CN102895670A - 水溶性分子靶向卟吩光敏剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水溶性分子靶向光敏剂及其制备方法。该光敏剂包括PEG二胺的桥链的两端分别连接叶酸和带有取代基的卟吩，其中卟吩上可连有其它取代基，PEG的平均分子量为1000-10000。其合成方法是由PEG二胺与叶酸反应，得到单叶酸取得的PEG胺，再与卟吩上的羧基、酰氯或酸酐取代基发生酰胺化反应得到卟吩-PEG-叶酸目标光敏剂。该光敏剂具有良好的光动力活性和肿瘤靶向性和满意的水溶性，可实现静脉给药，且可降低巨噬细胞对其的吞噬作用，延长其体内循环时间，提高其生物利用度。同时，该水溶性分子靶向光敏剂的制备方法操作简便，条件温和，可重复性强。

Description

水溶性分子靶向卟吩光敏剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种分子靶向光敏剂及其制备方法，特别是一种由叶酸受体介导的用于肿瘤靶向性光动力治疗的光敏剂及其制备方法。

背景技术

肿瘤在我国每年的发病率为230万，平均每分钟有3人死于肿瘤，已严重威胁人类健康。肿瘤光动力治疗（Photodynamic Therapy, PDT）是现代肿瘤微创或无创治疗领域的发展方向。由于光敏剂自身在没有光照射时对人体是安全的，而PDT充分利用激光选择性照射病灶和光敏剂选择性蓄积的双重选择作用特异地杀伤肿瘤细胞，对健康组织损害小。最近二十几年，PDT已陆续被各国政府正式批准进入临床，成为治疗多种肿瘤的一项常规手段。

PDT治疗的基础是光动力作用,它需要具备三个基本要素：光敏剂、光与分子氧。当给予光敏剂后，以特定波长的光照射肿瘤部位，在分子氧的参与下，通过光化学反应，产生化学性质非常活泼的单态氧(¹O₂ )和自由基，氧化多种生物大分子，损伤破坏细胞和组织，最终导致肿瘤细胞的死亡。因而光敏剂的光动力活性决定了PDT 的疗效。现临床上使用的光敏剂—Photofrin，在波长大于600 nm的红光区吸收较弱，导致光动力反应深度不能满足浸润较深的肿瘤的治疗要求；加之成分复杂，难以实现稳定规范的质量控制；特别是其中对肿瘤无选择性定位作用的卟啉含量高且在体内清除缓慢，使用后皮肤的光毒反应将持续1-3个月。

现一些已进入临床试验阶段的第二代光敏剂虽都具有结构单一、单态氧产率高、在红光区（波长650－800 nm）有较强吸收等优点，但是由于它们的肿瘤靶向性不强，导致除肿瘤组织以外的正常组织，如皮肤等对光敏剂的吸收，使病人在接受了光动力治疗后仍需长时避光以减轻皮肤红肿、色素沉着等光毒反应。为提高卟啉光敏剂的肿瘤靶向性，人们在卟啉光敏剂分子中引入一些具有生物识别功能的效应分子，如单克隆抗体（Hamblin, M.R, Miller J. L, Rizvi I, et al. Can Res. 2001, 61, 7155-7162）、多肽 (Noemie T, Denise B, Philippe B, et al . J Photochem Photobiol B；Biol, 2009, 96, 101-108)等得到一些偶联光敏剂，这些效应分子虽在一定程度上提高了光敏剂的靶向性，但由于单克隆抗体组织渗透能力弱、制备方法复杂及可能的免疫原性使其应用受到限制；而大多数多肽化合物在体内的半衰期很短，生物利用率低，且只有少数的多肽受体在肿瘤细胞中有高表达，因而多肽类靶向性光敏剂的应用同样受到极大的限制。

叶酸受体(folate receptor，FR)是一种糖基化磷脂酰肌醇连接的膜糖蛋白，研究发现，FR在正常组织中为低表达，而在大部分恶性肿瘤中为高表达，另FR对叶酸及叶酸类似物具有很高的亲和力，可介导其内吞进入细胞，是生物细胞最具特点的转运过程之一。鉴于叶酸受体在正常组织和恶性肿瘤组织中表达的差异性，利用叶酸对叶酸受体的高亲和性而实现叶酸受体介导的靶向性治疗已引起人们的广泛关注。由叶酸修饰的抗肿瘤药物的研究已不断见诸报道，但叶酸化光敏剂的靶向性研究并不多见。

