CN114292222B - 厚朴酚衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种厚朴酚衍生物及其制备方法和应用，所述厚朴酚衍生物包括：C27H25NO3(CT175)。本发明用全新的方法，创新性地实现了一步法进行厚朴酚和靛红片段的拼接。该合成反应具有很好的化学选择性，能够选择性的发生在厚朴酚酚羟基的邻位，实现了厚朴酚酚羟基邻位在温和条件下的官能团化，首次实现了全新骨架的厚朴酚衍生物CT175的合成。厚朴酚衍生物CT175在肺癌、肠癌、胃癌、肝癌中具有明显的抗肿瘤活性。
Description
技术领域
本发明涉及药物技术领域，特别涉及一种厚朴酚衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
以天然产物作为先导化合物的药物化学研究对于推动现代医药的发展发挥着越来越重要的作用，与天然产物相关的药物在各类获批上市的药物中占有相当大的比重。据统计，1981年至2006年，世界范围内获批的上市药物中，与天然产物相关的药物占据50％以上。因此，利用药物化学研究手段，对天然产物单体进行修饰，对于新药研究尤为重要。
厚朴酚是常用传统中药厚朴的主要活性成分之一，研究证实其具有抗氧化、抗微生物、抗肿瘤等多种药理作用[张勇，唐方.厚朴酚药理作用的最新研究进展[J].中国中药杂志,2012,37(23):3526-30.]。近年来国内外对厚朴酚的抗肿瘤研究与日俱增，厚朴酚也被学者修饰成衍生物以增强其抗肿瘤活性[Tang H,Zhang Y,Li D,et al.Discovery andsynthesis of novel magnolol derivatives with potent anticancer activity innon-small cell lung cancer[J].Eur J Med Chem.2018,156:190-205.]。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种厚朴酚衍生物及其制备方法和应用。所述技术方案如下：
第一方面，一种厚朴酚衍生物，具有以下结构：
第二方面，一种厚朴酚衍生物的制备方法，包括以下步骤：
取化合物1在氩气保护下加溶剂溶解，然后加入催化剂和厚朴酚，60℃搅拌24h后淬灭反应，萃取反应液，将有机相干燥后浓缩，分离得到所述厚朴酚衍生物；
所述化合物1的结构式为
所述厚朴酚衍生物的结构式为
进一步的，所述厚朴酚、化合物1和催化剂的摩尔比为1:1:1。
进一步的，所述溶剂包括二氯甲烷、DMF和四氢呋喃中的一种或几种组合。
进一步的，所述溶剂的用量为，化合物1：溶剂＝1mmol:2.5mL-1mmol:50mL。
进一步的，所述溶剂的用量为，化合物1：溶剂＝1mmol:10mL。
进一步的，所述催化剂包括：三氯化铁或三氯化铝。
进一步的，使用氯化铵水溶液淬灭反应后，使用DCM萃取反应液。
进一步的，使用硅胶柱分离干燥浓缩后的产物。
第三方面，上述第一方面所述的厚朴酚衍生物在制备抗癌药物中的应用。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明用全新的方法，创新性地实现了一步法进行厚朴酚和靛红片段的拼接。该合成反应具有很好的化学选择性，能够选择性的发生在厚朴酚酚羟基的邻位，实现了厚朴酚酚羟基邻位在温和条件下的官能团化，首次实现了全新骨架的厚朴酚衍生物CT175的合成。厚朴酚衍生物CT175在肺癌、肠癌、胃癌、肝癌中具有明显的抗肿瘤活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是本发明实施例中厚朴酚衍生物CT175的核磁1H NMR图。
图2是本发明实施例中厚朴酚衍生物CT175的核磁13C NMR图。
图3是本发明实施例中厚朴酚衍生物CT175的质谱图(0-1400m/z)。
图4是本发明实施例中厚朴酚衍生物CT175的质谱图(300-525m/z)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例
一、厚朴酚衍生物CT175的制备
氩气保护下，取10mmol化合物1溶于100mL二氯甲烷，再依次加入10mmol三氯化铁和10mmol厚朴酚，于60℃搅拌24h，然后向反应液中加入氯化铵水溶液淬灭反应，用DCM萃取，将萃取得到的有机相干燥，浓缩，使用硅胶柱分离得到厚朴酚衍生物CT175(3.2g，产率80％，HPLC纯度99％)。
对厚朴酚衍生物CT175分别进行核磁和质谱分析，结果如图1-4所示：
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.97(s,1H),8.60(s,1H),7.85–7.32(m,1H),7.22–7.14(m,1H),7.15–6.92(m,6H),6.86(td,J＝8.2,3.1Hz,2H),5.91(dt,J＝16.6,6.6Hz,2H),5.19–4.90(m,4H),3.32(d,J＝6.8Hz,2H),3.25(d,J＝6.8Hz,2H),1.83(d,J＝1.7Hz,3H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ185.21,151.32,150.19,139.82,137.75,137.48,134.60,132.38,132.26,131.40,129.04,128.02,127.60,126.98,125.88,124.28,122.94,117.06,115.75,115.48,110.48,52.36,39.51,39.41,29.68,23.38.
