形成树枝状体缀合物。因此，在一些实施方案中，至少一种试剂通过与树枝状体的末端官能团缀合所形成的醚键、酰胺键、或酯键而与树枝状体缀合。在一些实施方案中，至少一种试剂通过醚键或酰胺键与树枝状体缀合。在一些实施方案中，至少一种试剂通过醚键与树枝状体缀合。

在一些实施方案中，树枝状体上末端位点的数量可以取决于特定树枝状支架及其世代。例如，在一些实施方案中，树枝状体基于第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10代PAMAM树枝状支架，它们分别具有4、8、16、32、64、128、256、512、1024、2048，以及4096个末端位点。然而，应当理解，可以根据本公开使用在每世代具有不同数量的末端位点的不同树枝状支架。

在一些实施方案中，树枝状体的所有末端位点包含羟基。在一些实施方案中，树枝状体的每个末端位点包含羟基或胺基。在一些实施方案中，树枝状体缀合物的每个末端位点包含羟基、胺基、或通过醚或酰胺键与树枝状体缀合的试剂。在一些实施方案中，树枝状体缀合物的每个末端位点包含羟基或通过醚键与树枝状体缀合的试剂。

在一些实施方案中，树枝状体缀合物上至少50％的末端位点包含羟基(例如，至少50％的末端位点不包含胺基或试剂)。例如，在一些实施方案中，树枝状体缀合物上至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％的末端位点包含羟基。在一些实施方案中，树枝状体缀合物上约50-99％、约60-99％、约70-99％、约80-99％、约90-99％、约95-99％、约98-99％、约70-95％、约70-90％、约80-95％、或约80-90％的末端位点包含羟基。

在一些实施方案中，树枝状体缀合物上的一个或多个末端位点包含试剂。在一些实施方案中，树枝状体缀合物上至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、或更多个末端位点包含试剂。在一些实施方案中，树枝状体缀合物上至少1％的末端位点包含试剂。例如，在一些实施方案中，树枝状体缀合物上至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、或至少30％的末端位点包含试剂。在一些实施方案中，树枝状体缀合物上约1-50％、约1-40％、约1-25％、约1-10％、约5-50％、约5-40％、约5-25％、约5-10％、约10-50％、约10-40％、或约10-25％的末端位点包含试剂。在一些实施方案中，树枝状体上约1％、约2％、约3％、约4％、或约5％的末端位点包含试剂。在一些实施方案中，树枝状体上少于5％、少于10％、少于15％、少于20％、少于25％、少于30％、少于35％、少于40％、少于45％、少于50％、少于55％、少于60％、少于65％、少于70％、少于75％的末端位点包含试剂。在一些实施方案中，树枝状体缀合物具有有效量的用于靶向特定细胞类型的末端官能团(例如末端羟基)，同时具有有效量的用于如本文所述的治疗和/或成像的试剂。在一些实施方案中，可以使用质子核磁共振(¹H NMR)、或本领域已知的其它分析方法来评价树枝状体缀合物的末端位点，以测定具有试剂和/或末端官能团的末端位点的百分比。

在一些实施方案中，所期望的试剂荷载可以取决于某些因素，包括试剂的选择、树枝状体结构和尺寸，以及待治疗的细胞或组织。在一些实施方案中，树枝状体缀合物(例如治疗性化合物)为约0.01质量％至约45质量％(m/m)的试剂(例如治疗剂)。在一些实施方案中，树枝状体缀合物(例如治疗性化合物)为约10质量％至约20质量％的试剂(例如治疗剂)。在一些实施方案中，树枝状体缀合物为约0.1质量％至约30质量％、约0.1质量％至约20质量％、约0.1质量％至约10质量％、约1质量％至约10质量％、约1质量％至约5质量％、约3质量％至约20质量％、约3质量％至约10质量％的试剂。

如本文所述，在一些实施方案中，树枝状体缀合物可以根据试剂的质量百分比(例如，质量％(m/m))来表征。在一些实施方案中，质量百分比是指树枝状体缀合物中试剂的分子量(Da)百分比。在一些实施方案中，质量百分比可以通过如下通式来确定：(试剂M_W)/(缀合物M_W)×100。例如，在一些实施方案中，(试剂M_W)可以通过以下方式确定：计算或近似出作为单分子或化合物(缀合或未缀合)的试剂的分子量，并将该值乘以试剂在树枝状体缀合物中存在的末端位点的数量。在一些实施方案中，(试剂M_W)可以通过计算或近似出构成树枝状体缀合物中的试剂的所有原子的原子质量之和来确定。(试剂M_W)的值可以视为树枝状体缀合物的总分子量(缀合物M_W)的分数，并乘以100以提供质量百分比。在一些实施方案中，质量百分比可以通过实验或经验均值来确定。例如，在一些实施方案中，质量百分比可以使用质子核磁共振(¹H NMR)或本领域已知的其它分析方法来确定。

在一些实施方案中，树枝状体具有约1nm至约50nm的直径。例如，在一些实施方案中，直径为约1nm至约20nm、约1nm至约10nm、或约1nm至约5nm。在一些实施方案中，直径为约1nm至约2nm。在一些实施方案中，与相对大试剂(例如，大蛋白，如抗体)缀合的树枝状体可以具有相对于未缀合的树枝状体而言使这些值增加大约5-15nm的直径。在一些实施方案中，树枝状体具有约500道尔顿(Da)至约100,000Da(例如，约500Da至约50,000Da、或约1,000Da至约20,000Da)的分子量。

在一些实施方案中，本文所述的缀合物的树枝状体为聚(酰氨基胺)(PAMAM)树枝状体、聚丙胺(POPAM)树枝状体、2,2-双(羟甲基)丙酸(双-MPA)树枝状体、聚乙烯亚胺树枝状体、聚赖氨酸树枝状体、聚酯树枝状体、蝶烯树枝状体、脂族聚(醚)树枝状体、芳族聚醚树枝状体，或它们的组合。

在一些实施方案中，树枝状体缀合物包含PAMAM树枝状体。在一些实施方案中，PAMAM树枝状体包含具有酰胺基胺结构单元的不同核。在一些实施方案中，PAMAM树枝状体包含任何世代，包括但不限于第1代、第2代、第3代、第4代、第5代、第6代、第7代、第8代、第9代、或第10代的PAMAM树枝状体的羧基、胺、和/或羟基末端基团。在一些实施方案中，PAMAM树枝状体为第4代、第5代、第6代、第7代、或第8代羟基封端的PAMAM树枝状体。

在一些实施方案中，树枝状体包括多个羟基。一些示例性含高密度羟基的树枝状体包括市售的聚酯树枝状聚合物，如超支化2,2-双(羟基-甲基)丙酸聚酯聚合物(例如，超支化双-MPA聚酯-64-羟基，第4代)、树枝状聚甘油。在一些实施方案中，含高密度羟基的树枝状体为寡聚乙二醇(OEG)样树枝状体。例如，第2代OEG树枝状体(D2-OH-60)可以使用高效、稳健和原子经济的化学反应进行合成，如Cu(I)催化的炔烃-叠氮化物点击以及光催化的硫醇-烯点击化学。可以通过使用正交超单体和超核策略(例如，如WO 2019094952中所述)，在最少的反应步骤中以非常低的世代实现高密度多元醇树枝状体。在一些实施方案中，树枝状体骨架在整个结构中具有不可裂解的聚醚键，以避免树枝状体在体内崩解，并允许这样的树枝状体作为单一实体(例如，不可生物降解的)从体内消除。

在一些实施方案中，树枝状体缀合物包含与一种或多种治疗剂、一种或多种显像剂、和/或一种或多种靶向剂缀合的树枝状体。应当理解，在一些实施方案中，“至少一种”试剂、“一种或多种”试剂，以及类似的术语是指特定试剂，而不一定是缀合到树枝状体上的特定试剂的量。例如，在一些实施方案中，包含两种试剂的树枝状体缀合物是指具有在一个或多个末端位置处的第一试剂以及在一个或多个不同的末端位置处的第二试剂的树枝状体，其中第一和第二试剂是不同的(例如，化学上不同)。在一些实施方案中，第一和第二试剂可用于类似的目的(例如，两种试剂均为治疗剂)，或者第一和第二试剂可用于不同的目的(例如，第一试剂为治疗剂，并且第二试剂为靶向剂)。当用于类似的目的时，第一和第二试剂在化学上不同，并可因此提供不同的功能——例如，靶向不同受体或生物通路的不同治疗剂、或具有不同光谱特性的不同显像剂。

在一些实施方案中，树枝状体缀合物的试剂(例如，治疗剂、显像剂、靶向剂)为肽、蛋白质、糖、碳水化合物、寡核苷酸、核酸、脂质、小分子化合物，或它们的组合。在一些实施方案中，试剂为抗体或抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，试剂为核酸或编码蛋白质的寡核苷酸，如DNA表达载体或mRNA。在一些实施方案中，试剂为RNA沉默剂，如siRNA、shRNA、或微RNA。

在一些实施方案中，试剂为小分子化合物，如小分子有机、有机金属、或无机化合物。在一些实施方案中，试剂为分子量小于2,000道尔顿(Da)、小于1,500Da、小于1,000Da、或小于500Da的小分子化合物。在一些实施方案中，试剂是分子量为约100至约2,000Da的小分子化合物。例如，在一些实施方案中，小分子化合物具有约100至约1,500Da、约100至约1,000Da、约500至约2,000Da、或约300至约700Da的分子量。

在一些方面，本文所述的树枝状体缀合物的不可释放形式提供了与相同缀合物的可释放形式相比增强的治疗功效。因此，在一些实施方案中，试剂通过连接基与树枝状体缀合，该连接基以不可释放的方式(例如，通过醚和/或酰胺键)与树枝状体和试剂连接。在一些实施方案中，连接基具有可在生理条件下最低限度地释放(例如，可最低限度地裂解)的组成。

在一些实施方案中，树枝状体通过在体内条件下稳定的共价键与试剂缀合。在一些实施方案中，当给药于受试者并且/或者从体内完好无损的排泄出时，共价键是可最低限度裂解的。例如，在一些实施方案中，总树枝状体缀合物的少于10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、或少于0.1％在体内给药于受试者后24小时、或48小时、或72小时内具有裂解的试剂。在一些实施方案中，共价键包含醚键。在一些实施方案中，树枝状体与试剂之间的共价键不是可水解或酶促裂解的键，如酯键。

在一些方面，本公开提供了式(I)的树枝状体缀合物：

其中：D为树枝状体；X为O或NH；Y¹为第一基团；Y²为第二基团；Z为试剂；L为连接基；m为16至4096的整数(包括端值在内)；并且n为1至100的整数(包括端值在内)。

在一些实施方案中，D为选自聚(酰氨基胺)(PAMAM)聚合物、聚丙胺(POPAM)聚合物、聚乙烯亚胺聚合物、聚赖氨酸聚合物、聚酯聚合物、蝶烯聚合物、脂族聚(醚)聚合物、芳族聚醚聚合物、2,2-双(羟甲基)丙酸(双-MPA)聚合物，以及它们的组合的树枝状体。

在一些实施方案中，Y¹在生理条件下是不可水解的。在一些实施方案中，Y¹为任选取代的亚烷基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、或共价键。在一些实施方案中，Y¹为任选取代的C_1-20亚烷基。在一些实施方案中，Y¹为未取代的C_1-10亚烷基。

在一些实施方案中，Y¹为任选取代的亚烷基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、或共价键。在一些实施方案中，Y¹为任选取代的亚烷基(例如，任选取代的C_1-20亚烷基)。在一些实施方案中，Y¹为任选取代的亚乙基。在一些实施方案中，Y¹为任选取代的亚甲基。在一些实施方案中，Y¹为下式：其中q为1、2、3、4、5、或6(例如，其中q为1、2、或3)。在一些实施方案中，q为2。在一些实施方案中，q为1。在一些实施方案中，Y¹为未取代的亚烷基(例如，未取代的C_1-10亚烷基)。在一些实施方案中，Y¹为下式：/>

在一些实施方案中，Y²选自仲酰胺、叔酰胺、磺酰胺、仲氨基甲酸酯、叔氨基甲酸酯、碳酸酯、脲、甲醇、二硫化物、腙、酰肼、醚、羰基，以及它们的组合。在一些实施方案中，Y²选自-CONH-、-CONR^A-、-SO₂NR^A-、-OCONH-、-NHCOO-、-OCONR^A-、-NR^ACOO-、-OC(＝O)O-、-NHCONH-、-NR^ACONH-、-NHCONR^A-、-NRCONR^A-、-CHOH-、-CR^AOH-、-C(＝O)-，以及-C(＝O)R^A-，其中R^A为任选取代的烷基、任选取代的芳基、或任选取代的杂环基。

在一些实施方案中，Y²包含聚合物。在一些实施方案中，Y²包含亚烷基链(例如C_1-100,000亚烷基)，其中该链是介于L与Z之间的最短路径(不包括氢原子和取代基)。在一些实施方案中，Y²的链包含多至5,000-7,000；7,000-9,000；9,000-10,000；10,000-12,000；100,000-120,000；120,000-150,000；或150,000-200,000个连续共价键合的原子或长度(不包括氢原子和取代基)。在一些实施方案中，Y²为全碳、取代或未取代的C_1-200,000烃链，作为介于L与Z之间的最短路径(不包括氢原子和取代基)。在一些实施方案中，Y²中的任何原子均可被取代。在一些实施方案中，Y²中的原子均未被取代。在一些实施方案中，Y²中的碳原子均未被取代。在一些实施方案中，Y²的烃链的至少一个链原子独立地被-C(＝O)-、-O-、-NR^b-、-S-、或环状部分替代，其中R^b独立地为氢、取代或未取代的C_1-6烷基、或氮保护基。在一些实施方案中，Y²的烃链的至少一个链原子独立地被酰胺、异羟肟酸、醚、正烷基、碳酸酯、氨基甲酸酯、腙、硫醚、硫酯、二硫化物、原酸酯、尿烷、肟、任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、和/或任选取代的亚杂芳基替代。在一些实施方案中，Y²的烃链的至少一个链原子独立地被酰胺、异羟肟酸、醚、碳酸酯、氨基甲酸酯、腙、硫醚、硫酯、二硫化物、原酸酯、尿烷、和/或肟替代。在一些实施方案中，Y²包含亚烷基部分(例如为式其中q为1-100之间的整数(包括端值在内))。在一些实施方案中，Y²包含聚乙二醇部分(例如为式/>其中q为1-100之间的整数(包括端值在内))。在一些实施方案中，Y²包含亚烷基部分或聚乙二醇部分，以及烃链。在一些实施方案中，Y²的烃链的至少一个链原子独立地被酰胺、异羟肟酸、醚、碳酸酯、氨基甲酸酯、腙、硫醚、硫酯、二硫化物、原酸酯、尿烷、和/或肟替代。

在一些实施方案中，Z为如本文所述的治疗剂、显像剂、或靶向剂。在一些实施方案中，Z为治疗剂或显像剂。在一些实施方案中，式(I)的树枝状体缀合物还包含至少一种与树枝状体缀合的靶向剂。

在一些实施方案中，Z包括PAK1抑制剂。在一些实施方案中，Z包括Frax-1036。在一些实施方案中，Z为下式：

在一些实施方案中，Z包括MEK抑制剂。在一些实施方案中，Z包括司美替尼。在一些实施方案中，Z为下式：在一些实施方案中，Z包括曲美替尼。在一些实施方案中，Z为下式：/>在一些实施方案中，Z包括考比替尼。在一些实施方案中，Z为下式：/>在一些实施方案中，Z为下式：/>在一些实施方案中，Z为下式：/>

在一些实施方案中，Z包括受体酪氨酸激酶抑制剂。在一些实施方案中，Z包括达沙替尼。在一些实施方案中，Z为下式：在一些实施方案中，Z包括比美替尼(R428)。在一些实施方案中，Z为下式：/>在一些实施方案中，Z包括度博替尼(TP-0903)。在一些实施方案中，Z为下式：在一些实施方案中，Z包括卡博替尼。在一些实施方案中，Z为下式：/>

在一些实施方案中，L为包含聚合物以及至少一个部分的连接基。在一些实施方案中，聚合物为聚合物多元醇、多肽、或未取代的烷基链。在一些实施方案中，聚合物为选自聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇，以及聚乙烯醇的聚合物多元醇。在一些实施方案中，聚合物为具有至少2个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，聚合物为具有约2至约40个氨基酸(例如，2-25个、5-30个、10-25个、或5-15个氨基酸)的多肽。在一些实施方案中，聚合物为未取代的烷基链。在一些实施方案中，聚合物为未取代的C_2-50烷基链。在一些实施方案中，聚合物为未取代的C_2-30烷基链。在一些实施方案中，聚合物为未取代的C_5-25烷基链。在一些实施方案中，聚合物为如本文别处所述的聚合物。

在一些实施方案中，L的至少一个部分是由点击反应产生的部分。在一些实施方案中，至少一个部分是由用于产生缀合物的反应性点击化学柄部(例如，叠氮化物以及末端或应变炔烃、二烯和亲二烯体、硫醇和烯烃)之间的电环化反应(例如，3+2环加成、或4+2环加成)产生的5元杂环。在一些实施方案中，至少一个部分为包含1,2,3-三唑基、4,5-二氢-1,2,3-三唑基、异噁唑基、4,5-二氢异噁唑基、或1,4-二氢哒嗪基的双基。

在一些实施方案中，L包含下式的聚乙二醇部分：其中q为1-100之间的整数(包括端值在内)；以及烃链。在一些实施方案中，L的烃链的至少一个链原子独立地被酰胺、异羟肟酸、醚、碳酸酯、氨基甲酸酯、腙、硫醚、硫酯、二硫化物、原酸酯、尿烷、和/或肟替代。在一些实施方案中，q为1-50之间的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，q为1-10之间的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，q为1-8之间的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，L为式/>其中M为包含1,2,3-三唑基、4,5-二氢-1,2,3-三唑基、异噁唑基、4,5-二氢异噁唑基、或1,4-二氢哒嗪基的双基，并且q为1-100之间的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，q为1-50之间的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，q为1-10之间的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，q为1-8之间的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，L为式/>其中q为1-100之间的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，q为1-50之间的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，q为1-10之间的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，q为1-8之间的整数(包括端值在内)。

在一些方面，本公开提供了式(II)的树枝状体缀合物：

其中：D、m、n的每个实例、X的每个实例、Y¹的每个实例，以及Y²的每个实例独立地如关于式(I)所定义；L¹和L²独立地为如关于式(I)所定义的连接基；并且Z¹和Z²是不同的试剂。

在一些实施方案中，Z¹和Z²独立地为治疗剂、靶向剂、或显像剂，前提条件是Z¹和Z²是不同的(例如，化学上不同)。在一些实施方案中，Z¹和Z²为不同的治疗剂。在一些实施方案中，Z¹和Z²为靶向常见病理学中所牵涉的不同生物通路的不同治疗剂。在一些实施方案中，Z¹和Z²为不同的治疗剂，并且式(II)的树枝状体缀合物还包含至少一种与树枝状体缀合的靶向剂。在一些实施方案中，Z¹和Z²为不同的显像剂。在一些实施方案中，Z¹为治疗剂，并且Z²为靶向剂。在一些实施方案中，Z¹为显像剂，并且Z²为靶向剂。

合成方法

在一些方面，本公开涉及用于合成树枝状体(例如，官能化树枝状体，例如用指定数量的PEG-炔烃官能化的树枝状体，以允许经由点击缀合化学(例如叠氮化物-炔环加成)进一步安置试剂)的新技术的发现。有利地，本文所提供的方法和组合物可以允许使用相对于此前技术更温和的条件和调整的化学计量法，以高产物均匀度(低多分散度，例如小于1.05)来大型多克规模合成(例如，超过10克、超过40-50克、超过100克)树枝状体(例如，用指定数量的PEG-炔烃官能化的树枝状体)。

其中：

D为选自聚(酰氨基胺)(PAMAM)聚合物、聚丙胺(POPAM)聚合物、聚乙烯亚胺聚合物、聚赖氨酸聚合物、聚酯聚合物、蝶烯聚合物、脂族聚(醚)聚合物、芳族聚醚聚合物、2,2-双(羟甲基)丙酸(双-MPA)聚合物，以及它们的组合的树枝状体；

X为NH；

Y¹为任选取代的亚烷基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、或共价键；

m为16至4096的整数(包括端值在内)；并且

n为1至100的整数(包括端值在内)；

该方法包括：

使下式(II-A)的树枝状体与一种或多种胺在合适的条件下反应：

以形成式(I-A)的官能化树枝状体；

其中：

t为16至4096的整数(包括端值在内)；

其中每种胺为式H₂NR¹，

其中R¹为任选取代的亚烷基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、或共价键。

在一些实施方案中，在式(I-A)或(II-A)的树枝状体中，D为选自聚(酰氨基胺)(PAMAM)聚合物、聚丙胺(POPAM)聚合物、聚乙烯亚胺聚合物、聚赖氨酸聚合物、聚酯聚合物、蝶烯聚合物、脂族聚(醚)聚合物、芳族聚醚聚合物、2,2-双(羟甲基)丙酸(双-MPA)聚合物，以及它们的组合的树枝状体。

在一些实施方案中，Y¹为任选取代的亚烷基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、或共价键。在一些实施方案中，Y¹为任选取代的亚烷基(例如，任选取代的C_1-20亚烷基)。在一些实施方案中，X为-NH，并且Y¹为任选取代的乙基。在一些实施方案中，X为-NH，并且Y¹为被PEG-炔烃基团取代的乙基。在一些实施方案中，X为-NH，并且Y¹为下式：其中q为1、2、3、4、5、或6(例如，其中q为1、2、或3)。在一些实施方案中，X为-NH，并且Y¹为下式：/>其中q为2。在一些实施方案中，Y¹为未取代的亚烷基(例如，未取代的C_1-10亚烷基)。

在一些实施方案中，m为16至4096的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，m为16至20、20-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-160、160-180、180-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4100、或4100-4200的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，m为大约61或54(例如61或54)。

在一些实施方案中，n为1至100的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，n为1至3、3至5、1至5、5-7、7-9、9-10、10-12、12-14、14-16、16-18、18-20、20-22、22-24、24-26、26-28、28-30、30-32、32-34、34-36、36-38、38-40、40-42、42-44、44-46、46-48、48-50、50-52、52-54、54-56、56-58、58-60、60-62、62-64、64-66、66-68、68-70、70-72、72-74、74-76、76-78、78-80、80-82、82-84、84-86、86-88、88-90、90-92、92-94、94-96、96-98、或98-100的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，n为大约3或10(例如3或10)。在一些实施方案中，m为从64减去n的值。在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，n为2。在一些实施方案中，n为3。在一些实施方案中，n为4。在一些实施方案中，n为5。在一些实施方案中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、或75。在一些实施方案中，n介于大约1-2、2-4、4-5、5-6、6-8、8-10、或10-12之间；或介于大约2-11之间(例如，3、4、5、8、10)。在一些实施方案中，n为大约3或10(例如3或10)。在一些实施方案中，n为3且m为61。在一些实施方案中，n为10且m为54。在一些实施方案中，m为大约61或54(例如61或54)。

在一些实施方案中，在本文所述的合成方法中，提供了式(II-A)的树枝状体：

其中D为选自聚(酰氨基胺)(PAMAM)聚合物、聚丙胺(POPAM)聚合物、聚乙烯亚胺聚合物、聚赖氨酸聚合物、聚酯聚合物、蝶烯聚合物、脂族聚(醚)聚合物、芳族聚醚聚合物、2,2-双(羟甲基)丙酸(双-MPA)聚合物，以及它们的组合的树枝状体；

t为16至4096的整数(包括端值在内)；

以及一种或多种胺，其中每种胺为式H₂NR¹，

在一些实施方案中，在式(II-A)中，D为如本文所述的树枝状体。在一些实施方案中，合成方法包括使式(II-A)的树枝状体、或其盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、多晶型物、互变异构体、同位素富集形式(例如，同位素标记的衍生物)反应。式(II-A)包括取代基t。在一些实施方案中，t为16至4096的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，t为16至20、20-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-160、160-180、180-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4100、或4100-4200的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，n为t。在一些实施方案中，t为n。在一些实施方案中，在式(II-A)的树枝状体中，t与n相同。在一些实施方案中，在式(II-A)的树枝状体中，t为64。在一些实施方案中，t为20-40、40-50、50-60、60-70、70-80的整数(包括端值在内)。

