CN105343878B - 还原敏感型水溶性分子靶向光敏剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种还原敏感型水溶性分子靶向光敏剂，所述光敏剂是由间‑四羟基苯基卟吩(mTHPC)和叶酸基团通过碳酸酯键、二硫键及PEG链依次连接形成的缀合物。本发明还提供了用于制备所述光敏剂的卟吩中间体和叶酸PEG半胱酰胺中间体。本发明进一步提供了所述靶向光敏剂的制备方法。本发明提供了一种具有良好肿瘤靶向性和光动力活性及水溶性的光敏剂，通过在分子结构中引入双硫键和碳酸酯键，使得目标光敏剂在进入细胞后，可在肿瘤细胞的强还原性环境中发生巯基和双硫键的交换反应及分子内的亲核取代反应，从而完整地释放出mTHPC，保证了mTHPC的光动力活性不会因结构的改变而有所降低。

Description

还原敏感型水溶性分子靶向光敏剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物学和医学领域，具体地，本发明涉及一种分子靶向光敏剂及其制备方法，尤其涉及一种由叶酸受体介导的用于肿瘤靶向性光动力治疗的光敏剂及其制备方法。

背景技术

肿瘤光动力治疗(Photodynamic Therapy,PDT)是一种新兴的肿瘤微创或无创治疗方法。它通过先给予对肿瘤组织具有选择性聚集作用的光敏剂，再用特定波长的光源照射病灶从而在病灶触发光动力氧化损伤而杀死肿瘤细胞。因其具有靶向性、可重复性和协同性而受到人们的关注。在近二十几年来，PDT已陆续被各国政府正式批准进入临床，成为多种肿瘤的一种常规治疗手段，其中对浅表部位肿瘤的疗效尤为突出。

PDT治疗的基础是光动力作用,它包含三个基本要素:光敏剂、光与分子氧。光敏剂的光动力活性决定了PDT的疗效，是PDT的核心物质。现临床上使用的第一代光敏剂—血卟啉衍生物(Photofrin)为组成不固定的混合物，成分复杂，难以实现稳定规范的质量控制；其在波长大于600nm的红光区吸收较弱，导致光动力反应的强度不能满足浸润较深的肿瘤的治疗要求，治疗时需要较高的药剂量或光剂量，毒副作用大；特别是其在体内清除缓慢，使用后皮肤的光毒反应将持续1个月以上，病人需避光4-6周之久。间-四羟基苯基卟吩(mTHPC)作为第二代光敏剂的典型代表，与Photofrin相比，不仅结构明确、单一，且在600～800nm的“治疗窗”内吸收系数高出一个数量级，是目前光动力效应最强的光敏剂之一。2001年首先在欧洲被批准用于头颈部肿瘤的治疗。但mTHPC的肿瘤靶向性仍亟待提高；而且，其明显的暗毒性也制约着其临床应用(Bovis M,Woodhams J H,Loizidou M,et al.JControl Release,2012,157,196-205)；同时其疏水特性使得其在生理环境中聚集，明显降低了其光动力活性(Petri A,Yova D,Alexandratou E,et al.Photodiag PhotodynTherapy,2012,9,344-354)。