HRMS：m/z(M+Na)+calcd for C27H25NNaO3434.1732,found 434.1745
(1)考察催化剂的种类
分别使用三氯化铝、三氟化硼乙醚、三氯化硼、对甲苯磺酸中的一种，等摩尔替代三氯化铁作为催化剂。按实施例1的方法制备厚朴酚衍生物CT175。产率如表1所示。
表1不同催化剂种类制备CT175的产率
| 催化剂 | 三氯化铁 | 三氯化铝 | 三氟化硼乙醚 | 三氯化硼 | 对甲苯磺酸 |
| 产率 | 80％ | 8％ | 0％ | 0％ | 0％ |
实验表明，使用三氟化硼乙醚、三氯化硼、对甲苯磺酸代替三氯化铁时，厚朴酚和靛红片段无法进行反应，得不到终产物厚朴酚衍生物CT175；使用三氯化铝作为催化剂时，反应产率较低，仅有8％。因此，三氯化铁是较为合适的催化剂选择。
(2)考察溶剂的种类
分别使用DMF、甲苯、四氢呋喃、1,4-二氧六环中的一种，等体积替代二氯甲烷作为溶剂。按实施例1的方法制备厚朴酚衍生物CT175。产率如表2所示。
表2不同溶剂制备CT175的产率
| 溶剂 | 二氯甲烷 | DMF | 甲苯 | 四氢呋喃 | 1,4-二氧六环 |
| 产率 | 80％ | 20％ | 0％ | 25％ | 0％ |
实验表明，使用甲苯或1,4-二氧六环作为溶剂时，厚朴酚和靛红片段无法进行反应，得不到终产物厚朴酚衍生物CT175；使用DMF或四氢呋喃作为溶剂，反应产率较低，仅有20-25％。因此，二氯甲烷是较为合适的溶剂选择。
(3)考察溶剂的用量
分别使用10mL、25mL、50mL、200mL、500mL、1L的二氯甲烷作为溶剂。按实施例1的方法制备厚朴酚衍生物CT175。产率如表3所示。
表3不同溶剂用量CT175的产率
| 二氯甲烷用量(mL) | 10 | 25 | 50 | 100 | 200 | 500 | 1000 |
| 产率 | 0％ | 30％ | 30％ | 80％ | 25％ | 5％ | 0％ |
实验表明，反应产率随二氯甲烷的用量增加呈抛物线变化，初始时，反应产率随二氯甲烷的用量增加而升高，当反应产率到达一定量时，继续增加二氯甲烷用量，反应产率下降。从表3中可以看出，二氯甲烷用量为100mL时，厚朴酚衍生物CT175具有较高的产率。
二、药理、药效实验
(1)CT175对人肺癌细胞株A549增殖的影响
1.实验材料
1.1细胞株：人肺癌细胞株A549
1.2试剂和仪器：RPMI-1640培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，BI公司)，0.25％胰蛋白酶(Gibco公司)，磷酸盐缓冲液(PBS，Hyclone公司)，DMSO(Sigma公司)，CCK8试剂盒(APExBIO公司)，多功能酶标仪(Synergy H1，BioTek)，倒置显微镜(Leica公司)，超净台(新加坡艺思高科技有限公司)，恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)，低速离心机(湖南恒诺仪器设备有限公司)，细胞培养箱(新加坡艺思高科技有限公司)。
2.实验方法
2.1培养A549细胞至对数生长期，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，1200rpm离心3min，用含10％FBS的RPMI-1640培养液重悬细胞沉淀，以5000个/孔的密度100μL体积接种细胞于96孔培养板，然后置于培养箱中37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养过夜。
2.2每组设6个复孔，每孔按以下条件加药，然后继续培养24h。
对照组：即不加药组。
阳性对照组：加入厚朴酚或靛红，厚朴酚组和靛红组各分为3组：
阳性对照组1：加入终浓度为20μmol/L的厚朴酚。
阳性对照组2：加入终浓度为40μmol/L的厚朴酚。
阳性对照组3：加入终浓度为80μmol/L的厚朴酚。
阳性对照组4：加入终浓度为20μmol/L的靛红。
