CN108727437A

CN108727437A - 一类姜黄素芳基金属配合物及其合成方法和应用

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Publication number: CN108727437A
Application number: CN201810425570.3A
Authority: CN
Inventors: 刘红科; 郝元元; 苏志; 钱勇; 李季; 薛旭玲
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2018-05-04
Filing date: 2018-05-04
Publication date: 2018-11-02
Anticipated expiration: 2038-05-04
Also published as: CN108727437B

Abstract

本发明公开了一类姜黄素芳基金属配合物，该姜黄素芳基金属配合物能够有效提高姜黄素的生物利用率，具有良好的光毒性、抗癌活性、抑制血管生成能力和抗菌活性。本发明还公开了上述姜黄素芳基金属配合物的合成方法，该方法工艺流程简单、易于操作，且产率高。本发明最后公开了上述姜黄素芳基金属配合物在用于制备抗癌药物、抗癌药物组分、抗肿瘤转移药物、抗肿瘤转移药物组分、抗菌药物以及抗菌药物组分方面的应用。

Description

一类姜黄素芳基金属配合物及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及一类姜黄素芳基金属配合物，还涉及上述姜黄素芳基金属配合物的合成方法及其在用于制备抗癌药物、抗癌药物组分、抗肿瘤转移药物、抗肿瘤转移药物组分、抗菌药物和抗菌药物组分方面的应用。

技术背景

天然产物的潜在药用价值使得天然产物的抗肿瘤研究已逐步成为临床抗肿瘤药物研究的热点。姜黄素是从姜科植物姜黄的根茎中提取的一类活性成分，研究表明姜黄素本身具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化等生物活性。姜黄素的抗氧化活性和抗炎作用关系着人体众多疾病的发生以及姜黄素有助治疗耐药结核病。此外，许多体内外试验表明姜黄素能通过凋亡途径来诱导细胞凋亡有效抑制癌细胞增长。总之，姜黄素具有广谱抗肿瘤活性，毒副作用低，不良反应小等众多优势。但是姜黄素又具有不易溶于水，稳定性差，生物利用度低，用药剂量大等缺陷，这些限制了姜黄素作为候选抗癌药物或抗癌药物组分的应用。

金属抗癌药物由于其独特的药理作用而被广泛应用于药物化学的研究，其中芳基金属化合物作为化学疗法抗癌活性物质的研究，始于上世纪七十年代，本世纪初取得重大突破，其中抗癌活性较好的NAMI-A以及KP1019已经进入临床I期，同时一系列钌、锇配合物也正在做更深入的研究。然而芳基金属配合物也存在诸如毒副作用大，难代谢等缺陷。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一类姜黄素芳基金属配合物，该姜黄素芳基金属配合物一方面能够解决姜黄素作为抗癌药物或抗癌药物组分时存在的不易溶于水、稳定性差和生物利用度低的问题，另一方面还能够解决单纯芳基金属配合物抗癌药物或抗癌药物组分时存在的毒副作用大、代谢难的问题；本发明姜黄素芳基金属配合物在具有良好抗癌、抗转移、抗菌活性的同时毒副作用小。

本发明还要解决的技术问题是提供上述姜黄素芳基金属配合物的合成方法，该方法工艺简单、易于操作，且产率高。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述姜黄素芳基金属配合物在用于制备抗癌药物、抗癌药物组分、抗肿瘤转移药物、抗肿瘤转移药物组分、抗菌药物以及抗菌药物组分方面的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术手段为：

一类姜黄素芳基金属配合物，具有如下结构通式：

其中，M为Ru、Os、Ir或Rh；X为Cl、Br或I；

上述姜黄素芳基金属配合物的合成方法，包括如下步骤：

步骤1，将所需量的姜黄素和碱性物质溶解于有机溶剂中，搅拌反应一段时间；碱性物质的作用是拔掉姜黄素羟基上的氢，以易于与金属配位；

步骤2，往步骤1的混合物料中加入所需量的芳基金属二聚体，于一定温度下搅拌反应一段时间；反应完成后在减压蒸馏条件下移除有机溶剂，通过柱层析法来分离提纯产物；将得到的产物静置并收集晶体，最后于真空下干燥即可。

