CN102757442B

CN102757442B - 硫取代鬼臼类衍生物及其合成方法和应用

Info

Publication number: CN102757442B
Application number: CN201110106180.8A
Authority: CN
Inventors: 汤亚杰; 白佳珂
Original assignee: 汤亚杰
Current assignee: Hubei University of Technology
Priority date: 2011-04-27
Filing date: 2011-04-27
Publication date: 2015-06-24
Anticipated expiration: 2031-04-27
Also published as: CN102757442A

Abstract

本发明公开了硫取代鬼臼类衍生物及其合成方法和应用。本发明通过硫取代反应，将2-巯基-1，3，4-噻二唑或3-巯基-1，2，4-三氮唑分别引入到鬼臼毒素或4′-去甲基表鬼臼毒素的C环4位，得到式(V)所示的硫取代鬼臼类衍生物。体外BGC823、HepG2、A549肿瘤细胞株细胞凋亡试验结果表明，本发明硫取代鬼臼类衍生物具有良好的抗肿瘤活性且安全性好、毒副作用小，可制备成临床用抗肿瘤药物。

Description

硫取代鬼臼类衍生物及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及硫取代鬼臼类衍生物，尤其涉及鬼臼毒素或4′-去甲基表鬼臼毒素的C环4位取代后所得到的硫取代鬼臼类衍生物及其制备方法，本发明还涉及该硫取代鬼臼类衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途，属于鬼臼类衍生物领域。

背景技术

鬼臼毒素(Podophyllotoxin)和4′-去甲基表鬼臼毒素(4′-Demethylepipodophyllotoxin)的结构式为图1中的式(I)和(II)所示，它们是从鬼臼类植物中(例如：小檗科植物桃儿七、山荷叶、八角莲等)提取得到的具有独特抗肿瘤活性的天然活性先导化合物。但是，因强烈的毒副作用和生物利用度差等缺点，限制了它们在临床上的使用，因此，目前针对其结构修饰后的药物开发研究十分活跃。

3-巯基-1，2，4-三氮唑和2-巯基-1，3，4-噻二唑是具有刚性的芳香杂环化合物，其结构分别为图2中的式(III)和(IV)所示，以其作为取代基团可能有利于鬼臼毒素和4′-去甲基表鬼臼毒素C环4位β构型的形成，同时噻二唑和三氮唑是很多具有抗肿瘤活性药物合成的中间体，以其作为取代基团，期望得到抗肿瘤活性进一步提高，毒副作用降低的鬼臼类衍生物。

发明内容

本发明目的之一提供一类具有良好抗肿瘤活性的硫取代鬼臼类衍生物；

本发明目的之二是提供一种合成和纯化上述硫取代鬼臼类衍生物的方法；

本发明目的之三是将上述硫取代鬼臼类衍生物应用于制备成临床用抗肿瘤药物；

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一类具有抗肿瘤活性的硫取代鬼臼类衍生物，其结构式为式(V)所示：

式(V)

其中，R₁选自R₂选自CH₃或氢。

此外，式(V)化合物的酸成盐也当然包括在本发明的保护范围之内，优选的，所述的酸成盐包括盐酸盐或磷酸盐等酸成盐。

本发明目的之二是提供一种合成上述式(V)化合物的方法，包括：通过硫取代反应，将2-巯基-1，3，4-噻二唑或3-巯基-1，2，4-三氮唑引入到鬼臼毒素或4′-去甲基表鬼臼毒素的C环4位，即得。

所述的硫取代反应优选在以下条件下进行：将鬼臼毒素或4′-去甲表鬼臼毒素溶于三氟乙酸中，再加入2-巯基-1，3，4-噻二唑或3-巯基-1，2，4-三氮唑，搅拌进行反应，即得。

