CN110522923A - 果糖和rgd肽共修饰的双重靶向三阴性乳腺癌的脂质材料 - Google Patents

果糖和rgd肽共修饰的双重靶向三阴性乳腺癌的脂质材料 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型脂质材料，用于实现三阴性乳腺癌靶向药物的传递。所述的新型脂质材料以赖氨酸为连接基团，分别与胆甾部分、果糖部分和RGD部分连接。可利用该新型脂质材料中的果糖和RGD分别与三阴性乳腺癌细胞表面高表达的果糖转运体GLUT5和整合素受体αvβ3之间的亲和力，实现对三阴性乳腺癌的双重靶向功能，发挥更强的三阴性乳腺癌靶向治疗作用。该新型脂质材料可用于脂质体、纳米粒、胶束等在内的不同剂型，所制成的载紫杉醇脂质体具有明显的三阴性乳腺癌靶向性，拥有广阔的应用前景。

Description

果糖和RGD肽共修饰的双重靶向三阴性乳腺癌的脂质材料
技术领域
本发明涉及一类新型脂质材料及其在药物传递系统中的应用，具体是指在其对照品——果糖修饰的脂质材料和RGD肽修饰的脂质材料的基础上，将果糖和RGD用于共同修饰脂质材料，使其具有双重靶向三阴性乳腺癌的功能，期望进一步提高药物对三阴性乳腺癌的靶向能力。本发明包括该材料的制备和表征，及其作为药物载体在药物传递中的应用，属于医药技术领域。
背景技术
乳腺癌，作为严重影响女性生存、生活的恶性肿瘤，被称为女性的第一杀手；2019年1月，国家癌症中心发布了最新一期的全国癌症统计数据，其中，女性方面恶性肿瘤发病首位即为乳腺癌。并且，在全球范围内，发达国家和发展中国家女性的乳腺癌发病率均排名第一。三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受体（estrogenreceptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR ）、人表皮生长因子受体2（humanepidermal growth factor receptor 2，Her-2）均为阴性的乳腺癌，是乳腺癌中侵袭性最强的一种亚型，约占全部乳腺癌的20％。TNBC具有特殊的生物学行为和临床病理特征，如发病年龄小、侵袭性强、转移率高、总生存率低、预后差等特点。目前，用于治疗三阴性乳腺癌的药物仅有一个被批准上市，即以PD-L1为靶点的免疫治疗药物Atezolizumab。可见，三阴性乳腺癌独特的病理特征，使其缺乏治疗靶点，导致用于治疗TNBC的药物极其匮乏。
目前，临床上用于三阴性乳腺癌的治疗以手术、放疗和化疗（如紫杉醇、阿霉素、顺铂等）为主。缺乏肿瘤特异性是化疗药物的主要问题之一。化疗药物在正常细胞和癌细胞中非选择性的分布，不仅诱发过度的全身毒性，而且还减少肿瘤细胞中的药物积累，从而降低药物疗效，也会导致肿瘤对化疗药物的抗性。此外，药物与血浆和组织蛋白的无限制相互作用，可能导致化疗药物快速失活，从而进一步降低化疗药物的药效。因此，新型靶向递药系统（targeting drug delivery system, TDDS）的设计，在开发治疗三阴性乳腺癌的药物中有着举足轻重的作用。近年来，研究人员利用己糖转运体（GLUTs）、整合素受体、叶酸受体、转铁蛋白受体等不同类型的配体对药物递药系统进行修饰，以达到对肿瘤的靶向治疗的目的。
癌细胞具有增殖活跃和生长旺盛的特征，因此它们表现出与正常细胞不同的代谢特征，即使在氧气充足的条件下，癌细胞也容易进行糖酵解并产生大量乳酸，这就是Warburg效应。快速增殖和Warburg效应使癌细胞消耗了大量葡萄糖，使得癌细胞内部仍然呈现出低葡萄糖的微环境。为了在葡萄糖不足的微环境中生存，癌细胞可以利用其他营养物，如果糖，来代替葡萄糖。乳腺癌对于果糖的摄取比其他类型的肿瘤高8-10倍，并且远远高于正常乳腺细胞对果糖的摄取，而乳腺癌细胞和正常乳腺细胞对于葡萄糖的摄取仅有微小变化。这些结果表明果糖可以相对选择性地用于乳腺癌细胞。在己糖转运蛋白（GLUTs）的14种亚型种，仅有GLUT2和GLUT5能够转运果糖。其中，GLUT5对其他碳水化合物具有非常低的亲和力，因此GLUT5是果糖特异性转运蛋白。GLUT5负责果糖的主要转运，而GLUT2仅仅转运少量的果糖，如GLUT2在MCF-7和MDA-MB-231细胞的总果糖通量中分别占12％和30％。此外，GLUT5在乳腺癌中过度表达，而正常乳腺组织中很少表达。因此，我们设想将果糖修饰于脂质体表面，可实现对三阴性乳腺癌的靶向。
另一方面，整合素受体，又称整联蛋白，可介导细胞-细胞以及细胞-基质间的相互作用。在哺乳动物中的26种不同的整合素受体亚型中，受到相当关注的整合素受体是αvβ3。αvβ3在人肿瘤细胞上以及肿瘤新血管系统上过表达，但在正常组织早已存在的内皮上不表达，该特异性使αvβ3整合素受体成为重要的肿瘤标志物，并成为医学成像模式用于检测肿瘤组织和肿瘤血管生成的靶标。RGD是精氨酸（Arg）、甘氨酸（Gly）和天冬氨酸（Asp）形成的三肽，多种亚型的整合素受体均能识别相同的核心氨基酸序列Arg-Gly-Asp（RGD），因此RGD是整合素受体最重要的底物分子。由于TNBC细胞同样高表达αvβ3，因此，我们设想将RGD修饰于脂质体表面，亦可实现对三阴性乳腺癌的靶向。
现已有用果糖及其衍生物或RGD及其类似物修饰于纳米载体表面，用于对三阴性乳腺癌的靶向应用。但是仅仅通过单一的受体或转运蛋白的介导，其靶向能力有限，而引入两种靶向分子似乎能在单一靶向分子的基础上，进一步提高药物的靶向性。
发明内容