目前，基于叶酸受体在正常组织和恶性肿瘤组织中表达的差异性，以及叶酸受体对叶酸的高亲和性而进行的肿瘤靶向性治疗已引起人们的极大关注。人们将反义寡核苷酸(ASON)、抗肿瘤药物、转基因药物、放疗药物及药物载体等与叶酸或叶酸类似物偶联，通过叶酸受体介导进入肿瘤细胞内，从而实现靶向性治疗。在公开号为CN101569627的中国发明专利申请中公开了一种分子靶向光敏剂及其制备方法，其是利用一个脂肪短链通过醚键和酰胺键实现了卟啉分子与叶酸的键连。生物活性实验表明，被叶酸修饰后，卟啉光敏剂的肿瘤靶向性得到了明显提高。然而，由于卟啉分子自身的光动力活性不高，使得叶酸-卟啉靶向性光敏剂的光动力活性不理想；另外，卟啉多为脂溶性大环化合物，难溶于水，而叶酸的溶解性又极为有限，尤其在生理环境中几乎不溶，所以通过这些脂肪短链连接的卟啉-叶酸缀合物在生理环境中的溶解性都极差，导致这些靶向光敏剂静脉给药十分困难。本申请的发明人在研究中曾以mTHPC为母体，经结构修饰得到叶酸卟吩缀合物，发现由于叶酸分子的介入明显改善了其对叶酸受体阳性细胞的靶向性；同时，PEG链的应用又使其表现出良好的水脂溶性和在溶液中明显降低的聚集作用(Donghong Li,Pengxi Li,Huiyun Lin,et al.JPhotochem Photobio B Bio,2013,127,28-37)。然而，在考察其光动力活性时发明人发现，虽然其肿瘤靶向性和水脂溶性都得到明显的改善，但其光动力抑瘤活性却不如前体化合物mTHPC。这是因为经过化学修饰，叶酸卟吩缀合物在分子结构上与mTHPC相比已发生很大的变化，这些分子结构的改变严重地影响了其光动力活性。为此，如能在引入肿瘤靶向基团-叶酸的同时又能保持mTHPC分子结构的完整性，则可在提高mTHPC肿瘤靶向性的同时又保持其良好的光动力活性。

在动物和人体的细胞内，谷胱甘肽(GSH)是最丰富的低分子生物活性巯基(-SH)化合物，最主要的还原物质。在体液和细胞膜上，GSH的浓度很低，而在细胞内GSH的浓度很高，使得细胞内呈现出很强的还原环境。且由于代谢异常，其在肿瘤细胞中的浓度更是正常细胞的4～10倍(Wu G,Fang YZ,Yang S,et al.J Nutr,2004,134,489-492.)。而巯基与双硫键(-S-S-)之间的交换反应更具有快速，容易和可逆的特点，使其在维持细胞生物活性如保持蛋白质的结构稳定性，酶的活性等方面发挥着重要的作用。由于细胞内外还原性的差别及巯基与双硫键交换反应的特异性，使得含双硫键的化合物在体内循环时有着较好的稳定性，但当其进入细胞后会通过巯基-双硫键的交换反应在几分钟至几小时之内迅速地断裂。为此，含双硫键的还原敏感化合物在抗肿瘤药物及药物载体的设计合成方面具有极大的价值。近年来，双硫键的还原敏感特性被应用于不稳定药物的前药设计合成及药物载体的制备，这些前药和药物载体进入细胞后，在GSH的作用下发生双硫键的断裂而释放出活性药物(Lee MH,Yang Z,Lim CW,et al.Chem Rev,2013,113,5071-5109)。

发明内容

本发明的目的之一就是提供一类具有良好肿瘤靶向性和光动力活性的还原敏感型水溶性分子靶向光敏剂。该光敏剂以mTHPC作为光活性效应分子，叶酸作为肿瘤靶向基团，两者通过碳酸酯键、双硫键(-S-S-)和PEG链连接起来。进入肿瘤细胞后在强还原性环境中通过巯基和双硫键的交换反应及分子内亲核取代反应释放出mTHPC，在光照下发挥光动力灭瘤作用。

本发明的技术方案是：

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种还原敏感型水溶性分子靶向光敏剂，所述光敏剂的结构如式Ⅲ所示：

其中，n＝1～5，m＝20～227。

本发明还提供了一种用于合成上述光敏剂的卟吩中间体，所述卟吩中间体如式Ⅰ所示：

其中，n＝1～5。

在根据本发明的一个实施方案中，所述卟吩中间体是由间-四羟基苯基卟吩(mTHPC)与2-(n-羟烷基)二硫吡啶与三光气缩合形成；优选地，所述2-(n-羟烷基)二硫吡啶选自2-(羟甲基)二硫吡啶、2-(2-羟乙基)二硫吡啶、2-(3-羟丙基)二硫吡啶、2-(4-羟丁基)二硫吡啶和2-(5-羟戊基)二硫吡啶中的一种；更优选地，选自2-(2-羟乙基)二硫吡啶、2-(3-羟丙基)二硫吡啶和2-(4-羟丁基)二硫吡啶的一种。

