CN103304528B - 红茴香内酯f、其提取方法及其在药物制备中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种如下式（I）的化合物红茴香内酯F、其制备方法及其在药物制备中的用途，属药物技术领域。该化合物具有明确的体外抗乙型肝炎活性，效果显著，高效低毒，为开发用于乙型肝炎的治疗和预防药物提供了新的药物途径，而且扩大了临床用药的可选择范围。

Description

红茴香内酯F、其提取方法及其在药物制备中的用途

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体地说，本发明涉及化合物Henrylactone F，其制备方法及其在制备抗乙型肝炎药物或制备辅助抗乙型肝炎药物中的用途。

背景技术

红茴香 (Illicium henryi Diels.) 为八角科 (Illiciaceae) 八角属 (Illicium) 植物，主要分布于我国云南、四川、贵州等地。民间根皮入药，具有散淤痛，祛风除湿的功效，其果实常被当作八角误食引起中毒，其化学成分主要包括倍半萜和黄酮等成分。

前期的活性筛选发现红茴香果实的乙醇（90%）提取物具有抑制乙肝病毒表面抗原 (HBsAg) 和e抗原 (HBeAg) 分泌的活性，IC₅₀为2.96 mg/mL，1.96 mg/mL。治疗指数TI分别为2.2，1.9。为寻找活性成分，对红茴香果实的化学成分进行了研究，并对所分离得到的化合物进行抗HBV活性筛选。结果发现一个新奇的降倍半萜内酯类化合物红茴香内酯F (Henrylactone F)。目前未见关于Henrylactone F的结构，其制备方法及其在制备抗乙型肝炎药物或制备辅助抗乙型肝炎药物中的用途方面的报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种具有抗HBV活性的新的化合物红茴香内酯F；另一目的在于提供其提取方法；又一目的在于提供其在制备抗乙型肝炎药物或制备辅助抗乙型肝炎药物中的用途。

为实现本发明目的，所述红茴香内酯F（Henrylactone F）结构式如下所示：

（I）。

其制备方法通过如下步骤实现：

（1）红茴香（Illicium henryi Diels.）果实, 用醇类溶剂回流提取，减压浓缩得到提取物；

（2）加水悬浮后，用氯仿萃取，减压浓缩得到氯仿萃取部分；

（3）    氯仿部分经硅胶柱层析, 以氯仿/甲醇梯度洗脱，经TLC分析合并相同流分后得10个流分；

（4）    将步骤(3)所得的第4个流分经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，TLC分析合并相同流分后得到3个流分；

（5）将步骤(4)所得的第三个流分以氯仿/丙酮做洗脱剂经硅胶柱层析分离，TLC分析合并相同流分得到3个流分；

（6）将步骤(5)所得的第3个流分以甲醇为洗脱剂，SephadexLH-20进行纯化得到式（I）所示的化合物（Henrylactone F）。

式（I）所示的化合物（Henrylactone F）的制备方法优选如下步骤：

（1）取红茴香果实用质量百分比90%乙醇回流提取3次，每次25 L，每次2小时，减压浓缩得到乙醇提取物；

（2）加水悬浮后，分别用2 L×3氯仿和2 L×3正丁醇萃取，减压浓缩得到氯仿萃取部分；

（3）氯仿部分用氯仿/甲醇溶解吸附于等量硅胶，在室温下挥干后经硅胶柱层析, 以氯仿/甲醇体积比100：0，95：5，90：10，80：20，70：30梯度洗脱，经硅胶TLC分析合并相同流分后得到10个流分；

（4）将步骤(3)所得的第4流分经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯体积比 80：20，70：30，60：40，50：50)梯度洗脱，得到3个流分；

（5）将步骤(4)所得的第三个流分以氯仿/丙酮体积比8：2做洗脱剂，经硅胶柱层析，TLC分析合并相同流分得到3个流分；

（6）将步骤(5)所得的第3个流分以甲醇为洗脱剂，以SephadexLH-20反复进行纯化，得到式（I）所示的化合物。

以式（I）所示化合物Henrylactone F为有效药用成份，或与其它药物组合，按目前各种常规的制药方法和工艺要求，与制药中可以接受的辅助和/或添加成份混合后，制成抗乙型肝炎药物或辅助抗乙型肝炎的口服型制剂、注射型制剂等药物药物。口服型制剂为片剂、丸剂、胶囊、冲剂或糖浆等；注射型制剂包括注射液或冻干粉针剂型等。

