WO2011131034A1

WO2011131034A1 - 4'-去甲基表鬼臼毒素衍生物及其合成方法和应用

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Publication number: WO2011131034A1
Application number: PCT/CN2011/000710
Authority: WO
Inventors: 汤亚杰; 赵巍
Original assignee: 湖北工业大学
Priority date: 2010-04-23
Filing date: 2011-04-22
Publication date: 2011-10-27
Also published as: US8569309B2; CN102234283B; US20130040967A1; US20140024831A1; US8796279B2; CN102234283A

Description

4'-去甲基表鬼臼毒素衍生物及其合成方法和应用技术领域

本发明 4'-去甲基表鬼臼毒素衍生物及其合成和纯化方法，本发明还涉及该 4'- 去甲基表鬼臼毒素衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途，属于鬼臼类衍生物领域。背景技术

4'-去甲基表鬼臼毒素 (⁴'-Demethylepipodophyllotoxin) , 其结构如式（ I )所示, 是从鬼臼类植物，如：小檗科植物桃儿七、山荷叶、八角莲等提取，

具有独特抗肿瘤活性的天然活性先导化合物，因强烈的毒副作用和生物利用度差等缺点，限制了其在临床的使用，因此，目前针对其结构修饰后的药物开发研究十分活跃。

通过在鬼臼毒素 C环 4位以 β碳氮键引入芳环基团，所得衍生物普遍具有良好的肿瘤细胞抑制活性（Bioorgan Med Chem 2005; 13(22):6218-6225)；一种 4'-去甲基表鬼臼毒素 C环 4位的氨基取代衍生物，目前已进入二期临床实验（Anticancer Res, 2006, 26 (3A): 2149-2156);美国专利 US-07/987,765中记载了作为抗肿瘤药物开发的 C环 4位氨基化衍生物。迄今为止，在以上结构修饰及药物开发中，还尚未见到 C 环 4位引入吡嗪基团的研究报道。

川芎嗪 (Ligustrazine, tetramethylpyrazine)是中药川芎（伞形科植物川芎 Ligusticum chuanxiong HoW.)的有效成分，其结构式如 ( Π )所示，川芎 ^σ秦

通过直接抑制肿瘤、化疗增效及免疫调节达到抗肿瘤疗效；川芎嗪还具有緩解肿瘤细胞耐药性，其还可通过影响肿瘤细胞黏附与侵袭、抗凝血与抗血小板集聚作用而发挥抗肿瘤转移作用。发明内容

本发明目的之一提供一种水溶性好且具有良好抗肿瘤活性的 4'-去曱基表鬼臼毒素衍生物；

本发明目的之二是提供一种合成和纯化上述 4'-去曱基表鬼臼毒素衍生物的方法；

本发明目的之三是将上述 4'-去甲基表鬼臼毒素衍生物应用于制备成抗肿瘤药物；

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种具有抗肿瘤活性的 4'-去甲基表鬼臼毒素衍生物，其结构式为式（III )所示：

式（III ) 其中，

围之内，优选的，所述的酸成盐包括盐酸盐或磷酸盐等酸成盐本发明将 4'-去曱基表鬼臼毒素和川芎嗪通过转氨反应，得到具有良好抗肿瘤活性的式（III )化合物，该化合物可通过多途径、多靶点作用于肿瘤细胞，从而达到更好的抗肿瘤疗效。

本发明提供了一种合成上述式（III )化合物的方法，包括：

( 1 )、将 4'-去曱基表鬼臼毒素 C环 4位的羟基活化；

( 2 )、通过转氨反应，将川芎嗪、盐酸川芎嗪或磷酸川芎嗪引入到 4'-去曱基表鬼臼毒素的 C环 4位，即得。

其中，步骤（ 1 ) 中所述的 4'-去曱基表鬼臼毒素 C环 4位的羟基活化优选在以下条件下进行：将 4'-去曱基表鬼臼毒素溶于二氯曱烷中，再加入三乙胺和对甲基苯磺酰氯，搅拌反应，即得；其中，所述的搅拌转速优选为 50-800转 /分钟，更优选为 600转 /分钟；所述的反应温度优选为 -20-50°C , 更优选为 20-25°C ; 所述的反应时间优选为 1-8小时，更优选为 1小时；合成 4-(2,3 ,5 ,6-四曱基吡嗪- 1 -基) -4 '-去曱基表鬼臼毒素的前体：