在公告号为CN101569627的中国发明专利中公开了一种分子靶向光敏剂及其制备方法，其是利用一个脂肪短链通过醚键和酰胺键实现了卟啉分子与叶酸的键连。生物活性实验表明，被叶酸修饰后，卟啉光敏剂的肿瘤靶向性得到了明显提高。然而，由于卟啉分子自身的光动力活性不高，使得叶酸-卟啉靶向性光敏剂的光动力活性不理想；另外，卟啉多为脂溶性大环化合物，难溶于水，而叶酸的溶解性又极为有限，尤其在生理环境中几乎不溶，所以通过这些脂肪短链连接的卟啉-叶酸缀合物在生理环境中的溶解性都极差，导致这些靶向光敏剂静脉给药十分困难。为此，研制既有满意的光动力肿瘤靶向性，更有良好的光动力活性和水溶性的光敏剂，对提高肿瘤光动力疗法的疗效具有十分重要的理论和临床意义。

发明内容

本发明的目的之一就是提供一类具有良好肿瘤靶向性和光动力活性及水溶性的光敏剂。该光敏剂以卟吩作为光活性效应分子，叶酸作为靶向基团，PEG作为桥连基，具有良好的光动力活性和肿瘤靶向性和满意的水溶性，可实现静脉给药，且可降低巨噬细胞对其的吞噬作用，延长其体内循环时间，提高其生物利用度。

本发明的技术方案是：

水溶性分子靶向光敏剂，该光敏剂包括PEG二胺的桥链的两端分别连接叶酸和带有取代基的卟吩，所述卟吩结构通式如下所示：

卟吩结构通式中，卟吩结构通式I中取代基R₁-R₂₀中至少有一个R取代基，其它的为H、烃基、羟基、氨基、烃氧基中的一种或几种；卟吩结构通式II中R₁-R₆为H、烃基、羟基、烃氧基、氨基中的一种或几种；卟吩结构通式III中R₁为羟基、胺基或烃氧基，R₂-R₇为H、烃基、羟基、烃氧基、氨基中的一种或几种；卟吩结构通式IV中R₁和R₂中至少有一个为R"取代基，R₁和R₂中的另一个取代基为羟基或氨基或烃氧基， R₃为羟基或胺基或烃氧基，R₄-R₉为H、烃基、羟基、烃氧基、氨基的一种或几种。

所述的烃基为C₁～C₁₀的直链或支链烷烃基、烯烃基或炔烃基，烃氧基为C₁～C₁₀的直链或支链烷氧基、烯氧基或炔氧基。

卟吩结构通式I、II、III、IV取代基R、R＇、R"中的n为22～220。

制备水溶性分子靶向光敏剂的方法，包括以下两个步骤：

1）取聚乙二醇二胺（NH₂PEGNH₂），与等摩尔的叶酸在缩合剂催化下避光缩合反应，反应温度≥0℃且≤100℃，反应时间≥0.5小时且≤100小时，经柱层析分离纯化，得到叶酸PEG胺；

2）步骤1）生成的叶酸PEG胺与等摩尔的卟吩在缩合剂催化下避光缩合反应，反应温度≥0℃且≤100℃，反应时间≥0.5天且≤10天，经过柱层析分离纯化，得到水溶性分子靶向光敏剂；

上述反应中所用的反应溶剂均为二甲亚砜（DMSO）。

上述制备过程中，叶酸与缩合剂的摩尔比为10:1～1:10。

步骤2）中卟吩与缩合剂缩合反应时，卟吩上的羧基或酸酐与缩合剂缩合反应。

卟吩上的羧基或酸酐与缩合剂的摩尔比为10:1～1:10。

所述的缩合剂为N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）或DCC和N-羟基二酰亚胺的混合物。

所述N-羟基二酰亚胺为N-羟基琥珀酸亚胺（NHS）或N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺(HONb)。