  本发明优点及创新点：通过活性筛选，确定上述化合物具有明确的体外抗乙型肝炎活性，效果显著，高效低毒，为开发用于乙型肝炎的治疗和预防药物提供了新的药物途径，而且扩大了临床用药的可选择范围。

 具体实施方式

为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。

实施例1：化合物Henrylactone F的制备

实验仪器与材料

旋光由JASCODIP-370旋光仪测定；红外光谱(IR)采用KBr压片法，由Bio-Rad FTS-135型红外光谱仪；核磁共振谱 (¹H-、¹³C-NMR、DEPT) 用Brucker AM-400型超导核磁共振仪测定、TMS（四甲基硅烷）作内标；质谱(MS)用VGAutospec-3000型质谱仪测定；薄层色谱硅胶、柱层析硅胶（200-300 mesh）购自青岛美高集团有限公司。

阴干，粉碎的红茴香果实5.0 kg, 用90%乙醇回流提取3次，每次25 L，每次2小时。减压浓缩得到乙醇提取物。加水悬浮后，分别用氯仿 (2L×3) 和正丁醇 (2L×3) 萃取，减压浓缩得到氯仿萃取部分 (100 g) 和正丁醇萃取部分 (150 g)。

氯仿部分 (100 g) 用氯仿/甲醇溶解吸附于等量硅胶，在室温下挥干后经硅胶柱 (9.5×40 cm, 1.0 kg) 层析, 以氯仿/甲醇体积比100：0，95：5，90：10，80：20，70：30)梯度洗脱，经硅胶TLC分析合并相同流分后得到10个流分 (Fr.1– Fr.10)。

流分4 (4.5 g) 经硅胶柱层析 (3×34 cm，100 g)，以石油醚/乙酸乙酯体积比80：20，70：30，60：40，50：50梯度洗脱，得到流分4-1 (1.0 g)，4-2 (0.5 g)和4-3 (0.5 g)。4-3（0.5 g）以氯仿/丙酮体积比 8：2做洗脱剂经硅胶柱 (1.0×40 cm, 20 g) 层析得到流分4-3-1 (0.1 g)，4-3-2 (0.1 g)，4-3-3 (0.2 g)；以甲醇为洗脱剂，以SephadexLH-20反复对4-3-3 (0.2 g) 进行纯化得到化合物（Henrylactone F）。

Henrylactone F：无色针状晶体 (MeOH)；mp 133–135℃；[α]^21.1 _D –75.3 (c 0.107，MeOH)；IR (KBr) v_max 3491，3381，2979，1756，1737，1377，1209，1043 cm^-1；HR-ESI-MS (positive ion) m/z 269.1383 (计算值 C₁₄H₂₁O₅ [M + H]⁺， 269.1389)。

¹H-NMR (400 MHz，CD₃OD) : 3.80 (2H，m，H-13)，2.98 (1H，d，J = 18.0 Hz, H-10a)，2.76 (1H，q，J = 6.7 Hz，H-6)，2.60 (1H，d，J = 18.0 Hz，H-10a)，2.46 (1H，m，H-3a)，2.25 (1H，m，H-2a)，2.11 (1H，m，H-3b)，2.09 (1H，m，H-2b)，1.28 (3H，s，H-14)，0.95 (3H，d，J = 6.7 Hz，H-6，H-8)，0.81 (3H，s，H-12); ¹³C-NMR (100 MHz，CD₃OD)，: 93.7 (s，C-1)，39.8 (t，C-2)，34.5 (t，C-3)，87.6 (s，C-4)，46.2 (s，C-5)，49.0 (d，C-6)，215.3 (s，C-7)，7.6 (q，C-8)，64.8 (s，C-9)，34.1 (t，C-10)，174.2 (s，C-11)，13.9 (q，C-12)，66.2 (t，C-13)，21.7 (q，C-14)。