在一些实施方案中，合成方法包括使式(II-A)的树枝状体与一种或多种胺反应。在一些实施方案中，合成方法包括使式(II-A)的树枝状体与一种或多种胺反应，其中一种或多种胺的至少一个实例为式(Z)的化合物或其盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、多晶型物、互变异构体、同位素富集形式(例如，同位素标记的衍生物)，其中L^A为连接基，并且R^1A为卤素、任选取代的酰基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、任选取代的乙炔、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、-CH(＝N)(OH)R^D1、-CN、-NO₂、-OR^D1、-N(R^D1a)₂、-SO₂OR^D1、或-SR^D1，并且R^D1和R^D1a如本文所定义。在一些实施方案中，连接基L^A包含聚合物。在一些实施方案中，连接基L^A包含亚烷基链(例如C_1-100,000亚烷基)，其中该链是介于-NH₂与R^1A之间的最短路径(不包括氢原子和取代基)。在某些实施方案中，连接基L^A的链包含多至5,000-7,000；7,000-9,000；9,000-10,000；10,000-12,000；100,000-120,000；120,000-150,000；或150,000-200,000个连续共价键合的原子或长度(不包括氢原子和取代基)。在某些实施方案中，L^A为全碳、取代或未取代的C_1-200,000烃链，作为介于-NH₂与R^1A之间的最短路径(不包括氢原子和取代基)。在某些实施方案中，L^A中的任何原子均可被取代。在某些实施方案中，连接基L^A中的原子均未被取代。在某些实施方案中，连接基中的碳原子均未被取代。在某些实施方案中，L^A的烃链的至少一个链原子独立地被-C(＝O)-、-O-、-NR^b-、-S-、或环状部分替代，其中R^b独立地为氢、取代或未取代的C_1-6烷基、或氮保护基。在某些实施方案中，L^A的烃链的至少一个链原子独立地被酰胺、异羟肟酸、醚、正烷基、碳酸酯、氨基甲酸酯、腙、硫醚、硫酯、二硫化物、原酸酯、尿烷、肟、任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、和/或任选取代的亚杂芳基替代。在某些实施方案中，L^A的烃链的至少一个链原子独立地被酰胺、异羟肟酸、醚、碳酸酯、氨基甲酸酯、腙、硫醚、硫酯、二硫化物、原酸酯、尿烷、和/或肟替代。在某些实施方案中，连接基L^A包含聚乙二醇部分(例如为式/>其中q为1-100,000之间的整数(包括端值在内))，并且L^A的烃链的至少一个链原子独立地被酰胺、异羟肟酸、醚、碳酸酯、氨基甲酸酯、腙、硫醚、硫酯、二硫化物、原酸酯、尿烷、和/或肟替代。在某些实施方案中，连接基L^A包含由点击反应产生的部分。在一些实施方案中，由点击化学产生的至少一个部分是由用于产生缀合物的反应性点击化学柄部(例如，叠氮化物以及末端或应变炔烃、二烯和亲二烯体、硫醇和烯烃)之间的电环化反应(例如，3+2环加成、或4+2环加成)产生的5元杂环。在一些实施方案中，由点击反应产生的至少一个部分为包含1,2,3-三唑基、4,5-二氢-1,2,3-三唑基、异噁唑基、4,5-二氢异噁唑基、或1,4-二氢哒嗪基的双基。在某些实施方案中，连接基L^A为下式：/>其中l_n指示与式(Z)的化合物中的-NH₂的连接，并且l₁指示与R^1A的连接。在一些实施方案中，合成方法包括使式(II-A)的树枝状体与一种或多种胺反应，其中一种或多种胺的至少一个实例为式(A)的化合物：/>(A)、或其盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、多晶型物、互变异构体、同位素富集形式(例如，同位素标记的衍生物)，其中p、q、r、W，以及R^1A如本文所定义。在一些实施方案中，合成方法包括使式(II-A)的树枝状体与一种或多种胺反应，其中一种或多种胺的至少一个实例为式(A)的化合物：其中：R^1A为卤素、任选取代的酰基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、任选取代的乙炔、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、-CH(＝N)(OH)R^D1、-CN、-NO₂、-OR^D1、-N(R^D1a)₂、-SO₂OR^D1、或-SR^D1，其中R^D1独立地为氢、任选取代的酰基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、或连接到氧原子时的氧保护基、或连接到硫原子时的硫保护基；其中每次出现的R^D1a独立地为氢、任选取代的酰基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、或氮保护基；或者任选地，R^D1a的两个实例与它们的间隔原子一起形成取代或未取代的杂环或者取代或未取代的杂芳基环；W为-O-或-CH₂-，如化合价允许；p为0、1、2、或3；q为1-100,000之间的整数(包括端值在内)；并且r为0、1、2、3、4、5、或6。在一些实施方案中，R^1A为卤素(例如F、Cl、Br、或I)。在某些实施方案中，R^1A为任选取代的酰基(例如-C(＝O)Me)。在某些实施方案中，R^1A为任选取代的烷基(例如取代或未取代的C_1-6烷基)。在某些实施方案中，R^1A为取代或未取代的甲基。在某些实施方案中，R^1A为取代或未取代的乙基。在某些实施方案中，R^1A为取代或未取代的丙基。在某些实施方案中，R^1A为任选取代的烯基(例如取代或未取代的C_2-6烯基)。在某些实施方案中，R^1A为任选取代的炔基(例如取代或未取代的C_2-6炔基)。在某些实施方案中，R^1A为任选取代的碳环基(例如，取代或未取代的在碳环环系中包含零个、一个、或两个双键的3-至7-元单环碳环基)。在某些实施方案中，R^1A为任选取代的杂环基(例如，取代或未取代的5-至10-元单环或双环杂环，其中杂环中的一个或两个原子独立地为氮、氧、或硫)。在某些实施方案中，R^1A为任选取代的芳基(例如，取代或未取代的6-至10-元芳基)。在某些实施方案中，R^1A为苄基。在某些实施方案中，R^1A为取代或未取代的苯基。在某些实施方案中，R^1A为任选取代的杂芳基(例如，取代或未取代的5-至6-元单环杂芳基，其中杂芳基环系中的一个、两个、三个、或四个原子独立地为氮、氧、或硫；或者取代或未取代的9-至10-元双环杂芳基，其中杂芳基环系中的一个、两个、三个、或四个原子独立地为氮、氧、或硫)。在某些实施方案中，R^1A为-CH(＝N)(OH)R^D1、-CN、-NO₂、-OR^D1、-N(R^D1a)₂、-SO₂OR^D1、或-SR^D1，其中R^D1和R^D1a如本文所定义。在某些实施方案中，R^1A为-CH(＝N)(OH)R^D1(例如-CH(＝N)(OH)(任选取代的C_1-6烷基))。在某些实施方案中，R^1A为-CH(＝N)(OH)(任选被聚乙二醇连接基取代的C_1-6烷基)。在某些实施方案中，R^1A为-CN。在某些实施方案中，R^1A为-NO₂。在某些实施方案中，R^1A为-OR^D1(例如-OH或-OMe)。在某些实施方案中，R^1A为-N(R^D1a)₂(例如-NMe₂)。在某些实施方案中，R^1A为-SO₂OR^D1(例如-SO₂O(任选取代的烷基))。在某些实施方案中，R^1A为-SR^D1(例如-SMe)。在某些实施方案中，R^1A为-CH(＝N)(OH)R^D1、-CN、-NO₂、-OR^D1、-N(R^D1a)₂、-SO₂OR^D1、或-SR^D1，其中R^D1独立地为氢、任选取代的酰基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、或连接到氧原子时的氧保护基、或连接到硫原子时的硫保护基；并且其中每次出现的R^D1a独立地为氢、任选取代的酰基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、或氮保护基；或者任选地，R^D1a的两个实例与它们的间隔原子一起形成取代或未取代的杂环或者取代或未取代的杂芳基环。在某些实施方案中，R^1A为溴、炔烃、乙炔、烯烃、醛、胺、COOH、羟基、羧基(例如二苯并环辛炔或DBCO)、硫醇、磺酸酯、或-CN。在某些实施方案中，R^1A是点击反应柄部配偶体(例如，表A中或实施例6的路线1-19中所显示的点击化学柄部)。在某些实施方案中，点击柄部、点击配偶体，以及点击反应柄部配偶体可互换使用。在某些实施方案中，点击反应为：Cu(I)催化的炔烃-叠氮化物点击以及光催化的硫醇-烯点击化学；或电环化点击反应(例如，3+2环加成、或4+2环加成)。

表A.示例性点击化学反应和点击化学柄部

(a)酮/醛缩合；(b)施陶丁格反应；(c)1,3双极环加成(顶部：铜催化的炔烃-叠氮化物环加成(CuAAC)；底部：应变促进的[3+2]叠氮化物-炔烃环加成(SPAAC))；(d)反电子需求狄尔斯-阿尔德反应。

在某些实施方案中，R^1A和R²中的一个为-N₃，并且R^1A和R²中的另一个为二苯并环辛炔。在某些实施方案中，R^1A和R²中的一个为并且R^1A和R²中的另一个为-SH。在某些实施方案中，R^1A和R²中的一个为四嗪，并且R^1A和R²中的另一个为反式环辛烯。在某些实施方案中，R^1A和R²中的一个为/>并且R^1A和R²中的另一个为/>在某些实施方案中，R^1A和R²中的一个为-SH，并且R^1A和R²中的另一个为/>在某些实施方案中，R^1A和R²中的一个为-SH，并且R^1A和R²中的另一个为/>在某些实施方案中，R^1A和R²中的一个为-SH，并且R^1A和R²中的另一个为/>

在某些实施方案中，R^D1为氢。在某些实施方案中，R^D1为任选取代的酰基(例如-C(＝O)Me)。在某些实施方案中，R^D1为任选取代的烷基(例如取代或未取代的C_1-6烷基)。在某些实施方案中，R^D1为取代或未取代的甲基。在某些实施方案中，R^D1为取代或未取代的乙基。在某些实施方案中，R^D1为取代或未取代的丙基。在某些实施方案中，R^D1为任选取代的烯基(例如取代或未取代的C_2-6烯基)。在某些实施方案中，R^D1为任选取代的炔基(例如取代或未取代的C_2-6炔基)。在某些实施方案中，R^D1为任选取代的碳环基(例如，取代或未取代的在碳环环系中包含零个、一个、或两个双键的3-至7-元单环碳环基)。在某些实施方案中，R^D1为任选取代的杂环基(例如，取代或未取代的5-至10-元单环或双环杂环，其中杂环中的一个或两个原子独立地为氮、氧、或硫)。在某些实施方案中，R^D1为任选取代的芳基(例如取代或未取代的6-至10-元芳基)。在某些实施方案中，R^D1为苄基。在某些实施方案中，R^D1为取代或未取代的苯基。在某些实施方案中，R^D1为任选取代的杂芳基(例如，取代或未取代的5-至6-元单环杂芳基，其中杂芳基环系中的一个、两个、三个、或四个原子独立地为氮、氧、或硫；或者取代或未取代的9-至10-元双环杂芳基，其中杂芳基环系中的一个、两个、三个、或四个原子独立地为氮、氧、或硫)。在某些实施方案中，R^D1在连接到氧原子时为氧保护基。在某些实施方案中，R^D1在连接到硫原子时为硫保护基。

在某些实施方案中，R^D1a的至少一个实例为氢。在某些实施方案中，R^D1a的至少一个实例为任选取代的酰基(例如-C(＝O)Me)。在某些实施方案中，至少一个R^D1a为任选取代的烷基(例如取代或未取代的C_1-6烷基)。在某些实施方案中，R^D1a的至少一个实例为取代或未取代的甲基。在某些实施方案中，R^D1a的至少一个实例为取代或未取代的乙基。在某些实施方案中，R^D1a的至少一个实例为取代或未取代的丙基。在某些实施方案中，R^D1a的至少一个实例为任选取代的烯基(例如取代或未取代的C_2-6烯基)。在某些实施方案中，R^D1a的至少一个实例为任选取代的炔基(例如取代或未取代的C_2-6炔基)。在某些实施方案中，R^D1a的至少一个实例为任选取代的碳环基(例如，取代或未取代的在碳环环系中包含零个、一个、或两个双键的3-至7-元单环碳环基)。在某些实施方案中，R^D1a的至少一个实例为任选取代的杂环基(例如，取代或未取代的5-至10-元单环或双环杂环，其中杂环中的一个或两个原子独立地为氮、氧、或硫)。在某些实施方案中，R^D1a的至少一个实例为任选取代的芳基(例如取代或未取代的6-至10-元芳基)。在某些实施方案中，R^D1a的至少一个实例为苄基。在某些实施方案中，R^D1a的至少一个实例为取代或未取代的苯基。在某些实施方案中，R^D1a的至少一个实例为任选取代的杂芳基(例如，取代或未取代的5-至6-元单环杂芳基，其中杂芳基环系中的一个、两个、三个、或四个原子独立地为氮、氧、或硫；或者取代或未取代的9-至10-元双环杂芳基，其中杂芳基环系中的一个、两个、三个、或四个原子独立地为氮、氧、或硫)。在某些实施方案中，R^D1a的至少一个实例为氮保护基(例如，苄基(Bn)、碳酸叔丁酯(BOC或Boc)、氨基甲酸苄酯(Cbz)、9-芴甲基碳酸酯(Fmoc)、三氟乙酰基、三苯甲基、乙酰基、或对甲苯磺酰胺(Ts))。在某些实施方案中，R^D1a的两个实例与它们的间隔原子一起形成任选取代的杂环(例如，取代或未取代的5-至10-元单环或双环杂环，其中杂环中的一个或两个原子独立地为氮、氧、或硫)或任选取代的杂芳基环(例如，取代或未取代的5-至6-元单环杂芳基，其中杂芳基环系中的一个、两个、三个、或四个原子独立地为氮、氧、或硫；或者取代或未取代的9-至10-元双环杂芳基，其中杂芳基环系中的一个、两个、三个、或四个原子独立地为氮、氧、或硫)。

在一些实施方案中，p为0。在一些实施方案中，p为1。在一些实施方案中，p为2。在一些实施方案中，p为3。

在一些实施方案中，W为-O-。在一些实施方案中，W为-O-并且q为1-100,000之间的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，W为-CH₂-。在一些实施方案中，W为-CH₂-并且q为1-10,000之间的整数(包括端值在内)。

在一些实施方案中，q为1-50之间的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，q为1-100之间的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，q为1-5,000之间的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，q为1-10,000之间的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，q为1-50,000之间的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，q为1-100,000之间的整数(包括端值在内)。在一些实施方案中，q为1-25、25-50、50-75、75-100、100-125、125-150、150-175、175-200、200-225、225-250、250-275、275-300、300-325、325-350、350-375、375-400、400-425、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-6000、6000-7000、7000-8000、8000-9000；9000-10,000；10,000-12,000；100,000-120,000；120,000-150,000；150,000-175,000；或175,000-200,000之间的整数。

在一些实施方案中，合成方法包括使式(II-A)的树枝状体与一种或多种胺反应，其中每种胺为式H₂NR¹，并且R¹如本文所定义。在一些实施方案中，R¹的至少一个实例为任选取代的亚烷基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、或共价键。在一些实施方案中，R¹的至少一个实例为任选取代的亚烷基(例如任选取代的C_1-20亚烷基)。在一些实施方案中，在一种或多种胺中，R¹的每个实例为Y¹，其中每种胺为式H₂NR¹。在一些实施方案中，R¹的至少一个实例为任选取代的乙基。在一些实施方案中，R¹的至少一个实例是被PEG-炔烃基团取代的乙基。在一些实施方案中，R¹的至少一个实例为下式：其中q为1、2、3、4、5、或6(例如，其中q为1、2、或3)。在一些实施方案中，R¹的至少一个实例为下式：其中q为2。在一些实施方案中，R¹的至少一个实例为未取代的亚烷基(例如未取代的C_1-10亚烷基)。

在一些实施方案中，胺为下式的PEG-炔烃：其中q为1、2、3、4、5、或6。在一些实施方案中，胺为下式的PEG-炔烃：/>其中q为1、2、或3。在一些实施方案中，q为1。在一些实施方案中，q为2。在一些实施方案中，q为3。在一些实施方案中，q为4。在一些实施方案中，q为5。在一些实施方案中，q为6。在一些实施方案中，一种或多种胺的至少一个实例为下式的PEG-炔烃：/>在一些实施方案中，一种或多种胺的至少一个实例为下式的乙醇胺：/>在一些实施方案中，本文所述的合成方法包含两种不同的胺。在一些实施方案中，一种或多种胺中的一种为下式的PEG-炔烃：其中q为1、2、3、4、5、或6；并且另一种胺为乙醇胺(例如/>)。在一些实施方案中，一种或多种胺中的一种为下式的PEG-炔烃：/>并且另一种胺为乙醇胺(例如/>)。在一些实施方案中，在本文所述的合成方法中，式(II-A)的树枝状体与乙醇胺以及下式的PEG-炔烃两者进行反应：

在一些实施方案中，第一胺(例如乙醇胺)与第二胺(例如下式的PEG-炔烃：其中q为1、2、3、4、5、或6)的比率为大约10:1、9.8:1、9.5:1、9.4:1、9.3:1、9.2:1、9.1:1、或9:1。在一些实施方案中，乙醇胺与式：/>的PEG-炔烃(例如)的比率为9.4:1。在一些实施方案中，乙醇胺与式：的PEG-炔烃的比率为9.42:1。

在一些实施方案中，第一胺(例如乙醇胺)与第二胺(例如下式的PEG-炔烃：其中q为1、2、3、4、5、或6)的比率为大约3:1、3.0:1、2.8:1、2.6:1、2.4:1、2.3:1、2.2:1、或2.1:1、或2.0:1。在一些实施方案中，乙醇胺与式：/>的PEG-炔烃(例如/>)的比率为2.2:1。在一些实施方案中，乙醇胺与式：的PEG-炔烃的比率为2.23:1。在一些实施方案中，乙醇胺与式：(其中q为1、2、3、4、5、或6)的PEG-炔烃(例如/>的PEG-炔烃)的比率为2.2:1或9.4:1。

在一些实施方案中，一种胺(例如，式：的PEG-炔烃)与式(II-A)的树枝状体的比率为大约150:1。在一些实施方案中，一种胺(例如，式：/>的PEG-炔烃)与式(II-A)的树枝状体(/>其中D为PAMAM，并且t为大约50-60、60-70、或70-80的整数(包括端值在内))的比率为大约150:1。在一些实施方案中，一种胺(例如，式：的PEG-炔烃)与式(II-A)的树枝状体的比率为大约150:1；乙醇胺与PEG-炔烃的比率为9.42:1；并且n为3。

在一些实施方案中，一种胺(例如，式：的PEG-炔烃)与式(II-A)的树枝状体(/>其中D为PAMAM，并且t为大约50-60、60-70、或70-80的整数(包括端值在内))的比率为大约152:1、150:1、149:1、148:1、145:1、142:1、140:1、或138:1。在一些实施方案中，一种胺(例如，式：/>的PEG-炔烃)与式(II-A)的树枝状体(其中D为PAMAM，并且t为大约50-60、60-70、或70-80的整数(包括端值在内))的比率为大约152:1、150:1、149:1、148:1、145:1、142:1、140:1、或138:1；并且n为3。在一些实施方案中，一种胺(例如，式：/>的PEG-炔烃)与式(II-A)的树枝状体(其中D为PAMAM，并且t为大约50-60、60-70、或70-80的整数(包括端值在内))的比率为大约152:1、150:1、149:1、148:1、145:1、142:1、140:1、或138:1；乙醇胺与PEG-炔烃的比率为9.42:1；并且n为3。在一些实施方案中，一种胺(例如，式：/>的PEG-炔烃)与式(II-A)的树枝状体(/>其中D为PAMAM，并且t为大约50-60、60-70、或70-80的整数(包括端值在内))的比率为大约150:1；乙醇胺与PEG-炔烃的比率为9.42:1；并且n为3。

在一些实施方案中，D为PAMAM。在一些实施方案中，D是来自第3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5或9.5代的PAMAM，其中PAMAM树枝状体携带羧甲基。在一些实施方案中，一种胺(例如，式：的PEG-炔烃)与式(II-A)的树枝状体/>的比率为大约500:1。在一些实施方案中，一种胺(例如，式：/>的PEG-炔烃)与式(II-A)的树枝状体/>的比率为大约500:1；乙醇胺与PEG-炔烃的比率为2.2:1；并且n为10。在一些实施方案中，一种胺(例如，式：/>的PEG-炔烃)与式(II-A)的树枝状体的比率为495:1。在一些实施方案中，一种胺(例如，式：/>的PEG-炔烃)与式(II-A)的树枝状体(/>其中D为PAMAM，并且t为大约50-60、60-70、或70-80的整数(包括端值在内))的比率为大约505:1、503:1、502:1、501:1、500:1、499:1、498:1、497:1、496:1、495:1、494:1、493:1、492:1、491:1、或490:1。在一些实施方案中，一种胺(例如，式：/>的PEG-炔烃)与式(II-A)的树枝状体(/>其中D为PAMAM，并且t为大约50-60、60-70、或70-80的整数(包括端值在内))的比率为大约495:1。在一些实施方案中，一种胺(例如，式：/>的PEG-炔烃)与式(II-A)的树枝状体(/>其中D为PAMAM，并且t为大约50-60、60-70、或70-80的整数(包括端值在内))的比率为大约505:1、503:1、502:1、501:1、500:1、499:1、498:1、497:1、496:1、495:1、494:1、493:1、492:1、491:1、或490:1(例如大约495:1)；并且n为10。在一些实施方案中，一种胺(例如，式：/>的PEG-炔烃)与式(II-A)的树枝状体(/>其中D为PAMAM，并且t为大约50-60、60-70、或70-80的整数(包括端值在内))的比率为大约495:1；并且n为10。在一些实施方案中，一种胺(例如，式：/>的PEG-炔烃)与式(II-A)的树枝状体(/>其中D为PAMAM，并且t为大约50-60、60-70、或70-80的整数(包括端值在内))的比率为大约500:1；乙醇胺与PEG-炔烃的比率为2.2:1；并且n为10。

在一些实施方案中，式(II-A)的树枝状体的分子量为大约12,500g/mol、大约12,425g/mol、大约12,420g/mol、或大约12,418g/mol、或大约12,415g/mol。在一些实施方案中，式(II-A)的树枝状体的分子量为大约12,000-12,500g/mol。

在一些实施方案中，式(II-A)的树枝状体为下式：

在一些实施方案中，式(I-A)的官能化树枝状体的多分散度值较低，例如约1.00至约1.05(例如约1.03)。在一些实施方案中，式(I-A)的官能化树枝状体的多分散度值为约1.03。

在一些实施方案中，超过10-20克、20-30克、30-40克、40-50克、50-60克、60-70克、70-80克、80-90克、90-100克、100-110克、110-120克、120-130克、130-140克、150-160克、160-180克、180-200克的式(I-A)的官能化树枝状体通过本文所述的合成方法来合成。在一些实施方案中，超过30克、或超过50-100克(例如40克、160克)的式(I-A)的官能化树枝状体通过本文所述的合成方法来合成。

在一些实施方案中，在合成式(I-A)的官能化树枝状体的方法中，其中该方法包括使下式(II-A)的树枝状体与一种或多种胺(其中每种胺为式H₂NR¹)在合适的条件下反应：

以形成式(I-A)的官能化树枝状体；合适的条件包括反应溶剂以及使反应物在室温(例如，大约19℃至大约23℃)下反应。在某些实施方案中，合适的条件包括反应溶剂，即质子溶剂。例如，反应溶剂可为质子溶剂、或质子和非质子溶剂的混合物。在某些实施方案中，质子溶剂为醇，例如甲醇、乙醇、或异丙醇。在某些实施方案中，质子溶剂为甲醇。在某些实施方案中，醇是无水的，或者其可含有水。在某些实施方案中，反应溶剂可包括二氯甲烷。

在某些实施方案中，用于合成式(I-A)的官能化树枝状体的合适的条件包括使反应物在大约19℃至大约23℃，例如大约20℃至大约22℃下反应。在某些实施方案中，合适的条件包括使反应物在大约18-19℃、19-20℃、20-21℃、21-22℃、或22-23℃下反应。合适的条件包括甲醇反应溶剂以及使反应物在大约20℃下反应。

在某些实施方案中，用于合成式(I-A)的官能化树枝状体的合适的条件包括在0℃下将一种或多种胺(其中每种胺为式H₂NR¹)与式(II-A)的树枝状体，以及反应溶剂(例如醇，例如甲醇)一起搅拌大约1-5小时(例如2小时)的第一步骤；然后在大约19℃至大约23℃(例如20℃)下搅拌大约3-8天(例如6天)的第二步骤。在某些实施方案中，所合成的式(I-A)的官能化树枝状体为式：

/>

在一些实施方案中，用于合成式(I-A)的官能化树枝状体的方法还包括与式(B)的化合物进行反应：

其中：R²为卤素、任选取代的酰基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的乙酰基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、-N₃、-CH(＝N)(OH)R^D1、-CN、-NO₂、-OR^D1、-N(R^D1a)₂、-SO₂OR^D1、或-SR^D1，其中R^D1独立地为氢、任选取代的酰基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、或连接到氧原子时的氧保护基、或连接到硫原子时的硫保护基；其中每次出现的R^D1a独立地为氢、任选取代的酰基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、或氮保护基；或者任选地，R^D1a的两个实例与它们的间隔原子一起形成取代或未取代的杂环或者取代或未取代的杂芳基环；前提条件是R^1A和R²为反应配偶体；L^B为亚烷基连接基，其中烃链的一个或多个链原子独立地被酰胺、酯、异羟肟酸、醚、碳酸酯、氨基甲酸酯、腙、硫醚、硫酯、二硫化物、原酸酯、尿烷、或肟部分、或环状部分替代；并且T为治疗剂。