将反应产物用去离子水沖洗两次，收集有机层再以生理盐水沖洗一次，回收有机层并用无水硫酸钠干燥过夜；将处理并干燥后反应液减压浓缩至干燥，用乙酸乙酯复溶，并以正己烷进行滴加至沉淀不溶，避光条件下过夜保存于 4°C的冰箱中，将类白色沉淀真空干燥后，作为供合成 4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪 -1-基) -4'-去甲基表鬼臼毒素前体》

步骤（2 ) 中，所述的转氨反应优选在以下条件下进行：

(a)将川芎嗪、盐酸川芎嗪或磷酸川芎嗪中的任意一种与步骤 (1)所得到的 4'-去曱基表鬼臼毒素 C环 4位活化产物溶解在乙腈中，搅拌进行转氨反应；（b )将反应液减压浓缩至干燥，并以乙酸乙酯析出沉淀，即得。其中，按摩尔比计， 4'-去曱基表鬼臼毒素 C环 4位活化产物和川芎嗪、盐酸川芎嗪或磷酸川芎嗪得比例优选为 1 : 2; 所述的搅拌转速优选为 50-1000转 /分钟，更优选为 600转 /分钟；所述的反应温度优选为 -20-130°C，更优选为 80 °C ; 所述的反症时间优选为 1-72小时，更优选为 8小时。

本发明还提供了一种纯化上述 4'-去甲基表鬼臼毒素衍生物粗产物的方法，包括： ( 1 )、待分离纯化样品的制备：将 4'-去甲基表鬼臼毒素衍生物粗产物通过乙酸乙酯溶剂或极性相似溶剂反复沖洗、收集不溶物，真空干燥，备用；

( 2 )、分离纯化：将待分离纯化样品依次使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离，即得。

优选的，所述的硅胶柱层析的分离方法包括：（ 1 )硅胶柱层析为正相硅胶柱层析或反相硅胶柱层析，正相硅胶以低极性有机溶剂拌勾后装柱，以洗脱剂平衡，所述的洗脱剂优选是体积比为 40: 1的氯仿和丙酮组成；反相硅胶以甲醇拌勾后装柱，以洗脱剂平衡，所述的洗脱剂优选是体积比为 60: 1的甲醇和水组成；（2)将待分离纯化的样品以洗脱液溶解，进行上样吸附，然后用洗脱剂洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；

优选的，所述的凝胶柱层析分离方法包括：（1 )凝胶以曱醇浸泡；将处理好的凝胶装柱，以甲醇平衡；（2 )将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于甲醇中，进行上样吸附，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶。

BGC-823肿瘤细胞以及 KB细胞活性抑制的测试表明，本发明式（ III )化合物的抗肿瘤活性较 4'-去甲基表鬼臼毒素、川芎嗪、鬼臼毒素以及依托泊甙和替尼泊甙 (已经应用于临床的鬼臼类抗肿瘤药物)的抗肿瘤活性均有显著提高。

体外 HK-2正常细胞毒性的测试表明，本发明式（III )化合物的毒副作用较鬼臼毒素的细胞毒性有显著降低。同时，通过脂水分配系数测试得到的水溶性数据也表明，本发明式（III )化合物的水溶性较 4'-去甲基表鬼臼毒素、鬼臼毒素有显著增强。上述试验结果表明，本发明式（III )化合物可制备成抗肿瘤药物，临床应用于抗肿瘤治疗。、

本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，由式（III ) 所示的化合物和药学上可接受的载体配合而成，即将药学上可接受用量的式（III )化合物与药学上可接受的载体配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。通常该组合物适合于口服给药和注射给药，也适合其他的给药方法，例如经皮给药。

该组合物可以是片剂、胶囊、粉剂、颗粒、锭剂、栓剂，或口服液或无菌胃肠外悬液等液体制剂形式。该组合物可以是大或小容量注射剂、冻干粉针、无菌粉分装等制剂形式。为了达到给药的一致性，本发明组合物优选为单剂形式。用于口服给药的单剂形式可以是片剂和胶嚢，并可含有常规赋形剂诸如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸丐、山梨醇或甘氨酸；压片润滑剂，例如硬脂酸钹；崩解剂，例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉乙醇酸钠或微晶纤维素，或药学上可接受的湿润剂，诸如十二烷基疏酸钠。附图说明

图 1 为本发明式（III )化合物及对比物对 KB细胞生长抑制曲线图。

图 2 为本发明式（III )化合物及对比物对 BGC-823细胞生长抑制曲线图。图 3 为本发明式（ III )化合物及对比物对 A549细胞生长抑制曲线图。

图 4 为本发明式（ III )化合物及对比物对 HepG2细胞生长抑制曲线图。图 5 为本发明式（III )化合物及对比物对 HK-2细胞生长抑制曲线图。具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。试验材料