本发明还提供了一种用于合成上述光敏剂的叶酸PEG半胱酰胺中间体，所述叶酸PEG半胱酰胺中间体由叶酸与聚乙二醇二胺、半胱氨酸缩合形成；优选地，叶酸PEG半胱酰胺中间体的结构如式Ⅱ所示：

其中，Fol为叶酸基团，m＝20～227。

所用的半胱氨酸可以是保护氨基酸，也可以是不保护氨基酸。保护氨基酸中，氨基的保护基可以是苄氧羰基、取代的苄氧羰基、叔丁氧羰基和所有烷氧羰基型保护基；巯基的保护基可以是苄基、取代苄基、吡啶甲基、三苯甲基、四氢吡喃基、叔丁基等。

本发明进一步提供了一种制备上述光敏剂的方法，所述方法包括：

1)等摩尔的mTHPC、2-(n-羟烷基)二硫吡啶与等摩尔的三光气避光缩合反应，然后经柱层析分离纯化，得到含碳酸酯键和双硫键的卟吩中间体；其中，反应温度≥0℃且≤50℃，优选为20℃～40℃；反应时间≥0.5小时且≤40小时，优选为2～20小时；

2)聚乙二醇二胺(NH₂PEGNH₂)，与等摩尔的叶酸在缩合剂催化下避光缩合反应，然后经柱层析分离纯化，得到叶酸PEG胺；其中，所述聚乙二醇二胺的平均分子量为1000～10000，优选为1000～5000；反应温度≥0℃且≤100℃，优选为20℃～60℃；反应时间≥0.5小时且≤100小时，优选为5～50小时；

3)步骤2)生成的叶酸PEG胺与等摩尔的半胱氨酸在缩合剂催化下避光缩合反应，然后经过柱层析分离纯化，得到叶酸PEG半胱酰胺中间体；其中，反应温度≥0℃且≤100℃，优选为20℃～60℃；反应时间≥1小时且≤50小时，优选为2～20小时；

4)等摩尔的卟吩中间体与叶酸PEG半胱酰胺中间体发生巯基与双硫键的置换反应，然后，经柱层析分离纯化，得到靶向光敏剂；其中，反应温度≥0℃且≤50℃，优选为20℃～60℃；反应时间≥0.5小时且≤20小时，优选为1～10小时。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)是在反应溶剂I中进行的，所述反应溶剂I选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲亚砜(DMSO)中的一种。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤2～4是在反应溶剂Ⅱ中进行的，所述反应溶剂Ⅱ为二甲亚砜(DMSO)。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤2)和步骤3)中反应物与缩合剂的摩尔比为10:1～1:10，优选为1:1～1:5；所述的缩合剂为N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)或N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基二酰亚胺的混合物；优选地，所述N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)与N-羟基二酰亚胺的摩尔比为10:1～1:10，更优选为2:1～1:2；优选地，所述N-羟基二酰亚胺为N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)或N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺(HONb)，更优选为N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)～步骤4)所述的柱层析分离纯化是通过下述方法实现的：

以反相硅胶或离子交换树脂为固定相，以质子溶剂或质子溶剂与极性溶剂的混合液为流动相；

其中，质子溶剂选自水、甲醇、乙醇、醋酸-醋酸钠缓冲液、盐酸-氯化钠缓冲液、氨水-醋酸胺缓冲液中的一种；极性溶剂选自四氢呋喃、氯仿、乙腈或二氧六环中的一种；所述质子溶剂与极性溶剂的体积比为10:0～1:10。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤2)所述叶酸PEG胺是经离子交换树脂柱层析纯化的，其中，流动相选自水、甲醇、醋酸-醋酸钠缓冲液或氨水-醋酸胺缓冲液(各缓冲液参照张庆合主编《高效液相色谱实用手册》配制)；