基于上述研究及假设，本研究的目的是合成一种果糖和RGD共修饰的脂质材料，并将其用于脂质体的制备。利用三阴性乳腺癌细胞高表达的果糖转运体GLUT5和整合素受体αvβ3分别对果糖和RGD肽的高亲和力，在单一果糖或RGD肽修饰的脂质体材料的基础上，进一步提高脂质材料多三阴性乳腺癌的靶向性。将此材料应用于具体的制剂，具有以下优点：通过脂质体固有的EPR效应，以及果糖和RGD分别与GULT5与αvβ3的特异性作用，充分利用脂质体的被动靶向和主动靶向能力，实现药物对三阴性乳腺癌的靶向治疗，因此能显著改善用药安全性，允许更高剂量用药，减少正常组织的毒副作用；使用生物相容性的载体材料包载药物，可以减少免疫反应以及网状内皮系统的吞噬；对于如紫杉醇这样的生物药剂学分类系统（BCS）IV类药物，可以显著改善生物利用度；脂质材料与所包载的药物整体进入肿瘤细胞后再释放药物，可以减少药物与外排蛋白的作用，从而降低耐药性；该脂质材料可结合多种药物对TNBC实施联合给药。因此，我们设计了如通式（I）所示的一类脂质材料，该脂质材料的胆固醇部分嵌入到脂质体磷脂双分子层中，具有三阴性乳腺癌靶向的果糖部分和RGD部分暴露在脂质体的表面，从而使脂质体具有乳腺癌靶向功能。这种脂质材料可用于脂质体、纳米粒、胶束等在内的不同剂型，具有很大的应用前景。
本发明提供通式（I）所示结构的化合物或其药学上可接受的盐或水合物：
其中，所用PEG的分子量等于但并不仅限于200、400、600、800、1000、1500、2000、4000等。
通式（I）所示化合物的具体制备方法如下所示：
本发明所述的新型脂质材料可以作为配体用于制备三阴性乳腺癌靶向的脂质体。
所述脂质体其特征在于包含磷脂、胆固醇、通式（Fru-RGD-chol）及活性剂。
所述脂质体主要由膜材与活性剂组成，其膜材为磷脂双分子层，由卵磷脂，胆固醇以及脂质体配体组成，其中，各组分配比关系如下：胆固醇和磷脂的摩尔比为1~2:1~10，脂质体配体的摩尔含量为胆固醇和磷脂的总摩尔数的1~25%。本发明所述的活性剂优选治疗剂或显影剂，如本领域所知的，活性剂的剂量可以依据包含在载体中的活性剂来调整，其中按重量百分数计算，活性剂占总脂质的0.1％~50％。
所述的脂质体中的磷脂包括所有类型的磷脂，包括但不限于大豆磷脂、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油；优选卵磷脂。
所述的脂质体中的活性剂可以是抗肿瘤药物，包括但不限于烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、蒽环类抗生素、植物生物碱、紫杉醇衍生物、拓朴异构酶抑制剂、单克隆抗体、光敏剂、激酶抑制剂和含铂化合物。抗癫痫药物，包括但不限于巴比妥类、乙丙酰脲类、双链脂肪酸类、琥珀酰亚胺类、苯甲二氮卓类、亚氨基苷类、磺胺类、恶唑烷双酮类、胡椒碱类、皮质激素类、免疫球蛋白等。抗抑郁药物，包括但不限于去甲肾上腺素再摄取抑制剂、单胺氧化酶抑制剂、5-羟色胺再摄取抑制剂。
本发明所述的三阴性乳腺癌靶向脂质体的制备方法，包括以下步骤：
（一）称取磷脂、胆固醇、紫杉醇于茄型烧瓶中，用适量溶剂溶解，加入相应比例的脂质体配体（空白脂质体不加），于20-40 ℃恒温水浴旋转蒸发除去有机溶剂；
（二）再将茄型瓶置于真空干燥器中真空干燥过夜除去残余溶剂；
（三）向茄型瓶中加入磷酸盐缓冲液或硫酸铵溶液等水化液，用20 ℃恒温空气浴摇床水化约0.5-2小时后，冰水浴探头超声，用挤压过膜或超声等方法将脂质体粒径控制在110nm左右。
优选的步骤（一）中的紫杉醇：脂质材料比为1:30。
优选的步骤（一）中的溶剂为氯仿，脂质摩尔比1:2（胆固醇：大豆磷脂）。
优选的步骤（三）中的水化液为pH 7.4的0.01 M磷酸盐缓冲液（PBS）。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
具体实施方法
以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。
所述的新型脂质材料具体由以下步骤制备：
实施例1
化合物2的制备
氩气保护下，将无水果糖2（2.00 g, 11.10 mmol）于0 ℃下加入到39 mL无水丙酮和1.95 mL硫酸的混合溶液中。将反应液移至室温反应2 h，TLC监测反应完全，于冰浴下向反应液中缓慢加入0 ℃的氢氧化钠水溶液（6.10 g, 152.50 mmol, 55 mL）。抽滤，减压蒸馏除去滤液中的溶剂，将残留物溶于二氯甲烷（50 mL），再依次用水（100 mL × 2）、饱和食盐水（100 mL × 2）洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去多余溶剂，石油醚重结晶得白色固体2.10 g，收率72.66%。Mp: 94-96 ℃（文献Mp：95-96 ℃）。
实施例2
化合物3的制备
氩气保护下，将化合物2（2.00 g, 7.68 mmol）、丁二酸酐（923 mg, 9.23 mmol）和4-二甲氨基吡啶（DMAP, 94 mg, 0.77 mmol）溶解于无水甲苯和无水三乙胺的混合溶液（30 mL :1 mL）中，将反应液置于110 ℃油浴下回流2.5 h。TLC监测反应完全，减压蒸馏除去甲苯，残留物溶于38 mL二氯甲烷和54 mL水的混合溶液中，用乙酸调节pH至中性。用二氯甲烷（40mL × 3）萃取水层，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，得无色油状物2.69 g，收率97.11%。产品无需纯化直接进行下一步。1H-NMR (600 MHz, CDCl3 , ppm)δ: 1.34 (s,3H), 1.41 (s, 3H), 1.48 (s, 3H), 1.54 (s, 3H), 2.70 (s, 4H), 3.75-3.78 (m,1H), 3.89-3.92 (m, 1H), 4.06-4.09 (m, 1H), 4.23-4.25 (m, 1H), 4.31 (s, 1H),4.42-4.45 (m, 1H), 4.60-4.61 (m, 1H)。
实施例3
化合物6的制备
