CN101293889B - 水溶性青蒿素衍生物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水溶性青蒿素衍生物及其制备方法，有以下步骤：(1)制备二氢青蒿素；(2)全乙酰吡喃溴代甘露糖的制备；(3)水溶性青蒿素衍生物的制备。本发明对水溶性青蒿素衍生物进行了结构鉴定和水溶性的分析，证明其具有良好的水溶性，易于制剂，具有成药前景。本发明操作简单，反应条件温和，不需要额外的脱保护步骤。经初步细胞实验证明，对正常细胞无毒副作用。

Description

水溶性青蒿素衍生物及其制备方法

技术领域

本发明属于化学制药工程领域，具体涉及一种水溶性青蒿素衍生物及其制备与应用。

背景技术

青蒿素(artemisinin)是1971年我国科学工作者从菊科植物黄花蒿Artemisia annua L.中提取的新型抗疟药，具有高效、速效、低毒的特点，是中国唯一被世界卫生组织认可的按西药研究标准研究开发的植物药，也是第一个真正得到全球公认的中药产品。但由于青蒿素的溶解性差、复燃率高等缺点，限制了其临床应用。药物化学工作者开始对青蒿素进行了大量的结构修饰、构效关系的研究，并筛选出一些疗效更优良的药物，而真正用于临床的主要有青蒿琥酯、青蒿甲醚、二氢青蒿素等。

青蒿素是一种新型倍半萜内酯，具有过氧键和内酯环，有一个包括过氧桥在内的1，2，4-三恶烷结构单元，在自然界中是非常罕见的，它的分子中包括7个手性中心。纯净青蒿素为无色针状结晶，熔点为156-157℃，易溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯和苯，可溶于乙醇、乙醚，微溶于冷石油醚，在油中的溶解度很小，几乎不溶于水。薄层层析为单一色斑。因其具有特殊的过氧基团，对热不稳定，易受湿、热和还原性物质的影响而分解。

因此研究工作者在构效关系的指导下，结合实验结果，在保留过氧桥这个活性中心的前提下，主要对青蒿素的12位碳原子进行不同类别反应的修饰，将亲脂性、亲水性基团引入青蒿素结构中，以增加其油溶性、水溶性；或者将具有生理活性的大分子，如甾体等引入青蒿素结构中，以增强其稳定性等等。上个世纪七、八十年代，我国的科研工作者，尤其是5.23协作组的成员(1967年5月23日，毛泽东下令在全国范围内开展青蒿素抗疟疾的研究工作，国务院专 门成立“5.23”办公室，所有参与此研究工作的人员属于5.23协作组)，对青蒿素的合成及其结构修饰做了大量的工作。后来这个课题也引起了国外研究工作者的关注，截止目前已经有成百上千种的青蒿素衍生物合成，但是成功应用于临床的并不多。

虽然有几个青蒿素的衍生物已经应用于临床，被认为是低毒安全的药物。但在动物实验中，发现大剂量长期使用青蒿素及其衍生物时，可出现两方面的毒理作用：损害中枢神经系统、引起心电图的变化。而且这些药物复燃率仍然高，半衰期短、口服生物利用度低。青蒿琥酯在水中不稳定，必须用前溶解于碳酸氢钠制成钠盐，使用不方便。因此对青蒿素的结构改造工作仍有待进一步研究，以寻找溶解性更好、毒理作用更小的衍生物，将对青蒿素的临床应用和综合利用有着重要的意义。

众所周知，糖本身具有良好的溶解性能以及药理功能，近年来在药物的修饰中成为研究的热点领域。人们可以利用糖毒性小、结构新颖多样、靶向性好等特点对一些具有生物活性的基团或先导化合物进行结构修饰，希望通过相互的协同作用提高药物疗效、降低毒副作用、提高亲合性、增加生物利用度，以寻找和开发新药。

以糖及其衍生物为基团对有生物活性的物质进行化学修饰的研究始于上世纪80年代。如将一些水不溶解物质经与糖结合转变成糖苷，水溶解性增高，糖苷的这种性质对除去动物体内许多具有毒性的苯酚化合物很重要，这些苯酚化合物转变成糖苷后，能被水溶解，并与尿一并排出体外。许多糖苷药品就是利用这个性质，增强溶解性，降低毒性。

发明内容

本发明的目的，是提供一种水溶性青蒿素衍生物及其制备方法。本发明用糖对青蒿素进行修饰，得到的水溶性青蒿素衍生物可以提高青蒿素的衍生物水溶性和降低毒副作用，并且易于制剂，具有成药前景。本发明操作简单，反应条件温和，不需要额外的脱保护步骤。经初步细胞实验证明，对正常细胞无毒 副作用。