步骤1)所述卟吩中间体、步骤3)所述叶酸-PEG半胱酰胺中间体以及步骤4)所述靶向光敏剂是经由反相硅胶柱层析纯化的，其中，流动相选自水、乙腈或水与乙腈的混合液，所述水与乙腈的混合液中水与乙腈的体积比为1:0—1:5。

mTHPC作为第二代光敏剂，其光动力活性在临床已得到认可。在本发明中，选用mTHPC作为光活性效应基团，使得目标光敏剂的光动力活性得到了保证。而利用叶酸作为靶向基团，可通过叶酸与叶酸受体的特异性结合及叶酸受体的内吞作用提高mTHPC的肿瘤靶向性，达到减少用药量、降低病人皮肤光毒反应的目的。同时，利用两亲的PEG链连接mTHPC和靶向基团，可明显改善mTHPC的水脂溶性，实现其静脉给药。而且，长链PEG的引入，可减少体内巨噬细胞对其的吞噬作用，从而延长体内循环的时间，间接提高其生物利用率。最为重要的是通过在分子结构中引入双硫键和碳酸酯键，使得目标光敏剂在进入细胞后，可在肿瘤细胞的强还原性环境中发生巯基和双硫键的交换反应及分子内的亲核取代反应，从而完整地释放出mTHPC，保证了mTHPC的光动力活性不会因结构的改变而有所降低。

由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：

1.结构中的mTHPC基团确定了该类光敏剂的光动力活性；

2.结构中的叶酸基团使该类光敏剂可在叶酸受体的介导下实现对肿瘤细胞的主动靶向性；

3.结构中的PEG链改善了该类光敏剂的水脂溶性，减少了体内巨噬细胞对其的吞噬，延长了体内循环时间，提高了其生物利用率。

4.结构中的双硫键和碳酸酯键使得该类光敏剂可在肿瘤细胞中完整地释放出mTHPC，不改变其分子结构，保证了其光动力活性。

附图说明

图1为实施例7细胞对光敏剂吞噬作用示意图，图中，1为实施例6中所得光敏剂，F为叶酸，A549为人肺腺癌细胞(叶酸受体阴性细胞)；HeLa为人宫颈癌细胞(叶酸受体阳性细胞)。

图2为实施例8光敏剂1浓度对HeLa细胞的光毒性示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一、试剂和材料

人宫颈癌HeLa细胞株和人肺腺癌A549细胞株购于中国科学院上海生命科学研究所细胞库；

5,10,15,20-四间羟基苯基二氢卟吩、2-(n-羟烷基)二硫吡啶均由本实验室合成，纯度>98％；

细胞培养材料购于Costar(Dutscher,B rumath,France)；

胎牛血清、青霉素、链霉素和DPBS购于Hyclone(Logan,Utah,USA)；

胰蛋白酶、MTT、DMSO、NHS、叶酸和聚乙二醇二胺购于Sigma-Aldrich；

无叶酸RPMI-1640购于Gibco(USA)；

透析袋购于上海生物工程公司；

阴离子交换树脂购于TOSOH(日本)；

反相硅胶购于YMC(日本)；

其它普通化学试剂均为市购分析级试剂。

实施例1

本发明所述的还原敏感型水溶性分子靶向光敏剂是由中位苯环上带有羟基的卟吩结构单元通过碳酸酯键、双硫键和PEG胺与叶酸结构单元利用酰胺键结合起来的缀合物。

本发明的还原敏感型水溶性分子靶向光敏剂的制备方法是按如下步骤进行的：

(1)首先mTHPC、2-(n-羟烷基)二硫吡啶与等摩尔的三光气避光缩合反应，控制反应的温度和时间，纯化，得到含碳酸酯和双硫键的卟吩中间体；卟吩中间体结构通式如式Ⅰ所示：

