CN102875565B

CN102875565B - 具有抗肿瘤活性的酯化鬼臼类衍生物及其制备方法和用途

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Publication number: CN102875565B
Application number: CN201210374710.1A
Authority: CN
Inventors: 汤亚杰; 肖黎
Original assignee: Hubei University of Technology
Current assignee: Hubei University of Technology
Priority date: 2012-09-29
Filing date: 2012-09-29
Publication date: 2015-03-25
Anticipated expiration: 2032-09-29
Also published as: CN102875565A

Abstract

本发明公开了具有抗肿瘤活性的酯化鬼臼类衍生物及其制备方法和用途。本发明将金刚烷甲酸、乳清酸与鬼臼毒素或4′-去甲表鬼臼毒素进行酯化反应，得到具有抗肿瘤活性的式(Ⅴ)所示的酯化鬼臼类衍生物。本发明酯化鬼臼类衍生物通过多途径、多靶点作用于肿瘤细胞，具有更好的抗肿瘤疗效。体外细胞活性抑制测试表明，本发明酯化鬼臼类衍生物具有优异的抗肿瘤活性、毒副作用低，能制备成抗肿瘤药物应用于临床抗肿瘤治疗。

Description

具有抗肿瘤活性的酯化鬼臼类衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及鬼臼类衍生物，尤其涉及鬼臼毒素或4′-去甲基表鬼臼毒素的C环4位取代后所得到的具有抗肿瘤活性的酯化鬼臼类衍生物及其制备方法，本发明还涉及该酯化鬼臼类衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途，属于鬼臼类衍生物的制备及应用领域。

背景技术

鬼臼毒素(Podophyllotoxin)和4′-去甲基表鬼臼毒素(4′-Demethylepipodophyllotoxin)是从鬼臼类植物中(例如：小檗科植物桃儿七、山荷叶、八角莲等)提取得到的具有独特抗肿瘤活性的天然活性先导化合物。但是，鬼臼毒素、4′-去甲基表鬼臼毒素不同程度的存在抗肿瘤活性较低等缺陷，限制了它们在临床上的使用。

发明内容

本发明目的之一是提供一类具有抗肿瘤活性的酯化鬼臼类衍生物；

本发明目的之二是提供一种制备或纯化上述酯化鬼臼类衍生物的方法；

本发明目的之三是将上述酯化鬼臼类衍生物应用于制备成临床用抗肿瘤药物；

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

具有抗肿瘤活性的酯化取代鬼臼类衍生物，其结构式为式(Ⅴ)所示：

其中，R₁选自R₂选自CH₃或氢。

此外，式(Ⅴ)化合物的酸成盐也当然包括在本发明的保护范围之内，优选的，所述的酸成盐包括盐酸盐或磷酸盐等酸成盐。

金刚烷甲酸、乳清酸是具有刚性的化合物，以它们作为取代基团可能有利于鬼臼毒素或4′-去甲基表鬼臼毒素C环4位β构型的形成；本发明以它们作为鬼臼毒素或4′-去甲基表鬼臼毒素C环4位的取代基团，得到具有抗肿瘤活性的式(Ⅴ)所示的鬼臼类衍生物。

本发明目的之二是提供一种合成上述式(Ⅴ)化合物的方法，包括以下步骤：通过酯化反应，将金刚烷甲酸、乳清酸、引入到鬼臼毒素或4′-去甲基表鬼臼毒素的C环4位，即得。

所述的酯化反应优选在以下条件下进行：将鬼臼毒素或4′-去甲基表鬼臼毒素与干燥的二氯甲烷混合，再加入金刚烷甲酸、乳清酸、，最后加入酯化反应催化剂，搅拌进行酯化反应，即得。

为了达到更好的合成效果，鬼臼毒素或金刚烷甲酸、乳清酸、的摩尔比优选为1:3；所述的催化剂优选为二环己基碳二亚胺和4-二甲基氨基吡啶；所述的搅拌优选为在真空条件进行搅拌，其转速优选为50-800转/分钟，更优选为600转/分钟；所述的酯化反应温度为室温，优选为15-25℃，更优选为25℃；所述的酯化反应时间优选为12-48小时，更优选为24小时。

为了达到更好的技术效果，可以将上述反应产物在以下条件下进行初步纯化得到酯化鬼臼类衍生物粗产物：

将反应产物用滤纸对反应液进行过滤，除去不溶物，加入去离子水，保留有机相，反复两次，再用二氯甲烷对上步所得水相进行反萃，合并有机层，用无水硫酸钠干燥过夜，旋干即得初步纯化的酯化鬼臼类衍生物产品。