将化合物4（1.14 g, 6.51mmol）溶于30 mL四氢呋喃，加入N-甲基吗啉（NMM, 0.717mL, 6.51 mmol），于-10 ℃下缓慢滴加氯甲酸异丁酯（IBCF, 0.823 mL, 6.51 mmol），滴加完毕后，于-10 ℃下继续活化30 min。将化合物5（3.16 g, 6.51 mmol）用四氢呋喃（10 mL）和N-甲基吗啉（0.717 mL）的混合溶液溶解后，滴加入上述活化液中。滴加完毕，移至室温反应4 h，TLC监测反应完毕。减压除去反应液中的溶剂，残留物用30 mL二氯甲烷溶解，依次用稀盐酸(1 N，50 mL × 2)、饱和碳酸氢钠溶液（50 mL × 2）和饱和氯化钠溶液（50 mL ×2）洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去多余溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化（石油醚/乙酸乙酯=6/1），得白色固体2.80 g，收率91.44%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3, ppm)δ:1.45 (s, 9H), 2.87-2.93 (m, 1H), 3.06-3.11 (m, 1H), 3.76-3.86 (m, 2H), 4.89-4.93 (m, 1H), 5.05 (d, 2H, J=3.0 Hz), 5.14 (s, 2H), 7.26-7.36 (m, 10H)。
实施例4
化合物7的制备
将化合物6（2.00 g, 4.25 mmol）用20 mL二氯甲烷溶解，快速加入10 mL三氟乙酸，于30 ℃下反应8 h。TLC监测反应完毕，加入饱和碳酸氢钠溶液中和多余的三氟乙酸，用二氯甲烷萃取（30 mL × 3），合并有机层，有机层用饱和氯化钠溶液洗涤（50 mL × 3），无水硫酸钠干燥，过滤，减压干燥得白色固体2.03 g，收率98.54%。产品无需纯化直接进行下一步。
实施例5
化合物8的制备
将N-Boc-N’-NO2-精氨酸（0.92 g, 2.89 mmol）用10 mL二氯甲烷溶解，加入N-甲基吗啉（NMM, 0.317 mL, 2.89 mmol），于-10 ℃下缓慢滴加氯甲酸异丁酯（IBCF, 0.361 mL,2.89 mmol），滴加完毕后，于-10 ℃下继续活化30 min。将化合物7用10 mL二氯甲烷溶解，加入N-甲基吗啉（NMM, 0.317 mL, 2.89 mmol）促溶，然后滴加入上述活化液中。滴毕，将反应液移至室温搅拌反应2 h。TLC监测反应完毕，依次用稀盐酸（1 N，30 mL × 3）、饱和碳酸氢钠溶液（30 mL × 3）、饱和氯化钠溶液（30 mL × 3）洗涤反应液。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂后，残留物经硅胶柱层析纯化（二氯甲烷/甲醇=40/1），得白色蜡状固体1.05 g，收率54.40%。熔点：97-100 ℃。1H-NMR (400 MHz, CDCl3 , ppm)δ: 1.41(s, 9H), 1.72 (s, 4H), 2.89-2.95 (m, 1H), 3.07-3.11 (m, 2H), 3.26 (s, 1H),3.80-3.84 (m, 1H), 4.18 (br, 1H), 4.48 (br, 1H), 4.92 (s, 1H), 5.05 (s, 2H),5.09 (d, 2H, J=6.4 Hz), 7.25-7.31 (m, 10H), 7.76 (br, 1H), 8.41 (br, 1H)。
实施例6
化合物9的制备
将化合物8（1.00 g, 1.489 mmol）溶于20 mL二氯甲烷和三氟乙酸（V/V=1:1）的混合溶剂中，室温搅拌反应12小时。减压除去溶剂，将残留物溶于50 mL乙酸乙酯，依次用饱和碳酸氢钠溶液（50 mL × 2）、饱和氯化钠溶液（50 mL × 2）洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂得白色蜡状固体0.76 g，收率89.32%，产品无须纯化可直接进行下一步反应。1H-NMR (400 MHz, CDCl3, ppm)δ: 1.53-1.71 (m, 4H), 2.48 (br, 2H), 2.84-2.99 (m,2H), 3.22 (s, 2H), 3.55 (br, 1H), 3.90-4.00 (m, 2H), 4.90-5.04 (m, 5H), 7.20-7.26 (m, 10H), 7.59 (br, 2H), 8.15 (br, 1H)。
实施例7
化合物10的制备
将丁二酸酐（125 mg, 1.25 mmol）溶于二氧六环（15 mL）中，缓慢滴加化合物9（0.50g, 0.87 mmol）的二氧六环（15 mL）溶液。滴毕，于80 ℃油浴搅拌反应30 min。减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化（二氯甲烷/甲醇=20/1），得泡状固体0.43 g，收率73.13%。1H-NMR (400 MHz, CD3OD, ppm) δ:1.69 (s, 4H), 2.49-2.52 (m, 2H), 2.55 (s, 1H),2.59-2.62 (m, 2H), 2.91-2.93 (m, 2H), 3.24 (t, 2H, J=6.0 Hz), 3.88 (s, 2H),4.29-4.33 (m, 1H), 5.06 (s, 2H), 5.09 (d, 2H, J= 4.0 Hz), 7.30 (s, 10H)。
实施例8
化合物12的制备
将胆固醇11（30.00 g, 77.59 mmol）溶于100 mL无水吡啶中，于0 ℃下缓慢滴加对甲苯磺酰氯（TsCl, 23.67 g, 124.14 mmol）的吡啶溶液（50 mL）。滴加完毕后，将反应液移至55 ℃下反应过夜。TCL监测原料反应完毕，减压蒸馏除去吡啶，将残留物用乙酸乙酯（300mL）溶解，并依次用稀盐酸（1 N, 100 mL × 2）、饱和氯化钠水溶液（100 mL × 2）洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压除去溶剂，得白色固体37.79 g，收率90.06%。产品无需纯化直接进行下一步反应。Mp: 129-132 ℃（文献Mp：130-132 ℃）。