其中，n＝1～5。

(2)聚乙二醇二胺(NH₂PEGNH₂)与叶酸在缩合剂催化下避光缩合反应，控制反应的温度和时间，纯化，得到叶酸PEG胺；

(3)叶酸PEG胺与半胱氨酸在缩合剂催化下避光缩合反应，控制反应的温度和时间，纯化，得到叶酸PEG半胱酰胺中间体；

(4)卟吩中间体与叶酸PEG半胱酰胺中间体发生巯基与双硫键的置换反应，控制反应的温度和时间，纯化，得到还原敏感型水溶性靶向光敏剂：由PEG和双硫键连接的叶酸卟吩缀合物。

制备过程中较好的方法是：

(1)2-(n-羟烷基)二硫吡啶选自是2-(羟甲基)二硫吡啶、2-(2-羟乙基)二硫吡啶、2-(3-羟丙基)二硫吡啶、2-(4-羟丁基)二硫吡啶和2-(5-羟戊基)二硫吡啶，较好的是2-(2-羟乙基)二硫吡啶、2-(3-羟丙基)二硫吡啶、2-(4-羟丁基)二硫吡啶。反应的温度为0℃－50℃，较好的为20℃－40℃；反应时间为0.5－40小时，较好的为2－20小时。

(2)PEG二胺的平均分子量为1000—10000，较好的为1000—5000。PEG二胺与叶酸缩合时，反应的温度为0℃－100℃，较好的为20℃－60℃；反应时间为0.5－100小时，较好的为5－50小时。

(3)叶酸PEG胺与半胱氨酸缩合时，反应温度≥0℃且≤100℃，较好的为20℃－60℃；反应时间≥1小时且≤50小时，较好的为2－20小时。

(4)缩合反应时，所用的缩合剂均为N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)或DCC与N-羟基二酰亚胺[如N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)、N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺(HONb)等]的混合物，较好的为DCC或DCC与NHS的混合物，且DCC和N-羟基二酰亚胺的比例为10:1～1:10，较好的为2:1～1:2；

(5)缩合反应时，反应物与缩合剂的摩尔比为10:1—1:10，较好的为1:1—1:5。

(6)卟吩中间体与叶酸PEG半胱酰胺中间体发生反应时，反应温度≥0℃且≤50℃，较好的为20℃－60℃；反应时间≥0.5小时且≤20小时，较好的为1－10小时。

(7)粗产物经柱层析分离纯化时所用的固定相为反相硅胶或离子交换树脂，流动相为质子溶剂或质子溶剂与极性溶剂的混合物，质子溶剂如水、甲醇、乙醇、醋酸-醋酸钠缓冲液、盐酸-氯化钠缓冲液、氨水-醋酸胺缓冲液等，极性溶剂如四氢呋喃、氯仿、乙腈及二氧六环等，质子溶剂与极性溶剂的体积比为10:0—1:10。较好的为分离纯化叶酸PEG胺时用离子交换树脂，流动相用水、甲醇、醋酸-醋酸钠缓冲液和氨水-醋酸胺缓冲液；纯化卟吩中间体、叶酸-PEG半胱酰胺中间体和目标物卟吩-PEG-叶酸时用反相硅胶，流动相为水、乙腈或水与乙腈的混合液，水与乙腈的体积比为1:0—1:5。

实施例2 2-(2-羟乙基)-二硫吡啶的合成

在氩气保护下，将250ml磺酰氯加至含有25g 2-巯基吡啶的250ml干燥二氯甲烷中，室温反应4h，减压蒸干。新加入200ml二氯甲烷溶解，将50ml二氯甲烷(含有17ml 2-巯基乙醇)滴加至上述溶液，0℃反应30min后，室温过夜，减压蒸干，加入2倍的4-二甲氨基吡啶，搅拌。柱色谱分离(SiO₂,二氯甲烷：丙酮＝40:1)，得23.1g产品，产率：54.87％。¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δ9.97(s,1H),9.39(dd,J＝20.7,7.4Hz,2H),8.79(s,1H),5.34(t,J＝4.8Hz,2H),4.50(t,J＝4.8Hz,2H)；MS(ESI):188.0162(M+1)。结构式如下：