本发明还提供了一种将上述初步纯化的酯化鬼臼类衍生物产物进一步纯化的方法，包括以下步骤：

(1)待分离纯化样品的制备：将初步纯化的酯化鬼臼类衍生物产物用滤纸对反应液进行过滤，除去不溶物，加入去离子水，保留有机相，反复两次，再用二氯甲烷对上步所得水相进行反萃，合并有机层，用无水硫酸钠干燥过夜，后用三氯甲烷溶解，过滤不溶物，旋干即得待分离的产品。

(2)分离纯化：将待分离纯化产品依次使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离，即得。

优选的，所述的硅胶柱层析的分离方法包括：(1)硅胶柱层析为正相硅胶柱层析，正相硅胶以低极性有机溶剂拌匀后装柱，以洗脱剂平衡；所述的洗脱剂优选是由体积比为40：1的氯仿和丙酮组成；(2)将待分离纯化的样品以洗脱液溶解，进行上样吸附，然后用洗脱剂洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；

优选的，所述的凝胶柱层析分离方法包括：(1)凝胶以甲醇浸泡；将处理好的凝胶装柱，以甲醇平衡；(2)将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于甲醇中，进行上样吸附，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶。

本发明将金刚烷甲酸、乳清酸、3,4-二甲氧基苯甲酸，进行酯化代反应，得到具有抗肿瘤活性的式(Ⅴ)所示的化合物。体外BGC 823、Hela细胞活性抑制的测试表明，本发明式(Ⅴ)所示化合物的抗肿瘤活性较鬼臼毒素或4′-去甲基表鬼臼毒素活性有所提高，试验结果表明，本发明式(Ⅴ)化合物可制备成抗肿瘤药物，临床应用于抗肿瘤治疗。

本发明的另一目的在于提供一种抗肿瘤药物组合物，由式(Ⅴ)所示的化合物和药学上可接受的载体配合而成，即：将治疗上有效量的式(Ⅴ)化合物与药学上可接受的载体配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一类适宜的药物制剂；通常该药物组合物适合于口服给药和注射给药，也适合其它的给药方法，例如经皮给药。所述药物制剂可以是片剂、胶囊、粉剂、颗粒、锭剂、栓剂、口服液或无菌胃肠外悬液等液体制剂形式。该药物制剂也可以是大或小容量注射剂、冻干粉针、无菌粉分装等制剂形式。

为了达到给药的一致性，本发明药物组合物优选为单剂形式。用于口服给药的单剂形式可以是片剂和胶囊，并可含有常规赋形剂诸如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘氨酸；压片润滑剂，例如硬脂酸镁；崩解剂，例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉乙醇酸钠或微晶纤维素，或药学上可接受的湿润剂，诸如十二烷基硫酸钠。

附图说明

图1鬼臼毒素和4′-去甲基表鬼臼毒素的结构式。

图2金刚烷甲酸、乳清酸、4-(嘧啶硫代)苯乙酸、的结构式。

图3本发明酯化鬼臼类衍生物的8种具体结构式。

图4本发明酯化鬼臼类衍生物的通式结构式。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验材料

鬼臼毒素、4′-去甲基表鬼臼毒素和金刚烷甲酸均购自西安和霖生物工程有限公司，纯度为98％。

金刚烷甲酸、乳清酸、均购自阿拉丁试剂。

二氯甲烷的干燥：称取1.5g氢化钙于1000ML圆底四口瓶中，将干净的漏斗放入侧口，倒入500ML二氯甲烷，加入3-4颗玻璃珠防止暴沸，加热调整温度至二氯甲烷呈微沸状态，加回流管回流2-3h后冷凝回收至装有无水氯化钙的试剂瓶中，收集完液体后，向瓶中通入少许氮气，盖上盖子即可，以后每次用完后补充氮气。

实施例1 4-O-(金刚烷甲酸-1)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素(化合物(1))的合成和纯化

(1)4-O-(金刚烷甲酸-1)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素的合成：分别称取207mg 4′-去甲基表鬼臼毒素和270mg金刚烷甲酸于平皿中，45℃真空干燥2小时；氮气保护下，将干燥好的4′-去甲基表鬼臼毒素和金刚烷甲酸以及1236mg二环己基碳二亚胺加入四口瓶中，再加入10ml干燥好的二氯甲烷，搅拌反应30min，再向反应体系中加入10mg 4-二甲基氨基吡啶,室温25℃反应24小时；反应完毕后，用滤纸对反应液进行过滤，除去不溶物，加入100ml去离子水，保留有机相，反复两次，再用二氯甲烷对上步所得水相进行反萃，合并有机层，用无水硫酸钠干燥过夜，旋干即得4-O-(金刚烷甲酸-1)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素粗产品。

