KR102266865B1 - 지방산을 유효성분으로 포함하는 수용성 광감작제 결합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

지방산을 유효성분으로 포함하는 수용성 광감작제 결합체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지방산을 유효성분으로 포함하는 수용성 광감작제 결합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 탄소 18개로 이루어진 지방산; 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 또는 풀루란(Pullulan)에서 선택되는 친수성 고분자 연결체; 및 광감작제; 가 결합되어 이루어져 수상에서의 분산도를 높여 치료효과를 극대화할 수 있고, 장내분비 암세포에 특이적으로 상호작용하며, 다양한 암세포에 대해 높게 축적되어 광감작제에 의하여 효율적인 광역학적 치료 (photodynamic therapy, PDT)가 이루어질 수 있다.

Description

지방산을 유효성분으로 포함하는 수용성 광감작제 결합체 및 이의 제조방법{Water-soluble photosensitizer composite containing a fatty acid, and process of preparation thereof}
본 발명은 지방산을 유효성분으로 포함하는 수용성 광감작제 결합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
광역학 치료 (photodynamic therapy, PDT)는 빛을 이용한 광감작제 (photosensitizer)의 활성을 이용한 의학적 치료방법이다. 광역학 치료의 원리는 환자에게 광감작제를 투여하고 일정 시간이 지나면 암 조직에 광감작제가 선택적으로 축적되고, 광감작제의 파장에 맞는 빛을 조사하면 체내의 산소 분자와 화학적 반응을 일으킴으로써 단일 산소와 이에 의해 유발되는 자유라디칼이 암조직 특이적으로 세포사멸을 유도하는 치료방법이다.
이에 사용하는 광감작제의 이상적인 특징으로는 단시간에 종양에 최대로 축적되며, 정상조직에서는 빨리 대사되고 배설되어 영향을 최소화하고, 보다 친수성으로 투여에 용이하고 체내에서의 이행에 유리한 것이다.
그러나 대부분의 광감작제들은 소수성에 의해 물에서 난용성 약물이며, 체내 잔류시간이 길어 남아있는 광감작제에 의한 광독성이 나타날 수 있다는 단점을 지닌다. 또한, 체내 투입 시 광감작제의 소수성 상호작용에 의한 뭉침 현상으로 형광감도가 저하되어 치료 효율도 저하되는 문제점을 지닌다.
따라서 암세포와 상호작용하는 물질을 광감작제에 접합하여 보다 빠르게 암조직에 축적되고, 수용액에서의 용해가 증진된 광감작제 제조에 대한 연구가 필요한 실정이다.
1. 대한민국 공개특허 제10-2016-0088748호(2016.07.26)
본 발명의 목적은 암 조직에 축적률이 높으며, 수용액에서 용해도가 우수한 지방산-고분자 연결체-광감작제 결합체 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 지방산-고분자 연결체-광감작제 결합체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 탄소 18개로 이루어진 지방산; 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 또는 풀루란(Pullulan)에서 선택되는 친수성 고분자 연결체; 및 광감작제; 가 결합되어 이루어지는 지방산-고분자 연결체-광감작제 결합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 (Ⅰ) 광감작제와 촉매를 유기용매에 용해시키는 단계; (Ⅱ) 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 또는 풀루란(Pullulan)에서 선택되는 친수성 고분자 연결체를 유기용매에 용해시키는 단계; (Ⅲ) 상기 (Ⅰ) 단계와 (Ⅱ) 단계에서 제조된 용액을 혼합하여 반응시키는 단계; (Ⅵ) 올레산(Oleic acid), 팔미트산(Palmitic acid) 및 리놀레산(Linoleic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 지방산과 촉매를 유기용매에 용해시키는 단계; 및 (Ⅴ) 상기 (Ⅲ) 단계와 (Ⅵ) 단계에서 제조된 용액을 혼합하여 반응시키는 단계; 를 포함하는 지방산-고분자 연결체-광감작제 결합체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 지방산-고분자 연결체-광감작제 결합체를 유효성분으로 포함하는 광역학 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따라 제조된 지방산-고분자 연결체-광감작제로 이루어진 광역학 치료용 결합체는, 광감작제에 친수성 고분자 연결체를 결합하여 수상에서의 분산도를 높여 치료효과를 극대화할 수 있다. 또한, 지방산은 장내분비 암세포에 특이적으로 상호작용하며, 다양한 암세포에 대한 축적률을 증가시키므로 낮은 광감각제의 농도에서도 효율적인 광역학적 치료 (photodynamic therapy, PDT)가 가능한 효과가 있다.
도 1은 본 발명에서 제조한 올레산-폴리에틸렌글리콜 연결체-광감작제인 클로린 e6와 접합시킨 모식도와 이의 접합을 확인한 NMR spectrum을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에서 제조한 팔미트산-폴리에틸렌 글리콜 연결체-광감작제인 클로린 e6와 접합시킨 모식도와 이의 접합을 확인한 NMR spectrum을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명에서 제조한 리놀레산-폴리에틸렌 글리콜 연결체-광감작제인 클로린 e6와 접합시킨 모식도와 이의 접합을 확인한 NMR spectrum을 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명에서 제조한 올레산-풀루란을 연결체-광감작제인 클로린 e6와 접합시킨 모식도와 이의 접합을 확인한 NMR spectrum을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에서 제조한 올레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6, 팔미트산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6, 리놀레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6, 올레산-풀루란-클로린 e6와 지방산을 함유하지 않은 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6의 세포 내 흡수를 십이지장 암세포 (Hutu-80)에서 유세포 분석기를 통해 확인한 도면이다.