其中，鬼臼毒素或4′-去甲表鬼臼毒素与2-巯基-1，3，4-噻二唑或3-巯基-1，2，4-三氮唑的摩尔比优选为1∶1；

所述的搅拌为转速为50-800转/分钟真空搅拌，所述的反应温度为-20-20℃，所述的反应时间为1-6小时；优选的，所述的搅拌转速为600转/分钟，所述的反应温度为-10-10℃，所述的反应时间为1小时

为了达到更好的技术效果，可以将上述反应产物在以下条件下进行初步纯化得到硫取代鬼臼类衍生物粗产物：

将反应产物旋转蒸发浓缩，用乙酸乙酯复溶，再以去离子水洗涤三次，收集有机层，用无水硫酸钠干燥过夜；将处理并干燥后的反应液减压浓缩至干燥，即得硫取代鬼臼类衍生物粗产物。

本发明还提供了一种将上述硫取代鬼臼类衍生物粗产物进一步纯化的方法，包括：

(1)待分离纯化样品的制备：将硫取代鬼臼类衍生物粗产物通过乙酸乙酯溶剂溶解，并用水反复洗涤，收集有机层，真空干燥，备用；

(2)分离纯化：将待分离纯化样品依次使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离，即得。

优选的，所述的硅胶柱层析的分离方法包括：(1)硅胶柱层析为正相硅胶柱层析或反相硅胶柱层析，正相硅胶以低极性有机溶剂拌匀后装柱，以洗脱剂平衡；所述的洗脱剂优选是由体积比为40∶1的氯仿和丙酮组成；反相硅胶以甲醇拌匀后装柱，以洗脱剂平衡；所述的洗脱剂优选是由体积比为60∶1的甲醇和水组成；(2)将待分离纯化的样品以洗脱液溶解，进行上样吸附，然后用洗脱剂洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；

优选的，所述的凝胶柱层析分离方法包括：(1)凝胶以甲醇浸泡；将处理好的凝胶装柱，以甲醇平衡；(2)将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于甲醇中，进行上样吸附，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶。

本发明将鬼臼毒素或4′-去甲基表鬼臼毒素与3-巯基-1，2，4-三氮唑或2-巯基-1，3，4-噻二唑通过硫取代反应，得到具有良好抗肿瘤活性的式(V)所示的化合物，该化合物可通过多途径、多靶点作用于肿瘤细胞，从而达到更好的抗肿瘤疗效。体外BGC823、HepG2、A549细胞活性抑制的测试表明，本发明式(V)所示化合物的抗肿瘤活性较鬼臼毒素或4′-去甲基表鬼臼毒素的抗肿瘤活性有显著提高，且对正常细胞肾小管上皮细胞HK-2的毒副作用与鬼臼毒素相比显著降低。试验结果表明，本发明式(V)化合物可制备成抗肿瘤药物，临床应用于抗肿瘤治疗。

本发明的另一目的在于提供一类药物组合物，由式(V)所示的化合物和药学上可接受的载体配合而成，即：将药学上可接受用量的式(V)化合物与药学上可接受的载体配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一类适宜的药物组合物，通常该药物组合物适合于口服给药和注射给药，也适合其他的给药方法，例如经皮给药。

所述药物组合物可以是片剂、胶囊、粉剂、颗粒、锭剂、栓剂、口服液或无菌胃肠外悬液等液体制剂形式。该组合物可以是大或小容量注射剂、冻干粉针、无菌粉分装等制剂形式。

为了达到给药的一致性，本发明药物组合物优选为单剂形式。用于口服给药的单剂形式可以是片剂和胶囊，并可含有常规赋形剂诸如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘氨酸；压片润滑剂，例如硬脂酸镁；崩解剂，例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉乙醇酸钠或微晶纤维素，或药学上可接受的湿润剂，诸如十二烷基硫酸钠。

