CN112608325A - 血卟啉骈合维拉帕米片段的血卟啉衍生物的制备及应用 - Google Patents
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Classifications
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- A61P35/00—Antineoplastic agents
Abstract
本发明涉及药物化学领域，具体涉及血卟啉骈合维拉帕米片段的血卟啉衍生物的制备及其在增敏肿瘤药物中的应用。研究证明，本发明所涉及的血卟啉衍生物可显著逆转肿瘤多药耐药性，使细胞恢复对抗癌药物的敏感性。通过将血卟啉衍生物与抗癌药物合用，可以恢复抗性细胞对抗癌药物的敏感性，达到抗肿瘤的治疗与控制效果。
Description
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，尤其涉及血卟啉骈合维拉帕米片段的血卟啉衍生物的制备及在增敏肿瘤药物中的应用。
技术背景
肿瘤多药耐药性(MDR)是肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药现象后对同类或非同类结构，以及细胞靶点和作用机制相同或不同的其它抗肿瘤药物均产生的交叉耐药。维拉帕米(Verapamil,VER)是一种广泛用于心脏疾患的临床钙离子通道阻滞剂，实验研究表明，VER可以明显提高恶性肿瘤细胞对化学药物的敏感性，早在1982年，就有研究证实了维拉帕米对肿瘤细胞MDR表型的逆转作用。从而逆转肿瘤细胞MDR。然而，维拉帕米有效逆转肿瘤耐药的浓度是6.0-10.0μmol/L，但是维拉帕米的静脉安全浓度是1.0-2.0μmoL/L，超过安全浓度会导致窦性心动过缓、房室传导阻滞等严重的心血管毒副作用，这成为限制维拉帕米作为肿瘤耐药逆转剂在临床中广泛应用的主要原因。
血卟啉是由血红蛋白酸水解后产生的内源卟啉，它是一种光敏物质，在体内能选择性被恶性肿瘤吸收并潴留于肿瘤内。在630nm波长的光照下，产生光动力化学反应，杀伤肿瘤细胞。血卟啉分子的生物特性主要表现为特异性聚集，它能被肿瘤细胞吸收和滞留。因为肿瘤细胞对血卟啉的亲和力比正常细胞大10倍，血卟啉在肿瘤细胞中的浓度远大于正常组织。且滞留时间比较长，经过48-72小时之后，正常组织中的血卟啉已完全清除，而血卟啉全部滞留在肿瘤细胞内。其易溶于有机溶剂而难溶于水，因此不能直接通过静脉给药，从而极大的限制了其在临床中的应用。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种血卟啉骈合维拉帕米片段的血卟啉衍生物，该衍生物将维拉帕米功能性片段骈合到血卟啉母体上，改善血卟啉理化性质，同时通过血卟啉的肿瘤组织富集作用实现维拉帕米功能性片段在肿瘤组织的富集。
所述血卟啉衍生物具有A2或B2中任一种结构，或同时含有A2和B2 两种结构，A2和B2两种结构分别表示如下：
本发明同时提供了血卟啉衍生物A2和B2的制备方法，其中，血卟啉衍生物A2是由血卟啉与维拉帕米第一片段在苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐即BOP的催化下，通过酰胺缩合反应合成；
所述维拉帕米第一片段的结构如下：
具体步骤为：
S81、将0.5mmol血卟啉溶于盛有30mL二甲基甲酰胺(DMF)的反应容器中，并加入0.5-2mmol 3,4-二甲氧基苯乙胺即维拉帕米第一片段和0.5mmol苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)，室温搅拌3小时，等待反应结束；
S82、反应结束后，向反应容器中加入100mL水，并将反应容器放于冰上等待析出固体；
S83、抽滤所述析出固体并干燥，即得到粗产物；
S84、将粗产物溶于乙酸乙酯中，加入相当于粗产物三倍质量的硅胶，真空旋转蒸发乙酸乙酯；
S85、在硅胶柱层析中以二氯甲烷：甲醇体积比50:1为洗脱剂，将血卟啉衍生物A2与杂质分离，得到深棕色血卟啉衍生物A2固体纯品。
该合成反应的流程表示如下：
优选的，所述血卟啉、维拉帕米第一片段、BOP的比例为1：1：1。