实施例9
化合物13的制备
将化合物12（20.00 g, 36.98 mmol）溶于120 mL二氧六环中，加入二缩三乙二醇（TEG,27.79 g, 185.05 mmol），回流6小时，TLC监测原料反应完全。减压除去溶剂，残留物用200mL二氯甲烷溶解后，用饱和氯化钠水溶液洗涤（100 mL × 2），有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化（石油醚/丙酮=8/1），得到无色油状物11.68 g，收率60.87%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3, ppm)δ: 0.67 (s, 3H), 0.86 (d, 6H,J=4.4 Hz), 0.91 (d, 3H, J=4.4 Hz), 1.00 (s, 3H), 0.86-2.38 (remainingcholesterol protons), 3.16-3.21 (m, 1H), 3.62-3.63 (m, 2H), 3.65 (s, 4H),3.68 (d, 4H, J=2.4 Hz), 3.73-3.74 (m, 2H), 5.34 (s, 1H)。
实施例10
化合物14的制备
将化合物N-Boc-N'-Fmoc-L-赖氨酸（5.00 g, 10.67 mmol）溶于二氯甲烷（25 mL）中，依次加入（DCC, 2.93 g, 14.20 mmol）和4-二甲氨基吡啶（DMAP, 174 mg, 1.42 mmol），于-5 ℃下活化30 min。将化合物13（3.69 g, 7.11 mmol）溶于5 mL二氯甲烷中，缓慢滴加入上述活化液中，滴加完毕，移至室温搅拌8 h。TLC监测反应完全，过滤，除去二环己基碳二亚胺生成的副产物二环己基脲，减压除去溶剂后得到淡黄色油状液体，残留物经硅胶柱层析纯化（石油醚/丙酮=8/1），得到淡黄色固体6.41 g，收率93.07%。1H-NMR (400 MHz,CDCl3 , ppm)δ: 0.67 (s, 3H), 0.86 (d, 6H, J=6.4 Hz), 0.91 (d, 3H, J=6.4 Hz),0.98 (s, 3H), 1.43 (s, 9H), 0.85-2.36 (remaining cholesterol & Lys protons),3.10-3.19 (m, 3H), 3.63 (d, 8H, J=10.0 Hz), 3.71 (t, 2H, J=4.6 Hz) 4.22 (t,1H, J=6.8 Hz), 4.30-4.31 (m, 2H), 4.35-4.44 (m, 3H), 5.32-5.33 (m, 1H), 7.32(t, 2H, J=7.2 Hz), 7.40 (t, 2H, J=7.2 Hz), 7.61 (d, 2H, J=7.2 Hz), 7.77 (d,2H, J=7.2 Hz)。
实施例11
化合物15的制备
将化合物14（2.58 g, 2.66 mmol）溶于20 mL二氯甲烷中，加入1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯（DBU, 1.194 mL, 7.98 mmol），置于室温反应20 min。TLC监测反应完全，依次用水（50 mL × 3）、饱和氯化钠溶液（100 mL × 2）洗涤反应液，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂后得到淡黄色油状物，残留物经硅胶柱层析纯化（二氯甲烷/甲醇=15/1），得淡黄色固体1.85 g，收率93.03%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3 , ppm)δ: 0.67 (s, 3H),0.86 (d, 6H, J=6.4 Hz), 0.91 (d, 3H, J=6.4 Hz), 0.99 (s, 3H), 1.43 (s, 9H),0.85-2.38 (remaining cholesterol & Lys protons), 3.12-3.21 (m, 3H), 3.64 (d,8H, J=11.6 Hz), 3.70-3.75 (m, 4H), 4.14-4.15 (m, 1H), 4.31-4.43 (m, 2H), 5.34(s, 1H), 8.69 (s, 2H)。
实施例12
化合物16的制备
将化合物10（0.90 g, 1.34 mmol）溶于10 mL二氯甲烷，于-5 ℃下加入N-甲基吗啉（0.127 mL, 1.15 mmol）和氯甲酸异丁酯（IBCF, 0.151 mL, 1.15 mmol）活化30 min。将化合物15（0.71 g, 0.96 mmol）溶于10 mL二氯甲烷中，于-5 ℃下缓慢滴加入上述活化液中。滴毕，移至室温反应过夜。TLC监测反应完全，依次用稀盐酸（1 N, 50 mL × 2）、饱和氯化钠溶液（50 mL × 2）洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化（二氯甲烷/甲醇=50/1）得淡黄色泡沫状固体1.09 g，收率81.46%。1H-NMR (400MHz, CDCl3, ppm)δ: 0.67 (s, 3H), 0.86 (d, 6H, J=6.4 Hz), 0.91 (d, 3H, J=6.4Hz), 0.98 (s, 3H), 1.41 (s, 9H), 0.85-2.37 (remaining cholesterol & Lysprotons & Arg protons), 2.54 (s, 4H), 2.78 (br, 2H), 3.05 (s, 2H), 3.13-3.21(m, 1H), 3.29 (s, 2H), 3.61-3.63 (m, 8H), 3.67 (s, 2H), 3.93 (s, 2H), 4.19-4.28 (m, 2H), 4.44 (s, 2H), 4.91 (br, 1H), 5.04 (s, 2H), 5.09-5.10 (m, 2H),5.32-5.33 (m, 1H), 7.25-7.33 (m, 10H)。