4'-去甲基表鬼臼毒素和川芎嗪：均购自西安和霖生物工程有限公司。实施例 1 4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪 -1-基) -4'-去甲基表鬼臼毒素的合成和纯化

(1) 4-(2,3,5，6-四曱基吡嗪小基) -4'-去甲基表鬼臼毒素的合成：

(A) 4'-去甲基表鬼臼毒素 C环 4位的羟基活化：将 2 g (5 mmol) 4'-去曱基表鬼臼毒素溶于 40 mL无水二氯甲烷中， 0°C下加入 0.84 mL (6 mmol) 三乙胺、 0.48mL 对曱基苯磺酰氯，升温至 25 °C下搅拌反应 1 h结束；反应液以 20 mL去离子水冲洗两次，收集有机层再以 40 mL生理盐水冲洗一次，回收有机层并以 5 g无水硫酸钠干燥过夜，将处理并干燥后反应液减压浓缩至干燥，以 20 mL乙酸乙酯复溶，并以 100 mL正己烷进行少量多次滴加至沉淀不溶，避光条件下过夜保存于 4°C的冰箱中，将类白色沉淀真空干燥后，作为供合成 4-(2，3,5,6-四甲基吡嗪 -1-基) -4'-去甲基表鬼臼毒素前体；

(B) 4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪小基 )-⁴'-去曱基表鬼臼毒素的合成：将 2 mmol 4'-去甲基表鬼臼毒素 C环 4位活化产物和 4 mmol盐酸川芎嗪溶解在 10 mL乙腈中， 80°C 下反应 48 h结束，将反应液减压浓缩至干燥，并以 50 mL乙酸乙酯析出类白色絮状沉淀，真空干燥沉淀物后，避光条件下保存于 4°C的冰箱中，作为供分离纯化样品。

(2) 分离和纯化 4-(2,3,5,6-四曱基吡嗪小基) -4'-去甲基表鬼臼毒素：

使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化：

(A) 用正相硅胶柱 (正相硅胶：中国青岛海洋化工有限公司， HG/T2354-92; 分离系统：瑞士步琪等度快速色谱系统：色语柱：瑞士步琪玻璃柱 C-690 , 长 460毫米，内径 15毫米)或者相似极性柱分离；氯仿：丙酮 40: 1系统作为洗脱液，上样量 2毫升，流速恒流 1.0毫升 /分钟；每 2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层 (德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各榴分；氯仿：丙酮 35 : 1 系统作为展开剂，将 Rf值 0.46的馏分进行合并；将合并后的样品真空千燥，避光条件下保存于 4°C的水箱中作为供纯化样品。

(B) 用凝胶柱层析 (凝胶： Sephadex LH-20; 分离柱：玻璃柱，长 480毫米，内径 30毫米)分离；将处理好的 Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以曱醇平衡。将待纯化样品以溶于 6毫升曱醇中，以 0.6毫升 /分钟的流速上样吸附，然后用 600毫升曱醇以 0.6 毫升 /分钟的流速洗脱，每 10毫升洗脱液收集 1瓶，用正相硅胶薄层 (德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各條分；氯仿：丙酮 35: 1系统作为展开剂，将 Rf 值 0.46 的馏分进行合并；真空干燥并以甲醇重结晶的白色针状结晶样品为 4-(2,3,5,6-四曱基吡嗪 -1-基) -4'-去曱基表鬼臼毒素：白色毛状晶体， FT-IR (KBr, cm"¹): 1508.1(C=N), 1263.6(C-N)

C₂₉H₃₁N₂O₇, 1H NMR (600 MHz, CDC1₃), 6.66 (1H, H-5), 6.54 (1H, H-8), 6.28 (2H, H-2', H-6 5.90 (m, H-13), 5.89 (1H， H-13), 4.76 (d, J = 4.2 Hz, H-l), 4.75 (d, J =3.7 Hz, H-4), 4.84 (1H, H-l l), 4.81 (1H， H-l l), 3.50 (6H, MeO-3 ', MeO-5 '), 2.52 (dd, J = 13.8, 4.2 Hz, H-2), 2.11 (2H, 4-OH), 4.72 (m, H-3), 2.38 (6H, Me-3 ", Me-5 "), 1.18(6H, Me-2", Me-6"); C NMR (CDC1₃) 5172.41 (C-12), 158.06(C-3 ", C-5 "), 153.38 (C-3 ', C-5'), 147.40 (C-6), 147.51 (C-7), 144.67 (C-2"), 142.33 (C-6"), 135.02 (C-Γ), 12934 (C-9), 129.06 (C-10), 128.60 (C-4'), 109.78 (C-8), 108.05 (C-5), 105.32 (C-2'), 105.25 (C-6'), 101.62 (C-13), 69.74 (C-4), 71.29 (C-l l), 56.19; 56.13 (MeO-3', MeO-5'), 53.93 (C-2), 42.99 (C-l), 31.98 (C-3), 29.92 (Me-6"), 29.45 (Me-2"), 21.91 (Me-3 ", Me-5"); MS (ESI-MS): m/z =519 ([M]+). 试验例 1 MTT法测定 4-(2,3,5,6-四曱基吡嗪 -1-基) -4'-去曱基表鬼臼毒素对 KB细胞生长的抑制