附图说明

图1鬼臼毒素和4′-去甲基表鬼臼毒素的结构式。

图23-巯基-1，2，4-三氮唑和2-巯基-1，3，4-噻二唑的结构式。

图3本发明硫取代鬼臼类衍生物的结构式。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验材料

鬼臼毒素和4′-去甲基表鬼臼毒素：均购自西安和霖生物工程有限公司，纯度为98％。

3-巯基-1，2，4-三氮唑和2-巯基-1，3，4-噻二唑：均购自阿拉丁试剂。

实施例1 4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧鬼臼毒素(化合物(1))的合成和纯化

(1)4-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧鬼臼毒素的合成：取414mg(1mmol)的鬼臼毒素，101mg(1mmol)的三氮唑，真空干燥1h，在冰浴条件下以15ml三氟乙酸为溶剂，在4℃下真空搅拌(600转/分钟)1h，以氯仿丙酮为展开剂，检测反应终点。减压浓缩至近干，溶于乙酸乙酯中，并用10ml去离子水洗涤三次，收集乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥，浓缩即得粗产物。

(2)分离和纯化4-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧鬼臼毒素：

使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化：

(A)用正相硅胶柱(正相硅胶：中国青岛海洋化工有限公司，HG/T2354-92；分离系统：瑞士步琪等度快速色谱系统：色谱柱：瑞士步琪玻璃柱C-690，长460毫米，内径15毫米)或者相似极性柱分离；氯仿∶丙酮20∶1系统作为洗脱液，上样量2毫升，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿∶丙酮(2∶1)系统作为展开剂，将Rf值0.5的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。

(B)用凝胶柱层析(凝胶：Sephadex LH-20；分离柱：玻璃柱，长480毫米，内径30毫米)分离；将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以甲醇平衡。将待纯化样品溶于6毫升甲醇中，以0.6毫升/分钟的流速上样吸附，然后用600毫升甲醇以0.6毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿∶丙酮(2∶1)系统作为展开剂，将Rf值0.5的馏分进行合并；真空干燥后所得的白色粉末状样品为4-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧鬼臼毒素。

4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧鬼臼毒素：白色粉末，C24H23O7N3S1；497，1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.191(s，1H)，7.015(s，1H)，6.500(s，1H)，6.472(s，2H)，6.313(s，2H)，5.973(d，2H)，5.380(s，1H)，4.603(d，1H)，4.353(d，1H)，3.990(s，1H)，3.796(s，9H)，3.282(s，1H)；13C-NMR(300MHz，CDCl3)：δ174.829(C-12；C)，152.795(C-2”；C)，148.558(C-7；C)，147.684(C-6；C)，146.066(C-3’，C-5’；C)，137.405(C-4’；C)，135.758(C-9；C)，132.537(C-1’；C)，127.942(C-10，C)，110.475(C-8；CH)，110.117(C-5，C-8；CH)，108.571(C-2’，C-6’；CH)，101.842(-OCH2O)，70.789(C-11；CH2)，61.025(4’-OCH3；CH3)，56.487(3’，5’-OCH3；CH3)，48.828(C-4)，43.974(C-1；CH)，42.457(C-2，CH)，37.532(C-3；CH)。

实施例2 4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧鬼臼毒素(化合物(2))的合成和纯化

(1)4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧鬼臼毒素的合成：取414mg(1mmol)的鬼臼毒素，118mg(1mmol)的三氮唑，真空干燥1h，在冰浴条件下以15ml三氟乙酸为溶剂，在4℃下真空搅拌(600转/分钟)1.5h，以氯仿丙酮为展开剂，检测反应终点。减压浓缩至近干，溶于乙酸乙酯中，并用10ml去离子水洗涤三次，收集乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥，浓缩即得粗产物。

(2)分离和纯化4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧鬼臼毒素：

使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化：

(A)用正相硅胶柱(正相硅胶：中国青岛海洋化工有限公司，HG/T2354-92；分离系统：瑞士步琪等度快速色谱系统：色谱柱：瑞士步琪玻璃柱C-690，长460毫米，内径15毫米)或者相似极性柱分离；氯仿∶丙酮40∶1系统作为洗脱液，上样量2毫升，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿∶丙酮(15∶1)系统作为展开剂，将Rf值0.7的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。