其中，步骤1中，所述碱性物质为甲醇钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、碳酸钠或碳酸氢钠。

其中，步骤1和步骤2中，所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、乙二醇或丙酮。

其中，步骤1中，所述碱性物质与姜黄素的反应摩尔比为5∶1～1∶5。

其中，步骤2中，所述芳基金属二聚体为二氯(4-甲基异丙基苯基)合锇二聚体、二氯(联苯基)合锇二聚体、二氯(联苯基)合钌二聚体或二氯(五甲基环戊二烯基)合铱二聚体。

其中，步骤2中，所述芳基金属二聚体与姜黄素的反应摩尔比为5∶1～1∶20。

其中，步骤2中，反应温度为2～90℃；反应时间为2～72h。

上述姜黄素芳基金属配合物在用于制备抗癌药物、抗癌药物组分、抗肿瘤转移药物、抗肿瘤转移药物组分、抗菌药物以及抗菌药物组分方面的应用。

本发明姜黄素芳基金属配合物合成路线如下：

与现有技术相比，本发明的优点为：

本发明的姜黄素芳基金属配合物能够有效提高姜黄素的生物利用率，具有良好的光毒性(即在光照下具有良好的药物活性)、抗癌活性和抗菌活性；该姜黄素芳基金属配合物一方面能够解决姜黄素作为抗癌药物或抗癌药物组分时存在的不易溶于水、稳定性差和生物利用度低的问题，另一方面还能解决单纯芳基金属配合物抗癌药物或抗癌药物组分时存在的毒副作用大、代谢难的问题；另外，本发明姜黄素芳基金属配合物的合成方法具有工艺流程简单、易于操作和产率高的优点；本发明姜黄素芳基金属配合物的抗癌机制是DNA和线粒体等多靶点的共同作用从而诱导细胞死亡。

附图说明

图1是实施例1中配合物1的单晶结构图；

图2是实施例1配合物1与DNA相互作用的圆二色谱图；

图3是实施例2配合物2与DNA相互作用的圆二色谱图；

图4是实施例3配合物3与DNA相互作用的圆二色谱图；

图5是实施例1配合物1与DNA相互作用的电泳图；

图6是实施例2配合物2与DNA相互作用的电泳图；

图7是实施例3配合物3与DNA相互作用的电泳图；

图8是实施例2中配合物2浓度为10μM时癌细胞内活性氧生成的共聚焦荧光成像图及其细胞流式图；

图9是实施例2中配合物2浓度为20μM时癌细胞内活性氧生成的共聚焦荧光成像图及其细胞流式图；

图10为相同条件下，不加入配合物2时癌细胞内活性氧生成的共聚焦荧光成像图及其细胞流式图；

图11是实施例1～3中配合物1-3，配体4浓度为10μM和不加入任何物质时血管内皮细胞成管图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1

将姜黄素(18.40mg，0.05mmol)与甲醇钠(10.8mg，0.20mmol)溶解于20mL甲醇中，在常温下搅拌反应1小时；然后将二氯(4-甲基异丙基苯基)合锇(II)二聚体(39.54mg，0.05mmol)加入反应管中(混合反应物料位于反应管中反应)，于48℃、回流条件下搅拌反应24h；反应完全后在减压蒸馏条件下移除有机溶剂，选取合适的洗脱剂通过柱层析的方法来分离提纯，将分离提纯后的产物置于冰箱中重结晶，缓慢析出，得到橙红色晶体，收集晶体，真空干燥、称重，计算产率为：68％。