阳性对照组5：加入终浓度为40μmol/L的靛红。
阳性对照组6：加入终浓度为80μmol/L的靛红。
CT175组：将CT175组分为3组：
CT175组1：加入终浓度为20μmol/L的CT175。
CT175组2：加入终浓度为40μmol/L的CT175。
CT175组3：加入终浓度为80μmol/L的CT175。
以上细胞继续培养24h后，用CCK8试剂盒检测药物对A549细胞增殖的影响。具体操作如下：每孔加入10μL CCK8，继续培养2h后用酶标仪测定450nm波长处的吸光度(OD)值，以对照组细胞增殖抑制率为0％，计算各组的细胞增殖抑制率。
3.实验结果
表4 CT175对人肺癌细胞株A549增殖的影响
如表4所示，CT175能够明显抑制人肺癌细胞株A549的增殖，其抑制增殖的作用呈剂量依赖性，随剂量加大而递增；且抑制增殖的作用明显优于阳性对照药物厚朴酚和靛红。
(2)CT175对人肠癌细胞株SW480增殖的影响
1.实验材料
1.1细胞株：人肠癌细胞株SW480
1.2试剂和仪器：RPMI-1640培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，BI公司)，0.25％胰蛋白酶(Gibco公司)，磷酸盐缓冲液(PBS，Hyclone公司)，DMSO(Sigma公司)，CCK8试剂盒(APExBIO公司)，多功能酶标仪(Synergy H1，BioTek)，倒置显微镜(Leica公司)，超净台(新加坡艺思高科技有限公司)，恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)，低速离心机(湖南恒诺仪器设备有限公司)，细胞培养箱(新加坡艺思高科技有限公司)。
2.实验方法
2.1培养SW480细胞至对数生长期，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，1200rpm离心3min，用含10％FBS的RPMI-1640培养液重悬细胞沉淀，以5000个/孔的密度100μL体积接种细胞于96孔培养板，然后置于培养箱中37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养过夜。
2.2每组设6个复孔，每孔按以下条件加药，然后继续培养24h。
对照组：即不加药组。
阳性对照组：加入厚朴酚或靛红，厚朴酚组和靛红组各分为3组：
阳性对照组1：加入终浓度为20μmol/L的厚朴酚。
阳性对照组2：加入终浓度为40μmol/L的厚朴酚。
阳性对照组3：加入终浓度为80μmol/L的厚朴酚。
阳性对照组4：加入终浓度为20μmol/L的靛红。
阳性对照组5：加入终浓度为40μmol/L的靛红。
阳性对照组6：加入终浓度为80μmol/L的靛红。
CT175组：将CT175组分为3组：
CT175组1：加入终浓度为20μmol/L的CT175。
CT175组2：加入终浓度为40μmol/L的CT175。
CT175组3：加入终浓度为80μmol/L的CT175。
以上细胞继续培养24h后，用CCK8试剂盒检测药物对SW480细胞增殖的影响。具体操作如下：每孔加入10μL CCK8，继续培养2h后用酶标仪测定450nm波长处的吸光度(OD)值，以对照组细胞增殖抑制率为0％，计算各组的细胞增殖抑制率。
3.实验结果
表5 CT175对人肠癌细胞株SW480增殖的影响
| 分组 | 抑制率(％) |
| 对照组 | 0.00 |
| 阳性对照组1 | 4.72 |
| 阳性对照组2 | 15.74 |
| 阳性对照组3 | 28.19 |
| 阳性对照组4 | 6.28 |
| 阳性对照组5 | 16.21 |
| 阳性对照组6 | 32.77 |
| CT175组1 | 63.36 |
| CT175组2 | 88.85 |
| CT175组3 | 100.00 |
如表5所示，CT175能够明显抑制人肠癌细胞株SW480的增殖，其抑制增殖的作用呈剂量依赖性，随剂量加大而递增；且抑制增殖的作用明显优于阳性对照药物厚朴酚和靛红。