도 6은 본 발명에서 제조한 올레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6, 팔미트산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6, 리놀레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6, 올레산-풀루란-클로린 e6와 지방산을 함유하지 않은 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6의 세포 내 흡수를 십이지장 암세포 (Hutu-80)에서 공초점 현미경으로 관찰한 이미지를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명에서 제조한 올레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6, 팔미트산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6, 리놀레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6, 올레산-풀루란-클로린 e6의 십이지장 암세포 (Hutu-80)에서 세포독성과 레이저 조사에 의한 광독성을 지방산을 접합하지 않은 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6와 비교 관찰한 도면이다.
도 8은 본 발명에서 제조한 올레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6, 팔미트산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6, 리놀레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6, 올레산-풀루란-클로린 e6를 C57BL/6 생쥐에 경구투여 하였을 때, 십이지장에 축적된 광감작제(클로린 e6)를 비교 관찰한 도면이다.
도 9는 본 발명에서 제조한 올레산-풀루란-클로린 e6의 일 실시예에 따른 세포 내 흡수율을 폐암 세포 (A549), 췌장암 세포 (PANC1), 대장암 세포 (HCT 116) 에서의 세포 내 흡수율을 일반 섬유아세포 (L929)와 비교하여 유세포 분석기를 통해 확인한 도면이다.
도 10은 본 발명에서 제조한 올레산-풀루란-클로린 e6의 일 실시예에 따른 대장암 세포 (HCT 116)와 일반 섬유아세포 (L929)에서의 세포 내 분포를 공초점 현미경으로 관찰한 이미지를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명에서 제조한 올레산-풀루란-클로린 e6의 일 실시예에 따른 세포 독성과 레이저 조사에 의한 광독성을 폐암 세포 (A549), 췌장암 세포 (PANC1), 대장암 세포 (HCT 116), 일반 섬유아세포 (L929)에서 확인한 것을 나타낸다.
이하에서는 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 종래 광감작제의 수용액 상에서 낮은 용해도로 생체 내 이용률이 낮다는 점과 암세포와의 친화도가 낮은 문제점을 해결하기 위해 지방산-고분자 연결체-광감작제로 이루어진 광역학 치료용 결합체를 제조하였으며, 이는 수상에서의 분산도를 높여 치료효과를 극대화할 수 있고, 장내분비 암세포에 특이적으로 상호작용하며, 다양한 암세포에 대해 높게 축적되어 광감작제에 의하여 효율적인 광역학적 치료 (photodynamic therapy, PDT)가 이루어질 수 있으며, 특히, 암세포 내 축적률과 광독성 효과에서 올레산-풀루란-클로린 e6이 월등히 뛰어남을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 탄소 18개로 이루어진 지방산; 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 또는 풀루란(Pullulan)에서 선택되는 친수성 고분자 연결체; 및 광감작제; 가 결합되어 이루어지는 지방산-고분자 연결체-광감작제 결합체를 제공한다.
이때, 상기 지방산과 광감작제는 폴리에틸렌글리콜 고분자에 아마이드 결합(amide bond)으로 결합되며, 상기 지방산과 광감작제는 풀루란 고분자에 에스터 결합(ester bond)으로 결합될 수 있다.
또한, 상기 지방산은 올레산(Oleic acid), 팔미트산(Palmitic acid) 및 리놀레산(Linoleic acid)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 광감작제는 특정 파장의 빛이 조사되었을 때 여기(excitation)된 후, 형광 신호를 생성하거나, 주변의 기질 또는 산소와 반응하여 반응성 산소종(reactive oxygen specied)를 생성하고, 생성된 반응성 산소종은 주변 종양 세포를 자멸 또는 괴사시키는 광독성 효과가 있는 것으로, 포르피린계(phorphyrins) 화합물, 클로린계(chlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phtalocyanines) 화합물 및 나프탈로시아닌계(naphthalocyanines) 화합물로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되며, 바람직하게는 클로린 e6(Ce6)가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 지방산, 친수성 고분자 연결체 및 광감작제는 1:(1 내지 30):(0.1 내지 10)의 질량비로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
상기와 같이 제조된 지방산-고분자 연결체-광감작제 결합체에서 지방산은 세포와의 상호작용이 높아 결합체의 세포 내로의 축적률을 증가시켰으며, 수용성이 높은 친수성 고분자인 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)과 풀루란(Pullulan) 고분자를 연결체로 이용하여 기존 광감작제의 낮은 체내 용해도와 비특이적인 치료 효과를 개선할 수 있어 낮은 광감작제의 농도에서도 암세포 특이적으로 광독성 효과를 보임을 확인하였다.
특히, 본 발명의 일 실시예에 따르면 올레산-풀루란-클로린 e6 결합체는 정상세포보다 암세포 내로의 축적률을 월등히 증가시켰으며, 광독성 효과 또한 매우 우수함을 확인하였다.
또한, 본 발명은 (Ⅰ) 광감작제와 촉매를 유기용매에 용해시키는 단계; (Ⅱ) 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 또는 풀루란(Pullulan)에서 선택되는 친수성 고분자 연결체를 유기용매에 용해시키는 단계; (Ⅲ) 상기 (Ⅰ) 단계와 (Ⅱ) 단계에서 제조된 용액을 혼합하여 반응시키는 단계; (Ⅵ) 올레산(Oleic acid), 팔미트산(Palmitic acid) 및 리놀레산(Linoleic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 지방산과 촉매를 유기용매에 용해시키는 단계; 및 (Ⅴ) 상기 (Ⅲ) 단계와 (Ⅵ) 단계에서 제조된 용액을 혼합하여 반응시키는 단계; 를 포함하는 지방산-고분자 연결체-광감작제 결합체의 제조방법을 제공한다.