一、试验材料

4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪 -1-基) -4'-去甲基表鬼臼毒素（实施例 1所制备），纯度 97%; 4'-去甲基表鬼臼毒素，购自西安和霖生物工程有限公司，纯度 98%, 川芎。秦，购自西安和霖生物工程有限公司，纯度 98%;

二、试验方法

将对数生长期的 KB细胞（购自上海安普生物科技有限公司） 1 , 000 rpm离心 5分钟，弃上清，适量培养基悬浮，调整细胞浓度至 3.5X10³/孔。将细胞接种于 96 孔培养板中，分成阴性对照组和 3个试验组（ 3个试验组分别为：试验 1组： 4-(2,3，5,6- 四曱基吡嗪小基)- 4'-去甲基表鬼臼毒素组；试验 2组： 4'-去甲基表鬼臼毒素组；试验 3组：川芎嗪组），每个试验组设 7个剂量组，剂量组浓度按照（^g/L、 l g/L、 l(^g/L、 2(^g/L、 4(^g/L、 8(^g/L和 160 g/L逐级递增，每组设 3个平行孔，用含有 10%小牛血清的 RPMI1640作为培养液， 37°C、 5% CO₂及饱和湿度下培养 24 h 接近长满时，弃去培养液，加入含有不同浓度药物 10%小牛血清的 RPMI164培养液 0.15 mL; 阴性对照组所加入的 10%小牛血清的 RPMI164培养液中含有终浓度为 0.5%的 DMSO。继续培养 48 h, 每孔加入 5 mg/ml的 MTT 20 μΐ, 37°C 放置 4h。每孔加入 200 μΐ DMSO, 37°C摇床振荡 30min, 492nm/620nm测吸光度（ OD ), 计算 MTT比值 =药物组 OD值 /阴性对照组 OD值。用 MTT法测定细胞生长程度，以阴性对照组数值为 100%做细胞生长抑制图（如图 1所示)。

三、试验结果 .

由图 1可知， 4-(2，3,5,6-四曱基吡嗪 -1-基) -4'-去甲基表鬼臼毒素对 KB细胞株具有明显的生长抑制作用，并且在同浓度作用下， 4-(2,3,5,6-四曱基吡嗪小基) -4'-去甲基表鬼臼毒素对 KB细胞株的生长抑制率比 4'-去甲基表鬼臼毒素或川芎。秦对此细胞株的生长抑制率明显要高，说明本发明 4-(2，3,5，6-四甲基吡嗪 -1-基) -4'-去曱基表鬼臼毒素的抗肿瘤活性要明显高于 4'-去曱基表鬼臼毒素或川芎嗪的抗肿瘤活性。试验例 2 MTT 法测定 4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪 -1-基) -4'-去曱基表鬼臼毒素对 BGC-823肿瘤细胞生长的抑制。

一、试验材料

4-(2,3,5，6-四甲基吡嗪 -1-基) -4'-去曱基表鬼臼毒素（实施例 1所制备），纯度 97%; 4'-去曱基表鬼臼毒素，购自西安和霖生物工程有限公司，纯度 98%，川芎唤，购自西安和霖生物工程有限公司，纯度 98%; 依托泊甙，购自西安和霖生物工程有限公司，纯度 98%;