本发明水溶性青蒿素衍生物具有下列通式：

其中R＝CH₃。所述水溶性青蒿素衍生物的化学名称为(3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八氢-3，6，9-三甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-1，2-苯并二塞平-10-O-甘露糖基(D-甘露糖-青蒿素)，分子式C₂₁H₃₄O₁₀，分子量为446.51。

本发明对糖基进行保护(制备全乙酰吡喃溴代甘露糖)，完成了对青蒿素的羰基的还原，制备了二氢青蒿素，再与全乙酰吡喃溴代甘露糖发生醚合成反应，得到水溶性青蒿素衍生物，其总收率为20.5％。

本发明的水溶性青蒿素衍生物制备方法包括两个主体部分，一部分为通过糖基的全乙酰保护使其带一个-Br，另一部分是将上述还原产物二氢青蒿素与单糖在相转移催化剂催化下醚化得到新的糖基化青蒿素产物。

本发明还对水溶性青蒿素衍生物进行了结构鉴定和水溶性的分析，证明其具有良好的水溶性。

本发明采用化学方法对青蒿素进行糖基化修饰。在利用化学方法对药物进行糖基修饰过程中，控制反应的区域选择性和立体选择性是两个基本而关键的问题。而保护和去保护是提高区域选择性和立体选择性的重要方法。在糖苷的合成中，为了将糖环上定位地引入形成糖苷键，首先必须对糖环的各个羟基用不同性质的保护基团进行保护，然后再逐次选择性地脱去保护基团并分别先后 定位地引入糖基。

选择合适的糖基保护方法：最为有效的糖基方法主要有乙酰基保护和糖与丙酮在催化剂(如高氯酸、硫酸、盐酸、对甲苯磺酸和氯化锌等)作用下即可得到异丙叉缩酮。本发明采用了乙酰基保护法，并且通过红外图谱初步检测发现在水解作用下，保护基团即可水解掉，不需要额外的脱保护步骤，操作简便，其具体操作如下：

乙酰基保护法：取2.00克的D-葡萄糖加入到装有10mL醋酸酐的悬浮液的三颈瓶中，加入135mg碘，室温磁力搅拌反应至反应体系呈棕色透明(表明全乙酰化反应完成约5～30min)，然后将反应混合物用50mL干燥的二氯甲烷稀释，冰浴冷却下加入40％溴化氢的冰醋酸溶液14mL。加毕室温搅拌反应至TCL检测反应完毕(约需1～6h)。反应混合物用150mL二氯甲烷稀释，依次用冰水(60mL×2)、饱和碳酸氢钠溶液(50mL×2)、稀硫代硫酸钠溶液(0.4mol/L，50mL×2)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸馏浓缩得白色固体。用乙醚溶解后，向其中加入石油醚重结晶得白色针状晶体。

在糖基保护之后，将糖如何引入到青蒿素分子中也是合成的一个关键步骤。乙酰糖与青蒿素反应是在碱催化下的水-有机两相反应，其中最为重要是相转移催化剂的选择，本文以乙酰葡萄糖为例考察了不同的相转移催化剂，结果如下表：

相转移催化剂对反应的影响

-：无目标产物生成；+：少量目标产物生成；++：大量目标产物生成

不同的相转移催化剂催化反应经TLC分析生成目标产物的量存在较大差异。其中四丁基硫酸氢铵为相转移催化剂效果最为理想，因此选用四丁基硫酸氢铵作相转移催化剂催化乙酰糖与二氢青蒿素的醚化反应。

本发明通过对青蒿素糖基化产物结构的鉴定，以确认糖基确实引入到青蒿素分子，并且通过糖基修饰青蒿素可以提高其母体的水溶性。

本发明所述的水溶性青蒿素衍生物可以与药物载体一起组成药物制剂进行使用，经检测本发明所述青蒿素衍生物的水溶性，结果表明，所述青蒿素衍生物具有良好的水溶性。对正常细胞的生长抑制作用很小，毒副作用很小，可以用于制备治疗宫颈癌、肝癌、乳腺癌和治疗人体免疫功能亢进引起的疾病的药物。

本发明的优点是：

一方面，青蒿素与糖同样有着突出的生物活性，都在生命过程中扮演非常重要的角色，在有些方面表现出相似或相近的性质，如糖及其衍生物能与细胞膜表面上的糖蛋白或糖脂类受体分子结合，而青蒿素则与位于细胞核上的青蒿素受体结合；二者同在抗肿瘤、抗菌方面有良好的效果等。可以预期，青蒿素与糖的结合能很好的发挥二者的协同作用。