所述DCC与N-羟基二酰亚胺的摩尔比为10:1～1:10。

所述柱层析分离纯化中柱层析采用的固定相为反相硅胶或离子交换树脂，流动相为质子溶剂或质子溶剂与极性溶剂的混合液。

质子溶剂为水或甲醇或乙醇，极性溶剂如四氢呋喃或氯仿或乙腈或二氧六环，质子溶剂与极性溶剂的体积比为10:0～1:10。

卟吩作为第二代光敏剂，其光动力活性已得到普遍的认可，其中几个卟吩光敏剂已进入临床试验阶段。在本发明中，选用卟吩作为光活性效应基团，使得目标光敏剂的光动力活性得到了保证。而利用叶酸作用靶向基团，可通过叶酸与叶酸受体的特异性结合及叶酸受体的内吞作用目标光敏剂的肿瘤靶向性，达到减少用药量、降低病人皮肤光毒反应的目的。同时，利用两亲的PEG链连接光效应基团和靶向基团，可明显改善目标光敏剂的水溶性，实现其静脉给药。而且，长链PEG的引入，可减少体内巨噬细胞对其的吞噬作用，从而延长了体内循环的时间，间接提高了其生物利用率。

同时，该水溶性分子靶向光敏剂的制备方法操作简便，条件温和，可重复性强。

由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：

1.结构中的卟吩基团保证了该类光敏剂的光动力活性；

2.结构中的叶酸基团使该类光敏剂可在叶酸受体的介导下实现对肿瘤细胞的主动靶向性；

3.结构中的PEG链改善了该类光敏剂的水溶性，减少了体内巨噬细胞对其的吞噬，延长了体内循环时间，提高了其生物利用率。

4.制备方法操作简便，条件温和，可重复性强。

附图说明

图1为实施例7细胞对光敏剂吞噬作用示意图，图中，I 为实施例1中所得光敏剂，F 为叶酸，A549 为人肺腺癌细胞（叶酸受体阴性细胞）；HeLa 为人宫颈癌细胞（实验受体阳性细胞）；Hep-2 为人表皮样喉癌细胞（叶酸受体阳性细胞）；

图2为实施例8光敏剂I浓度对Hep-2细胞的细胞毒性示意图，图中 A为光照条件下；B为无光照条件下。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明：

一.试剂和材料

人肺腺癌A549细胞株、人宫颈癌HeLa细胞株和人表皮样喉癌Hep-2细胞株购于中国科学院上海生命科学研究所细胞库；

5-对羧基苯基-10,15,20-三间羟基苯基二氢卟吩由本实验室合成（见刁俊林，高华，童斌雪，周洁，李东红等著：“5-对羧基苯基-10,15,20-三间羟基苯基二氢卟吩的合成”，《精细化工中间体》，2011，41（4），40-42）、紫红素和焦脱镁叶绿酸购于上海先辉医药科技有限公司；

细胞培养材料购于Costar (Dutscher, B rumath, France)；

胎牛血清、青霉素、链霉素和DPBS购于Hyclone (Logan, Utah, USA)； 

胰蛋白酶、MTT、DMSO、NHS、叶酸和聚乙二醇二胺购于Sigma-Aldrich；

无叶酸RPMI-1640 购于Gibco (USA)；

透析袋购于上海生物工程公司；

阴离子交换树脂购于TOSOH(日本)；

反相硅胶购于YMC（日本）；

其它普通化学试剂均为市购分析级试剂。

二．实施例

本发明所述的水溶性分子靶向光敏剂是由中位苯环或吡咯环上带有不同取代基的卟吩结构单元通过PEG二胺与叶酸结构单元利用两个酰胺键结合起来的化合物。

 卟吩结构通式如上所述。其中，卟吩结构通式的取代基可以是H、烃基、羟基、氨基或烃氧基等。PEG的平均分子量为1000—10000。

   本发明的水溶性分子靶向光敏剂的制备方法是按如下步骤进行的：

（1）、首先用聚乙二醇二胺（NH₂PEGNH₂，PEG）与叶酸在缩合剂催化下避光缩合反应，控制反应的温度和时间，纯化，得到单叶酸取代的PEG胺；

（2）、叶酸PEG胺与卟吩上的羧基或酸酐在缩合剂催化下避光缩合反应，控制反应的温度和时间，纯化，得到水溶性的卟吩-PEG-叶酸目标靶向光敏剂

制备过程中较好的方法是：

（1）、PEG的平均分子量为1000—10000，较好的为1000—5000。反应的温度为0℃－100℃，较好的为20℃－50℃；反应时间为0.5－100小时，较好的为5－50小时。