元素分析：理论值(％)：C₃₁H₃₃O₆ClOs·(CH₃OH)·0.5(H₂O)：C50.02，H4.99；实验值：C49.84，H4.88。¹H NMR(400MHz，DMSO)δ9.56(s，2H)，7.41(d，J＝15.6Hz，2H)，7.24(d，J＝1.7Hz，2H)，7.06(dd，J＝8.2，1.7Hz，2H)，6.81(d，J＝8.1Hz，2H)，6.56(d，J＝15.7Hz，2H)，6.14(d，J＝5.6Hz，2H)，5.91(d，J＝5.6Hz，2H)，5.68(s，1H)，3.83(s，6H)，2.80-2.59(m，1H)，2.22(s，3H)，1.28(d，J＝6.9Hz，6H)。ESI-MS(in CH₃CN，+)：理论值：m/z691.82，实验值：m/z693.42。

实施例2

将姜黄素(18.40mg，0.05mmol)与氢氧化钾(2.8mg，0.05mmol)溶解于15mL乙二醇中，在常温下搅拌反应0.5小时；然后将二氯(联苯基)合锇(II)二聚体(33.23mg，0.04mmol)加入反应管中(混合反应物料位于反应管中反应)，于86℃、回流条件下搅拌反应17h；反应完全后在减压蒸馏条件下移除有机溶剂，选取合适的洗脱剂通过柱层析的方法来分离提纯，将分离提纯后的产物置于冰箱中重结晶，缓慢析出，得到橙红色晶体，收集晶体，真空干燥、称重，计算产率为：73％。

元素分析：理论值(％)C₃₃H₂₉O₆ClOs·0.5(CH₃OH)：C53.04，H3.91；实验值：C52.24，H3.87。¹H NMR(400MHz，DMSO)δ9.54(s，2H，OH of curc)，7.78(dd，J＝6.5，3.1Hz，2H，C(4，4’)H of curc)，7.49(m，3H)，7.15(t，J＝9.0Hz，4H，C(10，10’)H and C(6，6’)H of curc)，7.00(dd，J＝8.2，1.6Hz，2H，C(9，9’)H of curc)，6.80(d，J＝8.1Hz，2H，C(3，3’)H ofcurc)，6.66(d，J＝5.7Hz，2H，H_bip)，6.48(d，J＝15.6Hz，2H，H_bip)，6.40(t，J＝5.4Hz，2H，H_bip)，6.30(t，J＝5.1Hz，1H，H_bip)，5.63(s，1H，C(1)H of curc)，3.83(s，6H，OCH₃ ofcurc)).ESI-MS(in CH₃CN，m/z)：713.33[(η⁶-biphenyl)Os(curcuminato)]⁺.ESI-MS(inCH₃CN，+)：理论值：m/z 711.81，实验值：m/z713.33。

实施例3

将姜黄素(92.0mg，0.25mmol)与氢氧化钠(2.0mg，0.05mmol)溶解于20mL二氯甲烷中，在常温下搅拌反应2小时；然后将二氯(联苯基)合钌(II)二聚体(9.79mg，0.015mmol)加入反应管中(混合反应物料位于反应管中反应)，于25℃、回流条件下搅拌反应44h；反应完全后在减压蒸馏条件下移除有机溶剂，选取合适的洗脱剂通过柱层析的方法来分离提纯，将分离提纯后的产物置于冰箱中重结晶，缓慢析出，得到橙红色晶体，收集晶体，真空干燥、称重，计算产率为：80％。

元素分析：理论值(％)C₃₃H₂₉O₆C1Ru·0.5(CH₃OH)：C60.23，H4.44；实验值：C59.01，H 4.17。¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ7.81(dd，J＝6.6，2.7Hz，2H，C(4，4’)H of curc)，7.50(m，3H，H_bip)，7.04-6.92(m，4H，C(10，10’)H and C(6，6’)H of curc)，6.89(d，J＝8.1Hz，2H，C(9，9’)H of curc)，6.35(d，J＝15.6Hz，2H，C(3，3’)H of curc)，5.98(t，J＝5.7Hz，2H，H_bip)，5.87(d，J＝5.9Hz，2H，H_bip)，5.80(d，J＝5.8Hz，3H，H_bip)，5.41(s，1H，C(1)H ofcurc)，3.94(s，6H，OCH₃ of curc)。ESI-MS(in CH₃CN，+)：理论值：m/z622.65，实验值：m/z623.25。