二、试-险方法

将对数生长期的 BGC-823细胞（购自上海安普生物科技有限公司；)， 1， 000 rpm 离心 5分钟，弃上清，适量培养基悬浮，调整细胞浓度至 3.5X10³/孔。将细胞接种于 96孔培养板中，分成阴性对照和 4个试验组，（ 4个试验组分别为：试验 1组： 4-(2,3,5,6-四曱基吡嗪 -1-基) -4'-去甲基表鬼臼毒素组、试验 2组： 4'-去曱基表鬼臼毒素组、试验 3组：川芎嗪组、试验 4组：依托泊甙组），每个试验组设 7个剂量组，剂量组浓度按照（^g/L、 l g/L、 l(^g/L、 2(^g/L、 4(^g/L、 8(^g/L和 160 g/L逐级递增，每组设 3个平行孔，用含有 10%小牛血清的 RPMI1640作为培养液， 37°C、 5% CO₂及饱和湿度下培养 24 h接近长满时，弃去培养液，，加入含有不同浓度药物 10%小牛血清的 RPMI164培养液 0.15 mL; 阴性对照组所加入的 10%小牛血清的 RPMI 164培养液中含有终浓度为 0.5%的 DMSO。继续培养 48 h, 每孔加入 5mg/ml 的 MTT 20μ1, 37 °C 放置 4h。每孔加入 200 μΐ DMSO, 37°C摇床振荡 30min, 492nm/620nm测吸光度 ( OD ), 计算 MTT比值 =药物组 OD值 /阴性对照组 OD值。用 MTT法测定细胞生长程度，以阴性对照组数值为 100%做细胞生长抑制图（如图 2 所示)。

由图 2可知， 4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪小基) -4'-去曱基表鬼臼毒素对 BGC-823肿瘤细胞株具有明显的生长抑制作用，并且在同浓度作用下， 4-(2,3，5，6-四甲基吡嗪 -1- 基) -4'-去曱基表鬼臼毒素对此细胞株的生长半数抑制率（I o μΜ)比 4'-去曱基表鬼臼毒素、川芎"秦、鬼臼毒素和依托泊甙对此细胞株的生长半数抑制率明显要高： 4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪 -1-基) -4'-去曱基表鬼臼毒素（IC_5Q = 0.06 μΜ)对人胃癌细胞株 BGC-823的抑制活性较川芎嗪 (IC₅Q = 12907734 μΜ)、鬼臼毒素 (IC₅₍₎ = 529 μΜ)、 4'-去曱基表鬼臼毒素 (IC₅o = 398 μΜ)和应用于临床的鬼臼类药物 "依托泊甙"（IC₅₀ = 14 μΜ)分别提高了 2X10⁸倍、 5199倍、 3617倍和 226倍。

这说明在 4'-去甲基表鬼臼毒素 C环 4位通过转氨反应引入川芎嗪，可显著提高 4'-去曱基表鬼臼毒素的抗肿瘤活性，使得本发明 4-(2,3，5,6-四甲基吡嗪 -1-基) -4'-去曱基表鬼白毒素的抗肿瘤活性要明显高于 4'-去甲基表鬼臼毒素、鬼臼毒素和依托泊甙等鬼臼类化合物的抗肿瘤活性。试验例 3 ΜΤΤ法测定 4-(2,3，5，6-四甲基吡嗪 -1-基) -4'-去甲基表鬼臼毒素对 Α549肿瘤细胞生长的抑制。

一、试验材料

4-(2，3,5,6-四甲基吡嗪 -1-基) -4'-去曱基表鬼臼毒素，实施例 1所制备，纯度 97%; 4'-去甲基表鬼臼毒素，购自西安和霖生物工程有限公司，纯度 98%, 川芎嗪，购自西安和霖生物工程有限公司，纯度 98%; 依托泊甙，购自西安和霖生物工程有限公司，纯度 98%;

二、试-险方法

将对数生长期的 Α549细胞（购自上海安普生物科技有限公司） 1， 000 rpm离心 5分钟，弃上清，适量培养基悬浮，调整细胞浓度至 3.5X10³/孔。将细胞接种于 96孔培养板中，分成阴性对照组和同浓度同序列的 4个试验组，（4个试验组分別为： 4-(2，3,5,6-四曱基吡嗪 -1-基) -4'-去曱基表鬼臼毒素组、 4'-去曱基表鬼臼毒素组、川芎嗪组、依托泊甙组），每个试验组设 7个剂量组，剂量组浓度按照（^g/L、 ^g/L l(^g/L、 2(^g/L、 4(^g/L、 8(^g/L和 160 g/L逐级递增，每组设 3个平行孔，用含有 10%小牛血清的 RPMI1640作为培养液， 37°C、 5% CO₂及饱和湿度下培养 24 h 接近长满时，弃去培养液，加入含有不同浓度药物 10°/。小牛血清的 RPMI164培养液 0.15 mL; 阴性对照组所加入的 10%小牛血清的 RPMI164培养液中含有终浓度为 0.5%的 DMSO。继续培养 48 h，每孔加入 5mg/ml的 MTT 20μ1, 37 °C 放置 4h。每孔加入 200 μΐ DMSO , 37°C摇床振荡 30min， 492nm/620nm测吸光度（ OD )，计算 MTT比值 =药物组 OD值 /阴性对照组 OD值。用 MTT法测定细胞生长程度，以阴性对照组数值为 100%做细胞生长抑制图（如图 3所示）。