在一些实施方案中，连接基L^B包含聚合物。在一些实施方案中，连接基L^B包含亚烷基链(例如C_1-100,000亚烷基)，其中该链是介于R²与T之间的最短路径(不包括氢原子和取代基)。在某些实施方案中，连接基L^B的链包含多至5,000-7,000；7,000-9,000；9,000-10,000；10,000-12,000；100,000-120,000；120,000-150,000；或150,000-200,000个连续共价键合的原子或长度(不包括氢原子和取代基)。在某些实施方案中，L^B为全碳、取代或未取代的C_1-200,000烃链，作为介于R²与T之间的最短路径(不包括氢原子和取代基)。在某些实施方案中，L^B中的任何原子均可被取代。在某些实施方案中，连接基L^B中的原子均未被取代。在某些实施方案中，连接基中的碳原子均未被取代。在某些实施方案中，L^B的烃链的至少一个链原子独立地被-C(＝O)-、-O-、-NR^b-、-S-、或环状部分替代，其中R^b独立地为氢、取代或未取代的C_1-6烷基、或氮保护基。在某些实施方案中，L^B的烃链的至少一个链原子独立地被酰胺、异羟肟酸、醚、正烷基、碳酸酯、氨基甲酸酯、腙、硫醚、硫酯、二硫化物、原酸酯、尿烷、肟、任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、和/或任选取代的亚杂芳基替代。在某些实施方案中，L^B的烃链的至少一个链原子独立地被酰胺、异羟肟酸、醚、碳酸酯、氨基甲酸酯、腙、硫醚、硫酯、二硫化物、原酸酯、尿烷、和/或肟替代。在某些实施方案中，连接基L^B包含亚烷基部分(例如为式其中q为1-10,000或1-100,000之间的整数(包括端值在内))。在某些实施方案中，连接基L^B包含聚乙二醇部分(例如为式其中q为1-100,000之间的整数(包括端值在内))，并且L^B的烃链的至少一个链原子独立地被酰胺、异羟肟酸、醚、碳酸酯、氨基甲酸酯、腙、硫醚、硫酯、二硫化物、原酸酯、尿烷、和/或肟替代。在某些实施方案中，连接基L^B包含由点击反应产生的部分。在一些实施方案中，由点击化学产生的至少一个部分是由用于产生缀合物的反应性点击化学柄部(例如，叠氮化物以及末端或应变炔烃、二烯和亲二烯体、硫醇和烯烃)之间的电环化反应(例如，3+2环加成、或4+2环加成)产生的5元杂环。在一些实施方案中，由点击反应产生的至少一个部分为包含1,2,3-三唑基、4,5-二氢-1,2,3-三唑基、异噁唑基、4,5-二氢异噁唑基、或1,4-二氢哒嗪基的双基。

在某些实施方案中，R²为卤素(例如F、Cl、Br、或I)。在某些实施方案中，R²为任选取代的酰基(例如-C(＝O)Me)。在某些实施方案中，R²为任选取代的烷基(例如取代或未取代的C_1-6烷基)。在某些实施方案中，R²为取代或未取代的甲基。在某些实施方案中，R²为取代或未取代的乙基。在某些实施方案中，R²为取代或未取代的丙基。在某些实施方案中，R²为任选取代的烯基(例如取代或未取代的C_2-6烯基)。在某些实施方案中，R²为任选取代的炔基(例如取代或未取代的C_2-6炔基)。在某些实施方案中，R²为任选取代的乙酰基。在某些实施方案中，R²为任选取代的碳环基(例如，取代或未取代的在碳环环系中包含零个、一个、或两个双键的3-至7-元单环碳环基)。在某些实施方案中，R²为任选取代的杂环基(例如，取代或未取代的5-至10-元单环或双环杂环，其中杂环中的一个或两个原子独立地为氮、氧、或硫)。在某些实施方案中，R²为任选取代的芳基(例如，取代或未取代的6-至10-元芳基)。在某些实施方案中，R^1A为苄基。在某些实施方案中，R²为取代或未取代的苯基。在某些实施方案中，R²为任选取代的杂芳基(例如，取代或未取代的5-至6-元单环杂芳基，其中杂芳基环系中的一个、两个、三个、或四个原子独立地为氮、氧、或硫；或者取代或未取代的9-至10-元双环杂芳基，其中杂芳基环系中的一个、两个、三个、或四个原子独立地为氮、氧、或硫)。在某些实施方案中，R²为-CH(＝N)(OH)R^D1、-CN、-NO₂、-OR^D1、-N(R^D1a)₂、-SO₂OR^D1、或-SR^D1，其中R^D1和R^D1a如本文所定义。在某些实施方案中，R²为-CH(＝N)(OH)R^D1(例如-CH(＝N)(OH)(任选取代的C_1-6烷基))。在某些实施方案中，R²为-CH(＝N)(OH)(任选被聚乙二醇连接基取代的C_1-6烷基)。在某些实施方案中，R²为-CN。在某些实施方案中，R²为-NO₂。在某些实施方案中，R²为-OR^D1(例如-OH或-OMe)。在某些实施方案中，R^1A为-N(R^D1a)₂(例如-NMe₂)。在某些实施方案中，R²为-SO₂OR^D1(例如-SO₂O(任选取代的烷基))。在某些实施方案中，R²为-SR^D1(例如-SMe)。在某些实施方案中，R²为-CH(＝N)(OH)R^D1、-CN、-NO₂、-OR^D1、-N(R^D1a)₂、-SO₂OR^D1、或-SR^D1，其中R^D1独立地为氢、任选取代的酰基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、或连接到氧原子时的氧保护基、或连接到硫原子时的硫保护基；并且其中每次出现的R^D1a独立地为氢、任选取代的酰基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、或氮保护基；或者任选地，R^D1a的两个实例与它们的间隔原子一起形成取代或未取代的杂环或者取代或未取代的杂芳基环。在某些实施方案中，R²为溴、炔烃、乙炔、烯烃、醛、胺、COOH、羟基、羧基(例如二苯并环辛炔或DBCO)、硫醇、磺酸酯、或-CN。在某些实施方案中，R²是点击反应柄部(例如，表A中或实施例6的路线1-19中所显示的点击化学柄部)。在某些实施方案中，R^1A和R²为反应配偶体(例如，生物缀合反应配偶体)。在某些实施方案中，R^1A和R²为生物缀合反应配偶体(例如，点击反应配偶体)。在某些实施方案中，R^1A和R²为来自表A的点击反应配偶体。在某些实施方案中，L^B为亚烷基连接基，其中烃链的一个或多个链原子独立地被酰胺、酯、异羟肟酸、醚、碳酸酯、氨基甲酸酯、腙、硫醚、硫酯、二硫化物、原酸酯、尿烷、或肟部分、或环状部分替代。

在某些实施方案中，T的至少一个实例为如本文所定义的治疗剂、靶向剂、或显像剂。在某些实施方案中，T的至少一个实例为如本文所定义的治疗剂。在某些实施方案中，T的至少一个实例为生物分子。在某些实施方案中，T的至少一个实例为蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)药物。在某些实施方案中，T的至少一个实例为生物治疗剂(例如，蛋白质、肽、核酸、或抗体)。在某些实施方案中，T的至少一个实例为肽、核酸、或抗体。在某些实施方案中，核酸为寡核苷酸、DNA、或RNA(例如siRNA、mRNA)。在某些实施方案中，T的至少一个实例为基因、蛋白质、肽、寡核苷酸、碳水化合物、DNA、或RNA。在某些实施方案中，T的每个实例是不同的。在某些实施方案中，T的每个实例是相同的。

在某些实施方案中，本文提供了式(II-A)的中间体树枝状体：

其中D为选自聚(酰氨基胺)(PAMAM)聚合物、聚丙胺(POPAM)聚合物、聚乙烯亚胺聚合物、聚赖氨酸聚合物、聚酯聚合物、蝶烯聚合物、脂族聚(醚)聚合物、芳族聚醚聚合物、2,2-双(羟甲基)丙酸(双-MPA)聚合物，以及它们的组合的树枝状体；并且

t为16至4096的整数(包括端值在内)。

在某些实施方案中，本文提供了本文所述的合成方法中的中间体树枝状体，其中该中间体树枝状体为下式：

包含官能化树枝状体的组合物

在一些方面，本公开提供了一种组合物，该组合物包含式(I-A)的官能化树枝状体：

其中：

X为NH；

m为16至4096的整数(包括端值在内)；并且

n为1至100的整数(包括端值在内)。

在一些实施方案中，组合物中的官能化树枝状体的多分散度值小于或等于1.10。在一些方面，本公开提供了一种组合物，该组合物包含载体以及式(I-A)的官能化树枝状体：

其中：

X为NH；

m为16至4096的整数(包括端值在内)；并且

n为1至100的整数(包括端值在内)。

在一些实施方案中，组合物中的官能化树枝状体的多分散度值小于或等于1.10。在某些实施方案中，式(I-A)的官能化树枝状体中的取代基D、X、Y¹、m和n的定义如上所描述。在某些实施方案中，组合物中的官能化树枝状体的多分散度值小于或等于1.10(例如，小于或等于1.09、小于或等于1.08、小于或等于1.07、小于或等于1.06、小于或等于1.05、小于或等于1.04、小于或等于1.03、小于或等于1.02)。在某些实施方案中，组合物中的官能化树枝状体的多分散度值小于或等于1.05、小于或等于1.04、小于或等于1.03、小于或等于1.02、小于或等于1.01、或小于或等于1.00。在某些实施方案中，组合物包含至少10克的官能化树枝状体。在某些实施方案中，组合物包含至少10克、至少25克、至少50克、至少150克、或10-100克、100-150克、150-200克、20-200克、50-200克、或100-200克的官能化树枝状体(例如，式(I-A)的官能化树枝状体)。在一些实施方案中，组合物包含超过10-20克、20-30克、30-40克、40-50克、50-60克、60-70克、70-80克、80-90克、90-100克、100-110克、110-120克、120-130克、130-140克、150-160克、160-180克、180-200克的官能化树枝状体(例如，式(I-A)的官能化树枝状体)。在一些实施方案中，组合物包含超过30克、或超过50-100克(例如，40克、160克)的官能化树枝状体(例如，式(I-A)的官能化树枝状体)。

在某些实施方案中，组合物包含如本文所述的合适的载体(例如，固体或液体载体)。

治疗剂

在一些实施方案中，本公开提供了树枝状体缀合物，该树枝状体缀合物包含在树枝状体的一个或多个末端位置处具有至少一种治疗剂的树枝状体。在一些实施方案中，这样的树枝状体-药物缀合物具有相对于未缀合的药物(例如，在不存在树枝状体情况下的治疗剂)而言增加的治疗指数。在一些实施方案中，树枝状体-药物缀合物的治疗指数大于未缀合的药物的治疗指数的10％。在一些实施方案中，树枝状体-药物缀合物的治疗指数大于未缀合的药物的治疗指数的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。

治疗剂的治疗指数(TI)是引起治疗效应的治疗剂的量与引起毒性的量的比较。在一些实施方案中，治疗指数可表示为比率LD₅₀/ED₅₀，其中ED₅₀对应于50％群体中治疗有效的剂量，并且LD₅₀对应于50％群体致死的剂量。在一些实施方案中，药物和树枝状体-药物缀合物的治疗功效和毒性可以在细胞培养物或实验动物中通过标准药学程序来确定。

在一些实施方案中，树枝状体与两种或更多种不同类别的治疗剂复合或缀合，从而在靶位点处提供以不同或独立的释放动力学同时递送。例如，在一些实施方案中，STING激动剂和CSF1R抑制剂与树枝状体缀合以递送至靶细胞或组织。在一些实施方案中，将各自携带不同类别的治疗剂的树枝状体缀合物同时给药以进行组合治疗。在一些实施方案中，第4代或第6代PAMAM树枝状体与舒尼替尼和CXCR2抑制剂、或它们的类似物缀合。在一些实施方案中，第4代或第6代PAMAM树枝状体与长春新碱和舒尼替尼、或它们的类似物缀合。

在一些实施方案中，治疗剂为任何下述化合物或任何下述化合物的药学上可接受的衍生物、类似物、或前药。前药是当在体内代谢时经历向具有所期望药理活性的化合物转化的化合物。前药可以如通过用如本领域所述的“前部分”替代存在于治疗剂中的适当官能团进行制备(参见例如H.Bundgaar,Design of Prodrugs(1985))。前药的实例包括本文所述的治疗剂的酯、醚或酰胺衍生物、本文所述的治疗剂的聚乙二醇衍生物、N-酰基胺衍生物、二氢吡啶吡啶衍生物、与多肽缀合的含氨基衍生物、2-羟基苯甲酰胺衍生物、氨基甲酸酯衍生物、生物还原为活性胺的N-氧化物衍生物，以及N-曼尼希碱衍生物。对于前药的进一步讨论，参见例如Rautio,J.等人,Nature Reviews Drug Discovery.7:255-270(2008)。

在一些实施方案中，本公开的树枝状体缀合物包含选自以下的治疗剂：血管紧张素II受体阻断剂、法尼醇X受体(FXR)激动剂、死亡受体5激动剂、钠葡萄糖协同转运蛋白2型(SGLT2)抑制剂、溶血磷脂酸1受体拮抗剂、内皮素-A受体拮抗剂、过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)激动剂、AT1受体拮抗剂、CCR5/CCR2拮抗剂、抗纤维化剂、抗炎剂、抗氧化剂、干扰素基因刺激因子(STING)激动剂、集落刺激因子1受体(CSF1R)抑制剂、AXL抑制剂、c-Met抑制剂、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂、受体酪氨酸激酶抑制剂、MEK抑制剂、PAK1抑制剂、谷氨酰胺酶抑制剂、TIE II拮抗剂、趋化因子受体2(CXCR2)抑制剂、CD73抑制剂、精氨酸酶抑制剂、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)抑制剂、toll样受体4(TLR4)激动剂、toll样受体7(TLR7)激动剂、含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶-2(SHP2)抑制剂、化学治疗剂、STING拮抗剂，以及JAK1抑制剂。

在一些实施方案中，治疗剂为免疫调节剂。在一些实施方案中，免疫调节剂是指对受者的免疫系统引发特定效应的试剂。在一些实施方案中，与对照相比，免疫调节可以包括抑制、减少、增强、延长、或刺激对抗原的先天性或适应性免疫反应的一种或多种生理过程。在一些实施方案中，免疫调节剂可以通过靶向靶位点处的一种或多种免疫细胞或细胞类型来针对期望的免疫反应(例如，增加抗肿瘤活性，或增加在自身免疫性疾病中对其有需要的抗炎活性位点)调节免疫微环境。在一些实施方案中，递送免疫调节剂以杀伤、抑制、或减少抑制性免疫细胞如肿瘤相关巨噬细胞的活性或数量，以增强肿瘤部位处的抗肿瘤反应。在其它实施方案中，递送免疫调节剂以杀伤、抑制、或减少促炎性免疫细胞(例如，M1型巨噬细胞)的活性或数量，以减少与自身免疫性疾病相关联的发病部位处的促炎性免疫环境。

根据本公开使用的免疫调节剂的实例包括但不限于STING激动剂、STING拮抗剂、Janus激酶1(JAK1)抑制剂、CSF1R抑制剂、AXL抑制剂、c-Met抑制剂、PARP抑制剂、受体酪氨酸激酶抑制剂、MEK抑制剂、PAK1抑制剂、谷氨酰胺酶抑制剂、TIE II拮抗剂、CXCR2抑制剂、CD73抑制剂、精氨酸酶抑制剂、PI3K抑制剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、SHP2抑制剂、抗炎剂，以及它们的组合。

在一些实施方案中，治疗剂为选自环状二核苷酸GMP-AMP以及DMXAA的STING激动剂。在一些实施方案中，治疗剂为选自C-178、C-176、C18、Astin C、NO₂-CLA、H-151，以及α-倒捻子素的STING拮抗剂。在一些实施方案中，治疗剂是选自托法替尼、鲁索替尼、巴瑞克替尼、培菲替尼、德塞替尼、非戈替尼、索西替尼、伊他替尼、SHR0302、乌帕替尼、PF-04965842、Target-007，以及Target-006的JAK1抑制剂。在一些实施方案中，治疗剂是选自PLX3397、PLX108-01、ARRY-382、PLX7486、BLZ945、JNJ-40346527，以及GW 2580的CSF1R抑制剂。在一些实施方案中，治疗剂是选自奥拉帕尼、维利帕尼、尼拉帕利，以及卢卡帕尼的PARP抑制剂。在一些实施方案中，治疗剂是血管内皮生长因子受体(VEGFR)或表皮生长因子受体(EGFR)的受体酪氨酸激酶抑制剂。在一些实施方案中，治疗剂是AXL抑制剂(例如，比美替尼(R428)、度博替尼(TP-0903))。在一些实施方案中，治疗剂是c-Met抑制剂(例如卡博替尼)。在一些实施方案中，治疗剂是选自舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、凡德他尼、阿西替尼、西地尼布、瓦他拉尼、达沙替尼、比美替尼(R428)、度博替尼(TP-0903)、尼达尼布、卡博替尼，以及莫特塞尼的受体酪氨酸激酶(例如VEGFR、CSF1R、AXL、和/或c-Met)抑制剂。在一些实施方案中，治疗剂是曲美替尼、考比替尼、贝美替尼、司美替尼、PD325901、PD035901、PD032901，以及TAK-733的MEK抑制剂。在一些实施方案中，治疗剂是PAK1抑制剂。在一些实施方案中，PAK1抑制剂为Frax-1036(6-[2-氯-4-(6-甲基-2-吡嗪基)苯基]-8-乙基-2-[[2-(1-甲基-4-哌啶基)乙基]氨基]-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮)。在一些实施方案中，治疗剂是选自双-2-(5-苯基乙酰亚氨基-1,2,4-噻二唑-2-基)乙基硫醚(BPTES)、重氮丝氨酸、阿西维辛，以及CB-839的谷氨酰胺酶抑制剂。在一些实施方案中，治疗剂是选自Navarixin、SB225002，以及SB332235的CXCR2抑制剂。在一些实施方案中，治疗剂是选自APCP、檞皮素，以及替诺福韦的CD73抑制剂。在一些实施方案中，治疗剂是精氨酸酶抑制剂，如2-(S)-氨基-6-硼己酸。在一些实施方案中，治疗剂是选自阿培利司、serabelisib、pilaralisib、WX-037、达克利司、普瑞色替、伏他西布、PX-866、ZSTK474、布帕尼西、匹替利司，以及库潘尼西的PI3K抑制剂。

在一些实施方案中，治疗剂为抗炎剂。在一些实施方案中，抗炎剂减轻炎症，并且可包括甾体和非甾体药物。甾体药物的实例包括但不限于糖皮质素、黄体酮、盐皮质激素，以及皮质类固醇。非甾体抗炎药(NSAID)的实例包括但不限于甲芬那酸、阿司匹林、二氟尼柳、双水杨酯、布洛芬、萘普生、非诺洛芬、酪洛芬、Deacketoprofen、氟比洛芬、奥沙普秦、洛索洛芬、吲哚美辛、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、双氯芬酸、萘丁美酮、吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、屈噁昔康、氯诺昔康、伊索昔康、甲氯芬那酸、氟芬那酸、托芬那酸、塞来昔布(elecoxib)、罗非昔布、伐地昔布、伐地昔布、罗美昔布、依托考昔、非罗考昔、磺酰苯胺、尼美舒利、尼氟灭酸，以及利克飞龙。抗炎剂的额外实例包括但不限于醋酸曲安奈德、醋酸氟轻松、甲基强的松龙、泼尼松龙、强的松、地塞米松、氯替泼诺、氟米龙、布洛芬、阿司匹林、萘普生、环孢霉素、他克莫司、雷帕霉素，以及二甲双胍。在一些实施方案中，治疗剂是醋酸曲安奈德、强的松、或地塞米松。

在一些实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂。在一些实施方案中，治疗剂是化学治疗剂。根据本公开使用的细胞毒性剂的实例包括但不限于安吖啶、贝伐单抗、博来霉素、白消安、喜树碱、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、克利桑酶(crisantaspase)、环磷酰胺、阿糖孢苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、多西他赛、多柔比星、表鬼臼毒素、表阿霉素、依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基尿素、伊达比星、异环磷酰胺、innotecan、甲酰四氢叶酸、道诺霉素、洛莫司丁、氮芥、美法仑、巯嘌呤、美登素、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、一甲基瑞奥西汀E、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、喷司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、赛特铂、链脲霉素、替尼泊苷、优福定、替莫唑胺、替尼泊苷、噻替哌、硫鸟嘌呤、拓扑替康、曲奥舒凡、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、伏立诺他、紫杉醇、曲古菌素A、曲妥珠单抗、西妥昔单抗，以及利妥昔单抗。

在一些实施方案中，治疗剂是抗癌剂，如本文所述的细胞毒性剂。在一些实施方案中，治疗剂是组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，如伏立诺他。在一些实施方案中，治疗剂是拓扑异构酶I和/或II抑制剂，如依托泊苷或喜树碱。抗癌剂的额外实例包括但不限于伊立替康、依西美坦、奥曲肽、卡莫氟、克拉霉素、净司他丁、它莫西芬、替加氟、托瑞米芬、去氧氟尿苷、尼莫司汀、长春地辛、奈达铂、吡柔比星、氟他胺、法倔唑、强的松、甲羟孕酮、米托坦、吗替麦考酚酯，以及咪唑立宾。

在一些实施方案中，治疗剂是抗血管生成剂。抗血管生成剂的实例包括但不限于贝伐单抗rhuFAb V2(兰尼单抗，/>)、阿柏西普(pegaptanim sodium，抗-VEGF适体或EYE001)、色素上皮衍生因子(PEDF)、塞来昔布/>罗非昔布/>干扰素α、白介素-12(IL-12)、沙利度胺/>来那度胺/>角鲨胺、内皮抑素、血管抑素、/>(Sirna Therapeutics)、/>(AE-941)(AeternaLaboratories，Quebec City,Canada)、舒尼替尼/>索拉非尼/>埃罗替尼/>帕尼单抗/>以及西妥昔单抗/>抗血管生成剂的额外实例包括靶向血小板源性生长因子家族、表皮生长因子家族、成纤维细胞生长因子家族、转化生长因子-β超家族(TGF-β1，活化素、卵泡抑素以及骨形态发生蛋白)、血管生成素样家族、半乳凝素家族、整联蛋白超家族的成员，以及色素上皮衍生因子、肝细胞生长因子、血管生成素、内皮素、缺氧诱导因子、胰岛素样生长因子、细胞因子、基质金属蛋白酶以及它们的抑制剂，以及糖基化蛋白的试剂。

在一些实施方案中，治疗剂是可用于治疗一种或多种与肝脏相关联的病症或疾病和/或相关疾病或病症，如感染、败血病、糖尿病并发症、高血压、肥胖症、高血压、心力衰竭、肾脏疾病，以及癌症。这样的治疗剂的实例包括但不限于血管紧张素II受体阻断剂、FXR激动剂、死亡受体5激动剂、SGLT2抑制剂、溶血磷脂酸1受体拮抗剂、内皮素-A受体拮抗剂、PPARδ激动剂、AT1受体拮抗剂、CCR5/CCR2拮抗剂、胰岛素增敏剂、吡格列酮、抗纤维化剂、抗氧化剂、抗血管生成剂、抗兴奋性毒性剂(例如，丙戊酸、D-氨基膦酰基戊酸酯、D-氨基膦酰基庚酸酯)、谷氨酸形成/释放抑制剂(例如，巴氯芬、NMDA受体拮抗剂、兰尼单抗、抗-VEGF剂)，以及本文所述的免疫调节剂和细胞毒性剂。

在一些实施方案中，治疗剂是血管紧张素II受体阻断剂，如替米沙坦、替米沙坦-酰胺衍生物、或替米沙坦-酯衍生物。在一些实施方案中，治疗剂是FXR激动剂，如鹅去氧胆酸、鹅去氧胆酸-酰胺衍生物、或鹅去氧胆酸-酯衍生物。在一些实施方案中，治疗剂是选自根皮苷、T-1095、坎格列净、达格列净、依格列净、托格列净、恩格列净、鲁格列净、埃格列净，以及依碳酸舍格列净的SGLT2抑制剂。在一些实施方案中，治疗剂是PPARδ激动剂，如GW0742、GW0742-酰胺衍生物、或GW0742-酯衍生物。在一些实施方案中，治疗剂是抗氧化剂，如维生素E。

在一些实施方案中，治疗剂是N-乙酰基-L-半胱氨酸。在一些实施方案中，N-乙酰基-L-半胱氨酸经由不可裂解键与羟基封端的树枝状体缀合，以在给药后在体内最小化释放游离N-乙酰基-半胱氨酸。在一些实施方案中，与可释放或可裂解形式的树枝状体/N-乙酰基-半胱氨酸复合物相比，不可裂解形式的树枝状体/N-乙酰基-半胱氨酸缀合物提供了增强的治疗功效。

在一些实施方案中，治疗剂是聚唾液酸(例如，平均聚合度为20的低分子量polySia(polySia avDP20))、移位蛋白配体(例如，地西泮结合抑制剂(DBI))、干扰素-β(IFN-β)、或米诺环素。