（2）、中位苯环或吡咯环上的取代基，可以是H、烃基、羟基、氨基或烃氧基等；较好的为H、羟基、烃基或烃氧基。反应温度为0℃－100℃，较好的为20℃－50℃；反应时间为0.5 d－10 d，较好的为2 d－5d。 

（3）缩合反应时所用的缩合剂为N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）或DCC与N-羟基二酰亚胺[如N-羟基琥珀酸亚胺（NHS）、N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺(HONb)等]的混合物，较好的为DCC或DCC与NHS的混合物，且DCC和N-羟基二酰亚胺的比例为10:1～1:10，较好的为2:1～1:2。

（4）缩合反应时，叶酸与缩合剂的摩尔比为10:1—1:10，较好的为1:1—1:5；卟吩上的羧基或酸酐与缩合剂的摩尔比为10:1—1:10，较好的为1:1—1:5。

（5）粗产物经柱层析分离纯化时所用的固定相为反相硅胶或离子交换树脂，流动相为质子溶剂或质子溶剂与极性溶剂的混合物，质子溶剂如水、甲醇、乙醇、醋酸-醋酸钠缓冲液、盐酸-氯化钠缓冲液、氨水-醋酸胺缓冲液等，极性溶剂如四氢呋喃、氯仿、乙腈及二氧六环等，质子溶剂与极性溶剂的体积比为10:0—1:10。较好的为分离纯化叶酸PEG胺时用离子交换树脂，流动相用水、甲醇、醋酸-醋酸钠缓冲液和氨水-醋酸胺缓冲液；纯化卟吩-PEG-叶酸时用反相硅胶，流动相为水、乙腈或水与乙腈的混合液，水与乙腈的体积比为1:0—1:5。

    下面结合具体实施例对本发明上述的方法作相应的说明：

实施例1：叶酸-PEG（3350）NH₂的合成

称取221 mg 叶酸溶于5 ml DMSO中，加入20 ml吡啶和110 mg DCC，搅拌下加入1.68 g H₂N-PEG-NH₂(3350), 室温避光反应30 h后，加入10 ml去离子水，以去离子水为介质透析除去DMSO 和吡啶等小分子杂质，冻干，用阴离子交换树脂分离纯化，得到叶酸-PEG（3350）NH₂，产率25%。UV-vis(λ): 281(0.2431), 347(0.0534); HPLC(8.7, 98%)。

实施例2：叶酸-PEG（2000）NH₂的合成

称取442 mg 叶酸溶于12 ml DMSO中，加入35 ml吡啶，250 mg DCC和130 mg NHS，搅拌下加入2.0 g H₂N-PEG-NH₂(2000), 50℃避光反应12 h后，加入30 ml去离子水，以去离子水为介质透析除去DMSO 和吡啶等小分子杂质，冻干，用阴离子交换树脂分离纯化，得到叶酸-PEG（2000）NH₂，产率22%。UV-vis(λ): 281(0.2237), 347(0.0555); HPLC(8.4, 97%)。

实施例3：5-对羧基苯基-10,15,20-三间羟基苯基二氢卟吩-PEG（2000）-FOL的合成

称取18.7 mg 5-对羧基苯基-10,15,20-三间羟基苯基二氢卟吩，11 mg DCC和6 mg NHS，溶于2 ml DMSO中，氩气保护，于50℃避光反应24 h后，加入26.4 mg FOL-PEG（2000）-NH₂，继续避光反应5d，加2 ml蒸馏水，停止反应，冷冻干燥。粗产品经反相硅胶分离纯化（乙腈：水= 1:1），冷冻干燥，得目标产品30 mg，产率：36.5%; UV-vis(λ): 281(0.5468), 408(1.0595), 419(1.2341), 518(0.1211), 547(0.0810), 598(0.0462), 650(0.2341); HPLC(10.4, 97%)。其结构图如下：

