CN110075314B - 一种两亲性药药缀合物及其纳米颗粒制剂制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种两亲性药药缀合物及其纳米颗粒制剂制备方法，所述药药缀合物由含羟基疏水性抗肿瘤药物羟甲基小白菊内酯与含羟基的亲水性抗肿瘤药物构成，其中一种药物的羟基活化后与另一种药物的羟基经偶联反应得到碳酸酯键连接的两亲性药药缀合物。此两亲性药药缀合物，可在水中自组装形成纳米颗粒，在血液循环系统中具有较长的停留时间，可利用肿瘤组织的高通透性与滞留(EPR)效应，有效地自输送进入肿瘤细胞。进入肿瘤细胞后，在肿瘤微酸性环境下，所述药药缀合物的碳酸酯键发生降解，释放出两种小分子抗肿瘤药，协同抗肿瘤活性高。

Description

一种两亲性药药缀合物及其纳米颗粒制剂制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种由疏水性羟甲基小白菊内酯和亲水性抗肿瘤药物经碳酸酯键偶联得到的两亲性药药缀合物，含该缀合物的纳米颗粒制剂及其制备方法和应用。
背景技术
癌症(恶性肿瘤)目前已成为危害人类健康的主要疾病。最新数据统计显示，2018年全球有1810万癌症新增病例和960万癌症死亡病例。如何有效治疗癌症已成为全世界努力解决的难题之一。目前，临床上治疗癌症的主要手段包括：外科手术、化疗、放疗以及最新发展起来的免疫和生物治疗。其中，化疗是目前使用最广、最有效的全身性治疗手段之一。然而，大多数抗肿瘤药物都存在如下缺点：溶解性差、对正常组织毒副作用大、血液停留时间短等。针对上述问题，人们研究了各种纳米材料作为抗肿瘤药物输送载体，将药物送到癌细胞内并杀死癌细胞，如水溶性聚合物(Angew.Chem.Int.Ed.,2010,49,6288-6308)、超支化聚合物(Adv.Mater.,2010,22,4567-4590)、树枝状聚合物(Drug Discovery Today,2010,15,171-185)、脂质体(Adv.Drug Delivery Rev.,2013,65,36–48)、囊泡(Nat.Rev.Drug Discovery,2013,12,347)、聚合物纳米颗粒(J.Controlled Release,2006,112,312-319)和无机纳米颗粒(Small,2010,6,1952–1967)等。然而，这些纳米材料将药物送到癌细胞内后，其自身需要通过肾脏等器官排出体外，有可能引起肾脏等器官发生炎症或其它一些病症。此外，药物载体的尺寸也不易控制。
发明内容
本发明目的在于提供一种由疏水性抗肿瘤药物羟甲基小白菊内酯和含羟基亲水性抗肿瘤药物构建的两亲性药药缀合物及其纳米颗粒制剂，以解决现有技术中含羟基抗肿瘤药物采用其他纳米药物载体输送可能引起的炎症反应以及两种不同含羟基抗肿瘤药物难以协同治疗肿瘤等技术性问题。
本发明的另一目的在于提供上述由羟甲基小白菊内酯和含羟基亲水性抗肿瘤药物构建的两亲性药药缀合物及其纳米颗粒制剂的制备方法。
本发明的又一目的在于提供上述由羟甲基小白菊内酯和含羟基亲水性抗肿瘤药物构建的两亲性药药缀合物及其纳米颗粒制剂的用途。
本发明之目的可通过以下技术方案实现：
一种两亲性药药缀合物，所述缀合物是由疏水性抗肿瘤药物羟甲基小白菊内酯与含羟基的亲水性抗肿瘤药物通过碳酸酯键连接得到的两亲性药药缀合物；所述碳酸酯键连接是通过两种药物中任一种药物的羟基在活化后与另一种药物的羟基通过偶联反应来实现的。
一种两亲性药药缀合物纳米颗粒制剂，所述纳米颗粒制剂是由所述的两亲性药药缀合物在水中自组装而得；所述颗粒制剂的粒径在20nm-300nm范围内。