(3)CT175对人胃癌细胞株AGS增殖的影响
1.实验材料
1.1细胞株：人胃癌细胞株AGS
1.2试剂和仪器：RPMI-1640培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，BI公司)，0.25％胰蛋白酶(Gibco公司)，磷酸盐缓冲液(PBS，Hyclone公司)，DMSO(Sigma公司)，CCK8试剂盒(APExBIO公司)，多功能酶标仪(Synergy H1，BioTek)，倒置显微镜(Leica公司)，超净台(新加坡艺思高科技有限公司)，恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)，低速离心机(湖南恒诺仪器设备有限公司)，细胞培养箱(新加坡艺思高科技有限公司)。
2.实验方法
2.1培养AGS细胞至对数生长期，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，1200rpm离心3min，用含10％FBS的RPMI-1640培养液重悬细胞沉淀，以5000个/孔的密度100μL体积接种细胞于96孔培养板，然后置于培养箱中37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养过夜。
2.2每组设6个复孔，每孔按以下条件加药，然后继续培养24h。
对照组：即不加药组。
阳性对照组：加入厚朴酚或靛红，厚朴酚组和靛红组各分为3组：
阳性对照组1：加入终浓度为20μmol/L的厚朴酚。
阳性对照组2：加入终浓度为40μmol/L的厚朴酚。
阳性对照组3：加入终浓度为80μmol/L的厚朴酚。
阳性对照组4：加入终浓度为20μmol/L的靛红。
阳性对照组5：加入终浓度为40μmol/L的靛红。
阳性对照组6：加入终浓度为80μmol/L的靛红。
CT175组：将CT175组分为3组：
CT175组1：加入终浓度为20μmol/L的CT175。
CT175组2：加入终浓度为40μmol/L的CT175。
CT175组3：加入终浓度为80μmol/L的CT175。
以上细胞继续培养24h后，用CCK8试剂盒检测药物对AGS细胞增殖的影响。具体操作如下：每孔加入10μL CCK8，继续培养2h后用酶标仪测定450nm波长处的吸光度(OD)值，以对照组细胞增殖抑制率为0％，计算各组的细胞增殖抑制率。
3.实验结果
表6 CT175对人胃癌细胞株AGS增殖的影响
如表6所示，CT175能够明显抑制人胃癌细胞株AGS的增殖，其抑制增殖的作用呈剂量依赖性，随剂量加大而递增；且抑制增殖的作用明显优于阳性对照药物厚朴酚和靛红。
(4)CT175对人肝癌细胞株HepG2增殖的影响
1.实验材料
1.1细胞株：人肝癌细胞株HepG2
1.2试剂和仪器：DMEM培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，BI公司)，0.25％胰蛋白酶(Gibco公司)，磷酸盐缓冲液(PBS，Hyclone公司)，DMSO(Sigma公司)，CCK8试剂盒(APExBIO公司)，多功能酶标仪(Synergy H1，BioTek)，倒置显微镜(Leica公司)，超净台(新加坡艺思高科技有限公司)，恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)，低速离心机(湖南恒诺仪器设备有限公司)，细胞培养箱(新加坡艺思高科技有限公司)。
2.实验方法
2.1培养HepG2细胞至对数生长期，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，1200rpm离心3min，用含10％FBS的RPMI-1640培养液重悬细胞沉淀，以5000个/孔的密度100μL体积接种细胞于96孔培养板，然后置于培养箱中37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养过夜。
2.2每组设6个复孔，每孔按以下条件加药，然后继续培养24h。