实施例1制得的姜黄素芳基金属配合物1的晶体学数据如表1所示。

表1为金属配合物1的重要晶体学数据

光照和黑暗条件下，姜黄素和本发明姜黄素芳基金属配合物在制备抗肿瘤药物方面的应用：A549(非小细胞肺癌)、HeLa(宫颈癌)、HepG2(肝癌细胞)、L02(正常肝细胞)。

方法：MTT比色法，测定对人源癌细胞系(A549(非小细胞肺癌)、HeLa(宫颈癌)、HepG2(肝癌细胞)、L02(正常肝细胞))在体外的抗癌活性。A549、HeLa、HepG2和L02细胞在具有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基中，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。将细胞以5000细胞/孔的初始密度接种到96孔细胞培养板中，在培养24小时后移除培养基，加入不同浓度的待测配合物1，2，3以及姜黄素，给药12h后其中一组光照15分钟(425nm、36J·cm^-2)，继续孵育32h。之后，在每个孔中加入20μL的MTT溶液，继续孵育4h，最后移除培养基，加入150μL DMSO，震摇10分钟，并在ELIASA(Tecan Infinite M 1000 Pro)酶标仪上读取590nm处的吸光度。

实施例1～3制得的金属配合物1，2和3及姜黄素在光照及黑暗条件下的抗癌活性如表2所示。

表2为金属配合物1、2、3以及姜黄素配体4，顺铂(CDDP)在光照及黑暗条件下的IC₅₀(μM)值

结果表明，本发明的三种配合物均表现出良好的活性，与顺铂处于一个数量级上。同时在光照条件下(425nm，36J·cm^-2，15min)，本发明的三种配合物及姜黄素的活性比黑暗条件下要好甚至略优于顺铂。相较于实施例3制得的钌配合物3，实施例1和实施例2制得的锇配合物1和2对A549，HeLa和HepG2多种细胞系表现出更好的活性(IC₅₀(light)≈5-15μM)。其中实施例2制得的配合物2显示出最好的抗癌活性。结果表明，配合物的活性与配合物的芳基配体以及金属的选择有一定关系。同时配合物对正常细胞的毒副作用小，表明配合物具有选择性。

姜黄素及本发明姜黄素芳基金属配合物与DNA作用的应用：

方法一：圆二色谱法。通过CD光谱在PBS缓冲溶液(5mM，pH＝7.2)中研究配合物1，2，3与CT-DNA的相互作用。配制一系列不同摩尔比的(r_i＝[配合物]/[CT-DNA]，r_i值分别为0，0.08，0.16，0.24，0.32，0.40)样品，其中，CT-DNA碱基对浓度设定为100μM，于37℃恒温箱中孵化24小时。在1em宽度的比色皿中记录CD光谱，扫描范围设置为200～600nm，扫描速率为100nm·min^-1，狭缝宽度为1nm。

方法二：琼脂糖凝胶电泳法。通过凝胶电泳研究配合物1，2，3与超螺旋质粒DNApBR322在光照(365nm，15min)和黑暗条件下的相互作用。在50mM的Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液中配制一系列不同摩尔比的(r_i＝[配合物]/[质粒DNA]，配合物1和2r_i值分别为0，1，3，5，7，9，配合物3r_i值为0，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0)样品，其中，质粒DNA碱基对浓度设定为10μM，于37℃恒温箱中孵化24小时后，向内加入终止液(0.05％的溴酚蓝，50％的甘油和2mM的Na₂H₂edta)，将配制好的样品点样于提前铺制好的含有0.8％琼脂糖凝胶的孔槽中，在TAE(40mM Tris-Acetate，1 mM EDTA，PH＝8.3)溶液中电泳，电压设为70mV，时间为120min，结束电泳后，使用10mg/μl的溴化乙锭染色20min，染色后的凝胶置于Bio-Rad分子成像GelDoc XR系统的紫外灯下成像，获得所需电泳图像。