在一些实施方案中，治疗剂是抗感染剂。抗感染剂的实例包括但不限于抗病毒剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂，以及抗真菌剂。在一些实施方案中，治疗剂选自莫西沙星、环丙沙星、红霉素、左氧氟沙星、头孢唑林、万古霉素、替加环素、庆大霉素、妥布霉素、头孢他啶、氧氟沙星、加替沙星、两性霉素、伏立康唑，以及纳他霉素。

适合根据本公开使用的治疗剂在共同未决的国际申请号PCT/US2020/063332、PCT/US2020/063347、PCT/US2020/063342，以及PCT/US2021/029139中额外详细地描述，它们中每者的相关内容全文以引用方式并入本文。

显像剂

在一些实施方案中，本公开提供了树枝状体缀合物，该树枝状体缀合物包含在树枝状体的一个或多个末端位置处具有至少一种显像剂的树枝状体。在一些实施方案中，包含显像剂的树枝状体缀合物可用于诊断、治疗、或标记目的。在一些实施方案中，显像剂是顺磁性分子、荧光化合物、磁性分子、放射性核素、x射线显像剂、或造影剂。在一些实施方案中，造影剂是不透射线的气体或释放气体化合物。在一些实施方案中，包含显像剂的树枝状体缀合物可用于确定所给药的组合物的位置。可用于该目的的显像剂包括但不限于荧光标签、放射性核素，以及造影剂。可用于诊断目的的显像剂的实例包括但不限于染料、荧光染料、近红外染料、SPECT显像剂、PET显像剂，以及放射性同位素。染料的实例包括但不限于羰花青、吲哚羰花青、氧杂羰花青、硫代羰花青和部花青素、聚甲炔、香豆素、罗丹明、氧杂蒽、荧光素、硼联吡咯甲烷(BODIPY)、Cy5、Cy5.5、Cy7、VivoTag-680、VivoTag-S680、VivoTag-S750、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor700、AlexaFluor750、AlexaFluor790、Dy677、Dy676、Dy682、Dy752、Dy780、DyLight547、Dylight647、HiLyte Fluor 647、HiLyteFluor 680、HiLyte Fluor 750、IRDye 800CW、IRDye 800RS、IRDye 700DX、ADS780WS、ADS830WS，以及ADS832WS。

在一些实施方案中，树枝状体缀合物包含适合通过闪烁扫描、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、或正电子发射断层扫描(PET)进行成像的放射性核素报道分子。在一些实施方案中，树枝状体缀合物包含适于放射疗法的放射性核素。在一些实施方案中，树枝状体缀合物包含用于通过磁共振成像(MRI)进行成像的造影剂。在一些实施方案中，树枝状体缀合物包含可用于诊断成像的放射性核素或MRI造影剂的螯合剂，以及可用于放射疗法的螯合剂。因此，在一些实施方案中，单一树枝状体/显像剂缀合物可以同时治疗和诊断体内一个或多个位置处的疾病或病症。在一些实施方案中，树枝状体缀合物包含放射性标记的SPECT、或具有合适量的放射性的闪烁显像剂。

可以基于特定的成像方法来选择合适的显像剂。例如，在一些实施方案中，显像剂是用于光学成像的近红外荧光染料、用于MRI成像的钆螯合物、用于PET或SPECT成像的放射性核素、或用于CT成像的金纳米粒子。

在一些实施方案中，树枝状体缀合物包含一种或多种用于PET成像的显像剂，如一种或多种放射性核素。PET是使用特殊相机和计算机来检测体内少量的放射活性的放射性示踪剂或放射性药物，以评价器官和组织功能(例如，检测疾病的早期发作)的技术。

PET涉及使用符合检测从短寿命正电子发射放射性同位素(包括但不限于半衰期为大约110分钟的¹⁸F、半衰期为大约二十分钟的¹¹C、半衰期为大约十分钟的¹³N，以及半衰期为大约两分钟的¹⁵O)中检测出湮灭光子形式的伽马射线。因此，在一些实施方案中，用于PET成像的显像剂的实例包括但不限于各种正电子发射金属离子中的一种或多种，如⁵¹Mn、⁵²Fe、⁶⁰Cu、⁶⁸Ga、⁷²As、⁹⁴mTc、或¹¹⁰In。在一些实施方案中，显像剂是选自¹⁸F、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、⁷⁷Br，以及⁷⁶Br的放射性核素。用于闪烁扫描术或放射疗法的金属放射性核素的实例包括但不限于^99mTc、⁵¹Cr、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴⁷Sc、⁵¹Cr、¹⁶⁷Tm、¹⁴¹Ce、¹¹¹In、¹⁶⁸Yb、¹⁷⁵Yb、¹⁴⁰La、⁹⁰Y、⁸⁸Y、¹⁵³Sm、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁶Dy、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁹⁷Ru、¹⁰³Ru、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、²⁰³Pb、²¹¹Bi、²¹²Bi、²¹³Bi、²¹⁴Bi、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹¹⁷mSn、¹⁴⁹Pm、¹⁶¹Tb、¹⁷⁷Lu、²²⁵Ac、¹⁹⁸Au以及¹⁹⁹Au。金属的选择将基于期望的治疗或诊断应用来确定。例如，就诊断性目的而言，在一些实施方案中，可用的放射性核素包括⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、^99mTc，以及¹¹¹In。就治疗性目的而言，在一些实施方案中，可用的放射性核素包括⁶⁴Cu、⁹⁰Y、¹⁰⁵Rh、¹¹¹In、¹¹⁷mSn、¹⁴⁹Pm、¹⁵³Sm、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Tb、¹⁶⁶Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁷⁵Yb、¹⁷⁷Lu、²²⁵Ac、^186/ ¹⁸⁸Re，以及¹⁹⁹Au。

在一些实施方案中，显像剂是锝-99m(^99mTc)。在一些实施方案中，^99mTc由于其低成本、可用性、成像特性以及较高比放射性而可用于诊断应用。^99mTc的核和放射性特性使该同位素可用于闪烁成像。这种同位素的单光子能量为140keV，并且放射性半衰期为约6小时，并且易于由⁹⁹Mo-^99mTc发生器获得。在一些实施方案中，可用于PET成像的放射性核素包括¹⁸F、4-[¹⁸F]氟苯甲醛(¹⁸FB)、Al[¹⁸F]-NOTA、⁶⁸Ga-DOTA，以及⁶⁸Ga-NOTA。在一些实施方案中，¹⁵³Sm可以与螯合剂如乙二胺四亚甲基膦酸(EDTMP)或1,4,7,10-四氮杂环十二烷四亚甲基膦酸(DOTMP)一起用作显像剂。

MRI可用于评估脑疾病、脊柱障碍、血管显像、心脏功能，以及肌肉骨骼损伤，以及其它用途。MRI不需要使用电离辐射，并且扫描能够以任何选定的取向执行。MRI提供了全三维能力、高软组织对比度、高空间分辨率，并且擅长形态学和功能成像。因此，在一些实施方案中，树枝状体包含一种或多种用于MRI的显像剂，如一种或多种MRI造影剂。MRI造影剂的实例是本领域已知的，并且包括但不限于Gd、Mn、BaSO₄、氧化铁，以及铁铂。

靶向剂

在一些实施方案中，树枝状体包括一种或多种组织靶向或组织结合部分，用于使树枝状体靶向至体内特定位置，并且/或者用于增强在体内期望位置处的体内停留时间。例如，在一些实施方案中，在局部或全身给药到体内后，树枝状体多价螯合或结合至一种或多种不同的组织或器官。因此，相对于在不存在靶向或结合部分的情况下树枝状体和试剂，靶向或结合部分的存在可以增强试剂向靶位点的递送。树枝状体与一种或多种靶向或结合部分的缀合可以经由间隔基，并且介于间隔基与树枝状体、和/或间隔基与靶向剂之间的键可设计成提供可释放或不可释放形式的树枝状体-靶向剂复合物。

示例性靶向剂为阿仑膦酸(阿仑膦酸盐)，其与骨表面处的羟基磷灰石结合，并增强树枝状体复合物在骨上的停留时间。阿仑膦酸盐是选择性地与骨的组分羟基磷灰石结合的小分子靶向部分。因此，在一些实施方案中，树枝状体与阿仑膦酸盐缀合，用于使树枝状体选择性地靶向骨。在一些实施方案中，阿仑膦酸盐与树枝状体之间的缀合经由可逆(非共价)连接基。在其它实施方案中，阿仑膦酸盐与树枝状体之间的缀合经由不可裂解或可最低限度裂解的连接基。在一些实施方案中，靶向剂还在靶位点处具有治疗效应。在一些实施方案中，树枝状体与阿仑膦酸盐缀合，用于使树枝状体复合物靶向骨并在骨炎症部位处提供治疗效应。在一些实施方案中，阿仑膦酸盐结合的树枝状体与一种或多种试剂缀合，用于使试剂选择性地递送至骨炎症部位。

已经确立，与碳水化合物三触角型N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)缀合或复合的树枝状体选择性地在肝细胞内积聚。描述了通过将三触角型N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)加成到树枝状体表面而修饰的树枝状体的组合物。

肝细胞上大量表达的脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)可以通过糖识别域(CRD)选择性地识别半乳糖和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)并与受体紧密结合。碳水化合物部分与ASGPR受体的有效结合允许经由受体介导的内吞作用选择性地内化到肝细胞内。内含体中的低pH导致糖配体与ASGPR受体之间的四价钙螯合被破坏，从而在肝细胞中释放配体。一旦配体被释放，受体复合物就再循环，从而允许大量的配体内化到肝细胞中，而没有饱和效应。GalNAc与ASGPR的结合发生在肝细胞的血窦面，每个细胞含有约500,000个ASGPR受体，其中约5％-10％在任何时候存在于细胞表面处。先前的研究显示，配体与ASGPR的结合取决于糖的类型(GalNAc>Gal)以及糖的数量，其中4>3>2>1。ASGPR胞外域的X射线晶体结构揭示了浅碳水化合物结合袋，这解释了对多价的需求。因此，探索了多价结合，并且由于糖簇效应，三价和四价碳水化合物构建体对ASGPR的结合亲和力比单价配体强100-1000倍。

与SiRNA缀合的双-和三触角型GalNAc配体在皮下给药的C57BL/6小鼠的肝脏中展示出显著更高的GalNAc-siRNA水平，其中94％的GalNAc-siRNA位于肝细胞中。另外，这些siRNA缀合物介导有效的基因沉默。进一步的研究报道，在小鼠模型中，与三触角型GalNAc连接的反义寡核苷酸(ASO)的效力比亲本ASO高多至10倍。

碳水化合物-蛋白质相互作用在生物过程如受体介导的内吞作用中发挥着重要作用，并且已经应用于细胞识别研究以及生物医学材料的设计。碳水化合物封端的树枝状体(糖树状分子)赋予了与相关受体增强的结合亲和力，这使得它们能够以亲合力和选择性与特定细胞类型相互作用，以进行靶向药物递送。在药物递送平台中引入碳水化合物部分还提供了生物相容性，以及增加了树枝状体复合物的水溶性。

三触角型-GalNAc提供了与肝细胞上ASGPR的有效多价结合。因此，在一些实施方案中，树枝状体在一个或多个表面末端基团(例如-OH)处用一个或多个三触角型-GalNAc基团进行修饰。

树枝状体的三触角型GalNAc修饰在每个表面末端基团处产生了一组三个GalNAc。在一些实施方案中，三个β-GalNAc分子经由一个或多个连接基接枝到结构单元上，以产生适用于缀合至树枝状体的表面官能团的AB3结构单元(即，三触角型GalNAc树突)。

在一些实施方案中，三个β-GalNAc分子经由一个或多个连接基接枝到炔丙基化季戊四醇结构单元上，以产生适用于缀合至如下所示的树枝状体的表面官能团的AB3结构单元。

在一些实施方案中，三触角型-GalNAc通过一个或多个表面基团的缀合经由缀合前树枝状体的总可用表面官能团(如羟基)的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、或30％发生。在其它实施方案中，三触角型-β-GalNAc的缀合发生在缀合前树枝状体的总可用表面官能团的少于5％、少于10％、少于15％、少于20％、少于25％、少于30％、少于35％、少于40％、少于45％、少于50％上。在一些实施方案中，树枝状体与有效量的三触角型-β-GalNAc缀合以结合ASGPR和/或靶向并处于肝细胞上，同时与有效量的试剂缀合以治疗、预防、和/或成像肝脏疾病或障碍。

组合物

在一些方面，本公开提供了包含一种或多种本文所述的树枝状体缀合物的组合物。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。包括一种或多种树枝状体缀合物的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体(包括有利于将活性化合物处理成可药用制剂的赋形剂和助剂)以常规方式进行配制。适当的制剂取决于所选择的给药途径。在一些实施方案中，组合物被配制用于肠胃外递送。在一些实施方案中，组合物被配制用于瘤内注射。在一些实施方案中，组合物可以配制在无菌盐水或缓冲溶液中，以注射到待治疗的组织或细胞中。组合物可以冻干储存在一次性小瓶中，以在临使用前再水合。

在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种树枝状体缀合物以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。赋形剂的实例包括溶剂、稀释剂、pH调节剂、防腐剂、抗氧化剂、悬浮剂、润湿剂、粘度调节剂、张度剂、稳定剂，以及它们的组合。合适的药学上可接受的赋形剂可以选自公认为安全的(GRAS)材料，并且可以给药于受试者而不引起不期望的生物副作用或不希望的相互作用。

在一些实施方案中，药学上可接受的盐可以通过使化合物的游离酸或碱形式与化学计量的量的适当碱或酸在水或有机溶剂(例如非水介质，如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇、或乙腈)中反应来制备。药学上可接受的盐可以包括衍生自无机酸、有机酸的化合物的盐、碱金属盐和碱土金属盐，以及通过使化合物与合适的有机配体反应所形成的盐(例如，季铵盐)。合适的盐的列表见于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第20版,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2000,第704页。

在一些实施方案中，组合物被配制成单位剂型，以便于给药和剂量的均匀度。在一些实施方案中，单位剂型是指适于待治疗受试者的缀合物的物理离散单位。治疗有效剂量可初始在细胞培养测定中或在动物模型(如小鼠、兔、狗、或猪)中估计。动物模型也可用于实现期望的浓度范围和给药途径。这样的信息可用于确定在人体内给药的有用剂量和途径。缀合物的治疗功效和毒性例如ED50(该剂量在50％群体中治疗有效)和LD50(该剂量对50％群体致死)可以通过标准药学程序在细胞培养物或实验动物中进行测定。毒性与治疗效应的剂量比是治疗指数，并且其可表示为比率LD50/ED50。

在一些实施方案中，将组合物局部给药，例如通过直接注射到待治疗的部位。在一些实施方案中，将组合物注射、局部施用、或以其他方式直接给药到脉管系统中到损伤、手术、或植入部位之处或附近的脉管组织上。例如，在一些实施方案中，将组合物局部施用于在手术或植入、或移植规程期间暴露的脉管组织。描述了被配制用于通过肠胃外(肌内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、肠内，以及局部给药途径进行给药的药物组合物。

在一些实施方案中，树枝状体缀合物被配制用于胃肠外给药。短语“肠胃外给药”和“肠胃外给药的”是本领域公认的术语，并且包括除了肠内和局部给药之外的给药模式，如注射，并且可以包括静脉内、肌内、胸膜内、血管内、心包内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内，以及胸骨内注射和输注。在一些实施方案中，组合物经肠胃外给药，例如通过硬膜下、静脉内、鞘内、心室内、动脉内、关节内、滑膜内、羊膜内、腹膜内、或皮下途径。

对于液体制剂，药学上可接受的载体可为例如水性或非水性溶液、悬浮液、乳液、或油。肠胃外媒介物(用于皮下、静脉内、动脉内、或肌内注射)包括例如氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖以及氯化钠、乳酸林格氏液以及固定油。非水性溶剂的实例包括丙二醇、聚乙二醇，以及可注射有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括例如水、醇/水溶液、环糊精、乳液、或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。组合物还能够以乳液给药，例如油包水型。油的实例包括石油、动物、植物、或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、橄榄油、向日葵油、鱼肝油、芝麻油、棉籽油和玉米油。适用于肠胃外制剂的脂肪酸包括例如油酸、硬脂酸、异硬脂酸、油酸乙酯，以及肉豆蔻酸异丙酯。

在一些实施方案中，适用于肠胃外给药的组合物可以包括抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期受者的血液等渗的溶质，以及可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌混悬剂。静脉内媒介物可以包括流体和营养补充剂，以及电解质补充剂，如基于林格氏右旋糖的那些。一般而言，特别地对于可注射溶液剂而言，水、盐水、右旋糖水溶液和相关糖溶液以及二醇如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体载体。用于可注射组合物的可注射药物载体是本领域已知的(参见例如Pharmaceutics and PharmacyPractice,J.B.Lippincott Company,Philadelphia,PA,Banker和Chalmers编辑,第238250页(1982)，以及ASHP Handbook on Injectable Drugs,Trissel,第15版,第622 630页(2009))。

在一些实施方案中，树枝状体缀合物被配制用于经肠内给药。载体或稀释剂可为用于固体制剂的固体载体或稀释剂、用于液体制剂的液体载体或稀释剂、或它们的混合物。对于液体制剂，药学上可接受的载体可为例如水性或非水性溶液、悬浮液、乳液或油。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇，以及可注射有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括例如水、醇/水溶液、环糊精、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。油和脂肪酸的实例如对配制用于肠胃外给药的组合物所描述。

媒介物包括例如氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖以及氯化钠、乳酸林格氏液，以及固定油。制剂包括例如水性和非水性等渗无菌注射溶液剂，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期受者的血液等渗的溶质，以及可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌混悬剂。一般而言，水、盐水、右旋糖水溶液，以及相关糖溶液可用作液体载体。这些也可以与蛋白质、脂肪、糖以及婴儿配方食品的其它组分一起配制。

在一些实施方案中，树枝状体缀合物被配制用于经口服给药。口服制剂可为口香糖、凝胶条、片剂、胶囊剂或锭剂的形式。用于制备肠溶包衣口服制剂的包封物质包括邻苯二甲酸醋酸纤维素、聚醋酸乙烯苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，以及甲基丙烯酸酯共聚物。固体口服制剂，如胶囊剂或片剂是优选的。酏剂和糖浆剂也是公知的口服制剂。

在一些实施方案中，树枝状体缀合物被配制用于局部给药。局部给药可包括例如在手术期间直接施用于暴露的组织、脉管系统、粘膜或组织或假体。用于局部给药的优选组织是肿瘤。

治疗性用途

在一些实施方案中，树枝状体复合物用于治疗癌症。在其它实施方案中，树枝状体复合物用于治疗自身免疫性疾病。该方法典型地包括向对其有需要的受试者给药有效量的包括树枝状体和一种或多种治疗剂的组合物以调节免疫微环境，从而降低自身免疫反应或增加抗肿瘤反应。

一般而言，组合物及其治疗方法可用于癌症的背景下，包括肿瘤疗法。组合物还可用于治疗其它疾病、障碍和损伤，包括炎性疾病，包括但不限于溃疡性结肠炎、克罗恩病和类风湿性关节炎。

在一些实施方案中，待治疗的受试者是人类。所描述的所有方法可以包括鉴定和选择需要治疗的受试者、或将会受益于给药组合物的受试者的步骤。因此，在一些实施方案中，在治疗癌症、或治疗其它疾病、障碍和损伤(包括炎性疾病，如溃疡性结肠炎、克罗恩病、类风湿性关节炎和骨疾病)的背景下，将与一种或多种免疫调节剂和/或额外的治疗剂或诊断剂缀合或复合的树枝状体的组合物给药于需要免疫调节的受试者。

在一些实施方案中，将与一种或多种免疫调节剂和/或额外的治疗剂或诊断剂缀合或复合的树枝状体的组合物给药于患有增殖性疾病如良性或恶性肿瘤的受试者。在一些实施方案中，待治疗的受试者已被诊断患有I期、II期、III期、或IV期癌症。在一些实施方案中，增殖性疾病为神经纤维瘤病。神经纤维瘤病是指一类致使在神经组织上形成肿瘤的遗传性障碍。这些肿瘤可以在神经系统的任何之处发展，包括脑部、脊髓和神经。存在三种类型的神经纤维瘤病：1型神经纤维瘤病(NF1)、2型神经纤维瘤病(NF2)，以及神经鞘瘤病。NF1通常在儿童时期被诊断出来，而NF2和神经鞘瘤病通常在成年早期被诊断出来。这些障碍中的肿瘤通常为非癌性(良性)，但有时可能癌变(恶性)。因此，在一些实施方案中，待治疗的受试者患有或怀疑患有增殖性疾病，如NF1、NF2、和/或神经鞘瘤病。在一些实施方案中，待治疗的受试者患有或怀疑患有NF1。

1型神经纤维瘤病(NF1)是一种以缓慢生长的肿瘤(称为丛状神经纤维瘤)的进行性发展为特征的常见癌症易感性综合征。这些肿瘤涉及颅神经和大周围神经，由雪旺氏细胞中的NF1杂合性丢失引发，含有高水平的胶原蛋白，并且被炎症细胞浸润。由于纤维神经瘤的高度不宜手术性，药理治疗剂是靶向这些瘤的主要策略。有丝分裂原激活蛋白激酶(MEK)抑制剂司美替尼(Koselugo^TM)是唯一经FDA批准用于NF1的药物，尽管这种重要的抑制剂促进了儿童和成人两者中的部分反应，但仍然需要更大的收缩率和持久性。然而，组合试剂的整体毒性是治疗纤维神经瘤的限制因素，由此降低了药物减弱肿瘤收缩或进展的能力。

通过延缓或抑制受试者中肿瘤的生长、减少肿瘤的生长或尺寸、抑制或减少肿瘤的转移、和/或抑制或减少与肿瘤发展或生长相关联的症状，该组合物和方法可用于治疗患有良性或恶性肿瘤的受试者。例如，在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗患有与增殖性疾病如神经纤维瘤病(例如NF1)相关联(例如由增殖性疾病引起)的肿瘤的受试者的组合物和方法。

可用该组合物和方法治疗的癌症的类型包括但不限于骨、膀胱、脑部、乳腺、宫颈、结肠直肠、食道、肾、肝、肺、鼻咽、胰腺、前列腺、皮肤、胃和子宫的癌症，如脉管癌，如多发性骨髓瘤、腺癌和肉瘤。在一些实施方案中，组合物用于并行治疗多种癌症类型。组合物还可用于治疗多个位置处的转移瘤或肿瘤。

在一些实施方案中，将与一种或多种免疫调节剂和/或额外的治疗剂或诊断剂缀合或复合的树枝状体的组合物给药于患有自身免疫性或炎性疾病或障碍的受试者。当身体的自然防御系统不能有效地区分身体的自身细胞和外来细胞，从而导致身体错误地攻击正常细胞时，就会发生自身免疫性疾病。存在超过80种类型的影响广泛的身体部位的自身免疫性疾病。常见的自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、银屑病、银屑病性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、1型糖尿病、炎性肠病，以及甲状腺疾病。

在一些实施方案中，组合物还可用于治疗自身免疫性或炎性疾病或障碍，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴增生综合症(alps)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻性皮肤炎(celiac sprue-dermatitis)、慢性疲劳综合征、免疫缺陷综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、疤痕性类天疱疮、冷凝集素病、肢端硬皮综合征、克罗恩氏病、地高氏病、皮肌炎、幼年型皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫病、吉兰-巴雷综合症、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、Iga肾病、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、幼年型关节炎、梅尼埃病、混合性结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺性综合征(polyglancular syndromes)、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、雷诺现象、瑞特氏综合征、风湿热、结节病、硬皮病、干燥综合征、僵人综合征、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和韦格纳肉芽肿病。

在一些实施方案中，组合物和方法还可用于治疗涉及骨和关节的自身免疫性或炎性疾病或障碍，包括感染和免疫介导的局部和全身疾病。

组合物和方法适用于治疗一种或多种眼部疾病或障碍。组合物和方法适用于减轻与一种或多种眼部疾病或障碍相关联的一种或多种症状，例如不适、疼痛、干燥、过度流泪、损伤、感染、烧伤以及视力逐渐丧失。

在一些实施方案中，待治疗的眼部障碍是眼底疾病，如糖尿病性眼疾病、症状性玻璃体黄斑粘连/玻璃体黄斑牵拉(sVMA/VMT)，以及湿性(新生血管性)或干性AMD(年龄相关性黄斑变性)。在一些实施方案中，待治疗的眼部障碍是一种或多种视网膜和脉络膜血管疾病(例如，AMD、早产儿视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、视网膜静脉阻塞、与化疗毒性相关联的视网膜病变，例如MEK视网膜病变)。在一些实施方案中，待治疗的眼部障碍是年龄相关性黄斑变性(AMD)。年龄相关性黄斑变性(AMD)是造成中心视觉丧失的原因的神经退行性黄斑神经炎症性疾病。年龄相关性黄斑变性的发病机制涉及脉络膜(视网膜下的血管层)、视网膜色素上皮(RPE)、视网膜神经感觉层下的细胞层、布鲁赫膜和视网膜神经感觉层本身的慢性神经炎症。