一种两亲性药药缀合物纳米颗粒制剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
S1、用活化剂对所述疏水性抗肿瘤药物羟甲基小白菊内酯的羟基进行活化后，与所述含羟基的亲水性抗肿瘤药物在有机溶剂A中进行偶联反应，得到碳酸酯键连接的两亲性药药缀合物；
或，用活化剂对所述含羟基的亲水性抗肿瘤药物的羟基进行活化后，与所述疏水性抗肿瘤药物羟甲基小白菊内酯在有机溶剂A中进行偶联反应，得到碳酸酯键连接的两亲性药药缀合物；
S2、将所述两亲性药药缀合物溶解在有机溶剂B中，室温下将其滴入水中，除去有机溶剂B，得到两亲性药药缀合物的纳米颗粒制剂。
优选地，步骤S1中，所述偶联反应是在催化剂条件下进行的。
优选地，所述含羟基的亲水性抗肿瘤药物选自下列药物中的一种：自伊立替康、拓扑替康、氟脲苷、阿糖胞苷、吉西他滨、艾沙托立宾、曲沙他滨、羟基脲、米托蒽醌、阿美蒽醌、链脲菌素、平阳霉素、博来霉素、PF-0491502、PF-04217903、Apaziquone。
优选地，所述活化剂选自1,1'-羰基二(1,2,4-三唑)或1,1'-羰基二咪唑。
优选地，所述催化剂为三乙胺、吡啶、N,N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、三乙醇胺或四丁基溴化铵。
优选地，S2中所述有机溶剂B选自N,N′-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃或乙腈。
优选地，S1中所述有机溶剂A选自二氯甲烷、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或乙腈。
一种所述的两亲性药药缀合物纳米颗粒制剂在制备抗白血病、结肠癌、脑胶质瘤恶性肿瘤药物中的应用。
所述的两亲性药药缀合物及其纳米颗粒制剂与现有技术相比，有以下优点：
本发明采用的抗肿瘤药物均为含羟基抗肿瘤药物，经碳酸酯键偶联得到的两亲性药药缀合物可在水中自组装形成纳米颗粒，在血液循环系统中具有较长的停留时间，可利用肿瘤组织的高通透性与滞留(EPR)效应，有效地自输送进入肿瘤细胞。进入肿瘤细胞后，在肿瘤微酸性环境下，所述药药缀合物的碳酸酯键发生降解，释放出两种小分子抗肿瘤药，协同抗肿瘤活性较高。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为实施例1合成的两亲性药药缀合物化学结构式示意图；
图2为实施例1合成的两亲性药药缀合物的1H NMR谱图；
图3为实施例1合成的两亲性药药缀合物的13C NMR谱图；
图4为实施例1制备的基于两亲性药药缀合物纳米颗粒制剂的透射电镜照片；
图5为实施例2中合成的两亲性药药缀合物的化学结构式示意图；
图6为实施例3中合成的两亲性药药缀合物的化学结构式示意图；
图7为实施例4中合成的两亲性药药缀合物的化学结构式示意图；
图8为实施例1中制备的两亲性药药缀合物纳米颗粒制剂抑制肿瘤细胞生长示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
将羟甲基小白菊内酯(352mg)和1,1'-羰基二(1,2,4-三唑)(436mg)溶解在10mL二氯甲烷中，室温搅拌反应2h，然后加入10mL去离子水，再用50ml二氯甲烷萃取混合物。有机层用去离子水洗涤三次(10mL×3)，再干燥、减压浓缩得到羟基活化的小白菊内酯中间产物。
在室温下将中间产物(152mg)加入10mL溶有伊立替康(770mg)二氯甲烷中，再加入催化剂三乙胺(200μL)后搅拌反应48h。加入10mL去离子水后，再用二氯甲烷萃取。有机相用去离子水洗涤三次(10mL×3)，再用10mL饱和氯化钠溶液洗涤并干燥、过滤、除去有机溶剂得到粗产物。以二氯甲烷/甲醇(体积比＝20:1)为洗脱液，采用柱色谱纯化粗产物，经旋转蒸发得到目标产物210mg(黄色固体)，产率为63％。