实施例3 卟吩中间体(5-{3-[(2-吡啶二硫)乙基]氧羰基氧}苯基-10,15,20-三-(3-羟基苯基)卟吩)的合成

氩气保护下，将1.36g 2-二硫乙基醇吡啶，1ml三乙胺，0.72g三光气溶于200ml二氯甲烷中，室温反应20min后，滴加至15ml乙腈(含4.5g m-THPC，1ml三乙胺)中，室温反应10h，减压蒸干溶剂，反相硅胶柱色谱分离(ODS-AQ，甲醇)，得906.5mg，产率：15.36％。UV-Vis(CH₃OH,nm):414,514,540,594,648；¹HNMR(500MHz,DMSO-d₆)δ9.81,8.72～8.21(m,6H,CH,Pyrrole),8.21～7.06(m,20H),4.48(s,2H,CH_2,OCH₂),4.17(s,4H,CH₂,Pyrrole),3.23(s,2H,CH₂,CH₂S),1.23(s,2H,NH)；MS(ESI):894.1722(M+H)；HPLC:96.6％。其结构式如下：

实施例4 叶酸-PEG(3350)NH₂的合成

221mg叶酸溶于5ml DMSO中，加入20μl吡啶和110mg DCC，搅拌下加入1.68g H₂N-PEG-NH₂(3350),氩气保护下室温避光反应30h后，以去离子水为介质透析除去DMSO和吡啶等小分子杂质，冻干，用阴离子交换树脂分离纯化，得到叶酸-PEG(3350)NH₂，产率25％。UV-vis(λ):281(0.2431),347(0.0534)；HPLC(8.7,98％)。

实施例5 叶酸-PEG(3350)半胱氨酰中间体(Ⅱ)的合成

氩气保护下，15.3g Fmoc-Cys(Trt)-OH，6.5g DCC，3.6g NHS，溶于200ml DMSO，室温活化24h。将100g叶酸PEG(3350)NH₂加至上述溶液，室温反应10h。去离子水透析，离心，取上清液，阳离子交换树脂柱色谱分离(乙酸钠-乙酸缓冲液，pH＝5.0)，冷冻干燥。所得产物溶于500ml 20％哌啶DMF溶液中，室温反应6h，去离子水透析，反相硅胶柱色谱分离(ODS-AQ，40％乙腈水)，冷冻干燥。所得产品再溶于200ml三氟乙酸，三异丙基硅烷，水，乙二硫醇(92.5:2.5:2.5:2.5)的混合溶液，室温反应8h，减压蒸干溶剂，反相硅胶柱色谱分离(ODS-AQ，10％乙腈水)，冷冻干燥。得9.65g，产率：9.41％。结构图如式Ⅱ所示：

在本实施例中，m＝74。

实施例6 目标光敏剂1合成

0.5g中间体Ⅱ溶于70ml水中，饱和碳酸钠溶液调节pH＝6.8，将该溶液加至120mlDMSO(含0.11g卟吩中间体I)中，氩气保护，室温反应5h，去离子水透析，冷冻干燥，反相硅胶柱色谱分离(ODS-AQ，40％乙腈水)，得0.22g，产率：36.89％。UV-Vis(DMSO,nm):284,418,517,544,596,650；¹HNMR(500MHz,DMSO-d₆)δ:8.58～8.64,8.01～8.39,7.09～7.68(m，ArH),6.64，4.46，4.17(-CH₂-)，4.02,3.97,3.50(-CH₂O-),3.10；MS(MALDI-TOF):m/z4786.806；HPLC:99.1％。结构式如式1所示：