在其它实施方案中，待治疗的眼部障碍是眼部炎性疾病，即，与眼部组织炎症相关联的眼部疾病，包括例如AMD、色素性视网膜炎、视神经炎、肉样瘤、视网膜脱离、颞动脉炎、视网膜缺血、动脉硬化性视网膜病变、高血压性视网膜病变、视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、糖尿病视网膜病变、黄斑水肿、斯塔格特病(也称为斯塔加特黄斑变性或少年黄斑变性)、地图样萎缩、视神经脊髓炎，而且还包括血管生成疾病，包括例如视网膜血管新生和脉络膜血管新生。其它病症也可导致眼部的炎症和/或血管生成，例如感染、镰形细胞病、低血压等。

可治疗的眼部障碍的另外实例包括阿米巴角膜炎、真菌性角膜炎、细菌性角膜炎、病毒性角膜炎、盘尾丝虫性角膜炎、细菌性角结膜炎、病毒性角结膜炎、角膜营养不良性疾病、富克斯内皮营养不良、睑板腺功能障碍、前睑缘炎和后睑缘炎、结膜充血、结膜坏死、瘢痕性瘢痕(cicatrical scaring)和纤维化、点状上皮角膜裂纹、丝状角膜炎、角膜糜烂、变薄、溃疡和穿孔、干燥综合征、史蒂文斯-约翰逊综合征、自身免疫性干眼症、环境性干眼症、角膜新生血管疾病、角膜移植后排斥反应预防和治疗、自身免疫性葡萄膜炎、感染性葡萄膜炎、前葡萄膜炎、后葡萄膜炎(包括弓形体病)、全葡萄膜炎、玻璃体或视网膜炎性疾病、眼内炎预防和治疗、黄斑水肿、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、增殖性和非增殖性糖尿病视网膜病变、高血压性视网膜病变、视网膜自身免疫性疾病、原发性和转移性眼内黑色素瘤、其它眼内转移性肿瘤、开角型青光眼、闭角型青光眼、色素性青光眼以及它们的组合。其它障碍包括角膜损伤、烧伤、或擦伤、白内障以及年龄相关性眼退化或与此相关联的视力退化。

在一些实施方案中，将与一种或多种用于治疗、预防、和/或诊断一种或多种肝脏障碍和/或疾病的试剂复合或缀合的三触角型-GalNAc修饰的树枝状体给药于受试者，以治疗、预防、和/或诊断受试者的一种或多种肝脏障碍和/或疾病的一种或多种症状。

树枝状体-三触角型-β-GalNAc组合物有效地治疗或改善肝脏疾病、或障碍如急性或慢性肝脏疾病的一种或多种症状。可治疗的示例性适应症包括但不限于例如由肿瘤性浸润引起的急性肝衰竭(急性肝炎、暴发性肝炎)、急性布-加综合征、中暑、蘑菇摄入(mushroomingestion)、代谢性疾病如威尔逊氏病、或与病毒性肝病相关联，如由单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、巴二氏病毒、细小病毒、肝炎病毒(例如，甲型肝炎、戊型肝炎、丁+乙型肝炎感染)引起，或药物诱导的肝损伤，包括利福平诱导的肝毒性、对乙酰氨基酚诱导的肝毒性、娱乐性药物(如3,4-亚甲二氧基-N-甲基安非他明(MDMA，也称为摇头丸))诱导的毒性、或可卡因诱导的毒性、急性缺血性肝细胞损伤、或缺氧性肝炎、或由创伤性肝损伤引起。该方法可以治疗和预防由此前肝脏正常的个体中发生脑病、凝血病和黄疸所限定的任何超急性、急性和亚急性肝脏疾病。

急性肝脏疾病的症状和临床表现包括黄疸和脑病，以及肝功能受损(例如，代谢功能丧失、导致低血糖症的糖异生减少、导致乳酸性酸中毒的乳酸清除率减少、导致高血氨症的氨清除率减少，以及导致凝血病的合成能力降低)。急性肝脏疾病和障碍通常与多种全身表现相关联，包括促成高风险败血症的免疫不全麻痹；全身性炎症反应，具有高能量消耗或分解代谢率；门脉高压；肾功能障碍；心肌损伤；胰腺炎(特别是对乙酰氨基酚相关疾病)；肾上腺中的糖皮质激素产生不足，促成低血压；以及急性肺损伤，导致急性呼吸窘迫综合征。

所描述的所有方法还可以包括鉴定和选择需要治疗的受试者、或将会受益于给药组合物的受试者的步骤。在一些实施方案中，通过表现出疾病的临床(例如，身体)症状，受试者在医学上被诊断患有急性肝脏疾病或障碍。在其它实施方案中，通过表现出指示发展急性肝脏疾病的风险或可能性升高的临床(例如，身体)症状，受试者在医学被诊断患有亚急性或慢性肝脏疾病或障碍。因此，在一些实施方案中，在急性肝脏疾病的临床诊断之前，将所公开的树枝状体组合物的制剂给药于受试者。

在一些实施方案中，该方法治疗或预防非酒精性脂肪性肝炎、与非酒精性脂肪性肝炎相关联的肝纤维化、原发性胆汁性胆管炎。

在一些实施方案中，树枝状体缀合物可以与已知能够治疗以上所讨论的病症或疾病的一种或多种额外的治疗活性剂组合给药。

实施例

实施例1.二去乙基舒尼替尼经由不可裂解键的缀合

血管内皮生长因子(VEGF)的过表达牵涉到与许多与血管生成相关联的疾病。舒尼替尼是受体酪氨酸激酶抑制剂，它阻断VEGF受体，并且具有优异的抗血管生成活性，并且经FDA批准用于不同类型的癌症。二去乙基舒尼替尼是舒尼替尼的活性代谢物。尽管舒尼替尼及其类似物的优异治疗价值，其临床开发却受到相关联毒性的阻碍。树枝状体-二去乙基舒尼替尼缀合物旨在通过将舒尼替尼连接到羟基封端的树枝状体上来克服舒尼替尼的剂量相关毒性。本实施例中合成的树枝状体缀合物的化学结构显示于图1中。N,N-二去乙基舒尼替尼酰胺叠氮化物的合成与表征

具有酰胺键的N,N-二去乙基舒尼替尼叠氮化物的合成反应路线显示于图2中。

步骤1：5-氟-2,3-二氢-1H-吲哚-2-酮(化合物2)的合成

向5-氟-2,3-二氢-1H-吲哚-2,3-二酮(6.0克，1.0当量)在正丁醇(10V)中的搅拌溶液中添加三乙胺(6.12mL，1.2当量)，然后在室温下添加水合肼(3.56mL，2.0当量)。将所得溶液在100℃下搅拌16小时。通过TLC(含50％乙酸乙酯的己烷)监测反应进程。一旦判断反应完成，将反应物料按原样在真空和45℃下蒸发至干以获得深褐色固体。将所获得的固体用水(20V)猝灭并用乙酸乙酯(30V)萃取并将有机层水洗。使有机层在旋转蒸发仪上浓缩至干。使用乙酸乙酯通过重结晶纯化粗产物，得到灰色蓬松固体(4.0g，72％收率)。图2所显示的化合物2通过¹H NMR、液相色谱和质谱得以证实。

步骤2：5-{[(3Z)-5-氟-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-3-亚基]甲基}-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(化合物4)的合成

在室温下，向5-氟-2,3-二氢-1H-吲哚-2-酮(化合物2)(4.0克，1.0当量)和5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(化合物3)(4.41克，1.0当量)的乙醇(10V)的搅拌溶液中添加吡咯烷(4.42mL，2.0当量)。将所得溶液在80℃下搅拌3小时。通过TLC(含10％甲醇的DCM)监测反应进程。一旦判断反应完成，将反应物料冷却至室温，添加2M HCl溶液至pH＝3。形成棕红色沉淀并过滤。所获得的固体用乙醇(20V)，然后用己烷(30V)洗涤并过滤，得到红橙色固体(6.6g，82％收率)。图2中所显示的化合物4通过¹H NMR得以证实。

步骤3：N-{2-[(5-{[(3Z)-5-氟-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-3-亚基]甲基}-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基)甲酰胺基]乙基}氨基甲酸叔丁酯(化合物6)的合成

在0℃下，向5-{[(3Z)-5-氟-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-3-亚基]甲基}-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(化合物4)(6.5g，1.0当量)的DMF溶液中添加三乙胺(6.08mL，2.0当量)、EDC.HCl(8.68g，2.1当量)、HOBT(3.94g，1.35当量)以及N-(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(4.16g，1.2当量)。将反应在室温下搅拌16小时。反应混合物用水(20.0V)稀释，搅拌10分钟以沉淀，并过滤得褐色固体。将所获得的固体用乙酸乙酯(15.0V)，然后用己烷(15.0V)洗涤，过滤并干燥，得到棕橙色固体作为N-{2-[(5-{[(3Z)-5-氟-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-3-亚基]甲基}-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基)甲酰胺基]乙基}氨基甲酸叔丁酯(化合物6)(7.5g，78％收率)。图2中所显示的化合物6通过¹H NMR得以证实。

步骤4：N-(2-氨基乙基)-5-{[(3Z)-5-氟-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-3-亚基]甲基}-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物7)的合成：

在0-5℃下，向N-{2-[(5-{[(3Z)-5-氟-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-3-亚基]甲基}-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基)甲酰胺基]乙基}氨基甲酸叔丁酯(化合物6)(9.0g，1.0当量)的DCM(10.0V)溶液中添加三氟乙酸(3.0V)。将反应在室温下搅拌12小时。将反应物料按原样在真空和45℃下蒸发至干以获得深褐色固体。将所获得的固体用二乙醚(15.0V)洗涤，过滤并干燥，得到呈橙黄色固体(6.0g粗制物)。图2所显示的化合物7通过¹H NMR、液相色谱和质谱得以证实。

步骤5：N-{2-[(5-{[(3Z)-5-氟-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-3-亚基]甲基}-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基)甲酰胺基]乙基}-3-[2-(2-丙氧基乙氧基)乙氧基]丙酰胺(化合物9)的合成：

在0-5℃下，向3-[2-(2-丙氧基乙氧基)乙氧基]丙酸(8)(5.95g，1.0当量)的DMF(10.0V)溶液中添加DIPEA(8.40mL，2.0当量)、EDC.HCl(6.90g，1.5当量)、HOBT(0.65g，0.2当量)、N-(2-氨基乙基)-5-{[(3Z)-5-氟-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-3-亚基]甲基}-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物7)(11.0g，1.0当量)和DMAP(0.294g，0.1当量)。将反应在室温下搅拌3小时。通过TLC(含10％ MeOH的DCM)监测反应进程。反应混合物用水(20.0V)稀释，搅拌10分钟，以形成褐色沉淀并过滤。将所获得的固体通过反相柱色谱法纯化，获得呈橙色固体的N,N-二去乙基舒尼替尼酰胺叠氮化物(5.2g，37％收率)。化合物9通过¹HNMR、液相色谱和质谱得以证实。

树枝状体上经由不可裂解的醚键来合成树枝状体缀合物

合成以构建双官能树枝状体开始。在第3.5代树枝状体，使用在一端具有胺且在另一端具有己炔的聚乙二醇(PEG)连接基引入7个炔烃官能团，以产生在表面上具有7个炔烃臂和57个羟基的第4代双官能树枝状体(图3中的化合物1)。树枝状体的结构通过1H NMR光谱学得以证实。

合成了可点击二去乙基舒尼替尼类似物(图3中的化合物2，AVT-4517)，包括二去乙基舒尼替尼、三个乙二醇(PEG3)间隔基以及末端叠氮化物，以参与与树枝状体表面上炔烃基团的点击反应。活性剂化合物2使用如图2所显示和以上所描述的5步合成来制造。

AVT-4517(图3中的化合物2)最终通过铜(I)催化的炔烃-叠氮化物点击化学与具有己炔基团的双官能树枝状体(图3中的化合物1)反应，得到具有图1所显示的完整结构的D-4517.2(图3中的化合物3)。在类似物与树枝状体缀合之后，D-4517.2通过切向流过滤(TFF)进行纯化，以移除任何杂质并能够纯化为最终制剂。

D-4517.2缀合物的¹H-NMR分析

产物D-4517.2的形成通过¹H NMR得以证实。缀合物的¹H NMR光谱清楚地显示了与树枝状体、药物以及与其连接的连接基相对应的峰，并且通过借助于质子积分法比较这些峰来计算载药量。当在氘代DMSO中记录光谱时，来自树枝状体的内部酰胺质子存在于δ8.5-7.5ppm之间。这些酰胺峰是其余峰的参考标准。来自药物的-NH峰出现在δ13.6和10.8ppm处。存在来自药物的4个质子以及一个三唑质子，该三唑质子在点击反应后形成，与内部酰胺峰合并，并且在δ8.5-7.5ppm之间。另外，紧挨氟基团的舒尼替尼的2个芳族质子出现在δ6.95-6.85ppm处。当NMR溶剂从氘代DMSO转换为CD₃OD时，观察到δ7.7ppm处的尖锐三唑峰，这是点击转化的特征峰。在点击后，紧挨叠氮化物存在的CH₂被向下屏蔽，并且可以在δ4.4ppm处观察到。NMR还用于定量与羟基树枝状体缀合的药物分子的数量。通过比较树枝状体内部酰胺质子与药物质子的质子，通过质子积分法计算载药量。用于评估D-4517.2纯度的HPLC分析

使用HPLC来评价树枝状体药物缀合物、中间体和药物连接基的纯度。通过HPLC，最终缀合物纯度>99％。在HPLC中，树枝状体G4-OH和树枝状体己炔中间体在210nm通道处可见，并且二去乙基舒尼替尼在430nm处可见。化合物2的保留时间为约16.9分钟，但一旦疏水性药物分子连接到树枝状体上，最终缀合物的峰向右移动并达到约27分钟，这证实了疏水性药物与树枝状体结构的连接。一旦药物连接到树枝状体上，在210nm(树枝状体吸收波长)和430nm(药物吸收波长)通道处均可观察到与其相对应的峰，这进一步证实了产物的形成。树枝状体缀合物的载药量为约12.6％重量/重量，这相当于每个树枝状体分子连接有7个药物分子。

尺寸和ζ电势

使用Zetasizer Nano ZS仪器来测定D-4517.2的尺寸和ζ电势分布。对于尺寸测量，通过使树枝状体溶解于去离子水(18.2Ω)中以制成最终浓度为0.5mg/mL的溶液来制备样品。然后，使溶液通过0.2μm注射器过滤器(Pall Corporation，0.2μm HT Tuffryn膜)直接过滤到池中(UV透明一次性比色皿，尺寸：12.5×12.5×45mm)。对于ζ电势测量，使用以上所提及的程序在10mM NaCl中以0.2mg/mL的浓度制备样品。Malvern ZetasizerNanoseries一次性折叠毛细管池用于测量。DD-4517的尺寸为5.5±0.5nm，并且ζ电势略为正(+5.4±0.4mV)。

尺寸排阻色谱多角度激光散射(SEC-MALS)

D-4517.2的摩尔质量将通过尺寸排阻色谱多角度激光散射(SEC-MALS)进行测定。

结果

D-4517对VEGFR2具有纳摩尔亲和力，并且不需要释放活性药物AVT-4517。为了进一步提高缀合物在生理条件下的稳定性并进一步减少药物从缀合物的释放(如D-4517缓冲液和血浆稳定性研究中所观察)，将树枝状体表面上的可裂解酯键用不可裂解键替代，如结构D-4517.2中所展示(图1)。在D-4517.2的结构中不存在可裂解键。

D-4517.2是第4代羟基封端的PAMAM树枝状体的共价缀合物，其含有乙二胺(EDA)核、酰胺基胺重复单元[CH₂CH₂CONHCH₂CH₂N])，以及64个羟基端基(化学式：C₆₂₂H₁₁₈₄N₁₈₆O₁₈₈)，其中二去乙基舒尼替尼类似物(AVT-4517)通过高效点击化学方法与树枝状体缀合。第4代羟基PAMAM树枝状体是单分散的，并且以高组成纯度(>95％)产生。为了制备D-4517.2，树枝状体上64个羟基中的七个经修饰以连接AVT-4517(总质量的约12.6％)。

人类、小鼠和大鼠血浆中的稳定性研究

在生理条件下评价了树枝状体二去乙基舒尼替尼缀合物D-4517和D-4517.2在人类、小鼠和大鼠血浆中的体外稳定性。结果呈现于图4中。与D4517(在人类血浆中释放2％(重量百分比)，并且在大鼠血浆中释放4％(重量百分比))相比，D4517.2的血浆稳定性得到显著改善。在48小时，在所有三种血浆中，从树枝状体药物缀合物中释放出少于0.5％的药物(按重量计)。

结合亲和力

评价了D-4517和D-4517.2的激酶比较结合亲和力，并且结果呈现于表1中。

表1.树枝状体缀合物D-4517和D-4517.2结合测定研究

化合物名称	基因符号	改性剂	Kd(nM)
				D4517	VEGFR2	＝	27
D4517	VEGFR1	＝	1100
				D4517	CSF1R	＝	82
D4517	KIT	＝	3.4
				D4517	PDGFRA	＝	16
D4517	PDGFRB	＝	11
				D-4517.2	CSF1R	＝	41
D-4517.2	VEGFR1	＝	890
				D-4517.2	KIT	＝	3
D-4517.2	PDGFRA	＝	11
				D-4517.2	PDGFRB	＝	7.5
D-4517.2	VEGFR2	＝	14

在所有测试的测定中，D-4517.2的IC50结果低于D-4517，这指示D4517.2与酪氨酸激酶受体之间的结合更强。

实施例2.N-乙酰基-L-半胱氨酸经由不可裂解键的缀合

合成了经由不可裂解连接基与N-乙酰基-L-半胱氨酸缀合的树枝状体。树枝状体/N-乙酰基-半胱氨酸缀合物的不可释放(或不可裂解)形式的合成途径显示于图5中。如所显示，N-乙酰基-L-半胱氨酸经由不可裂解键与羟基封端的PAMAM树枝状体缀合，以在给药后在体内最小化释放游离N-乙酰基-半胱氨酸。与可释放或可裂解形式的树枝状体/N-乙酰基-半胱氨酸复合物相比，不可释放形式的树枝状体/N-乙酰基-半胱氨酸复合物提供了增强的治疗功效。

实施例3.靶向剂经由不可裂解键的缀合

评估了基于三触角型GalNAc的羟基树枝状体以位点特异性方式将药物靶向并递送至肝细胞。已显示，在非酒精性脂肪肝炎的STAM模型中，表面GalNAc糖对ASGPR产生多价结合效应，从而允许树枝状体在体内选择性地靶向并内化到肝细胞内。

β-GalNAc-三触角型-PEG3-叠氮化物(AB3结构单元)的合成路线显示于图6中。试剂和条件：(i)三氟甲磺酸钪，DCE，3小时，80℃，(ii)炔丙基溴，甲苯，氢氧化钠，水，TBAB，(iii)吡啶，亚硫酰氯，氯仿，65℃，2小时；(iv)四丁基硫酸氢铵，50％ NaOH，16小时，室温；(v)(iii)CuSO₄.5H₂O、抗坏血酸钠、THF、水，10小时；(vi)DMF，四丁基碘化铵，NaN₃，80℃，5小时；(vii)甲醇钠，无水甲醇，30℃，3小时。

制备了三触角型结构单元，其中将三个β-GALNAc-PEG3叠氮化物分子接枝到炔丙基化季戊四醇结构单元上，以得到AB₃型正交结构单元。在含三氟甲磺酸钪的二氯乙烷的存在下，合成以β-D-GalNAc五乙酸酯(1，图6)与2-[2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基]乙-1-醇(2)的糖基化反应开始，得到全乙酰化β-GalNAc-PEG3-叠氮化物(3)。另一方面，在含氢氧化钠和四丁基溴化铵的DMSO的存在下，根据文献方法，将季戊四醇4用3个炔丙基臂选择性修饰，得到三炔丙基季戊四醇(5)。使用含氢氧化钠和TBAB的DMSO，使化合物(5)上剩余的一个羟基与双氯四乙二醇(7)反应，得到中间体化合物(8)。在下一合成步骤中，使用常规CuAAC点击反应条件(五水硫酸铜(II)和抗坏血酸钠于THF:水中)，将全乙酰化β-GalNAc-PEG3-叠氮化物用AB₃结构单元(8)点击，得到化合物化合物(9)。点击反应的成功通过¹H NMR、HRMS和HPLC得以证实。在¹H NMR中，观察到7.9ppm处三唑的特征性尖锐单峰。其它特征峰是2.0-1.74ppm之间的乙酸盐峰、5.2-3.2ppm的GalNAc质子以及7.78ppm处GALNAC的NH。在下一合成步骤中，在含叠氮化钠和四丁基碘化铵的DMF的存在下，通过亲核取代将化合物(9)的末端氯基团交换为叠氮化物，得到化合物(10)。最后一步是使用zemplen条件进行酯交换，其中反应使用甲醇钠在甲醇中执行，得到脱乙酰化β-GalNAc-三触角型-PEG3叠氮化物(11)结构单元。

反应的成功完成通过¹H NMR证实，其中对应于O-乙酸盐的峰完全消失，并且所有糖质子均向高场偏移。使用¹H NMR、HPLC和HRMS对整个合成序列进行表征，以证实所期望的化合物。

如实施例1和2中所述制备了树枝状体-β-GalNAc缀合物。

实施例4.PEG-炔烃官能化PAMAM-G4-OH的制备.