实施例13
化合物17的制备
将化合物16（1.09 g, 0.78 mmol）加入12 mL三氟乙酸与二氯甲烷的混合溶液（V/V=1 :3）中，室温搅拌反应20 min，TLC监测反应完全。减压除去二氯甲烷和三氟乙酸，再重新用二氯甲烷（50 mL）溶解，依次用水（50 mL × 1）、饱和碳酸氢钠溶液（50 mL × 1）、饱和氯化钠溶液（50 mL × 2）洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，得浅黄色固体1.00g，收率98.52%。产品无须纯化直接用于下一步反应。1H-NMR (400 MHz, CDCl3, ppm)δ:0.67 (s, 3H), 0.86 (d, 6H, J=6.4 Hz), 0.91 (d, 3H, J=6.4 Hz), 0.98 (s, 3H),0.86-2.36 (remaining cholesterol & Lys protons & Arg protons), 2.56 (br, 4H),2.94-3.20 (m, 5H), 3.27 (s, 2H), 3.63-3.65 (m, 10H), 3.92 (br, 2H), 4.25 (s,2H), 4.42-4.55 (m, 2H), 4.90 (br, 1H), 5.04-5.09 (m, 4H), 5.33 (s, 1H), 7.28-7.32 (m, 10H)。
实施例14
化合物18的制备
将化合物3（425 mg, 1.15 mmol）溶于10 mL二氯甲烷中，依次加入N，N-二异丙基乙胺（DIPEA, 0.38 mL, 2.30 mmol）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDCI, 294mg, 1.54 mmol）和4-二甲氨基吡啶（DMAP, 188 mg, 1.54 mmol），于-5 ℃下活化30 min。将化合物17（0.999 g, 0.77 mmol）溶于10 mL二氯甲烷中，滴加入上述活化液中，移至室温搅拌反应过夜。TLC监测反应完全，依次用稀盐酸（1 N, 30 mL × 2）、饱和氯化钠溶液（30mL × 2）洗涤反应液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化（二氯甲烷/甲醇=8/1），得白色泡状固体977 mg，收率77.48%。1H-NMR (400 MHz,CDCl3 , ppm)δ: 0.66 (s, 3H), 0.86 (d, 6H, J=6.0 Hz), 0.91 (d, 3H, J=6.4 Hz),0.98 (s, 3H), 1.33 (s, 3H), 1.38 (s, 3H), 1.45 (s, 3H), 1.52 (s, 3H), 0.85-2.40 (remaining cholesterol & Lys protons& Arg protons), 2.46-2.79 (m, 8H),2.89-3.05 (m, 2H), 3.14-3.40 (m, 5H), 3.62 (d, 8H, J=6.8 Hz), 3.68 (t, 2H, J=4.0 Hz), 3.72-3.75 (m, 1H), 3.87-3.93 (m, 3H), 3.98-4.01 (m, 1H), 4.21-4.26(m, 3H), 4.30-4.31 (m, 1H), 4.42-4.47 (m, 3H), 4.58-4.61 (m, 1H), 4.87-4.91(m, 1H), 5.01-5.07 (m, 2H), 5.08-5.13 (m, 2H), 5.33 (s, 1H), 6.63 (br, 1H),7.00 (br, 1H), 7.29-7.34 (m, 10H), 7.42 (br, 1H), 7.84 (br, 1H). HRMS (ESI)calculated for C85H127N9NaO23 + [M+Na]+- 1664.8937, found 1664.9435。
实施例15
配体I（Fru-RGD-chol）的制备
将化合物18（100 mg, 0.06 mmol）加入6 mL三氟乙酸和水的混合溶剂中（V/V=1/1），室温搅拌反应24 h。TLC监测反应完全，减压除去三氟乙酸，加水50 mL稀释后，用二氯甲烷萃取（50 mL × 3），合并有机层，用饱和氯化钠溶液洗涤（100 mL × 1），有机层用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液经减压除去溶剂后得淡黄色半固体86 mg。HRMS (ESI) calculatedfor C79H119N9NaO23 + [M+Na]+- 1584.8311, found 1584.8318. 将上述淡黄色半固体（50mg, 0.032 mmol）溶于10 mL甲醇中，加入10% Pd/C（5 mg），于氢气压下（0.4 Mpa）45 ℃油浴搅拌反应48 h。TLC监测反应完全，过滤除去Pd/C，滤液经减压除去溶剂，残留物用乙醚洗去小极性杂质（10 mL × 5），减压除去残留的乙醚得白色固体22 mg。1H-NMR (400 MHz,CD3OD, ppm) δ: 0.67 (s, 3H), 0.86 (d, 6H, J=6.8 Hz), 0.91 (d, 3H, J=6.4 Hz),0.98 (s, 3H), 0.67-2.37 (remaining cholesterol and Lys protons), 2.50-2.79(m, 10H), 2.90-3.05 (m, 2H), 3.17-3.20 (m, 2H), 3.62-3.76 (m, 12H), 3.77-3.94(m, 5H), 4.18-4.35(m, 8H), 4.61(br, 1H). HRMS (ESI) calculated forC66H110N8NaO21 +[M+Na]+-1361.7678, found 1361.7202。