(B)用凝胶柱层析(凝胶：Sephadex LH-20；分离柱：玻璃柱，长480毫米，内径30毫米)分离；将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以甲醇平衡。将待纯化样品以溶于6毫升甲醇中，以0.6毫升/分钟的流速上样吸附，然后用600毫升甲醇以0.6毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿∶丙酮(15∶1)系统作为展开剂，将Rf值0.7的馏分进行合并；真空干燥后所得的白色粉末状样品为4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧鬼臼毒素。

4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧鬼臼毒素：白色粉末，C24H23O7N2S2；515，1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δ9.079(s，1H)，6.960(s，1H)，6.500(s，1H)，6.486(s，1H)，6.291(s，2H)，5.975(d，2H)，5.789(d，1H)，4.554(t，1H)，4.30(d，1H)，4.117(q，1H)，3.856(q，9H)，3.353(s，1H)，3.175(q，1H)；13C-NMR(600MHz，CDCl3)：δ174.358(C-12；C)，165.128(C-1”；C)，152.865(C-2”；C)，148.878(C-6，C-7；C)，147.823(C-3’，C-5’；C)，137.438(C-4’；C)，135.271(C-9；C)，133.076(C-1’；C)，126.807(C-10，C)，110.354(C-8；CH)，110.253(C-5，C-8；CH)，108.347(C-2’，C-6’；CH)，101.977(-OCH2O)，70.950(C-11；CH2)，60.998(4’-OCH3；CH3)，56.433(3’，5’-OCH3；CH3)，50.713(C-4)，43.924(C-1；CH)，42.783(C-2，CH)，37.309(C-3；CH)。

实施例3 4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素(化合物(3))的合成和纯化

(1)4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素的合成：取400mg(1mmol)的鬼臼毒素，101mg(1mmol)的三氮唑，真空干燥1h，在冰浴条件下以15ml三氟乙酸为溶剂，在-4℃下真空搅拌(800转/分钟)3h，以氯仿丙酮为展开剂，检测反应终点。减压浓缩至近干，溶于乙酸乙酯中，并用10ml去离子水洗涤三次，收集乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥，浓缩即得粗产物。

(2)分离和纯化4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素：

使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化：

(A)用正相硅胶柱(正相硅胶：中国青岛海洋化工有限公司，HG/T2354-92；分离系统：瑞士步琪等度快速色谱系统：色谱柱：瑞士步琪玻璃柱C-690，长460毫米，内径15毫米)或者相似极性柱分离；氯仿∶丙酮10∶1系统作为洗脱液，上样量2毫升，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿∶丙酮(2∶1)系统作为展开剂，将Rf值0.6的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。

(B)用凝胶柱层析(凝胶：Sephadex LH-20；分离柱：玻璃柱，长480毫米，内径30毫米)分离；将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以甲醇平衡。将待纯化样品以溶于6毫升甲醇中，以0.6毫升/分钟的流速上样吸附，然后用600毫升甲醇以0.6毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿∶丙酮(2∶1)系统作为展开剂，将Rf值0.6的馏分进行合并；真空干燥后所得的白色粉末状样品为4-S-(1，2，4-三氮唑-3-)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素。

4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素：白色晶体；C23H21O7N3S1；483，1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ9.072(s，1H)，δ6.970(s，1H)，6.500(s，1H)，6.315(s，2H)，5.994(d，2H，J＝4.2Hz)，5.805(d，1H，J＝1.8Hz)，5.439(s，1H)，4.691(d，1H)，4.618(d，1H)，4.522(t，1H)，3.896(t，1H)，3.796(s，6H)，3.379(t，1H)，3.190(dd，1H)；13C-NMR(300MHz，CDCl3)：δ174.106(C-12；C)，164.897(C-1”；C)，151.789(C-2”；C)，148.681(C-7；C)，147.588(C-6；C)，146.538(C-3’，C-5’；C)，134.258(C-4’；C)，133.087(C-9；C)，130.536(C-1’；C)，126.657(C-10，C)，110.091(C-5，C-8；CH)，107.927(C-2’，C-6’；CH)，101.733(-OCH2O)，70.665(C-11；CH2)，56.492(3’，5’-OCH3；CH3)，50.584(C-4)，43.591(C-1；CH)，42.712(C-2，CH)，37.061(C-3；CH)。