이때, 상기 유기용매는 디메틸포름아마이드(Dimethyformamide, DMF), 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide: DMSO), 클로로포름(Chlorform), 메틸렌클로라이드(Methylenchloride: MC), 에탄올(Ethanol) 및 메탄올(Methanol)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것이며, 상기 촉매는 N-N'-다이사이클로헥실카르보디이미드 (Dicyclohexycarbodiimide, DCC), N-하이드록시석신이미드(N-Hydroxysuccinimide, NHS), 4-디메틸아미노피리딘 (4-Dimethylaminopyridine; DMAP) 또는 이들의 혼합물인 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 촉매 반응에 의해 지방산과 광감작제는 폴리에틸렌글리콜 고분자에 아마이드 결합(amide bond)으로 결합되며, 상기 지방산과 광감작제는 풀루란 고분자에 에스터 결합(ester bond)으로 결합될 수 있다.
또한, 본 발명은 상에서 제조된 지방산-고분자 연결체-광감작제 결합체를 유효성분으로 포함하는 광역학 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 결합체는 광 조사에 의해 생체 외 또는 생체 내에서 광감작제의 활성을 나타낼 수 있다.
또한, 상기 광역학 치료용 약학 조성물은 장내분비 암세포를 표적으로 하거나 위장암, 직장암, 췌장암, 십이지장 암, 소장암, 대장암 및 간장암으로 이루어진 군에서 선택되는 소화기계 암을 표적으로 할 수 있다.
상기 광역학 치료용 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양의 고분자 접합체 또는 그의 염을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 "약학적으로 허용되는"이란, 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 의미한다.
상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 치료 효과적인 질환 상태 또는 증상이 있는 사람 또는 기타 포유동물에 적합하게는 주사 또는 기타 다른 방법으로 전달(예: 이식, 체강 또는 가능한 공간에 넣는 것, 신체의 조직 표면을 코팅 또는 이식가능한 장치의 표면을 코팅함으로써)될 수 있지만, 특히, 상기 약학 조성물은 비경구로 전달되는 것이 바람직하다. 이때, "비경구"란 근육내, 복막내, 복부내, 피하, 정맥 및 동맥내를 의미한다. 그러므로 본 발명의 고분자 접합체를 포함하는 약학조성물은 대표적으로 주사 제형으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 주사 가능한 약학 조성물은 임의의 적합한 방법, 바람직하게는 피하 바늘을 통한 주사에 의해 사람 또는 기타 포유동물의 체내에 주사 또는 삽입할 수 있다. 예를 들면, 주사 또는 기타 다른 방식으로 동맥내, 정맥내, 비뇨생식기, 피하, 근육내, 피하, 두개내, 심장막내, 흉막내, 또는 기타 신체강 또는 가능한 공간내로 투여할 수 있다. 또는, 카테터 또는 시린지를 통해 예를 들어 관절경 시술 동안에 관절내로, 또는 비뇨생식관내로, 맥관내로, 구개내로 또는 흉막내, 또는 신체 내임의의 체강 또는 가능한 공간내로, 수술, 외과, 진단 또는 중재 시술 도중에 도입할 수 있다.
본 발명에서는 지방산-고분자 연결체-광감작제 결합체를 통하여 광감작제의 세포 친화도 증대와 광감작제의 용해도를 증진시켰다. 기존 광감작제의 단점은 낮은 용해도로 인해 수용액 상에서 침전되어 생체 내 이용률이 낮다는 점과, 비특이적으로 모든 세포에 영향을 준다는 점이다. 광감작제에 친수성 고분자 연결체를 접합하면 수상에서의 분산도를 높여 치료효과를 극대화할 수 있다. 더불어 지방산은 십이지장 암세포에 특이적으로 세포 내 흡수율이 증진되었다. 이는 다양한 암세포에서도 지방산의 접합으로 특이적인 세포 내 흡수로 낮은 농도에서도 효율적인 광역학적 치료 (photodynamic therapy, PDT)를 기대할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1> 지방산을 유효성분으로 하는 광감작제 제조
1-1. PEG 고분자 연결체를 통해 친수성이 증진된 광감작제 제조
폴리에틸렌글리콜 [polyethylene glycol, PEG (Mw 2kDa)]에 아마이드 결합 (amide bond)을 통해 클로린 e6 (Chlorin e6, Ce6)을 결합하기 위해 DCC/NHS 촉매반응을 이용하였다.
Ce6 177.7 mg, N-N'-다이사이클로헥실카르보디이미드 (Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 74.3 mg, N-하이드록시석신이미드(N-Hydroxysuccinimide, NHS) 41.4 mg을 디메틸포름아마이드 (Dimethyformamide, DMF) 2 mL에 녹여 교반하였다. 4시간 후, 폴리에틸렌글리콜 500 mg을 디메틸포름아미드 10 mL에 녹여 준비하고, 미리 활성화한 클로린 e6 용액을 첨가하여 상온에서 24시간 반응하였다. 반응 후, 사용했던 용매 및 촉매 제거를 위해 반응물을 투석막 (Spectra/Por; molecular weight cutoff size 3500 Da)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후, 동결건조를 통해 반응물을 분말 형태로 회수하였다. 반응 후, 폴리에틸렌글리콜의 양쪽 말단에 아민기가 존재하는데, 이 중 한쪽 아민기에만 클로린 e6가 접합된 물질만을 획득하기 위해 세파덱스 LH20 소수성 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제하였다. 동결 건조된 분말은 메탄올에 녹여 컬럼에 주입하였고, 이동상은 50% 메탄올 (5:5 메탄올:물, 유속; 0.5 mL/min)을 이용하여 중력에 의해 흘러내리도록 하였다. 나누어진 구획에서 하나의 클로린 e6가 접합된 구획을 회수하여 회전증발농축기를 이용하여 메탄올을 제거하고 동결건조를 통해 물을 제거하여 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 (PEG-Ce6)를 합성하였다. 이는 핵자기공명스펙트럼 (1H-NMR) 분석을 통해 접합 여부를 확인하였다(도 1 내지 3).