本实施例合成的两亲性药药缀合物的化学结构如图1所示，1H NMR和13C NMR谱图如图2和图3所示，测试溶剂为CDCl3，对谱图中各个信号峰进行了归属并在谱图中标明。
图2中各质子信号峰归属如下：δ8.16(d,J＝9.0Hz,1H),7.86(s,1H),7.57(d,J＝9.1Hz,1H),6.08(s,1H),5.70(dd,J＝16.6,8.3Hz,2H),5.54(d,J＝10.4Hz,1H),5.41–5.32(m,1H),5.25(s,2H),4.65–4.44(m,4H),3.81(t,J＝9.2Hz,1H),3.54(s,2H),3.17–3.07(m,5H),2.90–2.81(m,2H),2.38(dd,J＝14.0,11.2Hz,4H),2.21(dd,J＝12.7,8.5Hz,3H),1.94(d,J＝17.1Hz,3H),1.68–1.57(m,1H),0.98(t,J＝7.3Hz,3H),0.88–0.71(m,3H)
图3中各个碳信号峰归属如下：δ(ppm from TMS),δ167.05,152.55,147.10，146.62,145.35,138.20,133.47,131.24,127.30,126.92,125.57,120.26,119.58,114.57,95.32,80.74,77.80,77.25，76.61,76.46,71.21,66.71,63.35,62.95,59.69,50.35,49.11,45.59,42.89,42.34,36.18,31.73，31.28,31.15,29.96,29.58，28.76,26.22,25.72,25.31,24.53,23.54,22.94,22.43,22.13,17.74,13.81,8.36,7.38,0.73。
将上述制得的两亲性药药缀合物溶解在二甲亚砜中，在室温下将其缓慢地滴入水中，除去二甲亚砜，得到两亲性药药缀合物的纳米颗粒水溶液。本实施例制备的两亲性药药缀合物伊立替康-羟甲基小白菊内酯纳米颗粒制剂的透射电镜照片如图4所示，纳米颗粒的平均粒径约为100nm。
实施例2
将吉西他滨(131.5mg)和1,1'-羰基二(1,2,4-三唑)(82.1mg)溶解在10mL二氯甲烷中，室温搅拌反应2小时，然后加入10mL去离子水，再用50mL二氯甲烷萃取混合物。有机层用去离子水洗涤三次(10mL×3)，干燥、减压浓缩得到羟基活化的吉西他滨中间产物。
室温下，将中间产物(71.6mg)加入到10mL溶有羟甲基小白菊内酯(52.8mg)的二氯甲烷中，再加入催化剂吡啶(200μL)，搅拌反应48小时。加入10mL去离子水，再用二氯甲烷萃取。有机相用去离子水洗涤三次(10mL×3)，再用10mL饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥并过滤，减压浓缩滤液得到粗产物，然后用二氯甲烷/甲醇(体积比＝40：1)作为洗脱液，通过柱色谱纯化粗产物，最后旋转蒸发除溶剂得到目标产物62.0mg，产率为56％。
本实施例合成的两亲性药药缀合物的化学结构如图5所示。将上述制得的两亲性缀合物溶解在二甲亚砜中，室温下将其滴入水中，除去二甲亚砜，得到两亲性药药缀合物的纳米颗粒水溶液。本实施例制备的两亲性药药缀合物吉西他滨-羟甲基小白菊内酯纳米颗粒的平均粒径约为150nm。