所述的乳腺癌靶向脂质体的具体制备方法：
实施例16
脂质体的制备
薄膜-水化超声法作为经典的脂质体制备方法，应用最为广泛，操作简单，制备出的脂质体结构典型。因此，本文选择采用薄膜-水化超声法来制备载紫杉醇脂质体。
根据本课题组前期对载紫杉醇脂质体的处方摸索，我们选取最优化处方：脂质材料摩尔比为胆固醇：大豆磷脂：配体=33:64:3，药脂质量比为脂质：紫杉醇=30:1，水化液为pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 M）。我们用上述处方分别制备了5种载紫杉醇脂质体：PTX-Lip、PTX-Fru-Lip、 PTX-RGD-Lip、 PTX-Fru-RGD-Lip以及PTX-Fru+RGD-Lip。
具体操作如下：准确称取处方量脂质材料和紫杉醇于50 mL茄型烧瓶中，用适量氯仿-甲醇的混合溶液（V/V=2/1）溶解，于37 ℃恒温水浴旋转蒸发除去溶剂后得均匀完整的脂质薄膜，真空干燥过夜除去残余溶剂。加入pH 7.4的PBS缓冲液，于20 ℃恒温空气浴摇床，180 rpm条件下水化30 min后，冰水浴下探头超声（80W，5S，5S）3分钟，即得略带乳光的脂质体溶液。
实施例17
脂质体的包封率及粒径与电位的测定
根据文献报道，本申请采用冷冻离心的方法将未包载的游离紫杉醇与载紫杉醇脂质体分离。按实施例16所述方法分别制备PTX-Lip、PTX-Fru-Lip、PTX-RGD-Lip、PTX-Fru-RGD-Lip、PTX-Fru+RGD-Lip。取部分上述载紫杉醇脂质体溶液在4 ℃条件下，10000 rpm离心20分钟，上清液即为不含游离紫杉醇的脂质体。分别取40 μL离心后的上清液和离心前的脂质体样品，加入960 μL甲醇，涡旋震摇10分钟使之完全破乳后，再次10000 rpm离心10分钟，取上清液注入高效液相色谱仪进行分析，并按公式计算载紫杉醇脂质体的包封率（encapsulation efficiency，EE%）：EE% = A离心后/A离心前× 100%，其中，A离心后和A离心前分别指离心后和离心前的脂质体样品的峰面积。此外，还对上述5种载紫杉醇脂质体进行了粒径和Zeta电位的测定。将所制得的脂质体用超纯水稀释到适宜浓度后，采用激光粒度及Zeta电位分析仪测定脂质体的粒径及电位，各组脂质体的粒径、电位及包封率见表1。
结果表明这5种载紫杉醇脂质体包封率良好，均大于80%。粒径均在110 nm左右，分散性指数（polymer dispersity index，PDI）在0.2左右，脂质体呈现均匀分布；Zeta电位为-5 mV左右，呈微弱的负电性。
实施例18
血清稳定性评价
本文采用浊度法测定不同配体修饰的载紫杉醇脂质体在50%胎牛血清中的透光率，具体操作如下：取各组载紫杉醇脂质体分别与等体积的胎牛血清混合均匀，于37 ℃恒温摇床中缓慢震摇（45 rpm），于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h分别取样，通过酶标仪测定样品在750 nm处的吸光度值，并换算成透光率。
结果（图1）表明，所有脂质体在和胎牛血清共孵育48小时后，其透光率仍大于90%，无明显的聚集现象，表明所制备的脂质体具有较好的血清稳定性，为后期体外、体内等实验奠定了基础。
实施例19
溶血性评价
取18-22 g昆明小鼠，经眼眶取血置于涂有肝素钠的离心管中，于4 ℃下离心（10000rpm × 10 min），弃去上清液，并用生理盐水清洗下层红细胞三次至上清液无色，最后用生理盐水将红细胞重悬为2%（w/v）的溶液。按实施例16所述方法制备五种载紫杉醇脂质体，并用生理盐水将其逐步稀释，使脂质浓度为800、600、400、300、200、150、100、75、50、25、10 μmol/L。分别取上述不同浓度的脂质体0.2 mL与等体积的2%红细胞悬液混合后，于37 ℃在恒温摇床中孵育1小时，10000 rpm离心10分钟，取上清液用酶标仪在波长540 nm处检测吸光度A。将1%曲拉通（聚乙二醇辛基苯基醚，Triton X-100）与红细胞共孵育的结果作为阳性对照，即溶血率为100%；以PBS与红细胞共同孵育的结果作为阴性对照，即溶血率为0%。各组脂质体的溶血率计算公式为：溶血率（percent hemolysis）% =（A样品–A阴性）/（A阳性–A阴性）×100%。
结果见图2，在10-800 μmol/L脂质浓度范围内，5种脂质体均没有引起明显的血红蛋白的释放，溶血率均小于10%，有较好的生物安全性，可用于后期体内外活性评价。
实施例20
体外释药评价
本文通过透析法对不同配体修饰的脂质体的体外药物释放进行考察。取0.4 mL各组载紫杉醇脂质体或等浓度的游离药物紫杉醇（溶剂为乙醇:聚氧乙烯蓖麻油=1:1，v/v）分别置于8000-12000 Da的透析袋中，密封后置于40 mL透析介质（1% Tween 80的PBS溶液，v/v）中，于恒温摇床中缓慢震摇（37 ℃，45 rpm），于0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h分别取样0.1 mL，并加入等体积的释放介质，48 h后将透析袋中的液体与释放介质混匀并取样作为紫杉醇释放完全的样品。取出的样品按上述HPLC色谱条件进行分析。并计算各个时间点每个样品的累积释放度，绘制其释放行为曲线（n=3），结果见图3。
结果表明，游离紫杉醇的释放较为迅速，在孵育12小时内释放了85%以上，48 h释放了90%以上，而其他各组载PTX的脂质体释放较为缓慢，48小时内释放70%左右，均无明显的突释现象，而且各组脂质体之间的释放特征无明显差异，表明脂质体可以明显改善药物的释放行为，起到缓释作用。