由图 3可知， 4-(2,3,5,6-四曱基吡嗪 -1-基) -4'-去曱基表鬼臼毒素对 A549肿瘤细胞株具有明显的生长抑制作用，并且在同浓度作用下， 4-(2,3，5，6-四曱基吡嗪 -1- 基) -4'-去甲基表鬼臼毒素对此细胞株的生长半数抑制率（IC₅o μΜ)比 4'-去甲基表鬼臼毒素和依托泊甙对此细胞株的生长半数抑制率明显要高， 4-(2,3,5,6-四曱基吡嗪小基) -4'-去曱基表鬼臼毒素（IC_5Q = 0.23 μΜ)对人肺癌细胞株 A549的抑制活性较川芎嗪 (IC₅。 = 12907734 μΜ)、 4'-去甲基表鬼臼毒素 (IC_5Q = 0.45 μΜ)和应用于临床的鬼臼类药物"依托泊甙"（IC₅G = 165 μΜ)分别提高了 2X10⁸倍、 1.06倍和 716倍。这说明本发明 4-(2,3 ,5,6-四甲基吡嗪- 1 -基) -4'-去甲基表鬼臼毒素的抗肿瘤活性要明显高于 4'-去甲基表鬼臼毒素和依托泊甙等鬼臼类化合物的抗肿瘤活性。试验例 4 ΜΤΤ法测定 4-(2，3，5,6-四甲基吡嗪 -1-基) -4'-去曱基表鬼臼毒素对 HepG2 肿瘤细胞生长的抑制。

一、试验材料

4-(2,3,5,6-四曱基吡嗪小基 )-4'-去曱基表鬼臼毒素（实施例 1 所制备）；依托泊甙，购自西安和霖生物工程有限公司，纯度 98%;

二、试险方法

将对数生长期的 HepG2细胞（购自上海安普生物科技有限公司）， 1 , 000 rpm 离心 5分钟，弃上清，适量培养基悬浮，调整细胞浓度至 3.5X10³/孔。将细胞接种于 96孔培养板中，分成阴性对照组和同浓度同序列的 4个试验组，（4个试验组分别为： 4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪 -1-基) -4'-去曱基表鬼臼毒素组、 4'-去甲基表鬼臼毒素组、川芎嗪组、依托泊甙组），每个试验组设 7个剂量组，剂量组浓度按照（^g/L、 l g/L、 l(^g L、 2(^g/L、 4(^g/L、 8(^g/L和 160 g/L逐级递增，每组设 3个平行孔。用含有 10%小牛血清的 RPMI1640作为培养液， 37°C、 5% CO₂及饱和湿度下培养 24 h 接近长满时，弃去培养液，加入含有不同浓度药物 10%小牛血清的 RPMI164培养液 0.15 mL; 阴性对照组所加入的 10%小牛血清的 RPMI164培养液中含有终浓度为 0.5%的 DMSO。继续培养 48 h，每孔加入 5mg/ml的 MTT 20μ1, 37°C 放置 4h。每孔加入 200 μΐ DMSO, 37。C摇床振荡 30min, 492nm/620nm测吸光度（ OD ), 计算 MTT比值 =药物组 OD值 /阴性对照组 OD值。用 MTT法测定细胞生长程度，以阴性对照組数值为 100%做细胞生长抑制图（如图 4所示)。

由图 4可知， 4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪 -1-基) -4'-去甲基表鬼臼毒素对 HepG2肿瘤细胞株具有明显的生长抑制作用，并且在同浓度作用下， 4-(2，3,5,6-四曱基吡嗪 -1- 基)— 4'-去甲基表鬼臼毒素对此细胞株的生长半数抑制率（IC_5Q μΜ)比依托泊甙对此细胞株的生长半数抑制率明显要高， 4-(2,3,5,6-四曱基吡嗪 -1-基) -4'-去曱基表鬼臼毒素（IC₅。= 0.29 μΜ)对人乳腺癌细胞株 HepG2的抑制活性较应用于临床的鬼臼类药物"依托泊甙"（IC₅₀ = 1.06 μΜ)分别显著提高了 2.7倍。这说明本发明 4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪小基 )-4'-去曱基表鬼臼毒素的抗肿瘤活性要明显高于依托泊甙的抗肿瘤活性。试验例 5 ΜΤΤ法测定 4-(2，3,5，6-四甲基吡嗪 -1-基) -4'-去曱基表鬼臼毒素对 ΗΚ-2 正常细胞生长的抑制。