实施例4 4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素(化合物(4))的合成和纯化

(1)4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素的合成：取400mg(1mmol)的鬼臼毒素，118mg(1mmol)的三氮唑，真空干燥1h，在冰浴条件下以15ml三氟乙酸为溶剂，在4℃下真空搅拌(100转/分钟)1h，以氯仿丙酮为展开剂，检测反应终点。减压浓缩至近干，溶于乙酸乙酯中，并用10ml去离子水洗涤三次，收集乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥，浓缩即得粗产物。

(2)分离和纯化4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素：

使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化：

(A)用正相硅胶柱(正相硅胶：中国青岛海洋化工有限公司，HG/T2354-92；分离系统：瑞士步琪等度快速色谱系统：色谱柱：瑞士步琪玻璃柱C-690，长460毫米，内径15毫米)或者相似极性柱分离；氯仿∶丙酮40∶1系统作为洗脱液，上样量2毫升，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿∶丙酮(10∶1)系统作为展开剂，将Rf值0.6的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。

(B)用凝胶柱层析(凝胶：Sephadex LH-20；分离柱：玻璃柱，长480毫米，内径30毫米)分离；将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以甲醇平衡。将待纯化样品以溶于6毫升甲醇中，以0.6毫升/分钟的流速上样吸附，然后用600毫升甲醇以0.6毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿∶丙酮(10∶1)系统作为展开剂，将Rf值0.6的馏分进行合并；真空干燥后所得的白色粉末状样品为4-S-(1，3，4-噻二唑-2-)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素。

4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素：白色针状晶体；C23H21O7N2S2；501，1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.196(s，1H)，δ6.989(s，1H)，6.446(s，1H)，6.319(s，2H)，5.950(d，2H，J＝8.1Hz)，5.367(s，1H)，4.571(s，1H)，4.294(d，1H)，3.976(t，1H，)，3.758(d，6H)，3.267(s，2H)；13C-NMR(300MHz，CDCl3)：δ174.556(C-12；C)，158.418(C-1”；C)，148.324(C-7；C)，147.417(C-6；C)，146.452(C-3’，C-5’；C)，134.130(C-4’；C)，132.544(C-9；C)，130.958(C-1’；C)，127.700(C-10，C)，110.191(C-5；CH)，109.920(C-8；CH)，108.019(C-2’，C-6’；CH)，101.590(-OCH2O)，70.494(C-11；CH2)，56.492(3’，5’-OCH3；CH3)，48.677(C-4)，43.591(C-1；CH)，42.384(C-2，CH)，37.211C-3；CH)。