其中，m＝74。

实施例7：本发明对肿瘤细胞的靶向作用

将处于对数生长期浓度为5×10⁴/mL的人肺腺癌A549细胞(叶酸受体阴性细胞)和人宫颈癌HeLa细胞株(叶酸受体阳性细胞)分别接种到12孔板中的载玻片上，每种细胞接种2孔，分别用无叶酸RPMI-1640培养24h后，每种细胞1孔加光敏剂1，使其终浓度为1.85×10^{- 5}M，1孔加光敏剂1和叶酸，使其终浓度分别为1.85×10^-5M和2×10^-3M，培养24h后，倾去培养液，DPBS洗涤3次，每孔用4％多聚甲醛固定20min后，吸出液体，DPBS洗涤，甘油封片，激光共聚焦测定各孔细胞中光敏剂的荧光强度(Ex:480nm；Em:660nm)。

如图1所示，光敏剂1在叶酸受体阳性细胞(HeLa)中的荧光强度明显大于在叶酸受体阴性细胞(A549)中的荧光强度，即叶酸受体阳性细胞对该光敏剂的吸收明显强于叶酸受体阴性细胞，且这种内吞作用被大量加入的自由叶酸所抑制，说明这种内吞作用是由肿瘤细胞表面的叶酸受体介导的。

实施例8：本发明对人宫颈癌HeLa细胞株的细胞毒性作用

将5×10⁴/ml的HeLa细胞接种到可拆卸的96孔培养板中，培养至对数生长期后分为15个组，除正常对照组外其余各组分别加入不同浓度的光敏剂1，使其终浓度分别为120μmol/L(C1)、60μmol/L(C2)、30μmol/L(C3)、15μmol/L(C4)、7.5μmol/L(C5)、3.8μmol/L(C6)、1.9μmol/L(C7)、0.9μmol/L(C8)、0.5μmol/L(C9)，每组4个复孔。培养24h后，移去培养液，冷PBS洗3次，换用新鲜培养液，除正常对照组外，其余9个浓度组分别单独用红光治疗仪垂直照射3min。光照后继续于孵箱中培养24h，然后每孔加MTT溶液20μl(5mg/ml in PBS)，培养4h后弃上清,加入150μl DMSO，振动10min，用酶标仪测定570nm波长处吸收值，以DMSO空白孔调零，并按下式计算细胞存活率(SR)：SR＝实验组OD值/对照组OD值×100％。

如图2所示，在所试验的浓度范围内，其光毒性随浓度的增加而增加，当浓度为15μmol/L时，HeLa细胞的存活率已降低到20.1％。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (20)

1.一种还原敏感型水溶性分子靶向光敏剂，其特征在于，所述光敏剂结构如式Ⅲ所示：

其中，n＝1～5，m＝20～227。

2.一种用于合成如权利要求1所述光敏剂的卟吩中间体，其特征在于，所述卟吩中间体结构如式Ⅰ所示：

其中，n＝1～5。

3.如权利要求2所述的卟吩中间体，其特征在于，所述卟吩中间体是由间-四羟基苯基卟吩(mTHPC)、2-(n-羟烷基)-二硫吡啶与三光气缩合形成，所述2-(n-羟烷基)-二硫吡啶选自2-(羟甲基)二硫吡啶、2-(2-羟乙基)二硫吡啶、2-(3-羟丙基)二硫吡啶、2- (4-羟丁基)二硫吡啶和2-(5-羟戊基)二硫吡啶中的一种。

4.如权利要求3所述的卟吩中间体，其特征在于，所述2-(n-羟烷基)-二硫吡啶选自2-(2-羟乙基)二硫吡啶、2-(3-羟丙基)二硫吡啶和2-(4-羟丁基)二硫吡啶中的一种。