一、试验材料

4-(2,3,5，6-四曱基吡嗪 -1-基) -4'-去甲基表鬼臼毒素（实施例 1所制备），纯度 97%; 鬼臼毒素，购自西安和霖生物工程有限公司，纯度 98%; 川芎嗪，购自西安和霖生物工程有限公司，纯度 98%;依托泊甙，购自西安和霖生物工程有限公司，纯度 98%; 二、试验方法

将对数生长期的 ΗΚ-2细胞（购自上海安普生物科技有限公司） 1 , 000 rpm离心 5分钟，弃上清，适量培养基悬浮，调整细胞浓度至 3.5X10³/孔。将细胞接种于 96孔培养板中，分成空白组，同浓度同序列的 4个试验组（4-(2,3,5，6-四曱基吡嗪 -1- 基) _₄'—去甲基表鬼臼毒素组、鬼臼毒素组，川芎嗪组，依托泊甙），每个试验组设 7 个剂量组，剂量组浓度按照（ g/L、 l g/L、 l( g/L、 2(^g/L、 4(^g/L、 8(^g/L 和 160 μ /L逐级递增，每组设 3个平行孔。用含有 10% Ί、牛血清的 RPMI 1640作为培养液， 37°C、 5% CO₂及饱和湿度下培养 24 h接近长满时，弃去培养液，加入含有不同浓度药物 10%小牛血清的 RPMI164培养液 0.15 mL; 阴性对照组所加入的 10% 小牛血清的 RPMI164培养液中含有终浓度为 0.5%的 DMSO。继续培养 48 h，每孔加入 5 mg/ml的 MTT 20 μΐ, 37 °C 放置 4h。每孔加入 200 μΐ DMSO, 37 °C摇床振荡 30 min, 492 nm/620nm测吸光度 ( OD )，计算 MTT比值 =药物组 OD值 /阴性对照组 OD值。用 MTT法测定细胞生长程度，以阴性对照组数值为 100%做细胞生长抑制图（如图 5所示)。

三、试验结果

由图 5可知， 4-(2,3,5,6-四曱基吡嗪 -1-基 )-4'-去曱基表鬼臼毒素对 HK-2正常细胞株的生长抑制作用不明显，在同浓度作用下， 4-(2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪 -1-基) -4'-去甲基表鬼臼毒素对此细胞株的生长半数抑制率比鬼臼毒素对此细胞株的生长半数抑制率明显要低， 4-(2， 3, 5, 6-四曱基吡嗪 -1-基) -4'-去曱基表鬼臼毒素 (IC_5Q = 0.24 μΜ)对人肾小管细胞 HK-2毒性较鬼臼毒素 (IC₅。 = 0.0035 μΜ)争低近 66倍。这说明本发明 4-(2,3,5,6-四曱基吡嗪 -1-基) -4'-去甲基表鬼臼毒素的细胞毒性要明显低于鬼臼毒素的细胞毒性。试验例 6 油脂分配系数测试

一、试验材料

4-(2，3,5,6-四曱基吡嗪 -1-基) -4'-去曱基表鬼臼毒素（实施例 1所制备），纯度 97%; 4'-去曱基表鬼臼毒素，购自西安和霖生物工程有限公司，纯度 98%; 鬼臼毒素，购自西安和霖生物工程有限公司，纯度 98%;

二、试-睑方法

称取 4-(2,3,5,6-四曱基吡嗪 -1-基) -4'-去甲基表鬼臼毒素、 4'-去曱基表鬼臼毒素和鬼臼毒素各 l mg，分别溶于三支含 2 mL正辛醇和 2 mL生理盐水的 10 mL离心管中，盖好后充分振荡 10 min后，静置 20 min, 分别取有机相和水相各 0.2 mL于干净试管中，以 UV分别测定有机相和水相的吸光度 A, 进而计算溶解质量 W醇和 W水。重复本操作 3次后取平均值，通过式 1计算其脂水分配系数：

W醇/ V醇

logP = log

W水/ V水

式 1中 W醇和 W水分别表示正辛醇相和水相中测得的质量; V醇和 V水分别表示正辛醇相和水相的体积。

三、试验结果

由表 1可知，川芎嗪的油脂分配系数 (logP > 5)较高，是具有强烈的亲水性化合物。通过将川芎嗪通过转氨反应引入 4'-去曱基表鬼臼毒素 C环 4位后，所得到产物 4-(2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪 -1-基) -4'-去甲基表鬼臼毒素的油脂分配系数比同浓度作用下 4'-去曱基表鬼臼毒素或鬼臼毒素均明显提升： 4-(2, 3, 5, 6-四曱基吡嗪 -1-基) -4'- 去甲基表鬼臼毒素的油脂分配系数 (log = 0.66)较 4'-去甲基表鬼臼毒素 (log = 0.57)和鬼臼毒素 (logP = 0.34) 的油脂分配系数分别提升了近 16%和 94%。这说明本发明 4-(2,3,5,6-四曱基吡嗪小基 )-4'-去曱基表鬼臼毒素的水溶性要明显高于 4'-去甲基表鬼臼毒素、鬼臼毒素的水溶性。