PAMAM G4-OH-炔烃_7-8以多步法产生。该过程已成功地扩大规模，以提供1kg和0.5kg批量的该材料。

开发了聚(酰氨基胺)第4代羟基封端的树枝状体(PAMAM-G4-OH)的制造方法，用于靶向试剂/药物递送应用。PAMAM G4-OH的叠氮化物修饰被用来使用叠氮化物-炔烃环加成(点击)缀合技术实现试剂的缀合。一种PAMAM G4-OH合成途径遵循不同的PAMAM树枝状体制备策略。该过程的最后一步是添加乙醇胺和PEG-炔烃胺，从而导致具有56-57个醇官能团和7-8个PEG-炔烃官能团的G4树枝状体。

分析方法

对于更高世代PAMAM树枝状体(≥G4)，开发了多种分析方法。在下面描述了每种分析方法的汇总。

UPLC方法(ASHV001O)

使用改良的文献方法(表1-1)，开发了用于解析每个PAMAM树枝状体世代和起始材料的反相UPLC方法。参见Cason,C.A.等人,Journal of Nanomaterials.2008,1-7.DOI:10.1155/2008/456082。

表1-1.UPLC条件汇总

反相柱	ACE Excel 3Super C18，LC柱，50×3×3μm
		柱温	40℃
流动相A	H₂O(0.05％TFA)
		流动相B	MeCN(0.05％TFA)
流量	1.27mL/分钟
		观察波长	210nm

该方法使用由合成获得的PAMAM核以及获自Sigma Aldrich,Inc的G0-G4样品进行开发。最后两代的样品保留时间和UPLC报告汇总提供于下表2中。

表2.PAMAM世代和起始材料的保留时间和UPLC报告

化合物	保留时间(分钟)	相对保留时间(分钟)
			PAMAM G3.5	2.805	1.462
PAMAM G4-OH-炔烃_7.8	1.918	1

SEC-MALLS方法

采用文献Mullen,D.G.等人,Macromolecules.2012,45,5316-5320中描述的方法，开发了采用多角度激光光散射(MALLS)和示差折光率(dRI)检测器的尺寸排阻色谱法。该方法的汇总提供于附录中。使用该方法能够解析每个PAMAM世代峰。最终2代的洗脱时间以及所测量的多分散度的汇总提供于下表3中。

表3.用于PAMAM树枝状体的SEC洗脱时间

定量¹H NMR

参考Sigma Aldrich级内标，执行定量¹H NMR光谱学。这些方法被用于量化PAMAM树枝状体溶液和分离的产物的效力。该方法进一步被用于测定PEG-炔烃材料(2-[2-(炔丙氧基)乙氧基]乙胺)的质量。1,3,5-三甲氧基苯用作内标，以d⁴-甲醇为溶剂。

PEG-炔烃臂的平均数量的分析方案

PAMAM G4-OH用PEG-炔烃的官能化程度的测定经由¹H-NMR光谱使用由两种方法(表示为方法A和方法B)提供的平均值进行确定。每种方法利用了用PAMAM-G4-64-OH观察到的积分以及用100％ PEG-炔烃官能化PAMAM-G4-64-PEG-炔烃观察到的理论积分。这两种材料相应的积分提供于下表4和表5中。

表4.PAMAM-G4-64-OH的质子化学位移和积分

质子	化学位移(ppm)	质子的#
			H_a	2.38ppm	248H
H_b	2.58ppm	124H
			H_c	2.79ppm	248H
H_d	3.26-3.33ppm	248H
			H_e	3.61ppm	128H

表5.PAMAM-G4-64-PEG-炔烃的质子化学位移和积分(理论)

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方法A.方法A基于在与100％炔烃官能化PAMAM-G4的H_m积分相比时，质子H_m的实际积分百分比的计算。这是通过将质子H_a和H_f对应的信号的积分设定为其理论值248来确定的(对于PAMAM-G4-64-OH和PAMAM-G4-64-PEG-炔烃两者，该信号预期为248)。该方法的示例性计算参照于图7中。

方法B.方法B基于来自乙醇胺末端臂的质子H_e相对于来自PEG-炔烃末端臂的质子H_m的比率的计算。由于乙醇胺臂的质子H_e与PEG-炔烃末端臂的H_k和H_l质子重叠，必须减去这些PEG-炔烃质子的积分(使用H_m质子的积分确定积分)。然后可以使用该比率来计算炔烃官能化臂的平均数量。示例性计算参照于图8中。

制造汇总

PAMAM核合成

PAMAM树枝状体核合成按照先前文献中所描述进行，如以上的路线所显示。在0℃下，将乙二胺的甲醇溶液滴加到过量丙烯酸甲酯的甲醇溶液中。在1小时后，将溶液温热至室温并搅拌24小时。然后将溶液在20℃下减压浓缩。然后将所得的油状物用MeOH(1L)稀释并再次减压浓缩。该过程再重复一次，从而以定量收率(17.5克)提供呈无色油状物的PAMAM核。¹H-NMR和GC分析显示以高纯度产生PAMAM核。该过程的指标汇总显示于下表6中。

表6.实验AA08-055的指标汇总

粗产物(g)	304.5g
		产物效力(％重量/重量)	55.12％
测定收率(g)	167.8克
		测定收率(％)	97％

完全代胺封端的PAMAM树枝状体的合成

完全代PAMAM树枝状体遵循文献条件进行制备。在这些条件下，将乙二胺溶液(86％重量/重量于甲醇中，在PAMAM起始材料上每酯25当量)在氮气气氛下冷却至0℃。然后，在2小时的过程内添加半代PAMAM树枝状体或PAMAM核的溶液(10％重量/重量于甲醇中)。在添加之后，将反应混合物在0℃下搅拌1小时。在此时间之后，将反应混合物温热至20℃并允许搅拌5天。然后通过真空蒸馏浓缩粗产物，使粗产物的温度维持<25℃。然后通过遵循以下2种方法中的1种移除残余的乙二胺：方法1：1.将粗产物残余物溶解于甲醇(2.5体积)中。2.用甲苯(24体积)稀释。3.通过真空蒸馏浓缩。该过程重复4次或者直至通过GC和¹H-NMR分析不再在粗产物或馏出物中检测到残余乙二胺。方法2：1.将粗产物残余物溶解于戊醇中，以生成10重量％的树枝状体溶液。2.使用刮膜蒸发器通过蒸馏浓缩。该过程重复>4x或者直至通过GC和¹H-NMR分析不再在粗产物或馏出物中检测到残余乙二胺。方法1用于PAMAM G0和G1，方法2用于PAMAM G2和G3。每种完全代胺封端的PAMAM树枝状体合成期间的结果汇总提供于下表7。

表7.完全代胺封端的PAMAM树枝状体的结果汇总

实验	PAMAM世代	收率(g)	收率(％)	多分散度(M_w/M_n)
					AA08-063	PAMAM G0	213.80	99.7	1.015
HA04-029	PAMAM G1	563	95	1.012
					HA04-036	PAMAM G2.0	652	*-	1.056
AA08-086	PAMAM G3.0	1322	95	1.14

半代酯封端的PAMAM树枝状体的合成

半代PAMAM树枝状体遵循文献条件进行制备。在这些条件下，将丙烯酸甲酯溶液(55％重量/重量于甲醇中，树枝状体起始材料上每个末端胺3当量)在氮气气氛下冷却至0℃。然后，在2小时的过程内，添加完全代PAMAM树枝状体的溶液(10％重量/重量于甲醇中)。在添加后，将反应混合物在0℃下搅拌1小时。在此时间之后，将反应混合物温热至20℃并允许搅拌3-4天，直至粗产物的¹H-NMR分析指示起始材料完全转化。然后通过真空蒸馏浓缩粗产物，使粗产物的温度维持<25℃。然后通过真空蒸馏经由与甲醇共沸移除3x来移除残余的丙烯酸甲酯(通过¹H-NMR、GC和/或UPLC分析指示丙烯酸甲酯的移除)。每种半代PAMAM树枝状体的合成期间的结果汇总显示于下表8中。

表8.半代酯封端的PAMAM树枝状体的结果汇总

实验	PAMAM世代	收率(g)	收率(％)	多分散度(M_w/M_n)
					HA04-024	PAMAM G0.5	499.4	定量	1.020
HA04-33	PAMAM G1.5	1025	91	1.020
					HA04-64	PAMAM G2.5	1215	定量	1.034
AA10-062	PAMAM G3.5	2360	99	1.1

PAMAM G4-OH-炔烃7–8产生

向夹套容器中装入摩尔比为3:1的乙醇胺和PEG-炔烃，然后装入甲醇。将容器用N₂(g)吹扫并冷却至0℃。然后在2小时内将含10重量％的PAMAM G3.5的甲醇添加到反应器中。然后将溶液在0℃下搅拌4小时，然后温热至20℃。然后允许该溶液在20℃下搅拌6天。在此时间之后，将溶液用水稀释至一半浓度，并通过超滤经受纯化，从而提供呈水溶液的产物。对于生产批量AA10-065，然后使用较大孔径的膜，使水溶液经受纯化以移除二聚体杂质。然后使用10倍渗滤体积的甲醇，通过超滤将溶剂交换为甲醇。每种放大结果的汇总提供于下表9中。

表9.实验AA10-007的结果汇总

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结论

成功地扩大了规模并开发了用于产生>1kg量的PAMAM G4-OH-炔烃_7-8的方法。该方法以500克和2-kg规模进行，从而产生了可再现质量和收率的产物。这展示出产物质量可以提高，并且可以在下游通过超滤纯化期间移除二聚体杂质。这允许移除在批次AA10-065途径的上游所产生的显著量的二聚体杂质。

实验

PAMAM核合成

PAMAM树枝状体核合成按照先前文献中所描述进行。在0℃下，将乙二胺的甲醇溶液滴加到过量丙烯酸甲酯的甲醇溶液中。在1小时后，将溶液温热至室温并搅拌24小时。然后将溶液在20℃下减压浓缩。然后将所得的油状物用MeOH(1L)稀释并再次减压浓缩。该过程再重复一次，从而以定量收率(17.5克)提供呈无色油状物的PAMAM核。¹H-NMR和GC分析显示以高纯度产生PAMAM核。该过程的指标汇总显示于表10中。

表10.实验AA08-055的指标汇总

PAMAM G0.0合成

在氮气气氛下，向5L夹套容器中装入乙二胺的甲醇溶液。将反应溶液冷却至0℃，并在2小时的过程内添加PAMAM核的溶液。在添加后，允许反应混合物在该温度下搅拌1小时。在此时间之后，将反应混合物温热至室温并搅拌5天。然后，通过真空蒸馏移除甲醇和显著部分的乙二胺，同时使反应器内容物维持低于25℃。然后，通过与21体积的1:9甲醇/甲苯共沸蒸馏5x移除残余乙二胺。通过¹H-NMR分析证实完全移除。在完全移除乙二胺之后，通过共沸蒸馏3x，从3体积的甲醇中移除残余甲苯，从而提供600克的PAMAM G0.0作为35.61％重量/重量的甲醇溶液。

PAMAM G0.5合成

表11.

向10L反应器中装入丙烯酸甲酯的甲醇溶液，并在2小时的时段内在0℃下添加PAMAM核的甲醇溶液。将溶液在0℃下再搅拌一小时，然后温热至20℃并搅拌3天。通过对残余伯胺的Kaiser测试确定反应完成，并通过¹H-NMR光谱进一步验证。然后通过减压蒸馏移除挥发物，且反应器夹套控制于20℃。然后通过与甲醇(3体积)共沸移除2x来移除残余的丙烯酸甲酯，之后粗制材料的GC和NMR显示丙烯酸甲酯的完全移除。获得了2359.9g粘性油状物的产物。定量¹H-NMR分析显示油状物为21.16重量％PAMAM G0.5，从而提供499.35g的测定收率(100.11％收率)。该过程的指标汇总显示于表12中。

表12.实验HA04-24的过程指标

PAMAM G1.0合成

表13.

将20L夹套反应器用N₂(g)吹扫并装入乙二胺溶液。在约2小时的时段内，在0℃下滴加PAMAM G0.5溶液。在0℃下再搅拌约4小时之后，使溶液温热至20℃并搅拌5天，之后¹H-NMR分析显示PAMAM G0.5的甲酯完全消耗。减压移除挥发物，且反应器夹套控制于20℃。然后通过与1:9MeOH/甲苯(23体积)共沸蒸馏7x来移除残余乙二胺。通过粗制反应混合物的NMR来监测乙二胺的移除。然后，在减压下以3x浓度从甲醇中移除残余的甲苯。产物作为油状物获得。定量H-NMR分析显示油状物为23.5重量％PAMAM G1.0，从而提供563.03g的测定收率(95％收率)。该过程的指标汇总显示于表14中。

表14.实验HA04-29的过程指标

PAMAM G1.5合成

表15.

向10L反应器中装入丙烯酸甲酯的甲醇溶液，并在2小时的时段内在0℃下添加PAMAM G1.0的甲醇溶液。将溶液在0℃下再搅拌两小时，然后温热至20℃并搅拌3天。通过¹H-NMR光谱验证反应完成。然后通过减压蒸馏移除挥发物，且反应器夹套控制于20℃。然后通过用甲醇(3体积)共沸移除3次来移除残余的丙烯酸甲酯，之后粗制材料的GC和NMR显示丙烯酸甲酯的完全移除。获得了2359.9g粘性油状物的产物。定量¹H-NMR分析显示油状物为32.89重量％PAMAM G1.5，从而提供1025g的测定收率(91％收率)。该过程的指标汇总显示于下表16中。

表16.实验HA04-33的过程指标

PAMAM G2.0合成

表17.

将夹套反应器用N₂(g)吹扫并装入乙二胺溶液。在约2小时的时段内，在0℃下滴加PAMAM G1.5溶液。在0℃下再搅拌约4小时之后，使溶液温热至20℃并搅拌5天，之后¹H-NMR分析显示PAMAM G1.5的甲酯完全消耗。减压移除挥发物。然后通过蒸馏移除残余乙二胺。通过粗制反应混合物的NMR来监测乙二胺的移除。产物作为油状物获得。定量H-NMR分析显示油状物为9.5重量％PAMAM G2.0。该过程的指标汇总显示于表18中。

表18.实验HA04-36的过程指标

PAMAM G2.5合成

表19.

向20L夹套反应器中装入丙烯酸甲酯的甲醇溶液，并在2小时的时段内在0℃下添加PAMAM G2.0的甲醇溶液。将溶液在0℃下再搅拌两小时，然后温热至20℃并搅拌4天。通过¹H-NMR光谱验证反应完成。然后通过减压蒸馏移除挥发物，且反应器夹套控制于20℃。然后通过用甲醇(3体积)共沸移除3次来移除残余的丙烯酸甲酯，之后粗制材料的GC和NMR显示丙烯酸甲酯的完全移除。获得了7610g粘性油状物的产物。定量¹H-NMR分析显示油状物为15.97重量％PAMAM G2.5，从而提供1215.3g的测定收率(100％收率)。该过程的指标汇总显示于表20中。

表20.实验HA04-64的过程指标

PAMAM G3.0合成

表21.

将夹套反应器用N₂(g)吹扫并装入乙二胺溶液。在约2小时的时段内，在0℃下经由隔膜泵添加PAMAM G2.5溶液(HA04-064)。在0℃下再搅拌约4小时之后，使溶液温热至20℃并搅拌5天，之后¹H-NMR分析显示PAMAM G2.5的甲酯完全消耗。减压移除挥发物。然后，使用刮膜蒸发器，通过蒸馏移除残余乙二胺。通过粗制反应混合物的NMR来监测乙二胺的移除。产物作为油状物获得。定量H-NMR分析显示油状物为21.5重量％PAMAM G3.0。该过程的指标汇总显示于表22中。

表22.实验AA08-086的过程指标

PAMAM G3.5合成

表23.

向20L夹套反应器中装入丙烯酸甲酯的甲醇溶液，并在2小时的时段内在0℃下添加PAMAM G3.0(AA08-086)的甲醇溶液。将溶液在0℃下再搅拌两小时，然后温热至20℃并搅拌4天。通过¹H-NMR光谱验证反应完成。然后通过减压蒸馏移除挥发物，且反应器夹套控制于20℃。然后通过用甲醇(3体积)共沸移除3次来移除残余的丙烯酸甲酯，之后粗制材料的GC和NMR显示丙烯酸甲酯的完全移除。获得了7610g粘性油状物的产物。定量¹H-NMR分析显示油状物为15.97重量％PAMAM G2.5，从而提供2360g的测定收率(99％收率)。该过程的指标汇总显示于表24中。

表24.实验AA10-062的过程指标

PAMAM G4-OH-炔烃_7–8合成——批次AA10-064

表25.

将夹套反应器用N₂(g)吹扫并装入乙二胺溶液。在约2小时的时段内，在0℃下经由隔膜泵添加PAMAM G3.5溶液。在0℃下再搅拌约4小时后，将溶液温热至20℃并搅拌6天。在此时间之后，用H₂O(11kg)稀释溶液。然后，通过采用具有5kDa MWCO的再生纤维素膜超滤，使溶液经受纯化，从而提供呈水溶液的产物，其通过¹H-NMR显示乙醇胺和PEG-炔烃被完全移除。经由连续渗滤使溶剂更换为甲醇，以提供作为甲醇溶液的产物PAMAM G4(3230.9g)。定量H-NMR分析显示该溶液为16.6重量％PAMAM G4-OH-炔烃_7-8(93％收率)。该过程的指标汇总显示于表26中。

表26.AA10-064结果汇总

批号	AA10-064
		PAMAM G3.5来源	Dendritech
甲醇溶液质量(kg)	3.25
		效力(％重量/重量)	16.6％重量/重量
收率	539.5g
		收率(％)	93％
多分散度(M_w/M_n)	1.030
		PEG-炔烃臂的平均值#	7.8
-OH/-NH比率	0.39
		残余乙醇胺(干基，GC)	0.2％
残余PEG-炔烃(干基，GC)	0.02％

PAMAM G4-OH-炔烃_7–8合成——批次AA10-065

将夹套反应器用N₂(g)吹扫并装入乙二胺溶液。在约2小时的时段内，在0℃下经由隔膜泵添加PAMAM G3.5溶液。在0℃下再搅拌约4小时后，将溶液温热至20℃并搅拌6天。在此时间之后，用H₂O(42kg)稀释溶液。然后，通过采用具有5kDa MWCO的再生纤维素膜超滤，使溶液经受纯化，从而提供呈水溶液的产物，其通过¹H-NMR显示乙醇胺和PEG-炔烃被完全移除。然后，通过使用具有30kDa MWCO的再生纤维素膜超滤来移除二聚体杂质，其中所期望的产物通过该再生纤维素膜以进行渗透。然后经由连续渗滤使溶剂更换为甲醇，以提供作为甲醇溶液的产物PAMAM G4(8205g)。定量H-NMR分析显示该溶液为19.5重量％PAMAM G4-OH-炔烃_7-8(71.8％收率)。该过程的指标汇总显示于下表27中。

表27.AA10-065的结果汇总

批号	AA10-065
		PAMAM G3.5来源	Snapdragon(批次AA10-062)
甲醇溶液质量(kg)	8.21kg
		效力(％重量/重量)	19.5％重量/重量
收率	1.6kg
		收率(％)	71.8％
多分散度(M_w/M_n)	1.045
		PEG-炔烃臂的平均值#	7.8
-OH/-NH比率	ND
		残余乙醇胺(干基，GC)	0.4％
残余PEG-炔烃(干基，GC)	0.01％

分析方法

UPLC方法(ASHV001O)

A.试剂

1.水：HPLC级

2.乙腈：HPLC级

3.三氟乙酸：HPLC级

B.溶液

1.稀释剂：MiliQ水

2.流动相：

A.含0.05％三氟乙酸的水

B.含0.05％三氟乙酸的乙腈

3.样品溶液：目标浓度为大约2mg/mL的样品溶液。

4.空白：稀释剂。

C.色谱条件

柱：ACE Excel 3Super C18，LC柱，50×3×3μm

温度：40℃

流量：1.27mL/分钟

检测：A：210nm下的UV；4.8nm带宽

B：220nm下的UV；4.8nm带宽

进样体积：10μL

运行时间：12.3分钟

梯度

/>

D.计算

A_b＝空白的总面积计数

A_c＝样品注射中组分的面积计数

T_a＝样品注射的总面积

该方法还可用于采用校准标准的测定分析的重量百分比。典型标准浓度为0.025为1.0mg/mL。

GC方法(ASV003F)

A.色谱条件

柱： Agilent CP-Volamine(部件编号CP7447)

入口温度： 250℃

入口压力： 14.3psi

入口总流量： 37.3mL/分钟

入口分流比： 10:1

进样体积： 5μL

柱流量： 3.1mL/分钟

FID温度： 300℃

FID H₂流量： 40.0mL/分钟

FID空气流量： 360.0mL/分钟

FID补偿流： 25mL/分钟

FID点火补偿： 0.5pA

运行时间： 20.33分钟

烘箱温度梯度

速率(℃/分钟)	温度(℃)	保持时间	运行时间
				N/A	65	4	4
15	100	3	9.33
				30	250	6	20.33

D.计算

A_b＝空白的总面积计数

A_c＝样品注射中组分的面积计数

R_a＝组分的响应因子

C_s＝样品浓度

为了使用该方法测定杂质，分别制备了14.928和10.332mg/mL乙醇胺和PEG炔烃于异丙醇中的标准品，并注射到GC上。这给出了约6.88分钟的乙醇胺保留时间，而PEG炔烃具有14.1分钟的保留时间。这些溶液以1:1比率组合。该组合溶液被用作使用异丙醇进行1/2系列稀释的储备溶液，从而分别达到0.007和0.005mg的乙醇胺和PEG炔烃的浓度。校准结果显示于下面。

用于乙醇胺和PEG-炔烃的GC校准数据

乙醇胺的校准曲线用于计算样品中乙醇胺的浓度。PEG-炔烃的信号低于LOD，因此校准中达到的最低值被报告为浓度。

SEC-MALLS方法

A.试剂

1.水：HPLC级

2.柠檬酸：ACS试剂，≥99.5％

B.溶液

1.稀释剂：水，0.1M柠檬酸，pH 2.7

2.流动相：

A.水，0.1M柠檬酸，pH 2.7

3.样品溶液：目标浓度为大约2mg/mL的样品溶液。

4.空白：稀释剂。

C.色谱条件

柱：TosoHaas TSK-Gel Guard PHW 0662(75mm×7.5mm，12μm)、G2000 PW 05761(300mm×7.5mm，10μm，)、G 3000PW 05762(300mm×7.5mm，10μm，/>)、G4000PW(300mm×7.5mm，17μm，/>)

温度：25℃

流量：1mL/分钟

检测：A：Wyatt Optilab示差折光率检测器，在658nm下操作B：Wyatt miniDAWN多角度激光光散射检测器，采用120

mW激光器，在658nm下操作

进样体积：100μL

运行时间：40分钟

实施例4参考文献：

1.Cason,C.A等人,Journal of Nanomaterials.2008,1-7.DOI:10.1155/2008/456082

2.Mullen,D.G.等人,Macromolecules.2012,45,5316-5320.

实施例5.PEG-炔烃官能化PAMAM-G4-OH的制备

开发出了设置具有3个PEG-炔烃(PAMAM G4-OH-炔烃₃)和10个PEG-炔烃(PAMAMG4-OH-炔烃₃)连接基臂的G4.0 PAMAM树枝状体的方法。这些官能化树枝状体通过调整PEG-炔烃相对于乙醇胺的化学计量产生，以考虑反应性的差异。该过程已成功地扩大规模，以提供40g的PAMAM G4-OH-炔烃₃以及160g的PAMAM G4.0-50-OH-10-PEG-炔烃。在这两种情况下，获得了具有约1.03的低多分散度的产物。

此外，开发了聚(酰氨基胺)第4代羟基封端的树枝状体(PAMAM-G4-OH)的制造方法，用于靶向药物递送应用。PAMAM G4-OH的叠氮化物修饰被用来使用叠氮化物-炔烃环加成(点击)缀合技术实现活性物的缀合。开发了用于制备具有平均七个炔烃官能团的PAMAMG4的方法。当前PAMAM G4-OH合成途径遵循不同的PAMAM树枝状体制备策略。该过程的最后一步是添加乙醇胺，从而导致具有64个醇官能团的G4树枝状体。对于缀合，开发了制备两种G4-OH类似物的方法，其中n分别大约等于3和10。

分析方法

由于PAMAM树枝状体的复杂性，产物的质量属性采用多种分析方法进行表征，包括SEC-MALLS(多分散度)、¹H NMR(特性、效力、平均连接基荷载)、¹³C NMR(特性)、GC(残余乙醇胺和PEG炔烃单体)。

SEC-MALLS方法

采用文献中描述的方法，开发了采用多角度激光光散射(MALLS)和示差折光率(dRI)检测器的尺寸排阻色谱法。参见Mullen,D.G.等人,Macromolecules.2012,45,5316-5320。使用该方法能够解析每个PAMAM世代峰。每世代的洗脱时间和所测量的多分散度的汇总提供于表28中。

表28.用于PAMAM树枝状体的SEC洗脱时间

定量¹H NMR

方法开发

PAMAM第3.5代源材料

使用前生成了PAMAM第3.5代的甲醇溶液(29.4％重量/重量)。该输入材料的质量属性提供于表29中。

表29.PAMAM G3.5试剂溶液产物信息

在较高胺过量条件下PAMAM G3.5与PEG-炔烃/乙醇胺的反应

进行了一系列实验，探索在较高胺过量条件(1600当量总胺，每个末端酯25当量)下PEG-炔烃/乙醇胺摩尔比的变化。首先，将PEG-炔烃和乙醇胺(约1600当量)的甲醇溶液冷却至0℃。然后，在2小时内滴加PAMAM G3.5(10％重量/重量)的甲醇溶液。在0℃下再搅拌2小时后，将溶液温热至20℃并搅拌6天。为了纯化，通过TFF处理该材料，从而提供产物的水溶液。为了分析，取出一部分溶液，并然后经由真空移除水，通过¹H-NMR对其进行分析。遵循相同的方案，设置了三个其它反应来探索PEG-炔烃/乙醇胺的比率以达到10和14条炔烃链。当前正在进行一项类似的研究，以优化平均3个炔烃臂官能化程度的条件。

PEG-炔烃臂的平均数量的分析方案

PAMAM G4-OH用PEG-炔烃的官能化程度的测定经由¹H-NMR光谱使用由两种方法(表示为方法A和方法B)提供的平均值进行确定。每种方法利用了用PAMAM-G4-64-OH观察到的积分以及用100％ PEG-炔烃官能化PAMAM-G4-64-PEG-炔烃观察到的理论积分。这两种材料相应的积分提供于表30和表31中。

表30.PAMAM-G4-64-OH的质子化学位移和积分

表31.PAMAM-G4-64-PEG-炔烃的质子化学位移和积分(理论)

质子	化学位移(ppm)	质子的#
			H_f	2.38ppm	258H
H_g	2.58ppm	124H
			H_h	2.79ppm	248H
H_i	3.27ppm	120H
			H_j	3.37ppm	128H
H_k	3.55ppm	128H
			H_l	3.65ppm(多重峰)	256H
H_m	4.2ppm	128H

不同PEG-炔烃/乙醇胺比率的实验结果

方法A和B用于计算实验DP07-51中所得的树枝状体上PEG-炔烃臂的平均数量，其中总胺相对于树枝状体为1600当量(相对于末端基团为25当量)。这些结果汇总于表32中。PEG-炔烃臂的平均数量与PEG-炔烃相对于总胺含量的摩尔％之间的关系显示于图10中。

表32.使用1600当量胺将PAMAM G-4进行PEG-炔烃官能化的结果汇总

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该数据与所获得的先前开发数据相结合并且列于表33中并绘制于图11中。这些数据进一步验证了PEG-炔烃臂的平均数量与PEG-炔烃相对于总胺含量的摩尔％之间的可再现线性相关性。

表33.所有实验的使用1600当量胺将PAMAM G-4进行PEG-炔烃官能化的结果汇总

LNB#	摩尔％炔烃	平均炔烃臂
			AA08-88-2	8.33	2.33
AA08-88-1	10.00	2.93
			AA08-88-3	20.00	6.62
DP07-51-1	25.00	7.78
			AA08-88-3	26.30	8.03
DP07-51-2	35.00	11.6
			DP07-51-3	40.00	13.28
DP07-51-4	45.00	15.38

对于n＝3而言不同PEG-炔烃/乙醇胺比率的实验结果

进行了一系列实验以微调PEG-炔烃/乙醇胺摩尔比，从而调出目标平均连接基n＝3(1600当量总胺，每个末端酯25当量)。首先，将PEG-炔烃和乙醇胺(约1600当量)的甲醇溶液冷却至0℃。然后，在2小时内滴加PAMAM G3.5(10％重量/重量)的甲醇溶液。在0℃下再搅拌2小时后，将溶液温热至20℃并搅拌6天。为了纯化，通过TFF处理该材料，从而提供产物的水溶液。为了分析，取出一部分溶液，并然后经由真空移除水，通过¹H-NMR对其进行分析。