实施例4：5-对羧基苯基-10,15,20-三间羟基苯基二氢卟吩-PEG（3350）-FOL的合成

称取37.4 mg 5-对羧基苯基-10,15,20-三间羟基苯基二氢卟吩，15 mg DCC和8 mg NHS，溶于5 ml DMSO中，氩气保护，于25℃避光反应24 h后，加入177 mg FOL-PEG（3350）-NH₂，继续避光反应2d，加5 ml蒸馏水，停止反应，冷冻干燥。粗产品经反相硅胶分离纯化（乙腈：水= 1:2），冷冻干燥，得目标产品70.9 mg，产率：30%; UV-vis(λ): 281(0.5937), 407(1.0992), 419(1.2453), 519(0.1133), 547(0.0807), 598(0.0460), 650(0.2315); HPLC(10.7, 98%)。

实施例5: 焦脱镁叶绿酸-PEG-FOL的合成

称取焦脱镁叶绿酸20.99 mg，DCC 16.26 mg及NHS 9.08 mg，溶于2 ml DMSO中，氩气保护，于20℃避光反应24 h后，将150 mg FOL-PEG（3350）-NH₂加入上述体系中，反应8 d后，加2 ml蒸馏水停止反应，粗产品经反相硅胶分离纯化（乙腈：水=1:2），冷冻干燥，得目标产品13 mg，产率7.60%。UV-vis(λ): 281(0.2248), 408(0.4643), 507(0.0424), 538(0.0394),  607(0.0449), 664(0.2053); HPLC(13.5, 98%)。其结构图如下：

实施例6：紫红素-PEG-FOL的合成

称取22.26 mg紫红素，150 mg FOL-PEG（3350）-NH₂溶于1.5 ml DMSO中，加入0.5 ml三乙胺，氩气保护，于40℃避光反应6 d后，冷冻干燥，粗产品经反相硅胶分离纯化（乙腈：水 = 2:1），冷冻干燥，得目标产品20 mg，产率11.61%。UV-vis(λ): 287(0.8660), 367(0.7323), 410(1.1591), 508(0.1756), 549(0.2510), 666(0.2363),700(0.4552); HPLC(10.9, 97%)。其结构图如下：

实施例7：本发明对肿瘤细胞的靶向作用 

将处于对数生长期浓度为5×10⁴ /mL的人肺腺癌A549细胞（叶酸受体阴性细胞）、人宫颈癌HeLa细胞和人表皮样喉癌Hep-2细胞分别接种到12孔板中的载玻片上，每种细胞接种2孔，分别用无叶酸RPMI-1640培养24 h后，每种细胞1孔加光敏剂I，使其终浓度为1.85×10^-5 M，1孔加光敏剂I和叶酸，使其终浓度分别为1.85×10^-5 M和2×10^-3 M，培养24 h后，倾去培养液，DPBS洗涤3次，每孔用4%多聚甲醛固定20 min后，吸出液体，DPBS洗涤，甘油封片，激光共聚焦测定各孔细胞中光敏剂的荧光强度（Ex: 480 nm; Em: 660 nm）。

如图1所示，光敏剂I在叶酸受体阳性细胞（HeLa和Hep-2细胞）中的荧光强度明显大于在叶酸受体阴性细胞（A549）中的荧光强度，即叶酸受体阳性细胞对该光敏剂的吸收明显强于叶酸受体阴性细胞，且这种内吞作用被大量加入的自由叶酸所抑制，说明这种内吞作用是由肿瘤细胞表面的叶酸受体介导的。

实施例8：本发明对鼻咽癌Hep-2细胞株的细胞毒性作用

将5×10⁴ /ml的Hep-2细胞接种到可拆卸的96孔培养板中，培养至对数生长期后分为15个组，除正常对照组外其余各组分别加入不同浓度的PS I，使其终浓度分别为110 mmol/L(C1)、55 mmol/L(C2)、28 mmol/L(C3)、14 mmol/L(C4)、6.8 mmol/L(C5)、3.4 mmol/L(C6)、1.7 mmol/L(C7)、0.85 mmol/L(C8)、0.43 mmol/L(C9)，其中C1-C5各设两个组，每组4个复孔。培养24 h后，移去培养液，冷PBS洗3次，换用新鲜培养液，除正常对照组和5个浓度组（C1-C5）外，其余9个浓度组分别单独用红光治疗仪垂直照射3 min。光照后继续于孵箱中培养24 h，然后每孔加MTT 溶液20 ml (5 mg/ml in PBS)，培养4 h 后弃上清, 加入150 ml DMSO，振动10 min，用酶标仪测定570 nm波长处吸收值，以DMSO空白孔调零，并按下式计算细胞存活率( SR)：SR = 实验组OD值/对照组OD值×100%。