1-2. 올레산을 유효성분으로 PEG를 연결체로 하는 광감작제 제조
상기 실시예 <1-1>을 통해 합성된 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 (PEG-Ce6)에 올레산 (Oleic acid, OA)을 접합시키기 위해 먼저 올레산을 활성화하였다.
올레산 22.6 mg, N-N'-다이사이클로헥실카르보디이미드(Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 19.8 mg, N-하이드록시석신이미드(N-Hydroxysuccinimide, NHS) 11 mg을 디메틸설폭시드 (Dimethyl sulfoxide, DMSO) 2mL에 녹여 교반하였다. 4시간 후, 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 100 mg을 디메틸설폭시드 용액에 녹인 후 앞서 활성화한 올레산과 24시간 동안 반응하였다. 정제를 위해 반응물을 투석막 (Spectra/Por; molecular weight cutoff size 3500 Da)을 이용하여 4일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 동결건조를 통해 반응물 올레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 (Oleic Acid-PEG-Ce6; OPC)을 분말 형태로 회수하였다. 이는 핵자기공명스펙트럼 (1H-NMR) 분석을 통해 접합 여부를 확인하였다(도 1).
1-3. 팔미트산을 유효성분으로 PEG를 연결체로 하는 광감작제 제조
상기 실시예 <1-1>을 통해 합성된 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 (PEG-Ce6)에 팔미트산 (Palmitic acid, PA)을 접합시키기 위해 먼저 팔미트산을 활성화하였다.
팔미트산 20.5 mg, N-N'-다이사이클로헥실카르보디이미드(Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 19.8 mg, N-하이드록시석신이미드(N-Hydroxysuccinimide, NHS) 11 mg을 디메틸설폭시드 (Dimethyl sulfoxide, DMSO) 2mL에 녹여 교반하였다. 4시간 후, 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 100 mg을 디메틸설폭시드 용액에 녹인 후 앞서 활성화한 올레산과 24시간 동안 반응하였다. 정제를 위해 반응물을 투석막 (Spectra/Por; molecular weight cutoff size 3500 Da)을 이용하여 4일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 동결건조를 통해 반응물 팔미트산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 (Palmitic acid-PEG-Ce6; PPC)을 분말 형태로 회수하였다. 이는 핵자기공명스펙트럼 (1H-NMR) 분석을 통해 접합 여부를 확인하였다(도 2).
1-4. 리놀레산을 유효성분으로 PEG를 연결체로 하는 광감작제 제조
상기 실시예 <1-1>을 통해 합성된 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 (PEG-Ce6)에 리놀레산 (Linoleic acid, LA)을 접합시키기 위해 먼저 리놀레산을 활성화하였다.
리놀레산 24.9 mg, N-N'-다이사이클로헥실카르보디이미드(Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 19.8 mg, N-하이드록시석신이미드(N-Hydroxysuccinimide NHS) 11 mg을 디메틸설폭시드 (Dimethyl sulfoxide, DMSO) 2mL에 녹여 교반하였다. 4시간 후, 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 100 mg을 디메틸설폭시드 용액에 녹인 후 앞서 활성화한 리놀레산과 24시간 동안 반응하였다. 정제를 위해 반응물을 투석막 (Spectra/Por; molecular weight cutoff size 3500 Da)을 이용하여 4일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 동결건조를 통해 반응물 리놀레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 (Linoleic acid-PEG-Ce6; LPC)을 분말 형태로 회수하였다. 이는 핵자기공명스펙트럼 (1H-NMR) 분석을 통해 접합여부를 확인하였다.
1-5. 올레산을 유효성분으로 풀루란을 연결체로 하는 광감작제 제조
올레산-풀루란-클로린 e6를 합성하기 위해 우선적으로 올레산과 풀루란을 먼저 접합하였다. 풀루란 (Pullulan, Mw 100 kDa)에 에스터 결합 (ester bond)을 통해 올레산 (Oleic acid, OA)을 결합하기 위해 DMAP/DCC 촉매반응을 이용하였다.
풀루란 200 mg, 올레산 165.2 mg, N-N'-다이사이클로헥실카르보디이미드(Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 144.8 mg, 4-디메틸아미노피리딘 (4-Dimethylaminopyridine) 7.1 mg을 디메틸설폭시드 (Dimethyl sulfoxide, DMSO) 10 mL에 녹여 48시간 동안 교반하였다. 정제를 위해 디에틸에테르 (Diethylether) 50mL에 결정화 시키고, 침전물 이외의 상층액을 버리고 다시 디에틸에테르를 넣어 재결정 시키는 과정을 3번 반복하여 미반응물과 부산물을 제거하였다. 이를 감압 건조를 통해 분말 형태의 올레산-풀루란(Oleic Acid-Pullulan)을 얻어 핵자기공명스펙트럼 (1H-NMR) 분석을 통해 접합 여부를 확인하였다(도 4).