这些结果汇总于表34中。PEG-炔烃臂的平均数量与PEG-炔烃相对于总胺含量的摩尔％之间的关系显示于下图12中。基于线性方程，对于n＝3，需要9.6摩尔％PEG-炔烃，并且对于n＝10，需要31摩尔％。

表34.使用1600当量胺将PAMAM G-4进行PEG-炔烃官能化的结果汇总

表35.对于DP07-60和DP07-51使用1600当量胺将PAMAM G-4进行PEG-炔烃官能化的结果汇总

实验	摩尔％炔烃	平均炔烃臂
			DP07-60-1	8	2.61
DP07-60-2	9	2.85
			DP07-60-3	10	3.15
DP07-60-4	11	3.51

5g验证运行以产生具有n＝3个炔烃臂的PAMAM G4.0(DP07-74-1)

实验DP07-74-1以5克规模进行，以允许进一步验证先前经由小规模反应筛选建立的PEG-炔烃/乙醇胺的比率。如前所解释，反应设置为采用9.6摩尔％的PEG-炔烃，并且在20℃下搅拌6天。将粗制反应物料用水稀释2x，并使用5kDa超滤膜经由TFF纯化以移除杂质。在该纯化之后，通过冻干移除水。定量¹H-NMR分析指示该材料为97％重量/重量的PAMAM G-4材料，调节的分离收率为74％。该过程的分析汇总提供于下表36中。与先前的工作范围相比降低的分离收率目前尚未得到理解，可能只是由TFF纯化期间的机械损失所致。

表36.DP07-74-1的具有3个炔烃臂的PAMAM G4.0的分析汇总

5g验证以产生具有n＝10个炔烃臂的PAMAM G4.0(DP07-68-1)

实验DP07-68-1以5克规模进行，以允许进一步验证从合成n＝10个炔烃臂的反应筛选所获得的PEG-炔烃/乙醇胺的比率。如前所解释，反应设置为采用31摩尔％的PEG-炔烃，并且在20℃下搅拌6天。将粗制反应物料用水稀释2x，并使用5kDa超滤膜经由TFF纯化以移除杂质。在该纯化之后，通过冻干移除水。该过程的分析汇总提供于表37中。如以上，与先前开发工作相比降低的分离收率被认为是由过滤设备中的机械损失所致。

表37.DP07-68-1的具有10个炔烃臂的PAMAM G4.0的分析汇总

参数	值
		分离收率(g)	3.8g
效力(¹H-NMR，％重量/重量)	100％
		分离收率(％)	63％
多分散度(M_w/M_n)	1.038
		平均值#炔烃臂	10.03(方法A：10.34，以及方法B：9.72)

放大生产具有3.0炔烃臂的40克PAMAM G4.0(DP07-82-1)

基于5g验证运行结果，该方法进一步放大以生产40g用n＝3个PEG-炔烃基团官能化的树枝状体。向1升夹套容器中装入摩尔比为9.42:1的乙醇胺和PEG-炔烃，然后装入甲醇。将容器用N₂(g)吹扫并冷却至0℃。然后在2小时内将含10重量％的PAMAM G3.5的甲醇添加到反应器中。然后将溶液在0℃下搅拌2小时，然后温热至20℃。然后允许该溶液在20℃下搅拌6天。在此时间之后，将溶液用水稀释至一半浓度，并通过超滤经受纯化，从而提供呈水溶液的产物。将溶液冷冻，并通过冻干移除水，从而提供呈浅黄色泡沫状物的产物。取较小的泡沫样品进行¹H-NMR和¹³C-NMR分析，以使用上述方法A和B测定炔烃官能化程度。剩余的固体溶解于甲醇中，以生成15.3重量％甲醇溶液(批号DP07-82-2)。放大结果的汇总提供于表38中。

表38.实验DP07-82-1(批号DP07-82-2)结果的汇总

放大生产具有10.0炔烃臂的160克PAMAM G4.0(DP07-85-1)

相似地，如上所述，将PAMAM G4.0的合成放大以生产用n＝10个PEG-炔烃官能化的树枝状体。向5升夹套容器中装入摩尔比为2.23:1的乙醇胺和PEG-炔烃，然后装入甲醇。将容器用N₂(g)吹扫并冷却至0℃。然后在2小时内将含10重量％的PAMAM G3.5的甲醇添加到反应器中。然后将溶液在0℃下搅拌2小时，然后温热至20℃。然后允许该溶液在20℃下搅拌6天。在此时间之后，将溶液用水稀释至一半浓度，并通过超滤经受纯化。将溶液冷冻，并通过冻干移除水，从而提供呈浅黄色泡沫状物的产物。取较小的泡沫样品进行¹H-NMR和¹³C-NMR分析，以使用实施例4中所述的方法A和B测定炔烃官能化程度。剩余的固体溶解于甲醇中，以生成15.3重量％甲醇溶液(批号DP07-85-3)。放大结果的汇总提供于表39中。

表39.实验DP07-85-1(批号DP07-85-3)结果的汇总

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结论

成功开发了用于产生>40g量的PAMAM G4-OH-炔烃₃以及>224g的PAMAM G4-OH-炔烃₁₀的方法。产品质量属性在预期控制范围之内。

实验

PAMAM G4-OH-炔烃₃合成——批次DP07-82-2

向1升夹套容器中装入摩尔比为9.42:1的乙醇胺和PEG-炔烃(Ambeed，批号100902012-00223 0BFY)，然后装入甲醇。将容器用N₂(g)吹扫并冷却至0℃。然后在2小时内将含10重量％的PAMAM G3.5(Dentritech，批号0121-02-E3.5-LD-A)的甲醇添加到反应器中。然后将溶液在0℃下搅拌2小时，然后温热至20℃。然后允许该溶液在20℃下搅拌6天。在此时间之后，将溶液用水稀释至一半浓度，并通过超滤经受纯化，从而提供呈水溶液的产物。将溶液冷冻，并通过冻干移除水，从而提供呈浅黄色泡沫状物的产物。取较小的泡沫样品进行¹H-NMR和¹³C-NMR分析，以使用实施例4中所述的方法A和B测定炔烃官能化程度。剩余的固体溶解于甲醇中，以生成15.3重量％甲醇溶液(批号DP07-82-2)。放大结果的汇总提供于表40中。

表40.实验DP07-82-1(批号DP07-82-2)结果的汇总

PAMAMG4-OH-炔烃₁₀合成——批次DP07-85-3

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向5升夹套容器中装入摩尔比为2.23:1的乙醇胺和PEG-炔烃(Ambeed，批号100902012-00223 0BFY)，然后装入甲醇。将容器用N₂(g)吹扫并冷却至0℃。然后在2小时内将含10重量％的PAMAM G3.5(Dentritech，批号0121-02-E3.5-LD-A)的甲醇添加到反应器中。然后将溶液在0℃下搅拌2小时，然后温热至20℃。然后允许该溶液在20℃下搅拌6天。在此时间之后，将溶液用水稀释至一半浓度，并通过超滤经受纯化。将溶液冷冻，并通过冻干移除水，从而提供呈浅黄色泡沫状物的产物。取较小的泡沫样品进行¹H-NMR和¹³C-NMR分析，以使用上述方法A和B测定炔烃官能化程度。剩余的固体溶解于甲醇中，以生成15.3重量％甲醇溶液(批号DP07-85-3)。放大结果的汇总提供于表41中。

表41.实验DP07-85-1(批号DP07-85-3)结果的汇总

批号	DP07-85-3
		PAMAM G4甲醇溶液(g)	1469.6
效力(％重量/重量)	15.3％
		收率(g)	224.85
收率(％)	98％
		多分散度(M_w/M_n)	1.032
PEG-炔烃臂的平均值#(得自方法A和B)	10.01
		-OH/-NH比率	0.34
残余乙醇胺(干基，GC)	0.1％
		残余PEG-炔烃(干基，GC)	0.1％
¹³C-NMR

分析方法

GC方法(ASV003F)

A.色谱条件

柱： Agilent CP-Volamine(部件编号CP7447)

入口温度： 250℃

入口压力： 14.3psi

入口总流量： 37.3mL/分钟

入口分流比： 10:1

进样体积： 5μL

柱流量： 3.1mL/分钟

FID温度： 300℃

FID H₂流量： 40.0mL/分钟

FID空气流量： 360.0mL/分钟

FID补偿流： 25mL/分钟

FID点火补偿： 0.5pA

运行时间： 20.33分钟

烘箱温度梯度

D.计算

A_b＝空白的总面积计数

A_c＝样品注射中组分的面积计数

R_a＝组分的响应因子

C_s＝样品浓度

为了使用该方法测定杂质，分别制备了14.928和10.332 mg/mL乙醇胺和PEG炔烃于异丙醇中的标准品，并注射到GC上。这给出了约6.88分钟的乙醇胺保留时间，而PEG炔烃具有14.1分钟的保留时间。这些溶液以1:1比率组合。该组合溶液被用作使用异丙醇进行1/2系列稀释的储备溶液，从而分别达到0.007和0.005 mg的乙醇胺和PEG炔烃的浓度。校准结果显示于下表42中。

表42.用于乙醇胺和PEG-炔烃的GC校准数据

使用来自上述系列稀释的数据，制作校准曲线(图13)。

SEC-MALLS方法

A.试剂

1.水：HPLC级

2.柠檬酸：ACS试剂，≥99.5％

B.溶液

1.稀释剂：水，0.1M柠檬酸，pH 2.7

2.流动相：

A.水，0.1M柠檬酸，pH 2.7

3.样品溶液：目标浓度为大约2mg/mL的样品溶液。

4.空白：稀释剂。

C.色谱条件

温度：25℃

流量：1mL/分钟

检测：A：Wyatt Optilab示差折光率检测器，在658nm下操作B：Wyatt miniDAWN多角度激光光散射检测器，采用120mW激光器，在658nm下操作

进样体积：100μL

运行时间：40分钟

实施例6.与药物缀合的示例性PAMAM树枝状体

以下路线1-19显示了用连接至官能团R的连接基对PAMAM树枝状体进行官能化(例如，PAMAM羧甲基官能化树枝状体)的示例性反应，其中R是胺、炔烃、乙炔、COOH、羟基、溴、DBCO、硫醇、烯烃、醛、羟基、磺酸盐、腈。在路线1-19中，聚乙二醇(PEG)连接基可以用连接基如

n＝1-100,000个乙二醇单元、或n＝1-100,000个CH₂单元替代。路线1-19的步骤1中的示例性反应配偶体包括：其中连接基长度可以在1-100,000个CH₂和乙二醇(PEG)单元之间变化，并且连接基可以包括具有不同分子量的PEG连接基。

其它示例性连接基为：

药物连接基

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路线1.

路线2.

用于官能化树枝状体的其它类型的点击反应包括以下(路线3-19所显示)：

硫醇马来酰亚胺点击：

路线3.

四嗪连接：

路线4.

由炔烃和肟形成异噁唑：

路线5.

硫醇-炔：

路线6.

硫醇-烯：

路线7.

硫醇-迈克尔点击：

路线8.

路线9.

路线10.

路线11.

使用如下方法一锅法中一种树枝状体上的3个不同部分：

路线12.

使用如下方法一锅法中一种树枝状体上的两种药物：路线13.

一种树枝状体上的一种药物和抗体：

路线14.

一种树枝状体上的一种抗体和寡核苷酸：

路线15.

一锅法中一种树枝状体上的肽和药物：

路线16.

一锅法中一种树枝状体上的靶向肽和PROTAC：

路线17.

一种树枝状体上的药物和RNA或DNA：

路线18.

一锅法中一种树枝状体上的3种不同的药物：

路线19.

实施例7.树枝状体-PAK1抑制剂的缀合物

合成并表征与PAK1抑制剂(Frax-1036类似物)缀合的树枝状体(图56A-56C)。图56A显示了用于制备树枝状体-PAK1缀合物D4-5100(D4-Frax-1036类似物)的示例性合成路线。评价了PAK1激酶组与PAK1的结合，并且结果显示于图56A(插图表)中。图56B-56C显示D4-5100的表征结果。D4-5100通过HPLC测定为纯度>99％(图56B，顶图)，并且¹HNMR证实了6个分子的连接(图56B，底图)，且荷载测定为15％。D4-5100通过人类血浆(图56C，左图)、小鼠血浆(图56C，中间图)，以及大鼠血浆(图56C，右图)中的血浆稳定性研究进一步评价，这展示D4-5100在各种血浆源中72小时内看起来是稳定的。

实施例8.树枝状体-MEK抑制剂的缀合物

合成并表征了与MEK抑制剂(司美替尼、曲美替尼、或考比替尼)缀合的树枝状体(图57A-57T)。

图57A显示了用于制备树枝状体-司美替尼缀合物D4-5111(D4-司美替尼)的示例性合成路线。图57B-57D显示了D4-5111的表征结果。

图57E-57H显示了用于制备树枝状体-曲美替尼缀合物D4-5116(D4-曲美替尼-酰胺类似物)的示例性合成路线，以及D4-5116的表征结果。图57I显示了用于制备树枝状体-曲美替尼缀合物D4-5119(D4-曲美替尼-二硫化物类似物)的示例性合成路线，以及D4-5119的表征结果。图57J-57M显示了用于制备树枝状体-曲美替尼缀合物D4-5121(D4-曲美替尼-二硫化物)的示例性合成路线，以及D4-5121的表征结果。图57N-57P显示了用于制备树枝状体-曲美替尼缀合物D4-5124(D4-曲美替尼-酯)的示例性合成路线，以及D4-5124的表征结果。

图57Q显示了用于制备树枝状体-考比替尼缀合物D4-5123的示例性合成路线。图57R-57T显示了用于制备树枝状体-考比替尼缀合物D4-5120的示例性合成路线，以及D4-5120的表征结果。

实施例9.树枝状体-受体酪氨酸激酶抑制剂的缀合物

合成并表征了与受体酪氨酸激酶抑制剂(达沙替尼、比美替尼(R428)、度博替尼(TP-0903)、或卡博替尼)缀合的树枝状体(图58A-58T)。

图58A显示了用于制备树枝状体-达沙替尼缀合物D4-5113(D4-达沙替尼-硫醇化)的示例性合成路线。图58B-58E显示了D4-5113的表征结果。图58F-58G显示了合成的树枝状体-达沙替尼缀合物D4-4531(D4-达沙替尼酯类似物)的化学结构和表征结果。图58H显示了经由末端叠氮化物基团进行化学缀合的达沙替尼类似物的示例性化学结构。

图58I显示了用于制备树枝状体-比美替尼(R428)缀合物D4-R428的示例性合成路线。图58J-58L显示了D4-R428的表征结果。图58M显示了用于制备树枝状体-比美替尼(R428)缀合物D4-R428-硫醇化的示例性合成路线。图58N显示了D4-R428-硫醇化的表征结果。

图58O显示了用于制备树枝状体-度博替尼(TP-0903)缀合物D4-5132(D4-TP-0903类似物)的示例性合成路线。图58P显示了D4-5132的表征结果。

图58Q显示了用于制备树枝状体-卡博替尼缀合物D4-4595和D4-4598的示例性合成路线。图58R-58T显示了D4-4595和D4-4598的表征结果。

等同物和范围

在权利要求中，冠词如“一个”、“一种”和“所述”可意指一个或多于一个，除非有相反的指出或否则从上下文明显看出。如果一个、多于一个或所有的组成员存在于、用于给定的产品或过程，或以其他方式与给定的产品过程相关，则认为在组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述是满意的，除非有相反的指出或否则从上下文中明显看出。本发明包括组中恰好一个成员存在于、用于给定的产品或过程，或以其他方式与给定的产品或过程相关的实施方案。本发明包括多于一个或所有的组成员存在于、用于给定的产品或过程，或以其他方式与给定的产品或过程相关的实施方案。

此外，本发明涵盖其中来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、要素、条款和描述性术语被引入另一权利要求中的所有变型形式、组合和排列。例如，可以修改从属于另一权利要求的任何权利要求，以包括从属于同一基本权利要求的任何其他权利要求中存在的一个或多个限制。在要素以列表呈现的情况下，例如，以马库什组形式，要素的每个子组也被公开，并且可以从组中移除任何要素。应当理解，一般来讲，在本发明或本发明的各方面被称为包括特定要素和/或特征的情况下，本发明或本发明的各方面的某些实施方案由或基本上由这样的要素和/或特征组成。为了简单起见，那些实施方案在本文中并未明文具体地阐述。

如本文在说明书和权利要求书中所用，短语“和/或”应理解为意指如此结合的要素中的“任一者或两者”，即在一些情况下结合地存在而在其他情况下分离地存在的要素。与“和/或”一起列出的多个要素应当以相同的方式解释，即如此结合的要素中的“一个或多个”。除了由“和/或”条款具体标识的要素之外，可以任选地存在其他要素，无论与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当结合开放性语言如“包含”使用时，提及到的“A和/或B”在一个实施方案中可仅指A(任选地包括除B以外的要素)；在另一个实施方案中仅指B(任选地包括除A以外的要素)；在又一个实施方案中指A和B两者(任选地包括其他要素)等。

如本文在说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或者“和/或”应被解释为包括性的，即包括多个要素或要素列表中的至少一个，而且还包括多于一个，以及任选地额外未列出的项目。只有明确地相反指示术语，如“仅其中一个”或“恰好其中一个”，或者当在权利要求中使用时，“由……组成”将指包括多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般来讲，当前面是排他性术语时，如本文所用，术语“或”应仅解释为指示排他性替代形式(即，“一个或另一个但不是两个”)，如“任一”、“其中一个”、“仅其中一个”或“恰好其中一个”。当在权利要求中使用时，“基本上由……组成”应具有其在专利法领域中使用的普通含义。

如本文在说明书和权利要求书中所用，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应理解为意指选自要素列表中的任何一个或多个要素的至少一个要素，但是不必包括要素列表内具体列出的每个和每一个要素中的至少一个，并且不排除要素列表中要素的任何组合。该定义还允许除了短语“至少一个”所涉及的要素列表内具体标识的要素以外的要素可以任选地存在，无论与那些具体标识的要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等效地“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可指至少一个(任选地包括超过一个)A而不存在B(并任选地包括除B以外的要素)；在另一个实施方案中指至少一个(任选地包括超过一个)B而不存在A(并任选地包括除A以外的要素)；在又一个实施方案中指至少一个(任选地包括超过一个)A，以及至少一个(任选地包括超过一个)B(和任选地包括其它元素)；等。

还应当理解，除非明确地相反指示，否则在本文所要求保护的包括超过一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不必限于所叙述方法的步骤或动作的顺序。

在权利要求书以及上面说明书中，所有过渡性短语如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”、“由……构成”等应理解为开放性的，即，意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节(United States Patent Office Manual ofPatent Examining Procedures,Section 2111.03)所陈述，仅过渡性短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别为封闭式或半封闭式过渡性短语。应当理解，在本文件中使用开放式过渡短语(例如，“包含”)描述的实施方案在替代实施方案中也被设想为由开放式过渡短语描述的“由该特征组成”和“基本上由该特征组成”。例如，如果本申请描述“包含A和B的组合物”，则本申请还设想替代实施方案“由A和B组成的组合物”和“基本上由A和B组成的组合物”。

当给出范围时，包括端点。此外，除非另外指出或否则从上下文和本领域的普通技术人员的理解明显看出，以范围表示的值可以假定在本发明的不同实施方案中所陈述的范围内的任何特定值或子范围，至范围下限的十分之一单位，除非上下文另外明确规定。

本申请涉及各种授权的专利、公开的专利申请、期刊文章和其他出版物，所有这些以引用方式并入本文。如果任何引入的参考文献与本说明书之间存在冲突，则以本说明书为准。此外，落入现有技术内的本发明的任何特定实施方案可以从任何一个或多个权利要求中明确地排除。因为这样的实施方案被认为是本领域的普通技术人员已知的，它们可以被排除，即使本文没有明确地阐述该排除。无论是否涉及到现有技术的存在，出于任何原因，本发明的任何特定实施方案可从任何权利要求中排除。

本领域的技术人员将认识到或者能够仅仅使用常规实验确定本文所述的具体实施方案的许多等同物。本文所述的本实施方案的范围不旨在限于具体实施方式，而是如所附权利要求中所阐述的。本领域的普通技术人员将理解，在不脱离如以下权利要求所限定的本发明的精神或范围的情况下，可以对本说明书作出各种改变和修改。

本文中变量的任何定义中化学基团列表的表述包括该变量作为任何单个基团或所列基团的组合的定义。本文中变量的实施方案的表述包括作为任何单个实施方案或与任何其它实施方案的组合或其部分的实施方案。本文中实施方案的表述包括作为任何单个实施方案或与任何其它实施方案的组合或其部分的实施方案。

Claims

1.一种组合物，所述组合物包含载体以及式(I-A)的官能化树枝状体：

其中：

X为NH；

m为16至4096的整数，包括端值在内；并且

n为1至100的整数，包括端值在内，

其中所述组合物中的所述官能化树枝状体的多分散度值小于或等于1.10。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中的所述官能化树枝状体的多分散度值小于或等于1.05。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中的所述官能化树枝状体的多分散度值小于或等于1.04。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中的所述官能化树枝状体的多分散度值小于或等于1.03。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少10克的所述官能化树枝状体。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少50克的所述官能化树枝状体。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少100克的所述官能化树枝状体。

8.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少150克的所述官能化树枝状体。

9.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含10-200克的所述官能化树枝状体。

10.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含20-200克的所述官能化树枝状体。

11.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含50-200克的所述官能化树枝状体。

12.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含100-200克的所述官能化树枝状体。

13.一种合成式(I-A)的官能化树枝状体的方法：

其中：

X为NH；

m为16至4096的整数，包括端值在内；并且

n为1至100的整数，包括端值在内；

所述方法包括：

以形成式(I-A)的官能化树枝状体；

其中：

t为16至4096的整数，包括端值在内；

其中每种胺为式H₂NR¹，

14.根据权利要求13所述的方法，其中n为1。

15.根据权利要求13所述的方法，其中n为2。

16.根据权利要求13所述的方法，其中n为3。

17.根据权利要求13所述的方法，其中n为4。

18.根据权利要求13所述的方法，其中n为10。

19.根据权利要求13或16所述的方法，其中m为61。

20.根据权利要求13或18所述的方法，其中m为54。

21.根据权利要求13-20中任一项所述的方法，其中R¹的至少一个实例为任选取代的亚烷基。

22.根据权利要求13-21中任一项所述的方法，其中所述一种或多种胺的至少一个实例为式(A)的化合物：

其中：

R^1A为卤素、任选取代的酰基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、任选取代的乙炔、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、-CH(＝N)(OH)R^D1、-CN、-NO₂、-OR^D1、-N(R^D1a)₂、-SO₂OR^D1、或-SR^D1，其中R^D1独立地为氢、任选取代的酰基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、或连接到氧原子时的氧保护基、或连接到硫原子时的硫保护基；

其中每次出现的R^D1a独立地为氢、任选取代的酰基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、或氮保护基；或者任选地，R^D1a的两个实例与它们的间隔原子一起形成取代或未取代的杂环或者取代或未取代的杂芳基环；

W为-O-或-CH₂-，如化合价允许；

p为0、1、2、或3；

q为1-100,000之间的整数，包括端值在内；并且

r为0、1、2、3、4、5、或6。

23.根据权利要求22所述的方法，其中W为-O-。

24.根据权利要求22或23所述的方法，其中W为-O-，并且q为1-100,000之间的整数，包括端值在内。

25.根据权利要求22所述的方法，其中W为-CH₂-，并且q为1-10,000之间的整数，包括端值在内。

26.根据权利要求13-25中任一项所述的方法，其中所述一种或多种胺的至少一个实例为下式的PEG-炔烃：其中q为1、2、3、4、5、或6。

27.根据权利要求13-26中任一项所述的方法，其中所述一种或多种胺的至少一个实例为下式的PEG-炔烃：

28.根据权利要求13-27中任一项所述的方法，其中所述一种或多种胺的至少一个实例为乙醇胺。

29.根据权利要求13-28中任一项所述的方法，其中所述式(II-A)的树枝状体与乙醇胺和下式的PEG-炔烃两者进行反应：

30.根据权利要求26-29中任一项所述的方法，其中所述乙醇胺与所述PEG-炔烃的比率为9.42:1或2.2:1。

31.根据权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述PEG-炔烃与所述式(II-A)的树枝状体的比率为大约150:1。

32.根据权利要求26-31中任一项所述的方法，其中所述PEG-炔烃与所述式(II-A)的树枝状体的比率为大约150:1；乙醇胺与所述PEG-炔烃的比率为9.42:1；并且n为3。

33.根据权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述PEG-炔烃与所述式(II-A)的树枝状体的比率为大约500:1。

34.根据权利要求26-30或33中任一项所述的方法，其中所述PEG-炔烃与所述式(II-A)的树枝状体的比率为大约500:1；所述乙醇胺与所述PEG-炔烃的比率为2.2:1；并且n为10。