本实施例中所用的亲水性药物吉他西滨和疏水性药物羟甲基小白菊内酯均含有羟基，所选用的羟基活化剂1,1'-羰基二(1,2,4-三唑)为生产中常用的高效羟基活化剂，吉他西滨中的羟基活化后得到中间体，再由中间体与羟甲基小白菊内酯中的伯羟基反应，反应活性较高，不存在其他副反应。该实施例得到药药缀合物的合成路线、反应机理与实施例1中相同，基于反应机理和文献调研，通过此方法必定能得到本实施例中所需要的缀合物。
实施例3
将氟脲苷(123.1mg)和1,1'-羰基二咪唑(81.1mg)溶解在10mL二氯甲烷中，室温搅拌反应2小时，然后加入10mL去离子水，再用50mL二氯甲烷萃取混合物。有机层用去离子水洗涤三次(10mL×3)，干燥、减压浓缩得到羟基活化的氟脲苷中间产物。
室温下将中间产物(68.2mg)加入到10mL溶有羟甲基小白菊内酯(52.8mg)的甲醇中，再加入催化剂三乙胺(200μL)，搅拌反应48小时。加入10mL去离子水，再用二氯甲烷萃取。有机相用去离子水洗涤三次(10mL×3)，再用10mL饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥并过滤，减压浓缩滤液得到粗产物，然后用三氯甲烷/甲醇(体积比＝20：1)作为洗脱液，通过柱色谱纯化粗产物，最后旋转蒸发除溶剂得到目标产物59.8mg，产率为57％。
本实施例合成的两亲性药药缀合物的化学结构如图6所示。将上述制得的两亲性缀合物溶解在二甲亚砜中，室温下将其滴入水中，除去二甲亚砜，得到两亲性药药缀合物的纳米颗粒水溶液。本实施例制备的两亲性药药缀合物氟脲苷-羟甲基小白菊内酯纳米颗粒的平均粒径约为170nm。
本实施例中所用的亲水性药物氟脲苷和疏水性药物羟甲基小白菊内酯均含有羟基，所选用的羟基活化剂1,1'-羰基二咪唑为生产中常用的高效羟基活化剂，氟脲苷中的羟基活化后得到中间体，再由中间体与羟甲基小白菊内酯中的伯羟基反应，反应活性较高，不存在其他副反应。该实施例得到药药缀合物的合成路线、反应机理与实施例1中相同，基于反应机理和文献调研，通过此方法必定能得到本实施例中所需要的缀合物。
实施例4
将羟甲基小白菊内酯(70.4mg)和1,1'-羰基二(1,2,4-三唑)(87.2mg)溶解在5mL二氯甲烷中，室温搅拌反应2h，然后加入10mL去离子水，再用50ml二氯甲烷萃取混合物。有机层用去离子水洗涤三次(10mL×3)，再干燥、减压浓缩得到羟基活化的小白菊内酯中间产物。
在室温下将中间产物(48.0mg)加入到10mL溶有曲沙他滨(28.3mg)的二氯甲烷中，再加入催化剂三乙胺(200μL)，搅拌反应48小时。加入10mL去离子水，再用二氯甲烷萃取。有机相用去离子水洗涤三次(10mL×3)，再用10mL饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥并过滤，减压浓缩滤液得到粗产物，然后用二氯甲烷/甲醇(体积比＝10：1)作为洗脱液，通过柱色谱纯化粗产物，最后旋转蒸发除溶剂得到目标产物33.4mg，产率为65％。
本实施例合成的两亲性药药缀合物的化学结构如图7所示。
将上述制得的两亲性缀合物溶解在二甲亚砜中，室温下将其滴入水中，除去二甲亚砜，得到两亲性药药缀合物的纳米颗粒水溶液。本实施例制备的两亲性药药缀合物曲沙他滨-羟甲基小白菊内酯纳米颗粒的平均粒径约为200nm。
本实施例中所用的亲水性药物曲沙他滨和疏水性药物羟甲基小白菊内酯均含有羟基，所选用的羟基活化剂1,1'-羰基二(1,2,4-三唑)为生产中常用的高效羟基活化剂，氟脲羟甲基小白菊内酯的羟基活化后得到中间体，再由中间体与曲沙他滨的伯羟基反应，反应活性较高。该实施例得到药药缀合物的合成路线、反应机理与实施例1中相同，基于反应机理和文献调研，通过此方法必定能得到本实施例中所需要的缀合物。