올레산-풀루란에 클로린 e6을 추가적으로 접합하기 위하여, 올레산-풀루란 100 mg, 클로린 e6 64.8 mg, N-N'-다이사이클로헥실카르보디이미드(Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 26.9 mg, 4-디메틸아미노피리딘 (4-Dimethylaminopyridine) 1.3 mg을 디메틸설폭시드 (Dimethyl sulfoxide, DMSO) 10 mL에 녹여 48시간 동안 교반하였다. 정제를 위해 디에틸에테르 (Diethylether) 50mL에 결정화 시키고, 침전물 이외의 상층액을 버리고 다시 디에틸에테르를 넣어 재결정 시키는 과정을 3번 반복하여 미반응물과 부산물을 제거하였다. 이를 감압 건조를 통해 분말 형태의 올레산-풀루란-클로린 e6(Oleic Acid-Pullulan-Ce6; OPuC)를 얻어 핵자기공명스펙트럼 (1H-NMR) 분석을 통해 접합 여부를 확인하였다(도 4).
< 실험예 1> 지방산을 유효성분으로 하는 광감작제의 세포 내 축적 정량적 확인
상기 <실시예 1>에서 제조된 지방산을 유효성분으로 하는 광감작제들인 OPC, PPC, LPC, OPuC 결합체가 지방산이 없는 물질과 비교하였을 때 세포 내 축적률의 변화를 확인하기 위해 각 물질을 십이지장 암세포와 1 시간, 4 시간 함께 배양하였을 때의 세포 내 축적 정도를 비교하였다.
1-1. 실험 재료 및 방법
HUTU-80 (사람 십이지장 세포)를 5 × 105 cells/well의 농도로 2 mL씩 6 well 세포배양접시에 분주한 뒤 24시간 동안 37℃, 5% CO2 배양조건에서 배양하였다. 이후, 상기 실시예 1-1에서부터 1-5까지 제조한 모든 물질을 Ce6 기준 10 μg/mL 농도로 각각 1시간, 4시간 동안 처리하였다. 이후, DPBS를 이용하여 3번 세척하고 세포를 회수하여 유입된 클로린 e6의 형광을 유세포 분석기(Flow cytometer, BD FACSCanto Ⅱ)를 통해 정량적으로 확인하였다. 이의 정량적인 비교를 위하여 대조군을 설정하기 위해 어떠한 물질도 포함하지 않은 배지에서 동일한 배양조건에서 배양한 그룹을 Control (CON)으로 진행하였다.
1-2. 실험 결과
상기 실시예 1-1에서 제조한 PEG-Ce6(PC)는 유효성분인 지방산이 없는 물질로, 세포 내 함입 정도를 비교했을 때 가장 저조하게 세포 내에 축적되었으나, 상기 실시예 1-2 내지 1-5에서 제조한 결합체 OPC, PPC, LPC, OPuC 은 유효성분인 지방산의 존재로 인해 세포 내 축적률이 상당히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 1시간, 4시간 처리했을 때 함께 배양한 시간이 늘어남에 따라 세포 내 클로린 e6의 축적양이 더욱 증가한 것을 확인하였다(도 5a).
게다가, 같은 올레산을 접합한 물질이더라도 연결체로 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 것 보다 더 많은 기능기를 지닌 풀루란 고분자를 연결체로 사용했을 때 더 많은 양이 축적된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 각 물질을 4시간 동안 함께 배양했을 때 올레산-풀루란-클로린 e6 > 올레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 > 리놀레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 > 팔미트산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 > 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6의 순서로 세포 내 축적률이 차이 나는 것을 확인하였다(도 5b).
< 실험예 2> 지방산을 유효성분으로 하는 광감작제의 세포 내 축적 이미지 확인
상기 <실시예 1>에서 제조된 지방산을 유효성분으로 하는 광감작제들인 OPC, PPC, LPC, OPuC 결합체가 지방산이 없는 물질과 비교하였을 때 세포 내 축적 정도를 비교하기 위해 각 물질을 십이지장 암세포와 2 시간 함께 배양하였을 때 세포 내 축적 정도를 이미지로 확인하였다.
2-1. 실험 재료 및 방법
HUTU-80 (사람 십이지장 세포)를 1 × 105 cells/well의 농도로 2 mL씩 6 well 세포배양접시에 분주한 뒤 24시간 동안 37℃, 5% CO2 배양조건에서 배양하였다. 이후, 상기 실시예 1-1에서부터 1-5까지 제조한 모든 물질을 Ce6 기준 10 μg/mL 농도로 2 시간 동안 처리하였다. 이후, DPBS를 이용하여 3번 세척하고 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)로 고정하고, 세포의 핵을 염색한 다음 공초점 현미경 (confocal laser scanning microscope, CLSM) 을 통해 이미지를 확인하였다. 어떠한 물질도 포함하지 않은 배지에서 동일한 배양조건에서 배양한 그룹을 Control (CON)으로 진행하였다.
2-2. 실험결과
공초점 현미경으로 관찰한 이미지에서 파란색은 세포의 핵을 의미하고, 빨간색은 세포 내로 함입된 클로린 e6을 의미한다. 상기 실시예 1-1에서 제조한 PEG-Ce6(PC)는 유효성분인 지방산이 없는 물질로, 세포 내 함입 정도를 비교했을 때 가장 저조하게 세포 내에 축적되었으나, 상기 실시예 1-2 내지 1-5에서 제조한 실시예 1-2 내지 1-5에서 제조한 결합체 OPC, PPC, LPC, OPuC 은 유효성분인 지방산의 존재로 인해 세포 내 축적률이 상당히 증가한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 이는 상기 <실험예 1>과 유사한 경향성으로 올레산-풀루란-클로린 e6 > 올레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 > 리놀레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 > 팔미트산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 > 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 의 순서로 세포 내 클로린 e6의 빛이 밝게 관찰되는 것을 확인하였다(도 6).