对照组：即不加药组。
阳性对照组：加入厚朴酚或靛红，厚朴酚组和靛红组各分为3组：
阳性对照组1：加入终浓度为20μmol/L的厚朴酚。
阳性对照组2：加入终浓度为40μmol/L的厚朴酚。
阳性对照组3：加入终浓度为80μmol/L的厚朴酚。
阳性对照组4：加入终浓度为20μmol/L的靛红。
阳性对照组5：加入终浓度为40μmol/L的靛红。
阳性对照组6：加入终浓度为80μmol/L的靛红。
CT175组：将CT175组分为3组：
CT175组1：加入终浓度为20μmol/L的CT175。
CT175组2：加入终浓度为40μmol/L的CT175。
CT175组3：加入终浓度为80μmol/L的CT175。
以上细胞继续培养24h后，用CCK8试剂盒检测药物对HepG2细胞增殖的影响。具体操作如下：每孔加入10μL CCK8，继续培养2h后用酶标仪测定450nm波长处的吸光度(OD)值，以对照组细胞增殖抑制率为0％，计算各组的细胞增殖抑制率。
3.实验结果
表7 CT175对肝癌细胞株HepG2增殖的影响
| 分组 | 抑制率(％) |
| 对照组 | 0.00 |
| 阳性对照组1 | 7.62 |
| 阳性对照组2 | 17.55 |
| 阳性对照组3 | 31.87 |
| 阳性对照组4 | 8.78 |
| 阳性对照组5 | 17.19 |
| 阳性对照组6 | 29.67 |
| CT175组1 | 23.20 |
| CT175组2 | 75.23 |
| CT175组3 | 100.00 |
如表7所示，CT175能显著抑制人肝癌细胞株HepG2的增殖，其抑制效果随剂量加大而递增；且抑制增殖的作用明显优于阳性对照药物厚朴酚和靛红。
根据以上药理、药效实验表明，本发明制备的CT175的抗肿瘤活性优于厚朴酚，并且骨架新颖，合成方法创新，是一个具有开发潜力的抗肿瘤化合物，可以直接用于相关疾病的治疗和相关药物的制备。
本发明用全新的方法，创新性地实现了一步法进行厚朴酚和靛红片段的拼接。该合成反应具有很好的化学选择性，能够选择性的发生在厚朴酚酚羟基的邻位，实现了厚朴酚酚羟基邻位在温和条件下的官能团化，首次实现了全新骨架的厚朴酚衍生物CT175的合成。厚朴酚衍生物CT175在肺癌、肠癌、胃癌、肝癌中具有明显的抗肿瘤活性。
上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种厚朴酚衍生物，其特征在于，具有以下结构：
2.一种厚朴酚衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取化合物1在氩气保护下加溶剂溶解，然后加入催化剂和厚朴酚，60℃搅拌24h后淬灭反应，萃取反应液，将有机相干燥后浓缩，分离得到所述厚朴酚衍生物；
所述溶剂选自二氯甲烷、DMF和四氢呋喃中的一种或几种组合；
所述催化剂选自三氯化铁或三氯化铝；
所述化合物1的结构式为
所述厚朴酚衍生物的结构式为
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述厚朴酚、化合物1和催化剂的摩尔比为1:1:1。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述溶剂的用量为，化合物1：溶剂＝1mmol:2.5mL-1mmol:50mL。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述溶剂的用量为，化合物1：溶剂＝1mmol:10mL。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：使用氯化铵水溶液淬灭反应后，使用DCM萃取反应液。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：使用硅胶柱分离干燥浓缩后的产物。
8.根据权利要求1所述的厚朴酚衍生物在制备抗癌药物中的应用。
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