血卟啉衍生物B2是由血卟啉与维拉帕米第二片段在苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐即BOP的催化下，通过酰胺缩合反应合成，
所述维拉帕米第二片段的结构如下：
具体步骤为：
S91、将0.5mmol血卟啉溶于盛有30mL二甲基甲酰胺(DMF)的反应容器中，并加入0.5-2mmol维拉帕米第二片段和0.5mmol苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)，室温搅拌5小时，等待反应结束；
S92、反应结束后，向反应容器中加入100mL水，并将反应容器放于冰上等待析出固体；
S93、抽滤所述析出固体并干燥，即得到粗产物；
S94、将粗产物溶于乙酸乙酯中，加入相当于粗产物三倍质量的硅胶，真空旋转蒸发乙酸乙酯；
S95、在硅胶柱层析中以二氯甲烷：甲醇体积比50:1为洗脱剂，将血卟啉衍生物B2与杂质分离，得到深棕色血卟啉衍生物B2固体纯品。
该合成反应的流程表示如下：
优选的，所述血卟啉、维拉帕米第二片段、BOP的比例为1：4：1。
所述同时含有A2和B2两种结构的含义为A2与B2可以以任意比例混合。
本发明提供血卟啉衍生物A2和B2中任一种或两种在药理学上容许的盐在制备抗肿瘤药物的增敏剂或者逆转耐受剂中的应用。
优选的，所述在药理学上容许的盐是由血卟啉衍生物A2和B2中任一种与无机酸、有机酸、碱金属、碱土金属或碱性氨基酸中任一种形成的盐，或血卟啉衍生物A2和B2共同与无机酸、有机酸、碱金属、碱土金属或碱性氨基酸中任一种形成的盐的混合。
所述无机酸为盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸中的任一种，所述有机酸为马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸，己二酸，棕榈酸，单宁酸中的任一种，所述碱金属为锂，钠、钾中的任一种；所述碱土金属为钙、镁中的任一种；所述碱性氨基酸为赖氨酸。
本发明还提供一种用于治疗肿瘤的药物组合物，该药物由药学上有效剂量的血卟啉衍生物A2和B2中的任一种或两种以及肿瘤化疗药物，以及药学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的载体制得。
优选的，所述肿瘤化疗药物为阿霉素(ADM)，5-氟尿嘧啶(5-Fu)，顺铂(Cisplatin)，多西他赛(Docetaxel)，奥沙利铂(Oxaliplatin)，吉西他滨(Gemcitabine)中的任一种或几种。
优选的，所述有效剂量为血卟啉衍生物A2和B2中的任一种或两种占药物组合物的质量分数为0.1-99％。
优选的，所述有效剂量为血卟啉衍生物A2和B2中的任一种或两种占药物组合物质量分数为10％、20％、30％、50％、70％。
本申请中所述药学上可接受的载体包括赋形剂、稳定剂、抗氧化剂、着色剂、稀释剂、缓释剂等一种或几种功能的辅料，如淀粉、脂类、蜡、糊精、蔗糖、乳糖、微晶纤维素、明胶、柠檬酸、无机盐类、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素等。
优选的，所述药物组合物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂中任意一种。
本发明的有益效果在于：将维拉帕米功能性片段骈合到血卟啉母体上，改善血卟啉理化性质，同时通过血卟啉的肿瘤组织富集作用实现维拉帕米功能性片段在肿瘤组织的富集，本发明提供的血卟啉衍生物A2、B2可应用于增敏肿瘤化疗药物。
具体实施方式：
为了更好的理解本发明实质，下面将用本发明的实施例来说明本发明的血卟啉衍生物A2和B2的制备方法和药理作用结果，但本发明的技术方案并不局限于此，任何采用类似本发明技术方案，不需要本领域普通技术人员创造性劳动即可做出的方案均认为属于本发明技术方案范畴。需强调，本文中使用的“A2”、“B2”仅作为对本申请使用的血卟啉衍生物的命名，并不用于限制该血卟啉衍生物。
实施例1：
血卟啉衍生物A2的合成：