< 실험예 3> 지방산을 유효성분으로 하는 광감작제의 세포실험을 통한 광독성 평가
상기 <실시예 1>에서 제조된 지방산을 유효성분으로 하는 광감작제들인 OPC, PPC, LPC, OPuC 결합체가 세포독성을 나타내지 않는 농도 범위를 확인하고, 레이저를 조사했을 때의 광독성이 나타나는 농도 범위를 확인하였다.
3-1. 실험 재료 및 방법
상기 실시예 1-1에서 1-5까지 제조한 모든 물질의 세포독성을 평가하기 위하여 HUTU-80 (사람 십이지장 세포)를 48 well에 2×104 cells/well의 농도로 각 well에 300 μL씩 분주하고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 각각의 세포에 제조한 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6, 올레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6, 팔미트산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6, 리놀레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6, 올레산-풀루란-클로린 e6를 클로린 e6을 기준농도로 0.10 내지 10 μg/mL의 다양한 농도로 처리하고 레이저를 조사하지 않은 군(Laser(-))과 2 J/cm2 의 세기로 조사한 (Laser(+))군을 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 반응시킨 후 MTT 시험법을 이용하여 세포생존율을 확인하였다. MTT 용액 처리 후 나타나는 형광강도를 570nm에서 멀티리더기 (Synergy H1 Multi-mode Reader, Biotek)을 이용하여 확인하였다.
3-2. 실험결과
광원을 조사하지 않은 군의 경우 모든 광감작제 OPC, PPC, LPC, OPuC 결합체에서 1 μg/mL의 농도까지는 80%이상의 세포생존율을 나타냈으며, 올레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6(OPC), 팔미트산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6(PPC), 올레산-풀루란-클로린 e6(OPuC)에서는 2.5 μg/mL 이상의 농도에서는 세포 생존율이 점점 감소하였다.
광원을 조사한 경우에는 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6(PC)의 경우 2.5 μg/mL에서 80%의 생존율을, 리놀레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6(LPC)의 경우 0.5 μg/mL에서 80%의 생존율을, 올레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6(OPC)의 경우 0.25 μg/mL에서 87.9%의 생존율을, 팔미트산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6(PPC)의 경우 81.9%의 생존율을, 올레산-풀루란-클로린 e6(OPuC)의 경우 0.10 μg/mL에서 9.6%의 생존율을 보였다.
따라서 광원 조사 시 세포 생존율을 비교했을 때, 올레산-풀루란-클로린 e6 > 올레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 > 리놀레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 > 팔미트산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 > 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 순으로 광독성이 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
따라서 상기 실시예 1-1에서 1-5까지 제조한 물질의 광원 조사 여부에 따른 세포독성을 비교했을 때, 광원 조사 시에 세포독성이 농도 증가에 따라 증가한 것을 확인할 수 있었다. 그중 올레산-풀루란-클로린 e6의 세포 광독성이 가장 심하게 관찰되었다. 이에, 본 발명에 따라 제조된 광감작제 OPC, PPC, LPC, OPuC 결합체들은 지방산을 유효성분으로 십이지장 암세포에 강한 상호작용을 나타내는 것을 확인하였다(도 7).
< 실험예 4> 지방산을 유효성분으로 하는 광감작제의 실험동물 내 십이지장 축적률 확인
상기 <실시예 1>에서 제조된 지방산을 유효성분으로 하는 광감작제들인 OPC, PPC, LPC, OPuC 결합체를 실험동물에 경구투여했을 때, 십이지장에 축적되는 정도를 확인 및 비교하였다.
4-1. 실험 재료 및 방법
상기 실시예 1-1에서 1-5까지 제조한 모든 물질의 십이지장에 축적되는 정도를 확인하기 위해서 C57BL/6 생쥐를 이용하여 실험하였다. 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6(PS), 올레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6(OPC), 팔미트산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6(PPC), 리놀레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6(LPC), 올레산-풀루란-클로린 e6(OPuC)를 클로린 e6을 기준농도로 2 mg/kg의 농도로 생리식염수에 분산하였다. 이후, 동물용 카테터를 이용하여 한 마리당 2mg/Kg의 농도로 200 μL의 물질을 투여하였다. 30분 이후, 십이지장에 축적된 각 물질의 양을 NEOscience 사의 FOBI (Fluorescence labeled Organism Bioimaging)을 이용하여 감지하였다. 이를 NEOimage software을 이용해 형광강도를 분석하였다. 어떠한 물질도 포함하지 않은 배지에서 동일한 배양조건에서 배양한 그룹을 Control (CON)으로 진행하였다.
4-2. 실험결과
경구투여 후 십이지장에 남아있는 클로린 e6의 형광강도를 탐지하여 상기 실시예 1-1에서 1-5까지 제조한 물질이 어느 정도 남아있는지를 확인하였다. 클로린 e6의 형광강도를 분석한 결과, 올레산-풀루란-클로린 e6의 강도가 가장 높게 나타났으며, 팔미트산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6, 리놀레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6, 올레산-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6는 비슷한 형광 수치를 나타냈으며, 지방산을 함유하지 않은 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6의 형광강도는 가장 낮게 나타남을 확인하였다.