第二方面，青蒿素与糖在其他性质方面也可以有效互补，如糖有良好的水溶性，而青蒿素水溶性差，二者的结合可以赋予青蒿素或糖及其衍生物以新的物理和化学特性，从而改变分子极性、溶解性及吸收代谢以提高药物分子的活性，降低毒副作用等。青蒿素也可激活糖的生物活性，增强糖的生物和药用价值。

第三方面，在细胞表面的大量受体分子几乎都是糖蛋白或糖脂类，因而青蒿素与糖的结合必然具有很强的靶向性，可以选择性的靶向给药，解决青蒿素药物治疗选择性差的棘手问题，减少对身体其他组织的损伤，增加药物的生物利用度，提高疗效，减低毒副作用，还可缓慢释放药物作用基团，起到控制或缓释作用。

本发明所述水溶性青蒿素衍生物的合成，合成思路新颖，产物结构特殊，为青蒿素衍生物的合成以及其他活性药物的糖基化修饰提供了新的思路。

附图说明

图1为青蒿素还原的示意图Artemisinin reduction reaction；

图2为水溶性青蒿素衍生物的合成示意图Synthetic route of D-mannose-artemisinin。

具体实施方式

材料：

D-甘露糖购于国药集团化学试剂，化学纯

NaBH₄及无水甲醇、乙酸乙酯购于国药集团化学试剂厂，均为化学纯

青蒿素标准品购于中国药品生物制品检定所

醋酸酐、碘、二氯甲烷(≥99.0％)、四丁基硫酸氢铵购于国药集团化学试剂厂，均为化学纯

溴化氢冰醋酸溶液(40％，工业级)，购自潍坊汇博进出口有限公司

201D-II型旋转蒸发仪                  郑州长城科工贸有限公司

2XZ-1型旋片式真空泵                  浙江黄岩求精真空泵厂

X-4数字显微熔点测定仪                北京福凯仪器有限公司

2F-2型三用紫外线分析仪               上海安亭电子仪器厂

SHB-III A循环水式多用真空泵          郑州长城科工贸有限公司

DF-101T型集热式恒温加热磁力搅拌器    江苏金坛市虹盛实验仪器厂

注：H¹NMR由Varian INOVA-400型核磁共振仪测定(CDCl₃作溶剂，TMS作内标，化学位移δ以ppm为单位)；MS由Finnigan-MAT 4510型质谱仪测定(EI)；IR由美国热电Varon傅立叶红外光谱仪测定(KBr压片法)

IMDM培养基                            美国Gibco公司

无水乙醇                              成都华西生物制品厂，分析纯

台盼蓝                                上海化学试剂厂，分析纯

胰酶                            Sigma公司产品

蛋白酶K                         Sigma公司产品

新生小牛血清                    Sigma公司产品

小鼠成纤维(3T3)细胞，猴肾(vero)细胞均购自众磊(北京)生物科技发展有限公司驻沪办。

净化工作台                     蚌埠产水平式双人超净工作台

水平式离心机                   北京医用离心机厂(LD4-2A)

AEL-40SM电子天平               日本岛津

CO₂培养箱                      日本平泽公司生产CPD-172型

Whatman 3mm滤纸                USA

倒置相差显微镜                 日本Olymmpus

4℃冷室                        日本SANYO(MLC)

-80℃冰箱                      日本SANYO

自动纯净水蒸馏器               上海亚容生化仪器厂

Hamilton微量注射器             辽宁中山医疗器械厂

96孔培养板                     Denmark

25cm²培养瓶                    Denmark

75cm²培养瓶                    Denmark

各种国产玻璃器材：如吸管、试管、离心管、培养瓶、培养皿、配液瓶等等，均需经过高温灭菌处理。

实施例1：青蒿素的还原

在25mL三颈瓶中加入2.81g(0.01mol)青蒿素、0.454g(0.012mol)NaBH₄及10mL无水甲醇室温下搅拌24h。滤液减压蒸馏回收甲醇。残液用250mL水溶解，然后用50mL乙酸乙酯萃取三次，有机层用少量水洗涤，水洗液及水层合并。再用乙酸乙酯萃取，合并有机层。蒸去溶剂，干燥得产品-二氢青蒿素(见图1)；