35.根据权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述PEG-炔烃与所述式(II-A)的树枝状体的比率为495:1。

36.根据权利要求13-35中任一项所述的方法，其中D为PAMAM。

37.根据权利要求13-36中任一项所述的方法，其中所述式(II-A)的树枝状体为下式：

38.根据权利要求13-37中任一项所述的方法，其中所述式(I-A)的官能化树枝状体的多分散度值为约1.00至约1.05。

39.根据权利要求13-38中任一项所述的方法，其中所述式(I-A)的官能化树枝状体的多分散度值为约1.03。

40.根据权利要求13-39中任一项所述的方法，其中所述合适的条件包括质子溶剂以及在大约19℃至大约23℃下反应。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述质子溶剂为醇。

42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述质子溶剂为甲醇。

43.根据权利要求13-42中任一项所述的方法，其中所述合适的条件包括在大约20℃至大约22℃下反应。

44.根据权利要求13-43中任一项所述的方法，其中所述合适的条件包括甲醇以及在大约20℃下反应。

45.根据权利要求13-44中任一项所述的方法，其中所述式(I-A)的官能化树枝状体为下式：

46.根据权利要求13-45中任一项所述的方法，其还包括与式(B)的化合物进行反应：

其中：

R²为卤素、任选取代的酰基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的乙酰基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、-N₃、-CH(＝N)(OH)R^D1、-CN、-NO₂、-OR^D1、-N(R^D1a)₂、-SO₂OR^D1、或-SR^D1，其中R^D1独立地为氢、任选取代的酰基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、或连接到氧原子时的氧保护基、或连接到硫原子时的硫保护基；

前提条件是R^1A和R²为反应配偶体；

L^B为亚烷基连接基，其中所述烃链的一个或多个链原子独立地被酰胺、酯、异羟肟酸、醚、碳酸酯、氨基甲酸酯、腙、硫醚、硫酯、二硫化物、原酸酯、尿烷、或肟部分、或环状部分替代；并且

T为治疗剂。

47.根据权利要求13-46中任一项所述的方法，其中R^1A和R²为生物缀合反应配偶体。

48.根据权利要求13-47中任一项所述的方法，其中R^1A和R²为点击反应配偶体。

49.根据权利要求13-48中任一项所述的方法，其中R^1A和R²为来自表A的点击反应配偶体。

50.根据权利要求13-49中任一项所述的方法，其中R^1A和R²中的一个为-N₃，并且R^1A和R²中的另一个为二苯并环辛炔。

51.根据权利要求13-49中任一项所述的方法，其中R^1A和R²中的一个为并且R^1A和R²中的另一个为-SH。

52.根据权利要求13-49中任一项所述的方法，其中R^1A和R²中的一个为四嗪，并且R^1A和R²中的另一个为反式环辛烯。

53.根据权利要求13-49中任一项所述的方法，其中R^1A和R²中的一个为并且R^1A和R²中的另一个为/>

54.根据权利要求13-49中任一项所述的方法，其中R^1A和R²中的一个为-SH，并且R^1A和R²中的另一个为

55.根据权利要求13-49中任一项所述的方法，其中R^1A和R²中的一个为-SH，并且R^1A和R²中的另一个为

56.根据权利要求13-49中任一项所述的方法，其中R^1A和R²中的一个为-SH，并且R^1A和R²中的另一个为

57.根据权利要求46-56中任一项所述的方法，其中T的至少一个实例为蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)药物。

58.根据权利要求46-56中任一项所述的方法，其中T的至少一个实例为生物治疗剂。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述生物治疗剂为肽、核酸、或抗体。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述核酸为寡核苷酸、DNA、或RNA。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述RNA为siRNA。

62.根据权利要求46-61中任一项所述的方法，其中T的每个实例是不同的。

63.一种下式的树枝状体：

64.一种式(I)的树枝状体缀合物：

其中：

X为O或NH；

Y²选自仲酰胺、叔酰胺、磺酰胺、仲氨基甲酸酯、叔氨基甲酸酯、碳酸酯、脲、甲醇、二硫化物、腙、酰肼、醚、羰基，以及它们的组合；

Z为治疗剂或显像剂；

L为包含聚合物以及至少一个选自1,2,3-三唑基、4,5-二氢-1,2,3-三唑基、异噁唑基、4,5-二氢异噁唑基，以及1,4-二氢哒嗪基的部分的连接基；

m为16至4096的整数，包括端值在内；并且

n为1至100的整数，包括端值在内。

65.根据权利要求64所述的树枝状体缀合物，其中Y¹在生理条件下是不可水解的。

66.根据权利要求64或65所述的树枝状体缀合物，其中Y¹为任选取代的C_1-20亚烷基。

67.根据权利要求64-66中任一项所述的树枝状体缀合物，其中Y¹为未取代的C_1-10亚烷基。

68.根据权利要求64-67中任一项所述的树枝状体缀合物，其中Y²选自–CONH–、–CONR^A–、–SO₂NR^A–、–OCONH–、–NHCOO–、-OCONR^A-、–NR^ACOO–、-OC(＝O)O-、-NHCONH-、-NR^ACONH-、-NHCONR^A-、-NRCONR^A-、-CHOH-、-CR^AOH-、-C(＝O)-，以及-C(＝O)R^A-，其中R^A为任选取代的烷基、任选取代的芳基、或任选取代的杂环基。

69.根据权利要求64-68中任一项所述的树枝状体缀合物，其中所述聚合物为聚合物多元醇、多肽、或未取代的烷基链。

70.根据权利要求64-68中任一项所述的树枝状体缀合物，其中所述聚合物为选自聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇，以及聚乙烯醇的聚合物多元醇。

71.根据权利要求64-68中任一项所述的树枝状体缀合物，其中所述聚合物为包含至少2个且多至25个氨基酸的多肽。

72.根据权利要求64-68中任一项所述的树枝状体缀合物，其中所述聚合物为未取代的C_2-30烷基链。

73.根据权利要求64-72中任一项所述的树枝状体缀合物，其还包含至少一种与所述树枝状体缀合的靶向剂。

74.根据权利要求73所述的树枝状体缀合物，其中所述靶向剂为三触角型-N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。

75.根据权利要求64-74中任一项所述的树枝状体缀合物，其中所述治疗剂选自血管紧张素II受体阻断剂、法尼醇X受体激动剂、死亡受体5激动剂、钠葡萄糖协同转运蛋白2型抑制剂、溶血磷脂酸1受体拮抗剂、内皮素-A受体拮抗剂、PPARδ激动剂、AT1受体拮抗剂、CCR5/CCR2拮抗剂、抗纤维化剂、抗炎剂、抗氧化剂、STING激动剂、CSF1R抑制剂、AXL抑制剂、c-Met抑制剂、PARP抑制剂、受体酪氨酸激酶抑制剂、MEK抑制剂、PAK1抑制剂、谷氨酰胺酶抑制剂、TIE II拮抗剂、CXCR2抑制剂、CD73抑制剂、精氨酸酶抑制剂、PI3K抑制剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、SHP2抑制剂、化学治疗剂、STING拮抗剂，以及JAK1抑制剂。

76.根据权利要求64-75中任一项所述的树枝状体缀合物，其中所述治疗剂为MEK抑制剂。

77.根据权利要求76所述的树枝状体缀合物，其中所述MEK抑制剂选自曲美替尼、考比替尼、贝美替尼、司美替尼、PD325901、PD035901、PD032901，以及TAK-733。

78.根据权利要求64-75中任一项所述的树枝状体缀合物，其中所述治疗剂为受体酪氨酸激酶抑制剂。

79.根据权利要求78所述的树枝状体缀合物，其中所述受体酪氨酸激酶抑制剂选自舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、凡德他尼、阿西替尼、西地尼布、瓦他拉尼、达沙替尼、比美替尼(R428)、度博替尼(TP-0903)、尼达尼布、卡博替尼，以及莫特塞尼。

80.根据权利要求64-75中任一项所述的树枝状体缀合物，其中所述治疗剂为PAK1抑制剂。

81.根据权利要求80所述的树枝状体缀合物，其中所述PAK1抑制剂为Frax-1036(6-[2-氯-4-(6-甲基-2-吡嗪基)苯基]-8-乙基-2-[[2-(1-甲基-4-哌啶基)乙基]氨基]-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮)。

82.根据权利要求64-81中任一项所述的树枝状体缀合物，其中所述显像剂选自染料、荧光染料、近红外染料、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)显像剂、正电子发射断层扫描(PET)显像剂、磁共振成像(MRI)造影剂，以及放射性核素。

83.根据权利要求64-82中任一项所述的树枝状体缀合物，其中m与(m+n)的比率为至少0.5。

84.根据权利要求64-83中任一项所述的树枝状体缀合物，其中m与(m+n)的比率为约0.50至约0.99。

85.一种式(II)的树枝状体缀合物：

其中：

X的每个实例独立地为O或NH；

Y¹的每个实例独立地为任选取代的亚烷基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、或共价键；

Y²的每个实例独立地选自仲酰胺、叔酰胺、磺酰胺、仲氨基甲酸酯、叔氨基甲酸酯、碳酸酯、脲、甲醇、二硫化物、腙、酰肼、醚、羰基，以及它们的组合；

Z¹和Z²独立地为治疗剂、靶向剂、或显像剂，前提条件是Z¹和Z²是不同的；

L¹和L²独立地为包含聚合物以及至少一个选自1,2,3-三唑基、4,5-二氢-1,2,3-三唑基、异噁唑基、4,5-二氢异噁唑基，以及1,4-二氢哒嗪基的部分的连接基；

m为16至4096的整数，包括端值在内；并且

n的每个实例独立地为1至100的整数，包括端值在内。

86.根据权利要求85所述的树枝状体缀合物，其中Z¹和Z²为不同的治疗剂。

87.根据权利要求86所述的树枝状体缀合物，其还包含至少一种与所述树枝状体缀合的靶向剂。

88.根据权利要求85所述的树枝状体缀合物，其中Z¹为治疗剂，并且Z²为靶向剂。

89.根据权利要求85所述的树枝状体缀合物，其中Z¹为显像剂，并且Z²为靶向剂。

90.根据权利要求87-89中任一项所述的树枝状体缀合物，其中所述靶向剂为三触角型-N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。

91.根据权利要求85-90中任一项所述的树枝状体缀合物，其中Y¹的每个实例在生理条件下是不可水解的。

92.根据权利要求85-91中任一项所述的树枝状体缀合物，其中Y¹的每个实例为任选取代的C_1-20亚烷基。

93.根据权利要求85-92中任一项所述的树枝状体缀合物，其中Y¹的每个实例为未取代的C_1-10亚烷基。

94.根据权利要求85-93中任一项所述的树枝状体缀合物，其中Y²的每个实例选自–CONH–、–CONR^A–、–SO₂NR^A–、–OCONH–、-NHCOO-、-OCONR^A-、–NR^ACOO–、-OC(＝O)O-、-NHCONH-、-NR^ACONH-、-NHCONR^A-、-NRCONR^A-、-CHOH-、-CR^AOH-、-C(＝O)-，以及-C(＝O)R^A-，其中R^A为任选取代的烷基、任选取代的芳基、或任选取代的杂环基。

95.根据权利要求85-94中任一项所述的树枝状体缀合物，其中所述聚合物为聚合物多元醇、多肽、或未取代的烷基链。

96.根据权利要求85-94中任一项所述的树枝状体缀合物，其中所述聚合物为选自聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇，以及聚乙烯醇的聚合物多元醇。

97.根据权利要求85-94中任一项所述的树枝状体缀合物，其中所述聚合物为包含至少2个且多至25个氨基酸的多肽。

98.根据权利要求85-94中任一项所述的树枝状体缀合物，其中所述聚合物为未取代的C_2-30烷基链。

99.根据权利要求85-98中任一项所述的树枝状体缀合物，其中所述治疗剂选自血管紧张素II受体阻断剂、法尼醇X受体激动剂、死亡受体5激动剂、钠葡萄糖协同转运蛋白2型抑制剂、溶血磷脂酸1受体拮抗剂、内皮素-A受体拮抗剂、PPARδ激动剂、AT1受体拮抗剂、CCR5/CCR2拮抗剂、抗纤维化剂、抗炎剂、抗氧化剂、STING激动剂、CSF1R抑制剂、AXL抑制剂、c-Met抑制剂、PARP抑制剂、受体酪氨酸激酶抑制剂、MEK抑制剂、PAK1抑制剂、谷氨酰胺酶抑制剂、TIE II拮抗剂、CXCR2抑制剂、CD73抑制剂、精氨酸酶抑制剂、PI3K抑制剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、SHP2抑制剂、化学治疗剂、STING拮抗剂，以及JAK1抑制剂。

100.根据权利要求85-99中任一项所述的树枝状体缀合物，其中至少一种所述治疗剂为MEK抑制剂。

101.根据权利要求100所述的树枝状体缀合物，其中所述MEK抑制剂选自曲美替尼、考比替尼、贝美替尼、司美替尼、PD325901、PD035901、PD032901，以及TAK-733。

102.根据权利要求85-99中任一项所述的树枝状体缀合物，其中至少一种所述治疗剂为受体酪氨酸激酶抑制剂。

103.根据权利要求102所述的树枝状体缀合物，其中所述受体酪氨酸激酶抑制剂选自舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、凡德他尼、阿西替尼、西地尼布、瓦他拉尼、达沙替尼、比美替尼(R428)、度博替尼(TP-0903)、尼达尼布、卡博替尼，以及莫特塞尼。

104.根据权利要求85-99中任一项所述的树枝状体缀合物，其中至少一种所述治疗剂为PAK1抑制剂。

105.根据权利要求104所述的树枝状体缀合物，其中所述PAK1抑制剂为Frax-1036(6-[2-氯-4-(6-甲基-2-吡嗪基)苯基]-8-乙基-2-[[2-(1-甲基-4-哌啶基)乙基]氨基]-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮)。

106.根据权利要求85-105中任一项所述的树枝状体缀合物，其中所述显像剂选自染料、荧光染料、近红外染料、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)显像剂、正电子发射断层扫描(PET)显像剂、磁共振成像(MRI)造影剂以及放射性核素。

107.根据权利要求85-106中任一项所述的树枝状体缀合物，其中m与(m+n)的比率为至少0.5。

108.根据权利要求85-107中任一项所述的树枝状体缀合物，其中m与(m+n)的比率为约0.50至约0.99。

109.一种在对其有需要的受试者中治疗或成像脑部或中枢神经系统的疾病或障碍的方法，所述方法包括：

以有效地治疗或成像所述受试者的脑部或中枢神经系统的疾病或障碍的量向所述受试者给药包含根据权利要求64-84或85-108中任一项所述的树枝状体缀合物的组合物。

110.根据权利要求109所述的方法，其中所述树枝状体缀合物被所述受试者的脑部或中枢神经系统中的活化小胶质细胞和/或活化巨噬细胞选择性地吸收。

111.根据权利要求110所述的方法，其中所述活化巨噬细胞是中枢神经系统的驻留型巨噬细胞。

112.根据权利要求109-111中任一项所述的方法，其中所述树枝状体缀合物穿过所述受试者的血脑屏障。

113.根据权利要求109-112中任一项所述的方法，其中所述疾病或障碍是脑部或中枢神经系统的肿瘤。

114.根据权利要求113所述的方法，其中所述树枝状体缀合物被所述受试者中的肿瘤的肿瘤相关巨噬细胞选择性地吸收。

115.根据权利要求113或114所述的方法，其中所述肿瘤是脑癌或中枢神经系统癌症。

116.根据权利要求113-115中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是选自瘤形成和增生的脑癌。

117.根据权利要求113-115中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是选自神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经管细胞瘤、神经节瘤以及神经鞘瘤的中枢神经系统的癌症。

118.根据权利要求113或114所述的方法，其中所述肿瘤是与神经纤维瘤病相关联的良性或恶性肿瘤。

119.根据权利要求118所述的方法，其中所述受试者患有或怀疑患有1型神经纤维瘤病(NF1)。

120.根据权利要求109-119中任一项所述的方法，其中所述树枝状体缀合物不与靶向部分缀合。

121.根据权利要求109-120中任一项所述的方法，其中所述组合物全身给药于所述受试者。

122.根据权利要求109-120中任一项所述的方法，其中所述组合物经静脉内给药于所述受试者。

123.根据权利要求109-120中任一项所述的方法，其中所述组合物经口服给药于所述受试者。

124.根据权利要求109-123中任一项所述的方法，其中所述树枝状体缀合物包含治疗剂，并且其中所述组合物的治疗指数相对于在不存在所述树枝状体的情况下包含所述治疗剂的组合物而言有所增加。

125.一种在对其有需要的受试者中治疗或成像眼部疾病或障碍的方法，所述方法包括：

以有效地治疗或成像所述受试者的眼部疾病或障碍的量向所述受试者给药包含根据权利要求64-84或85-108中任一项所述的树枝状体缀合物的组合物。

126.根据权利要求125所述的方法，其中所述树枝状体缀合物被所述受试者的眼部中的活化小胶质细胞和/或活化巨噬细胞选择性地吸收。

127.根据权利要求125或126所述的方法，其中所述树枝状体缀合物穿过所述受试者的血-视网膜屏障。

128.根据权利要求125-127中任一项所述的方法，其中所述树枝状体缀合物不与靶向部分缀合。

129.根据权利要求125-128中任一项所述的方法，其中所述组合物全身给药于所述受试者。

130.根据权利要求125-128中任一项所述的方法，其中所述组合物经静脉内给药于所述受试者。

131.根据权利要求125-128中任一项所述的方法，其中所述组合物经口服给药于所述受试者。

132.根据权利要求125-131中任一项所述的方法，其中所述树枝状体缀合物包含治疗剂，并且其中所述组合物的治疗指数相对于在不存在所述树枝状体的情况下包含所述治疗剂的组合物而言有所增加。

133.一种在对其有需要的受试者中治疗或成像增殖性疾病的方法，所述方法包括：

以有效地治疗或成像所述受试者的增殖性疾病的量向所述受试者给药包含根据权利要求64-84或85-108中任一项所述的树枝状体缀合物的组合物。

134.根据权利要求133所述的方法，其中所述增殖性疾病是神经纤维瘤病。

135.根据权利要求133或134所述的方法，其中所述增殖性疾病选自1型神经纤维瘤病(NF1)、2型神经纤维瘤病(NF2)，以及神经鞘瘤病。

136.根据权利要求133-135中任一项所述的方法，其中所述增殖性疾病为NF1。

137.根据权利要求133-136中任一项所述的方法，其中所述树枝状体缀合物不与靶向部分缀合。

138.根据权利要求133-137中任一项所述的方法，其中所述组合物全身给药于所述受试者。

139.根据权利要求133-137中任一项所述的方法，其中所述组合物经静脉内给药于所述受试者。

140.根据权利要求133-137中任一项所述的方法，其中所述组合物经口服给药于所述受试者。

141.根据权利要求133-140中任一项所述的方法，其中所述树枝状体缀合物包含治疗剂，并且其中所述组合物的治疗指数相对于在不存在所述树枝状体的情况下包含所述治疗剂的组合物而言有所增加。

142.根据权利要求141所述的方法，其中所述治疗剂为MEK抑制剂。

143.根据权利要求142所述的方法，其中所述MEK抑制剂选自曲美替尼、考比替尼、贝美替尼、司美替尼、PD325901、PD035901、PD032901，以及TAK-733。

144.根据权利要求141所述的方法，其中所述治疗剂为受体酪氨酸激酶抑制剂。

145.根据权利要求144所述的方法，其中所述受体酪氨酸激酶抑制剂选自舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、凡德他尼、阿西替尼、西地尼布、瓦他拉尼、达沙替尼、比美替尼(R428)、度博替尼(TP-0903)、尼达尼布、卡博替尼，以及莫特塞尼。

146.根据权利要求141所述的方法，其中所述治疗剂为PAK1抑制剂。

147.根据权利要求146所述的方法，其中所述PAK1抑制剂为Frax-1036(6-[2-氯-4-(6-甲基-2-吡嗪基)苯基]-8-乙基-2-[[2-(1-甲基-4-哌啶基)乙基]氨基]-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮)。

148.一种治疗性化合物的组合物，其包含通过末端醚或酰胺键与治疗剂缀合的树枝状体，其中所述树枝状体包含任选地被所述治疗剂取代的高密度末端羟基，其中所述治疗性化合物为10-20质量％的所述治疗剂。

149.根据权利要求148所述的组合物，其中所述树枝状体上至少50％的末端位点包含末端羟基。

150.根据权利要求148或149所述的组合物，其中所述树枝状体上至少50％且多至99％的末端位点包含末端羟基。

151.根据权利要求148-150中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂的水溶性相对于在不存在所述树枝状体的情况下包含所述治疗剂的未缀合化合物而言有所增加。

152.根据权利要求151所述的组合物，其中所述水溶性相对于所述未缀合的化合物而言增加至少10％。

153.根据权利要求151或152所述的组合物，其中所述水溶性相对于所述未缀合的化合物而言增加约10％至约100％。

154.根据权利要求151-153中任一项所述的组合物，其中所述水溶性相对于所述未缀合的化合物而言增加至少约两倍。

155.根据权利要求151-154中任一项所述的组合物，其中所述水溶性相对于所述未缀合的化合物而言增加约两倍至约十倍。

156.根据权利要求151-155中任一项所述的组合物，其中所述水溶性是生理条件下的溶解度。

157.根据权利要求151-156中任一项所述的组合物，其中所述水溶性是在pH为约7.0至约8.0的水中的溶解度。

158.根据权利要求151-157中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂以生理条件下所述未缀合的化合物不溶解的浓度存在。

159.根据权利要求148-158中任一项所述的组合物，其中所述树枝状体选自聚(酰氨基胺)(PAMAM)聚合物、聚丙胺(POPAM)聚合物、聚乙烯亚胺聚合物、聚赖氨酸聚合物、聚酯聚合物、蝶烯聚合物、脂族聚(醚)聚合物、芳族聚醚聚合物、2,2-双(羟甲基)丙酸(双-MPA)聚合物，以及它们的组合。

160.根据权利要求148-159中任一项所述的组合物，其中所述末端醚或酰胺键通过连接基与所述治疗剂缀合。

161.根据权利要求160所述的组合物，其中所述连接基包含聚合物。

162.根据权利要求161所述的组合物，其中所述聚合物为聚合物多元醇、多肽、或未取代的烷基链。

163.根据权利要求161所述的组合物，其中所述聚合物为选自聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇，以及聚乙烯醇的聚合物多元醇。

164.根据权利要求161所述的组合物，其中所述聚合物为包含至少2个且多至25个氨基酸的多肽。

165.根据权利要求161所述的组合物，其中所述聚合物为未取代的C_2-30烷基链。

166.根据权利要求160-165中任一项所述的组合物，其中所述连接基包含至少一个选自1,2,3-三唑基、4,5-二氢-1,2,3-三唑基、异噁唑基、4,5-二氢异噁唑基，以及1,4-二氢哒嗪基的部分。

167.根据权利要求160-166中任一项所述的组合物，其中所述连接基在生理条件下是不可水解的。

168.根据权利要求148-167中任一项所述的组合物，其还包含至少一种与所述树枝状体缀合的靶向剂。

169.根据权利要求168所述的组合物，其中所述靶向剂为三触角型-N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。

170.根据权利要求148-169中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂选自血管紧张素II受体阻断剂、法尼醇X受体激动剂、死亡受体5激动剂、钠葡萄糖协同转运蛋白2型抑制剂、溶血磷脂酸1受体拮抗剂、内皮素-A受体拮抗剂、PPARδ激动剂、AT1受体拮抗剂、CCR5/CCR2拮抗剂、抗纤维化剂、抗炎剂、抗氧化剂、STING激动剂、CSF1R抑制剂、AXL抑制剂、c-Met抑制剂、PARP抑制剂、受体酪氨酸激酶抑制剂、MEK抑制剂、PAK1抑制剂、谷氨酰胺酶抑制剂、TIEII拮抗剂、CXCR2抑制剂、CD73抑制剂、精氨酸酶抑制剂、PI3K抑制剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、SHP2抑制剂、化学治疗剂、STING拮抗剂，以及JAK1抑制剂。

171.根据权利要求148-170中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂为MEK抑制剂。

172.根据权利要求171所述的组合物，其中所述MEK抑制剂选自曲美替尼、考比替尼、贝美替尼、司美替尼、PD325901、PD035901、PD032901，以及TAK-733。

173.根据权利要求148-170中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂为受体酪氨酸激酶抑制剂。

174.根据权利要求173所述的组合物，其中所述受体酪氨酸激酶抑制剂选自舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、凡德他尼、阿西替尼、西地尼布、瓦他拉尼、达沙替尼、比美替尼(R428)、度博替尼(TP-0903)、尼达尼布、卡博替尼，以及莫特塞尼。

175.根据权利要求148-170中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂为PAK1抑制剂。

176.根据权利要求175所述的组合物，其中所述PAK1抑制剂为Frax-1036(6-[2-氯-4-(6-甲基-2-吡嗪基)苯基]-8-乙基-2-[[2-(1-甲基-4-哌啶基)乙基]氨基]-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮)。