表 1 4'-去曱基表鬼臼毒素衍生物及对比物的油脂分配系数（logR)。

化合物 4-(2,3，5,6-四曱基吡嗪小基) -4'-去曱基表鬼臼毒素 4'-去曱基表鬼臼毒素鬼臼毒素川芎嗪 logP 0.66 0.57 0.34 > 通过脂水分配系数测试得到的水溶性数据也表明，本发明式（III )化合物的水溶性较 4'-去曱基表鬼臼毒素或鬼臼毒素有显著增强。

Claims

权利要求

1、式（III ) 所示的化合物或其盐：

式（ III )。

2、按照权利要求 1所述的化合物或其盐，其特征在于：所述的盐包括盐酸盐或磷酸盐。

3、一种合成权利要求 1 所述式（III )化合物或其盐的方法，包括：

( 1 )、将 4'-去曱基表鬼臼毒素 C环 4位的羟基活化；

4、按照权利要求 3所述的方法，其特征在于：步骤 (1)中所述的 4'-去曱基表鬼臼毒素 C环 4位的羟基活化包括以下步骤：将 4'-去曱基表鬼臼毒素溶于二氯甲烷中，再加入三乙胺和对甲基苯磺酰氯，搅拌进行反应，即得。

5、按照权利要求 4所述的方法，其特征在于：所述的搅拌转速为 50-800转 /分钟，所述的反应温度为 -20-50°C，所述的反应时间为 1-8 小时；优选的，所述的搅拌转速为 600转 /分钟，所述的反应温度为 20-50°C , 所述的反应时间为 1小时。

6、按照权利要求 3所述的方法，其特征在于，步骤（2 ) 中所述的转氨反应包括：（ 1 )将川芎嗪、盐酸川芎嗪或磷酸川芎嗪中的任意一种与步骤（1 ) 中所得到的 4'-去曱基表鬼臼毒素 C环 4位活化产物溶解在乙腈中，搅拌进行亲核加成反应；

( 2 )将反应液减压浓缩至干燥，并以乙酸乙酯析出沉淀，即得。

7、按照权利要求 3 所述的方法，其特征在于：按摩尔比计， 4'-去曱基表鬼臼毒素 C环 4位活化产物和盐酸川芎嗪或磷酸川芎嗪的比例为 1: 2; 所述的搅拌转速为 50-1000转 /分钟，述的反应温度为 -20-130°C , 所述的反应时间为 1-72小时；优选的，所述搅拌转速为 600转 /分钟，所述的反应温度为 80°C , 所述的反应时间为 8小时。

8、按照权利要求 3所述的方法，其特征在于，还包括：

( 1 )、将所得到的粗产物通过乙酸乙酯溶剂或极性相似溶剂反复冲洗、收集不溶物，真空干燥，得到待分离纯化样品；

( 2 )、待分离纯化样品依次使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离，即得。

9、按照权利要求 8所述的方法，其特征在于：

所述的硅胶柱层析的分离方法包括：（1 )硅胶柱层析为正相硅胶柱层析或反相硅胶柱层析，正相硅胶以低极性有机溶剂拌匀后装柱，以洗脱剂平衡，所述的洗脱剂优选是体积比为 40: 1的氯仿和丙酮组成；反相硅胶以曱醇拌勾后装柱，以洗脱剂平衡，所述的洗脱剂优选是体积比为 60: 1的曱醇和水组成；（2)将待分离纯化的样品以洗脱液溶解，进行上样吸附，然后用洗脱剂洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；

所述的凝胶柱层析分离方法包括：（1 )凝胶以曱醇浸泡；将处理好的凝胶装柱，以曱醇平衡；（2 )将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于曱醇中，进行上样吸附，然后用曱醇洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶。

10、权利要求 1或 1所述化合物或其盐在制备抗肿瘤药物中的用途。

11、按照权利要求 10所述的用途，其特征在于：所述的肿瘤包括胃癌、鼻咽癌、胰腺癌或肝癌。

12、一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于：包括有效量的权利要求 1或 2所述的化合物或其盐和药学上可接受的载体。