实施例2.全乙酰吡喃溴代甘露糖的制备

 取2.00克D-甘露糖加入到装有10mL醋酸酐的悬浮液的三颈瓶中(其中醋酸酐保护糖分子上的羟基，使其变成稳定的酯)，加入135mg碘，室温磁力搅拌反应至反应体系呈棕色透明(表明全乙酰化反应完成约5-30min)，然后将反应混合物用50mL干燥的二氯甲烷稀释，冰浴冷却下加入40％溴化氢的冰醋酸溶液14mL(加入溴化氢，使糖分子带一个-Br)。加毕室温搅拌反应至TCL检测反应完毕(约需1-6h)。反应混合物用150mL二氯甲烷稀释，依次用冰水(60mL×2)、饱和碳酸氢钠溶液(50mL×2)、稀硫代硫酸钠溶液(0.4mol/L，50mL×2)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸馏浓缩得白色固体。用乙醚溶解后，向其中加入石油醚重结晶，得白色针状晶体-全乙酰吡喃溴代甘露糖晶体。

实施例3.D-甘露糖-青蒿素的制备：

参见图2。向装有磁力搅拌器的100mL三颈瓶内加入实施例1得到的青蒿素还原产物二氢青蒿素1.354g，四丁基硫酸氢铵0.2g(四丁基硫酸氢铵是相转移催化剂)，蒸馏水50mL，加入氢氧化钾0.134g，调整溶液的pH为8-9。搅拌回流4h后，向反应体系中加入1.62g实施例2所述全乙酰吡喃溴代甘露糖，冷凝回流5h后冷却，过滤，滤饼用乙醚和石油醚重结晶，即得本发明所述水溶性青蒿素衍生物-D-甘露糖-青蒿素。

实施例4：D-甘露糖-青蒿素的结构表征：

本实施例采用核磁共振、质谱和红外光谱对D-甘露糖-青蒿素的结构进行鉴定：

核磁共振：1H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：1.80～0.82(m，20H，CH₃，CH orCH₂)，2.19(m，1H，CH)，2.51(s，4H，OH)，3..33～3.25(m，4H，CH or CH₂)，4.90～4.40(m，1H，CH)，6.25～6.37(m，2H，CH)；

质谱：LC-MS(APCI：CHCl₃)m/z(％)：445.49(M-1⁺，100)；

红外光谱：IR(KBr cm^-1)3379(O-H stretching)，2946，2924(CH₃，CH or CH₂ sp³C-H stretching)，1092，1026，1014(C-O stretching)。

以上分析数据表明，合成产物的结构与所设计产物的结构吻合。

实施例5.D-甘露糖-青蒿素的水溶性：

精确称取25℃干燥至恒重的青蒿素标准品10mg置100mL容量瓶中，用95％乙醇稀释至刻度。分别吸取0，2，4，6，8，10mL于50mL容量瓶中，以95％乙醇补充至10mL，补加0.2％NaOH溶液至刻度，置(50±1)℃水浴中微温30min，冷水冷却至室温。另取乙醇10mL，用同一种方法加碱处理后，作为空白。分别在292nm处测吸光值，得到标准曲线的线性回归方程：

C＝1.05138×A+0.0105983(mg/50mL)，相关系数为0.999。

将足够量的青蒿素及D-甘露糖-青蒿素溶于相应pH的缓冲水溶液中，25℃恒温下，超声分散约40min，离心沉降除去溶液中的不溶物，取上层清液，即为25℃下的饱和溶液。饱和溶液经适当稀释后，在292nm处测其吸光度值，代入上述的方程计算得出饱和溶液的浓度，结果见表2.1。

D-甘露糖-青蒿素在不同pH缓冲水溶液中的溶解度(mg·mL^-1)

结果表明：用不同的糖对青蒿素修饰之后，水溶性得到了提高。经糖修饰后青蒿素的水溶解性在碱性范围比酸性范围好，在pH为4的酸性环境中难溶，随着pH的升高水溶性提高，在pH为9.18的水溶性均高于pH6.86。青蒿素被糖修饰后，由于糖基的引入，多羟基的亲水特性可使得整个分子溶解性能显著提高。由于糖带有多羟基，有弱酸性，随着pH升高溶解度有所提高。

实施例6：D-甘露糖-青蒿素对正常细胞的抑制作用

(1)配制药物工作浓度根据参考文献，药物浓度可采用等比间隔，选用10、20、40、80、160、320μmol/L作为实验浓度。将上述合成的D-甘露糖-青蒿素的原液用IMDM培养液稀释成浓度分别为10、20、40、80、160、320μmol/L的工作液。