实施例2：生物活性测试

1材料和方法

1.1化合物的制备

各供试所测样品溶解于DMSO (二甲基亚砜) 中，用培养基配置成母液浓度，保存于4℃冰箱中，用于抗HBV活性检测。拉米夫定（3TC）作为实验的药物对照。

1.2 所用试剂

         高糖DMEM完全培养基：含10 %胎牛血清，10 mM HEPES (4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素，0.03％氨酰胺，100 μg/mLG418，NaHCO₃调pH 7.0左右。HBsAg, HBeAg检测试剂盒；MTT (3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)。高糖DMEM及G418为Gibco公司产品；青霉素钠，硫酸链霉素购自石药集团中诺药业（石家庄）有限公司，MTT, 谷氨酰胺, HEPES为Amresco公司产品。胎牛血清购自天津血液研究所；乙肝两抗检测试剂盒购自安图生物工程公司。拉米夫定购自葛兰素史克公司 (Glaxo SmithKline, 中国苏州)。

1.3仪器

Thermo3110型CO₂培养箱（Thermo Electron Corporation, U.S.）；Bio-Rad 680型酶标仪 (美国)；XD-101型倒置生物显微镜（南京江南光电集团股份有限公司）；SW - CJ 系列医用型洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；全自动立式压力蒸汽灭菌器YXQ-LS-30SII（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；电热鼓风干燥箱DHG-101型（河南巩义市英峪予华仪器厂）。

1.4细胞

将含有HBV基因组的质粒稳定转染的肝癌细胞株获得的HepG 2.2.15细胞按常规方法复苏培养：从液氮中取出细胞，37 °C水浴快速复苏细胞，离心重悬于完全培养基，于37 °C，5 %CO₂培养，细胞每周传代一次，保证细胞处于对数生长期。

2实验方法

2.1药物配置

待测样品用DMSO溶解，用培养液四倍稀释成不同浓度梯度；对照药物拉米夫定用水溶解之后，用培养液稀释到4.7 mg/mL；并分别用50 g/L NaHCO₃ 或用1 mol/L HCL调整PH值为7.0，然后过滤除菌备用，使用时按不同浓度梯度稀释。

2.2 HepG 2.2.15细胞的复苏、培养、冻存

细胞的复苏：从液氮灌中取出冻存管，快速放入42℃水浴中不断摇动使其融化，将融化了的细胞悬液放入离心机中，1000 rpm离心5min，弃去上清液，加入新鲜培养液使细胞悬浮后转入培养瓶内，第二天更换培养液。

2.3 毒性试验

         MTT法测定各待测样品对HepG 2.2.15细胞的毒性。收集对数期细胞，细胞计数板计数，调整细胞悬液浓度，配成1×10⁵个/ml，96孔细胞培养板中每孔加入100 μl，每个浓度设三个复孔，细胞培养箱中（5 % CO₂，37℃）孵育24 h，细胞长成单层铺满孔底，加入含有不同待测样品浓度的培养基，并设调零孔，对照孔。连续培养72 h后，每孔加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml，即终浓度为0.5 % MTT），继续培养4 h后，小心吸去孔内培养液，每孔加入DMSO 200 μl，置摇床上低速避光振荡10 min，使结晶物充分溶解，酶标仪（检测波长490 nm，参考波长630 nm）测定，并读取各孔OD值，按下面的公式计算各药物对HepG 2.2.15细胞的抑制率：

细胞抑制率（%）=×100%

根据各待测样品对细胞抑制率，用Excel软件按待测样品对HepG 2.2.15细胞抑制率对待测样品浓度作图，拟合出量效关系曲线，求出半数毒性浓度TC₅₀，即抑制细胞生长达50 %时药物浓度。

2.4药物对细胞分泌HBsAg，HBeAg的抑制作用

ELISA法测定各待测样品对细胞上清液中HBsAg和HBeAg的影响，选择小于无毒性浓度的一系列浓度作为筛选浓度，将HepG 2.2.15细胞按2.5 × 10⁴个/ml密度接种于96孔培养板中，每孔200 μl ，24 h后待细胞贴于孔底，弃去上清，加入含有不同浓度待测样品的培养液，每个浓度设3个复孔，并设加完全培养基的细胞做为正常对照，5 % CO₂ 37℃下培养，根据需要换液，收集第6天细胞上清液，保存于–20℃。按照ELISA方法检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg含量，按下列公式计算各待测样品对抗原分泌的抑制率：