实施例1，2，3制得的姜黄素芳基金属配合物1、2、3与CT-DNA作用的圆二谱图分别如图2～4所示，与pBR322作用的凝胶电泳图分别如图5～7所示。

结果表明：随着[配合物]/[CT-DNA]摩尔比的增加，CT-DNA的负峰均减弱，表明配合物结构中所含基团的嵌入作用使双螺旋DNA发生部分解旋。同时CT-DNA的正峰增强，表明与DNA结合后使得DNA碱基堆积变得紧密，增强了DNA的碱基堆积作用。这说明配合物1，2，3可能通过水解配位以及嵌入插入模式改变DNA的二级结构。

闭环质粒DNA与药物结合后会改变其超螺旋密度，从而改变其在凝胶电泳中的迁移速率。随着配合物1，2，3浓度的增加，超螺旋DNA带(Form I)的迁移速度逐渐减小。这说明由于配合物的作用解旋了DNA的超螺旋结构，降低了它的超螺旋度，从而影响了DNA在电泳中的迁移率。同时发现光照条件下解旋作用明显(Lanes：2，4，6，8，10)。此外，配合物1和2的作用强度相似，光照条件下r_i的值为9.0时，出现共迁移点。配合物3与PBR322的作用结果与配合物1，2相似，不过配合物3的作用更加明显，当r_i的值为1.0时出现共迁移点。以上结果表明，配合物1，2，3均能诱导DNA发生解旋，但光照条件下作用更明显，同时配合物3的解旋作用更为明显。

本发明实施例2制得的姜黄素-联苯锇配合物2对诱发细胞内活性氧生成的应用：

方法1：流式细胞仪监测癌细胞内的ROS。A549细胞经不同浓度的配合物2(10μM，20μM)处理2h后用光源(425nm，36J·cm^-2)照射15min，继续孵化6h，继而用含10μM DCFH-DA的无血清培养基于37℃下避光染色15min，离心弃上清，用无血清的培养基洗涤三次，除去未进入细胞内的DCFHD。半小时内用流式细胞仪测定FL1通道的绿色荧光强度。激发波长为488nm，发射波长为530+20nm。绿光的平均荧光强度用FlowJo 7.6(Tree Star，OR，USA)软件分析。

方法2：共聚焦显微镜监测癌细胞内的ROS。A549细胞接种于35mm的Corning激光共聚焦培养皿中，当细胞密度生长至70％时，加入不同浓度的配合物2(10μM，20μM)处理2h后用光源(425nm，36J·cm^-2)照射15min，继续孵化6h，然后细胞用含10μM DCFH-DA的无血清培养基于37℃下避光染色15min，接着用无血清的培养基洗涤三次，除去未进入细胞内的DCFHD。随后立刻用共聚焦显微镜观察。激发波长为488nm，发射波长为530±20nm。

实施例2制得的姜黄素-联苯锇配合物2对诱发细胞内活性氧生成的结果如图8～9所示，图10为图8和图9对应的对照实验组的癌细胞内活性氧生成的共聚焦荧光成像图及其细胞流式图，即为在相同培养条件下，不加入配合物2时癌细胞内活性氧生成的共聚焦荧光成像图及其细胞流式图。

结果表明：光照条件下配合物2可以明显有效地诱发细胞内活性氧含量升高，A549细胞加入20μM化合物2后，细胞内活性氧物质增加4.4倍。这说明配合物2进入癌细胞后会诱导癌细胞产生活性氧物质(ROS)，从而导致癌细胞发生凋亡。