(2)接种细胞取对数生长期小鼠成纤维3T3细胞、猴肾vero细胞分别用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用10％IMDM完全培养基配成单个细胞悬液。 进行细胞计数后，按照5×10⁴个/孔的密度接种于96孔培养板中，每孔体积200μL。将培养板移入CO₂培养箱中，在37℃ 5％CO₂饱和湿度的条件下培养24小时。

(3)加药待上述细胞完全贴壁生长后，将培养液吸弃，换上含有不同浓度的D-甘露糖-青蒿素的培养基(10、20、40、80、160、320μmol/L)和青蒿素培养基(40μmol/L)，继续培养8，12，24，48，72小时，各浓度分别设计4个复孔。

(4)呈色在培养结束前4小时，每孔加入MTT溶液20μL。继续孵育4小时，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液后，每孔加入150μL DMSO，振荡均匀，使结晶物充分溶解。

(5)比色选择490nm波长，在自动酶标仪上检测各孔吸光度值(OD值)，记录结果。(实验重复三次)

(6)按下式计算各种浓度药物对细胞的增殖抑制活性

相对抑制率＝(对照孔平均OD值-加药孔平均OD值)/对照孔平均OD值×100％

(7)统计分析用SPSS 10.0 for windows统计软件处理。检测数据以均数±标准差(x±s)表示，并采用方差分析及t检验，P＞0.05表示无显著性差异，P＜0.05表示有显著性差异。

D-甘露糖-青蒿素作用于3T3细胞48h的抑制率测定(％，x±s)

                           P＞0.05

D-甘露糖-青蒿素作用于vero细胞48h的抑制率的测定(％，x±s)

                            P＞0.05

考察了青蒿素及D-甘露糖-青蒿素对正常细胞3T3和vero的增殖抑制影响。阳性对照青蒿素(40μmol/L)对正常细胞的生长无明显抑制作用，毒副作用较小，从结果的统计分析得出，D-甘露糖-青蒿素与青蒿素相比，无显著性差异(P＞0.05)。

结论：

目前青蒿素的化学修饰还停留在简单小分子取代的水平上，还没有涉及到一些大分子对青蒿素化合物的修饰。近年来对中药单体化合物的糖基化研究较为活跃，也展示出比较突出的功能活性。因此，本发明对青蒿素进行糖基化修饰，会有更加广阔的前景。随着人们对多糖类物质的研究越来越深入，多糖与青蒿素结合可能会达到事半功倍的效果。同时，与其他已知的和将来新发现的活性物质结合，以期望产生共效、促效作用，从而获得“me-too”和“me-better”的优化产物。

Claims (6)

1.一种水溶性青蒿素衍生物，具有下列通式：

所述R基团为CH₃。

2.制备权利要求1所述的水溶性青蒿素衍生物的方法，其特征在于有以下步骤：

(1)制备二氢青蒿素

取青蒿素、NaBH₄及无水甲醇，室温下搅拌24h，滤液蒸馏，用250mL水溶解后，再用乙酸乙酯萃取，蒸去溶剂，干燥得二氢青蒿素；

(2)全乙酰吡喃溴代甘露糖的制备

取D-甘露糖，加入到醋酸酐悬浮液中，加碘，室温下搅拌，得到反应混合物，反应混合物用二氯甲烷稀释，冰浴冷却下加入40％溴化氢的冰醋酸溶液，室温搅拌至反应完全，反应混合物用二氯甲烷稀释，洗涤，得到的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，得到的固体用乙醚溶解后，加入石油醚重结晶得全乙酰吡喃溴代甘露糖晶体；

(3)水溶性青蒿素衍生物的制备

取二氢青蒿素，加入四丁基硫酸氢铵，蒸馏水，调整溶液的pH至8-9，搅拌回流4h后，向反应体系中加入全乙酰吡喃溴代甘露糖，冷凝回流5h后冷却，过滤，滤饼用乙醚和石油醚重结晶，即得权利要求1所述水溶性青蒿素衍生物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中青蒿素∶NaBH₄∶无水甲醇的摩尔比为1∶0.8～1∶90～100。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中D-甘露糖∶醋酸酐∶碘∶40％溴化氢的冰醋酸溶液摩尔比为1∶2～2.5∶0.15～0.2∶1～1.2。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中二氢青蒿素∶四丁基硫酸氢铵∶全乙酰吡喃溴代甘露糖的摩尔比为1∶0.1～0.2∶1.3～1.5。

6.权利要求1所述的水溶性青蒿素衍生物在制备治疗宫颈癌、肝癌、乳腺癌的药物中的用途。

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