实施例21
细胞毒性实验
通过MTT法，考察不同配体修饰的载紫杉醇脂质体对人源三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231）以及鼠源三阴性乳腺癌细胞（4T1）的毒性。
将MDA-MB-231细胞或4T1细胞以5 × 103个/孔的浓度接种于96孔板内，在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱内孵育24 h。按实施例16制备的五种载紫杉醇脂质体，用含10%胎牛血清（FBS）的培养基将载紫杉醇脂质体或游离紫杉醇逐步稀释为PTX浓度为20、5、2、0.5、0.1和0.02 µmol/L的溶液，加入细胞培养板内共同培养24 h。弃去培养基，向96孔板内依次加入200 µL MTT浓度为0.5 mg/mL的不含血清的培养基，于细胞培养箱中继续孵育4 h。弃去培养基，并向细胞孔内加入DMSO（150 µL），置于酶标仪中震荡均匀并于570 nm处测定其光密度吸收值OD。以不加药处理的细胞孔的OD值作为空白组，以不加细胞液并且不加药的培养基组的OD值作为背景组，计算给药组的细胞存活率公式为：存活率（cell viability）% =(OD样品– OD背景)/(OD空白 – OD背景) × 100%，结果如图4A、4B。结果表明，PTX-Fru-RGD-Lip在这5种脂质体中，对两种细胞均表现出最强的细胞毒性，在各个给药浓度下表现出较强的抑制三阴性乳腺癌增殖的能力。
为了进一步对载体材料的毒性进行考察，按实施例16中的方法制备五种未载药的空白脂质体，并将其稀释为和载药脂质体相对应浓度的空白脂质体溶液，按照上述MTT的实验操作方法评价空白脂质体的细胞毒性，结果见图4C、4D。结果表明，未载药的脂质材料对两种三阴性乳腺癌细胞，在脂质浓度高达800 μmol/L的浓度下均未表现出明显毒性，可见载体材料具有较高的安全性，可用于后续体内外的活性评价。
实施例22
细胞摄取实验
按实施例16中载紫杉醇脂质体的制备方法，将紫杉醇替换为荧光剂CFPE，制备CFPE标记的脂质体。将MDA-MB-231细胞或4T1细胞以1×105个/孔或2×105个/孔接种于12孔板中，将按上述5种CFPE标记的脂质体，用无血清培养基稀释后加入孔板中，使脂质浓度为0.3 µmol/mL，CFPE浓度为2 μg/mL，于细胞培养箱中孵育2 h。弃去含药培养基并用预冷PBS洗涤2次，消化收集细胞，于4 ℃下离心（2000 rpm×3 min），弃去上清，用预冷PBS清洗2次后，将细胞用PBS重悬，用流式细胞仪检测细胞的荧光强度，其结果如图5A、5B所示。
流式细胞仪的测试基础上，进一步采用激光共聚焦显微镜，对细胞摄取进行了更直观的研究，具体操作如下：将MDA-MB-231或4T1细胞分别以5×105或1×106个/孔的浓度接种于预置有盖玻片的6孔板中，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。弃去培养基，加入CFPE标记的五种脂质体1 mL/孔，使脂质浓度为0.3 µmol/mL，CFPE浓度为2 μg/mL，于细胞培养箱中孵育2 h后弃去含药培养基并用冰冷PBS洗涤2次，每次5 min，加入4%多聚甲醛固定30min，弃去多聚甲醛，PBS清洗3次，每次5 min。加入5 μg/mL DAPI染料染核5 min，弃去染料，PBS清洗3次后，甘油封片，于激光共聚焦显微镜下拍摄。结果如图5C、5D所示。
按实施例16中载紫杉醇脂质体的制备方法，将紫杉醇替换为荧光剂CFPE，制备CFPE标记的脂质体。将MDA-MB-231细胞或4T1细胞以1×105个/孔或2×105个/孔接种于12孔板中，将按上述5种CFPE标记的脂质体，用无血清培养基稀释后加入孔板中，使脂质浓度为0.3 µmol/mL，CFPE浓度为2 μg/mL，于细胞培养箱中孵育2 h。弃去含药培养基并用预冷PBS洗涤2次，消化收集细胞，于4 ℃下离心（2000 rpm×3 min），弃去上清，用预冷PBS清洗2次后，将细胞用PBS重悬，用流式细胞仪检测细胞的荧光强度，其结果如图5A、5B所示。
流式细胞仪的测试基础上，进一步采用激光共聚焦显微镜，对细胞摄取进行了更直观的研究，具体操作如下：将MDA-MB-231或4T1细胞分别以5×105或1×106个/孔的浓度接种于预置有盖玻片的6孔板中，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。弃去培养基，加入CFPE标记的五种脂质体1 mL/孔，使脂质浓度为0.3 µmol/mL，CFPE浓度为2 μg/mL，于细胞培养箱中孵育2 h后弃去含药培养基并用冰冷PBS洗涤2次，每次5 min，加入4%多聚甲醛固定30min，弃去多聚甲醛，PBS清洗3次，每次5 min。加入5 μg/mL DAPI染料染核5 min，弃去染料，PBS清洗3次后，甘油封片，于激光共聚焦显微镜下拍摄。
共聚焦拍摄的摄取结果与流式细胞仪的结果一致，摄取强度为CFPE-Fru-RGD-Lip＞CFPE-Fru+RGD-Lip＞CFPE-RGD-Lip＞CFPE-Fru-Lip＞CFPE-Lip。说明用果糖和RGD共修饰的脂质体，其靶向三阴性乳腺癌的能力较单一靶向分子修饰的脂质体更强。
实施例23
摄取机制的研究
将MDA-MB-231细胞或4T1细胞分别以1×105个/孔或2×105个/孔接种于12孔板中，于37 ℃、5% CO2浓度中培养24 h后，弃去培养基，用PBS清洗一次后，分别加入含10 g/L果糖、200 μg/mL RGD、10 μg/mL氯丙嗪、1 μg/mL菲律平、2 mg/mL盐酸阿米洛利以及1 mg/mLNaN3的无血清培养基，于37 ℃孵育30 min。弃去培养基，PBS清洗一次，将按5.2.2.1所述方法制备的5种CFPE标记的脂质体，用无血清培养基稀释后加入孔板，使脂质浓度为0.3 µmol/mL，CFPE浓度为2 μg/mL，于细胞培养箱中孵育2 h。并设置低温组，即将加有脂质体的细胞于4 ℃条件下同样孵育2 h。弃去含药培养基并用预冷PBS洗涤2次，消化收集细胞，于4℃离心机中离心（2000 rpm × 3 min），弃去上清，用冰冷PBS清洗2次后，将细胞用PBS重悬，用流式细胞仪检测细胞的荧光强度，计算各组相对正常摄取组（对照组）的摄取率，其结果如图6。