将0.5mmol血卟啉溶于30mL DMF中，放在磁力搅拌器上搅拌，随后加入2mmol 3,4-二甲氧基苯乙胺即维拉帕米第一片段和0.5mmol苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)，室温搅拌3小时，使用薄板层析(TLC)检测反应进程。待反应结束后，向反应体系内加入100mL 水搅拌均匀，再将反应容器放于冰上析出固体。抽滤析出的固体并将该固体干燥，得到粗产物。将粗产物溶于乙酸乙酯中，加入相当于粗产物的三倍质量的200-300目硅胶，真空旋蒸掉乙酸乙酯，然后干法上样，以二氯甲烷：甲醇体积比50:1为洗脱剂在硅胶柱层析中纯化，根据血卟啉衍生物A2 与杂质极性不同，被洗脱下来时间不同，得到棕色的血卟啉衍生物A2固体，产率38％。
本实施例制备的血卟啉衍生物A2的氢谱、质谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.52–8.46(m,2H),8.27(d,J＝11.0Hz, 2H),8.16(s,1H),7.86(t,J＝4.8Hz,1H),6.85–6.77(m,4H),6.74–6.66(m, 2H),4.85(dd,J＝16.5,5.2Hz,2H),4.71(ddtd,J＝7.3,6.3,5.1,1.0Hz,1H), 4.45(qd,J＝6.7,5.4Hz,1H),3.82–3.77(m,12H),3.45(td,J＝5.3,4.8Hz, 2H),3.14(q,J＝5.3Hz,5H),3.01–2.92(m,2H),2.71(tt,J＝5.3,1.0Hz,4H), 2.55(dd,J＝16.4,0.4Hz,2H),2.50–2.39(m,4H),2.09(s,3H),1.98(d,J＝ 1.0Hz,3H),1.94(s,3H),1.28–1.16(m,6H)；MS(ESI):m/z 925.5[M+H]+。
实施例2：
血卟啉衍生物B2的合成：
将0.5mmol血卟啉溶于30mL DMF中，放在磁力搅拌器上搅拌，随后加入0.5mmol维拉帕米第二片段和0.5mmol苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)，室温搅拌5小时，使用薄板层析(TLC) 检测反应进程。反应结束后，加入100ML水溶液，再将反应容器放于冰上析出固体。抽滤析出的固体并将该固体干燥，得到粗产物。将粗产物溶于乙酸乙酯中，加入相当于粗产物质量三倍质量的200-300目硅胶，真空旋蒸掉乙酸乙酯，然后干法上样，以二氯甲烷：甲醇体积比50:1为洗脱剂在硅胶柱层析中纯化，根据血卟啉衍生物B2与杂质极性不同，被洗脱下来时间不同，得到血卟啉衍生物B2，产率46％。
本实施例制备的血卟啉衍生物B2的氢谱、质谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.36(d,J＝14.9Hz,2H),8.30(s,1H), 8.14(s,1H),7.70(t,J＝4.0Hz,1H),7.61(t,J＝4.0Hz,1H),7.23(d,J＝1.9Hz, 1H),7.21–7.14(m,2H),7.07(dd,J＝7.5,1.9Hz,1H),6.85(d,J＝7.5Hz,2H), 5.01(d,J＝5.0Hz,1H),4.90–4.80(m,2H),4.46(qd,J＝6.7,5.4Hz,1H), 3.82–3.77(m,12H),3.41(dq,J＝13.6,4.3Hz,1H),3.26(dq,J＝13.6,4.3Hz, 1H),3.13–3.02(m,3H),2.64(dq,J＝13.6,4.3Hz,1H),2.58–2.43(m,3H), 2.43–2.28(m,5H),2.18(ddt,J＝30.8,14.1,6.3Hz,2H),2.09(s,3H),1.95(s, 3H),1.94–1.83(m,4H),1.83–1.49(m,4H),1.40–1.33(m,1H),1.33–1.22 (m,3H),1.21(d,J＝6.6Hz,3H),1.10–1.02(m,9H),1.00(d,J＝7.0Hz,3H)； MS(ESI):m/z 1115.6[M+H]+。
实施例3
血卟啉衍生物A2和B2的活性评价