抗原分泌抑制率（%）=×100%

IC₅₀即半数抑制浓度，表示抗原分泌受到抑制达50 %时的待测样品浓度。根据抗原分泌抑制率，用Excel软件按待测样品对HepG 2.2.15细胞抗原抑制率对待测样品浓度作图，拟合出量效关系曲线，求出半数抑制浓度IC₅₀。

2.5. 判断药物的抗HBV效果

根据治疗指数TI = TC₅₀/ IC₅₀，按以下标准评价药物的抗HBV效果，TI < 1.0表明药物有毒无效，1.0 ≤ TI ≤ 2.0表明药物低效有毒即弱阳性，2.0 < TI < 10.0表明药物有效低毒即阳性，TI ≥ 10.0表明药物高效低毒即强阳性。

统计学方法实验数据用SPSS 13.0统计软件处理，结果以表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，a = 0.05为显著性检验水准。

表1 化合物Henrylactone F的生物活性

活性测试结果表明，筛选的化合物Henrylactone F对HBsAg和HBeAg均显示出较强的抑制活性，而且毒性较低，因此，化合物Henrylactone F具有用于制备抗乙型肝炎药物的用途。

实施例3：注射液

实施例1制备的化合物Henrylactone F用少量的DMSO溶解后，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例4：片剂

含实施例1制备的化合物Henrylactone F与赋形剂按照重量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片，得片剂。

实施例5：胶囊

实施例1制备的化合物Henrylactone F与赋形剂按照重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。

本发明的用途和方法已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发明的内容适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。

Claims (6)

1.红茴香内酯F，其特征在于，具有如下式（I）所示的结构：

（I）。

2.提取如权利要求1所述的红茴香内酯F的方法，其特征在于，通过如下步骤实现：

（1）取红茴香果实, 用醇类溶剂回流提取，减压浓缩得到提取物；

（2）加水悬浮后，用氯仿萃取，减压浓缩得到氯仿萃取部分；

（3）氯仿部分经硅胶柱层析, 以氯仿/甲醇梯度洗脱， 经TLC分析合并相同流分后得10个流分；

（4）将步骤(3)所得的第4个流分经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，TLC分析合并相同流分后得到3个流分；

（5）将步骤(4)所得的第三个流分以氯仿/丙酮做洗脱剂经硅胶柱层析分离，TLC分析合并相同流分得到3个流分；

（6）将步骤(5)所得的第3个流分以甲醇为洗脱剂，SephadexLH-20进行纯化得到式（I）所示的化合物。

3.根据权利要求2所述的提取红茴香内酯F的方法，其特征在于，优选如下步骤：

（1）取红茴香果实用质量百分比90%乙醇回流提取3次，每次25 L，每次2小时，减压浓缩得到乙醇提取物；

（2）加水悬浮后，分别用2 L×3氯仿和2 L×3正丁醇萃取，减压浓缩得到氯仿萃取部分；

（3）氯仿部分用氯仿/甲醇溶解吸附于等量硅胶，在室温下挥干后经硅胶柱层析, 以氯仿/甲醇体积比100：0，95：5，90：10，80：20，70：30梯度洗脱，经硅胶TLC分析合并相同流分后得到10个流分；

（4）将步骤(3)所得的第4流分经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯体积比 80：20，70：30，60：40，50：50梯度洗脱，得到3个流分；

（5）将步骤(4)所得的第三个流分以氯仿/丙酮体积比8：2做洗脱剂，经硅胶柱层析，TLC分析合并相同流分得到3个流分；

（6）将步骤(5)所得的第3个流分以甲醇为洗脱剂，以SephadexLH-20反复进行纯化，得到式（I）所示的化合物。

4.如权利要求1所述的红茴香内酯F在制备药物中的用途，其特征在于，将其用于制备抗乙型肝炎药物或制备辅助抗乙型肝炎药物中。

5.如权利要求4所述的红茴香内酯F在制备药物中的用途，其特征在于，将其作为活性成份或与其它药物组合，与制药中可以接受的辅助和/或添加成份混合后，按常规的制药方法和工艺要求，制成抗乙型肝炎或辅助抗乙型肝炎药物的口服型制剂、注射型制剂。

6.如权利要求5所述的红茴香内酯F在制备药物中的用途，其特征在于，口服型制剂为片剂、丸剂、胶囊、冲剂或糖浆；注射型制剂为注射液或冻干粉针剂型。