(2)分离和纯化4-O-(金刚烷甲酸-1)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素：使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化：

(A)用正相硅胶柱(正相硅胶：中国青岛海洋化工有限公司，HG/T2354-92；分离系统：瑞士步琪等度快速色谱系统；色谱柱：瑞士步琪玻璃柱C-690，长460毫米，内径15毫米)或者相似极性柱分离；氯仿：丙酮(50:1)系统作为洗脱液，上样量2毫升，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿：丙酮(10:1)系统作为展开剂，将Rf值0.5的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。

(B)用凝胶柱层析(凝胶：Sephadex LH-20；分离柱：玻璃柱，长480毫米，内径30毫米)分离；将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以甲醇平衡。将待纯化样品溶于6毫升甲醇中，以0.6毫升/分钟的流速上样吸附，然后用600毫升甲醇以0.6毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿：丙酮(10：1)系统作为展开剂，将Rf值0.5的馏分进行合并；真空干燥后所得的白色粉末状样品为4-O-(金刚烷甲酸-1)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素。

4-O-(金刚烷甲酸-1)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素:C32H34O9；562，¹H-NMR(300MHz,CDCl₃):δ7.246(s,1H),6.850(s,1H),6.533(s,2H),5.971(d,2H),5.938(s,1H),4.778(s,1H),4.458(d,1H),4.358(m,1H),3.648(s,6H),3.428(d,1H),3.267(t,1H),2.060(s,1H),1.735(s,15H)；¹³C-NMR(75MHz,CDCl₃):δ174.986(C-12,C-1″；C),152.580(C-3′；C),151.807.580(C-5′；C),148.700(C-6；C),147.689(C-7；C),140.010(C-1′；C),137.549(C-4′；C),132.093(C-9,C-10；C),110.790(C-5；CH),110.174(C-8；CH),109.080(C-2′；CH),108.184(C-6；CH),101.713(-OCH₂O),68.083(C-11；CH₂),66.924(4′-OCH₃；CH₃),56.544(3′,5′-OCH₃；CH₃),44.690(C-4),44.103(C-1；CH),41.239(C-2,CH),40.695(C-3；CH),38.949(C-2”,C-3”,C-4”,C-5”,C-6”；CH),36.672(C-7”,C-8”,C-9”,CH),28.125(C-10”；C)。

实施例2 4-O-(金刚烷甲酸-1)-4-脱氧鬼臼毒素(化合物(2))的合成和纯化

(1)4-O-(金刚烷甲酸-1)-4-脱氧鬼臼毒素的合成：分别称取207mg鬼臼毒素和510mg金刚烷甲酸于平皿中，45℃真空干燥2小时；氮气保护下，将干燥好的鬼臼毒素和金刚烷甲酸以及1236mg二环己基碳二亚胺加入四口瓶中，再加入10ml干燥好的二氯甲烷，搅拌反应30min,再向反应体系中加入10mg 4-二甲基氨基吡啶，20℃反应48小时；反应完毕后，用滤纸对反应液进行过滤，除去不溶物，加入100ml去离子水，保留有机相，反复两次，再用二氯甲烷对上步所得水相进行反萃，合并有机层，用无水硫酸钠干燥过夜，旋干即得4-O-(金刚烷甲酸-1)-4-脱氧鬼臼毒素粗产品。

(2)分离和纯化4-O-(金刚烷甲酸-1)-4-脱氧鬼臼毒素：

使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化：

(A)用正相硅胶柱(正相硅胶：中国青岛海洋化工有限公司，HG/T2354-92；分离系统：瑞士步琪等度快速色谱系统；色谱柱：瑞士步琪玻璃柱C-690，长460毫米，内径15毫米)或者相似极性柱分离；氯仿：丙酮(50：1)系统作为洗脱液，上样量2毫升，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿：丙酮(5：1)系统作为展开剂，将Rf值0.6的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。

(B)用凝胶柱层析(凝胶：Sephadex LH-20；分离柱：玻璃柱，长480毫米，内径30毫米)分离；将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以甲醇平衡。将待纯化样品以溶于6毫升甲醇中，以0.6毫升/分钟的流速上样吸附，然后用600毫升甲醇以0.6毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿：丙酮(5：1)系统作为展开剂，将Rf值0.6的馏分进行合并；真空干燥后所得的白色粉末状样品为4-O-(金刚烷甲酸-1)-4-脱氧鬼臼毒素。