由结果可见， MDA-MB-231和4T1细胞对于Fru-RGD-Lip和Fru+RGD-Lip的摄取是由GLUT5和αvβ3共同介导、由多种途径参与的、能量依赖的内吞方式实现的。
实施例24
体内靶向性评价
按实施例15中载紫杉醇脂质体的制备方法，将紫杉醇替换为荧光剂DiD，制备DiD标记的脂质体。荷4T1Balb/C小鼠建立14天后，按DiD 500 µg/kg的剂量经尾静脉注射，向模型小鼠给予载DiD的脂质体DiD-Lip、DiD-Fru-Lip、DiD-RGD-Lip、DiD-Fru-RGD-Lip和DiD-Fru+RGD-Lip。并将小鼠肿瘤部位毛发脱去以便于观察肿瘤部位的荧光强度。在给药后2 h、6 h、12 h、16 h和24 h后，将各组小鼠用4%多聚甲醛麻醉后置于小动物活体成像仪中观察，随后立即将各时间点的小鼠心脏灌流处死后，将心、肝、脾、肺、肾及肿瘤取出，同样置于活体成像仪中观察，并对离体肿瘤图片用软件进行定量处理。
结果表明，在各个时间点，五种脂质体在肿瘤部达的药物富集程度为，DiD-Fru-RGD-Lip＞DiD-Fru+RGD-Lip＞DiD-RGD-Lip＞DiD-Fru-Lip＞DiD-Lip。这些结果表明果糖和RGD共修饰的脂质体在单一靶向分子修饰的脂质体的基础上，能进一步显著提高脂质体靶向三阴性乳腺癌能力，与体外靶向性评价结果一致。
附图说明
图1：不同配体修饰的载紫杉醇脂质体在50%血清中孵育后透光率的变化（n=3,mean ± SD）
图2：不同配体修饰的载紫杉醇脂质体的溶血率（n=3，mean ± SD）
图3：不同配体修饰的载紫杉醇脂质体的体外释药行为（n=3，mean ± SD）
图4：各组载紫杉醇脂质体及游离紫杉醇对MDA-MB-231（A）及4T1（B）的细胞毒性研究;各组未载药的空白脂质体对MDA-MB-231（C）及4T1（D）的细胞毒性研究（n=3，mean ± SD）
图5：CFPE标记的脂质体在MDA-MB-231细胞（A）和4T1细胞(B)中摄取情况（*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001 versus CFPE-Lip; n=3，mean ± SD）
图6：CFPE-Fru-RGD-Lip 在MDA-MB-231细胞（A）和4T1细胞（B）中的摄取机制研究；CFPE-Fru+RGD-Lip在MDA-MB-231细胞（C）和4T1（D）中的摄取机制研究（*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001 versus control; n=3，mean ± SD）。

Claims (9)

1.一种果糖和RGD肽共修饰的双重靶向三阴性乳腺癌的脂质材料为通式I所示结构或其药学上可接受的盐或水合物，
其中，所用PEG的分子量等于但并不仅限于200、400、600、800、1000、1500、2000、4000等。
2.根据权利要求1所述的双重靶向三阴性乳腺癌的脂质材料I的结构特征在于：以赖氨酸为分枝骨架，一端连接聚乙二醇和胆固醇，另外两端分别连接具有三阴性乳腺癌靶向功能的果糖和RGD。
3.根据权利要求1所述的双重靶向三阴性乳腺癌的脂质材料其结构特征在于：以果糖的C1-OH以及RGD肽中的伯氨基作为修饰位点。
4.根据权利要求1所述的新型双重靶向三阴性乳腺癌的脂质材料I的结构，其合成路线特征在于：果糖部分将果糖用丙叉保护基对C2,3,4,5-OH保护后，用丁二酸对C1-OH进行延伸；RGD部分以Boc保护的甘氨酸、苄基保护的天冬氨酸以及Boc和硝基共同保护的精氨酸为原料首先合成全保护的RGD三肽，然后脱除精氨酸的Boc保护基并用丁二酸进行延伸；胆甾部分，以胆固醇为起始原料，首先用三甘醇进行延伸，再与中间连接基团N-Boc-N'-Fmoc-L-赖氨酸偶联，选择性依次脱去Fmoc保护基和Boc保护基后即可分别与RGD部分和果糖部分连接，最后脱去所有保护基即得目标化合物。
5.根据权利要求1所述的新型双重靶向三阴性乳腺癌的脂质材料作为药物载体在制备三阴性乳腺癌靶向药物中的应用。
6.根据权利要求1所述的新型双重靶向三阴性乳腺癌的脂质材料所制成的三阴性乳腺癌靶向脂质体，其特征在于，包括膜材与活性剂，所述的膜材为磷脂双分子层，由卵磷脂，胆固醇以及脂质体配体组成，其中，各组分配比关系如下：胆固醇和磷脂的摩尔比为1~2:1~10，脂质体配体的摩尔含量为胆固醇和磷脂的总摩尔数的1~25%；本发明所述的活性剂采用治疗剂或显影剂，活性剂的剂量可以依据包含在甾体中的活性剂来调整，其中按重量百分数计算，活性剂占总脂质的0.1％-50％；水化液为pH 7.4的0.01M磷酸盐缓冲液（PBS）。
7.根据权利要求1所述的新型双重靶向三阴性乳腺癌的脂质材料制成的三阴性乳腺癌靶向脂质体，其特征在于，根据上述组分配比关系，采用薄膜法制备乳腺癌靶向脂质体，可制备得到粒径及Zeta电位稳定的乳腺癌靶向脂质体，其脂质体粒度为110 nm左右，包封率大于80%。
8.根据权利要求1所述的新型双重靶向三阴性乳腺癌的脂质材料制成的三阴性乳腺癌靶向脂质体，其特征在于，所述磷脂本发明中采用卵磷脂。
9.根据权利要求1所述的新型双重靶向三阴性乳腺癌的脂质材料制成的三阴性乳腺癌靶向脂质体，其特征在于，所述的活性剂本发明中的治疗剂采用紫杉醇，显影剂采用CFPE或DiD2。
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