5.如权利要求1所述的光敏剂，其特征在于，所述光敏剂的一个中间体为叶酸PEG半胱酰胺中间体，该中间体由叶酸与聚乙二醇二胺、半胱氨酸缩合形成。

6.根据权利要求5所述的光敏剂，其特征在于，所述优选地，叶酸PEG半胱酰胺中间体的结构如式Ⅱ所示：

其中，Fol为叶酸基团，m＝20～227。

7.一种制备如权利要求1所述的光敏剂的方法，其特征在于，所述方法包括：

1)等摩尔的间-四羟基苯基卟吩(mTHPC)、2-(n-羟烷基)-二硫吡啶与等摩尔的三光气避光缩合反应，然后经柱层析分离纯化，得到含碳酸酯键和双硫键的卟吩中间体；其中，反应温度≥0℃且≤50℃，反应时间≥0.5小时且≤40小时；

2)聚乙二醇二胺(NH₂PEGNH₂)，与等摩尔的叶酸在缩合剂催化下避光缩合反应，然后经柱层析分离纯化，得到叶酸PEG胺；其中，所述聚乙二醇二胺的平均分子量为1000～10000，反应温度≥0℃且≤100℃，反应时间≥0.5小时且≤100小时；

3)步骤2)生成的叶酸PEG胺与等摩尔的半胱氨酸在缩合剂催化下避光缩合反应，然后经过柱层析分离纯化，得到叶酸PEG半胱酰胺中间体；其中，反应温度≥0℃且≤100℃，反应时间≥1小时且≤50小时；

4)等摩尔的卟吩中间体与叶酸PEG半胱酰胺中间体发生巯基与双硫键的置换反应，然后，经柱层析分离纯化，得到靶向光敏剂；其中，反应温度≥0℃且≤50℃；反应时间≥0.5小时且≤20小时。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤1)所述的反应温度为20℃～40℃；反应时间为2～20小时。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤2)所述聚乙二醇二胺的平均分子量为1000～5000；反应温度为20℃～60℃；反应时间为5～50小时。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤3)所述的应温度为20℃～60℃；反应时间为2～20小时。

11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤4)所述的反应时间为1～10小时。

12.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)是在反应溶剂I中进行的，所述反应溶剂I选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲亚砜(DMSO)中的一种。

13.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2～4是在反应溶剂Ⅱ中进行的，所述反应溶剂Ⅱ为二甲亚砜(DMSO)。

14.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)和步骤3)中反应物与缩合剂的摩尔比为10:1～1:10；所述的缩合剂为N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)或N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基二酰亚胺的混合物。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤2)和步骤3)中反应物与缩合剂的摩尔比为1:1～1:5。

16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)与N-羟基二酰亚胺的摩尔比为10:1～1:10；所述N-羟基二酰亚胺为N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)或N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺(HONb)。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)与N-羟基二酰亚胺的摩尔比为2:1～1:2。

18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述N-羟基二酰亚胺为N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)。

19.如权利要求7、8、12～18中任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)～步骤4)所述的柱层析分离纯化是通过下述方法实现的：

以反相硅胶或离子交换树脂为固定相，以质子溶剂或质子溶剂与极性溶剂的混合液为流动相；其中，

质子溶剂选自水、甲醇、乙醇、醋酸-醋酸钠缓冲液、盐酸-氯化钠缓冲液、氨水-醋酸胺缓冲液中的一种；极性溶剂选自四氢呋喃、氯仿、乙腈或二氧六环中的一种；所述质子溶剂与极性溶剂的体积比为10:0～1:10。

20.如权利要求7、9、13～18中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)所述叶酸PEG胺是经离子交换树脂柱层析纯化的，其中，流动相选自水、甲醇、醋酸-醋酸钠缓冲液或氨水-醋酸胺缓冲液；

步骤1)所述卟吩中间体、步骤3)所述叶酸-PEG半胱酰胺中间体以及步骤4)所述靶向光敏剂是经由反相硅胶柱层析纯化的，其中，流动相选自水、乙腈或水与乙腈的混合液，所述水与乙腈的混合液中水与乙腈的体积比为1:0—1:5。