1.实验设备与材料：仪器超净工作台(苏净集团安泰公司)、恒温培养箱(Thermoelectron Corporation)、酶标仪(BIO-RAD公司)、倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂)；试剂：细胞培养基RPMI-1640、DMEM(高糖) (GIBCO公司)、胎牛血清(杭州四季清有限公司)、四甲基偶氮唑蓝(MTT) (Sigma公司产品)、DMSO(Sigma公司)；细胞株：人食管癌细胞株 KYSE-150、人胃癌细胞株BGC-803、人肝癌细胞株SMCC-7721、人结肠癌细胞株HCT-116。
2.实验方法
2.1细胞抑制活性实验方法：
上述细胞在37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中常规培养。培养液为含10％热灭活胎牛血清、青霉素100U/mL和链霉素100U/mL的RPMI1640 细胞培养基。48h更换培养液，细胞贴壁后，用0.25％胰蛋白酶消化传代。实验用细胞均处于对数生长期，台盼蓝拒染法表明细胞活力>95％。
取处于对数生长期状态良好的细胞一瓶，加入消化液(0.125％胰蛋白酶+0.01％EDTA)消化，计数2-4×104cell/mL，制成细胞悬液接种于96孔板上，100μL/孔，置恒温CO2培养箱中培养24小时。换液，分别加入含有不同的浓度的血卟啉衍生物A2或B2溶液的新鲜培养基，100μL/孔，每个浓度设置5个重复孔，培养72小时。将MTT加入96孔板中，50μL/孔，培养箱中孵育4小时。吸去上清液，加DMSO，200μL/孔，平板摇床上震荡10分钟。受试物即血卟啉衍生物A2或和B2考察50μM，25μM，12.5μM， 6.25μM，3.13μM，1.56μM，0.78μM 7个浓度，用酶联免疫监测仪在波长为570nm处测定每孔的吸光度，分别计算各浓度下的细胞抑制率，然后使用SPSS软件推算出IC50(即细胞抑制率为50％时的药物浓度)，对照组默认数值为100，在表格中省略。
分别计算各浓度下的细胞抑制率。
抑制率计算方法：
药敏孔相对OD值＝药敏孔绝对OD值-空白对照孔绝对OD值
2.2实验结果
表1.血卟啉衍生物A2对4种人类癌细胞株抗增殖活性的IC50值(μM)
从表1中可以看出，血卟啉衍生物A2具有一定的抑制人食管癌细胞株 KYSE-150、人胃癌细胞株BGC-803、人肝癌细胞株SMCC-7721、人结肠癌细胞株HCT-116增殖的能力，其中对人结肠癌细胞株HCT-116具有最好的抑制能力，其IC50值为11.101μM。
表2.血卟啉衍生物B2对4种人类癌细胞株抗增殖活性的IC50值(μM)
从表2中可以看出，血卟啉衍生物B2具有一定的抑制人食管癌细胞株 KYSE-150、人胃癌细胞株BGC-803、人肝癌细胞株SMCC-7721、人结肠癌细胞株HCT-116增值的能力，并且活性略优于A2，其中血卟啉衍生物 B2对人肝癌细胞株SMCC-7721具有最好的抑制能力，其IC50值为1.44μM。
2.3结果讨论
血卟啉衍生物A2,B2对不同肿瘤细胞的作用进行活性评价。发现其对人食管癌细胞株KYSE-150、人胃癌细胞株BGC-803、人肝癌细胞株 SMCC-7721、人结肠癌细胞株HCT-116具有良好的抑制作用，提示血卟啉衍生物A2、B2可用于制备治疗肿瘤药物。
实施例4
以血卟啉衍生物A2为例验证对肿瘤化疗药物的增敏作用
1.实验设备与材料：血卟啉衍生物A2由血卟啉和维拉帕米的部分片段依据实施例1合成，纯度不低于95％。人肝癌细胞株HepG2、骨肉瘤细胞株G292、神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y、膀胱癌细胞株RT112/84、宫颈癌细胞株HELA由安徽省肿瘤医院表观遗传学实验室提供。阿霉素 (ADM)，5-氟尿嘧啶(5-Fu)，顺铂(Cisplatin)，多西他赛(Docetaxel) 购自拜尔迪公司，纯度均大于99％。CCK8试剂盒购自biosharp Life sciences 公司。
2.实验方法：从液氮罐中取出各细胞株冻存管复苏，先进行血卟啉衍生物A2对肝癌SMMC-7721、HepG2细胞的安全性实验，用于确定血卟啉衍生物A2的安全范围。