4-O-(金刚烷甲酸-1)-4-脱氧鬼臼毒素：白色粉末，C33H36O9；576,¹H-NMR(300MHz,CDCl₃):δ7.245(d,1H),7.028(s,1H),6.434(d,2H),5.928(d,2H),4.506(s,1H),4.487(d,1H),4.423(d,1H),3.856(q,9H),3.472(s,2H),3.469(q,1H)；1.542(m,15H).¹³C-NMR(75MHz,CDCl₃):δ177.992(C-12,C-1″；C),153.749(C-3′,C-5′；C),147.555(C-6；C),147.226(C-7；C),139.466(C-4′；C),133.347(C-9；C),132.222(C-1′；C),130.747(C-10,C),109.415(C-5,C-8；CH),105.879(C-2′,CH),105.546(C-6′；CH),101.369(-OCH₂O),69.937(C-11；CH₂),69.615(C-4),61.054(4′-OCH₃；CH₃),56.429(3′,5′-OCH₃；CH₃),45.557(C-1；CH),44.203(C-2,CH),42.814(C-3；CH)。

实施例4 4-O-(1,2,3,6-四氢-2,6-二氧-4-嘧啶甲酸-1)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素(化合物(4))的合成和纯化

(1)4-O-(1,2,3,6-四氢-2,6-二氧-4-嘧啶甲酸-1)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素的合成：分别称取100mg4′-去甲基表鬼臼毒素和226mg乳清酸于平皿中，45℃真空干燥2小时；氮气保护下，将干燥好4′-去甲基表鬼臼毒素和乳清酸以及309mg二环己基碳二亚胺加入四口瓶中，后加入2ml干燥好的N,N-二甲基甲酰胺，搅拌反应30min,向反应体系中加入5mg 4-二甲基氨基吡啶,25℃反应24小时；反应完毕后，用滤纸对反应液进行过滤，除去不溶物，加入100ml去离子水，保留有机相，反复两次，再用二氯甲烷对上步所得水相进行反萃，合并有机层，用无水硫酸钠干燥过夜，旋干即的粗产品。

(2)分离和纯化4-O-(1,2,3,6-四氢-2,6-二氧-4-嘧啶甲酸-1)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素：

使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化：

(A)用正相硅胶柱(正相硅胶：中国青岛海洋化工有限公司，HG/T2354-92；分离系统：瑞士步琪等度快速色谱系统；色谱柱：瑞士步琪玻璃柱C-690，长460毫米，内径15毫米)或者相似极性柱分离；氯仿：丙酮50：1系统作为洗脱液，上样量2毫升，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿：丙酮(10：1)系统作为展开剂，将Rf值0.4的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。

(B)用凝胶柱层析(凝胶：Sephadex LH-20；分离柱：玻璃柱，长480毫米，内径30毫米)分离；将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以甲醇平衡。将待纯化样品以溶于6毫升甲醇中，以0.6毫升/分钟的流速上样吸附，然后用600毫升甲醇以0.6毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿：丙酮(10：1)系统作为展开剂，将Rf值0.6的馏分进行合并；真空干燥后所得的白色粉末状样品为4-O-(1,2,3,6-四氢-2,6-二氧-4-嘧啶甲酸-1)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素：

4-O-(1,2,3,6-四氢-2,6-二氧-4-嘧啶甲酸-1)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素：白色粉末,C₂₆H₂₂O₁₁N₂；538,¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.708(d,1H),6.861(s,1H),6.550(d,1H),6.520(s,1H),5.254(s,2H),5.992(d,2H,),5.398(s,1H),4.637(d,1H),4.299(t,2H),4.057(m,1H),3.765(d,6H),3.375(d,1H),3.046(s,1H).