如图2所示，在所试验的浓度范围内，无光照时，Hep-2细胞的存活率和正常对照组（无光敏剂、无光照）一样，且不受光敏剂浓度变化的影响。但其光毒性却随浓度的增加而增加，当浓度为14 mmol/L时，Hep-2细胞的存活率已降低到33.9%。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。

Claims (13)

1.一种水溶性分子靶向光敏剂，其特征是，该光敏剂包括PEG二胺的桥链的两端分别连接叶酸和带有取代基的卟吩，所述卟吩结构通式如下所示：

。

2.根据权利要求1所述的水溶性分子靶向光敏剂，其特征在于：卟吩结构通式I中取代基R₁-R₂₀中至少有一个R取代基，其它的为H、烃基、羟基、氨基、烃氧基中的一种或几种；卟吩结构通式II中R₁-R₆为H、烃基、羟基、烃氧基、氨基中的一种或几种；卟吩结构通式III中R₁为羟基、胺基或烃氧基，R₂-R₇为H、烃基、羟基、烃氧基、氨基中的一种或几种；卟吩结构通式IV中R₁和R₂中至少有一个为R"取代基，R₁和R₂中的另一个取代基为羟基或氨基或烃氧基， R₃为羟基或胺基或烃氧基，R₄-R₉为H、烃基、羟基、烃氧基、氨基的一种或几种。

3.根据权利要求2所述的水溶性分子靶向光敏剂，其特征在于：所述的烃基为C₁～C₁₀的直链或支链烷烃基、烯烃基或炔烃基，烃氧基为C₁～C₁₀的直链或支链烷氧基、烯氧基或炔氧基。

4.根据权利要求1所述的水溶性分子靶向光敏剂，其特征在于：卟吩结构通式I、II、III、IV取代基R、R＇、R"中的n为22～220。

5.权利要求1-4任一所述的水溶性分子靶向光敏剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下两个步骤：

1）取聚乙二醇二胺（NH₂PEGNH₂），与等摩尔的叶酸在缩合剂催化下避光缩合反应，反应温度≥0℃且≤100℃，反应时间≥0.5小时且≤100小时，经柱层析分离纯化，得到叶酸PEG胺；

2）步骤1）生成的叶酸PEG胺与等摩尔的卟吩在缩合剂催化下避光缩合反应，反应温度≥0℃且≤100℃，反应时间≥0.5天且≤10天，经过柱层析分离纯化，得到水溶性分子靶向光敏剂；

上述反应中所用的反应溶剂均为二甲亚砜（DMSO）。

6.根据权利要求5所述的水溶性分子靶向光敏剂的制备方法，其特征在于：叶酸与缩合剂的摩尔比为10:1～1:10。

7.根据权利要求5所述的水溶性分子靶向光敏剂的制备方法，其特征在于：步骤2）中卟吩与缩合剂缩合反应时，卟吩上的羧基或酸酐与缩合剂缩合反应。

8.根据权利要求7所述的水溶性分子靶向光敏剂的制备方法，其特征在于：卟吩上的羧基或酸酐与缩合剂的摩尔比为10:1～1:10。

9.根据权利要求5-8任一所述的制备方法，其特征在于：所述的缩合剂为N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）或DCC和N-羟基二酰亚胺的混合物。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述N-羟基二酰亚胺为N-羟基琥珀酸亚胺（NHS）或N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺(HONb)。

11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述DCC与N-羟基二酰亚胺的摩尔比为10:1～1:10。

12.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述柱层析分离纯化中柱层析采用的固定相为反相硅胶或离子交换树脂，流动相为质子溶剂或质子溶剂与极性溶剂的混合液。

13.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：质子溶剂为水或甲醇或乙醇，极性溶剂如四氢呋喃或氯仿或乙腈或二氧六环，质子溶剂与极性溶剂的体积比为10:0～1:10。

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