上述细胞使用补充有10％FBS和不同浓度的血卟啉衍生物A2的新鲜培养基，在37℃，5％CO2条件下培养，血卟啉衍生物A2使用 50,20,10,5,2.5,1.25μmol/L共6种浓度梯度。温育后将每孔中液体弃去，在96孔板中每孔再加入CCK8溶液10μL和90μL的不含血清的培养基，并将96板再温育2小时。然后将96孔板放在酶标仪中450nm 处测吸光度值(OD450值)。空白组为不加细胞只加培养基，对照组为不加药细胞组。细胞抑制率＝1-(实验组OD450-空白组OD450)/(对照组OD450-空白组OD450)。
表3.血卟啉衍生物A2在人类癌细胞中的安全范围
以表3中测得的安全浓度为血卟啉衍生物A2使用量，检测肿瘤常用化疗药物阿霉素(ADM)，5-氟尿嘧啶(5-Fu)，顺铂(Cisplatin)，多西他赛(Docetaxel)单用及与血卟啉衍生物A2联用，对细胞作用的IC50值。实验方法同上，补充有10％FBS和不同浓度的不同化疗药物的新鲜培养基 37℃，5％CO2条件下培养24小时，每种化疗药物均使用 20,10,5,2.5,1.25μmol/L共5种浓度梯度。
表4.化疗药物抑制人类癌细胞增殖的IC50
表5.化疗药物抑制人类癌细胞增殖的IC50
表中“/”表示实验未做。结果表明，血卟啉衍生物A2具有增敏化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)、阿霉素(ADM)对肝癌治疗的效果，血卟啉衍生物A2具有增敏化疗药物多西他赛(Docetaxel)对骨肉瘤治疗的效果，血卟啉衍生物A2具有增敏化疗药物阿霉素(ADM)对神经母细胞瘤治疗的效果，血卟啉衍生物A2具有增敏化疗药物顺铂(Cisplatin)对膀胱癌治疗的效果，血卟啉衍生物A2具有增敏化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu) 对宫颈癌治疗的效果。
上述实验证明，血卟啉衍生物A2具有不同程度的增敏化疗药物对人类癌细胞的治疗效果。
Claims (10)
1.一种血卟啉衍生物，其特征在于，具有A2和B2中任一种或两种结构：
2.一种如权利要求1所述的血卟啉衍生物在药理学上容许的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述在药理学上容许的盐是由血卟啉衍生物与无机酸、有机酸、碱金属、碱土金属或碱性氨基酸中任一种形成的盐；所述无机酸为盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸中的任一种，所述有机酸为马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸，己二酸，棕榈酸，单宁酸中的任一种，所述碱金属为锂，钠、钾中的任一种；所述碱土金属为钙、镁中的任一种；所述碱性氨基酸为赖氨酸。
4.一种如权利要求1所述的血卟啉衍生物在制备抗肿瘤药物的增敏剂或者逆转耐受剂中的应用。
5.一种用于治疗肿瘤的药物组合物，该药物由药学上有效剂量的血卟啉衍生物以及肿瘤化疗药物，以及药学上可接受的载体制得。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述有效剂量为血卟啉衍生物占药物组合物的质量分数为0.1-99％。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述有效剂量为血卟啉衍生物占药物组合物质量分数为10％、20％、30％、50％、70％。
8.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂中任意一种。
9.一种制备权利要求1所述的血卟啉衍生物A2的方法，其特征在于：该血卟啉衍生物A2是由血卟啉与维拉帕米第一片段在苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐即BOP的催化下，通过酰胺缩合反应合成；
所述维拉帕米第一片段的结构如下：
10.一种制备权利要求1所述的血卟啉衍生物B2的方法，其特征在于：该血卟啉衍生物B2是由血卟啉与维拉帕米第二片段在苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐即BOP的催化下，通过酰胺缩合反应合成；
所述维拉帕米第二片段的结构如下：
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