결과적으로, 상기 실시예 1-1에서 1-5까지 제조한 물질의 십이지장 내 축적도를 확인해 봤을 때, 지방산을 함유한 물질들이 그렇지 않은 경우보다 약 2배 더 강한 형광강도를 나타내었다. 이는 지방산을 유효성분으로 동물의 체내에서도 더 강한 축적률을 보인다는 것을 알 수 있었다. 더불어, 고분자 연결체로 폴리에틸렌글리콜을 사용한 것 보다 풀루란을 사용했을 때, 고분자의 점성과 올레산의 효능에 의해 더 많은 양이 축적된 것을 확인하였다(도 8).
< 실험예 5> 올레산-풀 루란 - 클로린 e6의 암세포 상호작용을 확인하기 위한 광감작제의 세포 내 축적률 정량적 확인
상기 <실시예 1>에서 제조된 지방산을 유효성분으로 하는 광감작제들인 OPC, PPC, LPC, OPuC 결합체의 세포 축적률과 광독성을 평가했을 때, 올레산-풀루란-클로린 e6가 세포 내 축적률과 광독성이 가장 강하게 나타났다. 따라서, 올레산-풀루란-클로린 e6의 암세포와의 상호작용을 확인하였다.
5-1. 실험 재료 및 방법
상기 실시예 1-5에서 제조한 물질의 세포 내 축적률을 평가하기 위하여 A549 (폐암 세포), PANC1 (췌장암 세포), HCT-116 (대장암 세포), L929 (생쥐 섬유모세포)를 6 well에 1×106 cells/well의 농도로 각 well에 2 mL씩 분주하고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 각각의 세포에 제조한 올레산-풀루란-클로린 e6를 10 μg/mL의 농도로 처리하여 4시간 동안 함께 배양했다. 이후, DPBS를 이용하여 3번 세척하고 세포를 회수하여 유입된 클로린 e6의 양을 유세포분석기 (Flow cytometer, BD FACSCanto Ⅱ)를 통해 정량적으로 확인하였다.
5-2. 실험결과
상기 실시예 1-5에서 제조한 올레산-풀루란-클로린 e6는 정상세포인 L929 (생쥐 섬유모세포)의 경우, 풀루란-클로린 e6(PuC) 보다 올레산-풀루란-클로린 e6(OPuC)가 약 1.86배 더 많이 축적되었지만, A549 (폐암 세포)의 경우 3.21배, PANC1 (췌장암 세포)의 경우 3.16배, HCT-116 (대장암 세포)의 경우 3.27배 축적률이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 상기 실시예 1-5에서 제조한 물질의 세포 내 축적률을 다양한 암세포 (A549, PANC1, HCT-116)에서 확인했을 때, 정상 세포 (L929)에서 보다 지방산의 존재로 인한 세포 내 축적률 변화가 확연히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이로써 지방산을 유효성분으로 하는 광감작제는 지방산의 존재로 인해 암세포와 상호작용 한다는 것을 확인할 수 있었다(도 9).
< 실험예 6> 올레산-풀 루란 - 클로린 e6의 암세포 상호작용을 확인하기 위한 광감작제의 세포 내 축적률 이미지 분석
상기 실시예 1-5에서 제조한 물질이 암세포와 상호작용하는 사실을 상기 <실험예 5>를 통해 확인하였으며, HCT-116 (대장암 세포)와 L929 (섬유모세포)를 대상으로 세포 내 축적률을 비교함으로써 지방산을 유효성분으로 암세포와의 증진된 상호작용을 확인하였다.
6-1. 실험 재료 및 방법
HCT-116 (대장암 세포), L929 (섬유모세포)를 1 × 105 cells/well의 농도로 2 mL씩 6 well 세포배양 접시에 분주한 뒤 24시간 동안 37℃, 5% CO2 배양조건에서 배양하였다. 이후, 올레산-풀루란-클로린 e6를 클로린 e6 기준 10 μg/mL 농도로 2 시간 동안 함께 배양한 후, DPBS를 이용하여 3번 세척하고 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)로 고정하여 세포의 핵을 염색한 다음 공초점 현미경 (confocal laser scanning microscope, CLSM) 을 통해 이미지를 확인하였다. 어떠한 물질도 포함하지 않은 배지에서 동일한 배양조건에서 배양한 그룹을 Control (CON)으로 진행하였다.
6-2. 실험결과
공초점 현미경으로 관찰한 이미지에서 파란색은 세포의 핵을 의미하고, 빨간색은 세포 내로 함입된 클로린 e6을 의미한다. 풀루란-클로린 e6(PuC)의 경우, HCT-116와 L929 두 가지 세포에서 비슷한 클로린 e6의 형광강도가 감지되었지만, 올레산-풀루란-클로린 e6(OPuC)의 경우, 클로린 e6는 L929에서보다 HCT-116에서 더 높은 형광강도가 감지하였다.
따라서 상기 실시예 1-5에서 제조한 올레산-풀루란-클로린 e6는 정상세포에서보다 암세포에서 세포 내 축적이 더 잘 되는 것을 확인할 수 있었다. 이는, 올레산-풀루란-클로린 e6가 지방산을 유효성분으로 암세포에 더 많이 축적된다는 결론을 도출할 수 있다(도 10).
< 실험예 7> 올레산-풀 루란 - 클로린 e6의 암세포 특이적 광독성 평가
상기 실시예 1-5에서 제조한 올레산-풀루란-클로린 e6의 세포독성을 나타내지 않는 농도 범위를 확인하고, 레이저를 조사했을 때의 광독성이 나타나는 농도 범위를 확인하였다. 더불어, 지방산이 없는 풀루란-클로린 e6와 세포생존율을 비교함으로써, 암세포에 대한 특이성을 확인하였다.