试验例1本发明化合物抑制肿瘤细胞的活性以及对正常细胞的毒副作用试验

一、试验材料

1、供试化合物：实施例1-4所制备的化合物，分别编号为化合物(1)、化合物(2)、化合物(3)和化合物(4)；

2、对照化合物：鬼臼毒素和4′-去甲表鬼臼毒素购自西安和霖生物工程有限公司，纯度98％；依托泊苷，替尼泊苷；

3、细胞株：BGC823株、A549株、HepG2株和HK-2细胞株购自上海安普生物科技有限公司；

二、试验方法

将对数生长期的BGC823、A549、HepG2、HK-2细胞，1，000rpm离心5分钟，弃上清，适量培养基悬浮，调整细胞浓度至3.5×10³/孔。将细胞接种于96孔培养板中，分成阴性对照组和8个同浓度同序列的试验组，即：化合物(1)组，化合物(2)组，化合物(3)组，化合物(4)组，鬼臼毒素组，4′-去甲表鬼臼毒素组，依托泊苷组和替尼泊苷组；每孔0.10mL，用含有10％小牛血清的RPMI1640作为培养液，37℃、5％CO₂及饱和湿度下培养24h接近长满时，弃去培养液，分别加入化合物(1)、化合物(2)、化合物(3)、化合物(4)、鬼臼毒素、4′-去甲表鬼臼毒素、依托泊苷组、替尼泊苷10％小牛血清的RPMI164培养液0.15mL，阴性对照组加入终浓度为0.5％DMSO；各组均设3个复孔，继续培养48h，每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，37C放置4h。每孔加入200μlDMSO，37C摇床振荡30min，492nm/620nm测吸光度(OD)，计算MTT比值＝药物组OD值/阴性对照组OD值。

三、试验结果

试验结果见表1。由表1可知，除化合物(2)在A549细胞株上不溶解，化合物(4)在BGC823细胞株上不溶解外，四个硫取代鬼臼类衍生物均对BGC823、A549、HepG2细胞株具有明显的生长抑制作用，相比鬼臼毒素和4′-去甲基表鬼臼毒素呈显著提高，同时与目前已做为抗肿瘤药物上市的鬼臼类衍生物依托泊苷和替尼泊苷抗肿瘤活性均有所提高。毒副作用实验表明，除化合物(4)外，其余三个化合物的毒副作用均有大幅度降低，具有较好的成药性。

表1硫取代鬼臼类衍生物对体外肿瘤株以及对正常细胞株的EC50值

Claims

1.式(Ⅴ)所示的化合物或其盐：

其中，R₁选自R₂选自CH₃。

2.按照权利要求1所述的化合物或其盐，其特征在于：所述的盐包括盐酸盐或磷酸盐。

3.一种合成权利要求1所述式(Ⅴ)化合物的方法，包括：通过硫取代反应，将2-巯基-1,3,4-噻二唑引入到鬼臼毒素的C环4位，即得。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的硫取代反应包括：将鬼臼毒素溶于三氟乙酸中，加入2-巯基-1,3,4-噻二唑，搅拌进行反应，即得。

5.按照权利要求3或4所述的方法，其特征在于：鬼臼毒素与2-巯基-1,3,4-噻二唑的摩尔比例为1：1。

6.按照权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述的搅拌为转速为50-800转/分钟真空搅拌，所述的反应温度为-20-20℃，所述的反应时间为1-6小时。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的搅拌转速为600转/分钟，所述的反应温度为-10-10℃，所述的反应时间为1小时。

8.按照权利要求3或4所述的方法，其特征在于，还包括：

(1)将反应所得产物旋转蒸发浓缩，用乙酸乙酯溶剂复溶，并用超纯水反复洗涤，收集乙酸乙酯层，真空干燥，得到待分离纯化样品；

(2)将待分离纯化样品依次使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离，即得。

9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述的硅胶柱层析的分离方法包括：(1)硅胶柱层析为正相硅胶柱层析或反相硅胶柱层析，正相硅胶以低极性有机溶剂拌匀后装柱，以洗脱剂平衡；反相硅胶以甲醇拌匀后装柱，以洗脱剂平衡；(2)将待分离纯化的样品以洗脱液溶解，进行上样吸附，然后进行梯度洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；

所述的凝胶柱层析分离方法包括：(1)以石油醚：氯仿：甲醇＝5:5:1为洗脱剂，凝胶以洗脱剂浸泡，装柱，以洗脱剂平衡；(2)将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于以上洗脱剂中，进行上样吸附，洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶。

10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于：当为正相硅胶柱层时，所述的洗脱剂是由体积比为40：1的氯仿和丙酮组成。

11.按照权利要求9所述的方法，其特征在于：当为反相硅胶柱层时，所述的洗脱剂是由体积比为60：1的甲醇和水组成。

12.权利要求1所述化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

13.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于：包括有效量的权利要求1或2所述的化合物或其盐和药学上可接受的载体。