本发明所述的两亲性药药缀合物纳米颗粒制剂对癌细胞的影响实验。
将实施例1中制备得到的两亲性药药缀合物纳米颗粒分别用细胞培养液配制成浓度为0.2、0.5、0.75、1、2、5、10、50、100μmol/L的溶液，然后加入HCT-116细胞(结肠癌细胞)96孔培养皿培养72小时，采用MTT方法进行细胞活性测试，结果如图8所示。当两亲性药药缀合物纳米颗粒的浓度到达10μmol/L后，显示出良好的杀灭癌细胞的能力。说明该两亲性药药缀合物纳米颗粒制剂在治疗恶性肿瘤中具有潜在的应用价值。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种两亲性药药缀合物，其特征在于，所述缀合物是由疏水性抗肿瘤药物羟甲基小白菊内酯与含羟基的亲水性抗肿瘤药物通过碳酸酯键连接得到的两亲性药药缀合物；所述碳酸酯键连接是通过两种药物中任一种药物的羟基在活化后与另一种药物的羟基通过偶联反应来实现的。
2.一种两亲性药药缀合物纳米颗粒制剂，其特征在于，所述纳米颗粒制剂是由如权利要求1所述的两亲性药药缀合物在水中自组装而得；所述颗粒制剂的粒径为20nm-300nm。
3.一种如权利要求2所述的两亲性药药缀合物纳米颗粒制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、用活化剂对所述疏水性抗肿瘤药物羟甲基小白菊内酯的羟基进行活化后，与所述含羟基的亲水性抗肿瘤药物在有机溶剂A中进行偶联反应，得到碳酸酯键连接的两亲性药药缀合物；
或，用活化剂对所述含羟基的亲水性抗肿瘤药物的羟基进行活化后，与所述疏水性抗肿瘤药物羟甲基小白菊内酯在有机溶剂A中进行偶联反应，得到碳酸酯键连接的两亲性药药缀合物；
S2、将所述两亲性药药缀合物溶解在有机溶剂B中，将其滴入水中，除去有机溶剂B，得到两亲性药药缀合物的纳米颗粒制剂。
4.如权利要求3所述的两亲性药药缀合物纳米颗粒制剂的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述偶联反应是在催化剂条件下进行的。
5.如权利要求3所述的两亲性药药缀合物纳米颗粒制剂的制备方法，其特征在于，所述含羟基的亲水性抗肿瘤药物选自下列药物中的一种：伊立替康、拓扑替康、氟脲苷、阿糖胞苷、吉西他滨、艾沙托立宾、曲沙他滨、羟基脲、米托蒽醌、阿美蒽醌、链脲菌素、平阳霉素、博来霉素、PF-0491502、PF-04217903、Apaziquone。
6.如权利要求3所述的两亲性药药缀合物纳米颗粒制剂的制备方法，其特征在于，所述活化剂选自1,1'-羰基二(1,2,4-三唑)或1,1'-羰基二咪唑。
7.如权利要求4所述的两亲性药药缀合物纳米颗粒制剂的制备方法，其特征在于，所述催化剂为三乙胺、吡啶、N,N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、三乙醇胺或四丁基溴化铵。
8.如权利要求3所述的两亲性药药缀合物纳米颗粒制剂的制备方法，其特征在于，S2中所述有机溶剂B选自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃或乙腈。
9.如权利要求3所述的两亲性药药缀合物纳米颗粒制剂的制备方法，其特征在于，S1中所述有机溶剂A选自二氯甲烷、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或乙腈。
10.一种如权利要求2所述的两亲性药药缀合物纳米颗粒制剂在制备抗白血病、结肠癌、脑胶质瘤恶性肿瘤药物中的应用。
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