7-1. 실험 재료 및 방법
상기 실시예 1-5에서 제조한 물질의 세포 내 축적률을 평가하기 위하여 A549 (폐암 세포), PANC1 (췌장암 세포), HCT-116 (대장암 세포), L929 (생쥐 섬유모세포)를 48 well에 2×104 cells/well의 농도로 각 well에 300 μL씩 분주하고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 각각의 세포에 풀루란-클로린 e6(PuC), 올레산-풀루란-클로린 e6(OPuC)를 클로린 e6을 기준농도로 0.01 내지 2.00 μg/mL의 다양한 농도로 처리하고 레이저를 조사하지 않은 군(Laser(-))과 2 J/cm2 의 세기로 조사한 군(Laser(+))을 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 반응시킨 후 MTT 시험법을 이용하여 세포생존율을 확인하였다. MTT 용액 처리 후 나타나는 형광강도를 570nm에서 멀티리더기 (Synergy H1 Multi-mode Reader, Biotek)을 이용하여 확인하였다.
7-2. 실험결과
광원을 조사하지 않은 군의 경우 모든 농도에서 70% 이상의 세포 생존율을 나타냈다. 풀루란-클로린 e6의 경우 레이저를 조사해준 경우에도 세포 생존율이 눈에 띄게 감소한 경향은 나타나지 않았다. 올레산-풀루란-클로린 e6에 광원을 조사해준 그룹의 세포 생존율을 확인했을 때, A549의 경우 0.25 μg/mL에서 27.0%의 생존율을, PANC1의 경우 0.10 μg/mL에서 12.8%의 생존율을, HCT-116의 경우 0.25 μg/mL에서 45.9%의 생존율을, L929의 경우 0.25 μg/mL에서 12.4%의 생존율을 보였다.
따라서, 상기 실시예 1-5에서 제조한 올레산-풀루란-클로린 e6의 광원 조사 여부에 따른 세포독성을 여러 가지 세포주에서 비교했을 때, 광원 조사 시에 세포독성이 농도 증가에 따라 증가한 것을 확인할 수 있었다. 그중 암세포에 해당하는 A549, PANC1, HCT116에서는 더 낮은 농도에서 심한 광독성이 나타났으며, 정상세포에 해당하는 L929에서는 암세포보다 높은 농도에서 광독성이 나타나기 시작했다. 이로써 올레산-풀루란-클로린 e6가 암세포 특이적으로 광독성을 야기할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다(도 11).

Claims (13)

  1. 올레산, 풀루란 고분자 및 광감작제로 이루어지며,
    상기 풀루란 고분자 주사슬에 한 개 이상의 올레산과 광감작제를 에스터 결합(ester bond)으로 결합한 올레산-풀루란 고분자 연결체-광감작제 결합체를 유효성분으로 포함하는, 장내분비 암세포를 표적으로 하는 광역학 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 광감작제는 포르피린계(phorphyrins) 화합물, 클로린계(chlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phtalocyanines) 화합물 및 나프탈로시아닌계(naphthalocyanines) 화합물로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는, 광역학 치료용 약학 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 올레산, 풀루란 고분자 및 광감작제는 1:(1 내지 30):(0.1 내지 10)의 질량비로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 광역학 치료용 약학 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 결합체는 광 조사에 의해 생체 외 또는 생체 내에서 광감작제의 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 광역학 치료용 약학 조성물.
  12. 삭제
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 광역학 치료용 약학 조성물은 위장암, 직장암, 췌장암, 십이지장 암, 소장암, 대장암 및 간장암으로 이루어진 군에서 선택되는 소화기계 암을 표적으로 하는 것을 특징으로 하는, 광역학 치료용 약학 조성물.
KR1020200003641A 2020-01-10 2020-01-10 지방산을 유효성분으로 포함하는 수용성 광감작제 결합체 및 이의 제조방법 KR102266865B1 (ko)

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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110101338A (ko) * 2010-03-08 2011-09-16 가톨릭대학교 산학협력단 광역학 진단 또는 치료를 위한 생체 적합성 고분자와 광감작제의 결합체 및 이의 제조방법
KR101405403B1 (ko) * 2010-01-20 2014-06-11 주식회사 진코스 클로린 유도체와 불포화 지방산의 접합체, 이를 함유하는 광감작제, 및 이를 포함하는 광역학 치료에 사용하기 위한 암 치료용 조성물
KR20160088748A (ko) 2015-01-16 2016-07-26 가톨릭대학교 산학협력단 광역학 진단 또는 치료용 광감작제 및 이를 이용한 광역학 치료방법
KR20170031637A (ko) * 2015-09-11 2017-03-21 가톨릭대학교 산학협력단 고분자 또는 지질, α-리포익산 및 광감작제를 포함하는 약물전달체

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101405403B1 (ko) * 2010-01-20 2014-06-11 주식회사 진코스 클로린 유도체와 불포화 지방산의 접합체, 이를 함유하는 광감작제, 및 이를 포함하는 광역학 치료에 사용하기 위한 암 치료용 조성물
KR20110101338A (ko) * 2010-03-08 2011-09-16 가톨릭대학교 산학협력단 광역학 진단 또는 치료를 위한 생체 적합성 고분자와 광감작제의 결합체 및 이의 제조방법
KR20160088748A (ko) 2015-01-16 2016-07-26 가톨릭대학교 산학협력단 광역학 진단 또는 치료용 광감작제 및 이를 이용한 광역학 치료방법
KR20170031637A (ko) * 2015-09-11 2017-03-21 가톨릭대학교 산학협력단 고분자 또는 지질, α-리포익산 및 광감작제를 포함하는 약물전달체

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 2013. Vol.127, pp.28-37.* *

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