本发明实施例1，2，3制得的姜黄素芳基金属配合物1-3对抑制血管生成和抗肿瘤转移的应用：

方法：将载玻片放于10cm培养皿中，将BD基质胶于冰上解冻，滴加到载玻片孔内。后将培养皿放入培养箱中静置30min。在此期间将贴壁的HUVECs细胞用胰酶消化成细胞悬液。将细胞悬液滴加到已固化后的载玻片孔内，置于培养箱中30min待沉降。待细胞完全沉降后，将每孔中上层培养液吸出，重新加入含有10μM浓度的作用物1-4培养液，置于培养箱中继续培养12h。将载玻片中每孔的培养液小心移除，在荧光显微镜下观察成管现象。

实施例1，2，3制得的姜黄素芳基金属配合物1、2、3及姜黄素4的HUVECs成管实验如图11所示。

结果表明：在空白对照组中血管内皮细胞在基质胶的支撑下形成管状、环状及网状等类似毛细血管的结构。而加入化合物1-4处理后，细胞明显没有成管。表明配合物1-3和姜黄素4均能抑制血管内皮细胞的成管能力。肿瘤转移过程涉及细胞侵袭、迁移、随血液流动、着床及新生血管生成等。理论上只要能抑制上述一个或多个环节，均能起到抑制肿瘤转移的效果。表明配合物1-3和姜黄素4均有潜在的抗肿瘤转移能力。

本发明选用姜黄素作为配体与芳基金属二聚体反应，得到的姜黄素芳基金属配合物既能够解决姜黄素作为抗癌药物或抗癌药物组分时存在的不易溶于水、稳定性差和生物利用度低的问题，还能够解决单纯芳基金属配合物抗癌药物或抗癌药物组分时存在的毒副作用大、代谢难的问题，本发明姜黄素芳基金属配合物能够有效提高姜黄素的利用率，在具有良好抗癌、抑制血管生成、抗菌活性的同时毒副作用小，可应用于制备抗癌药物、抗癌药物组分、抗肿瘤转移药物、抗肿瘤转移药物组分、抗菌药物以及抗菌药物组分，拥有良好的药物应用前景。

Claims

1.一类姜黄素芳基金属配合物，其特征在于，具有如下结构通式：

其中，M为Ru、Os、Ir或Rh；X为Cl、Br或I；

2.一种权利要求1所述的姜黄素芳基金属配合物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，将所需量的姜黄素和碱性物质溶解于有机溶剂中，搅拌反应一段时间；

3.根据权利要求2所述的姜黄素芳基金属配合物的合成方法，其特征在于：步骤1中，所述碱性物质为甲醇钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、碳酸钠或碳酸氢钠。

4.根据权利要求2所述的姜黄素芳基金属配合物的合成方法，其特征在于：步骤1和2中，所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、乙二醇或丙酮。

5.根据权利要求2所述的姜黄素芳基金属配合物的合成方法，其特征在于：步骤1中，所述碱性物质与姜黄素的反应摩尔比为5∶1～1∶5。

6.根据权利要求2所述的姜黄素芳基金属配合物的合成方法，其特征在于：步骤2中，所述芳基金属二聚体为二氯(4-甲基异丙基苯基)合锇二聚体、二氯(联苯基)合锇二聚体、二氯(联苯基)合钌二聚体或二氯(五甲基环戊二烯基)合铱二聚体。

7.根据权利要求2所述的姜黄素芳基金属配合物的合成方法，其特征在于：步骤2中，所述芳基金属二聚体与姜黄素的反应摩尔比为5∶1～1∶20。

8.根据权利要求2所述的姜黄素芳基金属配合物的合成方法，其特征在于：步骤2中，反应温度为2～90℃；反应时间为2～72h。

9.权利要求1所述的姜黄素芳基金属配合物在用于制备抗癌药物、抗癌药物组分、抗肿瘤转移药物、抗肿瘤转移药物组分、抗菌药物以及抗菌药物组分方面的应用。