试验例1本发明化合物抑制肿瘤细胞的活性试验

一、试验材料

1、供试化合物：实施例1-8所制备的化合物，分别编号为化合物(1)、化合物(2)、化合物(3)、化合物(4)、化合物(5)、化合物(6)、化合物(7)和化合物(8)；

2、对照化合物：鬼臼毒素(PTOX)和4′-去甲表鬼臼毒素(DMEP)购自西安和霖生物工程有限公司，纯度98％；依托泊苷(Etoposide)；

3、细胞株：A549细胞株、BGC823细胞株、Hela细胞株以及人正常肝细胞株购自武汉博士得生物科技有限公司；

二、试验方法

将生长至对数生长期的A549细胞株和人正常肝细胞株，1000rpm离心5分钟，弃上清，适量DMEM培养基悬浮，调整细胞浓度至3.5×10⁴个/孔。将细胞以100μl/孔接种于96孔培养板中，分成阴性对照组,阳性对照组和11个同浓度同序列的试验组，即：化合物(1)组、化合物(2)组、化合物(3)组、化合物(4)组、化合物(5)、化合物(6)、化合物(7)、化合物(8)、4′-去甲表鬼臼毒素组、鬼臼毒素组，依托泊苷组；用含有10％小牛血清的DMEM培养液37℃、5％CO₂及饱和湿度下培养24h后，往96孔板中加入不同浓度的药物1μL(药物用DMSO溶解，使其终浓度分别为500μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、5μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.02μg/mL、0.004μg/mL，DMSO的终浓度<0.1％)，每个样品浓度做6个复孔，并设置对照组。置5％C0₂，37℃,继续培养48h，每孔加入5mg/ml的MTT 10μl,37℃，5％CO₂避光放置4h后吸出培养液。每孔加入100μl DMSO，37℃摇床振荡30min，492nm测吸光度(OD)，计算MTT比值＝药物组OD值/阴性对照组OD值。

三、试验结果

试验结果见表1。由表1可知，化合物(1)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)和(8)相比4′-去甲基表鬼臼毒素及目前已做为抗肿瘤药物上市的鬼臼类衍生物依托泊苷而言，针对Hela细胞株的抗肿瘤活性明显提高，同时，化合物(1)、(6)、(7)和(8)的毒副作用明显降低。化合物(2)相比鬼臼毒素及目前已做为抗肿瘤药物上市的鬼臼类衍生物依托泊苷而言，针对Hela细胞株的抗肿瘤活性明显提高。

表1酯化鬼臼类衍生物对体外正常细胞株的EC₅₀值

Claims

1.具有抗肿瘤活性的酯化取代鬼臼类衍生物或其盐，其特征在于，其结构式为式(Ⅴ)所示：

其中，R₁选自R₂选自CH₃或氢。

2.一种制备权利要求1所述酯化取代鬼臼类衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：将鬼臼毒素或4′-去甲表鬼臼毒素与干燥的二氯甲烷混合，再加入金刚烷甲酸、乳清酸,最后加入催化剂进行酯化反应，并进行搅拌，这样将金刚烷甲酸、乳清酸引入到鬼臼毒素或4′-去甲基表鬼臼毒素的C环4位，得到酯化取代鬼臼类衍生物粗产品。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：鬼臼毒素或4′-去甲表鬼臼毒素与金刚烷甲酸、乳清酸的摩尔比为1:3。

4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述催化剂为二环己基碳二亚胺和/或4-二甲基氨基吡啶。

5.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述搅拌的条件为真空，转速为50-800转/分钟；所述酯化反应温度为15-25℃；所述酯化反应时间为12-48小时。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述搅拌的转速优选为600转/分钟；所述酯化反应温度优选为25℃；所述酯化反应时间优选为24小时。

7.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：

(1)将酯化取代鬼臼类衍生物粗产品旋转蒸发浓缩，过滤，除去不溶物，加入去离子水，保留有机相，反复两次，再用二氯甲烷对所得水相进行反萃，合并有机层，干燥过夜，旋干，备用；

(2)将步骤(1)所制备的产品依次使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离，即得酯化取代鬼臼类衍生物纯品。

8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于：

所述的硅胶柱层析的分离方法包括：(1)硅胶柱层析为正相硅胶柱层析，正相硅胶以低极性有机溶剂拌匀后装柱，以洗脱剂平衡；所述的洗脱剂是由体积比为50：1的氯仿和丙酮组成；(2)将待分离纯化的样品以洗脱液溶解，进行上样吸附，然后进行梯度洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；

所述的凝胶柱层析分离方法包括：(1)以体积比为5:5:1的石油醚：氯仿：甲醇为洗脱剂，凝胶以洗脱剂浸泡，装柱，以洗脱剂平衡；(2)将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于以上洗脱剂中，进行上样吸附，洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶。

9.权利要求1所述酯化取代鬼臼类衍生物或其盐在制备抗子宫癌与抗肝癌药物中的用途。

10.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于：包括有效量的权利要求1所述的酯化取代鬼臼类衍生物或其盐和药学上可接受的载体。